JP2002017359A - ｃＧＭＰ可視化プローブ及びそれを利用したｃＧＭＰの検出・定量方法 - Google Patents

ｃＧＭＰ可視化プローブ及びそれを利用したｃＧＭＰの検出・定量方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃ
ＧＭＰを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプロ
ーブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法を提供
する。 【解決手段】 ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプ
チドと、該ポリぺプチドの両末端に異なる蛍光波長を有
する２つの発色団からなるｃＧＭＰ可視化プローブとす
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ｃＧＭＰ
を検出・定量するための可視化プローブと、それを用い
たｃＧＭＰの検出・定量方法に関するものである。さら
に詳しくは、この出願の発明は、ｃＧＭＰに特異的に結
合でき、ｃＧＭＰと特異的に結合することによって光学
的変化を生じ、ｃＧＭＰの検出・定量を可能とするｃＧ
ＭＰ可視化プローブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・
定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】細胞内二次情報伝達である環
状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）は、生体内におい
て、各種生化学反応過程のシグナル分子として作用して
いる。これまでに、循環器系筋細胞の緩和、網膜におけ
る光伝達、上皮での電解質運搬、骨の成長、ニューロン
活性等の様々な生理的プロセスがｃＧＭＰによって制御
されていることが明らかになっている。したがって、生
細胞中でのｃＧＭＰの合成、分解、局在等が明らかにな
れば、細胞および組織レベルでの循環器系、腎臓、網
膜、嗅覚、中枢神経等の作用機構が解明されるだけでな
く、ホスホジエステラーゼ阻害剤のように、細胞内にお
けるｃＧＭＰ濃度を制御する物質に関する知見を得る足
がかりになると期待される。
【０００３】これまで、ｃＧＭＰを検出・定量する方法
としては、放射性同位体によって標識された化合物を用
いる放射性免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）が行わ
れてきた。しかし、この方法は、細胞を破壊し、細胞可
溶化物と標識化合物の結合を検出することにより、全ｃ
ＧＭＰ量を分析するものであり、細胞生物学的、あるい
は薬学的に要求される精度が実現されていなかった。
【０００４】さらに、このようなラジオイムノアッセイ
は、破壊的測定法であるため、また同位体標識された物
質は安定性が低く、取り扱いにも注意を要するため、ｃ
ＧＭＰのin vitro測定にのみ適用できるという点で、測
定の適用範囲に限界があったのが実情である。
【０００５】そこで、この出願の発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を
解消し、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧ
ＭＰを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプロー
ブと、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法を提供す
ることを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、まず第１には、ｃＧＭＰ
に特異的に結合するポリぺプチドと、該ポリぺプチドの
両末端に連結された異なる蛍光波長を有する２つの発色
団からなることを特徴とするｃＧＭＰ可視化プローブを
提供する。
【０００７】第２には、この出願の発明は、上記プロー
ブにおいて、ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチド
がｃＧＭＰ結合蛋白であること、第３にはこのようなｃ
ＧＭＰ結合蛋白がｃＧＭＰ依存性キナーゼＩαであるこ
とを態様として提供する。
【０００８】また、この出願の発明は、第４には、発色
団がポリぺプチドのＮ−末端に連結されたシアン蛍光蛋
白と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍光蛋白であることを
提供する。
【０００９】さらに、第５には、この出願の発明は、上
記のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共
存させ、蛍光波長の変化を測定することを特徴とするｃ
ＧＭＰの検出および定量方法をも提供する。
【００１０】第６には、この出願の発明は、上記のｃＧ
ＭＰの検出および定量方法において、前記のいずれかの
ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを
細胞内に導入し、ｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと
共存させること、第７には、前記のいずれかのｃＧＭＰ
可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に
導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによ
って、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃ
ＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させることを態
様として提供する。
【００１１】また、この出願の発明は、第８には、上記
のいずれかのｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌ
クレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を
個体発生することによって得られる非ヒト動物またはそ
の子孫動物をも提供する。
【００１２】そして、第９には、この出願の発明は、上
記第８の発明の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試
料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞に
おけるｃＧＭＰを定量する物質のスクリーニング方法を
も提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】この出願の発明のｃＧＭＰプロー
ブは、各々異なる機能を有する２つの部位からなるもの
である。つまり、このｃＧＭＰプローブは、選択的にｃ
ＧＭＰを認識するｃＧＭＰ特異結合部位と、ｃＧＭＰと
ｃＧＭＰ特異結合部位のｃＧＭＰ認識を光学的に信号発
信する発色部位からなるものである。
【００１４】この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブ
は、ｃＧＭＰと共存したとき、ｃＧＭＰ特異結合部位が
ｃＧＭＰと結合し、その際に生じる発色部位の立体配置
の変化が、光学的変化として現れるという原理によるも
のであり、この光学的変化を測定することにより、ｃＧ
ＭＰを検出・定量できるものである。
【００１５】ｃＧＭＰと特異的に結合する部位は、例え
ば、種々のｃＧＭＰ結合蛋白等のポリぺプチドである。
ｃＧＭＰ結合蛋白としては、ｃＧＭＰ依存性蛋白キナー
ゼＩα（ＰＫＧ Iα）が例示される。
【００１６】哺乳動物のＰＫＧ Iαは、図１に示される
４種の機能性ドメインを有するふたつの同一モノマーか
らなる。Ｎ−末端側に存在する二量体化ドメインは、ロ
イシン／イソロイシンジッパーモチーフからなる。ｃＧ
ＭＰが共存しない場合、ＰＫＧ Iαは、キナーゼ不活性
で、触媒中心が自己阻害ドメインによって占有されるク
ローズドコンホメーションを示す。一方、ｃＧＭＰと結
合したＰＫＧ Iαでは、自己阻害ドメインが活性中心か
ら除去され、ＰＫＧ Iαは、オープンコンホメーション
を示す。したがって、このようなＰＫＧ Iαの両末端に
発色団を連結させれば、ｃＧＭＰとの結合により光学的
変化が生じ、ｃＧＭＰとの結合を可視的に検出できる。
【００１７】もちろん、ｃＧＭＰと特異的に結合するポ
リぺプチドは、ＰＫＧ Iαや、ｃＧＭＰ結合蛋白に限定
されず、合成および天然のあらゆるぺプチド鎖を用いる
ことができる。
【００１８】この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブ
において、分子認識の結果を光学的変化として発信する
部位としては、種々の発色団が考慮される。このとき、
発色団は、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ結合部位の結合により生
じる立体構造の変化に応答して精度高く波長変化を生じ
なければならない。生化学の分野においては、一般的に
種々の蛍光発色団が用いられるが、立体構造の変化に敏
速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動
（ＦＲＥＴ）の生起による色調に変化を来たす発色団が
ある。
【００１９】したがって、この出願の発明のｃＧＭＰ可
視化プローブにおいては、分子認識の結果を光学的変化
として発信する部位として、異なる蛍光波長を有する２
つの蛍光発色団を、各々ｃＧＭＰと特異的に結合するポ
リぺプチドの両末端にそれぞれ連結する。このような蛍
光発色団としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）のブルーシ
フト変異蛋白である、シアン蛍光蛋白（ＣＦＰ）やＧＦ
Ｐのレッドシフト変異蛋白である黄色蛍光蛋白（ＹＦ
Ｐ）が好ましく選択される。このとき、ＣＦＰをｃＧＭ
Ｐと特異的に結合するポリぺプチドのＮ−末端に、ＹＦ
ＰをＣ−末端に連結することにより、それぞれドナーお
よびアクセプターとして作用し、ＦＲＥＴを生起する。
【００２０】したがって、この出願の発明のｃＧＭＰ可
視化プローブは、ｃＧＭＰと共存するとき、ｃＧＭＰ結
合蛋白部位とｃＧＭＰの結合が起こり、Ｎ−およびＣ−
末端のそれぞれの蛍光発色団によるＦＲＥＴが生起し
て、蛍光波長の変化が生じるものである。したがって、
この蛍光変化を通常行われる種々の化学的、生化学的、
分析方法を用いて測定することにより、ｃＧＭＰを検出
することが可能となるのである。また、蛍光強度とｃＧ
ＭＰ濃度の関係を予め検量することにより、溶液中にお
けるｃＧＭＰ濃度を定量することができるのである。
【００２１】この出願の発明では、以上のとおりのｃＧ
ＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させる方法として
は、様々な方法が考えられる。例えば、細胞を破壊し
て、細胞内からｃＧＭＰを溶出させ、その溶液にｃＧＭ
Ｐ可視化プローブを添加して、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視
化プローブを共存させる方法があげられる。このような
方法でｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プローブを共存させる
場合には、ｃＧＭＰをinvitroで検出・定量できる。
【００２２】また、この出願の発明では、ｃＧＭＰ可視
化プローブを組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞
に導入する方法により、ｃＧＭＰとｃＧＭＰ可視化プロ
ーブを共存させることができる。発現ベクターとして
は、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用
いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入
する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム
法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の
方法を採用することができる。このように、ｃＧＭＰ可
視化プローブを組み込んだ発現ベクターを細胞に導入す
る方法を用いることにより、細胞内でｃＧＭＰとｃＧＭ
Ｐ可視化プローブが共存でき、細胞を破壊することな
く、ｃＧＭＰの検出および定量をするin vivo法が可能
となる。
【００２３】さらに、この出願の発明のｃＧＭＰの検出
および測定方法では、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現す
るポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能
性細胞を個体発生することによって、この動物またはそ
の子孫動物の全細胞においてｃＧＭＰ可視化プローブと
ｃＧＭＰを共存させることもできる。
【００２４】この出願の発明では、以上のとおりの各種
方法により、ｃＧＭＰ可視化プローブを発現するポリヌ
クレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を
個体発生することによって、全細胞においてｃＧＭＰ可
視化プローブとｃＧＭＰが共存しているトランスジェニ
ック非ヒト動物が得られる。トランスジェニック非ヒト
動物は、公知の作成法（例えばProc. Natl. Acad. Sci.
USA 77; 7380-7384,1980）に従って作成することがで
きる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、す
べての体細胞にｃＧＭＰ可視化プローブを保有している
ため、例えば、その体内に医薬品や毒物などの検査物質
を導入し、細胞および組織におけるｃＧＭＰの濃度を測
定することによって、様々な物質のスクリーニングを行
うことができる。
【００２５】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。
【００２６】この出願の発明のｃＧＭＰ可視化プローブ
は、遺伝子的にコードされているため、通常の遺伝子工
学的手法を用いて、最適化することができる。例えば、
細胞内におけるｃＧＭＰ可視化プローブの位置などは、
シグナル配列やグアニリルシクラーゼ等の蛋白質、環状
ヌクレオチド作動性カチオンチャンネル、ＰＫＧ Iαの
アンカリング蛋白質等を融合することにより制御するこ
とができる。
【００２７】さらに、この出願の発明のｃＧＭＰ可視化
プローブと同様に、環状ヌクレオチドの結合ドメインに
関する遺伝子工学的知見に基づいて、環状アデノシン一
リン酸（ｃＡＭＰ）可視化プローブ等を発展させること
も考えられる。
【００２８】
【実施例】実施例１ ｃＧＭＰ可視化プローブの作成 発光オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍
光蛋白（ＥＧＦＰ：例えばCurrent Biology 6(2); 178-
182, 1996）の変異蛋白である、シアン蛍光蛋白（ＥＣ
ＦＰ：F64L/S65T/Y66W/ N146I/M153T/V163A/N212K）と
黄色蛍光蛋白（ＥＹＦＰ：S65G/V68L/Q69K/S72A/T203
Y）を、図１に示されるようにｃＧＭＰ依存性蛋白キナ
ーゼ（ＰＫＧ Iα）のＮ−およびＣ−末端にそれぞれ遺
伝子工学的に連結し、ＣＦＰ−ＰＫＧ Iα−ＹＦＰ融合
蛋白（以下ＣＧＹとする）を作成した。
【００２９】また、このＣＧＹにおいて、ＰＫＧ Iαの
アミノ酸配列を全長有するもの（以下ＣＧＹ−ＦＬとす
る）の他に、同様の方法により、ＰＫＧ Iαの１〜４７
番目のアミノ酸のうち、ロイシン、イソロイシン、およ
びシステイン残基をすべてアラニンに変換したもの（以
下ＣＧＹ−Ａ１２とする）、ＰＫＧ Iαの１〜４７番目
のアミノ酸を削除し、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)としたもの
（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ１とする）を作成した。
【００３０】さらに、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１において、ＰＫ
Ｇ Iα(Δ1-47)とＥＣＦＰの間にリンカー配列として、
ＭＤＥＬＫＹを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ２と
する）、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＹＦＰの間にＹＰＹＤ
ＶＰＤＹＡＮを導入したもの（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ３と
する）、およびＰＫＧ Iα(Δ1-47)とＥＣＦＰの間にリ
ンカー配列としてＭＤＥＬＫＹ、ＰＫＧ Iα(Δ1-47)と
ＥＹＦＰの間にＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮを導入したもの
（以下ＣＧＹ−Ｄｅｌ４とする）を同様に作成した。実施例２ チャイニーズハムスター卵巣細胞へのｃＧＭ
Ｐ可視化プローブ（ＣＧＹ）の導入 チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＨａｍのＦ−
１２培養液中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。
【００３１】得られたＣＨＯ−Ｋ１に、Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔＡＭＩＮＥ２０００試薬（ライフテクノロジー社製）
を用いて、ＣＧＹ−ＦＬ、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−
Ａ１２発現ベクターをそれぞれ遺伝子導入した。
【００３２】さらに、遺伝子導入後１２〜２４時間後に
これらの各種ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１を取り出し、ガラ
ス底培養皿に塗布した。実施例３ ｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）を導入さ
れたＣＨＯ−Ｋ１のイメージング まず、実施例２の培養液をＨａｎｋの平衡塩類溶液で置
換した。
【００３３】次に、ＭｅｔａＦｌｕｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ社製）で制御され、冷却ＣＣＤ
カメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ：Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ 社製）を有するＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉ
ｏｖｅｒｔ １３５顕微鏡で、ＣＧＹ導入後３〜５日経
過したＣＨＯ−Ｋ１を室温にてイメージングした。励起
は、波長４４０±１０ｎｍ、励起時間は５０ｍｓで、顕
微鏡像は、４８０±１５ｎｍフィルターおよび５３５±
１２．５ｎｍフィルターを通して、４０×の油浸レンズ
（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）で検出された。
【００３４】図２（ａ）に、遺伝子導入された細胞のＣ
ＦＰ（４８０ｎｍ）およびＹＦＰ（５３５ｎｍ）の顕微
鏡像を示した。これよりＣＧＹ−Ａ１２が、細胞核内に
まで導入されていることが示された。
【００３５】ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１の中の
約３０％が、ＣＦＰおよびＹＦＰによる細胞核での発光
を示したことから、ＰＫＧ Iαの二量体化ドメインにお
いて、ロイシン／イソロイシンジッパーモチーフにキナ
ーゼを細胞核外に留めるような情報が込められていると
考えられる。実施例４ ｃＧＭＰ可視化プローブ（ＣＧＹ）の応答性 実施例１で作成された各ＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１を、ｃ
ＧＭＰの細胞膜透過性ホスホジエステラーゼ抵抗性類似
体として知られる８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激し、蛍光顕
微鏡で蛍光を測定した。 （１） ＣＧＹ−ＦＬ発現ＣＨＯ−Ｋ１ 図２（ｂ）に、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加前および８−Ｂ
ｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）添加後の、ＣＧＹ発現ＣＨＯ−
Ｋ１細胞の４８０±１５ｎｍと５３５±１２．５ｎｍの
発光比の変化を示した。
【００３６】また、図３に、細胞質における発光比の経
時的変化を示した。
【００３７】これより、ＣＧＹ−ＦＬでは、発光比に大
きな変化が見られないことが明らかになった。また、Ｃ
ＦＰおよびＹＦＰの蛍光強度は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの
添加により影響されないことが明らかになった。 （２） ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１ 一方、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１では、図２ｂ
に示したとおり、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの添加によって発
光比の顕著な減少が確認された。
【００３８】また、図４に示したように、ＣＦＰおよび
ＹＦＰ強度には、相反的変化が見られた。また、発光比
の減少は、ＣＦＰおよびＹＦＰ強度の相反的変化と経時
的に同様な傾向にあることが分かった。
【００３９】以上より、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰがＣＧＹ−
Ｄｅｌ１と結合することにより、ＣＦＰおよびＹＦＰ間
の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が増大している
ことが示された。 （３） ＣＧＹ−Ａ１２発現ＣＨＯ−Ｋ１ また、ＣＧＹ−Ａ１２発現ＣＨＯ−Ｋ１では、８−Ｂｒ
−ｃＧＭＰの添加によって発光に変化が見られた（図２
ｂ、３）。しかし、その最大発光比変化は、ＣＧＹ−Ｄ
ｅｌ１におけるそれの約１／３程度と小さかった。実施例５ ｃＧＭＰ可視化プローブにおけるリンカー配
列導入の影響 ＣＨＯ−Ｋ１細胞中に実施例１で作成されたＣＧＹ−Ｄ
ｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、および
ＣＧＹ−Ｄｅｌ４を実施例２と同様の方法で発現し、発
光強度の変化を測定した。
【００４０】８−Ｂｒ−ｃＧＭＰと共存させた際の初期
発光比と蛍光比の変化の関係を図５に示した。
【００４１】これより、各ｃＧＭＰ発現ＣＨＯ−Ｋ１
で、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加に対する応答が確認された
が、ＭＤＥＬＫＹ、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＮのいずれのリ
ンカー配列も、初期発光比および蛍光比に対してあまり
大きな効果を示さないことが明らかになった。
【００４２】また、ＣＧＹ−Ａ１２とＣＧＹ−ＤＥＬ１
〜４の間で、初期発光比に大きな差が見られないことか
ら、この発明のｃＧＭＰ可視化プローブでは、ポリぺプ
チドプチド鎖中に種々の柔軟なドメインを導入すること
によって、その構造を最適化できるとが示唆される。
【００４３】以上の結果より、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１〜４
が、細胞中のｃＧＭＰ濃度を測定するためのｃＧＭＰ可
視化プローブとして好ましいものであることが示され
た。実施例６ ヒト胎児腎細胞へのＣＧＹの導入 ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）を１０％ＦＣＳ、１ｍ
Ｍ ピルビン酸ナトリウム、および０．１ｍＭの非必須
アミノ酸を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改良Ｅａｇｌｅ
培養液中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養し、ＨＥＫ２９
３を得た。
【００４４】得られたＨＥＫ２９３に、実施例２と同様
の方法で、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、ＣＧ
Ｙ−Ｄｅｌ３、ＣＧＹ−Ｄｅｌ４の発現ベクターをそれ
ぞれ遺伝子導入し、各ＣＧＹ発現ＨＥＫ２９３を得た。実施例７ ｃＧＭＰ可視化プローブを用いた生体細胞内
におけるｃＧＭＰの定量 ｃＧＭＰ可視化プローブを用いて、生体細胞を一酸化窒
素（ＮＯ）で刺激した際に発生する細胞内のｃＧＭＰを
検出した。
【００４５】まず、実施例６で得られたＣＧＹ−Ｄｅｌ
１導入ＨＥＫ２９３において、細胞内の可溶性グアニリ
ルシクラーゼを活性化させるためにＮＯを自発的かつ速
度論的に放出する化合物であるＮＯＣ−７を、最終的な
細胞外濃度が５００μＭとなるように添加した。
【００４６】図６にＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３
単一細胞におけるＮＯＣ−７誘発発光における顕微鏡像
を示した。
【００４７】図６から、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現したＨ
ＥＫ２９３細胞に５００μＭのＮＯＣ−７を添加するこ
とにより発光比は急激に減少するが、その後再び発光比
の増大が見られ、発光比はほぼ初期値まで戻ることが示
された。
【００４８】また、図７に、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥ
Ｋ２９３単一細胞におけるＮＯＣ−７誘発発光比の変化
を示した。
【００４９】発光比は、まず急激に減少し、その後緩や
かに増大した。
【００５０】次に、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３
を１００μＭのザプリナスト（ｃＧＭＰ特異的ホスホジ
エステラーゼの選択的阻害剤）で処理したところ、同様
に初期の急激な発光比の減少が見られた。しかし、その
後の緩やかな発光比の増大は見られなくなった。
【００５１】また、細胞をあらかじめ１０μＭのＯＤＱ
（ＮＯ感受性グアニリルシクラーゼの選択的阻害剤）で
処理した場合には、ＮＯＣ−７による発光比変化は全く
見られなくなった。
【００５２】図７から、発光比が減少した後に再び発光
比が増大する現象は、ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラ
ーゼによるｃＧＭＰ分解によるものと示唆される。
【００５３】同様の結果は、ＣＧＹ−ＤＥｌ２〜４を発
現したＨＥＫ２９３単一細胞についても得られた。
【００５４】以上より、この出願の発明のｃＧＭＰ可視
化プローブを用いて、生体細胞内におけるｃＧＭＰの発
生が確認できることが示された。実施例８ ｃＧＭＰ可視化プローブによる細胞内ｃＧＭ
Ｐ濃度変動の測定 そこで、上記の系にｃＧＭＰのホスホジエステラーゼ抵
抗性類似体である８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを１ｍＭ添加し
た。
【００５５】図８に結果を示した。
【００５６】発光比は、減少、増加の後、８−Ｂｒ−ｃ
ＧＭＰを１ｍＭ添加することにより、再び減少した。ま
た、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの代わりにザプリナストを用い
ても、同様に、発光比が回復した系での再減少が確認さ
れた。
【００５７】以上の結果より、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１のｃＧ
ＭＰ検出による応答が可逆的であり、この出願の発明の
ｃＧＭＰ可視化プローブを用いることにより生体細胞に
おけるｃＧＭＰ濃度の変動を測定することが可能となる
ことが確認された。
【００５８】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧＭ
Ｐを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプローブ
と、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法が提供され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のｃＧＭＰ可視化プローブの構成を例
示した概略摸式図である。
【図２】この発明の実施例において、ｃＧＭＰ可視化プ
ローブを発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞における８−Ｂｒ−
ｃＧＭＰ応答性を示した図である。（ａ）ＣＧＹ−Ｆ
Ｌ、ＣＧＹ−Ａ１２、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ１を発現し
た細胞の顕微鏡像である。（励起：４４０±１０ｎｍ、
フィルター：４８０±１５ｎｍ（ＣＦＰ）および５３５
±１２．５ｎｍ（ＹＦＰ））；（ｂ）１ｍＭの８−Ｂｒ
−ｃＧＭＰと共存させたＣＧＹ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の
４８０±１５ｎｍと５３５±１２．５ｎｍの発光比の経
時変化。
【図３】この発明の実施例において、ＣＧＹ−ＦＬ、Ｃ
ＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ａ１２を発現したＣＨＯ−Ｋ
１細胞を８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激した際の発光比の経
時的変化を示すグラフである。（ａ）ＣＧＹ−ＦＬ；
（ｂ）ＣＧＹ−Ｄｅｌ１；（ｃ）ＣＧＹ−Ａ１２
【図４】この発明の実施例において、４８０±１５ｎｍ
（ＣＦＰ）および５３５±１２．５ｎｍ（ＹＦＰ）にお
けるＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞質蛍
光強度の速度論的挙動を示すグラフである。（ａ）ＣＦ
Ｐ；（ｂ）ＹＦＰ
【図５】この発明の実施例において、ＣＧＹ−ＦＬ、Ｃ
ＧＹ−Ａ１２、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１、ＣＧＹ−Ｄｅｌ２、
ＣＧＹ−Ｄｅｌ３、およびＣＧＹ−Ｄｅｌ４の初期発光
比と発光比変化を示す図である。
【図６】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１
を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７
で刺激した際の細胞質の発光比を示す顕微鏡像である。
（ＮＯＣ−７添加９００秒後、８ーＢｒ−ｃＧＭＰを添
加。）
【図７】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１
を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７
で刺激した際の発光比の変化を示すグラフである。
（ａ）ＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞；（ｂ）
１００μＭのザプリナストで処理されたＣＧＹ−Ｄｅｌ
１発現ＨＥＫ２９３細胞；（ｃ）１０μＭのＯＤＱで処
理されたＣＧＹ−Ｄｅｌ１発現ＨＥＫ２９３細胞。
【図８】この発明の実施例において、ＣＧＹ−Ｄｅｌ１
を発現したＨＥＫ２９３細胞を５００μＭのＮＯＣ−７
で刺激した際の発光比の変化を示すグラフである。
（ａ）ＮＯＣ−７添加９００秒後、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ
添加；（ｂ）ＮＯＣ−７添加９００秒後、ザプリナスト
添加
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月１１日（２００１．４．１
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、in vivoにおいても高い精度で、簡便に、ｃＧＭ
Ｐを検出・定量することを可能とするｃＧＭＰプローブ
と、それを用いたｃＧＭＰの検出・定量方法が提供され
る。
【配列表】 <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Probe for imaging cGMP and method of detecting and determining cGM P <130> NP00199-SH <140> 2000-202730 <141> 2000-07-04 <160> 2 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligopeptide <400> 1 Met Asp Glu Leu Lys Tyr 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligopeptide <400> 2 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asn 1 5 10
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ ４Ｂ０６３ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｆ ４Ｂ０６５ 1/48 21/78 Ｃ ４Ｈ０４５ Ｇ０１Ｎ 21/64 33/15 Ｚ 21/78 33/50 Ｐ 33/15 Ｚ 33/50 33/58 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/58 ） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 EA01 FA02 GA07 GB07 GB21 JA03 KA02 KA05 LA03 2G045 AA40 CB01 CB17 DA12 DA77 FB07 FB12 GC15 2G054 AA08 AB02 AB07 CA21 CE02 EA03 GA04 GB02 4B024 AA11 BA10 BA80 CA04 CA07 CA10 DA02 DA03 GA13 GA18 HA11 4B050 CC05 EE01 LL03 4B063 QA01 QQ02 QQ08 QQ62 QR48 QR56 QS32 QS38 QX02 4B065 AA90X AA90Y AA93X AB01 AC09 AC14 AC16 BA02 BB01 BC01 BD32 BD50 CA24 CA29 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 CA50 DA89 EA50 FA74

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチ
    ドと、該ポリぺプチドの両末端に連結された異なる蛍光
    波長を有する２つの発色団からなることを特徴とするｃ
    ＧＭＰ可視化プローブ。
  2. 【請求項２】 ｃＧＭＰに特異的に結合するポリぺプチ
    ドがｃＧＭＰ結合蛋白である請求項１のｃＧＭＰ可視化
    プローブ。
  3. 【請求項３】 ｃＧＭＰ結合蛋白がｃＧＭＰ依存性キナ
    ーゼＩαである請求項２のｃＧＭＰ可視化プローブ。
  4. 【請求項４】 発色団がポリぺプチドのＮ−末端に連結
    されたシアン蛍光蛋白と、Ｃ−末端に連結された黄色蛍
    光蛋白である請求項１ないし３のいずれかのｃＧＭＰ可
    視化プローブ。
  5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ
    可視化プローブをｃＧＭＰと共存させ、蛍光波長の変化
    を測定することを特徴とするｃＧＭＰの検出および定量
    方法。
  6. 【請求項６】 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ
    可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に
    導入し、ｃＧＭＰ可視化プローブをｃＧＭＰと共存させ
    る請求項５のｃＧＭＰの検出および定量方法。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ
    可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に
    導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによ
    って、この動物またはその子孫動物の全細胞においてｃ
    ＧＭＰ可視化プローブとｃＧＭＰを共存させる請求項５
    の検出および定量方法。
  8. 【請求項８】 請求項１ないし４のいずれかのｃＧＭＰ
    可視化プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に
    導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによ
    って得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
  9. 【請求項９】 請求項８の非ヒト動物またはその子孫動
    物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動
    物の細胞におけるｃＧＭＰを定量する物質のスクリーニ
    ング方法。
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