CN109628456B - 特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体 - Google Patents

特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学技术领域。本发明提供了利用全细菌SELEX技术（whole bacteria‑SELEX）筛选粪肠球菌适配体的方法，得到35条粪肠球菌特异性适配体序列，并从中优选出Apt10、Apt21、Apt29、Apt34四条与粪肠球菌具有高亲和力的ssDNA适配体序列，可以特异性地和粪肠球菌结合，为粪肠球菌的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰的高特异性检测识别元件。

Description

特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体
技术领域
本发明涉及特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，具体涉及对粪肠球菌特异性的新型识别元件ssDNA适配体的筛选，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学技术领域。
背景技术
肠球菌（Enterococcus）是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌，其致病机理主要是通过分泌细胞溶解素、明胶酶等毒性物质侵袭破坏宿主组织细胞，并耐受宿主的非特异性免疫应答，从而引起感染性疾病的发生与发展。随着抗生素的广泛使用，肠球菌的多重耐药性不断增强，特别是耐万古霉素的肠球菌的出现，使肠球菌感染成为重要的公共卫生问题。据2010年中国CHINET细菌耐药监测网显示，肠球菌在尿路感染中所占比例仅次于大肠埃希菌，而在血流感染中居第三位。临床感染的肠球菌以粪肠球菌和屎肠球菌为主，其中粪肠球菌（Enterococcus faecalis）最为多见，约45%~65%。目前，常规的粪肠球菌检测方法主要分为四大类，即微生物学检测法、分子生物学方法、免疫学方法和仪器分析法。然而，这些方法存在灵敏度低、成本高、耗时长、操作繁琐等缺点，不能很好地实现粪肠球菌的快速检测。因此，建立一种高灵敏度、快速检测粪肠球菌的方法是十分必要的。
指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX）是近年来新建立的一种体外筛选技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有1013~1015个不同基元的初始文库中，经过数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。SELEX可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如：靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研究领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。
发明内容
本发明的目的是通过whole bacteria-SELEX技术，筛选得到能特异性识别和结合粪肠球菌的ssDNA适配体，该适配体是粪肠球菌的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。
本发明的技术方案，特异性结合粪肠球菌的ssDNA适配体，选自序列表Apt1~Apt35所示序列的一种或多种，包括含有Apt1~Apt35所述序列的ssDNA。
其中，序列表Apt1~Apt35在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3’。其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
在序列表中，优选序列Apt10、Apt21、Apt29和Apt34所示的序列。具体如下：
Apt10: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCAAGGTCA CATAGTGCAC TCTATGTGAGTACCCTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
Apt21: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTTGAAATC GCACAAGTTC CGTCCTCTCTACGACTCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
Apt29: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCGTCGTCC AAGCATTGCT CAAAAGGAACCGTAGTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
Apt34: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTTGCAGC GACAGCCCGG TTTTATGTTTGTAAGTGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’。
根据序列表Apt1~Apt35所述的适配体，其能被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基等所修饰。
用于粪肠球菌检测的组合物、试剂盒和芯片，其中含有序列表Apt1~Apt35中任一项的适配体。
筛选特异性结合粪肠球菌ssDNA适配体的whole bacteria-SELEX技术是采用文库与菌株孵育结合后，热变性并离心的方法，结合PCR扩增技术，在链霉亲和素-生物素的作用下，以指数的方式富集与粪肠球菌特异性结合的寡核苷酸（图1），包括步骤（a）-（j）：
a、筛选文库：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3’，其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基；
引物：
引物I-1：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3’；
引物I-2：5’-FAM-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3’；
引物II-1：5’-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3’；
引物II-2：5’-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3’。
b、粪肠球菌溶液：1×108 cfu/mL；
c、链霉亲和素磁珠：粒径1-2µm，浓度为5mg·mL-1；
d、使步骤a中的ssDNA文库与步骤b中的粪肠球菌溶液在适宜的条件下孵育；所述适宜条件包括37℃，作用时间45min，结合缓冲液（BB）成分为50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH7.4），5mmol·L-1 KCl，100mmol·L-1 NaCl，1mmol·L-1 MgCl2·H2O；
e、通过热变性、离心收集经步骤d处理的与步骤b中粪肠球菌结合的ssDNA序列；
f、采用引物I-1和引物II-2对步骤e的文库成员进行PCR扩增；
g、链霉亲和素磁珠法制备ssDNA次级文库：步骤c中的链霉亲和素磁珠经PBS（94.7mmol·L-1 Na2HPO4·12H2O，5.3mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O，1.54 mmol·L-1 NaCl，pH8.0）洗涤后加入步骤f中所得的生物素标记的PCR产物，室温结合2h（轻微震荡），磁性分离弃上清、经PBS缓冲液冲洗，洗去未结合到磁珠上的dsDNA。向上述混合物中加入NaOH溶液，37℃孵育2h，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链DNA，即为下一轮筛选的次级文库；
h、收集步骤e或步骤g中与步骤b特异性结合的文库成员；
i、重复步骤d～g，重复次数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次，优选重复12次；
j、对步骤h获得的最终文库成员进行确定，优选序列测定。
本发明的有益效果：本发明采用whole bacteria-SELEX技术，筛选得到与粪肠球菌高特异结合的ssDNA适配体，方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟粪肠球菌结合，为粪肠球菌的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰的高特异性检测识别元件。
附图说明
图1 基于whole bacteria-SELEX技术筛选粪肠球菌适配体的原理图。
图2 SELEX筛选过程中结合粪肠球菌的ssDNA文库的荧光强度。
图3-A 测定适配体序列Apt10的 Kd值的拟合曲线图。
图3-B测定适配体序列Apt21的 Kd值的拟合曲线图。
图3-C测定适配体序列Apt29的 Kd值的拟合曲线图。
图3-D测定适配体序列Apt34的 Kd值的拟合曲线图。
具体实施方式
实施例1 核酸适配体的体外筛选
a、随机单链DNA文库与引物合成：构建长度为79 nt的随机ssDNA文库，其两端为固定引物序列，中间为随机序列，其中N代表碱基A、T、C、G中任一个，序列为：5’-TAGGGAATTCGTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3’。
引物：
引物I-1：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3’；
引物I-2：5’-FAM-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3’；
引物II-1：5’-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3’；
引物II-2：5’-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3’。
b、核酸适配体的体外筛选：为筛选出与粪肠球菌有高亲和力和高特异性的ssDNA适配体，共进行了12轮筛选，每一轮筛选获得的次级文库与粪肠球菌结合的ssDNA的荧光强度如图2所示。
Whole bacteria-SELEX技术筛选粪肠球菌适配体的具体流程为：将粪肠球菌在液体培养基中， 37℃、220 r·min-1摇床培养至对数生长期（OD600=0.3），收集菌液1 mL，3500r·min-1、4℃离心5 min，弃上清，用BB清洗两次，去除培养基。同时，对ssDNA文库进行预处理，即95℃热变性10 min，立即冰浴10 min。第一轮筛选时，反应体系为600 μL，缓冲液为BB，随机ssDNA文库的投入量为2 nmol，粪肠球菌投入量为108 cfu/mL。ssDNA文库与粪肠球菌37℃、180 r·min-1孵育1h后，将其在4℃，3500 r·min-1条件下离心5 min，弃上清。复合物用含0.2% BSA的BB清洗2次后，重悬于100 μL ddH2O中，95℃热变性10 min，立即冰浴10min，解离与细胞紧密结合的适配体，8000 r·min-1，4℃离心5 min，上清即为该轮筛选的产物。从第二轮开始，每轮次级文库的投入量为100 pmol，孵育体系调整为350 μL。为了获得高特异性的适配体，从第八轮开始，连续分别采用大肠杆菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对得到的次级文库进行反向筛选。
c、以次级文库为模板，用引物I-1和引物II-2进行PCR扩增，核酸电泳进行验证。25μL的PCR扩增体系如表1所示。
表1
Figure 912686DEST_PATH_IMAGE001
扩增条件：95℃，预变性5 min；95℃，变性30 s；57.6℃，退火30 s；72℃，延伸15s；72℃，延伸5 min；12~30个循环。
d、制备次级文库：取350 μL链霉亲和素磁珠液，经PBS（94.7 mmol·L-1 Na2HPO4·12H2O, 5.3 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O, 1.54 mmol·L-1 NaCl, pH 8.0）洗涤后加入生物素标记的PCR产物160 pmol，并用PBS将体系补足到400 μL，220 r·min-1、28.5℃孵育2 h。磁性分离弃上清，经PBS洗涤4次后，加入现配的50 μL 0.1 M NaOH，37℃孵育2 h，磁性分离取上清即为ssDNA次级文库，用于下一轮筛选。
e、筛选次数的确定：筛选得到的ssDNA次级文库用引物I-2和II-2进行PCR扩增，扩增产物通过链霉亲和素磁珠法获得FAM标记的ssDNA次级文库。将100 pmol ssDNA文库与1x 108 cfu/mL的粪肠球菌在500 μL BB中，37℃、180 r·min-1孵育45 min，3500 r·min-1、4℃离心5 min，弃上清，重复洗涤3次。将ssDNA-粪肠球菌混合物重悬于100 μL ddH2O中，95℃热变性10 min，立即冰浴10 min，8000 r·min-1，4℃离心5 min，重复三次，最后将三次离心所得上清液置于96孔板中，用多功能酶标仪（激发波长494 nm，发射波长520 nm）测其荧光强度。评价各轮筛选的次级文库与粪肠球菌的结合能力。
f、下一轮筛选根据上面的筛选方法重复进行，重复12次。如图2所示，随着筛选轮数的增加，筛选产物出现了明显的富集，且富集现象在第九轮达到顶峰。由于反向筛选的进行，从第十轮开始与粪肠球菌结合的ssDNA文库的荧光强度略微下降，但ssDNA文库的特异性得到了进一步提高，因此选择第十二轮的ssDNA次级文库进行后续实验。
实施例2. 筛选得到的ssDNA文库克隆、测序、结构分析
经过12轮筛选得到的ssDNA文库，用I-1和II-1进行PCR扩增，扩增产物全量上样于3%琼脂糖凝胶，并对其进行回收。用7 μL纯化的PCR产物与1 μL pMD-19T载体混合均匀，在T4连接酶的作用下16℃连接12-14 h，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃过夜培养。随机挑取39个阳性克隆子转接到液体LB培养基中，培养12 h，用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒测序得到Apt1~ Apt35的35条不同的适配体序列。
实施例3. 荧光分析法测定适配体序列的解离常数Kd值
运用荧光分析法来测定候选适配体的解离常数（Kd），具体方法为：取不同浓度梯度的FAM标记的适配体（0~1500 nmol·L-1）与固定浓度的粪肠球菌（108 cfu/mL）37℃、180r·min-1孵育45min后，3500 r·min-1离心5min，弃上清，用BB清洗三次后重悬于100 μLddH2O中，95℃热变性10 min，立即冰浴10 min，8000 r·min-1，4℃离心5 min，重复三次，最后将三次离心所得上清液置于96孔板中，用多功能酶标仪测定其荧光强度。在实验过程中，荧光标记的单链DNA文库被用作控制非特异性结合。根据测量得到的荧光强度，利用GraphPad Prism 5.0软件进行非线性回归分析，根据公式：Y=Bmax×X/ ( Kd+X )计算出Kd值（Bmax为最大结合位点的数目，X为适配体浓度，Y为荧光强度）。图3是Apt10、Apt21、Apt29、Apt34与粪肠球菌的结合饱和曲线，解离常数（Kd）分别为829.5±170.4 nmol·L-1， 549.2±147.4 nmol·L-1，614.3±121.9 nmol·L-1和988.0±208.7 nmol·L-1。
序列表
<110> 江南大学
<120> 特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体
<141> 2019-01-25
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 22
tagggaattc gtcgacggat ccatttccac attagaacgt acaatagtcc gtcggaactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 23
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 23
tagggaattc gtcgacggat cccagctgcc cgcattcgaa tctagattta aatccaactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 24
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 24
tagggaattc gtcgacggat ccatataccc tggagggaac cccgtcacat tcataaactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 25
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 25
tagggaattc gtcgacggat ccggtccaga atgacggaac agaataggtc taggcgtctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 26
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 26
tagggaattc gtcgacggat ccttcttgac actgagtgta acgttcaaac ggttgcactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 27
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 27
tagggaattc gtcgacggat ccaaaacccg actcgctcat ttgatactca tcatttactg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 28
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 28
tagggaattc gtcgacggat cctgtatatg caacgtctcc gctctggtac tttgtatctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 29
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 29
tagggaattc gtcgacggat cccgtcgtcc aagcattgct caaaaggaac cgtagttctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 30
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 30
tagggaattc gtcgacggat ccgaccaaaa acccgttgga ccaagttttt gacgtttctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 31
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 31
tagggaattc gtcgacggat cccagattga attggtgacc ggatcaatta tagttatctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 32
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 32
tagggaattc gtcgacggat ccatcagctg gtcttttatc attcggatcg aacgattctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 33
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
tagggaattc gtcgacggat ccagtgatgg tcatcctcaa ttctccctct ttccgttctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 34
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
tagggaattc gtcgacggat ccgttgcagc gacagcccgg ttttatgttt gtaagtgctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79
<210> 35
<211> 79
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 35
tagggaattc gtcgacggat ccctacctct cttagcttta caatggttgt aatcctcctg 60
caggtcgacg catgcgccg 79

Claims (5)

1.特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于：所述的ssDNA适配体序列为Apt10、Apt21、Apt29或Apt34；
Apt10: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCAAGGTCA CATAGTGCAC TCTATGTGAGTACCCTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
Apt21: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCTTGAAATC GCACAAGTTC CGTCCTCTCTACGACTCCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
Apt29: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCCGTCGTCC AAGCATTGCT CAAAAGGAACCGTAGTTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
Apt34: 5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGTTGCAGC GACAGCCCGG TTTTATGTTTGTAAGTGCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’。
2.根据权利要求1所述特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于：所述ssDNA适配体能被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
3.用于粪肠球菌检测的组合物、试剂盒或芯片，其特征在于：其中含有权利要求1所述的ssDNA适配体。
4.根据权利要求1所述特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于：其筛选时采用PCR扩增，引物如下：
引物I-1：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3’；
引物I-2：5’-FAM-TAGGGAATTC GTCGACGGAT-3’；
引物II-1：5’-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3’；
引物II-2：5’-biotin-CGGCGCATGC GTCGACCTG-3’。
5.根据权利要求4所述特异性识别粪肠球菌的ssDNA适配体，其特征在于：其采用wholebacteria-SELEX进行适配体筛选。
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