JPWO2018143106A1 - デバイス、及びそれを用いた判定システム - Google Patents

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Abstract

操作性及び可搬性に優れるデバイス及びそれを用いた判定システムの提供。化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有し、前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に試料を供給すると、前記化学発光指示薬と前記基質とが反応可能なように前記試薬部に独立して配置されているデバイスに関する。また、該デバイスに試薬を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、前記撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含み、前記撮像端末と前記情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能である、遠隔地診断システムに関する。

Description

本開示は、デバイス、及びそれを用いた判定システムに関する。
近年、生体物質に限られず、食品に含まれる物質や化学物質等を簡便に分析する方法が求められている。これらの物質を測定する方法の一例として、比色定量法がある（例えば、非特許文献１及び２等）。
吉田俊彦ら、モダンメディア ５９巻５号２０１３［医学検査のあゆみ］１１９−１２４ 山田隆、ぶんせきＮｏ．４ ２９６−３０１（１９９７）
比色定量法の場合、測定を行うには特別な測定装置で行う必要がある場合がある。このため、
特別な装置を使用することなく、ユーザー自身が容易に測定可能な新たな手段が求められている。
本開示は、一態様において、操作性及び可搬性に優れるデバイス及びそれを用いた判定システムを提供する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有し、前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に独立して配置されているデバイスに関する。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスに試薬を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、前記撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含み、前記撮像端末と前記情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能である、判定システムに関する。
本開示によれば、一態様において、操作性及び可搬性に優れるデバイス及びそれを用いた判定システムを提供できる。
図１は、本開示のデバイスにおける化学発光指示薬及び該指示薬の発光基質の配置（パターニング）の例を示す概略図である。 図２は、Ｃ末／Ｎ末欠損変異した様々なＵｎａＧとＮＬｕｃとの融合タンパク質の化学発光スペクトルを示す。ＵｎａＧ（ＣΔ０）＋ＮＬｕｃ（ＮΔ１）が最も大きなＦＲＥＴ効率を示した。 図３は、リンカー配列に様々な変異を挿入した際の化学発光スペクトルを示す。野生型化学発光ビリルビン指示薬の配列（ＧＴ）に比べ、ＤＤ配列に置換された変異体が最も大きなＦＲＥＴ効率変化を示した。 図４は、野生型化学発光ビリルビン指示薬の滴定曲線を示す。３回の独立した計測の平均値をプロットし、ヒルの式によりフィッティングを行った。Ｋd値は３．０５ｎＭであった。 図５は、室温で保存された凍結乾燥試料の、ビリルビンに対するアフィニティー（乖離定数、Ｋd値）の変化を示す。 図６は、スマートフォンで撮影した、野生型化学発光ビリルビン指示薬とさまざまな濃度のビリルビン溶液の、９６ウェルプレート上での化学発光像を示す。 図７Ａ及びＢは、ビリルビン溶液を滴下したデバイスをカメラで撮影した化学発光像を示し、図７Ａは、カラーカメラで撮影した化学発光像を示し、図７Ｂは、スマートフォンのカメラで撮影した化学発光像を示す。 図８は、実施例２におけるＵｎａＧ（ＣΔ０）−ＮＬｕｃ（ＮΔ１）融合タンパク質によるビリルビン測定の結果の一例を示し、図８Ａは化学発光スペクトルを示し、図８ＢはＵｎａＧ（ＣΔ０）−ＮＬｕｃ（ＮΔ１）融合タンパク質溶液（検出試薬）の希釈率と発光強度から得られたピークのレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）との関係を示すグラフである。 図９は、比較例１におけるＵｎａＧタンパク質によるビリルビン測定の結果の一例を示し、図９Ａは蛍光スペクトルを示し、図９ＢはＵｎａＧタンパク質溶液（検出試薬）の濃度とピーク（５３０ｎｍ）の蛍光強度との関係を示すグラフである。
本開示は、試料を滴下した場合に、化学発光指示薬と該化学発光指示薬の発光基質とが反応するようにこれらを配置したデバイスを使用することで、測定のための励起光源や特別な装置を使用しなくても、ユーザー自身が容易に試料中の物質の測定を行うことができる、という知見に基づく。
本開示は、物質と結合して蛍光を発するタンパク質に、共鳴エネルギー移動が起こりうるように化学発光タンパク質を融合させた化学発光指示薬を使用することで、測定のための励起光源や特別な装置を使用しない場合であっても、ユーザー自身が容易に物質の測定を行うことができる、という知見に基づく。
本開示は、上記化学発光指示薬を用いて得られる化学発光が、モバイル端末（スマートフォンやタブレット端末等）やデジタルカメラ等のユーザー自身が所持する撮像手段によって検出でき、それを、通信回線を用いて検査機関等に送信したり、モバイル端末のアプリケーションに送ることによって、迅速な測定、判定又は診断等が可能になるという知見に基づく。
［デバイス］
本開示に係るデバイスは、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有する。
試薬部には、化学発光指示薬と該化学発光指示薬の発光基質とが少なくとも配置されている。
化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、分析物質と結合又は作用することによって発光シグナルを発生する指示薬が挙げられる。化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、分析物質と結合又は作用することによって発光可能なアクセプタータンパク質と、自身の発光エネルギーによりアクセプタータンパク質の発光を励起できるドナータンパク質とが融合された融合タンパク質が挙げられる。化学発光指示薬は、一又は複数の実施形態において、分析物質に応じて適宜選択することができる。化学発光指示薬の具体例は後述する。
発光基質としては、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬の化学発光タンパク質の基質となり、かつ光を生じる物質が挙げられる。発光基質は、一又は複数の実施形態において、ドナータンパク質の基質となる物質である。発光基質は、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬又はドナータンパク質に応じて適宜決定することができる。
本開示のデバイスにおいて、化学発光指示薬と発光基質とは、独立して配置されている。化学発光指示薬と発光基質とは、一又は複数の実施形態において、これらが配置された試薬部に試料を供給すると、化学発光指示薬と発光基質とが反応して発光シグナルを発生可能なように配置されている。これにより、試薬部に試料を供給すると、化学発光指示薬と発光基質とが接触（混合）するとともに、試薬中の分析物質が化学発光指示薬と結合又は作用することによって、発光シグナルを生じさせることができる。このような構成を有する本開示のデバイスによれば、一又は複数の実施形態において、より高いシグナル・ノイズ比を有し、また、励起光が不要であるため特別な測定装置や測定設備が不要であるという効果を好ましくは奏しうる。また、本開示のデバイスによれば、一又は複数の実施形態において、ユーザーが、自身が所持するモバイル端末等の撮像手段によって撮像することにより、生じる発光シグナルを検出することができ、またそのユーザーが撮像することにより得られたデータを用いて迅速な測定、判定又は診断等を行うことができる。
本開示において「独立して配置」としては、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬と発光基質とが、試料等の液体が接触することなしに反応が生じない状態で配置されていることが挙げられる。独立して配置としては、一又は複数の実施形態において、隣接する化学発光指示薬と発光基質とが物理的に分離して配置されていることが挙げられる。また、独立して配置は、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬と発光基質とが反応しない状態（例えば乾燥状態）であれば、互いに接触して配置された形態を含みうる。
化学発光指示薬及び発光基質は、一又は複数の実施形態において、パターニングされて配置されていてもよい。パターニングの形状としては、一又は複数の実施形態において、ドット状、ライン状、又はサークル状等が挙げられる。化学発光指示薬と発光基質との接触率を高め、より高い発光シグナルを発生させる点から、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬と発光基質とが交互にかつモザイク状にパターニングされていることが好ましい。再現性を向上できる点から、パターニングは微細であることが好ましい。
本開示のデバイスにおいて、試薬部は基材に形成されている。試薬部は、一又は複数の実施形態において、１枚の基材の同一平面に形成されていてもよいし、２枚の基材によって挟み込まれるように形成されていてもよい。
図１に、特に限定されないパターニングの形状を例示する。図１Ａでは、１枚の基材１１上にドット状の化学発光試薬１３及び発光基質１４が交互にモザイク状にパターニングされることにより試薬部１２が形成されている。図１Ｂでは、２枚の基材１１の一方の面に化学発光試薬１３と発光基質１４とがそれぞれドット状にパターニングされ、化学発光試薬１３と発光基質１４とがパターニングされた面が向かい合うように２枚の基材１１が配置されることにより試薬部１２が形成されている。図１Ｃ及びＤでは、それぞれ、１枚の基材１１上に化学発光試薬１３と発光基質１４とがライン状又はサークル状にパターニングされることにより試薬部１２が形成されている。
化学発光指示薬及び発光基質は、試料供給前に化学発光指示薬と発光基質とが反応することを低減する点から、一又は複数の実施形態において、乾燥状態であることが好ましい。
基材の材質は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、パラフィン、テフロン（登録商標）等のフッ素系材料、ガラス、ポリプロピレン、織布、不織布、及び紙等が挙げられる。基材の材質は、高い発光シグナルを検出できる点から、一又は複数の実施形態において、疎水性であることが好ましい。
［化学発光指示薬］
本開示において「化学発光指示薬」とは、該化学発光指示薬が発光シグナルを発生する過程の少なくとも一部に化学発光又は化学発光エネルギーの発生を含むものいう。
化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、化学発光タンパク質部分を含む融合タンパク質が挙げられる。化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、公知の化学発光指示薬であってもよいし、現在開発中又は今後開発されうる化学発光指示薬であってもよい。
化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、分析物質と結合又は作用することによって生じるＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動）を利用した化学発光指示薬等が挙げられる。ＦＲＥＴを利用した化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、化学発光性カルシウムイオン指示薬（K Saito et al., PLoS ONE, 5: e9935, 2010、K Saito et al., Nature, Communications, 3, 1262, 2012、K Suzuki et al, Nature, Communications, 7, 13718, 2016、Yang J et al., Nature Communications, 7, 13268, 2016）、並びに化学発光性ＡＴＰ指示薬及び化学発光性ｃＡＭＰ指示薬（K Saito et al., Nature, Communications, 3, 1262, 2012）等が挙げられる。
その他の化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態として、試料中の生体物質等の分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）等があげられる。該化学発光指示薬は、本発明者らによる、生体物質と結合して蛍光を発するタンパク質に、共鳴エネルギー移動が起りうるように化学発光タンパク質を融合させることで、観測のための励起光源を使用とせず、また、２波長の測定光を使用できるようになり、該分析物質の定量を容易化できるという知見に基づく。「分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ）」としては、一又は複数の実施形態において、分析物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、及び、自家蛍光分子である分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）が挙げられる。
本開示のデバイスに用いる化学発光指示薬の一例として、融合タンパク質（Ｃ）において、タンパク質（Ａ）が結合可能な分析物質が生体物質である場合を例にとり、具体的に説明する。
［生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）］
該形態における融合タンパク質（Ｃ）における「生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）」としては、一又は複数の実施形態において、生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、及び、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）が挙げられる。
生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）としては、一又は複数の実施形態において、アポ体では無蛍光性であり、リガンドである生体物質が結合してホロ体となり蛍光性となるタンパク質が挙げられる。前記タンパク質（Ａ１）の一又は複数の実施形態としては、ＵｎａＧタンパク質が挙げられる。また、前記タンパク質（Ａ１）のその他の一又は複数の実施形態としては、ｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、及びｉＲＦＰが挙げられる。
ＵｎａＧタンパク質は、間接ビリルビンと特異的に結合し、シアン色の励起光により緑色に光る性質を有する（Kumagai et al., Cell 2013, 153, 1602-1611）。ＵｎａＧは間接ビリルビンと極めて高い結合能力（解離定数＝９８ｐＭ）を有する。ＵｎａＧの配列情報は、UniProtKB/Swiss-Prot: P0DM59.1、又は、GenBank: AB763906.1を参照できる(2016年8月時点)。前記タンパク質（Ａ１）としてＵｎａＧタンパク質を用いれば、例えば、間接ビリルビンの検出ができる。
ｓｍＵＲＦＰは、small ultra red fluorescent proteinの略称であり、ヘモグロビンの代謝物であるビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である（Rodriguez et al., Nature Methods, 2016, 13, 763-769）。
ＩＦＰは、infrared-fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である（Shu X, et al., Science 2009, 324(5928), 804-8-7）。
ｉＲＦＰは、near-infrared fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である（Filonov GS, et al., Nat Biotech 2011, 29(8), 757-761）。
前記タンパク質（Ａ１）としてこれらのｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、又はｉＲＦＰを用いれば、例えば、ビリベルジンの検出ができる。
前記タンパク質（Ａ１）としては、ＵｎａＧタンパク質又はｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、若しくはｉＲＦＰの改変体であってもよい。ＵｎａＧタンパク質又はｓｍＵＲＦＰ、ＩＦＰ、若しくはｉＲＦＰの改変体としては、リガンドであるビリルビン又はビリベルジンが結合してホロ体となり蛍光性となる特性を維持できる範囲で、欠失、付加、置換等の変異がされていてもよい。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１〜４、１〜３、１〜２、又は１個が挙げられ、あるいは、少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の同一性を示すアミノ酸配列の範囲が挙げられる。変異の限定されない例として、融合タンパク質（Ｃ）におけるタンパク質（Ｂ）との融合部分（Ｃ末又はＮ末）の欠失が挙げられる。
自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）は、該自家蛍光分子を結合することで蛍光性となるタンパク質をいう。前記自家蛍光分子としては、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）が挙げられる。自家蛍光分子（ＦＭＮ）を結合可能なタンパク質（Ａ２）としては、一又は複数の実施形態において、ＦｂＦＰ、ｉＬＯＶタンパク質、及びｍｉｎｉ−ＳＯＧタンパク質が挙げられる。
ＦｂＦＰは、Flavin mononucleotide (FMN)-based fluorescent proteinの略称であり、バクテリアの青色受容体由来の蛍光タンパク質である（Drepper T., et al., Nat Biotech. 2007, 25(4) 443-445）。
ｉＬＯＶタンパク質は、植物青色受容体フォトトロピンのlight, oxygen or voltage-sensing (LOV)ドメイン由来の蛍光タンパク質を改変して蛍光特性がインプルーブしたタンパク質である（Chapman S., et al., PNAS 2008, 105(50) 20038-43）。
ｍｉｎｉ−ＳＯＧタンパク質は、mini Singlet Oxygen Generatorの略称であり、Arabidopsisのフォトトロピン２由来の蛍光タンパク質である（Shu X., et al., PLoS Biol. 2011, 9(4) ）。
前記タンパク質（Ａ２）は、前記自家蛍光分子を結合しうる範囲で、欠失、付加、又は置換等の変異がされた改変体であってもよい。変異のアミノ酸の数としては、上述の範囲が挙げられる。
［化学発光タンパク質（Ｂ）］
化学発光タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーによりタンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである。このような化学発光タンパク質（Ｂ）が融合した融合タンパク質（Ｃ）を検出試薬として使用することから、本開示に係る検出方法によれば、観察のための励起光源を使用することなく、生体物質の定量的な測定を行うことができる。化学発光タンパク質（Ｂ）としては、共鳴エネルギー移動により前記タンパク質（Ａ）の蛍光を励起できる共鳴エネルギー移動のドナーとなりえる発光タンパク質（ルシフェラーゼ）が挙げられる。発光色によって検出を判定できる点からは、前記タンパク質（Ａ）の発光色と、前記タンパク質（Ｂ）の発光色とは異なることが好ましい。
前記共鳴エネルギー移動は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）あるいは生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）として知られている。該タンパク質（Ｂ）は、前記タンパク質（Ａ１）の吸収波長、又は、前記タンパク質（Ａ２）に結合する自家蛍光分子の吸収波長に応じて選択できる。該タンパク質（Ｂ）としては、公知の発光タンパク質、例えば、ホタルルシフェラーゼ、イクオリン、バクテリアルシフェラーゼ、及びこれらの改変体が挙げられる。
前記タンパク質（Ａ）がＵｎａＧの場合、前記タンパク質（Ｂ）としては、一又は複数の実施形態において、セレンテラジン化合物を発光基質とするルシフェラーゼが挙げられる。該ルシフェラーゼの一又は複数の実施形態として、ＮＬｕｃが挙げられる。
前記タンパク質（Ｂ）は、公知のルシフェラーゼの改変体であってもよい。ルシフェラーゼの改変体としては、ルシフェリンが結合して発光する特性を維持できる範囲で、欠失、付加、置換等の変異がされていてもよい。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１〜４、１〜３、１〜２、又は１個が挙げられ、あるいは、少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の同一性を示すアミノ酸配列の範囲が挙げられる。変異の限定されない例として、融合タンパク質（Ｃ）におけるタンパク質（Ａ）との融合部分（Ｃ末又はＮ末）の欠失が挙げられる。
［リンカー］
前記融合タンパク質（Ｃ）において、前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、リンカーで結合されていてもよい。該リンカーは前記タンパク質（Ｂ）から前記タンパク質（Ａ）への共鳴エネルギー移動の効率が高くなるように選択されうる。該リンカーの長さとしては、一又は複数の実施形態において、１〜１０、１〜５、２〜４又は２〜３アミノ酸残基が挙げられる。
前記タンパク質（Ａ）がＵｎａＧの場合、リンカーとしては、一又は複数の実施形態において、ＧＴ、ＤＤ、ＧＴＧ、又はＧＴＧＧ等が挙げられ、これらの中でも発光効率の点から、ＤＤ、ＧＴＧ、又はＧＴＧＧが好ましく、ＧＴＧがより好ましい。
前記融合タンパク質（Ｃ）における前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）との融合の順番は特に限定されず、Ｎ末側が前記タンパク質（Ａ）であってもよく、前記タンパク質（Ｂ）であってもよい。前記融合タンパク質（Ｃ）は、一又は複数の実施形態において、Ｎ末又はＣ末にタグタンパク質が融合されてもよい。
前記融合タンパク質（Ｃ）は上述した構成を備えるため、前記タンパク質（Ａ）の基質である生体物質と前記タンパク質（Ｂ）の基質であるルシフェリンが共に存在する場合には前記タンパク質（Ａ）の発光色の傾向を示し、前記タンパク質（Ａ）の基質である生体物質の量が少なくなるほど前記タンパク質（Ｂ）の発光色の傾向が強くなる。よって、前記融合タンパク質（Ｃ）を用いれば、生体物質の検出/測定が可能となる。
本開示のデバイスは、一又は複数の実施形態において、特定の検出対象を分析するための分析用デバイス又はチップともいうことができる。本開示のデバイスは、一又は複数の実施形態において、分析物質が生体物質の場合、バイオデバイス又はバイオチップともいうことができる。
本開示のデバイスの分析物質としては、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、生体試料における生体物質、食品中のアレルゲン若しくは有害物質、河川水若しくは海水等の自然環境における汚染物質若しくは有害物質、又は病原菌等が挙げられる。試料としては、一又は複数の実施形態において、生体試料、食品等が挙げられる。
生体試料としては、生物に由来する該生体物質を含む試料であって、液体状であることが好ましい。そのような生体試料としては、特に制限されないが、例えば、全血、血清、血漿、及び尿などの体液試料があげられる。また、本開示における生体試料は、必要に応じて希釈及び／又は前処理などをされたものであってもよい。本開示に係る検出方法は、当然ながら、上記「生体試料」以外の試料を測定対象とすることができる。例えば、分析物質である生体物質の標準試料、すなわち、測定するためのコントロール試料が挙げられる。
生体物質としては、一又は複数の実施形態において、生体内の低分子化合物、分解代謝物、核酸、糖、ペプチド、タンパク質、細胞、又は微生物等が挙げられる。
［デバイスの製造方法］
本開示に係る製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスの製造方法である。本開示の製造方法は、化学発光指示薬と該化学発光指示薬の発光基質とが独立して配置されるように基材にパターニングすることを含む。
化学発光指示薬と発光基質とのパターニングとしては、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬と発光基質とが配置された箇所に試料を供給すると、化学発光指示薬と発光基質とが接触（混合）して発光シグナルを発生可能なように、これらを独立して配置することにより行うことができる。
パターニングの方法としては、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬又は発光基質の溶液を、所定のパターン形状に配置して乾燥させることにより行うことができる。パターニングは、一又は複数の実施形態において、インクジェットプリンター等の公知の技術を用いて行うことができる。
化学発光指示薬、発光基質、基材及びパターニングの形状等としては、本開示のデバイスと同様である。
［検出方法］
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスを用いて、試料中の分析物質を検出する方法である。
本開示の検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスの試薬部に試料を供給すること、及び試料を供給することにより生じた発光シグナルを検出することを含む。本開示のデバイスによれば励起光が不要であるため、発光シグナルの検出は、一又は複数の実施形態において、モバイル端末（スマートフォン等）及びデジタルカメラ等の撮像手段により行うことができる。
本開示の検出方法は、一又は複数の実施形態において、室温又は環境温度で行うことができる。試料を供給してから観察するまでの時間としては、一又は複数の実施形態において、数秒から数分程度、又は、数秒から１分程度が挙げられる。
本開示の検出方法の特に限定されない一又は複数の実施形態として、生体物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）を用いた形態を例にとり説明する。
融合タンパク質（Ｃ）とタンパク質（Ｂ）の基質とが配置された試薬部に試料を添加すると、発光が生じる。その発光シグナルを指標にタンパク質（Ａ）に結合した生体物質の有無が判別できる。基本的には、該生体物質が存在すれば発光色はタンパク質（Ａ）のものとなり、存在しなければタンパク質（Ｂ）のものとなる。
また、本形態の検出方法は、一又は複数の実施形態において、試料の発光色が、該生体物質の濃度依存的に変化する。該生体物質の濃度が上がるほど、試料の発光色は、タンパク質（Ｂ）の発光色からタンパク質（Ａ）の発光色へと変化する。すなわち、発光シグナルにおけるタンパク質（Ａ）とタンパク質（Ｂ）との発光強度比と生体物質の濃度とを関連付けすることができる。
したがって、本形態の検出方法によれば、試料量に関わらず、発光シグナルから定量的な該生体物質の濃度測定が可能となる。定量的測定を可能とする点からは、試料と接触（混合）させる融合タンパク質（Ｃ）のモル濃度は、Ｋd程度の濃度域にあることが好ましい。
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、試料の発光シグナルから生体物質の濃度を定量的に算出する工程を含んでもよい。
［判別方法］
本開示は、その他の態様において、本開示に係る検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の分析物質の濃度を判別することを含む、試料中の分析物質の濃度判別方法に関する。
上述のように、本開示に係る検出方法で得られる発光シグナルにおけるタンパク質（Ａ）と（Ｂ）との発光強度比は、試料中の生体物質の濃度に依存させることができる。よって、検出に使用した融合タンパク質（Ｃ）の情報と発光シグナルとから生体物質の濃度を判別することができる。
前記発光シグナルデータは、モバイル端末（スマートフォン等）のカラーカメラなどのカラー検出器で簡便に取り込み、送受信することが可能であるから、簡便に生体物質の濃度を把握することができる。
［判定システム］
本開示は、その他の態様において、本開示のデバイスを用いた判定システム（本開示の判定システム）に関する。本開示の判定システムは、本開示のデバイスに試料を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含む。本開示の判定システムにおいて、撮像端末と情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能であってもよい。また、本開示の判定システムは、さらに、情報処理手段とネットワークを介して双方向に通信が可能な通信端末を含んでいてもよい。
本開示の判定システムによれば、一又は複数の実施形態において、特別な検査機関等に行くことなく、また、場所を問わず、遠隔地であっても、迅速かつ容易に専門家による分析、判定又は診断結果を得ることができる。本開示の判定システムは、一又は複数の実施形態において、遠隔地分析システム、遠隔地判定システム又は遠隔地診断システムとして利用できる。
撮像端末としては、一又は複数の実施形態において、汎用の画像読取装置等が挙げられる。画像読取装置としては、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、スマートフォン又はタブレット端末等のモバイル端末、デジタルカメラ、及びＣＣＤカメラ等が挙げられる。撮像端末としては、迅速な測定及び判定結果の受信等が可能になることから、一又は複数の実施形態において、スマートフォン又はタブレット端末等のモバイル端末が挙げられる。
発光シグナルの検出は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスに試料が供給されたことにより発せられた発光シグナルを撮像端末によって撮像することにより行うことができる。発光シグナルの検出は、測定精度を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、撮像端末のカメラ部分にアタッチメントを取り付け、そこに試料を供給した本開示のデバイスを配置することにより行うことができる。
検出された発光シグナルは、一又は複数の実施形態において、発光シグナルを検出した撮像端末によって、情報処理手段に送信することができる。情報処理手段への送信は、一又は複数の実施形態において、撮像端末のアプリケーションを通じて行うことができる。 また、検出された発光シグナルは、撮像端末とは異なる通信端末によって情報処理手段に送信してもよい。通信端末としては、一又は複数の実施形態において、通信機能を有するパーソナルコンピュータ等が挙げられる。
情報処理手段は、一又は複数の実施形態において、分析物質に使用する化学発光指示薬による発光シグナルデータと、基準となる発光シグナルデータに関連付けられた情報とが蓄積されており、これらと撮像端末で検出された発光シグナルデータとに基づいた判定を行うことができる。情報処理手段は、一又は複数の実施形態において、送信された発光シグナルデータと基準となる発光シグナルデータとを比較し、得られた診断結果を、撮像端末に送信することを含む。
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕 化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、
前記試薬部が形成された基材とを有し、
前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に独立して配置されている、デバイス。
〔２〕 前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に試料を供給すると、前記化学発光指示薬と前記基質とが反応可能なように配置されている、〔１〕記載のデバイス。
〔３〕 前記化学発光指示薬は、前記試料中の分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）であり、
前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、〔２〕記載のデバイス。
〔４〕 前記基質は、化学発光タンパク質（Ｂ）の基質である、〔３〕記載のデバイス。
〔５〕 前記タンパク質（Ａ）は、前記分析物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、〔３〕又は〔４〕に記載のデバイス。
〔６〕 〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のデバイスに試料を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、
前記撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含み、
前記撮像端末と前記情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能である、判定システム。
〔７〕 化学発光指示薬と前記指示薬の発光基質とが独立して配置されるように、これらを基材にパターニングすることを含む、デバイスの製造方法。
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
［実験例］
１．融合タンパク質（化学発光指示薬）の遺伝子構築
野生型UnaGのC末欠損変異体を、N末にBamHI制限酵素部位、C末にKpnI制限酵素部位を付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
Forward primer: CGCGGATCCGGGTGGTTCTGGTATGG 配列番号１
Reverse primer0: (CΔ0) GCTGGTACCTTCCGTCGCCCTCCG 配列番号２
Reverse primer1: (CΔ1) GCTGGTACCCGTCGCCCTCCGGTA 配列番号３
Reverse primer2: (CΔ2) GCTGGTACCCGCCCTCCGGTAGCT 配列番号４
Reverse primer3: (CΔ3) GCTGGTACCCCTCCGGTAGCTGCG 配列番号５
Reverse primer4: (CΔ4) GCTGGTACCCCGGTAGCTGCGCAC 配列番号６
野生型NLucのN末欠損変異体を、N末にKpnI制限酵素部位、C末にEcoRI制限酵素部位を付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
Forward primer 1: (NΔ1) GCCGGTACCGTCTTCACACTCGAAGATTTCG 配列番号７
Forward primer 2: (NΔ4) GCCGGTACCCTCGAAGATTTCGTTGGGGAC 配列番号８
Forward primer 3: (NΔ5) GCCGGTACCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGC 配列番号９
Reverse primer: ATGAATTCTTACGCCAGAATGCGTTCGCACAG 配列番号１０
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅したDNA断片をフェノール・クロロホルム法により抽出した。UnaGのDNA断片はBamHI及びKpnIにより制限酵素処理した。NLucのDNA断片は、KpnI及びEcoRIで制限酵素処理した。アガロースゲル電気泳動後、ゲルからバンドを切り出したのち精製した(QIAEX2, QIAGEN)。精製した各断片と、BamHI, EcoRIにより制限酵素処理されたpRSETBベクターをライゲーションし、JM109(DE3)株に形質転換後、１０ｃｍディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で３７℃一晩培養した。
２．スクリーニング
コロニーの生えた寒天培地を室温に置き、室温近くまで冷ました１％低融点アガロースゲルに最終濃度１０μＭのBilirubinを加えた溶液４ｍＬを加えて、寒天培地上に注ぎ、室温で固めた。次に、ゲルの上から１０μＭ Coelenterazine-h溶液を加え、すぐに暗箱に設置した一眼レフカメラ(Sony α7)により撮影し、コロニーのカラー画像を取得した。RGB画像の緑チャンネル(UnaGの発光)と青チャンネル(NLucの発光)画像からレシオ画像を作成し、レシオ値が高いコロニーをピックアップした。次に、ピックアップしたコロニーを、９６ウェルプレートで、LB培地＋１０μＭ Bilirubin＋１００μｇ／ｍＬ Ampicillinで２３℃、６０時間培養した。培養液に１０μＭ coelenterazineを加え、蛍光分光光度計(FV7000)あるいはプレートリーダーにより化学発光スペクトルを計測した。波長４５０ｎｍで規格化し、波長５２５ｎｍの相対値（レシオ値）をもとにスクリーニングを行った。
C末欠損変異体UnaGとN末欠損変異体NLucをKpnIサイトで融合させたタンパク質をスクリーニングしたところ、UnaG(CΔ0)とNLuc(NΔ1)との組み合わせ（以下、"UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質"という。）が、最も大きなフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)効率を示した（図２）。このUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質の塩基配列は配列番号１１であり、アミノ酸配列は配列番号１２である。
３．融合タンパク質のリンカー配列の最適化
UnaGとNLucのつなぎ目の配列である２残基（GT）を、インバースPCR法によってランダムな配列に置換した。次のプライマーを使用した。
Forward primer: NNKNNKGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号１３
Reverse primer: TTCCGTCGCCCTCCGGTAGCTG 配列番号１４
ベクター配列を含む全長を増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、１０ｃｍディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、３７℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記２で記述した方法でスクリーニングした。
４．融合タンパク質へのリンカー配列の挿入
UnaGとNLucのつなぎの配列 (GT)の後ろに、リンカー配列をインバースPCR法により挿入した。以下のプライマーを使用した。
Forward primer (G): GGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号１５
Forward primer (GG): GGCGGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号１６
Forward primer (GGS): GGCGGCAGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号１７
Reverse primer: GGTACCTTCCGTCGCCCTC 配列番号１８
ベクター配列を含む全長をPCRにて増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、１０ｃｍディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、３７℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記２で記述した方法でスクリーニングした。
ランダム変異挿入によるリンカー配列最適化により、野生型のリンカー配列(GT)に比べ、(DD)配列が大きなFRET効率の変化を示した（図３）。さらに、フレキシブルリンカーを追加した化学発光ビリルビン指示薬のFRET効率を調べたところ、(GTG)配列が最も大きなFRET効率を示した。
５．タンパク質の精製
J JM109(DE3)株に形質転換したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を、２００ｍＬのLB培地＋1００μｇ／ｍＬ Carvenisillin溶液で、２３℃で６０時間培養した。集菌後、フレンチプレス法により大腸菌を破砕し、Ni-NTAカラム(QIAGEN)を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。さらに、過剰なimidazoleを取り除くために、ゲルろ過カラム(PD-10, GE HealthCare)を用いた。タンパク質濃度はブラッドフォード法により計測した。
６．凍結乾燥試料の作成
精製したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質５００μＬを１５ｍＬファルコンチューブに入れ、液体窒素により凍らせた。その後、凍結乾燥装置により、タンパク質溶液の粉末を得た。粉末は室温で保存した。
７．滴定曲線の計測
最終濃度５ｎＭのUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質に対し、０．０１ｎＭ，０．０５ｎＭ，０．１ｎＭ，０．５ｎＭ，１ｎＭ，２．５ｎＭ，５ｎＭ，又は１０ｎＭのビリルビン溶液及び最終濃度５μＭ Coelenterazine-hを混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器（PMA-12, 浜松ホトニクス製）あるいはプレートリーダーにより計測した。その結果の一例を図４に示す。３回の独立した計測の平均値をプロットし、ヒルの式によりフィッティングを行った。Ｋd値は３．０５ｎＭであった。
また、凍結乾燥試料作成後、どの程度の期間活性を保つか調べるために、数日ごとに凍結乾燥試料を水に融解したものを室温で保存し、上記７に記述した方法によりビリルビンによるアフィニティーを計測した。その結果、ややアフィニティーにばらつきはあるものの、活性を保つ事が明らかとなった（図５）。
８．スマートフォンによる測定
９６マルチウェルプレートに、最終濃度５０ｎＭの融合タンパク質に最終濃度１０ｎＭ，２０ｎＭ，３０ｎＭ，４０ｎＭ，５０ｎＭ，１００ｎＭ，又は２５０ｎＭのビリルビン溶液及び最終濃度５μＭ Coelenterazine-hを混合し、ｉＰｈｏｎｅ(登録商標)６に搭載したアプリ(Manual - Custom exposure camera)を用い、ＩＳＯ１５００，露光時間０．５秒により計測した。
マルチウェルプレート上に作成した融合タンパク質及び様々な濃度のビリルビン溶液をカラー撮影したところ、ビリルビン濃度依存的に溶液が青色から緑色に変化していく様子を計測することに成功した（図６）。図６に示すように、ビリルビンが０ｎＭのときは化学発光タンパク質の発光色（シアン）である。ビリルビン濃度が増すにつれてＵｎａＧの発光色（緑）に変化した。ＲＧＢを使って色の変化の様子の一例を説明すると、発光色は、0nM（56,133,204）、10nM（79,157,215）、20nM（96,169,209）、30nM（101,164,194）、40nM（119,179,189）、50nM（123,169.156）、100nM（154,187,111）、250nM（158,191,107）に変化した。
図６のような相関があれば、発光データ（発光色）からビリルビン濃度が算出できる。
［実施例１］
上記のUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を用いて、デバイスを作製し、それを用いて試料中のビリルビンの測定を行った。
＜デバイスの製造方法＞
下記の化学発光指示薬及び発光基質を使用してデバイスを製造した。
化学発光指示薬：67.6 μM UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質
発光基質 ：150 nM Coelenterazine-h
Certus liquid dispenser(Gyger社製)の１，５３６マルチウェルパターン機能を用いて、化学発光指示薬及び発光基質のそれぞれについて３０ｎＬのドロップレットを、カバーガラス又はパラフィルム上に図１Ａのように市松状となるようにパターニングした。ドロップ（径１〜２ｍｍ）の間隔（隣接するドロップの中心と中心との距離）は２ｍｍとした。
＜ビリルビンの測定＞
１００ｎＭのビリルビン溶液５μＬ又はリン酸緩衝液(PBS)（ビリルビンなし）５μＬをデバイス上に暗室中で滴下し、化学発光シグナルをカラーカメラ(α7, Sony製)で、ＩＳＯ２５，６００、０．５秒露光時間で撮像した。さらに、スマートフォン（ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）６，Ａｐｐｌｅ製）のカメラにおいても、ＩＳＯ１，５００，０．５秒露光により撮像した。その結果を図７Ａ及びＢに示す。
図７Ａは、カラーカメラで撮影した化学発光像であり、図７Ｂは、スマートフォンのカメラで撮影した化学発光像である。図７Ａ及びＢに示すように、ビリルビン溶液を滴下した部分とリン酸緩衝液（ビリルビンなし）を滴下した部分とで発光色が異なった。また、その発光データ（発光色）の傾向も図６と同様であった。
これらのことから、図６のような相関データに基づけば、本開示のデバイスを用いて得られた発光データ（発光色）から溶液のビリルビン濃度が算出できることが判った。
［実施例２］
一定濃度のビリルビン・発光基質（Coelenterazine-h）溶液に対し、原液、２倍希釈、４倍希釈又は８倍希釈のUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液を混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器（PMA-12，浜松ホトニクス製）により計測し、得られた発光強度からＵｎａＧの発光波長（５３０ｎｍ）の発光強度とＮＬｕｃの発光波長（４６０ｎｍ）の発光強度とのレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）を算出した。その結果の一例を図８に示す。図８において、図８Ａが化学発光スペクトルを示し、図８ＢがUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液（検出試薬）の希釈率とレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）との関係を示すグラフである。
［比較例１］
９６ウェルプレート（黒色）にUnaGタンパク質溶液（８．２５ｎＭ，１６．５ｎＭ，３１．５ｎＭ，６２．５ｎＭ，１２５ｎＭ又は２５０ｎＭ）を５０μＬずつ加え、ついで４００ｎＭビリルビン溶液を５０μＬずつ加えた。マイクロプレートリーダー（SH-9000，corona社製）を用いて４５０ｎｍの波長の励起光を照射後、蛍光スペクトルを取得した。その結果の一例を図９に示す。図９において、図９Ａが蛍光スペクトルを示し、図９ＢがUnaGタンパク質溶液（検出試薬）の濃度とＵｎａＧの発光波長（５３０ｎｍ）の蛍光強度との関係を示すグラフである。
比較例１では、図９Ａ及びＢに示すように、検出対象であるビリルビンの濃度が同じであるにも関わらず、検出試薬の濃度によって蛍光強度が変化した。つまり、比較例１（UnaGタンパク質を用いた方法）では、定量的な計測はできないといえる。
これに対し、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を用いて計測した実施例２では、検出試薬の濃度によって発光強度は異なるものの、スペクトルの波形が一定であり（図８Ａ）、図８Ｂに示す通り、検出試薬の濃度にかかわらず同一のビリルビン濃度に対するピークレシオ値（５３０ｎｍ／４６０ｎｍ）は略同じであった。このため、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を使用することにより、検出試薬の濃度に関わらない測定、つまり定量的な計測が可能であるといえる。
配列番号 １：フォワードプライマー
配列番号 ２：リバースプライマー
配列番号 ３：リバースプライマー
配列番号 ４：リバースプライマー
配列番号 ５：リバースプライマー
配列番号 ６：リバースプライマー
配列番号 ７：フォワードプライマー
配列番号 ８：フォワードプライマー
配列番号 ９：フォワードプライマー
配列番号１０：リバースプライマー
配列番号１１：UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質の塩基配列
配列番号１２：UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３：フォワードプライマー
配列番号１４：リバースプライマー
配列番号１５：フォワードプライマー
配列番号１６：フォワードプライマー
配列番号１７：フォワードプライマー
配列番号１８：リバースプライマー

Claims (7)

  1. 化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、
    前記試薬部が形成された基材とを有し、
    前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に独立して配置されている、デバイス。
  2. 前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に試料を供給すると、前記化学発光指示薬と前記基質とが反応可能なように配置されている、請求項１記載のデバイス。
  3. 前記化学発光指示薬は、前記試料中の分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ）と化学発光タンパク質（Ｂ）とが融合した融合タンパク質（Ｃ）であり、
    前記タンパク質（Ａ）と前記タンパク質（Ｂ）とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、請求項２記載のデバイス。
  4. 前記基質は、前記タンパク質（Ｂ）の基質である、請求項３記載のデバイス。
  5. 前記タンパク質（Ａ）は、前記分析物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質（Ａ１）、又は、自家蛍光分子である分析物質を結合可能なタンパク質（Ａ２）であり、
    前記タンパク質（Ｂ）は、その発光エネルギーにより前記タンパク質（Ａ）の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、請求項３又は４に記載のデバイス。
  6. 請求項１から５のいずれかに記載のデバイスに試料を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、
    前記撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含み、
    前記撮像端末と前記情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能である、判定システム。
  7. 化学発光指示薬と前記指示薬の発光基質とが独立して配置されるように、これらを基材にパターニングすることを含む、デバイスの製造方法。
JP2018565519A 2017-02-03 2018-01-26 デバイス、及びそれを用いた判定システム Active JP7137842B2 (ja)

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