JP2020076673A - 蛍光プローブ及びそのプローブを用いた迅速蛍光測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
蛍光タンパク質には、特定の波長で励起することにより、赤色、緑色、青色、白色等、種々の蛍光を発するものがあり、目的に応じて使い分けられている。
そして、FlAsHといった蛍光標識テクノロジーも開発されている(非特許文献2、以下、「従来技術2」という。)。これらの技術的特徴は、ペプチドアプタマーと有機色素という低分子同士を結合させると、蛍光特性が変化するという点にある。
従来技術1は、明るい赤色の蛍光を発し抗体及びタンパク質と結合する蛍光標識剤であり、初期の発色は鮮やかであるものの、バッファー中での光安定性や褪色性の点でやや不足があった。一方、従来技術2は、部位特異的なタンパク質標識に二砒素試薬を使用して標識するという二砒素標識テクノロジーを応用し、チオール結合部位競合物としてβ−メルカプトエタノールを使用し、染色効率を向上させたという点では優れた発明である。しかし、細胞内に毒性の高いヒ素が蓄積されるという問題があった。
このため、発光するまでの時間をできる限り短くするとともに、毒性のない化合物を用いて、リアルタイムでの観察が行えるようにすることについて、強い社会的要請があった。
すなわち、蛍光消光団として働く色素と結合することにより蛍光特性を変化させるペプチドアプタマーの取得による新規蛍光プローブに対する強い社会的要請があった。
本発明の第1の態様は、上記表1に示す配列を有するぺプチドアプタマーであって、蛍光消光団として働く色素と結合したときに蛍光を増強する、蛍光プローブである。ここで、「蛍光プローブ」とは、「観測対象分子と特異的に反応するか、又は相互作用し、蛍光特性が大きく変化する機能性分子」をいう。
一般的には、蛍光団に結合している消光団を酵素的に分離させることによって、蛍光を増強させる(J. Am. Chem. Soc., 137 4759)。
上記のキットを使用する場合には、0.5〜1μLの20 X Translation Mix minus-Met、0.5〜1μLの20 X Translation Mix minus-Leu、及び15〜20μLのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッティングして混合する。
上記翻訳反応後に、連結体Aと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に15〜25μLの2〜4Mの塩化カリウム、及び4〜8μLの0.5〜2Mの塩化マグネシウムを加え37℃にて30〜50分間反応させる。
引き続き、適当な酵素、例えば、RNase T1、を用いて、約35〜38℃にて、10分間反応させ、cDNAが連結された連結体(cDNAディスプレイ)を磁性ビーズから遊離させる。
ここで使用する蛍光分子としては、フルオレセイン、GFP等を挙げることができる。
以上のようにして、本発明のペプチドアプタマーを製造することができる。
スクリーニング用リンカーを、PEGスペーサー、切断用のrG又はイノシン、dTビーズでの精製用のPolyA等を含まない必要最低限の構造となるように設計し(配列番号3)、化学合成はつくばオリゴサービス(株)に委託した。必要最低限の構造となっている点で、従来のリンカーとは構造的に大きく相違するものとなっている。
下記の配列中、Bはビオチン‐トリエチレングリコールを、Kは3-シアノビニルカルバゾールを、Pはピューロマイシンを、FはFITC-dTをそれぞれ表す。このリンカーの構造を図1に模式的に示す。
5’-(B)AAAAATT(F)TCCAKGCCGCCCCCCGTCCTCCP-3’
(1)Trp固定ライブラリの構築
鋳型DNA作製用に、下記のDNAフラグメントを使用した。
5’- GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGGAAGTAT TTTTACAACA ATTACCAACA ACAACAACAA ACAACAACAA CATTACATTT TACATTCTAC AACTACAAGC CACCATGGGC GGTGGCAGTA AAGTTATCCT ATTTGAGGGT CCAGCTGGAN NBNNBNNBNN BNNBNNBNNB TGGNNBNNBN NBNNBNNBNN BNNBGGTGCT CCAGGAAGCA AGGTCATATT ATTCGAAGGG GGAGGCAGCC ATCATCATCA TCATCACGGC GGAAGCAGGA CGGGGGGCGG CGTGGAAA -3’
まず、プライマーとして、T7 omega new及びΩnew-SKとを用いて、エクステンションPCRを行い、PCR産物1を得た。次いで、プライマーとしてSKVILFE-ランダム-Trp-ランダム-SK及びGAPG-SKVILFE-GGGS-His(Ytag cnvK)とを用いて、エクステンションPCRを行い、PCR産物2を得た。上記PCR産物1及び2を常法に従って精製し、これらを鋳型として、さらにエクステンションPCRを行い、PCR産物3を得た。
PCR産物3を常法に従って精製した後に、精製PCR産物3を鋳型とし、プライマーとしてNewleft及びPolyA&cnvK-Linker用NewYtagを用いてPCRを行い、PCR産物4を得た。
PCR産物4を精製し、DNAコンストラクトとして使用した。
上記のようにして得られたDNAコンストラクトを、RiboMAX Large Scale RNA Production Systemsを用いてmRNAに転写した。下記表5にバッファー組成を示す。
また各ラウンドで転写に用いたDNAテンプレートの量は下記表6に示す通りとした。なお、上記表5に示す反応組成中のxは、使用したDNAテンプレートの量に応じて変更した。
RNAとcnvK Linkerとを光架橋によって連結した。反応溶液の組成および手順は下記表7に示すとおりとした。なおmRNAとcnvK Linkerの比率は5:4とした。
上記mRNA-Linker連結体を、無細胞翻訳系で翻訳し、mRNA-ペプチド連結体を形成した。下記表8に反応溶液の組成と手順とを示す。
また、この後、別のチューブに、60μLのDynabeads MyOne Streptavidin C1を入れ、6 pmol のmRNA-ペプチド連結体を加えた。次に、Dynabeads MyOne Streptavidin C1の入ったチューブを磁気スタンドに静置し、上清を捨てた。その後、1 x 結合バッファーを100μL加え、ビーズを再懸濁させて上清を捨てた(洗浄)。洗浄を終えたDynabeads MyOne Streptavidin C1にmRNA-ペプチド連結体を加え、25℃にてローターで撹拌しながら30分間反応させ、mRNA-ペプチド連結体とDynabeads MyOne Streptavidin C1とを、結合させた。
以上のようにして得られたmRNA-ペプチド連結体を結合したDynabeads MyOne Streptavidin C1を磁気スタンドに静置して上清を捨て、200μL の1 x 結合バッファーを加えて再懸濁させ、その後、再び磁気スタンドに静置して上清を捨てた(Dynabeads MyOne Streptavidin C1の洗浄)。この洗浄をさらに2回行った。
次に、100μL の1 x ReverTra バッファーで同様に洗浄を1回行い、上清を捨てた。ここに、下記表9に示す組成の反応溶液を加え、42℃にてローターで撹拌しながら30 分間インキュベートした。
次にHis-タグによる精製を行なった。なお、後述するセレクションの1stラウンドでは、His-タグ精製は行わなかった。
まず、逆転写用とは異なるチューブにHis Mag セファロース Niを20μL入れ、磁気スタンド状に静置して上清を捨てた。その後、1 x His-タグ結合バッファー 100μLで洗浄した。洗浄の際の上清を捨て、予めインキュベートしておいたcDNA ディスプレイ分子をこのチューブに40μL加えて、25℃にてローターで撹拌しながら1 時間反応させた。
反応が終了後、このチューブを磁気スタンド上に静置して上清を捨てた。その後、1 x His-タグ洗浄バッファー 100μLを加えて再懸濁し、その後、磁気スタンド上に静置して上清を捨てた。次に、1 x His-タグ溶出バッファー 40μLを加え、25℃でローターを使用して15 分間インキュベートした。インキュベーション終了後、磁気スタンドにこのチューブを静置して上清を回収した。
2ラウンド以降は、各ラウンドで使用する固定担体(セレクション前にQSY9を固定化していない)に、cDNA ディスプレイ分子を30分間(〜3ラウンド目まで)または60分間(4ラウンド目以降)インキュベートし、フロースルー画分を回収してセレクションを行った。
(9−1)カラムを用いたセレクション
まず、1 x セレクションバッファーで、QSY9を固定化してあるEAH セファロース4Bをチューブ内で3回洗浄した。その後、cDNA ディスプレイ分子をこのチューブに加え、室温で1 時間インキュベートした。インキュベート中は、20 分ごとにタッピングを行った。その後、QSY9と結合しなかったであろうcDNA ディスプレイ分子を含む溶液をフロースルー画分として回収した。
まず、QSY9を固定化してある磁性ビーズを1 x セレクションバッファーで3回洗浄した。その後、cDNA ディスプレイ分子を加え、室温で1 時間、ローテーターにてインキュベートした。その後、QSY9と結合しなかったであろうcDNA ディスプレイ分子を含む溶液をフロースルー画分として回収した。
下記表9に示す各ラウンドの産物について、セレクションの結果を確認した。
上記表9に示す溶出画分についてエタノール沈殿を行った。得られたエタノール沈殿物を鋳型とし、プライマーとしてT7 omega new及びPolyA&cnvK-Linker用NewYtagを用いてPCRを行った。得られたPCR産物を、4% PAGEに供してセレクション結果を確認した。
上記(10-1)と同様に、各溶出画分についてエタノール沈殿を行い、得られたエタノールノーツ沈殿物を鋳型とし、プライマーとしてqPCR-SKV及びPolyA&cnvK-Linker用NewYtagを用いてqPCRを行い、セレクション結果を確認した。7ラウンド後のDNAライブラリについては、次世代シーケンサーを用いて配列の解析を行った。
上記表9に示すように、7ラウンドまではアフィニティによるセレクションを行った。アフィニティセレクションによって得られたライブラリから得られた次世代シーケンスの結果に基づいて、上位10個のペプチド配列についてプルダウンアッセイを行ない、QSY9との結合能の評価を行った。
プルダウンアッセイの結果より得られた二つのペプチドの配列は次の通りであった。
次いで、上記2つのペプチドとQSY9とをインキュベートし、蛍光分光光度計により蛍光強度の変化を観察した。ペプチドの濃度はいずれも10μM、QSY9の濃度は1μMとし、室温で1時間インキュベートした後に測定した。
その後、励起光560 nmで蛍光スペクトルを測定し、ピークの見られた604 nmでの蛍光強度比を求めた。次に、FAPA-4について、1μM、10μM、又は100μMの濃度で、10μMのQSY9と室温で1時間インキュベートし、励起光560 nmで蛍光スペクトルを測定し、ピークの見られた596 nmでの蛍光強度比を求めた。その結果100μMのFEPA-4とインキュベートさせた場合には2.1倍の蛍光の増強が確認された。
また、その後アフィニティセレクションにより得られたDNAライブラリを次世代シーケンサーにより解析を行った結果、最大で10%の重複が確認できQSY9 と結合する可能性のあるペプチド配列が得られたと考えられた。
Claims (6)
- 所定の配列を有するぺプチドアプタマーであって、蛍光消光団として働く色素と結合したときに、目的タンパク質に結合した蛍光団の蛍光を増強する、蛍光プローブ。
- 前記所定の配列は、下記の配列番号1又は2に示すであることを特徴とする、請求項1に記載の蛍光プローブ。
(配列番号1)
SKVILFEGPAGWLDIQFTWIMWNPVVGAPGSKVILFE
(配列番号2)
SKVILFEGPAGVLRIWFLWILPCPFKGAPGSKVILFE - 前記蛍光消光団として働く色素は、非蛍光性有機色素であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の蛍光プローブ。
- 前記非蛍光性有機色素は、QSY9であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の蛍光プローブ。
- 蛍光消光団として働く色素を、蛍光団で標識した目的タンパク質と結合させて色素結合タンパク質を作製する色素結合タンパク質作製工程と;
請求項1〜4のいずれかに記載のペプチドアプタマーを、前記色素結合タンパク質作製工程で得られた色素結合タンパク質と結合させ、蛍光を直ちに増強させる蛍光増強工程と;
前記増強された蛍光を測定する蛍光測定工程と;
を備える、迅速蛍光測定方法。 - 前記所定の配列は、下記の配列番号1又は2に示すであることを特徴とする、請求項5に記載の迅速蛍光測定方法。
(配列番号1)
SKVILFEGPAGWLDIQFTWIMWNPVVGAPGSKVILFE
(配列番号2)
SKVILFEGPAGVLRIWFLWILPCPFKGAPGSKVILFE
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