JPWO2018143106A1 - デバイス、及びそれを用いた判定システム - Google Patents
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Abstract
Description
特別な装置を使用することなく、ユーザー自身が容易に測定可能な新たな手段が求められている。
本開示は、物質と結合して蛍光を発するタンパク質に、共鳴エネルギー移動が起こりうるように化学発光タンパク質を融合させた化学発光指示薬を使用することで、測定のための励起光源や特別な装置を使用しない場合であっても、ユーザー自身が容易に物質の測定を行うことができる、という知見に基づく。
本開示に係るデバイスは、一又は複数の実施形態において、化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、前記試薬部が形成された基材とを有する。
本開示において「化学発光指示薬」とは、該化学発光指示薬が発光シグナルを発生する過程の少なくとも一部に化学発光又は化学発光エネルギーの発生を含むものいう。
化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、分析物質と結合又は作用することによって生じるFRET(フェルスター共鳴エネルギー移動)を利用した化学発光指示薬等が挙げられる。FRETを利用した化学発光指示薬としては、一又は複数の実施形態において、化学発光性カルシウムイオン指示薬(K Saito et al., PLoS ONE, 5: e9935, 2010、K Saito et al., Nature, Communications, 3, 1262, 2012、K Suzuki et al, Nature, Communications, 7, 13718, 2016、Yang J et al., Nature Communications, 7, 13268, 2016)、並びに化学発光性ATP指示薬及び化学発光性cAMP指示薬(K Saito et al., Nature, Communications, 3, 1262, 2012)等が挙げられる。
該形態における融合タンパク質(C)における「生体物質を結合可能なタンパク質(A)」としては、一又は複数の実施形態において、生体物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、及び、自家蛍光分子である生体物質を結合可能なタンパク質(A2)が挙げられる。
IFPは、infrared-fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である(Shu X, et al., Science 2009, 324(5928), 804-8-7)。
iRFPは、near-infrared fluorescent proteinの略称であり、ビリベルジンと結合して赤色の蛍光性を示すタンパク質である(Filonov GS, et al., Nat Biotech 2011, 29(8), 757-761)。
前記タンパク質(A1)としてこれらのsmURFP、IFP、又はiRFPを用いれば、例えば、ビリベルジンの検出ができる。
iLOVタンパク質は、植物青色受容体フォトトロピンのlight, oxygen or voltage-sensing (LOV)ドメイン由来の蛍光タンパク質を改変して蛍光特性がインプルーブしたタンパク質である(Chapman S., et al., PNAS 2008, 105(50) 20038-43)。
mini−SOGタンパク質は、mini Singlet Oxygen Generatorの略称であり、Arabidopsisのフォトトロピン2由来の蛍光タンパク質である(Shu X., et al., PLoS Biol. 2011, 9(4) )。
化学発光タンパク質(B)は、その発光エネルギーによりタンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである。このような化学発光タンパク質(B)が融合した融合タンパク質(C)を検出試薬として使用することから、本開示に係る検出方法によれば、観察のための励起光源を使用することなく、生体物質の定量的な測定を行うことができる。化学発光タンパク質(B)としては、共鳴エネルギー移動により前記タンパク質(A)の蛍光を励起できる共鳴エネルギー移動のドナーとなりえる発光タンパク質(ルシフェラーゼ)が挙げられる。発光色によって検出を判定できる点からは、前記タンパク質(A)の発光色と、前記タンパク質(B)の発光色とは異なることが好ましい。
前記融合タンパク質(C)において、前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、リンカーで結合されていてもよい。該リンカーは前記タンパク質(B)から前記タンパク質(A)への共鳴エネルギー移動の効率が高くなるように選択されうる。該リンカーの長さとしては、一又は複数の実施形態において、1〜10、1〜5、2〜4又は2〜3アミノ酸残基が挙げられる。
生体物質としては、一又は複数の実施形態において、生体内の低分子化合物、分解代謝物、核酸、糖、ペプチド、タンパク質、細胞、又は微生物等が挙げられる。
本開示に係る製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスの製造方法である。本開示の製造方法は、化学発光指示薬と該化学発光指示薬の発光基質とが独立して配置されるように基材にパターニングすることを含む。
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のデバイスを用いて、試料中の分析物質を検出する方法である。
本開示に係る検出方法は、一又は複数の実施形態において、試料の発光シグナルから生体物質の濃度を定量的に算出する工程を含んでもよい。
本開示は、その他の態様において、本開示に係る検出方法で得られた発光シグナルデータに基づき試料中の分析物質の濃度を判別することを含む、試料中の分析物質の濃度判別方法に関する。
上述のように、本開示に係る検出方法で得られる発光シグナルにおけるタンパク質(A)と(B)との発光強度比は、試料中の生体物質の濃度に依存させることができる。よって、検出に使用した融合タンパク質(C)の情報と発光シグナルとから生体物質の濃度を判別することができる。
前記発光シグナルデータは、モバイル端末(スマートフォン等)のカラーカメラなどのカラー検出器で簡便に取り込み、送受信することが可能であるから、簡便に生体物質の濃度を把握することができる。
本開示は、その他の態様において、本開示のデバイスを用いた判定システム(本開示の判定システム)に関する。本開示の判定システムは、本開示のデバイスに試料を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含む。本開示の判定システムにおいて、撮像端末と情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能であってもよい。また、本開示の判定システムは、さらに、情報処理手段とネットワークを介して双方向に通信が可能な通信端末を含んでいてもよい。
本開示の判定システムによれば、一又は複数の実施形態において、特別な検査機関等に行くことなく、また、場所を問わず、遠隔地であっても、迅速かつ容易に専門家による分析、判定又は診断結果を得ることができる。本開示の判定システムは、一又は複数の実施形態において、遠隔地分析システム、遠隔地判定システム又は遠隔地診断システムとして利用できる。
〔1〕 化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、
前記試薬部が形成された基材とを有し、
前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に独立して配置されている、デバイス。
〔2〕 前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に試料を供給すると、前記化学発光指示薬と前記基質とが反応可能なように配置されている、〔1〕記載のデバイス。
〔3〕 前記化学発光指示薬は、前記試料中の分析物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)であり、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、〔2〕記載のデバイス。
〔4〕 前記基質は、化学発光タンパク質(B)の基質である、〔3〕記載のデバイス。
〔5〕 前記タンパク質(A)は、前記分析物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である分析物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、〔3〕又は〔4〕に記載のデバイス。
〔6〕 〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のデバイスに試料を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、
前記撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含み、
前記撮像端末と前記情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能である、判定システム。
〔7〕 化学発光指示薬と前記指示薬の発光基質とが独立して配置されるように、これらを基材にパターニングすることを含む、デバイスの製造方法。
1.融合タンパク質(化学発光指示薬)の遺伝子構築
野生型UnaGのC末欠損変異体を、N末にBamHI制限酵素部位、C末にKpnI制限酵素部位を付加した以下のプライマーを用いて増幅した。
Forward primer: CGCGGATCCGGGTGGTTCTGGTATGG 配列番号1
Reverse primer0: (CΔ0) GCTGGTACCTTCCGTCGCCCTCCG 配列番号2
Reverse primer1: (CΔ1) GCTGGTACCCGTCGCCCTCCGGTA 配列番号3
Reverse primer2: (CΔ2) GCTGGTACCCGCCCTCCGGTAGCT 配列番号4
Reverse primer3: (CΔ3) GCTGGTACCCCTCCGGTAGCTGCG 配列番号5
Reverse primer4: (CΔ4) GCTGGTACCCCGGTAGCTGCGCAC 配列番号6
Forward primer 1: (NΔ1) GCCGGTACCGTCTTCACACTCGAAGATTTCG 配列番号7
Forward primer 2: (NΔ4) GCCGGTACCCTCGAAGATTTCGTTGGGGAC 配列番号8
Forward primer 3: (NΔ5) GCCGGTACCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGC 配列番号9
Reverse primer: ATGAATTCTTACGCCAGAATGCGTTCGCACAG 配列番号10
コロニーの生えた寒天培地を室温に置き、室温近くまで冷ました1%低融点アガロースゲルに最終濃度10μMのBilirubinを加えた溶液4mLを加えて、寒天培地上に注ぎ、室温で固めた。次に、ゲルの上から10μM Coelenterazine-h溶液を加え、すぐに暗箱に設置した一眼レフカメラ(Sony α7)により撮影し、コロニーのカラー画像を取得した。RGB画像の緑チャンネル(UnaGの発光)と青チャンネル(NLucの発光)画像からレシオ画像を作成し、レシオ値が高いコロニーをピックアップした。次に、ピックアップしたコロニーを、96ウェルプレートで、LB培地+10μM Bilirubin+100μg/mL Ampicillinで23℃、60時間培養した。培養液に10μM coelenterazineを加え、蛍光分光光度計(FV7000)あるいはプレートリーダーにより化学発光スペクトルを計測した。波長450nmで規格化し、波長525nmの相対値(レシオ値)をもとにスクリーニングを行った。
UnaGとNLucのつなぎ目の配列である2残基(GT)を、インバースPCR法によってランダムな配列に置換した。次のプライマーを使用した。
Forward primer: NNKNNKGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号13
Reverse primer: TTCCGTCGCCCTCCGGTAGCTG 配列番号14
ベクター配列を含む全長を増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、10cmディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、37℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記2で記述した方法でスクリーニングした。
UnaGとNLucのつなぎの配列 (GT)の後ろに、リンカー配列をインバースPCR法により挿入した。以下のプライマーを使用した。
Forward primer (G): GGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号15
Forward primer (GG): GGCGGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号16
Forward primer (GGS): GGCGGCAGCGTCTTCACACTCGAAGATTTC 配列番号17
Reverse primer: GGTACCTTCCGTCGCCCTC 配列番号18
ベクター配列を含む全長をPCRにて増幅後、制限酵素DpnIで処理することでテンプレートプラスミドを処理し、Ligation後、JM109(DE3)株に形質転換し、10cmディッシュに作成したLBアガー寒天培地上で、37℃で一晩培養した。発現したコロニーを、上記2で記述した方法でスクリーニングした。
J JM109(DE3)株に形質転換したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を、200mLのLB培地+100μg/mL Carvenisillin溶液で、23℃で60時間培養した。集菌後、フレンチプレス法により大腸菌を破砕し、Ni-NTAカラム(QIAGEN)を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。さらに、過剰なimidazoleを取り除くために、ゲルろ過カラム(PD-10, GE HealthCare)を用いた。タンパク質濃度はブラッドフォード法により計測した。
精製したUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質500μLを15mLファルコンチューブに入れ、液体窒素により凍らせた。その後、凍結乾燥装置により、タンパク質溶液の粉末を得た。粉末は室温で保存した。
最終濃度5nMのUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質に対し、0.01nM,0.05nM,0.1nM,0.5nM,1nM,2.5nM,5nM,又は10nMのビリルビン溶液及び最終濃度5μM Coelenterazine-hを混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器(PMA-12, 浜松ホトニクス製)あるいはプレートリーダーにより計測した。その結果の一例を図4に示す。3回の独立した計測の平均値をプロットし、ヒルの式によりフィッティングを行った。Kd値は3.05nMであった。
96マルチウェルプレートに、最終濃度50nMの融合タンパク質に最終濃度10nM,20nM,30nM,40nM,50nM,100nM,又は250nMのビリルビン溶液及び最終濃度5μM Coelenterazine-hを混合し、iPhone(登録商標)6に搭載したアプリ(Manual - Custom exposure camera)を用い、ISO1500,露光時間0.5秒により計測した。
図6のような相関があれば、発光データ(発光色)からビリルビン濃度が算出できる。
上記のUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を用いて、デバイスを作製し、それを用いて試料中のビリルビンの測定を行った。
下記の化学発光指示薬及び発光基質を使用してデバイスを製造した。
化学発光指示薬:67.6 μM UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質
発光基質 :150 nM Coelenterazine-h
Certus liquid dispenser(Gyger社製)の1,536マルチウェルパターン機能を用いて、化学発光指示薬及び発光基質のそれぞれについて30nLのドロップレットを、カバーガラス又はパラフィルム上に図1Aのように市松状となるようにパターニングした。ドロップ(径1〜2mm)の間隔(隣接するドロップの中心と中心との距離)は2mmとした。
100nMのビリルビン溶液5μL又はリン酸緩衝液(PBS)(ビリルビンなし)5μLをデバイス上に暗室中で滴下し、化学発光シグナルをカラーカメラ(α7, Sony製)で、ISO25,600、0.5秒露光時間で撮像した。さらに、スマートフォン(iPhone(登録商標)6,Apple製)のカメラにおいても、ISO1,500,0.5秒露光により撮像した。その結果を図7A及びBに示す。
これらのことから、図6のような相関データに基づけば、本開示のデバイスを用いて得られた発光データ(発光色)から溶液のビリルビン濃度が算出できることが判った。
一定濃度のビリルビン・発光基質(Coelenterazine-h)溶液に対し、原液、2倍希釈、4倍希釈又は8倍希釈のUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液を混合し、発光スペクトルをマルチチャンネル分光器(PMA-12,浜松ホトニクス製)により計測し、得られた発光強度からUnaGの発光波長(530nm)の発光強度とNLucの発光波長(460nm)の発光強度とのレシオ値(530nm/460nm)を算出した。その結果の一例を図8に示す。図8において、図8Aが化学発光スペクトルを示し、図8BがUnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質溶液(検出試薬)の希釈率とレシオ値(530nm/460nm)との関係を示すグラフである。
96ウェルプレート(黒色)にUnaGタンパク質溶液(8.25nM,16.5nM,31.5nM,62.5nM,125nM又は250nM)を50μLずつ加え、ついで400nMビリルビン溶液を50μLずつ加えた。マイクロプレートリーダー(SH-9000,corona社製)を用いて450nmの波長の励起光を照射後、蛍光スペクトルを取得した。その結果の一例を図9に示す。図9において、図9Aが蛍光スペクトルを示し、図9BがUnaGタンパク質溶液(検出試薬)の濃度とUnaGの発光波長(530nm)の蛍光強度との関係を示すグラフである。
これに対し、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を用いて計測した実施例2では、検出試薬の濃度によって発光強度は異なるものの、スペクトルの波形が一定であり(図8A)、図8Bに示す通り、検出試薬の濃度にかかわらず同一のビリルビン濃度に対するピークレシオ値(530nm/460nm)は略同じであった。このため、UnaG(CΔ0)-NLuc(NΔ1)融合タンパク質を使用することにより、検出試薬の濃度に関わらない測定、つまり定量的な計測が可能であるといえる。
配列番号 2:リバースプライマー
配列番号 3:リバースプライマー
配列番号 4:リバースプライマー
配列番号 5:リバースプライマー
配列番号 6:リバースプライマー
配列番号 7:フォワードプライマー
配列番号 8:フォワードプライマー
配列番号 9:フォワードプライマー
配列番号10:リバースプライマー
配列番号11:UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質の塩基配列
配列番号12:UnaG(C 0)-NLuc(N 1)融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:フォワードプライマー
配列番号14:リバースプライマー
配列番号15:フォワードプライマー
配列番号16:フォワードプライマー
配列番号17:フォワードプライマー
配列番号18:リバースプライマー
Claims (7)
- 化学発光指示薬及び前記指示薬の発光基質が配置された試薬部と、
前記試薬部が形成された基材とを有し、
前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に独立して配置されている、デバイス。 - 前記化学発光指示薬及び前記基質は、前記試薬部に試料を供給すると、前記化学発光指示薬と前記基質とが反応可能なように配置されている、請求項1記載のデバイス。
- 前記化学発光指示薬は、前記試料中の分析物質を結合可能なタンパク質(A)と化学発光タンパク質(B)とが融合した融合タンパク質(C)であり、
前記タンパク質(A)と前記タンパク質(B)とは、共鳴エネルギー移動が可能なように連結されている、請求項2記載のデバイス。 - 前記基質は、前記タンパク質(B)の基質である、請求項3記載のデバイス。
- 前記タンパク質(A)は、前記分析物質を結合した状態で蛍光を発しうるタンパク質(A1)、又は、自家蛍光分子である分析物質を結合可能なタンパク質(A2)であり、
前記タンパク質(B)は、その発光エネルギーにより前記タンパク質(A)の蛍光又は自家蛍光を励起できるものである、請求項3又は4に記載のデバイス。 - 請求項1から5のいずれかに記載のデバイスに試料を供給することにより発せられる発光シグナルを検出する撮像端末と、
前記撮像端末で得られた発光シグナルデータを処理する情報処理手段とを含み、
前記撮像端末と前記情報処理手段とは、ネットワークを介して双方向に通信が可能である、判定システム。 - 化学発光指示薬と前記指示薬の発光基質とが独立して配置されるように、これらを基材にパターニングすることを含む、デバイスの製造方法。
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