JP3643520B2 - ｃＧＭＰ可視化プローブ及びそれを利用したｃＧＭＰの検出・定量方法 - Google Patents
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- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ｃＧＭＰを検出・定量するための可視化プローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ｃＧＭＰに特異的に結合でき、ｃＧＭＰと特異的に結合することによって光学的変化を生じ、ｃＧＭＰの検出・定量を可能とするｃＧＭＰ可視化プローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
細胞内二次情報伝達である環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は、生体内において、各種生化学反応過程のシグナル分子として作用している。これまでに、循環器系筋細胞の緩和、網膜における光伝達、上皮での電解質運搬、骨の成長、ニューロン活性等の様々な生理的プロセスがｃＧＭＰによって制御されていることが明らかになっている。したがって、生細胞中でのｃＧＭＰの合成、分解、局在等が明らかになれば、細胞および組織レベルでの循環器系、腎臓、網膜、嗅覚、中枢神経等の作用機構が解明されるだけでなく、ホスホジエステラーゼ阻害剤のように、細胞内におけるｃＧＭＰ濃度を制御する物質に関する知見を得る足がかりになると期待される。
【０００３】
これまで、ｃＧＭＰを検出・定量する方法としては、放射性同位体によって標識された化合物を用いる放射性免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）が行われてきた。しかし、この方法は、細胞を破壊し、細胞可溶化物と標識化合物の結合を検出することにより、全ｃＧＭＰ量を分析するものであり、細胞生物学的、あるいは薬学的に要求される精度が実現されていなかった。
【０００４】
さらに、このようなラジオイムノアッセイは、破壊的測定法であるため、また同位体標識された物質は安定性が低く、取り扱いにも注意を要するため、ｃＧＭＰのin vitro測定にのみ適用できるという点で、測定の適用範囲に限界があったのが実情である。
【０００５】
そこで、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧＭＰを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法を提供することを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に連結された異なる蛍光波長を有する２つの発色団からなることを特徴とするｃＧＭＰ可視化プローブを提供する。
【０００７】
第２には、この出願の発明は、上記プローブにおいて、ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチドがｃＧＭＰ結合蛋白であること、第３にはこのようなｃＧＭＰ結合蛋白がｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαであることを態様として提供する。
【０００８】
また、この出願の発明は、第４には、発色団がポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光蛋白と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光蛋白であることを提供する。
【０００９】
さらに、第５には、この出願の発明は、上記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とするｃＧＭＰの検出および定量方法をも提供する。
【００１０】
第６には、この出願の発明は、上記のｃＧＭＰの検出および定量方法において、前記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、ｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させること、第７には、前記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させることを態様として提供する。
【００１１】
また、この出願の発明は、第８には、上記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物をも提供する。
【００１２】
そして、第９には、この出願の発明は、上記第８の発明の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞におけるｃＧＭＰを定量する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明のｃＧＭＰプローブは、各々異なる機能を有する２つの部位からなるものである。つまり、このｃＧＭＰプローブは、選択的にｃＧＭＰを認識するｃＧＭＰ特異結合部位と、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ特異結合部位のｃＧＭＰ認識を光学的に信号発信する発色部位からなるものである。
【００１４】
この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰと共存したとき、ｃＧＭＰ特異結合部位がｃＧＭＰと結合し、その際に生じる発色部位の立体配置の変化が、光学的変化として現れるという原理によるものであり、この光学的変化を測定することにより、ｃＧＭＰを検出・定量できるものである。
【００１５】
ｃＧＭＰと特異的に結合する部位は、例えば、種々のｃＧＭＰ結合蛋白等のポリぺプチドである。ｃＧＭＰ結合蛋白としては、ｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼＩα（ＰＫＧ Iα）が例示される。
【００１６】
哺乳動物のＰＫＧ Iαは、図１に示される４種の機能性ドメインを有するふたつの同一モノマーからなる。Ｎ−末端側に存在する二量体化ドメインは、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフからなる。ｃＧＭＰが共存しない場合、ＰＫＧ Iαは、キナーゼ不活性で、触媒中心が自己阻害ドメインによって占有されるクローズドコンホメーションを示す。一方、ｃＧＭＰと結合したＰＫＧ Iαでは、自己阻害ドメインが活性中心から除去され、ＰＫＧ Iαは、オープンコンホメーションを示す。したがって、このようなＰＫＧ Iαの両末端に発色団を連結させれば、ｃＧＭＰとの結合により光学的変化が生じ、ｃＧＭＰとの結合を可視的に検出できる。
【００１７】
もちろん、ｃＧＭＰと特異的に結合するポリぺプチドは、ＰＫＧ Iαや、ｃＧＭＰ結合蛋白に限定されず、合成および天然のあらゆるぺプチド鎖を用いることができる。
【００１８】
この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブにおいて、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位としては、種々の発色団が考慮される。このとき、発色団は、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ結合部位の結合により生じる立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じなければならない。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、立体構造の変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の生起による色調に変化を来たす発色団がある。
【００１９】
したがって、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブにおいては、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位として、異なる蛍光波長を有する２つの蛍光発色団を、各々ｃＧＭＰと特異的に結合するポリぺプチドの両末端にそれぞれ連結する。このような蛍光発色団としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）のブルーシフト変異蛋白である、シアン蛍光蛋白（ＣＦＰ）やＧＦＰのレッドシフト変異蛋白である黄色蛍光蛋白（ＹＦＰ）が好ましく選択される。このとき、ＣＦＰをｃＧＭＰと特異的に結合するポリぺプチドのＮ−末端に、ＹＦＰをＣ−末端に連結することにより、それぞれドナーおよびアクセプターとして作用し、ＦＲＥＴを生起する。
【００２０】
したがって、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰと共存するとき、ｃＧＭＰ結合蛋白部位とｃＧＭＰの結合が起こり、Ｎ−およびＣ−末端のそれぞれの蛍光発色団によるＦＲＥＴが生起して、蛍光波長の変化が生じるものである。したがって、この蛍光変化を通常行われる種々の化学的、生化学的、分析方法を用いて測定することにより、ｃＧＭＰを検出することが可能となるのである。また、蛍光強度とｃＧＭＰ濃度の関係を予め検量することにより、溶液中におけるｃＧＭＰ濃度を定量することができるのである。
【００２１】
この出願の発明では、以上のとおりのｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させる方法としては、様々な方法が考えられる。例えば、細胞を破壊して、細胞内からｃＧＭＰを溶出させ、その溶液にｃＧＭＰ可視化プローブを添加して、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる方法があげられる。このような方法でｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる場合には、ｃＧＭＰをin
ｖｉｔｒｏで検出・定量できる。
【００２２】
また、この出願の発明では、ｃＧＭＰ可視化プローブを組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞に導入する方法により、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させることができる。発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、ｃＧＭＰ可視化プローブを組み込んだ発現ベクターを細胞に導入する方法を用いることにより、細胞内でｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブが共存でき、細胞を破壊することなく、ｃＧＭＰの検出および定量をするin vivo法が可能となる。
【００２３】
さらに、この出願の発明のｃＧＭＰの検出および測定方法では、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させることもできる。
【００２４】
この出願の発明では、以上のとおりの各種方法により、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰが共存しているトランスジェニック非ヒト動物が得られる。トランスジェニック非ヒト動物は、公知の作成法（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980）に従って作成することができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞にｃＧＭＰ可視化プローブを保有しているため、例えば、その体内に医薬品や毒物などの検査物質を導入し、細胞および組織におけるｃＧＭＰの濃度を測定することによって、様々な物質のスクリーニングを行うことができる。
【００２５】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００２６】
この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブは、遺伝子的にコードされているため、通常の遺伝子工学的手法を用いて、最適化することができる。例えば、細胞内におけるｃＧＭＰ可視化プローブの位置などは、シグナル配列やグアニリルシクラーゼ等の蛋白質、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャンネル、ＰＫＧ Iαのアンカリング蛋白質等を融合することにより制御することができる。
【００２７】
さらに、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブと同様に、環状ヌクレオチドの結合ドメインに関する遺伝子工学的知見に基づいて、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）可視化プローブ等を発展させることも考えられる。
【００２８】
【実施例】
実施例１ ｃＧＭＰ可視化プローブの作成
発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光蛋白（ＥＧＦＰ：例えばCurrent Biology 6(2); 178-182, 1996）の変異蛋白である、シアン蛍光蛋白（ＥＣＦＰ：F64L/S65T/Y66W/ N146I/M153T/V163A/N212K）と黄色蛍光蛋白（ＥＹＦＰ：S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y）を、図１に示されるようにｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼ（ＰＫＧ Iα）のＮ−およびＣ−末端にそれぞれ遺伝子工学的に連結し、ＣＦＰ−ＰＫＧ Iα−ＹＦＰ融合蛋白（以下ＣＧＹとする）を作成した。
【００２９】
また、このＣＧＹにおいて、ＰＫＧ Iαのアミノ酸配列を全長有するもの（以下ＣＧＹ−ＦＬとする）の他に、同様の方法により、ＰＫＧ Iαの１〜４７番目のアミノ酸のうち、ロイシン、イソロイシン、およびシステイン残基をすべてアラニンに変換したもの（以下ＣＧＹ−Ａ１２とする）、ＰＫＧ Iαの１〜４７番目のアミノ酸を削除し、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)としたもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ１とする）を作成した。
【００３０】
さらに、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１において、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＣＦＰの間にリンカー配列として、ＭＤＥＬＫＹを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ２とする）、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＹＦＰの間にＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ３とする）、およびＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＣＦＰの間にリンカー配列としてＭＤＥＬＫＹ、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＹＦＰの間にＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ４とする）を同様に作成した。
実施例２ チャイニーズハムスター卵巣細胞へのｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）の導入
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＨａｍのＦ−１２培養液中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。
【００３１】
得られたＣＨＯ−Ｋ１に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（ライフテクノロジー社製）を用いて、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ａ１２発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入した。
【００３２】
さらに、遺伝子導入後１２〜２４時間後にこれらの各種ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１を取り出し、ガラス底培養皿に塗布した。
実施例３ ｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）を導入されたＣＨＯ−Ｋ１のイメージング
まず、実施例２の培養液をＨａｎｋの平衡塩類溶液で置換した。
【００３３】
次に、ＭｅｔａＦｌｕｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ社製）で制御され、冷却ＣＣＤカメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ：Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製）を有するＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５顕微鏡で、ＣＧＹ導入後３〜５日経過したＣＨＯ−Ｋ１を室温にてイメージングした。励起は、波長４４０±１０ｎｍ、励起時間は５０ｍｓで、顕微鏡像は、４８０±１５ｎｍフィルターおよび５３５±１２．５ｎｍフィルターを通して、４０×の油浸レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で検出された。
【００３４】
図２（ａ）に、遺伝子導入された細胞のＣＦＰ（４８０ｎｍ）およびＹＦＰ（５３５ｎｍ）の顕微鏡像を示した。これよりＣＧＹ−Ａ１２が、細胞核内にまで導入されていることが示された。
【００３５】
ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１の中の約３０％が、ＣＦＰおよびＹＦＰによる細胞核での発光を示したことから、ＰＫＧ Iαの二量体化ドメインにおいて、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフにキナーゼを細胞核外に留めるような情報が込められていると考えられる。
実施例４ ｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）の応答性
実施例１で作成された各ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１を、ｃＧＭＰの細胞膜透過性ホスホジエステラーゼ抵抗性類似体として知られる８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激し、蛍光顕微鏡で蛍光を測定した。
（１） ＣＧＹ−ＦＬ発現ＣＨＯ−Ｋ１
図２（ｂ）に、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加前および８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）添加後の、ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の４８０±１５ｎｍと５３５±１２．５ｎｍの発光比の変化を示した。
【００３６】
また、図３に、細胞質における発光比の経時的変化を示した。
【００３７】
これより、ＣＧＹ−ＦＬでは、発光比に大きな変化が見られないことが明らかになった。また、ＣＦＰおよびＹＦＰの蛍光強度は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加により影響されないことが明らかになった。
（２） ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１
一方、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１では、図２ｂに示したとおり、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加によって発光比の顕著な減少が確認された。
【００３８】
また、図４に示したように、ＣＦＰおよびＹＦＰ強度には、相反的変化が見られた。また、発光比の減少は、ＣＦＰおよびＹＦＰ強度の相反的変化と経時的に同様な傾向にあることが分かった。
【００３９】
以上より、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰがＣＧＹ−Ｄｅｌ１と結合することにより、ＣＦＰおよびＹＦＰ間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が増大していることが示された。
（３） ＣＧＹ−Ａ１２発現ＣＨＯ−Ｋ１
また、ＣＧＹ−Ａ１２発現ＣＨＯ−Ｋ１では、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加によって発光に変化が見られた（図２ｂ、３）。しかし、その最大発光比変化は、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１におけるそれの約１／３程度と小さかった。
実施例５ ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるリンカー配列導入の影響
ＣＨＯ−Ｋ１細胞中に実施例１で作成されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ４を実施例２と同様の方法で発現し、発光強度の変化を測定した。
【００４０】
８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共存させた際の初期発光比と蛍光比の変化の関係を図５に示した。
【００４１】
これより、各ｃＧＭＰ発現ＣＨＯ−Ｋ１で、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加に対する応答が確認されたが、ＭＤＥＬＫＹ、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮのいずれのリンカー配列も、初期発光比および蛍光比に対してあまり大きな効果を示さないことが明らかになった。
【００４２】
また、ＣＧＹ−Ａ１２とＣＧＹ−ＤＥＬ１〜４の間で、初期発光比に大きな差が見られないことから、この発明のｃＧＭＰ可視化プローブでは、ポリぺプチドプチド鎖中に種々の柔軟なドメインを導入することによって、その構造を最適化できるとが示唆される。
【００４３】
以上の結果より、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１〜４が、細胞中のｃＧＭＰ濃度を測定するためのｃＧＭＰ可視化プローブとして好ましいものであることが示された。
実施例６ ヒト胎児腎細胞へのＣＧＹの導入
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）を１０％ＦＣＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、および０．１ｍＭの非必須アミノ酸を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培養液中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養し、ＨＥＫ２９３を得た。
【００４４】
得られたＨＥＫ２９３に、実施例２と同様の方法で、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、ＣＧＹ−Ｄｅｌ４の発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入し、各ＣＧＹ発現ＨＥＫ２９３を得た。
実施例７ ｃＧＭＰ可視化プローブを用いた生体細胞内におけるｃＧＭＰの定量
ｃＧＭＰ可視化プローブを用いて、生体細胞を一酸化窒素（ＮＯ）で刺激した際に発生する細胞内のｃＧＭＰを検出した。
【００４５】
まず、実施例６で得られたＣＧＹ−Ｄｅｌ１導入ＨＥＫ２９３において、細胞内の可溶性グアニリルシクラーゼを活性化させるためにＮＯを自発的かつ速度論的に放出する化合物であるＮＯＣ−７を、最終的な細胞外濃度が５００μＭとなるように添加した。
【００４６】
図６にＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３単一細胞におけるＮＯＣ−７誘発発光における顕微鏡像を示した。
【００４７】
図６から、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞に５００μＭのＮＯＣ−７を添加することにより発光比は急激に減少するが、その後再び発光比の増大が見られ、発光比はほぼ初期値まで戻ることが示された。
【００４８】
また、図７に、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３単一細胞におけるＮＯＣ−７誘発発光比の変化を示した。
【００４９】
発光比は、まず急激に減少し、その後緩やかに増大した。
【００５０】
次に、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３を１００μＭのザプリナスト（ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの選択的阻害剤）で処理したところ、同様に初期の急激な発光比の減少が見られた。しかし、その後の緩やかな発光比の増大は見られなくなった。
【００５１】
また、細胞をあらかじめ１０μＭのＯＤＱ（ＮＯ感受性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤）で処理した場合には、ＮＯＣ−７による発光比変化は全く見られなくなった。
【００５２】
図７から、発光比が減少した後に再び発光比が増大する現象は、ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼによるｃＧＭＰ分解によるものと示唆される。
【００５３】
同様の結果は、ＣＧＹ−ＤＥｌ２〜４を発現したＨＥＫ２９３単一細胞についても得られた。
【００５４】
以上より、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブを用いて、生体細胞内におけるｃＧＭＰの発生が確認できることが示された。
実施例８ ｃＧＭＰ可視化プローブによる細胞内ｃＧＭＰ濃度変動の測定
そこで、上記の系にｃＧＭＰのホスホジエステラーゼ抵抗性類似体である８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを１ｍＭ添加した。
【００５５】
図８に結果を示した。
【００５６】
発光比は、減少、増加の後、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを１ｍＭ添加することにより、再び減少した。また、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの代わりにザプリナストを用いても、同様に、発光比が回復した系での再減少が確認された。
【００５７】
以上の結果より、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１のｃＧＭＰ検出による応答が可逆的であり、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブを用いることにより生体細胞におけるｃＧＭＰ濃度の変動を測定することが可能となることが確認された。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この発明によって、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧＭＰを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のｃＧＭＰ可視化プローブの構成を例示した概略摸式図である。
【図２】この発明の実施例において、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞における８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ応答性を示した図である。（ａ）ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ａ１２、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現した細胞の顕微鏡像である。（励起：４４０±１０ｎｍ、フィルター：４８０±１５ｎｍ（ＣＦＰ）および５３５±１２．５ｎｍ（ＹＦＰ））；（ｂ）１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共存させたＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の４８０±１５ｎｍと５３５±１２．５ｎｍの発光比の経時変化。
【図３】この発明の実施例において、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ａ１２を発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞を８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した際の発光比の経時的変化を示すグラフである。（ａ）ＣＧＹ−ＦＬ；（ｂ）ＣＧＹ−Ｄｅｌ１；（ｃ）ＣＧＹ−Ａ１２
【図４】この発明の実施例において、４８０±１５ｎｍ（ＣＦＰ）および５３５±１２．５ｎｍ（ＹＦＰ）におけるＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞質蛍光強度の速度論的挙動を示すグラフである。（ａ）ＣＦＰ；（ｂ）ＹＦＰ
【図５】この発明の実施例において、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ａ１２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ４の初期発光比と発光比変化を示す図である。
【図６】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７で刺激した際の細胞質の発光比を示す顕微鏡像である。（ＮＯＣ−７添加９００秒後、８ーＢｒ−ｃＧＭＰを添加。）
【図７】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７で刺激した際の発光比の変化を示すグラフである。（ａ）ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞；（ｂ）１００μＭのザプリナストで処理されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞；（ｃ）１０μＭのＯＤＱで処理されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞。
【図８】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７で刺激した際の発光比の変化を示すグラフである。（ａ）ＮＯＣ−７添加９００秒後、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加；（ｂ）ＮＯＣ−７添加９００秒後、ザプリナスト添加
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ｃＧＭＰを検出・定量するための可視化プローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ｃＧＭＰに特異的に結合でき、ｃＧＭＰと特異的に結合することによって光学的変化を生じ、ｃＧＭＰの検出・定量を可能とするｃＧＭＰ可視化プローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
細胞内二次情報伝達である環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は、生体内において、各種生化学反応過程のシグナル分子として作用している。これまでに、循環器系筋細胞の緩和、網膜における光伝達、上皮での電解質運搬、骨の成長、ニューロン活性等の様々な生理的プロセスがｃＧＭＰによって制御されていることが明らかになっている。したがって、生細胞中でのｃＧＭＰの合成、分解、局在等が明らかになれば、細胞および組織レベルでの循環器系、腎臓、網膜、嗅覚、中枢神経等の作用機構が解明されるだけでなく、ホスホジエステラーゼ阻害剤のように、細胞内におけるｃＧＭＰ濃度を制御する物質に関する知見を得る足がかりになると期待される。
【０００３】
これまで、ｃＧＭＰを検出・定量する方法としては、放射性同位体によって標識された化合物を用いる放射性免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）が行われてきた。しかし、この方法は、細胞を破壊し、細胞可溶化物と標識化合物の結合を検出することにより、全ｃＧＭＰ量を分析するものであり、細胞生物学的、あるいは薬学的に要求される精度が実現されていなかった。
【０００４】
さらに、このようなラジオイムノアッセイは、破壊的測定法であるため、また同位体標識された物質は安定性が低く、取り扱いにも注意を要するため、ｃＧＭＰのin vitro測定にのみ適用できるという点で、測定の適用範囲に限界があったのが実情である。
【０００５】
そこで、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧＭＰを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法を提供することを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に連結された異なる蛍光波長を有する２つの発色団からなることを特徴とするｃＧＭＰ可視化プローブを提供する。
【０００７】
第２には、この出願の発明は、上記プローブにおいて、ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチドがｃＧＭＰ結合蛋白であること、第３にはこのようなｃＧＭＰ結合蛋白がｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαであることを態様として提供する。
【０００８】
また、この出願の発明は、第４には、発色団がポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光蛋白と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光蛋白であることを提供する。
【０００９】
さらに、第５には、この出願の発明は、上記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とするｃＧＭＰの検出および定量方法をも提供する。
【００１０】
第６には、この出願の発明は、上記のｃＧＭＰの検出および定量方法において、前記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、ｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させること、第７には、前記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させることを態様として提供する。
【００１１】
また、この出願の発明は、第８には、上記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物をも提供する。
【００１２】
そして、第９には、この出願の発明は、上記第８の発明の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞におけるｃＧＭＰを定量する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明のｃＧＭＰプローブは、各々異なる機能を有する２つの部位からなるものである。つまり、このｃＧＭＰプローブは、選択的にｃＧＭＰを認識するｃＧＭＰ特異結合部位と、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ特異結合部位のｃＧＭＰ認識を光学的に信号発信する発色部位からなるものである。
【００１４】
この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰと共存したとき、ｃＧＭＰ特異結合部位がｃＧＭＰと結合し、その際に生じる発色部位の立体配置の変化が、光学的変化として現れるという原理によるものであり、この光学的変化を測定することにより、ｃＧＭＰを検出・定量できるものである。
【００１５】
ｃＧＭＰと特異的に結合する部位は、例えば、種々のｃＧＭＰ結合蛋白等のポリぺプチドである。ｃＧＭＰ結合蛋白としては、ｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼＩα（ＰＫＧ Iα）が例示される。
【００１６】
哺乳動物のＰＫＧ Iαは、図１に示される４種の機能性ドメインを有するふたつの同一モノマーからなる。Ｎ−末端側に存在する二量体化ドメインは、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフからなる。ｃＧＭＰが共存しない場合、ＰＫＧ Iαは、キナーゼ不活性で、触媒中心が自己阻害ドメインによって占有されるクローズドコンホメーションを示す。一方、ｃＧＭＰと結合したＰＫＧ Iαでは、自己阻害ドメインが活性中心から除去され、ＰＫＧ Iαは、オープンコンホメーションを示す。したがって、このようなＰＫＧ Iαの両末端に発色団を連結させれば、ｃＧＭＰとの結合により光学的変化が生じ、ｃＧＭＰとの結合を可視的に検出できる。
【００１７】
もちろん、ｃＧＭＰと特異的に結合するポリぺプチドは、ＰＫＧ Iαや、ｃＧＭＰ結合蛋白に限定されず、合成および天然のあらゆるぺプチド鎖を用いることができる。
【００１８】
この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブにおいて、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位としては、種々の発色団が考慮される。このとき、発色団は、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ結合部位の結合により生じる立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じなければならない。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、立体構造の変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の生起による色調に変化を来たす発色団がある。
【００１９】
したがって、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブにおいては、分子認識の結果を光学的変化として発信する部位として、異なる蛍光波長を有する２つの蛍光発色団を、各々ｃＧＭＰと特異的に結合するポリぺプチドの両末端にそれぞれ連結する。このような蛍光発色団としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）のブルーシフト変異蛋白である、シアン蛍光蛋白（ＣＦＰ）やＧＦＰのレッドシフト変異蛋白である黄色蛍光蛋白（ＹＦＰ）が好ましく選択される。このとき、ＣＦＰをｃＧＭＰと特異的に結合するポリぺプチドのＮ−末端に、ＹＦＰをＣ−末端に連結することにより、それぞれドナーおよびアクセプターとして作用し、ＦＲＥＴを生起する。
【００２０】
したがって、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブは、ｃＧＭＰと共存するとき、ｃＧＭＰ結合蛋白部位とｃＧＭＰの結合が起こり、Ｎ−およびＣ−末端のそれぞれの蛍光発色団によるＦＲＥＴが生起して、蛍光波長の変化が生じるものである。したがって、この蛍光変化を通常行われる種々の化学的、生化学的、分析方法を用いて測定することにより、ｃＧＭＰを検出することが可能となるのである。また、蛍光強度とｃＧＭＰ濃度の関係を予め検量することにより、溶液中におけるｃＧＭＰ濃度を定量することができるのである。
【００２１】
この出願の発明では、以上のとおりのｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させる方法としては、様々な方法が考えられる。例えば、細胞を破壊して、細胞内からｃＧＭＰを溶出させ、その溶液にｃＧＭＰ可視化プローブを添加して、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる方法があげられる。このような方法でｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる場合には、ｃＧＭＰをin
ｖｉｔｒｏで検出・定量できる。
【００２２】
また、この出願の発明では、ｃＧＭＰ可視化プローブを組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞に導入する方法により、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させることができる。発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、ｃＧＭＰ可視化プローブを組み込んだ発現ベクターを細胞に導入する方法を用いることにより、細胞内でｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブが共存でき、細胞を破壊することなく、ｃＧＭＰの検出および定量をするin vivo法が可能となる。
【００２３】
さらに、この出願の発明のｃＧＭＰの検出および測定方法では、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させることもできる。
【００２４】
この出願の発明では、以上のとおりの各種方法により、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰが共存しているトランスジェニック非ヒト動物が得られる。トランスジェニック非ヒト動物は、公知の作成法（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980）に従って作成することができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞にｃＧＭＰ可視化プローブを保有しているため、例えば、その体内に医薬品や毒物などの検査物質を導入し、細胞および組織におけるｃＧＭＰの濃度を測定することによって、様々な物質のスクリーニングを行うことができる。
【００２５】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００２６】
この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブは、遺伝子的にコードされているため、通常の遺伝子工学的手法を用いて、最適化することができる。例えば、細胞内におけるｃＧＭＰ可視化プローブの位置などは、シグナル配列やグアニリルシクラーゼ等の蛋白質、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャンネル、ＰＫＧ Iαのアンカリング蛋白質等を融合することにより制御することができる。
【００２７】
さらに、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブと同様に、環状ヌクレオチドの結合ドメインに関する遺伝子工学的知見に基づいて、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）可視化プローブ等を発展させることも考えられる。
【００２８】
【実施例】
実施例１ ｃＧＭＰ可視化プローブの作成
発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光蛋白（ＥＧＦＰ：例えばCurrent Biology 6(2); 178-182, 1996）の変異蛋白である、シアン蛍光蛋白（ＥＣＦＰ：F64L/S65T/Y66W/ N146I/M153T/V163A/N212K）と黄色蛍光蛋白（ＥＹＦＰ：S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y）を、図１に示されるようにｃＧＭＰ依存性蛋白キナーゼ（ＰＫＧ Iα）のＮ−およびＣ−末端にそれぞれ遺伝子工学的に連結し、ＣＦＰ−ＰＫＧ Iα−ＹＦＰ融合蛋白（以下ＣＧＹとする）を作成した。
【００２９】
また、このＣＧＹにおいて、ＰＫＧ Iαのアミノ酸配列を全長有するもの（以下ＣＧＹ−ＦＬとする）の他に、同様の方法により、ＰＫＧ Iαの１〜４７番目のアミノ酸のうち、ロイシン、イソロイシン、およびシステイン残基をすべてアラニンに変換したもの（以下ＣＧＹ−Ａ１２とする）、ＰＫＧ Iαの１〜４７番目のアミノ酸を削除し、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)としたもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ１とする）を作成した。
【００３０】
さらに、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１において、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＣＦＰの間にリンカー配列として、ＭＤＥＬＫＹを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ２とする）、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＹＦＰの間にＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ３とする）、およびＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＣＦＰの間にリンカー配列としてＭＤＥＬＫＹ、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＹＦＰの間にＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ４とする）を同様に作成した。
実施例２ チャイニーズハムスター卵巣細胞へのｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）の導入
チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＨａｍのＦ−１２培養液中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。
【００３１】
得られたＣＨＯ−Ｋ１に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（ライフテクノロジー社製）を用いて、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ａ１２発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入した。
【００３２】
さらに、遺伝子導入後１２〜２４時間後にこれらの各種ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１を取り出し、ガラス底培養皿に塗布した。
実施例３ ｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）を導入されたＣＨＯ−Ｋ１のイメージング
まず、実施例２の培養液をＨａｎｋの平衡塩類溶液で置換した。
【００３３】
次に、ＭｅｔａＦｌｕｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ社製）で制御され、冷却ＣＣＤカメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ：Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製）を有するＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５顕微鏡で、ＣＧＹ導入後３〜５日経過したＣＨＯ−Ｋ１を室温にてイメージングした。励起は、波長４４０±１０ｎｍ、励起時間は５０ｍｓで、顕微鏡像は、４８０±１５ｎｍフィルターおよび５３５±１２．５ｎｍフィルターを通して、４０×の油浸レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で検出された。
【００３４】
図２（ａ）に、遺伝子導入された細胞のＣＦＰ（４８０ｎｍ）およびＹＦＰ（５３５ｎｍ）の顕微鏡像を示した。これよりＣＧＹ−Ａ１２が、細胞核内にまで導入されていることが示された。
【００３５】
ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１の中の約３０％が、ＣＦＰおよびＹＦＰによる細胞核での発光を示したことから、ＰＫＧ Iαの二量体化ドメインにおいて、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフにキナーゼを細胞核外に留めるような情報が込められていると考えられる。
実施例４ ｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）の応答性
実施例１で作成された各ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１を、ｃＧＭＰの細胞膜透過性ホスホジエステラーゼ抵抗性類似体として知られる８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激し、蛍光顕微鏡で蛍光を測定した。
（１） ＣＧＹ−ＦＬ発現ＣＨＯ−Ｋ１
図２（ｂ）に、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加前および８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）添加後の、ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の４８０±１５ｎｍと５３５±１２．５ｎｍの発光比の変化を示した。
【００３６】
また、図３に、細胞質における発光比の経時的変化を示した。
【００３７】
これより、ＣＧＹ−ＦＬでは、発光比に大きな変化が見られないことが明らかになった。また、ＣＦＰおよびＹＦＰの蛍光強度は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加により影響されないことが明らかになった。
（２） ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１
一方、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１では、図２ｂに示したとおり、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加によって発光比の顕著な減少が確認された。
【００３８】
また、図４に示したように、ＣＦＰおよびＹＦＰ強度には、相反的変化が見られた。また、発光比の減少は、ＣＦＰおよびＹＦＰ強度の相反的変化と経時的に同様な傾向にあることが分かった。
【００３９】
以上より、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰがＣＧＹ−Ｄｅｌ１と結合することにより、ＣＦＰおよびＹＦＰ間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が増大していることが示された。
（３） ＣＧＹ−Ａ１２発現ＣＨＯ−Ｋ１
また、ＣＧＹ−Ａ１２発現ＣＨＯ−Ｋ１では、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加によって発光に変化が見られた（図２ｂ、３）。しかし、その最大発光比変化は、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１におけるそれの約１／３程度と小さかった。
実施例５ ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるリンカー配列導入の影響
ＣＨＯ−Ｋ１細胞中に実施例１で作成されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ４を実施例２と同様の方法で発現し、発光強度の変化を測定した。
【００４０】
８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共存させた際の初期発光比と蛍光比の変化の関係を図５に示した。
【００４１】
これより、各ｃＧＭＰ発現ＣＨＯ−Ｋ１で、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加に対する応答が確認されたが、ＭＤＥＬＫＹ、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮのいずれのリンカー配列も、初期発光比および蛍光比に対してあまり大きな効果を示さないことが明らかになった。
【００４２】
また、ＣＧＹ−Ａ１２とＣＧＹ−ＤＥＬ１〜４の間で、初期発光比に大きな差が見られないことから、この発明のｃＧＭＰ可視化プローブでは、ポリぺプチドプチド鎖中に種々の柔軟なドメインを導入することによって、その構造を最適化できるとが示唆される。
【００４３】
以上の結果より、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１〜４が、細胞中のｃＧＭＰ濃度を測定するためのｃＧＭＰ可視化プローブとして好ましいものであることが示された。
実施例６ ヒト胎児腎細胞へのＣＧＹの導入
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）を１０％ＦＣＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、および０．１ｍＭの非必須アミノ酸を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培養液中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養し、ＨＥＫ２９３を得た。
【００４４】
得られたＨＥＫ２９３に、実施例２と同様の方法で、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、ＣＧＹ−Ｄｅｌ４の発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入し、各ＣＧＹ発現ＨＥＫ２９３を得た。
実施例７ ｃＧＭＰ可視化プローブを用いた生体細胞内におけるｃＧＭＰの定量
ｃＧＭＰ可視化プローブを用いて、生体細胞を一酸化窒素（ＮＯ）で刺激した際に発生する細胞内のｃＧＭＰを検出した。
【００４５】
まず、実施例６で得られたＣＧＹ−Ｄｅｌ１導入ＨＥＫ２９３において、細胞内の可溶性グアニリルシクラーゼを活性化させるためにＮＯを自発的かつ速度論的に放出する化合物であるＮＯＣ−７を、最終的な細胞外濃度が５００μＭとなるように添加した。
【００４６】
図６にＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３単一細胞におけるＮＯＣ−７誘発発光における顕微鏡像を示した。
【００４７】
図６から、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞に５００μＭのＮＯＣ−７を添加することにより発光比は急激に減少するが、その後再び発光比の増大が見られ、発光比はほぼ初期値まで戻ることが示された。
【００４８】
また、図７に、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３単一細胞におけるＮＯＣ−７誘発発光比の変化を示した。
【００４９】
発光比は、まず急激に減少し、その後緩やかに増大した。
【００５０】
次に、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３を１００μＭのザプリナスト（ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼの選択的阻害剤）で処理したところ、同様に初期の急激な発光比の減少が見られた。しかし、その後の緩やかな発光比の増大は見られなくなった。
【００５１】
また、細胞をあらかじめ１０μＭのＯＤＱ（ＮＯ感受性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤）で処理した場合には、ＮＯＣ−７による発光比変化は全く見られなくなった。
【００５２】
図７から、発光比が減少した後に再び発光比が増大する現象は、ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼによるｃＧＭＰ分解によるものと示唆される。
【００５３】
同様の結果は、ＣＧＹ−ＤＥｌ２〜４を発現したＨＥＫ２９３単一細胞についても得られた。
【００５４】
以上より、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブを用いて、生体細胞内におけるｃＧＭＰの発生が確認できることが示された。
実施例８ ｃＧＭＰ可視化プローブによる細胞内ｃＧＭＰ濃度変動の測定
そこで、上記の系にｃＧＭＰのホスホジエステラーゼ抵抗性類似体である８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを１ｍＭ添加した。
【００５５】
図８に結果を示した。
【００５６】
発光比は、減少、増加の後、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを１ｍＭ添加することにより、再び減少した。また、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの代わりにザプリナストを用いても、同様に、発光比が回復した系での再減少が確認された。
【００５７】
以上の結果より、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１のｃＧＭＰ検出による応答が可逆的であり、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブを用いることにより生体細胞におけるｃＧＭＰ濃度の変動を測定することが可能となることが確認された。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳しく説明した通り、この発明によって、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧＭＰを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のｃＧＭＰ可視化プローブの構成を例示した概略摸式図である。
【図２】この発明の実施例において、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞における８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ応答性を示した図である。（ａ）ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ａ１２、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現した細胞の顕微鏡像である。（励起：４４０±１０ｎｍ、フィルター：４８０±１５ｎｍ（ＣＦＰ）および５３５±１２．５ｎｍ（ＹＦＰ））；（ｂ）１ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共存させたＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の４８０±１５ｎｍと５３５±１２．５ｎｍの発光比の経時変化。
【図３】この発明の実施例において、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ａ１２を発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞を８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した際の発光比の経時的変化を示すグラフである。（ａ）ＣＧＹ−ＦＬ；（ｂ）ＣＧＹ−Ｄｅｌ１；（ｃ）ＣＧＹ−Ａ１２
【図４】この発明の実施例において、４８０±１５ｎｍ（ＣＦＰ）および５３５±１２．５ｎｍ（ＹＦＰ）におけるＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞質蛍光強度の速度論的挙動を示すグラフである。（ａ）ＣＦＰ；（ｂ）ＹＦＰ
【図５】この発明の実施例において、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ａ１２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ４の初期発光比と発光比変化を示す図である。
【図６】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７で刺激した際の細胞質の発光比を示す顕微鏡像である。（ＮＯＣ−７添加９００秒後、８ーＢｒ−ｃＧＭＰを添加。）
【図７】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７で刺激した際の発光比の変化を示すグラフである。（ａ）ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞；（ｂ）１００μＭのザプリナストで処理されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞；（ｃ）１０μＭのＯＤＱで処理されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞。
【図８】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７で刺激した際の発光比の変化を示すグラフである。（ａ）ＮＯＣ−７添加９００秒後、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加；（ｂ）ＮＯＣ−７添加９００秒後、ザプリナスト添加
Claims (9)
- ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの両末端に連結された異なる蛍光波長を有する２つの発色団からなることを特徴とするｃＧＭＰ可視化プローブ。
- ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチドがｃＧＭＰ結合蛋白である請求項１のｃＧＭＰ可視化プローブ。
- ｃＧＭＰ結合蛋白がｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαである請求項２のｃＧＭＰ可視化プローブ。
- 発色団がポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光蛋白と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光蛋白である請求項１ないし３のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブ。
- 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とするｃＧＭＰの検出および定量方法。
- 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、ｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させる請求項５のｃＧＭＰの検出および定量方法。
- 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させる請求項５の検出および定量方法。
- 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
- 請求項８の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞におけるｃＧＭＰを定量する物質のスクリーニング方法。
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