KR101963904B1 - 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 항체의 바이오어세이법 및 측정 키트와 이들에 이용하는 신규 유전자 재조합 세포 - Google Patents

갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 항체의 바이오어세이법 및 측정 키트와 이들에 이용하는 신규 유전자 재조합 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조작이 간편하면서도 안전한 TSH 수용체 항체의 측정 방법 및 측정 키트를 제공한다. 본 발명은 TSH 수용체, 시클릭 뉴클레오티드 응답성 칼슘 채널 및 에쿼린 발광 단백질을 함께 발현시킨 유전자 재조합 세포를 포함하는 조성물을 제공함으로써, 시료 중에 포함되는 TSH 수용체 항체의 측정을 가능하게 하였다.

Description

갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 항체의 바이오어세이법 및 측정 키트와 이들에 이용하는 신규 유전자 재조합 세포{BIOASSAY MEHTOD FOR ANTIBODY AGAINST THYROID-STIMULATING HORMONE RECEPTOR, MEASUREMENT KIT FOR THE ANTIBODY, AND NOVEL GENETICALLY MODIFIED CELL FOR USE IN THE BIOASSAY METHOD OR THE MEASUREMENT KIT}
본 발명은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 상기 세포를 포함하는 조성물, 상기 조성물의 갑상선 질환 진단에 대한 용도, 및 상기 조성물을 이용한 갑상선 질환의 진단 방법 등에 관한 것이다.
하수체에 의해 생산되는 갑상선 자극 호르몬(TSH)은, 갑상선에 존재하는 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR)에 결합하여 갑상선 호르몬의 분비를 촉진한다. 갑상선 호르몬은 전신의 신진 대사를 높이는 호르몬이기 때문에, 이 호르몬의 작용의 이상 항진 또는 이상 저하에 의해 심신에 다양한 영향을 미쳐 갑상선 질환을 야기한다. 예를 들면, 바세도우병에서는, 체내에 TSHR 자극형 항체(TSAb:Thyroid stimulating antibody)가 생산되고, 그것이 TSH 대신에 TSHR을 지나치게 자극하기 때문에, 갑상선 기능이 항진되어 갑상선 종대, 안구 돌출, 빈맥 등의 증상이 출현한다. 한편, 갑상선 기능 저하증 중에는, TSHR 결합 저해형 항체(TSBAb:Thyroid stimulation blocking antibody)가 생산되서 갑상선 기능이 저하되어, 체중 증가, 우울 상태, 전신 피로 등의 증상이 출현하는 질환도 존재한다.
지금까지, 혈중에서의 이들 자기 항체(TSAb 및 TSBAb)의 측정이 바세도우병 및 갑상선 기능 저하증의 진단에 이용되어 오고 있었다.
대표적인 측정 방법으로는, 방사성 동위원소 표식한 TSH 또는 TSHR에 대한 모노클로날 항체를 이용하여, 환자 혈청 중의 자기 항체와 TSHR과의 결합에 대하여 경합 저해시킴으로써 결합 항체량을 측정하는 방사성 수용체 어세이법(TBII법), 또는 TSHR에 결합하는 항체를 돼지 갑상선 세포 등에 작용시키고, 갑상선 세포에서의 cAMP의 농도의 상승을 방사성 동위원소 표식 cAMP를 이용하여 측정함으로써 TSAb의 양을 측정하는 바이오 어세이법(TSAb법)이 보고되어 있다(비특허 문헌 1 및 비특허 문헌 2).
Methods in Enzymology, 74, 405 내지 420(1981) J Clin Endocrinol Metab. 1986 May; 62(5):855-62
본 발명의 목적은, 특별한 기술이나 설비를 요하는 방사성 동위원소를 사용하지 않고 종래 방법에 비해 간편히 조작할 수 있는, TSAb 및/또는 TSBAb의 측정용 조성물 및 갑상선 질환 진단용 조성물 등을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 이용한 갑상선 질환의 진단 방법 등을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR)에 TSHR 자극형 항체(TSAb)가 결합함으로써 생성되는 cAMP가 야기하는 칼슘 이온의 세포 내로의 유입량을 칼슘 감수성 단백질을 이용하여 측정하였다. 그로 인해, 본 발명자는 방사성 동위원소를 이용하지 않고서 TSAb의 양을 측정하는 데에 성공하였다. 또한, 마찬가지의 원리를 이용하여 TSHR 결합 저해형 항체(TSBAb)의 양을 측정하는 데에도 성공하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 및 상기 세포를 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 TSHR, cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를 포함하는, 생물 시료 중의 TSHR 자극성의 항체량 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체량의 측정용, 갑상선 질환의 진단용, 갑상선 질환을 발병하는 위험성이 높은 인간의 판정용, 또는 갑상선 질환의 치료를 받고 있는 인간의 치료 효과 판정용의 조성물 및 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 하기 공정 (1), (2) 및 (3), 또는 (1'), (2) 및 (3):
(1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2 + 불포함 배지 또는 Ca2 + 및 Mg2 + 불포함 배지, TSH 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 포함하는 혼합물을 제조함; 또는
(1') 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2 + 불포함 배지 또는 Ca2 + 및 Mg2 + 불포함 배지 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 포함하는 혼합물을 제조함;
(2) (1) 또는 (1')에서 제조한 혼합물에 Ca2 + 함유 용액을 첨가함; 및
(3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정함
을 포함하는, 갑상선 질환의 판정 방법, 갑상선 질환을 발병할 위험성이 높은 인간의 판정 방법 또는 갑상선 질환에 대한 치료의 유효성을 판정하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 하기 공정 (1) 내지 (3):
(1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2 + 함유 배지, TSH 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 포함하는 혼합물을 제조함;
(2) (1)에서 제조한 혼합물에 포르스콜린 함유 용액을 첨가함; 및
(3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정함
을 포함하는, 갑상선 기능 저하증의 판정 방법, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간의 판정 방법 또는 갑상선 기능 저하증에 대한 치료의 유효성을 판정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 방사성 동위원소를 사용함에 따른 번잡한 조작을 요하지 않고, 간편하면서도 안전한 조작으로, 생물 시료 중의 TSHR 자극형 항체(TSAb)의 양 및 TSHR 결합 저해형 항체(TSBAb)의 양을 측정할 수 있어, 갑상선 질환을 진단할 수 있다.
도 1은 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주로부터 발생되는 발광이, 소 유래 TSH(bTSH)의 농도에 의존적인 것을 도시한 도면이다.
도 2는 저용량의 bTSH에서의, 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주로부터 발생되는 발광량을 도시한 도면이다.
도 3은 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주로부터 발생되는 발광량에 대한, 에쿼린 발광 기질의 농도 및 배양 시간의 영향을 도시한 도면이다.
도 4는 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주로부터 발생되는 발광량에 대한, 도입하는 TSHR 발현 플라스미드량의 영향을 도시한 도면이다.
도 5는 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주의 세포 농도와 발광량의 관계를 나타낸 도면이다.
도 6은 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주의 세포 농도와 발광량의 관계를, 각 블랭크값을 1로 한 상대값으로 나타낸 도면이다.
도 7은 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주로부터 발생되는 발광량에 대한, 첨가하는 CaCl2의 농도의 영향을 도시한 도면이다.
도 8은 본 발명에 관한 키트가 TSHR 자극형 항체(TSAb)를 정량할 수 있는 것을 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명에 관한 키트가 TSHR 결합 저해형 항체(TSBAb)를 검출할 수 있는 것을 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명에 관한 키트가 세포의 탈감작을 이용하여 TSHR 결합 저해형 항체(TSBAb)를 검출할 수 있는 것을 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명에 관한 키트가 종래품[갑상선 자극성 자기 항체 키트 TSAb 키트 "야마사"(등록상표)]보다 고감도로 TSHR 자극형 항체(TSAb)를 검출할 수 있는 것을 도시한 도면이다.
도 12는 인간 TSHR, 개변 CNG 채널 및 개변 에쿼린을 발현하는 CHO 세포주로부터 발생되는 발광량의 경시 변화를 도시한 도면이다.
도 13은 저해형 항체의 농도 의존성을 도시한 도면이다.
도 14는 포르스콜린 용액 첨가에 의한 저해형 항체의 검출의 농도 의존성을 도시한 도면이다.
도 15는 자극형 항체(TSAb)의 배양 시간에 따른 발광량의 변화를 나타낸 도면이다.
도 16은 저해형 항체(TSBAb)의 배양 시간에 따른 발광량의 변화를 나타낸 도면이다.
도 17은 포르스콜린 첨가에 의한 저해형 항체(TSBAb)의 배양 시간에 따른 발광량의 변화를 나타낸 도면이다.
도 18은 플라스미드 pmCNGα2를 나타낸 도면이다.
도 19는 플라스미드 pcDNA mt s AEQ를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명에 관한 키트를 이용하여 측정한 건강한 정상인 48예의 TSAb값의 막대 그래프를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명에 관한 키트를 이용하여 측정한 각종 갑상선 질환 유래의 혈청 샘플 중의 TSAb값의 분포를 도시한 도면이다.
본 발명은, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 및 상기 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR)는, 갑상선 자극 호르몬(TSH)이 결합하는 수용체이면 좋고, 아데닐산 시크라제를 활성화하여 cAMP를 증가시키는 수용체를 포함한다. TSHR의 유래는 포유류이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 인간, 마우스, 소, 래트, 돼지일 수 있다. 또한, TSHR은, 적절하게 그 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 개변(부가, 치환, 결실 등)되어도 좋고, 또는 TSHR은, 천연의 TSHR에 대하여 아미노산 서열의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, TSH가 결합하여, 아데닐산 시크라제를 활성화해서 cAMP를 증가시키는 기능을 갖는 단백질이어도 좋다.
TSHR은, 서열번호 1로 나타내지는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한 TSHR은, 서열번호 1로 나타내지는 아미노산 서열과의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, TSH가 결합하여, 아데닐산 시크라제를 활성화해서 cAMP를 증가시키는 기능을 갖는 단백질일 수 있다.
또는 TSHR은, TSHR와 유사한 수용체, 예를 들면 황체호르몬 수용체, 난포 자극 호르몬 수용체, 인간 융모성 고나도트로핀 수용체 등과 TSHR과의 키메라 단백질일 수 있다. 이들 키메라 단백질은, TSHR의 아미노산 잔기 8-89 또는 8-165 이외의 부분을, 황체호르몬 수용체, 난포 자극 호르몬 수용체, 인간 융모성 고나도트로핀 수용체가 적절한 부분과 치환함으로써 제조해도 좋다. 예를 들면, TSHR-황체호르몬 수용체 키메라 단백질을 제조하기 위하여, TSHR의 아미노산 잔기 90-165를 LH-CG 수용체의 세그먼트 Mc2와 치환하고, 또한, TSHR의 아미노산 잔기 261-370을 LH-CG 수용체의 세그먼트 Mc4와 치환해도 좋다.
또한 본 발명에서, TSH는 포유류 유래이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 인간, 마우스, 소, 래트, 돼지 유래일 수 있다. TSH는, 적절하게 그 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 개변(부가, 치환, 결실 등)되어도 좋고, 천연의 TSH에 대하여, 아미노산 서열의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, TSHR에 결합하여, 아데닐산 시크라제를 활성화해서 cAMP를 증가시키는 기능을 갖는 단백질이어도 좋다.
cAMP 의존성 칼슘 채널은, cAMP의 농도 변화에 응답하여 칼슘 이온의 세포로의 유입량을 변화시키는 채널이며, cAMP의 농도 증가에 응답하여 세포 내로의 칼슘 이온 유입량을 증대시키는 채널을 포함한다. cAMP 의존성 칼슘 채널의 예로는, CNG(고리형 뉴클레오티드-개폐형 이온 채널; cyclic nucleotide gated ion channel) 칼슘 채널이 있다. 경우에 따라서 그 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 개변(부가, 치환, 결실 등)되어 있어도 좋고, 예를 들면, cGMP에 비해 cAMP에 의해 감수성을 나타낸 바와 같이 개변(치환, 부가, 결실을 포함함)되어도 좋다. CNG 칼슘 채널은, 천연의 CNG 칼슘 채널에 대하여, 아미노산 서열의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, cAMP의 농도 증가에 응답하여 세포 내로의 칼슘 이온 유입량을 증대시키는 단백질일 수 있다. 개변의 예로는, 마우스 CNG 칼슘 채널에서의 460번째의 시스테인의 트립토판으로의 치환, 마우스 CNG 칼슘 채널에서의 583번째의 글루탐산의 메티오닌으로의 치환, 소 CNG 칼슘 채널에서의 537번째의 트레오닌의 세린, 메티오닌, 발린 또는 알라닌으로의 치환, 및 이들의 조합 등을 들 수 있다. 상기에 예로 든 치환은, 그 유래로 하는 동물 종에 한하지 않고, 다른 동물 종의 대응하는 부위에서의 아미노산의 치환에도 적용된다. 예를 들면, 소 CNG 칼슘 채널에서의 537번째의 트레오닌에 대응하는 마우스 CNG 칼슘 채널의 트레오닌을, 세린, 메티오닌, 발린 또는 알라닌으로 치환할 수 있다. 치환은, 1 이상의 위치에서 행할 수 있으며, 예를 들면 마우스 CNG 칼슘 채널에서의 460번째의 시스테인의 트립토판으로의 치환을 행하는 동시에, 583번째의 글루탐산의 메티오닌으로의 치환을 행할 수도 있다.
CNG 칼슘 채널은, α-서브 유닛 및/또는 β-서브 유닛으로 이루어질 수 있다. 그 구성은 임의이며, 예를 들면 α2 서브 유닛, α3 서브 유닛, α4 서브 유닛 및 β1b 서브 유닛으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 서브 유닛으로 이루어지는 구성을 취할 수 있다. 그리고, 서브 유닛은, 각각 상기한 바와 같이 개변될 수 있다.
CNG 칼슘 채널의 유래는 포유류이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 인간, 마우스, 소, 래트, 돼지일 수 있다. CNG 칼슘 채널은, 서열번호 2로 나타내지는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한, CNG 칼슘 채널은, 서열번호 2로 나타내지는 아미노산 서열과의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, cAMP의 농도 증가에 응답하여 세포 내로의 칼슘 이온 유입량을 증대시키는 단백질일 수 있다.
칼슘 감수성 단백질은, 칼슘에 응답하여 구조가 변화하는 단백질을 포함하고, 칼슘을 감수하여 발광하는 단백질, 이른바 칼슘 센서로서 기능하는 단백질을 포함한다.
칼슘 감수성 단백질의 예로는, 에쿼린(aequorin), 카멜레온(cameleon; 인비트로젠), 케이스12(Case12; 에브로뉴(Evrogne)사), 클라이틴, 오벨린, 미트로코민, 미네옵신, 벨보인, 칼슘에 감수성이 있는 칼모듈린과 그것에 결합하는 미오신 경쇄 키나아제의 일부 배열과 2개의 색의 서로 다른 GFP를 결합한 단백질, GFP의 아미노산 서열의 144번과 146번의 사이에 칼모듈린을 결합한 칼슘 감수성 단백질, 및 일본 특허 공개 제2002-153279에 기재되어 있는 프로브 번호 G3-85, A1-2의 단백질, 또는 존재하는 경우에는, 이들 아포 단백질(예를 들면, 아포에쿼린)을 들 수 있다.
칼슘 감수성 단백질은, 적절하게 목적에 따라서 그 아미노산 서열이 개변(부가, 치환, 결실 등)되어도 좋고, 발광량을 증가시키기 위해서 및/또는 SN비를 좋게 하기 위해서 개변되어도 좋다. 개변에는, 아미노산 서열에서의, 1개 또는 수개의 아미노산의 부가, 치환, 결실이 포함된다. 칼슘 감수성 단백질에는, 천연 칼슘 감수성 단백질의 아미노산 서열과의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서 칼슘을 감수하여 발광하는 단백질이 포함된다. 예를 들면, 칼슘 감수성 단백질은, 그 유전자를 인간형의 코돈 빈도에 최적화하고, 미토콘드리아 이행 시그널을 갖도록 개변될 수 있다.
칼슘 감수성 단백질은, 서열번호 3으로 나타내지는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한, 칼슘 감수성 단백질은, 서열번호 3으로 나타내지는 아미노산 서열과의 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 칼슘을 감수하여 발광하는 단백질일 수 있다.
본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질은, 각각 세포에 일과성 또는 안정적으로 발현한다. 세포는 특별히 한정되지 않으며, CHO 세포, HEK293 세포, 3T3 세포 등의 세포주일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포는, TSHR이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, cAMP 의존성 칼슘 채널이 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개변 CNG 칼슘 채널이고, 칼슘 감수성 단백질이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개변 아포에쿼린이고, 각 단백질을 안정적으로 발현시킨 CHO 세포일 수 있다. 또한, 예를 들면, 본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포는, TSHR, cAMP 의존성 칼슘 채널, 칼슘 감수성 단백질의 각각이, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대하여, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 각각이 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널, 또는 칼슘 감수성 단백질의 기능을 유지한 단백질을 안정적으로 발현시킨 CHO 세포일 수 있다.
또한, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 단백질을 천연적으로 발현하는 세포를 이용해도 좋고, 상기 세포에 발현하지 않은 단백질을 일과적 또는 안정적으로 발현시킴으로써, 본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를 제조할 수도 있다. 이러한 예로서, FRTL-5 또는 Nthy-ori 3-1 등의 TSHR을 내재적으로 발현하는 갑상선 유래의 세포에, cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 각각 일과성 또는 안정적으로 강제 발현시킨 세포, CNG 칼슘 채널을 내재적으로 발현하는 후조직 유래의 세포에, TSHR 및 칼슘 감수성 단백질을 각각 일과성 또는 안정적으로 강제 발현시킨 세포를 들 수 있다.
본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포는 동결 보존할 수 있다. 동결 보존은, 세포 동결 보존액으로 적절한 온도, 예를 들면 -20℃ 또는 -80℃에서 보존될 수 있다. 세포 동결 보존액은, 한정되지는 않지만, 셀뱅커(CELLBANKER; 등록상표)(닛본 전약 공업), 뱀뱅커(등록상표)(가부시끼가이샤 인포텍), 셀베이션(Cellvation; 등록상표)(셀록스 래보레이토리스, 인크.(CELOX LABORATORIES, Inc.)), 크리오스토르(CryoStor; 등록상표)(바이오라이프 솔루션스(BIOLIFE SOLUTIONS)) 등이 포함된다. 동일 로트의 세포를 대량으로 동결 보존함으로써, 조성물 사이 또는 키트 사이에서의 세포에 유래하는 측정 오차를 크게 억제할 수 있어, 측정 결과의 재현성을 양호한 것으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포는 동결 보존하여, 그것을 온욕 등으로 해동한 후에도, 인간 혈중에 존재하는 TSHR 자극형 항체(TSAb) 및 TSHR 결합 저해형 항체(TSBAb)를 검출하는 데 충분한 감수성을 유지한다. 또한, 해동 후에 적절한 용기에 파종하여, 배양을 약 2시간 정도 행하는 것만으로, TSAb 및 TSBAb의 검출를 위해 첨가되는 시약이나 인간 혈액 유래의 성분에 의해 세포의 상태가 나빠지는 일이 없다.
본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 조성물[예를 들면, 본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 수용액]은, TSHR 자극성의 항체의 양 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체의 양의 측정용, 갑상선 질환의 진단용, 갑상선 질환을 발병할 위험성이 높은 인간의 판정용, 및/또는 갑상선 질환의 치료를 받고 있는 인간의 치료 효과의 판정용에 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 갑상선 질환에는, 갑상선 기능 항진증 및 갑상선 기능 저하증이 포함되며, 갑상선 기능 항진증에는 바세도우병이 포함되고, 갑상선 기능 저하증에는 하시모토병이 포함된다. 본 명세서에 있어서, 하시모토병은, 혈중에 있어서 TSBAb가 양성인 갑상선 기능 저하증, 갑상선종이 없는 위축성 갑상선염, TSBAb에 의해 야기되는 위축성 갑상선염, 점액 수종을 포함한다.
갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
TSHR 자극성의 항체(TSAb)는, TSHR의 아고니스트로서 작용할 수 있는 항체이며, 바세도우병 환자의 혈중에서 발견할 수 있다.
TSHR 결합 저해형의 항체(TSBAb)는, TSHR에 결합하여 TSHR의 길항제로서 작용할 수 있는 항체이며, 예를 들면, TSH의 TSHR에 대한 결합을 경합 저해하는 항체를 포함한다. TSHR 결합 저해형의 항체(TSBAb)는, 갑상선 기능 저하증의 환자의 혈중, 예를 들면 하시모토병의 환자의 혈중에서 발견할 수 있다.
생물 시료 중에 존재하는 TSHR 자극성의 항체(TSAb) 또는 TSHR 결합 저해형의 항체(TSBAb)는, 이하의 작용 기구를 이용하여 측정될 수 있다.
(1) 생물 시료 중에 TSHR 자극성의 항체( TSAb )가 존재하는 경우
TSAb는 본 발명에 관한 세포상의 TSHR에 작용함으로써 cAMP를 증가시킨다. 이에 따라, CNG 칼슘 채널이 활성화되어 칼슘의 세포 내 유입이 증가하기 때문에, 칼슘 감수성 단백질이 발광한다. 즉, 샘플 중의 TSAb의 존재는, 칼슘 감수성 단백질의 발광이라는 아웃풋으로서 나타난다.
(2) 생물 시료 중에 TSHR 결합 저해형의 항체( TSBAb )가 존재하는 경우
(a) TSH와의 경합 저해를 이용하는 방법
TSBAb는 TSH와 함께 첨가됨으로써, TSH의 TSHR에 대한 결합을 경합 저해한다. 이에 따라, TSH의 작용을 저해하여 cAMP의 농도의 증가를 억제함으로써, CNG 칼슘 채널을 통한 칼슘의 유입의 증가도 억제되어, 칼슘 감수성 단백질의 발광이 억제된다. 즉, 샘플 중의 TSBAb의 존재는 칼슘 감수성 단백질의 발광 억제라는 아웃풋으로서 나타난다.
(b) CNG 칼슘 채널의 탈감작을 이용하는 방법
TSBAb는 TSH와 함께 첨가됨으로써, TSH의 TSHR에 대한 결합을 경합 저해한다. 이에 따라, TSH의 작용을 저해하여 cAMP의 농도의 증가를 억제한다. 여기서, 만약에 TSBAb가 존재하지 않으면, TSH의 작용에 의해 cAMP의 농도가 증가하여 CNG 칼슘 채널이 활성화되지만, 일정 시간 후에 상기 CNG 칼슘 채널은 탈감작되어, 새롭게 첨가되는 포르스콜린(또는, cAMP의 농도를 증가시키는 약제)에 응답하지 않는다. 따라서, 샘플에 TSBAb가 존재하지 않으면, 칼슘의 세포 내 유입은 발생하지 않고, 칼슘 감수성 단백질의 발광의 억제라는 아웃풋으로서 나타난다. 한편, 샘플 중에 TSBAb가 존재하면, CNG 칼슘 채널은 탈감작이 발생하지 않아, 칼슘 감수성 단백질의 발광은 억제되지 않는다.
본 발명의 하나의 실시 양태에서는, 상기한 작용 기구를 이용하여 본 발명에 관한 조성물을 이용함으로써, 생물 시료 중에서의 TSHR 자극성의 항체 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체를 검출할 수 있으며, 2개의 생물 시료에서의 TSHR 자극성의 항체 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체의 농도를 비교할 수 있고, 또는 2개의 생물 시료에서의 TSHR 자극성의 항체 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체의 상대량을 측정할 수 있다. 또한, 본 발명에 관한 조성물을 이용함으로써, 생물 시료 중에서의 TSHR 자극성의 항체 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체의 농도를 측정할 수도 있다.
본 명세서에서, 생물 시료에는 혈액 및 혈액으로부터 제조된 시료 등의 생물 유래의 시료가 포함되며, 예를 들면 인간의 혈액, 인간의 혈액으로부터 제조된 시료, 개의 혈액, 개의 혈액으로부터 제조된 시료, 고양이의 혈액, 고양이의 혈액으로부터 제조된 시료가 포함된다.
본 발명에 관한 조성물을 이용함으로써 인간의 혈중에서의 TSHR 자극성의 항체 및/또는 TSHR 결합 저해형의 항체를 측정할 수 있으므로, 피험자가 갑상선 질환을 앓고 있는지의 여부를 진단할 수 있다.
상기 (1)에서 설명한 작용 기구를 이용한 경우, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 바세도우병을 진단할 수 있다. 예를 들면, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량과, 피험자의 혈액 시료와 동량의 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정함으로써, 바세도우병을 진단할 수 있다. 이 경우, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 자극성의 항체(TSAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 바세도우병이라고 진단할 수 있다.
또한, 미리 다수의 정상인 집단, 예를 들면 50 내지 100명의 정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)을 측정하여, 그 평균치와 표준 편차(SD)를 산출해도 좋다. 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 자극성의 항체의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 바세도우병이라고 진단할 수 있다.
본원 명세서 및 특허청구의 범위에서, "정상인의 혈액 유래의 샘플"로부터 얻어지는 값이란, 특별히 언급이 없는 한 정상인의 혈액 시료(표준품)의 측정치 또는 정상인 집단의 측정치로부터 미리 얻어진 값 등일 수 있다.
또는, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)/정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)×100(%)을 산출해도 좋다(산출치를 산출치 A라고 한다). 미리, 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 바세도우병 환자 집단, 예를 들면 각각 50 내지 100명의 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)을 측정하여, 바세도우병의 유병 진단율(true positive rate) 및/또는 정상인인 것의 무병 진단율(true negative rate)이, 각각 예를 들면 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상인 컷오프치(cut off)를 설정해도 좋다. 산출치 A가 컷오프치보다 높은 경우, 피험자는 바세도우병이라고 진단할 수 있다. 컷오프치는, 연령, 성별 등의 대상이 되는 집단의 성질에 따라 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%로 할 수 있다.
또한, 항체(TSAb)의 표준품(예를 들면, NIBSC 90/672 또는 65/122)을 이용하여 농도를 단계 희석해서 검량선을 작성해도 좋다. 해당 검량선을 참고로 하여, 측정한 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량으로부터 실제 항체(TSAb)의 혈중 농도를 산출하여, 미리 측정한 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 바세도우병 환자 집단, 예를 들면 각각 50 내지 100명의 집단의 항체(TSAb)의 혈중 농도, 또는 문헌 등에서 보고되어 있는 공지 데이터와 비교함으로써, 피험자가 바세도우병인지의 여부를 진단할 수도 있다. 예를 들면, 정상인 집단의 (TSAb)의 혈중 농도의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자는 바세도우병이라고 진단할 수 있다.
발광량의 측정에 관해서는, 일정 시간의 적산치를 측정하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 5초간, 10초간, 15초간, 20초간, 30초간, 40초간, 50초간, 1분간의 적산치를 측정할 수 있다.
또한, 상기 (2)(a)에서 설명한 작용 기구를 이용하는 경우, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 갑상선 기능 저하증(하시모토병을 포함함)을 진단할 수 있다. 예를 들면, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량과, 피험자의 혈액 시료와 동량의 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포에서의 TSH에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정함으로써, 갑상선 기능 저하증을 진단할 수 있다. 이 경우, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량보다 낮으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수 있다.
또한, 미리 다수의 정상인 집단, 예를 들면 50 내지 100명의 정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량(적산치)을 측정하여, 그 평균치와 표준 편차(SD)를 산출해도 좋다. 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의해 야기되는 발광량이, 정상인 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의해 야기되는 발광량(적산치)의 평균치-nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 낮으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수 있다.
또는, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)/정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)×100(%)을 산출해도 좋다(산출치를 산출치 B라고 한다). 미리, 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각 50 내지 100명의 집단의 혈액 시료에 기인하는 발광량(적산치)을 측정하여, 갑상선 기능 저하증의 유병 진단율 및/또는 정상인인 것의 무병 진단율이, 각각 예를 들면 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상인 컷오프치를 설정하고, 산출치 B가 컷오프치보다 낮은 경우, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수도 있다. 컷오프치는, 연령, 성별 등의 대상이 되는 집단의 성질에 따라 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%로 할 수 있다.
또한, 기지 농도의 항체(TSBAb)의 표준품을 이용하여 농도를 단계 희석해서 검량선을 작성해도 좋다. 해당 검량선을 참고로 하여, 측정한 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량으로부터 실제 항체(TSBAb)의 혈중 농도를 산출하여, 미리 측정한 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각각 각 50 내지 100명의 집단의 항체(TSBAb)의 혈중 농도, 또는 문헌 등에서 보고되어 있는 공지 데이터와 비교함으로써, 피험자가 갑상선 기능 저하증인지의 여부를 진단할 수도 있다. 예를 들면, 정상인 집단의 (TSBAb)의 혈중 농도의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수도 있다.
발광량의 측정에 대해서는, 일정 시간의 적산치를 측정하는 것이 바람직하며, 예를 들면 5초간, 10초간, 15초간, 20초간, 30초간, 40초간, 50초간, 1분간의 적산치를 측정할 수 있다.
또한, 상기 (2)(b)에서 설명한 작용 기구를 이용하는 경우, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 갑상선 기능 저하증(하시모토병을 포함함)을 진단할 수 있다. 예를 들면, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 포르스콜린에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량과, 피험자의 혈액 시료와 동량의 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포에서의 포르스콜린에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정함으로써, 갑상선 기능 저하증을 진단할 수 있다. 이 경우, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수 있다.
또한, 미리 다수의 정상인 집단, 예를 들면 50 내지 100명의 정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 포르스콜린에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량(적산치)을 측정하여, 그 평균치와 표준 편차(SD)를 산출해도 좋다. 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 포르스콜린에 의해 야기되는 발광량이, 정상인 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 포르스콜린에 의해 야기되는 발광량(적산치)의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수도 있다.
또는, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)/정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)×100(%)을 산출해도(산출치를 산출치 C라고 한다) 좋다. 미리, 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각 50 내지 100명의 집단의 혈액 시료에 기인하는 발광량(적산치)을 측정하여, 갑상선 기능 저하증의 유병 진단율 및/또는 정상인인 것의 무병 진단율이, 각각 예를 들면 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상인 컷오프치를 설정하고, 산출치 C가 컷오프치보다 높은 경우, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수도 있다. 컷오프치는, 연령, 성별 등의 대상이 되는 집단의 성질에 따라 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800% 또는 900%로 할 수 있다.
또한, 기지 농도의 항체(TSBAb)의 표준품을 이용하여, 농도를 단계 희석해서 검량선을 작성해도 좋다. 측정한 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 포르스콜린에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량으로부터 실제 항체(TSBAb)의 혈중 농도를 산출하여, 미리 측정한 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각각 각 50 내지 100명의 집단의 항체(TSBAb)의 혈중 농도, 또는 문헌 등에서 보고되어 있는 공지 데이터와 비교함으로써, 피험자가 갑상선 기능 저하증인지의 여부를 진단할 수도 있다. 예를 들면, 정상인 집단의 (TSBAb)의 혈중 농도의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 진단할 수도 있다.
발광량의 측정에 대해서는, 일정 시간의 적산치를 측정하는 것이 바람직하며, 예를 들면 5초간, 10초간, 15초간, 20초간, 30초간, 40초간, 50초간, 1분간의 적산치를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여, 갑상선 질환을 발병할 위험성이 높은 인간, 예를 들면 바세도우병 또는 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간을 판정할 수 있다.
예를 들면, 건강 진단시, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 혈중의 TSHR 자극성의 항체 농도가 바세도우병 환자의 수치보다 낮고 정상인의 수치보다 높으면, 바세도우병을 발병할 위험성이 높은 인간으로 판정할 수 있고, 혈중의 TSHR 결합 저해형의 항체 농도가 갑상선 기능 저하증의 수치보다 낮고 정상인의 수치보다 높으면, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간이라고 판정할 수 있다. 또한, 건강 진단시, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 혈중의 TSHR 자극성의 항체의 농도가 경시적으로 서서히 증가하고 있으면, 바세도우병을 발병할 위험성이 높은 인간이라고 판정할 수 있고, 혈중의 TSHR 결합 저해형의 항체의 농도가 경시적으로 서서히 증가하고 있으면, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간이라고 판정할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 갑상선 질환의 치료를 받고 있는 인간, 예를 들면 바세도우병 또는 갑상선 기능 저하증을 발병해서 그 치료를 받고 있는 인간의 치료의 유효성을 판단할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여, 치료의 전과 후 양쪽에서 동일 개체로부터 채취한 혈액 샘플에서의 TSHR 자극성의 항체 또는 TSHR 결합 저해형의 항체의 농도, 해당 농도의 경시 변화를 측정함으로써, 치료의 유효성의 유무를 판정할 수 있으며, 본 발명에 관한 조성물을 이용하여 혈중의 TSHR 자극성의 항체의 농도가 치료 전에 비해 치료 후에 저하되어 있으면, 바세도우병의 치료가 유효했다고 판정할 수 있고, 혈중의 TSHR 결합 저해형의 항체의 농도가 치료 후에 비해 치료 전에 저하되어 있으면, 갑상선 기능 저하증의 치료가 유효했다고 판정할 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 조성물 외에도, 세포 배양액, 검출액, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질 또는 그의 수용액, 항체 분리액, 세포 배양용 플레이트 또는 시험관, TSH 또는 그의 수용액, 항 TSH 항체 및 정상인 IgG 대조 혈청으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개를 포함할 수 있는 키트를 제공한다. 예를 들면, 키트를 구성하는 물질, 조성물을 개별적으로 곤포하여 이것들을 합쳐서 하나의 상자 등의 용기에 넣어 키트를 제조할 수 있다.
본 발명에 관한 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포는, 적절하게 제조될 수 있으며, 예를 들면 3×104세포/ml 내지 3×106세포/ml의 농도로 제조된다. 본 발명에 관한 세포는, 예를 들면 3×106세포/ml의 농도로 수용액으로 현탁하여 제조될 수 있다. 세포 배양용 플레이트로서 96구멍 플레이트를 이용하는 경우, 세포는 96구멍 플레이트의 1웰당, 예를 들면 3×103세포 내지 3×105세포로 파종될 수 있다.
세포 배양액은 본 발명에 관한 세포를 유지할 수 있는 것이면 한정되지 않으며, Ca2 + 불포함 또는 Ca2 +, Mg2 + 불포함일 수 있다.
검출액은, CaCl2, 트리판블루, 에쿼린을 발광시킬 수 있는 칼슘과 치환 가능한 양이온(예를 들면, 카드뮴 이온, 스트론튬 이온), 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 포함할 수 있다. CaCl2 및 트리판블루의 농도는, 당업자가 적절하게 설정할 수 있으며, 예를 들면 CaCl2의 농도는 9 내지 18mM, 트리판블루의 농도는 0.001 내지 0.010%이다. 예를 들면, 검출액은 9mM CaCl2, 0.002% 트리판블루를 포함하는 수용액이다. 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정할 때의 CaCl2의 최종 농도는 3 내지 6mM로 할 수 있다. 또한, 예를 들면 검출액에 칼슘과 치환 가능한 양이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 용해시킴으로써, 검출액이 칼슘과 치환 가능한 양이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 포함할 수 있다.
칼슘 감수성 단백질의 발광 기질은, 에쿼린의 발광 기질인 코엘렌테라진(coelenterazine) 또는 코엘렌테라진의 유도체를 포함하며, 코엘렌테라진의 유도체에는 비비렌(Viviren; 등록상표, 프로메가사)이 포함된다. 비비렌의 농도는 적절히 설정될 수 있으며, 예를 들면 0.6 내지 30mM이다. 예를 들면, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질의 수용액은 4mM 비비렌(프로메가) 수용액이다. 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정할 때의 비비렌의 최종 농도는 0.24 내지 12μM로 할 수 있다.
항체 분리액은 혈액 샘플로부터 TSHR 자극성의 항체 및 TSHR 결합 저해형의 항체를 회수할 수 있으면 되며, PEG6000을 10 내지 30% 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 분리액은 PEG6000을 30% 포함하는 수용액일 수 있다.
세포 배양용 플레이트의 예로는, 발광 측정 장치로 발광량을 측정할 수 있는 것이며, 세포 배양을 할 수 있는 96구멍 플레이트를 들 수 있다.
시험관은 특별히 한정되지 않으며, 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 칼슘 감수성 단백질로부터 발생하는 발광을 측정하는 장치에 적합한 시험관을 사용할 수 있다.
TSH는, TSHR의 아고니스트로서 사용할 수 있는 것이면 되며, 양성 대조로서 사용될 수 있다. TSH는 한정되지는 않지만, 소 유래의 TSH일 수 있다. TSH는 당업자가 적절하게 제조할 수 있으며, 0.01 내지 100mU/ml로 조정될 수 있다. 예를 들면, 소 유래 TSH는 1mU/ml의 수용액으로서 제조된다. 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정할 때의 소 유래 TSH의 최종 농도는, 0.6μU/ml 내지 6mU/ml로 할 수 있다. 예를 들면, 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정할 때의 소 유래 TSH의 최종 농도는 100μU/ml이다. 또한, TSH 대신에, 또는 TSH 외에도 TSAb를 사용할 수도 있다. TSAb는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.
정상인 IgG 대조 혈청은 음성 대조로서 사용될 수 있는 것이며, 당업자가 적절하게 제조할 수 있다.
항 TSH 항체는 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체이어도 좋다. 항 TSH 항체는 적절한 포유 동물 유래의 항체일 수 있으며, 마우스 항 TSH 항체, 래트 항 TSH 항체, 토끼 항 TSH 항체, 염소 항 TSH 항체가 포함된다. 항 TSH 항체는 당업자에 의해 적절하게 개변될 수 있다. 또한, 항원이 되는 TSH도 적절하게 선택되며, 항원이 되는 TSH에는, 인간 TSH, 마우스 TSH, 래트 TSH, 토끼 TSH, 고양이 TSH, 개 TSH가 포함된다. 본 발명의 키트에 이용되는 항 TSH 항체의 예로는, 염소 항 인간 TSH 폴리클로날 항체를 들 수 있다. 항 TSH 항체의 농도는 당업자가 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 키트에 곤포되는 항 TSH 항체 용액의 농도를 0.01μg/ml 내지 100μg/ml로 해도 좋다. 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 측정할 때의 항 TSH 모노클로날 항체의 최종 농도는, 예를 들면 0.05 내지 5.48μg/ml일 수 있다.
갑상선 기능 저하증의 환자 중에는 혈중의 TSH량이 높은 값인 환자가 존재한다. 이 경우, TSH에 의해 세포에서 칼슘 감수성 단백질이 발광하기 때문에, 갑상선 기능 저하증의 환자임에도 불구하고 바세도우병으로 진단될 수 있다. 그러나, 해당 TSH량이 높은 값인 갑상선 기능 저하증의 환자 유래의 혈액 시료를 항 TSH 항체와 함께 본 발명에 관한 세포에 첨가함으로써, 환자 유래의 TSH가 중화되기 때문에, 해당 환자를 바세도우병으로 잘못 진단하는 것을 회피할 수 있다. 또한, 항 TSH 항체를 환자 유래의 혈액 시료와 함께 본 발명의 세포에 첨가한 경우와, 항 TSH 항체를 첨가하지 않고 환자 유래의 혈액 시료를 본 발명의 세포에 첨가한 경우의 칼슘 감수성 단백질로부터 발생하는 발광량을 비교함으로써, 환자의 혈중에서의 TSH량에 관한 정보를 얻을 수 있다. 해당 정보와 환자의 임상 증상을 합침으로써, 의사는 갑상선 질환을 보다 정확하게 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는, 갑상선 질환의 환자의 혈청, 예를 들면 바세도우병 환자 및/또는 갑상선 기능 저하증 환자의 혈청을 더 포함하며, 이들 혈청은, 갑상선 질환의 진단, 상기 질환 발병의 위험성의 판정, 상기 질환의 치료의 유효성 판정에 있어서 대조 또는 농도 산출용의 표준품으로서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는, 아데닐산 시크라제를 활성화하는 물질, 예를 들면 포르스콜린을 포함할 수 있다. 피험자의 혈액 유래의 샘플을 TSH와 함께 세포에 첨가하고, 일정 시간 배양한 후에 포르스콜린을 첨가함으로써, 상기 샘플 중의 TSHR 결합 저해형의 항체의 존재, 비존재를 판정할 수 있다. 또한, 상기 샘플 중의 TSHR 결합 저해형의 항체의 농도를 측정할 수도 있으며, 이에 따라 갑상선 기능 저하증(예를 들면, 하시모토병)을 진단하여, 갑상선 기능 저하증(예를 들면, 하시모토병)을 발병할 위험성을 갖는 인간을 판정해서, 갑상선 기능 저하증(예를 들면, 하시모토병)의 치료를 받은 환자의 치료 효과를 판단할 수 있다.
본 발명에 관한 조성물 또는 키트는, 또한 환자의 임상 증상 및/또는 다른 검사 결과를 고려하여, 의사가 바세도우병 및/또는 갑상선 기능 저하증을 진단하기 위한 진단 보조에도 유용하다. 예를 들면, 갑상선 기능 항진증을 나타내는 환자의 혈액 시료 중의 TSHR 자극형 항체(TSAb)의 양을 본 발명에 관한 조성물 또는 키트를 이용하여 측정하는 것은, 바세도우병과 파괴성 갑상선 기능 항진증(예를 들면, 무통성 갑상선염, 아급성 갑상선염)의 감별 진단에 유용할 수 있다.
본 발명은, 또한 하기 공정 (A) 내지 (C):
(A) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2 + 불포함 배지, 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 포함하는 혼합물을 제조함;
(B) (A)에서 제조한 혼합물에 Ca2 + 함유 용액을 첨가함; 및
(C) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정함
를 포함하는, 바세도우병의 판정 방법을 제공한다.
상기 방법의 공정 (A)에서 사용하는 Ca2 + 불포함 배지는 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, Ca2 +, Mg2 + 불포함 배지일 수 있다.
상기 방법의 공정 (B)에서 사용하는 Ca2 + 함유 용액은 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, 예를 들면 CaCl2 용액일 수 있다. Ca2 + 함유 용액은 또한 칼슘과 치환 가능한 양이온(예를 들면, 카드뮴 이온, 스트론튬 이온), 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 포함할 수도 있다.
상기 방법의 공정 (A)에서 제조되는 혼합물은, 또한 항 TSH 항체를 포함할 수도 있다. 상기 방법의 공정 (A)에서 제조되는 혼합물이 항 TSH 항체를 포함함으로써, 혈중의 TSH량이 높은 값인 갑상선 기능 저하증의 환자를 잘못해서 바세도우병이라고 판정하는 것이 회피될 수 있다.
상기 방법의 공정 (A)에 기재한 물질을 어떠한 순서로 첨가할지는, 당업자가 적절하게 설정할 수 있다.
예를 들면, 본 발명은, 하기 공정:
(1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질을 첨가한 Ca2+ 불포함의 배지 속에서 배양하는 공정;
(2) 피험자의 혈액 유래의 샘플을 배양 세포에 첨가하고, 또한 배양하는 공정; 및
(3) 배양 세포에 CaCl2 용액을 첨가하고, 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정하는 공정을 포함하는, 바세도우병의 판정 방법을 제공한다.
해당 방법에 있어서, 세포는 동결 보존되어 있어도 좋고, 그 경우에는, 온욕 등의 온화한 조작에 의해 해동될 수 있다. 해동된 세포는 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질을 첨가한 Ca2 +, Mg2 + 불포함 배지 속에서 배양되어도 좋다. 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질에는, 코엘렌테라진 및 비비렌(등록상표)이 포함된다.
Ca2 + 불포함 배지는, 세포를 유지할 수 있는 것이면 되며, 예를 들면 130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4가 사용된다. 또한, Ca2 + 불포함 배지는, Ca2 + 및 Mg2 + 불포함 배지일 수 있다. 세포는, 적절한 용기에 적절한 농도로 파종하면 되며, 예를 들면 발광 측정 장치에 대응할 수 있는 96구멍 플레이트에 3 내지 30×104개/ml로 90μl/웰로 파종된다. 공정 (1)에서의 배양 시간은 2시간 이상이면 되며, 2 내지 8시간으로 설정될 수 있으며, 예를 들면 3시간이다. 일반적으로, 계대에 의한 손상으로부터 회복시켜, 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 증가시키기 위해서, 배양은 세포 파종 후 12 내지 24시간 정도 이루어지는 것이 통상적이지만, 본 발명에서는 2시간 정도의 배양으로도 첨가물에 의한 세포사가 야기되지 않아, 칼슘 감수성 단백질이 강한 발광을 나타내는 것이 확인되었다. 예를 들면, 칼슘 감수성 단백질로서 에쿼린를 채용하고, 그 DNA 배열의 코돈을 인간형에 최적화하고 미토콘드리아 이행 시그널을 부가함으로써, 또한 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질로서 비비렌(등록상표)을 채용함으로써, 세포 파종 후 2시간 정도로도 칼슘 감수성 단백질로부터의 강한 발광을 검출할 수 있음이 확인되었다.
공정 (2)에서 첨가되는 혈액 유래의 샘플은, 피험자 등의 혈액에 PEG 수용액을 가하여 침전 획분을 회수함으로써 제조된다. PEG 수용액의 예로는 30% PEG6000이 사용된다. 또한, 경우에 따라서 바세도우병 환자의 혈액 유래의 샘플을 양성 대조로서, 및/또는 정상인 유래의 혈액 샘플을 음성 대조로서 사용하여, 공정 (2)에서 각각 세포에 첨가할 수도 있다. 공정 (2)에서의 배양 시간은 한정되지는 않지만, 30 내지 60분간으로 할 수 있으며, 예를 들면 30분간으로 할 수 있다. 이에 의해, 세포 내에 cAMP가 축적되어, 샘플 첨가 후의 배양이 없는 경우에 비해 CaCl2 용액의 첨가 직후부터 보다 안정된 강한 발광을 측정할 수 있다.
공정 (2) 및 공정 (3)의 배양 시간이 총 약 4시간 이내이면, 시간이 짧기 때문에 무균적인 배양일 필요는 없다.
공정 (2)에서, 또한 항 TSH 항체를 배양 세포에 첨가해도 좋다. 항 TSH 항체는, 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체이어도 좋다. 항 TSH 항체는 적절한 포유 동물 유래의 항체일 수 있으며, 마우스 항 TSH 항체, 래트 항 TSH 항체, 토끼 항 TSH 항체, 염소 항 TSH 항체가 포함된다. 항 TSH 항체는, 당업자가 적절하게 개변할 수 있다. 또한, 항원이 되는 TSH도 적절하게 선택되며, 항원이 되는 TSH에는 인간 TSH, 마우스 TSH, 래트 TSH, 토끼 TSH, 고양이 TSH, 개 TSH가 포함된다. 본 발명의 방법에 이용되는 항 TSH 항체의 예로는, 염소 항 인간 TSH 폴리클로날 항체를 들 수 있다.
공정 (3)에서 사용하는 CaCl2 함유 용액은 또한 칼슘과 치환 가능한 양이온(예를 들면, 카드뮴 이온, 스트론튬 이온), 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 포함할 수도 있다. CaCl2 용액에 포함될 수 있는 Ca2 +, 칼슘과 치환 가능한 양이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및 탄산 이온의 농도는 세포를 유지할 수 있으며, 또한 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질이 적절히 발광하도록 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다.
공정 (3)에서, 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광은 CaCl2 용액의 첨가 후 바로 행해지며, 당업자에 의해 주지의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 교반과 측정을 자동적으로 연속해서 할 수 있는 발광 측정 장치(퍼킨엘머(PerkinElmer)사, ARVO-Sx)를 사용하여, 교반 후 15 내지 30초간의 발광치를 적산하여 발광량을 측정할 수 있다. 발광량의 측정에 사용할 수 있는 장치는 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.
상기 방법을 실시한 결과, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 높으면, 바세도우병이라고 판정할 수 있다. 또한, 혈중의 항체 농도를 구하여 바세도우병 환자 및/또는 정상인의 표준 항체 농도와 비교함으로써, 바세도우병인지의 여부를 판정할 수 있다.
예를 들면, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량과, 피험자의 혈액 시료와 동량의 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량을 측정하여, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 자극성의 항체(TSAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 바세도우병이라고 판정할 수 있다.
또한, 미리 다수의 정상인 집단, 예를 들면 50 내지 100명의 정상인의 혈액 시료를 첨가한 경우의 발광량(적산치)를 측정하여, 그 평균치와 표준 편차(SD)를 산출해도 좋다. 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 자극성의 항체의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 바세도우병이라고 판정할 수 있다.
또한, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)/정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)×100(%)을 산출해도(산출치를 산출치 D라고 한다) 좋다. 미리, 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 바세도우병 환자 집단, 예를 들면 각각 50 내지 100명의 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)를 측정하여, 바세도우병의 유병 진단율 및/또는 정상인인 것의 무병 진단율이, 각각 예를 들면 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상인 컷오프치를 설정하여, 산출치 D가 컷오프치보다 높은 경우, 피험자는 바세도우병이라고 판정할 수도 있다. 컷오프치는, 연령, 성별 등의 대상이 되는 집단의 성질에 따라서 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%로 할 수 있다.
또한, 항체(TSAb)의 표준품(예를 들면, NIBSC 90/672 또는 65/122)을 이용하여, 농도를 단계 희석해서 검량선을 작성해도 좋다. 해당 검량선을 참고로 하여, 측정한 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 칼슘 감수성 단백질의 발광량으로부터 실제 항체(TSAb)의 혈중 농도를 산출하여, 미리 측정한 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 바세도우병 환자 집단, 예를 들면 각각 50 내지 100명의 집단의 항체(TSAb)의 혈중 농도, 또는 문헌 등에서 보고되어 있는 공지 데이터와 비교함으로써, 피험자가 바세도우병인지의 여부를 판정할 수도 있다. 예를 들면, 정상인 집단의 (TSAb)의 혈중 농도의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자는 바세도우병이라고 판정할 수도 있다.
또한, 상기 방법을 실시한 결과, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 높고, 바세도우병 환자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 낮으면, 바세도우병을 발병할 위험성이 높은 인간이라고 판정할 수 있다. 또는, 혈중의 항체 농도를 구하여 바세도우병 환자 및/또는 정상인의 표준 항체 농도와 비교함으로써, 바세도우병을 발병할 위험성이 높은 인간인지의 여부를 판정할 수 있다.
또한, 공정 (2)에서, 피험자의 혈액 유래의 샘플로서, 동일한 바세도우병 환자의 치료 전과 치료 후의 샘플을 첨가하여, 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 비교함으로써, 상기 치료의 유효성을 판정할 수 있다. 시험을 한 결과, 치료 전보다 치료 후의 샘플이 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이 낮으면, 치료가 유효했다고 판정할 수 있다.
본 발명은, 또한 하기 공정 (A) 내지 (C):
(A) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2 + 불포함 배지, TSH 또는 자극형의 TSAb 모노클로날 항체, 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 포함하는 혼합물을 제조함;
(B) (A)에서 제조한 혼합물에 Ca2 + 함유 용액을 첨가함; 및
(C) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
을 포함하는, 갑상선 기능 저하증의 판정 방법을 제공한다.
상기 방법의 공정 (A)에서 사용하는 Ca2 + 불포함 배지는 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, Ca2 +, Mg2 + 불포함 배지일 수 있다.
상기 방법의 공정 (B)에서 사용하는 Ca2 + 함유 용액은 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, 예를 들면 CaCl2 용액일 수 있다. 또한, Ca2 + 함유 용액은 칼슘과 치환 가능한 양이온(예를 들면, 카드뮴 이온, 스트론튬 이온), 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 더 포함할 수도 있다.
상기 방법의 공정 (A)에 기재한 물질을 어떠한 순서로 첨가할지는 당업자가 적절하게 설정할 수 있다.
예를 들면, 본 발명은 하기 공정:
(1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질을 첨가한 Ca2+ 불포함 배지 속에서 배양하는 공정;
(2) 피험자의 혈액 유래의 샘플을 TSH와 함께 배양 세포에 첨가하고, 추가로 배양하는 공정; 및
(3) 배양 세포에 CaCl2 용액을 첨가하여, 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정하는 공정을 포함하는, 갑상선 기능 저하증(예를 들면, 하시모토병)의 판정 방법을 제공한다.
공정 (1) 내지 (3)은, 상기 바세도우병의 판정 방법을 참고로 하여 당업자에 의해 적절하게 실시될 수 있다.
경우에 따라서, 공정 (2)에서, 정상인의 혈액 유래의 샘플이 음성 대조로서, 및/또는 갑상선 기능 저하증 환자의 혈액 유래의 샘플이 양성 대조로서 사용되어, 각각 세포에 첨가될 수 있다. 또한, 공정 (2)에서의 배양 시간은 한정되지는 않지만, 30 내지 120분간으로 할 수 있으며, 예를 들면 30분간으로 할 수 있다. 또한, 공정 (2)에서, TSH는 소 유래 TSH일 수 있고, 경우에 따라서 TSH 대신에, 또는 TSH 외에도 TSAb를 첨가할 수 있다. TSAb는 모노클로날 항체일 수 있다.
상기 방법을 실시한 결과, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 낮으면, 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수 있다. 또한, 혈중의 항체 농도를 구함으로써, 갑상선 기능 저하증 환자 및/또는 정상인의 표준 항체 농도와 비교함으로써, 갑상선 기능 저하증인지의 여부를 판정할 수 있다.
예를 들면, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량과, 피험자의 혈액 시료와 동량의 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량을 측정하여, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량보다 낮으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수 있다.
또한, 미리 다수의 정상인 집단, 예를 들면 50 내지 100명의 정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의한 칼슘 감수성 단백질의 발광량(적산치)을 측정하여, 그 평균치와 표준 편차(SD)를 산출해도 좋다. 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의한 발광량이, 정상인 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포에서의 TSH에 의한 발광량(적산치)의 평균치-nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 낮으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수도 있다.
또한, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 경우의 발광량(적산치)/정상인의 혈액 시료를 첨가한 경우의 발광량(적산치)×100(%)을 산출해도(산출치를 산출치 E라고 한다) 좋다. 미리, 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각 50 내지 100명의 집단의 혈액 시료에 기인하는 발광량(적산치)을 측정하여, 갑상선 기능 저하증의 유병 진단율 및/또는 정상인인 것의 무병 진단율이, 각각 예를 들면 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상인 컷오프치를 설정하여, 산출치 E가 컷오프치보다 낮은 경우, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수도 있다. 컷오프치는, 연령, 성별 등의 대상이 되는 집단의 성질에 따라 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%로 할 수 있다.
또한, 기지 농도의 항체(TSBAb)의 표준품을 이용하여, 농도를 단계 희석해서 검량선을 작성해도 좋다. 해당 검량선을 참고로 하여, 측정한 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량으로부터 실제 항체(TSBAb)의 혈중 농도를 산출하여, 미리 측정한 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각각 각 50 내지 100명의 집단의 항체(TSBAb)의 혈중 농도, 또는 문헌 등에서 보고되어 있는 공지 데이터와 비교함으로써, 피험자가 갑상선 기능 저하증인지의 여부를 판정할 수도 있다. 예를 들면, 정상인 집단의 (TSBAb)의 혈중 농도의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수도 있다.
또한, 상기 방법을 실시한 결과, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 낮고, 갑상선 기능 저하증 환자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린의 발광량에 비교하여 높으면, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간이라고 판정할 수 있다. 또는, 혈중의 항체 농도를 구하여, 갑상선 기능 저하증 환자 및/또는 정상인이 표준 항체 농도와 비교함으로써, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간인지의 여부를 판정할 수 있다.
또한, 공정 (2)에서, 피험자의 혈액 유래의 샘플로서, 동일한 갑상선 기능 저하증 환자의 치료 전과 치료 후의 샘플을 첨가하여, 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 비교함으로써, 상기 치료의 유효성을 판정할 수 있다. 시험을 한 결과, 치료 전보다 치료 후의 샘플이 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이 높으면, 치료가 유효했다고 판정할 수 있다.
본 발명은, 또한 하기 공정 (A) 내지 (C):
(A) 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재한 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2 + 함유 배지, TSH 또는 자극형의 TSAb 모노클로날 항체, 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 포함하는 혼합물을 제조함;
(B) (A)에서 제조한 혼합물에 포르스콜린을 첨가함; 및
(C) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
을 포함하는, 갑상선 기능 저하증의 판정 방법을 제공한다.
상기 방법의 공정 (A)에서 사용하는 Ca2 + 함유 배지는 당업자가 적절하게 선택할 수 있으며, 예를 들면 CaCl2를 함유하는 배지일 수 있다. 또한, Ca2 + 함유 배지는 칼슘과 치환 가능한 양이온(예를 들면, 카드뮴 이온, 스트론튬 이온), 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및/또는 탄산 이온을 더 포함할 수도 있다. Ca2 + 함유 배지에 포함될 수 있는 Ca2 +, 칼슘과 치환 가능한 양이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 황산 이온 및 탄산 이온의 농도는, 세포를 유지할 수 있고, 또한 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질이 적절히 발광하도록 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다.
상기 방법의 공정 (A)에 기재한 물질을 어떠한 순서로 첨가할지는 당업자가 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 하기 공정:
(1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cAMP 의존성 칼슘 채널 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포를, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질을 첨가한 Ca2+ 함유 배지 중에서 배양하는 공정;
(2) 피험자의 혈액 유래의 샘플을 TSH와 함께 배양 세포에 첨가하고, 추가로 배양하는 공정; 및
(3) 배양 세포에 포르스콜린을 첨가하여, 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정하는 공정을 포함하는, 갑상선 기능 저하증(예를 들면, 하시모토병)의 판정 방법을 제공한다.
공정 (1) 내지 (3)은, 상기 바세도우병의 판정 방법을 참고로 하여 당업자에 의해 적절하게 실시될 수 있다.
경우에 따라서 공정 (2)에서, 정상인의 혈액 유래의 샘플이 음성 대조로서, 및/또는 갑상선 기능 저하증 환자의 혈액 유래의 샘플이 양성 대조로서 사용되어, 각각 세포에 첨가될 수 있다. 또한, 공정 (2)에서의 배양 시간은 한정되지는 않지만, 10 내지 120분간으로 할 수 있으며, 예를 들면 10분간으로 할 수 있다. 또한, 공정 (2)에서, TSH는 소 유래 TSH일 수 있으며, 경우에 따라서 TSH 대신에, 또는 TSH 외에도 TSAb를 첨가할 수 있다. TSAb는 모노클로날 항체일 수 있다.
공정 (3)에서, 포르스콜린의 농도는 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있다.
상기 방법을 실시한 결과, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 높으면, 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수 있다. 또한, 혈중의 항체 농도를 구함으로써, 갑상선 기능 저하증 환자 및/또는 정상인의 표준 항체 농도와 비교함으로써, 갑상선 기능 저하증인지의 여부를 판정할 수 있다.
예를 들면, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량과, 피험자의 혈액 시료와 동량의 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량을 측정하여, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인의 혈액 시료(표준품)를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수 있다.
또한, 미리 다수의 정상인 집단, 예를 들면 50 내지 100명의 정상인의 혈액 시료를 첨가한 경우의 발광량(적산치)을 측정하여, 그 평균치와 표준 편차(SD)를 산출해도 좋다. 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량이, 정상인 집단의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자의 혈중에서의 TSHR 저해형의 항체(TSBAb)의 농도가 정상인에 비교하여 높은 것으로 판단할 수 있어, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수도 있다.
또한, 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)/정상인의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량(적산치)×100(%)을 산출해도(산출치를 산출치 F라고 한다) 좋다. 미리, 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각 50 내지 100명의 집단의 혈액 시료에 기인하는 발광량(적산치)을 측정하여, 갑상선 기능 저하증의 유병 진단율 및/또는 정상인인 것의 무병 진단율이, 각각 예를 들면 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상인 컷오프치를 설정하여, 산출치 F가 컷오프치보다 높은 경우, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수도 있다. 컷오프치는, 연령, 성별 등의 대상이 되는 집단의 성질에 따라서 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800% 또는 900%로 할 수 있다.
또한, 기지 농도의 항체(TSBAb)의 표준품을 이용하여, 농도를 단계 희석해서 검량선을 작성해도 좋다. 해당 검량선을 참고로 하여, 측정한 피험자의 혈액 시료를 첨가한 세포로부터 발생하는 발광량으로부터 실제 항체(TSBAb)의 혈중 농도를 산출하여, 미리 측정한 다수의 정상인 집단 및 다수의 미치료 갑상선 기능 저하증 환자 집단, 예를 들면 각각 각 50 내지 100명의 집단의 항체(TSBAb)의 혈중 농도, 또는 문헌 등에서 보고되어 있는 공지 데이터와 비교함으로써, 피험자가 갑상선 기능 저하증인지의 여부를 판정할 수도 있다. 예를 들면, 정상인 집단의 (TSBAb)의 혈중 농도의 평균치+nSD(예를 들면, n=1, 2, 3, 4 또는 5)보다 높으면, 피험자는 갑상선 기능 저하증이라고 판정할 수도 있다.
또한, 상기 방법을 실시한 결과, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 높고, 갑상선 기능 저하증 환자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 낮으면, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간이라고 판정할 수 있다. 또는, 혈중의 항체 농도를 구하여, 갑상선 기능 저하증 환자 및/또는 정상인의 표준 항체 농도와 비교함으로써, 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은 인간인지의 여부를 판정할 수 있다.
또한, 공정 (2)에서, 피험자의 혈액 유래의 샘플로서, 동일한 갑상선 기능 저하증 환자의 치료 전과 치료 후의 샘플을 첨가하여, 세포로부터 발생하는 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량을 비교함으로써 상기 치료의 유효성을 판정할 수 있다. 시험을 한 결과, 치료 전보다 치료 후의 샘플이 에쿼린 등의 칼슘 감수성 단백질의 발광량이 낮으면, 치료가 유효했다고 판정할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 동결 세포의 구축 방법의 상세
인간 갑상선 유래의 cDNA 라이브러리로부터 PCR법에 의해 인간 갑상선 자극 호르몬 수용체의 cDNA 배열(진뱅크(Genbank) No.NM_000369)(서열번호 5)을 증폭하여, pUC18에 클로닝하였다. pUC18에 클론화한 hTSHR cDNA를 BamH1로 잘라내어, pZeoSV2 벡터(인비트로젠)에 리클로닝해서 pZeoSV2 hTSHR을 제조하였다.
마우스 후상피 세포 유래의 cDNA 라이브러리로부터 시클릭 뉴클레오티드 의존형의 칼슘 채널(진뱅크 No. BC048775)(서열번호 4)을 PCR법으로 증폭하여(1994bp) 발현 벡터(pCMVSPORT, 인비트로젠)에 클로닝해서 pmCNGα2(도 18)를 제조하였다. 또한, cAMP에 대한 선택성과 감도를 상승시키기 위해서, 460번째의 시스테인(C)을 트립토판(W)에, 583번째의 글루탐산(E)을 메티오닌(M)에 아미노산 치환을 도입한 개변 시클릭 뉴클레오티드 의존형의 칼슘 채널(서열번호 6)을 발현하는 컨스트럭트 pmCNGα2MW를 점변이 PCR법에 의해 제조하였다. 또한, 올리고 DNA 신장법에 의해 인간형의 코돈 빈도로 최적화하고, 미토콘드리아 이행 시그널을 갖는 합성 아포에쿼린 cDNA 배열(676bp)(서열번호 7)을, KpnI, NheI로 제한 효소 처리하고, KpnI, NheI로 처리한 pcDNA3.1(인비트로젠)에 클로닝하여 아포에쿼린 발현 벡터 pcDNA mt sAEQ(도 19)를 제조하였다.
CHO 세포주를 10cm2 페트리 접시에 세포 농도 1.0×105세포/ml로 파종하였다. 다음날, 페트리 접시당 1μg의 pZeoSV2 hTSHR, 2μg의 pmCNGα2MW, 2μg의 pcDNA mt sAEQ를 푸진(FuGENE)6TM(로슈사)을 이용하여 유전자 도입하였다. 다음날, 페트리 접시에 400μL의 베르센 용액(EDTA)을 첨가하여, 세포를 페트리 접시로부터 박리해서 10mL의 5% cFCS를 포함하는 DMEM/F12 배지에 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 1000회전으로 5분간 원심 분리한 후, 펠릿을 2 내지 5×106세포/mL의 농도로 1mL의 셀뱅커에 용해시켜 -80℃에서 보존하였다.
2. 동결 세포를 이용한 소의 TSH ( bTSH )의 농도 의존 곡선과 최저 검출 감도
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼(130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, PBS로 단계 희석한 bTSH를 10μL 첨가하여(n=6) 30분 배양한 후, 3mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치(퍼킨엘머사, ARVO-Sx, 이하, 실시예에서 동일 기종을 사용함)로 발광량을 측정하였다. 도 1에 bTSH의 농도 의존 곡선을 나타내었다.
저농도 영역에 대하여 확대한 도 2에서 도시한 바와 같이 블랭크치의 +3SD의 값을 유의하게 분리할 수 있는 bTSH의 최저 검출 감도는, 0.16μU/mL였다. 또한, 에쿼린은, 발광 반응을 이용하고 있기 때문에, 본 방법에서는, 높은 블랭크/시그널비(S/N비) 100μU/mL bTSH S/N비, 약 45배(9000000/200000)가 얻어졌다.
저농도 영역에 대하여 확대한 도 2에서 도시한 바와 같이 블랭크치의 +3SD의 값을 유의하게 분리할 수 있는 bTSH의 최저 검출 감도는, 0.16μU/mL로서, 기존의 야마사쇼유의 키트의 최저 검출 감도 1μU/mL(나가타 아츠오 외: 호르몬과 임상, 41:1023, 1993)보다 한자릿수 고감도였다.
또한, 에쿼린은 발광 반응을 이용하고 있으며, 본 방법의 100μU/mL bTSH S/N비, 약 45배(9000000/200000)라는 높은 블랭크/시그널비(S/N비)는, 야마사 키트(100μU/mL bTSH SN=7)에 비해 크게 개선되었다.
3. 재현성의 검토
인간 바세도우 환자 유래의 TSAb 표준품, MRC 리서치 스탠다드 B 1966 지속성 갑상선 자극 물질(NIBSC·Nasional Institute for Biological Standards and Control, 코드 65/122)를 정상인 혈청으로 희석하여, H(1.88mU LAST/ml) M(1.25mU LAST/ml) L(0.94mU LAST/ml)의 대조 검체를 제조하였다. 제조한 50μL의 대조 혈청에 150μL의 30% PEG6000을 가하여 교반한 후, 4℃에서 5분간 정치하였다. 4℃ 3000rpm 20분간 원심한 후, 얻어진 침전을 400μL 샘플 버퍼에 용해시켜 샘플액으로 했다. 1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여, 80μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, 조정한 샘플을 20μL 첨가하여(n=2) 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL 첨가해서 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다. LMH 샘플을 6샘플 동시에 정제 및 측정한 경우(동시 재현성), 서로 다른 10일에 독립적으로 정제 및 측정을 행한 경우(일차(日差) 재현성), 서로 다른 제조 로트에 대하여 동일한 날에 LMH 샘플을 정제 및 측정한 경우(상이 로트간 재현성)를 비교하였다. 측정 샘플 외에 야마사 키트에서 별도 값을 매긴 H(576 TSAb%), M(342 TSAb%), L(197 TSAb%)을 플레이트 내에 가하여 검량선을 적고, 얻어진 회귀 직선으로부터 구한 값을 샘플 농도(야마사 키트 환산 TSAb%)로 하였다[야마사 TSAb% = 검체의 값/정상인 혈청의 값×100(%)].
Figure 112012006742646-pct00001
본 방법에서는, 측정계가 고감도이며 S/N비가 높기 때문에 높은 재현성을 얻을 수 있음이 확인되었다. 또한, 본 방법에서의, 서로 다른 로트간의 CV는, 5 내지 6%로 재현성이 높음을 알 수 있었다. 라인화된 CHO 세포와 최적화된 유전자 도입 조건에 의해, 상이 로트간 차가 적은 측정계를 구축할 수 있었다.
기존의 야마사쇼유의 TSAb 키트의 재현성의 CV치는 10 내지 15%임이 보고되어 있어, 본 방법의 높은 재현성이 확인되었다.
또한, 기존의 키트는, 돼지 조직 유래의 갑상선 세포를 동결시켜 제조하고 있기 때문에, 조직이 유래하는 돼지의 개체 차에 의한 로트간의 편차가 큰 것이 문제였었는데(상이 로트간 CV 10 내지 19%), 본 방법은, 서로 다른 로트간에서도 재현성이 높음을 알 수 있었다.
4. 에쿼린 발광 기질(비비렌)의 첨가 후의 배양 시간의 검토
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하고, 첨가 후 30분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8시간 후, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. PBS로 단계 희석한 b TSH를 10μL 첨가하여 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
비비렌 첨가 후 2시간만에 발광량은 플래토에 달함을 알 수 있었다(도 3 참조).
5. 트랜스펙션하는 수용체 플라스미드량의 검토
CHO 세포를 10cm2 페트리 접시에 1×105세포/mL 농도의 CHO 세포를 10mL 파종하여 1일 배양한 후, 3ug pcDNA mt sAEQ, 1ug pmCNGα2MW와 0 내지 1ug의 pZeoSV2 TSHR 플라스미드를 혼합하고, 600μL DMEM/F12, 18μL 푸진6(로슈사)을 혼합하여, 트랜스펙션을 행하였다. 또한, 밤새 배양한 후 배지를 제거하고, 10mL PBS로 세정한 후, 800μL의 베르센을 가하여 37℃ 5분간 배양한 후, 10mL의 DMEM/F12 cFCS에 현탁하였다. 1000rpm 5분간 원심한 후, 침전을 10mL의 DMEM/F12 cFCS에 용해시키고, 6.5μL의 4mM 비비렌을 첨가하여 37℃에서 3시간 배양한 후, PBS로 치환하여 90μL/웰로 96웰 플레이트에 파종하였다. bTSH의 농도계열을 첨가한 후, 30분 후에 3mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
최적의 발광량을 얻기 위해서는, 수용체 플라스미드에 대하여 1ug/플레이트 양의 트랜스펙션이 필요하다는 사실이 분명해졌다(도 4 참조).
6. 세포 농도의 최적화
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가했다. 세포 농도를 3×103세포/mL 내지 3×105세포/mL 농도로 조정한 세포 계열을 제조하고, 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, PBS로 단계 희석한 b TSH를 10μL 첨가하여 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 5 및 도 6에 도시한 바와 같이 세포 농도에 의존하여 발광량은 증가하였다. 각 블랭크치를 1로 한 상대치 환산에서는, 3×105세포/mL가 최적의 농도인 것이 분명해졌다.
7. CaCl 2 검출액의 첨가 농도의 검토
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, PBS로 단계 희석한 b TSH를 10μL 첨가하여 30분 배양하였다. 최종 농도 0 내지 30mM의 CaCl2 검출액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
백그라운드(0)에서의 값이 낮고, 샘플에서 발광량이 높은 3 내지 6mM의 CaCl2 농도가 최적인 것이 분명해졌다(도 7 참조).
8. 자극형 항체 대조 혈청을 이용한 희석 직선성의 검토
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여, 80μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양하였다. 30% PEG6000으로 정제하여 희석한 양성 대조 혈청 계열(로슈사 NIBSC 90/672 준거, 40IU/mL, 13IU/mL, 8IU/mL, 4IU/mL)의 IgG 분획을, 각각 샘플 버퍼로 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32배로 희석하여 20μL 첨가하였다. 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 8에 도시한 바와 같이, 직선성을 갖고 발광량이 증가하는 것이 확인되었다.
9. TSHR 에 대한 저해형 항체( TSBAb )의 검출법의 검토
1로 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, 30% PEG6000으로 정제한 갑상선 기능 저하증 환자 유래의 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb) 분획 및 정상인 혈청 유래의 IgG 분획을 10μL 첨가하고, 또한 동시에 bTSH를 10μL/웰로 100μU 내지 2.5μU/mL의 최종 농도가 되도록 첨가하여, 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
갑상선 기능 저하증 환자 유래의 항체 분획에서는, 2.5 내지 10μU/mL bTSH 존재하에서 90% 이상의 발광량이 저해되는 것이 분명해졌다(도 9 참조). 100μU/mL bTSH에서는 50% 정도 저해가 관찰되어, 경합시키는 bTSH의 농도에 따라서 경합 저해가 인정됨을 알 수 있었다(도 9 참조).
저해형 항체를 검출하는 경우, bTSH 공존하에서의 시그널의 저하를 보는 것이 일반적인데, 지금까지의 방법은 S/N비가 5 내지 10배로 낮아, S/N비가 낮으면 측정 범위가 좁아지는 결점이 알려져 있었는데, 본 방법은 bTSH의 유무에서의 S/N비가 50배로 측정 범위가 넓기 때문에 저해형 항체를 고감도로 검출할 수 있다.
10. 세포의 탈감작으로 TSHR 에 대한 저해형 항체( TSBAb )를 검출하는 방법의 검토
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 칼슘을 포함하는 DMEM/F12 cFCS 배지를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, 30% PEG6000으로 정제한 기능 저하증 환자 유래의 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb) 분획 및 정상인 혈청 유래의 IgG 분획을 10μL 첨가하였다. 또한 동시에 bTSH를 10μL/웰로 100μU 내지 2.5μU/mL의 최종 농도가 되도록 첨가하여, 30분 배양한 후, 10-4M 포르스코인(Forskoin) 용액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 10으로부터, 5μU 이하의 bTSH 농도에서는 탈감작이 충분하지 않아, 저해형 항체와 정상인의 차이는 볼 수 없지만, 100μU bTSH 존재하에서는, 정상인 혈청에서 발광량이 저하되고, 저해형 항체의 존재하에서 발광량의 증가가 인정되어, 본 방법에 의해 탈감작을 이용하여 저해 항체의 유무를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
[본 방법에서의 저해형 항체 유무에 의한 발광의 메카니즘]
이 조건에서는, 정상인 혈청과 같은 저해형 항체가 없는 경우, bTSH를 세포에 첨가한 시점에서 배지 중에 칼슘이 존재하기 때문에, bTSH 첨가 직후에 발광 반응이 일어난다. 이에 반해, 저해형 항체(TSBAb)가 존재하는 경우, TSBAb가 bTSH의 작용을 저해하여 발광 반응은 일어나지 않는다. 이 상태에서, 계속해서 아데닐레이트 사이클라아제를 활성화하는 포르스콜린을 첨가하면 TSH 수용체를 통하지 않고 cAMP가 생성되어 발광한다. 그러나 TSBAb가 없는 경우, 세포는 bTSH에 의해서 한번 아데닐레이트 사이클라아제의 활성화를 통해 발광 반응이 일어나서 탈감작되어 있기 때문에, 두번째의 자극인 포르스콜린을 더 첨가해도 발광하지 않는다. 이에 반해 TSBAb가 존재하는 경우, 저해 항체에 의해 bTSH는 아데닐레이트 사이클라아제를 활성화하지 않는다. 따라서, 계속해서 포르스콜린을 첨가하면 cAMP가 생성되어 발광 반응이 일어난다.
[고찰]
지금까지의 저해형 항체를 검출하는 방법은, 정상인에 대하여 %저해율로 표기되어 있다. 그러나, %저해율로 나타내는 경우, 90% 이상의 고농도 영역에서 정량성이 없는 문제가 있었다.
세포의 탈감작 작용과 포르스콜린을 이용하는 본 방법에서는, 정상인에 대하여 증가하는 발광량으로 표기할 수 있기 때문에, 상한치가 규정되지 않아, 고농도 영역에서도 직선성을 갖고 저해형 항체의 유무를 검출할 수 있다.
11. 자극형 항체 표준품을 이용한 기존 키트와의 감도 비교
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. MRC 리서치 스탠다드 B 1966(NIBSC 65/122)을 정상인 혈청으로 희석하여 농도 계열을 제조하였다. 제조한 50μL의 대조 계열에 150μL의 30% PEG6000을 가하여 교반한 후, 4℃에서 5분간 정치하였다. 4℃ 3000rpm 20분간 원심한 후, 얻어진 침전을 50μL 샘플 버퍼에 용해시켜 샘플액으로 했다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, 샘플액을 10μL 첨가하여 30분 배양하였다. 9mM의 CaCl2 검출액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
별도로, 기존의 야마사사의 돼지 갑상선을 이용한 키트로 측정한 값을 나타내었다. 기존의 야마사 키트에서는, 0.94mU LAST/mL에서 200 TSAb%가 되고, 그 이하의 농도는 감도 이하로 검출할 수 없지만, 본 방법에서는, 0.94mU LAST/mL에서 2018 TSAb%, 0.06mU LAST/mL에서도 242 TSAb%로 검출할 수 있음을 알 수 있어, 기존의 키트에 비해 자극형 항체에 대해서 약 16배 고감도로 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 11 참조).
12. 동결 세포를 이용한 키트의 발광의 경시 변화의 검토
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼(130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, 30% PEG6000으로 정제한 H(높은 값), M(중간값), L(낮은 값)의 샘플을 10μL 첨가하여(n=6) 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 3초 교반한 후, 13초간 경시적으로 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다. 그 결과, 도 12에 도시한 바와 같이, CaCl2액 첨가 직후부터 비교적 안정된 발광이 관찰되었다.
13. TSHR 에 대한 저해형 항체( TSBAb )의 정량성의 검토
(1) bTSH와의 경합 저해를 이용하여 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb)를 검출하는 방법
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼(130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 37℃ CO2로 3시간 배양한 후, 30% PEG6000으로 정제한 기능 저하증 환자 유래의 저해형 항체를 희석한 샘플 계열 10μL와 세포액 90μL를 혼합해서 30분 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, 본 동결 세포를 이용하여 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb)가 정량적으로 검출되었다.
(2) 세포의 탈감작을 이용하여 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb)를 검출하는 방법의 농도 의존성
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼(3mM CaCl2, 130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 30% PEG6000으로 정제한 기능 저하증 환자 유래의 저해형 항체를 희석한 샘플 계열을 10μL 첨가하고, 또한 10μL/웰의 bTSH 용액을 최종 농도 100μL/mL가 되도록 첨가하여, 37℃ CO2로 30분간 배양한 후, 10-4M 포르스콜린 용액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, 본 동결 세포를 이용하여 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb)가 농도 의존적으로 검출되었다.
14. TSHR 에 대한 자극형 항체( TSAb ) 또는 저해형 항체( TSBAb )의 작용 시간(배양 시간)의 검토
(1) 자극형 항체(TSAb)를 검출하는 방법
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼(130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 30% PEG6000으로 정제한 높은 값(H), 중간값(M), 낮은 값(L), 정상인(N) 혈청 샘플을 10μL 첨가하여 30분에서 1.5시간 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 15에 도시된 바와 같이, 본 발명에 관한 세포와 자극형 항체(TSAb)의 작용 시간은 30분 내지 1시간으로, 발광량은 플래토에 달했다.
(2) bTSH와의 경합 저해를 이용하여 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb)를 검출하는 방법에 있어서의 작용 시간의 검토
1에서 제조한 동결 세포1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 샘플 버퍼(130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM HEPES, 1mM MgCl2, 4.8mM NaHCO3, 5% PEG6000, pH7.4)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 샘플 버퍼를 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종해서 3시간 배양하였다. 30% PEG6000으로 정제한 기능 저하증 환자 유래의 혈청 샘플, 및 정상인 혈청 샘플을 10μL 첨가하고, 또한 10μL/웰의 bTSH 용액을 최종 농도 10μU/mL가 되도록 가하여 10분에서 2시간 배양한 후, 9mM CaCl2액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명에 관한 세포와 저해형 항체(TSBAb)와 경합시키는 bTSH의 작용 시간은 30분으로, 발광량은 플래토에 달했다.
(3) 세포의 탈감작을 이용하여 TSHR에 대한 저해형 항체(TSBAb)를 검출하는 방법
1에서 제조한 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 CO2 독립 배지(Cat No.18045, 인비트로젠사)에 현탁하고, 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 10mL의 CO2 독립 배지에 가하고 7.5μL 4mM 비비렌(프로메가사)을 첨가하여, 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종해서 3시간 배양하였다. 30% PEG6000으로 정제한 기능 저하증 환자 유래의 혈청 샘플, 및 정상인 혈청 샘플을 10μL 첨가하고, 또한 10μL/웰의 bTSH 용액을 최종 농도 100μU/mL가 되도록 가하여, 10분에서 2시간 배양한 후, 10-4M의 포르스콜린 용액을 50μL/웰로 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다.
도 17에 도시된 바와 같이, 본 발명에 관한 세포와 저해형 항체(TSBAb)와 경합시키는 bTSH의 작용 시간은 10분으로, 발광량은 플래토에 달했다.
15. 각종 갑상선 질환 환자 샘플에서의 측정
1에서 제조한 동결 세포, 및 이하에 기재한 세포 배양액, 세포 세정액, 비비렌, 칼슘 용액, 염소 항 hTSH 항체, 대조 혈청 및 96구멍 플레이트를 포함하는 본 발명이 제공하는 바세도우병 진단 키트를 이용하여, 각종 갑상선 질환 환자군에서의 혈청 중의 TSAb 활성에 대해 검토하였다. 구체적으로는, 임상상의 확정 진단을 받은, 미치료 바세도우병 환자 198예, 기능 저하증 환자 18예, 건강한 정상인 48예, 기능성 결절 2예, 출산 후 갑상선염 6예, 무통성 갑상선염 22예, 아급성 갑상선염 22예의 혈청을 이용하였다(표 2 참조). 50μL의 환자 혈청에 150μL의 30% PEG6000을 가하여 교반한 후, 4℃에서 5분간 정치하였다. 4℃ 3000rpm 20분간 원심한 후, 얻어진 침전을 400μL의 세포 배양액[5% PEG6000, CO2 독립 배지(염화칼슘, D-칼슘 판토텐산염, L-글루타민, 페놀레드 불포함, 인비트로젠사)]에 용해시켜 샘플액으로 했다. 샘플액을 10μL/웰로 96구멍 플레이트에 첨가하였다(n=2). 동결 세포 1ml(3×106세포/ml)를 온욕으로 용해시켜 10mL의 세포 세정액(CO2 독립 배지)에 현탁하였다. 1000rpm 5분 원심한 후, 얻어진 침전에 12mL의 세포 배양액을 가하여 세포액을 조정하였다. 세포액에 7.5μL의 4mM 비비렌을 첨가하고 90μL/웰로 96구멍 플레이트에 파종하였다. 4시간 배양한 후, 3mM의 칼슘 용액을 100μL 첨가하여 발광 측정 장치로 발광량을 측정하였다. 기능 저하증 환자 중에는, 혈청 중의 hTSH가 높은 값이 되는 환자가 존재하기 때문에, hTSH의 작용을 중화하기 위해서, 세포 배양액에 염소 항 hTSH 폴리클로날 항체(라이프 사이언스사)를 1.2μL 첨가한 조건으로 측정을 행하였다. NIBSC 65/122를 건강한 정상인 혈청으로 희석(1.874mU LATS/mL)한 대조 혈청의 측정치를 1800으로 한 일점 검량선에 의해 각 환자에서의 측정치를 산출하였다. 또한, 동일한 환자 혈청에 대하여, 기존 키트(TSAb 키트, 야마사사)를 이용해서 키트 첨부서에 따라 측정을 행하였다.
건강한 정상인의 혈청 중 TSAb치로부터 TSAb치의 컷오프치를 설정하였다. 도 20에 건강한 정상인 48예에서의 혈청 중의 TSAb치의 횟수 분포를 나타내었다. 건강한 정상인의 평균치는 124±34로 정규 분포를 나타내었다. 평균치+3SD=180을 컷오프치로 설정하였다.
각 갑상선 질환의 TSAb치를 도 21에 나타내었다. 미치료 바세도우병에서는 198예 중 195예가 양성(98%), 기능 저하증에서는 3예가 양성, 무통성 갑상선염, 출산 후 갑상선염에서는 1예가 양성을 나타내었다. 표 3에서, 미치료 바세도우병 환자 198예에서 기존 키트와의 바세도우병의 양성율을 검토하였다. 기존 키트의 양성율은 68%, 본 발명이 제공하는 키트에서는 98%이므로, 기존 키트에 비해 바세도우병의 검출 감도가 현저히 향상되어 있음을 알 수 있다.
Figure 112012006742646-pct00002
Figure 112012006742646-pct00003
본 발명에 따르면, 조작이 간편하면서도 안전한 TSH 수용체 항체의 측정 방법 및 측정 키트를 제공할 수 있게 되어, 갑상선 질환의 진단이 가능해진다.
본 출원의 우선권주장의 기초가 되는 출원은 일본 특허 출원: 일본 특허 출원2009-155183이며, 인용에 의해 그 전체 내용이 본 출원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd. <120> A bioassay method and a kit for measuring an antibody against TSH receptor and a novel recombinant cell therefor <130> 669763 <150> JP 2009-155183 <151> 2009-06-30 <160> 7 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 764 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro 1 5 10 15 Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His 20 25 30 Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro 35 40 45 Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu 50 55 60 Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg 65 70 75 80 Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser 85 90 95 Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg 100 105 110 Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu 115 120 125 Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu 130 135 140 Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys 165 170 175 Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val 180 185 190 Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val 210 215 220 Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala 225 230 235 240 Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn 245 250 255 Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu 260 265 270 Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn 275 280 285 Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser 290 295 300 Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser 305 310 315 320 Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly 325 330 335 Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr 340 345 350 Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln 355 360 365 Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His 370 375 380 Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro 385 390 395 400 Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe 405 410 415 Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val 435 440 445 Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly 450 455 460 Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu 465 470 475 480 Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr 485 490 495 Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu 500 505 510 Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Arg 515 520 525 Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly 530 535 540 Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile 545 550 555 560 Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr 565 570 575 Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val 580 585 590 Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val 595 600 605 Arg Asn Pro Gln Tyr Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys 610 615 620 Arg Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Ile Cys Met Ala Pro Ile 625 630 635 640 Ser Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val 645 650 655 Ser Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Leu Asn Ser Cys 660 665 670 Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp 675 680 685 Val Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln 690 695 700 Ala Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln 705 710 715 720 Val Gln Lys Val Thr His Glu Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu 725 730 735 Asp Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln 740 745 750 Gly Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu 755 760 <210> 2 <211> 664 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified CNG alpha2 <400> 2 Met Met Thr Glu Lys Ser Asn Gly Val Lys Ser Ser Pro Ala Asn Asn 1 5 10 15 His Asn His His Pro Pro Pro Ser Ile Lys Ala Asn Gly Lys Asp Asp 20 25 30 His Arg Ala Gly Ser Arg Pro Gln Ser Val Ala Ala Asp Asp Asp Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Leu Gln Arg Leu Ala Glu Met Asp Thr Pro Arg Arg Gly 50 55 60 Arg Gly Gly Phe Arg Arg Ile Val Arg Leu Val Gly Ile Ile Arg Asp 65 70 75 80 Trp Ala Asn Lys Asn Phe Arg Glu Glu Glu Pro Arg Pro Asp Ser Phe 85 90 95 Leu Glu Arg Phe Arg Gly Pro Glu Leu Gln Thr Val Thr Thr His Gln 100 105 110 Gly Asp Gly Lys Gly Asp Lys Asp Gly Glu Gly Lys Gly Thr Lys Lys 115 120 125 Lys Phe Glu Leu Phe Val Leu Asp Pro Ala Gly Asp Trp Tyr Tyr Arg 130 135 140 Trp Leu Phe Val Ile Ala Met Pro Val Leu Tyr Asn Trp Cys Leu Leu 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Cys Phe Ser Asp Leu Gln Arg Asn Tyr Phe Val Val 165 170 175 Trp Leu Val Leu Asp Tyr Phe Ser Asp Thr Val Tyr Ile Ala Asp Leu 180 185 190 Ile Ile Arg Leu Arg Thr Gly Phe Leu Glu Gln Gly Leu Leu Val Lys 195 200 205 Asp Pro Lys Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Ile His Thr Leu Gln Phe Lys 210 215 220 Leu Asp Val Ala Ser Ile Ile Pro Thr Asp Leu Ile Tyr Phe Ala Val 225 230 235 240 Gly Ile His Ser Pro Glu Val Arg Phe Asn Arg Leu Leu His Phe Ala 245 250 255 Arg Met Phe Glu Phe Phe Asp Arg Thr Glu Thr Arg Thr Ser Tyr Pro 260 265 270 Asn Ile Phe Arg Ile Ser Asn Leu Val Leu Tyr Ile Leu Val Ile Ile 275 280 285 His Trp Asn Ala Cys Ile Tyr Tyr Ala Ile Ser Lys Ser Ile Gly Phe 290 295 300 Gly Val Asp Thr Trp Val Tyr Pro Asn Ile Thr Asp Pro Glu Tyr Gly 305 310 315 320 Tyr Leu Ala Arg Glu Tyr Ile Tyr Cys Leu Tyr Trp Ser Thr Leu Thr 325 330 335 Leu Thr Thr Ile Gly Glu Thr Pro Pro Pro Val Lys Asp Glu Glu Tyr 340 345 350 Leu Phe Val Ile Phe Asp Phe Leu Ile Gly Val Leu Ile Phe Ala Thr 355 360 365 Ile Val Gly Asn Val Gly Ser Met Ile Ser Asn Met Asn Ala Thr Arg 370 375 380 Ala Glu Phe Gln Ala Lys Ile Asp Ala Val Lys His Tyr Met Gln Phe 385 390 395 400 Arg Lys Val Ser Lys Asp Met Glu Ala Lys Val Ile Lys Trp Phe Asp 405 410 415 Tyr Leu Trp Thr Asn Lys Lys Thr Val Asp Glu Arg Glu Val Leu Lys 420 425 430 Asn Leu Pro Ala Lys Leu Arg Ala Glu Ile Ala Ile Asn Val His Leu 435 440 445 Ser Thr Leu Lys Lys Val Arg Ile Phe Gln Asp Trp Glu Ala Gly Leu 450 455 460 Leu Val Glu Leu Val Leu Lys Leu Arg Pro Gln Val Phe Ser Pro Gly 465 470 475 480 Asp Tyr Ile Cys Arg Lys Gly Asp Ile Gly Lys Glu Met Tyr Ile Ile 485 490 495 Lys Glu Gly Lys Leu Ala Val Val Ala Asp Asp Gly Val Thr Gln Tyr 500 505 510 Ala Leu Leu Ser Ala Gly Ser Cys Phe Gly Glu Ile Ser Ile Leu Asn 515 520 525 Ile Lys Gly Ser Lys Met Gly Asn Arg Arg Thr Ala Asn Ile Arg Ser 530 535 540 Leu Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Cys Leu Ser Lys Asp Asp Leu Met Glu 545 550 555 560 Ala Val Thr Glu Tyr Pro Asp Ala Lys Lys Val Leu Glu Glu Arg Gly 565 570 575 Arg Glu Ile Leu Met Lys Met Gly Leu Leu Asp Glu Asn Glu Val Ala 580 585 590 Ala Ser Met Glu Val Asp Val Gln Glu Lys Leu Glu Gln Leu Glu Thr 595 600 605 Asn Met Glu Thr Leu Tyr Thr Arg Phe Ala Arg Leu Leu Ala Glu Tyr 610 615 620 Thr Gly Ala Gln Gln Lys Leu Lys Gln Arg Ile Thr Val Leu Glu Thr 625 630 635 640 Lys Met Lys Gln Asn His Glu Asp Asp Tyr Leu Ser Asp Gly Ile Asn 645 650 655 Thr Pro Glu Pro Ala Val Ala Glu 660 <210> 3 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> modified aequorin <400> 3 Met Ser Val Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly Ser Ala 1 5 10 15 Arg Arg Leu Pro Val Pro Arg Ala Lys Ile His Ser Leu Pro Pro Glu 20 25 30 Gly Lys Leu Gly Ile Met Lys Val Lys Leu Thr Ser Asp Phe Asp Asn 35 40 45 Pro Lys Trp Ile Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp Val 50 55 60 Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala Ser 65 70 75 80 Asp Ile Val Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala Lys Arg 85 90 95 His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met Lys Tyr 100 105 110 Gly Val Glu Thr Glu Trp Pro Glu Tyr Ile Glu Gly Trp Lys Arg Leu 115 120 125 Ala Thr Glu Glu Leu Glu Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile Thr Leu Ile 130 135 140 Arg Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp Lys Asp Gln Asn 145 150 155 160 Gly Ala Ile Thr Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Thr Lys Ser Ala Gly 165 170 175 Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr Phe Arg Val Cys Asp 180 185 190 Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu Met Thr Arg Gln His 195 200 205 Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala Cys Glu Lys Leu Tyr Gly 210 215 220 Gly Ala Val Pro 225 <210> 4 <211> 1995 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 atgatgaccg aaaaatccaa cggtgtgaag agctctccag ctaataacca taaccatcat 60 cctcctcctt ctatcaaggc caatggcaaa gatgaccaca gggcaggtag cagaccacag 120 tctgtggcag ctgatgatga cacttcctca gaactgcaaa ggttggcaga gatggatact 180 ccacgcaggg gaaggggtgg cttccgaagg attgtccgcc tggtggggat catcagagac 240 tgggccaaca aaaatttccg tgaggaggaa ccaagacctg actccttcct agagcgtttc 300 cgtgggcctg agctccagac tgtgacaacc catcaggggg atggcaaagg cgacaaggac 360 ggcgagggaa agggcaccaa aaagaaattt gaactgtttg ttttggaccc agctggagac 420 tggtattacc gttggttgtt tgtcattgcc atgcctgttc tttacaactg gtgtctgttg 480 gtagccagag cctgcttcag tgatctacag agaaactatt ttgtggtatg gctggtgctg 540 gattacttct cagacactgt ttatattgca gacctcatca ttcggctgcg cacaggcttc 600 ctagaacaag ggctcctggt caaagacccc aagaaattgc gagacaacta tatccacact 660 ttgcagttca aattggatgt ggcttctatc atccccactg acctcattta ttttgctgtg 720 ggtatccaca gccctgaggt acgctttaat cgtctgttac actttgcccg tatgtttgag 780 ttctttgacc gcactgagac acgtacaagc taccccaaca tcttccgaat cagcaacctg 840 gtcctctaca tcttggtcat catccactgg aatgcttgta tttactatgc tatctctaag 900 tccattggct ttggggttga cacctgggtt taccccaaca ttactgaccc tgaatatggc 960 tacctggcta gggagtacat ttactgcctt tactggtcca cactgaccct caccaccatt 1020 ggagagacac caccccctgt aaaggatgag gagtacctat ttgtcatctt tgacttcctg 1080 attggtgtcc tcatctttgc cactattgtg ggaaatgtgg gctccatgat ctccaacatg 1140 aatgccacac gagcagagtt ccaggccaag attgatgctg tcaaacacta catgcagttc 1200 cgaaaggtca gtaaagacat ggaagccaag gtcatcaaat ggtttgacta cttgtggacc 1260 aataagaaga cagtagatga acgagaagtc ctaaagaacc tgcctgcaaa gcttagggca 1320 gagatagcca ttaatgttca tttgtccact ctgaagaaag tgcgcatatt ccaggattgt 1380 gaagctggcc tgctggtgga actggtactg aagcttcgtc ctcaggtctt tagtcctgga 1440 gattatattt gccgtaaggg ggacattggc aaggaaatgt acatcatcaa ggagggcaaa 1500 ttggcagtgg tagctgatga tggtgtgact cagtatgcct tgctgtcagc tgggagctgc 1560 tttggtgaga ttagtatcct taacattaag ggtagcaaaa tgggcaatcg gcgcactgcc 1620 aatatccgta gtctgggcta ctcagatctc ttctgcttgt ccaaggatga tcttatggaa 1680 gctgtgactg agtatcctga tgccaagaaa gtcctggaag aacggggtag ggagatcctg 1740 atgaaggaag gtctactgga tgagaatgaa gtggcagcta gtatggaggt agatgttcag 1800 gagaagctgg agcagctgga gacaaacatg gagaccttgt acactcgttt tgcccgcctg 1860 ctggctgagt acactggagc ccagcagaag ctcaaacagc gcatcacagt gctggagacc 1920 aagatgaaac agaaccatga ggatgattac ctatcagatg ggataaacac ccctgagcca 1980 gctgttgctg aatag 1995 <210> 5 <211> 2301 <212> DNA <213> Human <400> 5 tggaaaatga ggccggcgga cttgctgcag ctggtgctgc tgctcgacct gcccagggac 60 ctgggcggaa tggggtgttc gtctccaccc tgcgagtgcc atcaggagga ggacttcaga 120 gtcacctgca aggatattca acgcatcccc agcttaccgc ccagtacgca gactctgaag 180 cttattgaga ctcacctgag aactattcca agtcatgcat tttctaatct gcccaatatt 240 tccagaatct acgtatctat agatgtgact ctgcagcagc tggaatcaca ctccttctac 300 aatttgagta aagtgactca catagaaatt cggaatacca ggaacttaac ttacatagac 360 cctgatgccc tcaaagagct ccccctccta aagttccttg gcattttcaa cactggactt 420 aaaatgttcc ctgacctgac caaagtttat tccactgata tattctttat acttgaaatt 480 acagacaacc cttacatgac gtcaatccct gtgaatgctt ttcagggact atgcaatgaa 540 accttgacac tgaagctgta caacaatggc tttacttcag tccaaggata tgctttcaat 600 gggacaaagc tggatgctgt ttacctaaac aagaataaat acctgacagt tattgacaaa 660 gatgcatttg gaggagtata cagtggacca agcttgctgg acgtgtctca aaccagtgtc 720 actgcccttc catccaaagg cctggagcac ctgaaggaac tgatagcaag aaacacctgg 780 actcttaaga aacttccact ttccttgagt ttccttcacc tcacacgggc tgacctttct 840 tacccaagcc actgctgtgc ttttaagaat cagaagaaaa tcagaggaat ccttgagtcc 900 ttgatgtgta atgagagcag tatgcagagc ttgcgccaga gaaaatctgt gaatgccttg 960 aatagccccc tccaccagga atatgaagag aatctgggtg acagcattgt tgggtacaag 1020 gaaaagtcca agttccagga tactcataac aacgctcatt attacgtctt ctttgaagaa 1080 caagaggatg agatcattgg ttttggccag gagctcaaaa acccccagga agagactcta 1140 caagcttttg acagccatta tgactacacc atatgtgggg acagtgaaga catggtgtgt 1200 acccccaagt ccgatgagtt caacccgtgt gaagacataa tgggctacaa gttcctgaga 1260 attgtggtgt ggttcgttag tctgctggct ctcctgggca atgtctttgt cctgcttatt 1320 ctcctcacca gccactacaa actgaacgtc ccccgctttc tcatgtgcaa cctggccttt 1380 gcggatttct gcatggggat gtacctgctc ctcatcgcct ctgtagacct ctacactcac 1440 tctgagtact acaaccatgc catcgactgg cagacaggcc ctgggtgcaa cacggctggt 1500 ttcttcactg tctttgcaag cgagttatcg gtgtatacgc tgacggtcat caccctggag 1560 cgctggtatg ccatcacctt cgccatgcgc ctggaccgga agatccgcct caggcacgca 1620 tgtgccatca tggttggggg ctgggtttgc tgcttccttc tcgccctgct tcctttggtg 1680 ggaataagta gctatgccaa agtcagtatc tgcctgccca tggacaccga gacccctctt 1740 gctctggcat atattgtttt tgttctgacg ctcaacatag ttgccttcgt catcgtctgc 1800 tgctgttatg tgaagatcta catcacagtc cgaaatccgc agtacaaccc aggggacaaa 1860 gataccaaaa ttgccaagag gatggctgtg ttgatcttca ccgacttcat atgcatggcc 1920 ccaatctcat tctatgctct gtcagcaatt ctgaacaagc ctctcatcac tgttagcaac 1980 tccaaaatct tgctggtact cttctatcca cttaactcct gtgccaatcc attcctctat 2040 gctattttca ccaaggcctt ccagagggat gtgttcatcc tactcagcaa gtttggcatc 2100 tgtaaacgcc aggctcaggc ataccggggg cagagggttc ctccaaagaa cagcactgat 2160 attcaggttc aaaaggttac ccacgagatg aggcagggtc tccacaacat ggaagatgtc 2220 tatgaactga ttgaaaactc ccatctaacc ccaaagaagc aaggccaaat ctcagaagag 2280 tatatgcaaa cggttttgta a 2301 <210> 6 <211> 1995 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> modified CNG alpha2 <400> 6 atgatgaccg aaaaatccaa cggtgtgaag agctctccag ctaataacca taaccatcat 60 cctcctcctt ctatcaaggc caatggcaaa gatgaccaca gggcaggtag cagaccacag 120 tctgtggcag ctgatgatga cacttcctca gaactgcaaa ggttggcaga gatggatact 180 ccacgcaggg gaaggggtgg cttccgaagg attgtccgcc tggtggggat catcagagac 240 tgggccaaca aaaatttccg tgaggaggaa ccaagacctg actccttcct agagcgtttc 300 cgtgggcctg agctccagac tgtgacaacc catcaggggg atggcaaagg cgacaaggac 360 ggcgagggaa agggcaccaa aaagaaattt gaactgtttg ttttggaccc agctggagac 420 tggtattacc gttggttgtt tgtcattgcc atgcctgttc tttacaactg gtgtctgttg 480 gtagccagag cctgcttcag tgatctacag agaaactatt ttgtggtatg gctggtgctg 540 gattacttct cagacactgt ttatattgca gacctcatca ttcggctgcg cacaggcttc 600 ctagaacaag ggctcctggt caaagacccc aagaaattgc gagacaacta tatccacact 660 ttgcagttca aattggatgt ggcttctatc atccccactg acctcattta ttttgctgtg 720 ggtatccaca gccctgaggt acgctttaat cgtctgttac actttgcccg tatgtttgag 780 ttctttgacc gcactgagac acgtacaagc taccccaaca tcttccgaat cagcaacctg 840 gtcctctaca tcttggtcat catccactgg aatgcttgta tttactatgc tatctctaag 900 tccattggct ttggggttga cacctgggtt taccccaaca ttactgaccc tgaatatggc 960 tacctggcta gggagtacat ttactgcctt tactggtcca cactgaccct caccaccatt 1020 ggagagacac caccccctgt aaaggatgag gagtacctat ttgtcatctt tgacttcctg 1080 attggtgtcc tcatctttgc cactattgtg ggaaatgtgg gctccatgat ctccaacatg 1140 aatgccacac gagcagagtt ccaggccaag attgatgctg tcaaacacta catgcagttc 1200 cgaaaggtca gtaaagacat ggaagccaag gtcatcaaat ggtttgacta cttgtggacc 1260 aataagaaga cagtagatga acgagaagtc ctaaagaacc tgcctgcaaa gcttagggca 1320 gagatagcca ttaatgttca tttgtccact ctgaagaaag tgcgcatatt ccaggattgg 1380 gaagctggcc tgctggtgga actggtactg aagcttcgtc ctcaggtctt tagtcctgga 1440 gattatattt gccgtaaggg ggacattggc aaggaaatgt acatcatcaa ggagggcaaa 1500 ttggcagtgg tagctgatga tggtgtgact cagtatgcct tgctgtcagc tgggagctgc 1560 tttggtgaga ttagtatcct taacattaag ggtagcaaaa tgggcaatcg gcgcactgcc 1620 aatatccgta gtctgggcta ctcagatctc ttctgcttgt ccaaggatga tcttatggaa 1680 gctgtgactg agtatcctga tgccaagaaa gtcctggaag aacggggtag ggagatcctg 1740 atgaagatgg gtctactgga tgagaatgaa gtggcagcta gtatggaggt agatgttcag 1800 gagaagctgg agcagctgga gacaaacatg gagaccttgt acactcgttt tgcccgcctg 1860 ctggctgagt acactggagc ccagcagaag ctcaaacagc gcatcacagt gctggagacc 1920 aagatgaaac agaaccatga ggatgattac ctatcagatg ggataaacac ccctgagcca 1980 gctgttgctg aatag 1995 <210> 7 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> modified aequorin <400> 7 atgagcgtgc tgacccccct gctgctgcgc ggcctgaccg gcagcgcccg ccgcctgccc 60 gtgccccgcg ccaagatcca cagcctgccc cccgagggca agctgggcat catgaaggtg 120 aagctgacca gcgacttcga caaccccaag tggatcggcc gccacaagca catgttcaac 180 ttcctggacg tgaaccacaa cggccgcatc agcctggacg agatggtgta caaggccagc 240 gacatcgtga tcaacaacct gggcgccacc cccgagcagg ccaagcgcca caaggacgcc 300 gtggaggcct tcttcggcgg cgccggcatg aagtacggcg tggagaccga gtggcccgag 360 tacatcgagg gctggaagcg cctggccacc gaggagctgg agcgctacag caagaaccag 420 atcaccctga tccgcctgtg gggcgacgcc ctgttcgaca tcatcgacaa ggaccagaac 480 ggcgccatca ccctggacga gtggaaggcc tacaccaaga gcgccggcat catccagagc 540 agcgaggact gcgaggagac cttccgcgtg tgcgacatcg acgagagcgg ccagctggac 600 gtggacgaga tgacccgcca gcacctgggc ttctggtaca ccatggaccc cgcctgcgag 660 aagctgtacg gcggcgccgt gccctaa 687

Claims (39)

  1. 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 칼슘 감수성 단백질이 아포에쿼린인 세포.
  3. 제2항에 있어서, TSHR이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 TSHR이고, cAMP 의존성 칼슘 채널이 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개변 CNG 칼슘 채널이고, 칼슘 감수성 단백질이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개변 아포에쿼린인 세포.
  4. 제3항에 있어서, CHO 세포, HEK293 세포 및 3T3 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포.
  5. 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 형광을 발하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 및 발광 기질을 포함하는, 생물 시료 중 TSHR 자극성 항체의 양의 측정용 키트.
  6. 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 형광을 발하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 발광 기질, 및 TSH를 포함하는, 생물 시료 중 TSHR 결합 저해형 항체의 양의 측정용 키트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 갑상선 질환의 진단에 사용할 수 있는 키트.
  8. 제7항에 있어서, 갑상선 질환이 갑상선 기능 항진증 또는 갑상선 기능 저하증인 키트.
  9. 제8항에 있어서, 바세도우병 및/또는 하시모토병의 진단에 사용할 수 있는 키트.
  10. 바세도우병의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 공정 (1) 내지 (3):
    (1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 발광하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2+ 불포함 배지 또는 Ca2+ 및 Mg2+ 불포함 배지, 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 혼합함;
    (2) (1)에서 제조한 혼합물에 Ca2+ 함유 용액을 첨가함; 및
    (3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 측정함
    을 포함하는, 상기 칼슘 감수성 단백질의 발광을 검출하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, (1)에서 제조되는 혼합물이 항 TSH 항체를 더 포함하는 방법.
  12. 갑상선 기능 저하증의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 공정 (1) 내지 (3):
    (1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 발광하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2+ 불포함 배지 또는 Ca2+ 및 Mg2+ 불포함 배지, TSH 또는 자극형의 TSAb 모노클로날 항체, 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 혼합함;
    (2) (1)에서 제조한 혼합물에 Ca2+ 함유 용액을 첨가함; 및
    (3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
    을 포함하는, 상기 칼슘 감수성 단백질의 발광을 검출하는 방법.
  13. 갑상선 기능 저하증의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 공정 (1) 내지 (3):
    (1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 발광하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2+ 함유 배지, TSH 또는 자극형의 TSAb 모노클로날 항체, 및 피험자의 혈액 유래의 샘플을 혼합함;
    (2) (1)에서 제조한 혼합물에 포르스콜린을 첨가함; 및
    (3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
    을 포함하는, 상기 칼슘 감수성 단백질의 발광을 검출하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 피험자가 바세도우병 또는 바세도우병을 발병할 위험성이 높은지의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 높은지를 검출하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 피험자가 갑상선 기능 저하증 또는 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은지의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 낮은지를 검출하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 피험자가 갑상선 기능 저하증 또는 갑상선 기능 저하증을 발병할 위험성이 높은지의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 피험자의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 것에 의해 야기되는 칼슘 감수성 단백질의 발광량이, 정상인의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광량에 비교하여 높은지를 검출하는 방법.
  17. 바세도우병 환자의 치료 유효성의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 공정 (1) 내지 (3):
    (1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 발광하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2+ 불포함 배지 또는 Ca2+ 및 Mg2+ 불포함 배지, 및 바세도우병 환자의 치료 전 또는 치료 후의 혈액 유래의 샘플을 혼합함;
    (2) (1)에서 제조한 혼합물에 Ca2+ 함유 용액을 첨가함; 및
    (3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
    을 포함하고,
    치료 전과 치료 후의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 배양 세포로부터 발생하는 발광량을 비교하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, (1)에서 제조되는 혼합물이 항 TSH 항체를 더 포함하는 방법.
  19. 갑상선 기능 저하증 환자의 치료 유효성의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 공정 (1) 내지 (3):
    (1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 발광하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2+ 불포함 배지 또는 Ca2+ 및 Mg2+ 불포함 배지, TSH 또는 자극형의 TSAb 모노클로날 항체, 추가로 갑상선 기능 저하증 환자의 치료 전 및 치료 후의 혈액 유래의 샘플을 각각 혼합함;
    (2) (1)에서 제조한 혼합물에 Ca2+ 함유 용액을 첨가함; 및
    (3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
    을 포함하고,
    치료 전과 치료 후의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 배양 세포로부터 발생하는 발광량을 비교하는 방법.
  20. 갑상선 기능 저하증 환자의 치료 유효성의 판정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 공정 (1) 내지 (3):
    (1) 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR), cGMP에 비해 cAMP에 높은 감수성을 나타내는 개변된 cAMP 의존성 칼슘 채널, 및 칼슘에 반응하여 발광하는 단백질인 칼슘 감수성 단백질을 발현하는 세포, 칼슘 감수성 단백질의 발광 기질, Ca2+ 함유 배지, TSH 또는 자극형의 TSAb 모노클로날 항체, 및 갑상선 기능 저하증 환자의 치료 전 또는 치료 후의 혈액 유래의 샘플을 혼합함;
    (2) (1)에서 제조한 혼합물에 포르스콜린을 첨가함; 및
    (3) 상기 세포로부터 발생하는 칼슘 감수성 단백질의 발광을 정량함
    을 포함하고,
    치료 전과 치료 후의 혈액 유래의 샘플을 첨가한 배양 세포로부터 발생하는 발광량을 비교하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 갑상선 기능 저하증이 하시모토병인 방법.
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