WO2018139614A1 - 生体物質の検出方法、それに用いる化学発光指示薬 - Google Patents

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Definitions

  • FIG. 4 shows the change in affinity (dissociation constant, K d value) for bilirubin of a lyophilized sample stored at room temperature.
  • FIG. 5 shows chemiluminescence images on a 96-well plate of wild-type chemiluminescent bilirubin indicator and various concentrations of bilirubin solutions taken with a smartphone.
  • FIG. 6 shows an example of the result of bilirubin measurement using the UnaG (C ⁇ 0) -NLuc (N ⁇ 1) fusion protein in Example 2, FIG. 6A shows the chemiluminescence spectrum, and FIG. 6B shows UnaG (C ⁇ 0) -NLuc (N ⁇ 1).
  • the sample When the fusion protein (C) and the protein (B) substrate are added to the target sample, the sample emits light.
  • the presence or absence of a biological substance bound to the protein (A) can be determined using the luminescence signal as an index. Basically, if the biological material is present, the emission color is that of the protein (A), and if it is not present, it is that of the protein (B).
  • the protein (A1) is IFP, iRFP, smURFP, or a modified form thereof that can emit fluorescence in a state where biliverdin is bound thereto, and the biological substance to be detected is biliverdin. Detection method.
  • the protein (A2) is a protein selected from the group consisting of FbFP, iLOV protein, mini-SOG protein, and variants thereof capable of binding flavin mononucleotide, and the biological substance to be detected is The detection method according to any one of [1] to [3], which is a flavin mononucleotide.
  • Example 1 Gene construction of fusion protein (chemiluminescence indicator) A C-terminal deletion mutant of wild-type UnaG was amplified using the following primers with a BamHI restriction enzyme site at the N-terminus and a KpnI restriction enzyme site at the C-terminus.
  • Reverse primer CGCGGATCCGGGTGGTTCTGGTATGG SEQ ID NO: 1
  • Reverse primer0 (C ⁇ 0) GCTGGTACCTTCCGTCGCCCTCCG
  • Reverse primer1 (C ⁇ 1) GCTGGTACCCGTCGCCCTCCGGTA SEQ ID NO: 3
  • Reverse primer2 (C ⁇ 2) GCTGGTACCCGCCCTCCGGTAGCT SEQ ID NO: 4
  • Reverse primer3 (C ⁇ 3) GCTGGTACCCCTCCGGTAGCTGCG SEQ ID NO: 5
  • Reverse primer4 (C ⁇ 4) GCTGGTACCCCGGTAGCTGCGCAC SEQ ID NO: 6
  • the emission colors are 0 nM (56,133,204), 10 nM (79,157,215), 20 nM (96,169,209), 30 nM (101,164,194), 40 nM (119,179,189), 50 nM (123,169.156), 100 nM. (154,187,111) and 250 nM (158,191,107). If there is a correlation as shown in FIG. 5, the bilirubin concentration can be calculated from the emission data (emission color).
  • FIG. 6A shows the chemiluminescence spectrum
  • FIG. 6B is a graph showing the relationship between the dilution rate of UnaG (C ⁇ 0) -NLuc (N ⁇ 1) fusion protein solution (detection reagent) and the ratio value (530 nm / 460 nm). is there.
  • Comparative Example 1 As shown in FIGS. 7A and 7B, the fluorescence intensity varied depending on the concentration of the detection reagent, although the concentration of the target bilirubin was the same. That is, it can be said that quantitative measurement cannot be performed in Comparative Example 1 (method using UnaG protein).
  • Example 2 measured using the UnaG (C ⁇ 0) -NLuc (N ⁇ 1) fusion protein, although the emission intensity varies depending on the concentration of the detection reagent, the spectrum waveform is constant (FIG. 6A), and FIG. 6B.
  • the peak ratio value (530 nm / 460 nm) for the same bilirubin concentration was almost the same regardless of the concentration of the detection reagent. For this reason, it can be said that by using the UnaG (C ⁇ 0) -NLuc (N ⁇ 1) fusion protein, measurement irrespective of the concentration of the detection reagent, that is, quantitative measurement is possible.

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Abstract

定量的な測定が容易となりうる生体物質の検出方法の提供。　試料中の生体物質の検出方法であって、前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）、及び、前記化学発光タンパク質（Ｂ）の基質を混合すること、並びに、前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、検出方法。

Description

生体物質の検出方法、それに用いる化学発光指示薬
　本開示は、生体物質の検出方法、及びそれに用いる化学発光指示薬に関する。
　試料中の生体物質を検出する方法として、蛍光タンパク質を用いた方法が挙げられる。例えば、特許文献１は、生体物質である非抱合型ビリルビンを結合して蛍光特性を発揮するＵｎａＧタンパク質又はその改変体を用いて非抱合型ビリルビンを検出することを提案する。
　ビリルビンはヘモグロビンの構成物であるヘムの分解産物をいう。ビリルビンには脂溶性の非抱合型ビリルビン（間接ビリルビンともいう）と水溶性の抱合型ビリルビン（直接ビリルビンともいう）がある。非抱合型ビリルビンは、肝機能の低下とともに血液中や尿中に排出される。高濃度の間接ビリルビンは、核黄疸（ビリルビン脳症）を引き起こす。
　従来、ビリルビンの測定はジアゾ法に代表される比色定量法が主である。血液検査の際には、間接ビリルビンは、通常、総ビリルビン（直接ビリルビンと間接ビリルビンの合計）と直接ビリルビンとを測定し、その差分として算出される。
WO 2014/133158
　ＵｎａＧのような生体物質を結合する蛍光タンパク質を使用して該生体物質の検出・定量をする場合、観測のための励起光源が必要となる。また、一波長励起一波長測光であるため、定量的な測定が難しい場合がある。
　そこで、本開示は、一態様において、定量的な測定が容易となりうる生体物質の検出方法及び化学発光指示薬を提供する。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、試料中の生体物質の検出方法であって、
　前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）、及び、前記化学発光タンパク質（Ｂ）の基質を混合すること、並びに、
　前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである検出方法（以下、本開示に係る検出方法ともいう。）に関する。
　本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）を含む化学発光指示薬であって、
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである化学発光指示薬に関する。
　本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、融合タンパク質（Ｃ）を発現可能なベクター又は形質転換体に関する。
　本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質濃度を判別することを含む方法に関する。
　本開示によれば、一態様において、定量的な測定が容易となりうる生体物質の検出方法を提供できる。
図１は、Ｃ末／Ｎ末欠損変異した様々なＵｎａＧとＮＬｕｃとの融合タンパク質の化学発光スペクトルを示す。ＵｎａＧ（ＣΔ０）＋ＮＬｕｃ（ＮΔ１）が最も大きなＦＲＥＴ効率を示した。 図２は、リンカー配列に様々な変異を挿入した際の化学発光スペクトルを示す。野生型化学発光ビリルビン指示薬の配列（ＧＴ）に比べ、ＤＤ配列に置換された変異体が最も大きなＦＲＥＴ効率変化を示した。 図３は、野生型化学発光ビリルビン指示薬の滴定曲線を示す。３回の独立した計測の平均値をプロットし、ヒルの式によりフィッティングを行った。Ｋd値は３．０５ｎＭであった。 図４は、室温で保存された凍結乾燥試料の、ビリルビンに対するアフィニティー（乖離定数、Ｋd値）の変化を示す。 図５は、スマートフォンで撮影した、野生型化学発光ビリルビン指示薬とさまざまな濃度のビリルビン溶液の、９６ウェルプレート上での化学発光像を示す。 図６は、実施例２におけるＵｎａＧ（ＣΔ０）－ＮＬｕｃ（ＮΔ１）融合タンパク質によるビリルビン測定の結果の一例を示し、図６Ａは化学発光スペクトルを示し、図６ＢはＵｎａＧ（ＣΔ０）－ＮＬｕｃ（ＮΔ１）融合タンパク質溶液（検出試薬）の希釈率と発光強度から得られたピークのレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）との関係を示すグラフである。 図７は、比較例１におけるＵｎａＧタンパク質によるビリルビン測定の結果の一例を示し、図７Ａは蛍光スペクトルを示し、図７ＢはＵｎａＧタンパク質溶液（検出試薬）の濃度とピーク（５３０ｎｍ）の蛍光強度との関係を示すグラフである。
　本開示は、生体物質を検出するにあたり、当該生体物質と結合して蛍光を発するタンパク質に、共鳴エネルギー移動が起りうるように化学発光タンパク質を融合させることで、観測のための励起光源を使用とせず、また、２波長の測定光を使用できるようになり、該生体物質の定量を容易化できる、という知見に基づく。
　本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）を化学発光指示薬として使用して、試料中の生体物質を検出することを含む。
　［生体物質及び試料］
　本開示に係る検出方法の検出対象としては、生体試料における生体物質が挙げられる。生体試料としては、生物に由来する該生体物質を含む試料であって、液体状であることが好ましい。そのような生体試料としては、特に制限されないが、例えば、全血、血清、血漿、及び尿などの体液試料があげられる。また、本発明における生体試料は、必要に応じて希釈及び／又は前処理などをされたものであってもよい。本開示に係る検出方法は、当然ながら、上記「生体試料」以外の試料を測定対象とすることができる。例えば、検出対象の生体物質の標準試料、すなわち、測定するためのコントロール試料が挙げられる。　生体物質としては、後述するタンパク質（Ａ）に結合するものであって、例えば、生体内の低分子化合物、分解代謝物、核酸、糖、ペプチド、タンパク質、細胞、又は微生物等が挙げられる。
　［生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）］
　本開示に係る「生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）」としては、一又は複数の実施形態において、生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、及び、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）が挙げられる。
　生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）としては、一又は複数の実施形態において、アポ体では無蛍光性であり、リガンドである生体物質が結合してホロ体となり蛍光性となるタンパク質が挙げられる。前記タンパク質（Ａ１）の一又は複数の実施形態としては、ＵｎａＧタンパク質が挙げられる。また、前記タンパク質（Ａ１）のその他の一又は複数の実施形態としては、ｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、及びｉＲＦＰが挙げられる。
　ＵｎａＧタンパク質は、間接ビリルビンと特異的に結合し、シアン色の励起光により緑色に光る性質を有する（Kumagai et al., Cell 2013, 153, 1602-1611）。ＵｎａＧは間接ビリルビンと極めて高い結合能力（解離定数＝９８ｐＭ）を有する。ＵｎａＧの配列情報は、UniProtKB/Swiss-Prot: P0DM59.1、又は、GenBank: AB763906.1を参照できる(2016年8月時点)。前記タンパク質（Ａ１）としてＵｎａＧタンパク質を用いれば、例えば、間接ビリルビンの検出ができる。
　ｓｍＵＲＦＰは、small ultra red fluorescent proteinの略称であり、ヘモグロビンの代謝物であるビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である（Rodriguez et al., Nature Methods, 2016, 13, 763-769）。
　ＩＦＰは、infrared-fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である（Shu X, et al., Science 2009, 324(5928), 804-8-7）。
　ｉＲＦＰは、near-infrared fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である（Filonov GS, et al., Nat Biotech 2011, 29(8), 757-761）。
　前記タンパク質（Ａ１）としてこれらのｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、又はｉＲＦＰを用いれば、例えば、ビリベルジンの検出ができる。
　前記タンパク質（Ａ１）としては、ＵｎａＧタンパク質又はｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、若しくはｉＲＦＰの改変体であってもよい。ＵｎａＧタンパク質又はｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、若しくはｉＲＦＰの改変体としては、リガンドであるビリルビン又はビリベルジンが結合してホロ体となり蛍光性となる特性を維持できる範囲で、欠失、付加、置換等の変異がされていてもよい。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１～４、１～３、１～２、又は１個が挙げられ、あるいは、少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の同一性を示すアミノ酸配列の範囲が挙げられる。変異の限定されない例として、融合タンパク質（Ｃ）におけるタンパク質（Ｂ）との融合部分（Ｃ末又はＮ末）の欠失が挙げられる。
　自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）は、該自家蛍光分子を結合することで蛍光性となるタンパク質をいう。前記自家蛍光分子としては、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられる。自家蛍光分子（ＦＭＮ）を結合可能なタンパク質（Ａ２）としては、一又は複数の実施形態において、ＦｂＦＰ、ｉＬＯＶタンパク質、及びｍｉｎｉ－ＳＯＧタンパク質が挙げられる。
　ＦｂＦＰは、Flavin mononucleotide (FMN)-based fluorescent proteinの略称であり、バクテリアの青色受容体由来の蛍光タンパク質である（Drepper T., et al., Nat Biotech. 2007, 25(4) 443-445）。
　ｉＬＯＶタンパク質は、植物青色受容体フォトトロピンのlight, oxygen or voltage-sensing (LOV)ドメイン由来の蛍光タンパク質を改変して蛍光特性がインプルーブしたタンパク質である（Chapman S., et al., PNAS 2008, 105(50) 20038-43）。
　ｍｉｎｉ－ＳＯＧタンパク質は、mini Singlet Oxygen Generatorの略称であり、Arabidopsisのフォトトロピン２由来の蛍光タンパク質である（Shu X., et al., PLoS Biol. 2011, 9(4) ）。
　前記タンパク質（Ａ２）は、前記自家蛍光分子を結合しうる範囲で、欠失、付加、又は置換等の変異がされた改変体であってもよい。変異のアミノ酸の数としては、上述の範囲が挙げられる。
　［化学発光タンパク質（Ｂ）］
　化学発光タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーによりタンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである。このような化学発光タンパク質（Ｂ）が融合した融合タンパク質（Ｃ）を検出試薬として使用することから、本開示に係る検出方法によれば、観察のための励起光源を使用することなく、生体物質の定量的な測定を行うことができる。化学発光タンパク質（Ｂ）としては、共鳴エネルギー移動により前記タンパク質（Ａ）の蛍光を励起できる共鳴エネルギー移動のドナーとなりえる発光タンパク質（ルシフェラーゼ）が挙げられる。発光色によって検出を判定できる点からは、前記タンパク質（Ａ）の発光色と、前記タンパク質（Ｂ）の発光色とは異なることが好ましい。
　前記共鳴エネルギー移動は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）あるいは生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）として知られている。該タンパク質（Ｂ）は、前記タンパク質（Ａ１）の吸収波長、又は、前記タンパク質（Ａ２）に結合する自家蛍光分子の吸収波長に応じて選択できる。該タンパク質（Ｂ）としては、公知の発光タンパク質、例えば、ホタルルシフェラーゼ、イクオリン、バクテリアルシフェラーゼ、及びこれらの改変体が挙げられる。
　前記タンパク質（Ａ）がＵｎａＧの場合、前記タンパク質（Ｂ）としては、一又は複数の実施形態において、セレンテラジン化合物を発光基質とするルシフェラーゼが挙げられる。該ルシフェラーゼの一又は複数の実施形態として、ＮＬｕｃが挙げられる。
　前記タンパク質（Ｂ）は、公知のルシフェラーゼの改変体であってもよい。ルシフェラーゼの改変体としては、ルシフェリンが結合して発光する特性を維持できる範囲で、欠失、付加、又は置換等の変異がされていてもよい。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１～４、１～３、１～２、又は１個が挙げられ、あるいは、少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の同一性を示すアミノ酸配列の範囲が挙げられる。変異の限定されない例として、融合タンパク質（Ｃ）におけるタンパク質（Ａ）との融合部分（Ｃ末又はＮ末）の欠失が挙げられる。
　［リンカー］
　前記融合タンパク質（Ｃ）において、前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、リンカーで結合されていてもよい。該リンカーは前記タンパク質（Ｂ）から前記タンパク質（Ａ）への共鳴エネルギー移動の効率が高くなるように選択されうる。該リンカーの長さとしては、一又は複数の実施形態において、１～１０、１～５、２～４又は２～３アミノ酸残基が挙げられる。
　前記タンパク質（Ａ）がＵｎａＧの場合、リンカーとしては、一又は複数の実施形態において、ＧＴ、ＤＤ、ＧＴＧ、又はＧＴＧＧ等が挙げられ、これらの中でも発光効率の点から、ＤＤ、ＧＴＧ、又はＧＴＧＧが好ましく、ＧＴＧがより好ましい。
　前記融合タンパク質（Ｃ）における前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）との融合の順番は特に限定されず、Ｎ末側が前記タンパク質（Ａ）であってもよく、前記タンパク質（Ｂ）であってもよい。前記融合タンパク質（Ｃ）は、一又は複数の実施形態において、Ｎ末又はＣ末にタグタンパク質が融合されてもよい。
　前記融合タンパク質（Ｃ）は上述した構成を備えるため、前記タンパク質（Ａ）の基質である生体物質と前記タンパク質（Ｂ）の基質であるルシフェリンが共に存在する場合には前記タンパク質（Ａ）の発光色の傾向を示し、前記タンパク質（Ａ）の基質である生体物質の量が少なくなるほど前記タンパク質（Ｂ）の発光色の傾向が強くなる。よって、前記融合タンパク質（Ｃ）を用いれば、前記生体物質の検出/測定が可能となる。
　［検出方法］
　したがって、本開示に係る検出方法は、試料中の生体物質の検出方法であって、
　前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）、及び、前記化学発光タンパク質（Ｂ）の基質を混合すること、並びに、
　前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである。
　対象の試料に、融合タンパク質（Ｃ）とタンパク質（Ｂ）の基質とを添加すると、試料が発光する。その発光シグナルを指標にタンパク質（Ａ）に結合した生体物質の有無が判別できる。基本的には、該生体物質が存在すれば発光色はタンパク質（Ａ）のものとなり、存在しなければタンパク質（Ｂ）のものとなる。
　本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、室温又は環境温度で行うことができる。前記融合タンパク質（Ｃ）と前記タンパク質（Ｂ）の基質とを混合してから観察するまでの時間としては、一又は複数の実施形態において、数秒から数分程度、又は、数秒から１分程度が挙げられる。本開示に係る検出方法における前記融合タンパク質（Ｃ）としては、上述のものを使用できる。
　また、本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、試料の発光色が、該生体物質の濃度依存的に変化する。該生体物質の濃度が上がるほど、試料の発光色は、タンパク質（Ｂ）の発光色からタンパク質（Ａ）の発光色へと変化する。すなわち、発光シグナルにおけるタンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との発光強度比と生体物質の濃度とを関連付けすることができる。
　したがって、本開示に係る検出方法によれば、試料量に関わらず、発光シグナルから定量的な該生体物質の濃度測定が可能となる。定量的測定を可能とする点からは、試料に添加する融合タンパク質（Ｃ）のモル濃度は、Ｋｄ程度の濃度域にあることが好ましい。
　本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、試料の発光シグナルから生体物質の濃度を定量的に算出する工程を含んでもよい。
　［指示薬］
　本開示は、その他の態様において、融合タンパク質（Ｃ）に関する。
　また、融合タンパク質（Ｃ）は、前記生体物質の化学発光指示薬として使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）を含む化学発光指示薬であって、前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである化学発光指示薬に関する。
　また、前記化学発光指示薬は、本開示に係る検出方法に使用できるから、本開示は、その他の態様において、本開示に係る検出方法に使用するための前記化学発光指示薬、及びその使用に関する。
　前記融合タンパク質（Ｃ）は、一又は複数の実施形態において、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよいし、化学合成により合成したタンパク質であってもよい。遺伝子組み換え技術による組み換えタンパク質の作製としては、一又は複数の実施形態において、融合タンパク質（Ｃ）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて作製する方法、或いは、無細胞系で作製する方法が挙げられる。該融合タンパク質（Ｃ）は、タグタンパク質を利用するなどして精製してもよい。
　［核酸］
　本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質（Ｃ）をコードする核酸に関する。本開示において、核酸は、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡから選択される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びにこれらのＤＮＡの転写生成物が挙げられる。
　［発現カセット］
　本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質（Ｃ）をコードする核酸を含む発現カセットに関する。該発現カセットにおいて、前記核酸は、導入する宿主細胞に応じた発現調節配列が作動的に連結されている。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
　［ベクター］
　本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質（Ｃ）を発現可能なベクターに関する。本開示は、その他の態様において、本開示に係るベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又は発現カセットを有する発現ベクターである。本開示に係るベクターは、発現させたい細胞（宿主）に応じた発現ベクター系を適宜選択して使用できる。本開示に係るベクターに利用できるベクターとしては、限定されない一又は複数の実施形態として、プラスミド、コスミド、ＹＡＣＳ、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、エピソームＥＢＶなど）ベクター及びファージベクターが挙げられる。
　［形質転換体］
　本開示は、一態様において、本開示に係る融合タンパク質（Ｃ）を発現する形質転換体に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又はベクターを有する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸、発現カセット又はベクターを宿主に導入することによって作成することができる。宿主としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び微生物等が挙げられる。
　［判別方法］
　本開示は、その他の態様において、本開示に係る検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質の濃度を判別することを含む、試料中の生体物質の濃度判別方法に関する。
　上述のように、本開示に係る検出方法で得られる発光シグナルにおけるタンパク質（Ａ）と（Ｂ）との発光強度比は、試料中の生体物質の濃度に依存させることができる。よって、検出に使用した融合タンパク質（Ｃ）の情報と発光シグナルとから生体物質の濃度を判別することができる。
　前記発光シグナルデータは、モバイル端末（スマートフォンなど）のカラーカメラなどのカラー検出器で簡便に取り込み、送受信することが可能であるから、簡便に生体物質の濃度を把握することができる。
　本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕　試料中の生体物質の検出方法であって、
　前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）、及び、前記化学発光タンパク質（Ｂ）の基質を混合すること、並びに、
　前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、検出方法。
〔２〕　前記タンパク質（Ａ１）が、ビリルビンを結合した状態で蛍光を発しうるＵｎａＧタンパク質又はその改変体であり、検出対象の生体物質が、ビリルビンである、〔１〕に記載の検出方法。
〔３〕　前記タンパク質（Ａ１）が、ビリベルジンを結合した状態で蛍光を発しうる、ＩＦＰ、ｉＲＦＰ、ｓｍＵＲＦＰ、及びこれらの改変体であり、検出対象の生体物質がビリベルジンである、〔１〕に記載の検出方法。
〔４〕　前記タンパク質（Ａ２）が、フラビンモノヌクレオチドを結合可能な、ＦｂＦＰ、ｉＬＯＶタンパク質、ｍｉｎｉ－ＳＯＧタンパク質、及びこれらの改変体からなる群から選択されるタンパク質であり、検出対象の生体物質がフラビンモノヌクレオチドである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の検出方法。
〔５〕　生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）を含む化学発光指示薬であって、
　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、化学発光指示薬。
〔６〕　〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の検出方法に使用するための、〔５〕に記載の化学発光指示薬。
〔７〕　〔１〕から〔４〕のいずれかで規定された融合タンパク質（Ｃ）を発現可能なベクター又は形質転換体。
〔８〕　〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質の濃度を判別することを含む、試料中の生体物質の濃度判別方法。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
　［実施例１］
　１．融合タンパク質（化学発光指示薬）の遺伝子構築
　野生型UnaGのC末欠損変異体を、N末にBamHI制限酵素部位、C末にKpnI制限酵素部位を付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
　Forward primer: CGCGGATCCGGGTGGTTCTGGTATGG　配列番号１
　Reverse primer0: (CΔ0) GCTGGTACCTTCCGTCGCCCTCCG  配列番号２
　Reverse primer1: (CΔ1) GCTGGTACCCGTCGCCCTCCGGTA  配列番号３
　Reverse primer2: (CΔ2) GCTGGTACCCGCCCTCCGGTAGCT  配列番号４
　Reverse primer3: (CΔ3) GCTGGTACCCCTCCGGTAGCTGCG  配列番号５
　Reverse primer4: (CΔ4) GCTGGTACCCCGGTAGCTGCGCAC  配列番号６
　野生型NLucのN末欠損変異体を、N末にKpnI制限酵素部位、C末にEcoRI制限酵素部位を付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
　Forward primer 1: (NΔ1) GCCGGTACCGTCTTCACACTCGAAGATTTCG　配列番号７
　Forward primer 2: (NΔ4) GCCGGTACCCTCGAAGATTTCGTTGGGGAC  配列番号８
　Forward primer 3: (NΔ5) GCCGGTACCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGC　配列番号９
　Reverse primer: ATGAATTCTTACGCCAGAATGCGTTCGCACAG　配列番号１０
　ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅したDNA断片をフェノール・クロロホルム法により抽出した。UnaGのDNA断片はBamHI及びKpnIにより制限酵素処理した。NLucのDNA断片は、KpnI及びEcoRIで制限酵素処理した。アガロースゲル電気泳動後、ゲルからバンドを切り出したのち精製した(QIAEX2, QIAGEN)。精製した各断片と、BamHI, EcoRIにより制限酵素処理されたpRSETBベクターをライゲーションし、JM109(DE3)株に形質転換後、１０ｃｍディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で３７℃一晩培養した。
　２．スクリーニング
　コロニーの生えた寒天培地を室温に置き、室温近くまで冷ました１％低融点アガロースゲルに最終濃度１０μＭのBilirubinを加えた溶液４ｍＬを加えて、寒天培地上に注ぎ、室温で固めた。次に、ゲルの上から１０μＭ Coelenterazine-h溶液を加え、すぐに暗箱に設置した一眼レフカメラ(Sony α7)により撮影し、コロニーのカラー画像を取得した。RGB画像の緑チャンネル(UnaGの発光)と青チャンネル(NLucの発光)画像からレシオ画像を作成し、レシオ値が高いコロニーをピックアップした。次に、ピックアップしたコロニーを、９６ウェルプレートで、LB培地＋１０μＭ Bilirubin＋１００μｇ／ｍＬ Ampicillinで２３℃、６０時間培養した。培養液に１０μＭ coelenterazineを加え、蛍光分光光度計(FV7000)あるいはプレートリーダーにより化学発光スペクトルを計測した。波長４５０ｎｍで規格化し、波長５２５ｎｍの相対値（レシオ値）をもとにスクリーニングを行った。
　C末欠損変異体UnaGとN末欠損変異体NLucをKpnIサイトで融合させたタンパク質をスクリーニングしたところ、UnaG(CΔ0)とNLuc(NΔ1)との組み合わせ（以下、"UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質"という。）が、最も大きなフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)効率を示した（図１）。このUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質の塩基配列は配列番号１１であり、アミノ酸配列は配列番号１２である。
　３．融合タンパク質のリンカー配列の最適化
　UnaGとNLucのつなぎ目の配列である２残基（GT）を、インバースPCR法によってランダムな配列に置換した。次のプライマーを使用した。
　Forward primer: NNKNNKGTCTTCACACTCGAAGATTTC  配列番号１３
　Reverse primer: TTCCGTCGCCCTCCGGTAGCTG　配列番号１４
　ベクター配列を含む全長を増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、１０ｃｍディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、３７℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記２で記述した方法でスクリーニングした。
　４．融合タンパク質へのリンカー配列の挿入
　UnaGとNLucのつなぎの配列(GT)の後ろに、リンカー配列をインバースPCR法により挿入した。以下のプライマーを使用した。
　Forward primer (G): GGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC　配列番号１５
　Forward primer (GG): GGCGGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC　配列番号１６
　Forward primer (GGS): GGCGGCAGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC　配列番号１７
　Reverse primer: GGTACCTTCCGTCGCCCTC  配列番号１８
　ベクター配列を含む全長をPCRにて増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、１０ｃｍディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、３７℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記２で記述した方法でスクリーニングした。
　ランダム変異挿入によるリンカー配列最適化により、野生型のリンカー配列(GT)に比べ、(DD)配列が大きなFRET効率の変化を示した（図２）。さらに、フレキシブルリンカーを追加した化学発光ビリルビン指示薬のFRET効率を調べたところ、(GTG)配列が最も大きなFRET効率を示した。
　５．タンパク質の精製
　JM109(DE3)株に形質転換したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を、２００ｍＬのLB培地＋1００μｇ／ｍＬ Carvenisillin溶液で、２３℃で６０時間培養した。集菌後、フレンチプレス法により大腸菌を破砕し、Ni-NTAカラム(QIAGEN)を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。さらに、過剰なimidazoleを取り除くために、ゲルろ過カラム(PD-10, GE HealthCare)を用いた。タンパク質濃度はブラッドフォード法により計測した。
　６．凍結乾燥試料の作成
　精製したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質５００μＬを１５ｍＬファルコンチューブに入れ、液体窒素により凍らせた。その後、凍結乾燥装置により、タンパク質溶液の粉末を得た。粉末は室温で保存した。
　７．滴定曲線の計測
　最終濃度５ｎＭのUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質に対し、０．０１ｎＭ，０．０５ｎＭ，０．１ｎＭ，０．５ｎＭ，１ｎＭ，２．５ｎＭ，５ｎＭ，又は１０ｎＭのビリルビン（ＢＲ）溶液及び最終濃度５μＭ　Coelenterazine-hを混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器（PMA-12,浜松ホトニクス製）あるいはプレートリーダーにより計測した。その結果の一例を図３に示す。３回の独立した計測の平均値をプロットし、ヒルの式によりフィッティングを行った。Ｋd値は３．０５ｎＭであった。
　また、凍結乾燥試料作成後、どの程度の期間活性を保つか調べるために、数日ごとに凍結乾燥試料を水に融解したものを室温で保存し、上記７に記述した方法によりビリルビンによるアフィニティーを計測した。その結果、ややアフィニティーは落ちるものの、活性を保つ事が明らかとなった（図４）。
　８．スマートフォンによる測定
　９６マルチウェルプレートに、最終濃度５０ｎＭの融合タンパク質に最終濃度１０ｎＭ，２０ｎＭ，３０ｎＭ，４０ｎＭ，５０ｎＭ，１００ｎＭ，又は２５０ｎＭのビリルビン溶液及び最終濃度５μＭ Coelenterazine-hを混合し、ｉＰｈｏｎｅ(登録商標)６に搭載したアプリ(Manual - Custom exposure camera)を用い、ＩＳＯ１５００，露光時間０．５秒により計測した。
　マルチウェルプレート上に作成した融合タンパク質及び様々な濃度のビリルビン溶液をカラー撮影したところ、ビリルビン濃度依存的に溶液が青色から緑色に変化していく様子を計測することに成功した(図5)。図５に示すように、ビリルビンが０ｎＭのときは化学発光タンパク質の発光色（シアン）である。ビリルビン濃度が増すにつれてＵｎａＧの発光色（緑）に変化した。ＲＧＢを使って色の変化の様子の一例を説明すると、発光色は、0nM（56,133,204）、10nM（79,157,215）、20nM（96,169,209）、30nM（101,164,194）、40nM（119,179,189）、50nM（123,169.156）、100nM（154,187,111）、250nM（158,191,107）であった。
　図５のような相関があれば、発光データ（発光色）からビリルビン濃度が算出できる。
　［実施例２］
　一定濃度のビリルビン・発光基質（Coelenterazine-h）溶液に対し、原液、２倍希釈、４倍希釈又は８倍希釈のUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液を混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器（PMA-12，浜松ホトニクス製）により計測し、得られた発光強度からＵｎａＧの発光波長（５３０ｎｍ）の発光強度とＮＬｕｃの発光波長（４６０ｎｍ）の発光強度とのレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）を算出した。その結果の一例を図６に示す。図６において、図６Ａが化学発光スペクトルを示し、図６ＢがUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液（検出試薬）の希釈率とレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）との関係を示すグラフである。
　［比較例１］
　９６ウェルプレート（黒色）にUnaGタンパク質溶液（８．２５ｎＭ，１６．５ｎＭ，３１．５ｎＭ，６２．５ｎＭ，１２５ｎＭ又は２５０ｎＭ）を５０μＬずつ加え、ついで４００ｎＭビリルビン溶液を５０μＬずつ加えた。マイクロプレートリーダー（SH-9000，corona社製）を用いて４５０ｎｍの波長の励起光を照射後、蛍光スペクトルを取得した。その結果の一例を図７に示す。図７において、図７Ａが蛍光スペクトルを示し、図７ＢがUnaGタンパク質溶液（検出試薬）の濃度とＵｎａＧの発光波長（５３０ｎｍ）の蛍光強度との関係を示すグラフである。
　比較例１では、図７Ａ及びＢに示すように、検出対象であるビリルビンの濃度が同じであるにも関わらず、検出試薬の濃度によって蛍光強度が変化した。つまり、比較例１（UnaGタンパク質を用いた方法）では、定量的な計測はできないといえる。
　これに対し、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を用いて計測した実施例２では、検出試薬の濃度によって発光強度は異なるものの、スペクトルの波形が一定であり（図６Ａ）、図６Ｂに示す通り、検出試薬の濃度にかかわらず同一のビリルビン濃度に対するピークレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）は略同じであった。このため、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を使用することにより、検出試薬の濃度に関わらない測定、つまり定量的な計測が可能であるといえる。
配列番号　１：フォワードプライマー
配列番号　２：リバースプライマー
配列番号　３：リバースプライマー
配列番号　４：リバースプライマー
配列番号　５：リバースプライマー
配列番号　６：リバースプライマー
配列番号　７：フォワードプライマー
配列番号　８：フォワードプライマー
配列番号　９：フォワードプライマー
配列番号１０：リバースプライマー
配列番号１１：UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質の塩基配列
配列番号１２：UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：フォワードプライマー
配列番号１４：リバースプライマー
配列番号１５：フォワードプライマー
配列番号１６：フォワードプライマー
配列番号１７：フォワードプライマー
配列番号１８：リバースプライマー

Claims (8)

  1. 　試料中の生体物質の検出方法であって、
    　前記試料に、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）、及び、前記化学発光タンパク質（Ｂ）の基質を混合すること、並びに、
    　前記試料からの発光シグナルを観察することを含み、
    　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
    　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
    　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、検出方法。
  2. 　前記タンパク質（Ａ１）が、ビリルビンを結合した状態で蛍光を発しうるＵｎａＧタンパク質又はその改変体であり、
    　検出対象の生体物質が、ビリルビンである、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記タンパク質（Ａ１）が、ビリベルジンを結合した状態で蛍光を発しうる、ＩＦＰ、ｉＲＦＰ、ｓｍＵＲＦＰ、及びこれらの改変体からなる群から選択されるタンパク質であり、
    　検出対象の生体物質が、ビリベルジンである、請求項１に記載の検出方法。
  4. 　前記タンパク質（Ａ２）が、フラビンモノヌクレオチドを結合可能な、ＦｂＦＰ、ｉＬＯＶタンパク質、ｍｉｎｉ－ＳＯＧタンパク質、及びこれらの改変体からなる群から選択されるタンパク質であり、
    　検出対象の生体物質が、フラビンモノヌクレオチドである、請求項１に記載の検出方法。
  5. 　生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）を含む化学発光指示薬であって、
    　前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されており、
    　前記タンパク質（Ａ）は、前記生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
    　前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、化学発光指示薬。
  6. 　請求項１から４のいずれかに記載の検出方法に使用するための、請求項５に記載の化学発光指示薬。
  7. 　請求項１から４のいずれかで規定された融合タンパク質（Ｃ）を発現可能なベクター又は形質転換体。
  8. 　請求項１から４のいずれかに記載の検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の生体物質の濃度を判別することを含む、試料中の生体物質の濃度判別方法。
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