CN102369275A

CN102369275A - 新型细胞系和方法

Info

Publication number: CN102369275A
Application number: CN2010800148653A
Authority: CN
Inventors: K·夏柯达; D·梭茱克; P·M·沙阿
Original assignee: Chromocell Corp
Current assignee: Chromocell Corp
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2012-03-07
Also published as: EP2391711A2; EP2391711B1; JP2012516687A; EP2391711A4; US20120015841A1; US20170052170A1; WO2010088633A2; AU2010207940A1; MX2011008129A; WO2010088633A4; KR101751074B1; KR20110117695A; JP2017136065A; JP2018085991A; IL214403A0; IL214403A; NZ603996A; EP2924112A1; JP6297769B2; JP2016039802A

Abstract

本发明涉及新型细胞和细胞系以及制备和使用它们的方法。

Description

新型细胞系和方法

本申请要求2009年2月2日提交的美国临时申请No.61/149,321、2009年2月2日提交的美国临时申请361/149,318、2009年2月2日提交的美国临时申请No.61/149,324、2009年2月2日提交的美国临时申请No.61/149,311、2009年8月19日提交的美国临时申请No.61/235,181和2009年7月31日提交的美国临时申请No.61/230,536的权益，上述专利申请中的每一个通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包括已通过EFS-Web提交的并且通过引用整体并入本文的序列表。于2010年2月1日创建的所述ASCII拷贝被命名为0022980025 SeqList.txt，并且大小为200,023个字节。

技术领域

本发明涉及新型细胞和细胞系以及用于制备和使用它们的方法。在具体的实施方案中，本发明涉及稳定地表达复杂靶标(complextarget)的细胞和细胞系。本发明还提供了制备此类细胞和细胞系的方法。本文中提供的细胞和细胞系用于鉴定此类复杂靶标的调节剂。

背景技术

目前，据报导制药公司的药物开发项目的工业平均失败率为大约98％。虽然这包括该过程的所有阶段的失败，但高失败率意味着迫切需要在过程效率中的任何改善。

促成高失败率的一种因素是缺乏表达治疗性靶标的细胞系，所述治疗性靶标在药物开发过程中的基于细胞的功能测定中使用。毫无疑问地，使用基于细胞的测定的研究，特别是药物开发研究，将获益于在基于细胞的测定中使用的细胞和细胞系。

因此，迫切需要快速和有效地建立基于细胞的测定以用于更快速开发新的和改良的药物。优选地，为了更有效的药物开发，测定系统应提供生理学上更加相关的调节剂在体内的效应的预测物。

除需要基于细胞的测定外，还需要改良细胞用于蛋白质生产、基于细胞的疗法和各种其它用途。

因此，存在对表达功能性目的蛋白质或RNA的细胞和细胞系的急切需要。

在口中，可在包括舌、腭的部分、会厌、喉和咽的几个特化区域中发现味觉受体细胞(TRC)。在舌上，TRC被组织成称为味蕾的细胞群。味蕾由单个顶孔组成，其中TRC的微绒毛与存在于口腔内的促味剂(tastant)接触。在舌上，味蕾埋在三类特化表皮结构中。菌状乳头分布在舌的前三分之二上。在舌的后三分之一的侧面上发现在出生时良好发育的但随着年龄增长退化的叶状乳头。7至9个轮廓乳头位于后舌上远至接近界沟的后部。除了味蕾中有组织的‘经典’TRC外，在肺和肠的非舌上皮中发现了化学感受性细胞簇(chemosensory cellcluster)或单独的化学感受性细胞(solitary chemosensory cell)。

甜味受体

甜味感觉由两个亚单位TASR2(T1R2)和TASR3(T1R3)组成的异聚G蛋白偶联受体(GPCR)介导。该受体被称为甜味受体。受体的两个亚单位是C类GPCR亚家族的成员并且具有大N端胞外域，通常称为捕蝇夹域(venus flytrap domain)。T1R亚单位可偶联至G蛋白α转导蛋白(transducin)或α味转导素(gustducin)，通过所述G蛋白它们可激活磷脂酶C(PLC)β2-依赖性途径以增加胞内Ca²⁺浓度。它们还可激活cAMP依赖性途径。

甜味受体检测多种甜味化学品，包括单一碳水化合物(例如糖)、氨基酸、肽、蛋白质和合成甜味剂。甜味受体对天然和人造甜味剂都很敏感。鉴于多种已知激活受体的化学结构，已提出受体中存在多个结合位点，包括跨膜区中的位点和T1R3上的位点，所述T1R3用作与鲜味受体共有的亚单位。

甜味受体也牵涉病症例如肥胖症和糖尿病，因为此类受体似乎在营养物检测和感觉中起着重要作用。味觉受体在人的近端小肠的营养物检测区中表达，其中证据表明它们在检测肠腔中的营养物方面起作用。在该区域中，更具体地在肠的内分泌细胞中存在甜味受体和味转导素(参与细胞内味觉信号传导的G蛋白)的高度协同表达。因此此类甜味受体的功能可显示与其它G蛋白偶联受体相似的配体介导的控制，即，它们可在其高浓度的配体存在的情况下失去其活性和/或表达。这可产生响应血液和腔中葡萄糖浓度的动态代谢变化的肠‘味觉’信号传导。因此，甜味受体和其在肠中的调节可在饮食、食欲以及在多种疾病例如肥胖症和糖尿病的治疗中具有重要作用。

由天然糖和人造甜味剂对肠甜味受体的激活还导致增加的顶端葡萄糖转运蛋白(apical glucose transporter)、GLUT2和其它葡萄糖转运蛋白的表达。例如，人造甜味剂具有营养活性，因为它们可使功能性味觉接受系统(functional taste reception system)发出信号以在进餐过程中增加糖的吸收，这在营养和食欲中、从而在营养不良和进食障碍的潜在治疗中是可具有重要意义的发现。始终升高的顶端GLUT2水平导致增加的糖吸收并且为实验性糖尿病以及由果糖和脂肪诱导的胰岛素抵抗状态的特征。此外，神经内分泌细胞中甜味受体的激活导致胰高血糖素样肽(GLP-1)和可能的其它消化调节剂的释放。总体而言，肠中的甜味受体在感觉肠腔内容物的营养价值中起着重要作用并且通过受调节的吸收和消化帮助协调身体的反应。这些发现表明，甜味受体可用作用于治疗肥胖症和糖尿病的调节剂的可能的靶标。

鲜味受体

美味(鲜味)感觉由2个亚单位TASR1(T1R1)和TASR3(T1R3)组成的异聚GPCR介导。该受体被称为鲜味受体。受体的两个亚单位都是C类GPCR亚家族的成员并且具有通常称为捕蝇夹域的大N末端胞外域。T1R亚单位可偶联至G蛋白α转导蛋白或α味转导素，通过所述G蛋白它们可激活磷脂酶C(PLC)2-依赖性途径以增加细胞内Ca²⁺浓度。它们还可激活cAMP-依赖性途径。此类受体可检测许多种美味化学物质包括L-氨基酸和谷氨酸单钠(MSG)。也已显示T1R1结合5′-肌苷酸二钠(IMP)和其它核苷酸、已知的鲜味增强剂。

鲜味受体也在人的近端小肠的营养物检测区中表达，在所述区域中，它们被认为在检测肠腔中的营养物方面起作用。在该区域中，具体地在神经内分泌细胞中，存在鲜味受体和味导蛋白(参与细胞内味觉信号传导的G蛋白)的高度协同表达。氨基酸对肠鲜味受体的激活导致顶端寡肽转运蛋白PepT1的调节。总体而言，肠中的鲜味受体在感觉肠腔内容物的营养价值中起着重要作用并且通过受调节的吸收和消化帮助协调身体的反应。这些发现表明鲜味受体可用作用于治疗肥胖症和糖尿病的调节剂的可能的靶标。

苦味受体

苦味受体是在味觉受体细胞的表面上表达的G蛋白偶联受体(GPCR)并且被偶联至第二信使途径。TAS2R受体可以例如被偶联至转导蛋白(例如，GNAT1、GNAT2和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(t))或味导蛋白(例如，GNAT3鸟嘌呤核苷酸结合蛋白和α转导蛋白3)，通过所述蛋白它们可激活磷酸二酯酶和磷脂酶C(PLC)β2-依赖性途径以增加胞内Ca²⁺浓度。TAS2R受体还可被偶联至人GNA15(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)α15(Gq种类；异名GNA16)和小鼠Gα15以及它们的嵌合蛋白Gα15-GNA15(也称为Gα15-Ga16)。

人苦味由人TAS2受体(hTAS2R)基因家族的约25个成员介导。苦味受体除了在味觉中的作用之外在一系列生理背景中也是非常重要的。例如，味觉受体激动剂在肠内分泌细胞体外以及在动物体内诱发分泌应答，并且诱导神经元活化。因此，所有苦味受体家族成员是管理多种与苦味促味剂的检测相关的状况的重要的临床靶标。

特异性靶向味觉受体(例如，甜味受体、鲜味受体和苦味受体)并且由此调节它们的活性的新型和改良化合物的发现一直受阻于缺乏稳健的生理学相关的基于细胞的系统，更具体地易于进行高通量形式处理以鉴定和测试味觉受体调节剂(例如，甜味受体调节剂、鲜味受体调节剂和苦味受体调节剂)的此类系统。此类基于细胞的系统对于药物发现和确认是优选的，因为相对于仅提供结合测定的无细胞系统它们为化合物提供了功能测定。此外，基于细胞的系统具有同时测试细胞毒性的优点。理想地，基于细胞的系统还应当稳定地且组成型地表达靶蛋白。还期望基于细胞的系统是可重现的。本发明在提供细胞和细胞系的背景中在各种实施方案中解决这些问题，所述细胞和细胞系以生理学相关的形式和在使用此类细胞和细胞系鉴定味觉受体(例如甜味受体、苦味受体或鲜味受体)的调节剂的方法中稳定地表达味觉受体例如甜味受体、苦味受体或鲜味受体。

发明内容

在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的目的异源二聚体蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的目的异源二聚体蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质，其中所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质，其中所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养。

在某些实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的第二个亚单位的核酸是内源的。在其它实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的第二个亚单位的核酸是引入的。在另外其它的实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签。

在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质选自由下列组成的组：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体、抗体、生物制品和免疫受体。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质是抗体或生物制品。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质选自由下列组成的组：甜味受体和鲜味受体。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不具有已知的配体。在其它实施方案中，不存在检测目的异源二聚体蛋白质的功能表达的已知的测定。

在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不在相同类型的细胞中表达。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。

在某些实施方案中，细胞的进一步特征在于它具有选自下述的另外所需性质：信噪比大于1，随着时间推移是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC₅₀值和生理学IC₅₀值。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质以一定形式一致地且可重现性地产生选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。在某些实施方案中，功能测定选自：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。在某些实施方案中，功能测定是膜电位测定、ELISA、质谱法、目的蛋白质的生物化学表征、细胞生长测定、活力测定、细胞特化测定(cell specification assay)或蛋白质生产的能力。在其它实施方案中，细胞适合用于基于细胞的高通量筛选。

在某些实施方案中，选择压力是抗生素。在其它实施方案中，所述细胞在不存在选择压力的情况下表达异源二聚体蛋白质，进行至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位由所引入核酸编码，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中对所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位由所引入核酸编码，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源多聚体蛋白质的细胞，其中所述异源多聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中对所述细胞进行改造以激活编码目的异源多聚体蛋白质的至少一个亚单位的内源核酸的转录，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。

在某些实施方案中，编码目的异源多聚体蛋白质的至少一个亚单位的核酸是内源的。

在某些实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位的核酸是引入的。

在某些实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签。

在某些实施方案中，目的异源多聚体蛋白质选自由下列组成的组：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。在某些实施方案中，目的异源多聚体蛋白质是抗体或生物制品。在其它实施方案中，目的异源多聚体蛋白质选自由下列组成的组：GABA、ENaC和NaV。在某些实施方案中，目的异源多聚体蛋白质不具有已知的配体。在其它实施方案中，不存在检测所述目的异源多聚体蛋白质的功能表达的已知测定。

在某些实施方案中，目的异源多聚体蛋白质不在相同类型的细胞中表达。在其它实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。

在某些实施方案中，细胞的其它特征在于其具有选自下述的另外所需性质：大于1的信噪比、随着时间推移是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC50值和生理学IC50值。在其它实施方案中，目的异源二聚体蛋白质以一定形式一致地且可重夏性地产生选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。

在某些实施方案中，功能测定选自由下列组成的组：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。在某些实施方案中，功能测定是膜电位测定、ELISA、质谱法、目的蛋白质的生物化学表征、细胞生长测定、活力测定、细胞特化测定或蛋白质生产的能力。在其它实施方案中，表达异源多聚体蛋白质的细胞适合用于基于细胞的高通量筛选。

在某些实施方案中，在不存在选择压力的情况下培养表达异源多聚体蛋白质的细胞。在某些实施方案中，选择压力是抗生素。在其它实施方案中，权利要求35或36的细胞，其中所述细胞在不存在选择压力的情况下表达异源多聚体蛋白质，进行至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。

在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的两种或更多种目的蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的目的蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或在不存在选择压力的情况下培养所述细胞，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达两种或更多种目的蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的两种或更多种目的蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供了表达两种或更多种目的蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。

在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质中的至少一种是二聚体蛋白质。在其它实施方案中，目的二聚体蛋白质是同源二聚体蛋白质。在其它实施方案中，目的二聚体蛋白质是异源二聚体蛋白质。在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质的至少一种是多聚体蛋白质。在其它实施方案中，目的多聚体蛋白质是同源多聚体蛋白质。在其它实施方案中，目的多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质.

在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质之一由内源核酸编码。在其它实施方案中，两种或更多种目的蛋白质之一由所引入核酸编码。在其它实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签。

在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质之一选自由下列组成的组：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体、抗体、生物制品和免疫受体。在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质独立地是抗体或生物制品。在其它实施方案中，目的蛋白质之一不具有已知的配体。在其它实施方案中，不存在检测两种或更多种目的蛋白质的功能表达的已知的测定。

在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质之一不在相同类型的细胞中表达。在某些实施方案中，表达两种或更多种蛋白质的细胞是哺乳动物细胞。

在某些实施方案中，表达两种或更多种蛋白质的细胞的其它特征在于其具有选自如下性质的其它所需性质：大于1的信噪比、随着时间推移是稳定的、无选择压力生长而不丧失表达、生理学EC50值和生理学IC50值。

在某些实施方案中，两种或更多种目的蛋白质以一定的形式一致地且可重现性地产生，进行选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。

在某些实施方案中，功能测定选自由下列组成的组：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。在某些实施方案中，功能测定是膜电位测定、ELISA、质谱法、目的蛋白质的生物化学表征、细胞生长测定、活力测定、细胞特化测定或蛋白质生产的能力。在其它实施方案中，表达两种或更多种蛋白质的细胞适合用于基于细胞的高通量筛选。

在某些实施方案中，在不存在选择压力的情况下培养表达两种或更多种蛋白质的细胞。在某些实施方案中，选择压力是抗生素。在某些实施方案中，细胞在不存在选择压力的情况下表达两种或更多种蛋白质，进行至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。

在某些实施方案中，本发明提供了表达至少一种目的RNA的细胞，其中所述目的RNA由所引入核酸编码，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的至少一种目的RNA，其中所述目的RNA不包含标签，或所述RNA以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了表达至少一种目的RNA的细胞，其中对所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码至少一种目的RNA，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定中使用的形式的至少一种目的RNA，其中所述目的RNA不包含标签，或所述RNA以这样的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。

在某些实施方案中，细胞表达至少两种目的RNA。在其它实施方案中，细胞表达至少三种目的RNA。在某些实施方案中，细胞还表达由所引入核酸编码的RNA。在某些实施方案中，该目的RNA选自：编码离子通道的RNA、编码G蛋白偶联受体(GPCR)的RNA、编码酪氨酸受体激酶的RNA、编码细胞因子受体的RNA、编码核类固醇激素受体的RNA和编码免疫受体的RNA。在其它实施方案中，目的RNA是编码抗体的RNA或编码生物制品的RNA。

在某些实施方案中，目的RNA不在相同类型的细胞中表达。在某些实施方案中，表达目的RNA的细胞是哺乳动物细胞。

在某些实施方案中，表达目的RNA的细胞的进一步特征在于它具有选自下述的另外所需性质：信噪比大于1，随着时间推移是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC50值和生理学IC50值。在其它实施方案中，目的RNA以一定形式一致地且可重现性地产生，进行选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。

在某些实施方案中，功能测定选自由下列组成的组：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。在其它实施方案中，功能测定是膜电位测定、ELISA、质谱法、目的蛋白质的生物化学表征、细胞生长测定、活力测定、细胞特化测定或蛋白质生产的能力。

在某些实施方案中，表达目的RNA的细胞适合用于基于细胞的高通量筛选。

在某些实施方案中，本发明提供了从本文中描述的细胞产生的细胞系。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生表达目的蛋白质的细胞的方法，其中所述细胞具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质，所述方法包括下列步骤：

a)提供多个表达编码目的蛋白质的mRNA的细胞；

b)将细胞单个地分散至单个培养器皿中，从而提供多个分离的细胞培养物；

c)使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于所述条件对于分离的细胞培养物各自是基本等同的，在这个培养过程中使细胞数目/分离的细胞培养物进行标准化，并且其中分离培养物根据相同时间表进行传代；

d)测定分离的细胞培养物的目的蛋白质的至少一种所需特征至少2次；和

e)鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。在具体的实施方案中，由本文中描述的方法产生的细胞是分化细胞。在具体的实施方案中，由本文中描述的方法产生的细胞是去分化的细胞。在具体的实施方案中，去分化的细胞是选自下组的干细胞：多能干细胞、多潜能性干细胞(pluripotent stem cell)、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生表达目的蛋白质的细胞的方法，其中所述细胞至少一种具有随着时间推移保持一致的所需性质，所述方法包括下列步骤：

a)提供至少两个表达编码目的蛋白质的RNA的细胞；

e)鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。在具体的实施方案中，由本文中描述的方法产生的细胞是分化细胞。在具体的实施方案中，由本文中描述的方法产生的细胞是去分化的细胞。在具体的实施方案中，去分化的细胞是选自多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞的干细胞。

在某些实施方案中，在本文描述的方法的步骤a)中的多个细胞在步骤b)中的分散前培养一段时间。

在某些实施方案中，在本发明的方法中使用的单个培养器皿选自：多孔平板的单个孔和小瓶。

在某些实施方案中，该方法进一步包括测定多个分离的细胞培养物的生长速率，并且通过其生长速率将分离的细胞培养物分成组的步骤，从而使得在任何组中最快和最慢的生长速率之间的差异在步骤b)和c)之间不超过1、2、3、4或5小时。

在某些实施方案中，该方法还包括制备一种或多种分离的培养物的贮藏原种的步骤。在某些实施方案中，该方法还包括制备分离的细胞培养物的一个或多个复制组和与所述源分离的细胞培养物分开培养所述一个或多个复制组的步骤。

在某些实施方案中，本发明的方法的步骤d)中的测定是用于蛋白质的功能测定。

在某些实施方案中，在步骤e)中保持一致的至少一种特征是蛋白质功能。

在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤c)中的培养是机器人细胞培养器。在某些实施方案中，机器人细胞培养器包括多通道机器人移液器。在某些实施方案中，多通道机器人移液器包括至少96个通道。在某些实施方案中，机器人细胞培养器进一步包括择优挑选(cherry-picking)臂。

在某些实施方案中，自动化方法包括如下的一项或多项：培养基去除、培养基替换、细胞洗涤、试剂添加、细胞取出、细胞分散和细胞传代。

在某些实施方案中，用于本发明的多个分离的细胞培养物是至少50个培养物。在其它实施方案中，多个分离的细胞培养物是至少100个培养物。在其它实施方案中，多个分离的细胞培养物是至少500个培养物。在其它实施方案中，多个分离的细胞培养物是至少1000个培养物。

在某些实施方案中，通过选择如下方法的方法测定生长速率：测量ATP、测量细胞汇合、光散射、光密度测量。在某些实施方案中，组中最快与最慢生长速率之间的差异不超过1、2、3、4或5个小时。

在某些实施方案中，本发明的方法的步骤c)中的培养为至少2天。

在某些实施方案中，多个分离的细胞培养物的生长速率通过分散细胞且测量细胞汇合进行测定。在某些实施方案中，本发明的方法的每个分离的细胞培养物中的细胞在测量细胞汇合前进行分散。在某些实施方案中，分散步骤包括将胰蛋白酶加入孔中并且消除凝块。在某些实施方案中，使用自动化微板读取器测量多个分离的细胞培养物的细胞汇合。

在某些实施方案中，在计算生长速率前进行至少2次汇合测量。在某些实施方案中，通过自动化平板读取器测量细胞汇合，并且汇合值与计算生长速率的软件程序一起使用。

在某些实施方案中，就所需特性表征步骤d)中的分离的细胞培养物，所需特性选自：脆性(fragility)、形态学、与固体表面的附着；缺乏与固体表面的附着和蛋白质功能。在其它实施方案中，所需特性是UPR、细胞活力、提高蛋白质产量的能力、产率、折叠(folding)、装配、分泌、至细胞膜内的整合、翻译后修饰或糖基化或其任何组合。

在某些实施方案中，用于本发明的方法的细胞是真核细胞。在某些实施方案中，用于本发明的方法的真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞系选自由下列组成的组：NS0细胞、CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、HUVEC、3T3细胞和HeLa细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞系是Perc6。

在某些实施方案中，在本发明的方法中表达的目的蛋白质是人蛋白质。在某些实施方案中，目的蛋白质是异源多聚体。在某些实施方案中，目的蛋白质是G蛋白偶联受体。在其它实施方案中，蛋白质不具有已知配体。在其它实施方案中，不存在检测所述蛋白质的功能表达的已知测定。

在某些实施方案中，本发明的方法在鉴定步骤后还包括下列步骤：

a)在所需培养条件下扩增步骤e)中鉴定的细胞培养物的贮藏等分试样；和

b)确定a)的经扩增的细胞培养物是否具有所需特征。

在某些实施方案中，本发明提供了克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系具有相同的细胞类型，并且其中实验对象组中的每一个细胞系表达目的蛋白质，并且其中使实验对象组中的克隆细胞系相匹配，以共享相同的生理特性，从而允许进行平行加工。

在某些实施方案中，本发明提供了克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系具有相同的细胞类型，并且其中实验对象组中的至少两个细胞系表达目的蛋白质，并且其中使实验对象组中的克隆细胞系相匹配以共享相同的生理特性，从而允许进行平行加工。

在某些实施方案中，本发明提供了克隆细胞系的组合相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系具有相同的细胞类型，并且其中实验对象组中的至少两个细胞系表达目的多亚单位蛋白质，并且其中所述克隆细胞系各自包含目的多亚单位蛋白质的亚单位的不同组合；并且其中使实验对象组中的克隆细胞系相匹配，从而使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。

在某些实施方案中，生理特性是生长速率。在其它实施方案中，生理特性是与组织培养物表面的附着。在其它实施方案中，生理特性是Z′因子。在其它实施方案中，生理特性是编码目的蛋白质的RNA的表达水平。在其它实施方案中，生理特性是目的蛋白质的表达水平。在其它实施方案中，生理特性是编码目的蛋白质的RNA的活性水平。在某些实施方案中，实验对象组中克隆细胞系的生长速率在彼此的1、2、3、4或5个小时内。在其它实施方案中，用于相匹配实验对象组的培养条件对于实验对象组内的所有克隆细胞系是相同的。

在某些实施方案中，用于相匹配实验对象组中的克隆细胞系是真核细胞系。在某些实施方案中，真核细胞系是哺乳动物细胞系。在某些实施方案中，用于相匹配实验对象组中的克隆细胞系细胞选自由下列组成的组：原代细胞和永生化细胞。

在某些实施方案中，用于相匹配实验对象组中的细胞系细胞是原核或真核细胞。在某些实施方案中，用于相匹配实验对象组中的细胞系细胞是真核细胞并且选自由下列组成的组：真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、藻类、甲壳类动物细胞、节肢动物细胞、禽类细胞、爬行类动物(reptilian)细胞、两栖动物细胞和植物细胞。在某些实施方案中，用于相匹配实验对象组中的细胞系细胞是哺乳动物并且选自由下列组成的组：人、非人灵长类动物、牛科动物、猪科动物、猫科动物、大鼠、有袋动物、鼠科动物、犬科动物、绵羊、山羊(caprine)、兔子、豚鼠、仓鼠。

在某些实施方案中，对相匹配实验对象组的细胞系中的细胞进行改造以表达目的蛋白质。在某些实施方案中，相匹配实验对象组的细胞系中的细胞表达来自所引入核酸的目的蛋白质，所述引入核酸编码蛋白质，在多聚体蛋白质的情况下，编码蛋白质的亚单位。在某些实施方案中，细胞表达来自内源核酸的目的蛋白质，并且其中对所述细胞进行改造以激活内源蛋白质的转录，或在多聚体蛋白质的情况下，激活蛋白质的亚单位的转录。

在某些实施方案中，实验对象组包括至少4个克隆细胞系。在其它实施方案中，实验对象组包括至少6个克隆细胞系。在其它实施方案中，实验对象组包括至少25个克隆细胞系。

在某些实施方案中，实验对象组中的2个或更多个克隆细胞系表达相同的目的蛋白质。在其它实施方案中，实验对象组中的2个或更多个克隆细胞系表达不同的目的蛋白质。

在某些实施方案中，实验对象组中的细胞系表达目的蛋白质的不同形式，其中所述形式选自由下列组成的组：同种型、氨基酸序列变体、剪接变体、截断形式、融合蛋白、嵌合体或其组合。在其它实施方案中，所述形式是活性形式、修饰形式、糖基化形式、蛋白质水解的形式或功能形式或其组合。在其它实施方案中，所述形式选自由下列组成的组：同种型、氨基酸序列变体、剪接变体、截断形式、融合蛋白、嵌合体、活性形式、修饰形式、糖基化形式、蛋白质水解的形式、功能形式或其组合。

在某些实施方案中，实验对象组中的细胞系表达一组目的蛋白质中的不同蛋白质，其中所述目的蛋白质的组选自由下列组成的组：相同信号传导途径中的蛋白质、相似蛋白质的表达文库、单克隆抗体重链文库、单克隆抗体轻链文库和SNP。

在某些实施方案中，实验对象组中表达的目的蛋白质是单链蛋白质。在某些实施方案中，所述单链蛋白质是G蛋白偶联受体。在某些实施方案中，G蛋白偶联受体是味觉受体。在某些实施方案中，味觉受体选自由下列组成的组：苦味受体、甜味受体、咸味受体和鲜味受体。

在其它实施方案中，实验对象组中表达的目的蛋白质是多聚体蛋白质。在某些实施方案中，所述蛋白质是异源二聚体或异源多聚体。

在某些实施方案中，实验对象组中表达的目的蛋白质选自由下列组成的组：离子通道、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。在其它实施方案中，实验对象组中表达的目的蛋白质是抗体或生物制品。在某些实施方案中，相匹配实验对象组中表达的蛋白质是上皮钠通道(ENaC)。在某些实施方案中，ENaC包括α亚单位、β亚单位和γ亚单位。在其它实施方案中，实验对象组中的细胞系表达不同的ENaC同种型。在其它实施方案中，实验对象组中的细胞系包含ENaC的不同的蛋白质水解的同种型。在某些实施方案中，ENaC是人ENaC。在某些实施方案中，相匹配实验对象组中表达的蛋白质是电压门控钠通道(NaV)。在某些实施方案中，NaV包含α亚单位和2个β亚单位。在某些实施方案中，NaV是人NaV。

在某些实施方案中，相匹配实验对象组中表达的蛋白质选自由下列组成的组：γ-氨基丁酸A受体(GABA_A受体)、γ-氨基丁酸B受体(GABA_B受体)和γ-氨基丁酸C受体(GABA_c受体)。在某些实施方案中，蛋白质是GABA_A受体。在某些实施方案中，GABA_A受体包含2个α亚单位、2个β亚单位和γ或δ亚单位。

在某些实施方案中，在实验对象组中的克隆细胞系同时或在彼此不超过4周内产生。在其它实施方案中，使用基本上相同的方法(用于实验对象组的克隆细胞系的分离、维持或测试)产生实验对象组中的克隆细胞系。

在某些实施方案中，本发明提供了从所引入的编码所述目的单体蛋白质的核酸表达目的单体蛋白质的细胞，其特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞并且其中蛋白质的表达在3个月内改变不超过5％。在某些实施方案中，蛋白质的表达在6个月内改变不超过5％。在某些实施方案中，目的单体蛋白质不具有已知的配体。

在某些实施方案中，本发明提供了从所引入的编码所述目的单体蛋白质的核酸表达目的单体蛋白质的细胞，其特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞并且其中蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％。在某些实施方案中，蛋白质的表达在6个月内改变不超过30％。

在某些实施方案中，本发明提供了表达至少一种目的RNA的细胞，其中所述目的RNA由所引入的核酸编码，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的RNA，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞并且其中RNA的表达在3个月内改变不超过30％。在某些实施方案中，RNA的表达在6个月内改变不超过30％。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的蛋白质的细胞，其中所述目的蛋白质由所引入的核酸编码，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞并且其中蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％。在某些实施方案中，蛋白质的表达在6个月内改变不超过30％。

在某些实施方案中，本发明提供了表达至少一种目的蛋白质的细胞，其中目的蛋白质不具有已知的配体或其中不存在检测所述目的蛋白质的功能表达的已知测定；并且其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签。

在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定目的蛋白质的调节剂的方法，包括下列步骤：

a)将根据上述细胞实施方案中的任一项的细胞与测试化合物接触；和

b)检测相比于未与测试化合物接触的细胞中蛋白质的活性，与所述测试化合物接触的细胞中目的蛋白质的活性的变化；

其中与在不存在的情况下相比较，在存在的情况下产生活性差异的化合物是目的蛋白质的调节剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过上述段落的方法鉴定的调节剂。

在某些实施方案中，本发明提供了从所引入的编码至少一种目的蛋白质的核酸表达至少一种目的蛋白质的细胞，其中所述至少一种目的蛋白质改变细胞的生理特性，并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的蛋白质的细胞，其中对所述细胞进行改造以激活编码目的蛋白质的内源核酸的转录，其中所述目的蛋白质改变细胞的生理特性，并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的RNA的细胞，其中所述目的RNA由所引入的核酸编码，其中所述至少一种目的RNA改变细胞的生理特性，并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％。

从所引入的编码至少一种目的蛋白质的核酸表达至少一种目的蛋白质的细胞，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少500、2,500、5,000或100,000皮克蛋白质/细胞/天。

表达目的蛋白质的细胞，其中对所述细胞进行改造以激活编码目的蛋白质的内源核酸的转录，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少500、2,500、5,000或100,000皮克蛋白质/细胞/天。

在某些实施方案中，在选自少于1周、少于2周、少于3周、少于4周、少于1个月、少于2个月、少于3个月、少于4个月、少于5个月、少于6个月、少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了从所引入的编码至少一种目的蛋白质的核酸表达至少一种目的蛋白质的细胞，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在选自少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生细胞，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少0.5、1.0、5.0或10g/L的蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供了表达目的蛋白质的细胞，其中对所述细胞进行改造以激活编码目的蛋白质的内源核酸的转录，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在选自少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生细胞，并且所述细胞一致地且可重现性地表达至少0.5、1.0、5.0或10g/L的蛋白质。

在某些实施方案中，在选自少于3个月、少于4个月或少于6个月的时间段中产生细胞。在某些实施方案中，蛋白质是单体蛋白质。在其它实施方案中，蛋白质是多聚体蛋白质。在某些实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签或在不存在选择压力的情况下培养所述细胞，或其组合。在某些实施方案中，多聚体目的蛋白质包含至少2、3、4、5或至少6个亚单位。在某些实施方案中，目的多聚体蛋白质选自由下列组成的组：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体、抗体、生物制品和免疫学受体。在某些实施方案中，目的多聚体蛋白质是离子通道并且细胞生理特性选自膜电位、UPR、细胞活力、提高蛋白质产量的能力、产率、折叠装配、分泌、至细胞膜内的整合、翻译后修饰、糖基化或其任何组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了从本文中描述的细胞产生的细胞系。

在某些实施方案中，本发明提供了鉴定目的蛋白质的调节剂的方法，包括下列步骤：

a)将本文中描述的细胞(例如，表达至少一种目的蛋白质或RNA的细胞)与测试化合物接触；和

b)检测相比于未与测试化合物的细胞中蛋白质的活性，与测试化合物接触的细胞中目的蛋白质的活性的变化；

其中与不存在的情况下相比较，在存在的情况下产生活性差异的化合物是目的蛋白质的调节剂。

在某些实施方案中，本发明提供了细胞或克隆细胞系的相匹配实验对象组，其包含至少2种本文中描述的细胞(例如，表达至少一种目的蛋白质或RNA的细胞)或2种本文中描述的克隆细胞系(例如，从本文中描述的细胞产生的细胞系)，其中所述至少2种细胞或至少2种克隆细胞系是相匹配的，使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。

在某些实施方案中，相匹配实验对象组包括至少10种细胞、10个克隆细胞系并且至少10种细胞或10个克隆细胞系是相匹配的，使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。在其它实施方案中，实验对象组包括至少100种细胞或至少100种克隆细胞系并且地将所述至少100种细胞或至少100种克隆细胞系在相同的细胞培养条件下培养。

在某些实施方案中，本发明提供了克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系具有相同的类型并且包含第一和第二目的蛋白质；其中第一目的蛋白质在每一个克隆细胞系中是相同的；其中第二目的蛋白质是功能生物学途径的组分；并且其中：

a)所述实验对象组包括至少5个细胞系；

b)在6个月内产生所述实验对象组；

c)第一和第二目的蛋白质不具有蛋白质标签；

d)在不存在选择压力的条件下培养克隆细胞系；或

e)a)-d)的任何组合。

在某些实施方案中，第一目的蛋白质是抗体并且功能生物学途径是糖基化途径。

某些实施方案中，本发明提供了用于产生体内生理特性的体外相关性的方法，其中所述方法包括：

a)将具有生理特性的化合物或多种化合物与表达第一目的蛋白质的第一细胞接触；

b)在功能测定中测定化合物或多种化合物对第一蛋白质的效应；

c)将化合物或多种化合物与表达第二目的蛋白质的第二细胞接触；

d)在功能测定中测定化合物或多种化合物对第二蛋白质的效应；

其中第一和第二蛋白质独立地i)不包含蛋白质标签；ii)以适合于功能测定的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，iii)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，iv)改变细胞的生理特性并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％；v)于在选择不存在的情况下培养的细胞中稳定地表达并且其中蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％，vi)在还表达另一种蛋白质的细胞中表达并且在不存在选择压力的情况下培养所述细胞或vii)其任何组合；以及其中步骤a)至d)中获得的特征谱提供了体内生理特性的体外相关性。

在某些实施方案中，第一和第二目的蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。在某些实施方案中，多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。在某些实施方案中，多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质。在某些实施方案中，第一和第二目的蛋白质独立地选自由下列组成的组：ENaC、NaV、GABAA、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR和GCC。

在某些实施方案中，第一和第二细胞是还包括至少一种其它细胞的细胞的实验对象组内的细胞；对细胞的实验对象组中的每一种细胞进行改造以表达不同的蛋白质，并且将所述细胞与化合物或多种化合物接触；在功能测定中测定化合物或多种化合物对细胞的实验对象组中的每一种细胞中表达的每一种蛋白质的效应；并且将每一种细胞中化合物或多种化合物的活性谱用于产生生理特性的体外相关性。

在某些实施方案中，每一种蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。在某些实施方案中，多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。在某些实施方案中，多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质。在某些实施方案中，每一种蛋白质独立地选自由下列组成的组：ENaC、NaV、GABAA、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR和GCC。

在某些实施方案中，本发明提供了用于预测测试化合物的生理特性的方法，其中所述方法包括：

a)将测试化合物或多种测试化合物与表达上文中描述的第一目的蛋白质(例如，如用于产生体内生理特性的体外相关性的方法中描述的第一目的蛋白质)的第一细胞接触；

b)在功能测定中测定测试化合物或多种测试化合物对第一蛋白质的效应；

c)将测试化合物或多种测试化合物与表达上文中描述的第二目的蛋白质(例如，如用于产生体内生理特性的体外相关性的方法中描述的第二目的蛋白质)的第二细胞接触；

d)在功能测定中测定测试化合物或多种测试化合物对第二蛋白质的效应；

e)将步骤a)至d)中获得的测试化合物的活性谱与如通过上文中描述的方法(例如，用于产生体内生理特性的体外相关性的方法)产生的体外相关性相比较，

其中第一和第二蛋白质独立地i)不包含蛋白质标签，ii)以适合用于功能测定的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，iii)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，iv)改变细胞的生理特性并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％；v)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达并且其中所述蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％，vi)在还表达另一种蛋白质的细胞中表达并且在不存在选择压力的情况下培养所述细胞或vii)其任何组合；以及其中如果测试化合物的活性谱与体外相关性的活性谱具有至少90％的相同，那么预测测试化合物或多种测试化合物具有体外相关性的生理特性。

在某些实施方案中，本发明提供了用于证实测试化合物或多种测试化合物的生理特性的方法，其中所述方法包括：

e)将步骤a)至d)中获得的测试化合物或多种测试化合物的活性谱与如通过上文中描述的方法(例如，用于产生体内生理特性的体外相关性的方法)产生的体外相关性相比较，其中第一和第二蛋白质独立地i)不包含蛋白质标签，ii)以适合用于功能测定的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，iii)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，iv)改变细胞的生理特性并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％；v)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达并且其中蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％，vi)在还表达另一种蛋白质的细胞中表达并且在不存在选择压力的情况下培养所述细胞或vii)其任何组合；以及其中如果测试化合物或多种测试化合物的活性谱与体外相关性的活性谱具有至少90％的相同，那么测试化合物被证实为具有生理特性。

在某些实施方案中，第一和第二蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。在某些实施方案中，多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或至少6个亚单位。在某些实施方案中，多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质。

在某些实施方案中，第一和第二细胞是还包括至少一种其它细胞的细胞的实验对象组中的细胞；对细胞的实验对象组中的每一种细胞进行改造以表达不同的蛋白质，并且将所述细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；在功能测定中测定测试化合物或多种测试化合物对细胞的实验对象组中的每一个细胞中表达的每一种目的蛋白质的效应；并且将每一种细胞中测试化合物或多种测试化合物的活性谱用于与体外相关性的特征谱相比较。

在某些实施方案中，第一多聚体目的蛋白质和第二多聚体目的蛋白质的至少一个是异聚体蛋白质。在某些实施方案中，第一目的蛋白质和第二目的蛋白质的至少一个是二聚体蛋白质。在其它实施方案中，第一目的蛋白质和第二目的蛋白质的至少一个是三聚体蛋白质。在某些实施方案中，第一目的蛋白质和第二目的蛋白质是多聚体蛋白质的不同形式。在某些实施方案中，多聚体蛋白质是GABAA受体。

在某些实施方案中，第一或第二目的蛋白质的至少一个是功能生物学途径的部分。在某些实施方案中，功能生物学途径选自由下列组成的组：糖基化、蛋白质合成、UPR、ER、核糖体、线粒体活性、RNA合成、翻译后修饰、细胞信号传导、细胞生长和细胞死亡。

在某些实施方案中，生理特性是治疗效应。在某些实施方案中，生理特性是不利效应。在某些实施方案中，利用高通量筛选测定化合物或多种化合物对生理特性的效应。在某些实施方案中，在计算机系统中执行上文中描述的比较步骤。

在某些实施方案中，本发明提供了用于测定测试化合物或多种测试化合物的生理特性的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)接受所述测试化合物或多种测试化合物的第一活性谱，其中通过上文中描述的方法产生所述第一活性谱，并且其中所述第一活性谱提供了所述测试化合物或多种测试化合物的生理特性的体外相关性；

(b)将所述第一活性谱与数据库中存储的多个标志性活性谱相比较以测定所述第一活性谱与所述多个标志性活性谱中的每一个所述标志性活性谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性活性谱提供了各已知化合物或多个已知化合物的已知的生理特性的体外相关性；

(c)基于步骤(b)中测定的相似性量度确定与所述第一活性谱最相似的一个或多个标志性活性谱：和

(d)将与经测定与步骤(c)中的所述第一活性谱最相似的一个或多个标志性活性谱相关的已知生理特性鉴定为所述测试化合物或多种测试化合物的生理特性；其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)、(b)、(c)和(d)。

在某些实施方案中，如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么一个或多个标志性活性谱与所述第一活性谱最相似。

在某些实施方案中，本发明提供了用于将测试化合物或多种测试化合物表征为与特定生理特性相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(b)将多个活性谱聚类，所述多个活性谱包括所述第一活性谱和多个标志性活性谱，其中每一个所述标志性活性谱为各已知化合物或多个已知化合物的已知的生理特性提供体外相关性；

(c)鉴定所述多个标志性活性谱中与所述第一活性谱聚类的一个或多个标志性活性谱；和

(d)将测试化合物或多种测试化合物表征为与各已知化合物或多个已知化合物的所述已知的生理特性相关，所述化合物的所述已知的生理特性对应于在步骤(c)中被鉴定为与所述第一活性谱聚类的一个或多个标志性活性谱；

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)、(b)、(c)和(d)。

在某些实施方案中，本发明提供了使用分类器(classifier)依据生理特性分类测试化合物或多种测试化合物的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)使用数据库中存储的多个标志性活性谱训练分类器以依据药理性质分类测试化合物或多种测试化合物，其中每一个所述标志性活性谱为各已知化合物或多个已知化合物的已知的生理特性提供了体外相关性；和

(b)使用所述分类器处理由上文中描述的方法产生的第一活性谱以依据生理特性分类所述测试化合物或多种测试化合物；

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

在某些实施方案中，本发明提供了使用分类器依据生理特性分类测试化合物或多种测试化合物的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)使用数据库中存储的多个标志性活性谱训练分类器以依据药理性质分类化合物或多种化合物，其中每一个所述标志性活性谱为各化合物的已知的体内药理性质提供了体外相关性；和

(b)使用所述分类器处理由上文中描述的方法产生的第一活性谱以依据生理特性分类所述测试化合物或多种测试化合物，

(c)使用数据库中存储的多个标志性活性谱训练分类器以依据生理特性分类测试化合物或多种测试化合物，其中每一个所述标志性活性谱为各已知化合物或多种化合物的已知的生理特性提供了体外相关性；

(d)其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

在某些实施方案中，本发明提供了用于表征细胞中多聚体目的蛋白质的活性亚单位组合的方法，其中所述方法包括：

(a)将表达目的多聚体蛋白质的第一亚单位的第一细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；

(b)将表达目的多聚体蛋白质的第二亚单位的第二细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；

(c)将表达目的多聚体蛋白质的第一亚单位和第二亚单位的第三细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；

(d)在功能测定中测定测试化合物或多种测试化合物对多聚体蛋白质(当其在第一细胞、第二细胞、第三细胞中表达时)的效应；

(e)推断第一和/或第二亚单位是否是生物活性多聚体蛋白质的部分；和

其中步骤a)至d)中获得的特征提供了体内生理特性的体外相关性，并且其中多聚体蛋白质的第一、第二亚单位独立不包含蛋白质标签，于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，或其任何组合。

在某些实施方案中，目的多聚体蛋白质是异源二聚体。在其它实施方案中，目的多聚体蛋白质异源三聚体。

(c)表达目的多聚体蛋白质的第三亚单位的第三细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；

(d)表达目的多聚体蛋白质的第一、第二和第三亚单位的第四细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；

(e)在功能测定中测定测试化合物或多种测试化合物对多聚体蛋白质(当其在第一细胞、第二细胞、第三细胞和第四细胞中表达时)的效应；

(f)推断第一、第二和/或第三亚单位是否是生物活性多聚体蛋白质的部分；

其中多聚体蛋白质的第一、第二和第三亚单位独立不包含蛋白质标签，于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，或其任何组合。

在某些实施方案中，多聚体蛋白质是异源三聚体。在某些实施方案中，多聚体蛋白质是GABAA受体。

在某些实施方案中，本发明提供了细胞的实验对象组，其中所述实验对象组包括第一细胞和第二细胞，其中已对第一和第二细胞进行改造以表达多聚体目的蛋白质的相同亚单位，其中第一细胞中目的多聚体蛋白质的生理特性与第二细胞中多聚体蛋白质的生理特性不同，并且其中第一和第二细胞源自相同的宿主细胞系；其中目的多聚体蛋白质的亚单位不包含蛋白质标签，在不存在选择压力的条件下培养的细胞中表达，或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明提供了克隆细胞系的实验对象组，其中已将每一个细胞系进行改造以表达目的多聚体蛋白质的相同亚单位，并且其中每一个细胞系中多聚体蛋白质的生理特性与所述实验对象组的另一个细胞系中目的多聚体蛋白质的生理特性不同，并且其中细胞系的实验对象组中的细胞系来源于相同宿主细胞系；其中目的多聚体蛋白质的亚单位不包含蛋白质标签，在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，或其任何组合。

在某些实施方案中，实验对象组包括2个细胞系。在某些实施方案中，实验对象组包括5个细胞系。在某些实施方案中，实验对象组包括10个细胞系。

在某些实施方案中，目的多聚体蛋白质是NaV。

在某些实施方案中，本发明提供已进行了改造以表达功能生物学途径的所有组成蛋白的细胞。

在某些实施方案中，该途径具有至少5种蛋白质组分。在某些实施方案中，在不存在选择压力的情况下培养所述细胞。在某些实施方案中，生物学途径的组成蛋白质不包含蛋白质标签。

在某些实施方案中，本发明提供了包括多个克隆细胞系的克隆细胞系的实验对象组，其中多个克隆细胞系的每一个克隆细胞系已进行改造以表达不同的气味受体；其中所述气味受体不包含蛋白质标签，或所述气味受体以适合用于功能测定的形式一致地且可重现性地产生，使得细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，或在不存在选择压力的情况下培养克隆细胞系，或其任何组合。

在某些实施方案中，多个克隆细胞系包括至少10个细胞系。在某些实施方案中，不同气味受体是人气味受体或昆虫气味受体。

在某些实施方案中，不同人气味受体选自由下列组成的组：OR10A1、OR10A3、OR10A4、OR10A5、OR10A6、OR10A7、OR10C1、OR10C2、OR10D4、OR10G2、OR10G3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR10H5、OR10J1、OR10J3、OR10J5、OR10J6、OR10K1、OR10K2、OR10Q1、OR10R2、OR10S1、OR10T2、OR10V1、OR10Z1、OR11A1、OR11G2、OR11H1、OR11H4、OR11H6、OR11H7P、OR11L1、OR12D3、OR13A1、OR13C2、OR13C3、OR13C4、OR13C5、OR13C7、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13E2、OR13F1、OR13G1、OR13H1、OR13J1、OR14A16、OR14A2、OR14C36、OR14J1、OR1A1、OR1A2、OR1A2、OR1B1、OR1C1、OR1D2、OR1D4、OR1D5、OR1E1、OR1E2、OR1E2、OR1E5、OR1E5、OR1E6、OR1E7、OR1F1、OR1F10、OR1F11、OR1F12、OR1F2、OR1G1、OR1I1、OR1J1、OR1J2、OR1J2、OR1J4、OR1J5、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L4、OR1L6、OR1L8、OR1M1、OR1M1、OR1N1、OR1N2、OR1N3、OR1Q1、OR1S1、OR1S2、OR2A1、OR2A10、OR2A19、OR2A20、OR2A21、OR2A4、OR2A42、OR2A5、OR2A6、OR2A7、OR2AE1、OR2AJ1、OR2AK2、OR2B1、OR2B2、OR2B3、OR2B6、OR2B9、OR2C1、OR2D1、OR2D2、OR2D3、OR2F1、OR2F2、OR2F3、OR2G2、OR2G3、OR2H1、OR2H2、OR2H3、OR2J2、OR2J3、OR2K1、OR2K2、OR2L1、OR2L2、OR2L3、OR2L5、OR2L8、OR2M1、OR2M2、OR2M4、OR2S2、OR2T1、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2V1、OR2V2、OR2V3、OR2W1、OR2W3、OR2Y1、OR2Z1、OR3A1、OR3A2、OR3A3、OR3A4、OR4A15、OR4A16、OR4A4、OR4A5、OR4B1、OR4C12、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C6、OR4D1、OR4D2、OR4D5、OR4D6、OR4D9、OR4E2、OR4F10、OR4F15、OR4F16、OR4F16、OR4F17、OR4F18、OR4F19、OR4F3、OR4F6、OR4K1、OR4K13、OR4K14、OR4K15、OR4K17、OR4K2、OR4K3、OR4K5、OR4L1、OR4M1、OR4M2、OR4N2、OR4N4、OR4N5、OR4P4、OR4Q3、OR4S1、OR4X1、OR4X2、OR51A2、OR51A4、OR51A7、OR51B2、OR51B4、OR51D1、OR51E1、OR51E2、OR51F2、OR51G1、OR51G2、OR51H1、OR51I1、OR51I2、OR51L1、OR51M1、OR51Q1、OR51S1、OR51T1、OR52A1、OR52A2、OR52B2、OR52B4、OR52B4、OR52B4、OR52B6、OR52D1、OR52E2、OR52E4、OR52E5、OR52E6、OR52E8、OR52H1、OR52I1、OR5212、OR52J3、OR52K1、OR52K2、OR52L1、OR52L2、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52N5、OR52P1、OR52R1、OR56A4、OR56A6、OR56B2、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AC2、OR5AK2、OR5AK3、OR5AN1、OR5AP2、OR5AR1、OR5AS1、OR5AU1、OR5AU1、OR5B13、OR5B16、OR5B17、OR5B2、OR5B3、OR5C1、OR5D13、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5G3、OR5H1、OR5H2、OR5H6、OR5I1、OR5K1、OR5K2、OR5L1、OR5L2、OR5M1、OR5M10、OR5M11、OR5M11、OR5M3、OR5M3、OR5M8、OR5M9、OR5P2、OR5P3、OR5T2、OR5T3、OR5V1、OR6A1、OR6B1、OR6B2、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6F1、OR6J2、OR6K3、OR6K6、OR6M1、OR6N1、OR6N2、OR6P1、OR6Q1、OR6S1、OR6T1、OR6V1、OR6X1、OR6Y1、OR7A10、OR7A17、OR7A2、OR7A5、OR7C1、OR7C2、OR7D2、OR7D2、OR7D4P、OR7E102、OR7E120、OR7G1、OR7G2、OR7G3、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8B8、OR8D1、OR8D2、OR8D4、OR8G1、OR8G2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR9A2、OR9A4、OR9G1、OR9G4、OR9G5、OR9I1、OR9K2和OR9Q1。

在某些实施方案中，不同昆虫气味受体是蚊子气味受体，其选自由下列组成的组：IOR100、IOR101、IOR102、IOR103、IOR104、IOR105、IOR106、IOR107、IOR108、IOR109、IOR110、IOR111、IOR112、IOR113、IOR114、IOR115、IOR116、IOR117、IOR118、IOR119、IOR120、IOR121、IOR122、IOR123、IOR124、IOR125、IOR126、IOR127、IOR49、IOR50、IOR51、IOR52、IOR53、IOR54、IOR55、IOR56、IOR57、IOR58、IOR59、IOR60、IOR61、IOR62、IOR63、IOR64、IOR65、IOR66、IOR67、IOR68、IOR69、IOR70、IOR71、IOR72、IOR73、IOR74、IOR75、IOR76、IOR77、IOR78、IOR79、IOR80、IOR81、IOR82、IOR83、IOR84、IOR85、IOR86、IOR87、IOR88、IOR89、IOR90、IOR91、IOR92、IOR93、IOR94、IOR95、IOR96、IOR97、IOR98、IOR99、ORL7077、ORL7078、ORL7079、ORL7080、ORL7081、ORL7082、ORL7083、ORL7084、ORL7085、ORL7086、ORL7087、ORL7088、ORL7089、ORL7090、ORL7091、ORL7092、ORL7093、ORL7094、ORL7095、ORL7096、ORL7097、ORL7098、ORL7099、ORL7100、ORL7101、ORL7102、ORL7103、ORL7104、ORL7105、ORL7106、ORL7107、ORL7108、ORL7109、ORL7110、ORL7111、ORL7112、ORL7113、ORL7114、ORL7115、ORL7116、ORL7117、ORL7118、ORL7119、ORL7120、ORL7121、ORL7122、ORL7123、ORL7124、ORL7125、TPR2307、TPR2308、TPR2309、TPR2310、TPR2312、TPR2314、TPR2315、TPR2316、TPR2317、TPR2318、TPR2319、TPR2320、TPR2321、TPR2321、TPR698、TPR699、TPR700、TPR701、TPR702、TPR703、TPR704、TPR705、TPR706、TPR707、TPR708、TPR709、TPR710、TPR711、TPR712、TPR713、TPR714、TPR715、TPR716、TPR717、TPR718、TPR719、TPR720、TPR721、TPR722、TPR723、TPR724、TPR725、TPR725、TPR726、TPR727、TPR728、TPR729、TPR730、TPR731、TPR732、TPR733、TPR734、TPR735、TPR736、TPR737、TPR738、TPR739、TPR740、TPR741、TPR742、TPR743、TPR744、TPR745、TPR746、TPR747、TPR748、TPR749、TPR750、TPR751、TPR752、TPR753、TPR754、TPR755、TPR756、TPR757、TPR758、TPR759、TPR760、TPR761、TPR762、TPR763、TPR764、TPR765、TPR766、TPR767、TPR768、TPR769、TPR770、TPR771和TPR772。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法，其中所述方法包括：

i.将本文中描述的实验对象组(例如，包括多个克隆细胞系的克隆细胞系的实验对象组，其中多个克隆细胞系的每一个克隆细胞系已进行改造以表达不同气味受体)与测试化合物或组合物接触；和

ii测量测试化合物或组合物对实验对象组中至少2种不同气味受体在功能测试中的活性的效应，其中步骤(ii)中测量的活性提供了测试化合物或组合物的气味活性谱。

在某些实施方案中，本发明提供了鉴定模拟第一测试化合物或组合物的气味的第二测试化合物的方法，其中所述方法包括：

i.将本文中描述的实验对象组(例如，包括多个克隆细胞系的克隆细胞系的实验对象组，其中多个克隆细胞系的每一个克隆细胞系已进行改造以表达不同气味受体)与第二测试化合物接触；

ii测试第二测试化合物对实验对象组中至少2种气味受体在功能测定中的活性的效应；

iii.将步骤(ii)中获得的第二测试化合物的气味活性谱与第一测试化合物或组合物的气味活性谱相比较；其中，如果第二测试化合物的气味活性谱与第一测试化合物或组合物的气味活性谱相似，那么第二测试化合物模拟第一测试化合物或组合物的气味。

在某些实施方案中，本发明提供了鉴定改变第一测试化合物或组合物的气味活性谱的第二测试化合物的方法，其中所述方法包括：

i.按照本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)在第一测试化合物或组合物存在的情况下产生第二测试化合物的气味活性谱；

ii将步骤(i)中获得的气味活性谱与在第二测试化合物不存在的情况下的第一测试化合物或组合物的气味活性谱相比较；其中如果单独的第一测试化合物或组合物的气味活性谱与在第一测试化合物或组合物存在的情况下的第二测试化合物的气味活性谱不同，那么第二测试化合物改变了第一测试化合物或组合物的气味活性谱。

在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定与测试化合物相关的气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)接受测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

(b)将所述第一气味活性谱与数据库中存储的多个标志性气味活性谱相比较以测定所述第一气味活性谱与所述多个标志性气味活性谱中的每一个所述标志性气味活性谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各个具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

(c)基于步骤(b)中测定的相似性量度确定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱；和

(d)将与步骤(c)中经确定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱相关的气味鉴定为与所述已知化合物相关的气味；

在某些实施方案中，如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么一个或多个标志性气味活性谱与所述第一气味活性谱最相似。

在某些实施方案中，本发明提供了用于将化合物表征为与特定气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)接受所述化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

(b)将多个气味活性谱聚类，所述多个气味活性谱包括所述第一气味活性谱和多个标志性气味活性谱，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各个具有已知气味的已知化合物，并且其中所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

(c)鉴定所述多个标志性气味活性谱中与第一气味活性谱聚类的一个或多个标志性气味活性谱；和

(d)将化合物表征为与所述已知的气味相关，所述气味与对应于在步骤(c)中被鉴定为与所述第一气味活性谱聚类的一个或多个标志性气味活性谱的各化合物相关；

在某些实施方案中，本发明提供了使用分类器将测试化合物分类为具有气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)使用数据库中存储的多个标志性气味活性谱训练分类器以依据气味分类测试化合物，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各自具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；和

(b)使用所述分类器处理由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生的所述化合物的第一气味活性谱以依据已知气味分类所述化合物；

在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

使用所述分类器处理由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生的所述化合物的第一气味活性谱以依据已知的气味分类所述化合物，其中根据方法训练所述分类器，所述方法包括：

使用数据库中存储的多个标志性气味活性谱训练分类器以依据气味分类测试化合物，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各自具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

其中在使用适当程序化的计算机上进行处理。

在某些实施方案中，本发明提供了用于使一种或多种测试化合物与气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)接受第一测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生，并且其中所述第一测试化合物具有已知的气味；

(b)将所述第一气味活性谱与数据库中存储的多个标志性气味活性谱相比较以测定所述第一气味活性谱与所述多个标志性气味活性谱中的每一个所述标志性气味活性谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各自已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

(c)基于步骤(b)中测定的相似性量度，确定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱；

(d)将对应于在步骤(c)中被测定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱的各测试化合物表征为与所述已知的气味相关；

在某些实施方案中，如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性气味活性谱与所述第一气味活性谱最相似。

在某些实施方案中，本发明提供了用于将一种或多种测试化合物表征为与特定气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

(a)接受第一测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生，并且所述第一测试化合物具有已知的气味；

(b)将多个气味活性谱聚类，所述多个气味活性谱包括所述第一气味活性谱和多个标志性气味活性谱，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各自已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

(d)将所述化合物表征为与所述已知的气味相关，所述已知的气味与对应于在步骤(c)中被鉴定为与所述第一气味活性谱聚类的一个或多个标志性气味活性谱的各化合物相关；

在某些实施方案中，本发明提供了使用分类器将一种或多种测试化合物分类为具有气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

使用所述分类器处理由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱对应于具有已知气味的第一测试化合物，以将数据库中存储的多个标志性气味活性谱中的一个或多个标志性气味活性谱分类为具有所述已知气味，其中根据方法训练所述分类器，所述方法包括：

使用所述多个标志性气味活性谱训练分类器将所述一个或多个标志性气味活性谱分类为具有气味，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各自已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由本文中描述的方法(例如，用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法)产生；

其中在使用适当程序化的计算机上进行处理。

在某些实施方案中，目的RNA是siRNA或反义RNA。在某些实施方案中，目的蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

在某些实施方案中，目的蛋白质是由表8中显示的人基因符号标识的孤儿受体，其选自由下列组成的组：BRS3、GPR42P、FPRL2、GPR81、OPN3、GPR52、GPR21、GPR78、GPR26、GPR37、GPR37L1、GPR63、GPR45、GPR83、GRCAe、GPR153、P2RY5、P2RY10、GPR174、GPR142、GPR139、ADMR、CMKOR1、LGR4、LGR5、LGR6、GPR85、GPR27、GPR173、CCRL2、MAS1、MAS1L、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGX3e、MRGX4e、GPR50、GPR87、TRAR3f、TRAR4、TRAR5、PNRe、GPR57g、GPR58、EBI2、GPR160、GPRe、GPR1、GPR101、GPR135、OPN5、GPR141、GPR146、GPR148、GPR149、GPR15、GPR150、GPR152、GPR161、GPR17、GPR171、GPR18、GPR19、GPR20、GPR22、GPR25、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR55、GPR61、GPR62、GPR79h、GPR82、GPR84、GPR88、GPR92、P2RY8、GPR15、GPR64、GPR56、GPR115、GPR114、BAM、BAI2、BAI3、CELSR1、CELSR2、CELSR3、EMR1、EMR2、GPR97、GPR110、GPR111、GPR112、GPR113、GPR116、MASS1、ELTD1、GPR123、GPR124、GPR125、GPR126、GPR128、GPR144、EMR3、EMR4b、CD97、LPHN2、LPHN3、LPHN1、GPR157、GPR51、GPR156、GPRC6A、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、GPR158和GPR158L1。

在某些实施方案中，通过基因激活表达目的蛋白质的至少一个亚单位。在其它实施方案中，从所引入的核酸表达目的蛋白质的至少一个亚单位。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生细胞系的方法，其中所述方法包括在相同的培养条件下在多个平行培养中培养多个细胞系，和鉴定具有至少一种随着时间推移保持一致的性质的细胞系。

在某些实施方案中，多个平行培养包括至少50个细胞培养。在其它实施方案中，多个平行培养包括至少100个细胞培养。在其它实施方案中，多个平行培养包括至少200个细胞培养。

在某些实施方案中，本发明提供了为体内目的蛋白质或多个目的蛋白质的体外相关性的蛋白质或多种蛋白质，其中所述体外相关性预示着体内表达的相应目的蛋白质或多个目的蛋白质的功能或活性；其中所述体外相关性是在体外非生理条件下表达的具有生物活性的蛋白质或多种蛋白质；其中所述体外相关性包括对应于体内目的蛋白质或多种蛋白质的至少一种功能或药理或生理特性；并且其中至少10％的使用所述体外相关性在高通量筛选中鉴定的化合物能够具有体内治疗效应。

在某些实施方案中，体外相关性包含至少2、3、4、5或6个亚单位。在某些实施方案中，体外相关性的至少一种蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。在某些实施方案中，体外相关性包括异源多聚体。在某些实施方案中，体外相关性的至少一种蛋白质包括异源多聚体。在某些实施方案中，体外相关性的蛋白质或多种蛋白质不包含蛋白质标签。

在某些实施方案中，所述体外相关性在于不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达。在某些实施方案中，所述体外相关性在细胞系中表达而不引起细胞毒性。在某些实施方案中，所述体外相关性在不内源性表达蛋白质或多种蛋白质的细胞中表达。

在某些实施方案中，可由本发明的细胞产生蛋白质或多种蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供了表达如上文中描述的蛋白质或多种蛋白质的细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了从表达如上文中描述的蛋白质或多种蛋白质的细胞产生的细胞系。

在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定体内目的蛋白质的调节剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a)将表达如上文中描述的蛋白质或多种蛋白质的细胞与测试化合物接触；和

b)检测相比于未与测试化合物接触的细胞中的体外相关性的蛋白质或多个蛋白质的活性，与所述测试化合物接触的细胞中的体外相关性的蛋白质或多个蛋白质的活性的变化；

其中与在不存在的情况下相比较，在存在的情况下产生活性差异的化合物是体内目的蛋白质的调节剂。

在某些实施方案中，本发明提供了通过上述段落中描述的方法鉴定的调节剂。

在某些实施方案中，在上述段落的任一段落中描述的细胞是分化细胞。在某些实施方案中，在上述段落的任一段落中描述的细胞是去分化的细胞。在其它实施方案中，去分化的细胞是选自下组的干细胞：多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞。

在具体的实施方案中，本发明提供了用于产生干细胞的方法，其包括下列步骤：使分化细胞去分化成干细胞，其中分化细胞是本文中描述的细胞或由本文中描述的方法产生的细胞。在具体的实施方案中，所述干细胞选自多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生再分化的细胞的方法，其包括下列步骤：

a)使上述段落的任一段中描述的细胞或由本文中描述的方法产生的细胞去分化以产生干细胞；和

b)将干细胞再分化以产生再分化的细胞。在具体的实施方案中，干细胞选自由下列组成的组：多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞。在某些实施方案中，再分化的细胞与未经历去分化的分化细胞是不同的类型。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生非人生物体的方法，包括下列步骤：

(a)使本文中描述的分化细胞或由本文中描述的方法产生的分化细胞去分化，以产生干细胞，其中所述干细胞是胚胎干细胞或诱导的多潜能性干细胞；和

(b)使干细胞再分化以产生非人生物体。在此类方法的特定实施方案中，生物体是哺乳动物。在此类方法的其它特定实施方案中，哺乳动物是小鼠。

在其它方面，本发明提供了通过本文中描述的方法产生的再分化细胞。

在某些方面，本发明提供了由本文中描述的方法产生的非人生物体。在此类方法的某些实施方案中，生物是哺乳动物。在此类方法的具体实施方案中，哺乳动物是小鼠。

在某些实施方案中，可从如本文中描述的细胞的群体分离出内源性表达目的蛋白质的细胞。可将此类分离的细胞用于本文中公开的方法和组合物，例如筛选方法和实验对象组。

在某些方面中，本文中提供了稳定地表达包含甜味受体T1R2亚单位和甜味受体T1R3亚单位的甜味受体的细胞或细胞系，至少一个亚单位的表达因编码亚单位的核酸至宿主细胞内的引入，或已存在于宿主细胞中的编码亚单位的核酸的基因激活而产生，所述细胞或细胞系衍生自宿主细胞。任选地，还可对细胞或细胞系进行改造以产生G蛋白。

在具体的实施方案中，至少一个甜味受体亚单位从被引入宿主细胞中的编码该亚单位的核酸表达。在其它具体的实施方案中，至少一个甜味受体亚单位通过基因激活从存在于宿主细胞中的核酸表达。在其它具体的实施方案中，宿主细胞：a)是真核细胞；b)是哺乳动物细胞；c)不内源性表达甜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或d)(a)、(b)和(c)的任何组合。在其它具体的实施方案中，宿主细胞是HEK-293细胞。在其它具体的实施方案中，甜味受体a)是哺乳动物；b)是人；c)包括来自不同物种的亚单位；d)包括为一个或多个嵌合的亚单位；或e)(a)-(d)的任何组合。在其它具体的实施方案中，甜味受体具有功能。在其它具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞系在测定中具有至少0.3的Z’值。在其它具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞系在测定中具有至少0.7的Z’值。在其它具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞系在不存在选择压力的情况下在培养基中稳定地表达甜味受体。在其它具体的实施方案中，甜味T1R2受体亚单位选自由下列组成的组：

a)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的甜味受体亚单位；

b)包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的甜味受体亚单位；

c)包含由在严格条件下与SEQ ID NO：31或编码SEQ IDNO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位；和

d)包含由与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：34的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位。

在具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞的甜味受体亚单位T1R2由核酸编码，所述核酸选自由下列组成的组：

a)包含SEQ ID NO：31的核酸

b)包含编码含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸；

c)包含在严格条件下与a)或b)的核酸杂交的核苷酸序列的核酸；和

d)包含与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：34的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸。在其它具体的实施方案中，甜味受体亚单位T1R3选自：

e)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的甜味受体亚单位；

f)包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的甜味受体亚单位；

g)包含由在严格条件下与SEQ ID NO：32或编码SEQ IDNO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位；和

h)h)包含由与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位。

在其它具体的实施方案中，甜味受体T1R3亚单位由选自下组的核酸编码：

a)包含SEQ ID NO：32的核酸；

b)包含编码含有SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸；

d)包含与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核苷酸序列的核酸。

在其它具体的实施方案中，G蛋白选自由下列组成的组：

a)包含SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的G蛋白；

b)包含与SEQ ID NO：36或37或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的G蛋白；

c)包含由在严格条件下与SEQ ID NO：33或编码SEQ IDNO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的G蛋白；和

d)包含由与SEQ ID NO：33或编码SEQ ID NO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列的G蛋白。

在其它具体的实施方案中，G蛋白由选自下组的核酸编码：

a)包含SEQ ID NO：33的核酸；

b)包含编码SEQ ID NO：36或37的多肽或另一物种的对应氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；

c)包含在严格条件下与a)或b)的核酸序列杂交的核苷酸序列的核酸和；

d)包含与SEQ ID NO：33或编码SEQ ID NO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的核酸。

在某些方面，本文中提供了稳定地表达包含鲜味受体T1R1亚单位和鲜味受体T1R3亚单位的鲜味受体的细胞或细胞系，至少一个亚单位的表达因编码该亚单位的核酸至宿主细胞的引入或已存在于宿主细胞中的编码该亚单位的核酸的基因激活而产生，所述细胞或细胞系衍生自宿主细胞。任选地，还可对细胞或细胞系进行改造以产生G蛋白。

在具体的实施方案中，至少一个鲜味受体亚单位从编码被引入宿主细胞的亚单位的核酸表达。在其它具体的实施方案中，至少一个鲜味受体亚单位通过基因激活从存在于宿主细胞中的核酸表达。在其它具体的实施方案中，宿主细胞：a)是真核细胞；b)是哺乳动物细胞；c)不内源性表达鲜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或d)(a)、(b)和(c)的任何组合。在其它具体的实施方案中，宿主细胞是人HEK-293细胞。在其它具体的实施方案中，鲜味受体a)是哺乳动物的鲜味受体；b)是人的鲜味受体；c)包含来自不同物种的亚单位；d)包含为嵌合体的一个或多个亚单位；或e)(a)-(d)的任何组合。在其它具体的实施方案中，鲜味受体具有功能。在其它具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞系在测定中具有至少0.3的Z’值。在其它具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞系在测定中具有至少0.7的Z’值。在其它具体实施方案中，本文中描述的细胞或细胞系在不存在选择压力的情况下在培养基中稳定地表达鲜味受体。在其它具体的实施方案中，鲜味受体的T1R1受体亚单位选自由下列组成的组：

a)包含SEQ ID NO：42-45中的任一个的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

b)包含与SEQ ID NO：42-45中的任一个的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

c)包含由在严格条件下与SEQ ID NO：41或编码SEQ IDNO：42-45中的任一个的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；和

d)包含由与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：42-45中的任一个的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位。

在具体的实施方案中，本文中描述的细胞或细胞的鲜味受体亚单位T1R1由选自下组的核酸编码：

a)包含SEQ ID NO：41：的核酸；

b)包含编码含有SEQ ID NO：42-45中的任一个的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸；

d)包含与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：34的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸。在其它具体的实施方案中，鲜味受体亚单位T1R3选自：

e)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

f)包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

g)包含由在严格条件下与SEQ ID NO：32或编码SEQ IDNO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；和

h)包含由与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位。

在其它具体的实施方案中，鲜味受体T1R3亚单位由选自下组的核酸编码：

a)包含SEQ ID NO：32的核酸；

在其它具体的实施方案中，G蛋白选自由下列组成的组：

在其它具体的实施方案中，G蛋白由选自下组的核酸编码：

a)包含SEQ ID NO：33的核酸；

c)包含在严格条件下与a)或b)的核酸序列杂交的核苷酸序列核酸和；

d)包含与SEQ ID NO：33或编码SEQ ID NO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的核酸。

在一个实施方案中，本发明的细胞和细胞系产生具有功能且生理学相关的鲜味受体或甜味受体。因此，将它们用于鉴定和选择鲜味受体或甜味受体的调节剂。

在另一个实施方案中，本发明的细胞和细胞系在1至4周、1至9个月中或其间的任何时间中稳定地表达鲜味受体或甜味受体。

在另一个实施方案中，本发明的细胞和细胞系在1至4周、1至9个月中或其间的任何时间中以基本上相同的水平表达鲜味受体或甜味受体。

在具体的实施方案中，使用功能测定测量表达水平。

在其它实施方案中，本发明涉及使用本发明的细胞和细胞系鉴定的鲜味受体或甜味受体的调节剂，以及此类调节剂在改变产品(包括食品和药物)的味道中或在治疗其中牵涉鲜味受体或甜味受体的疾病(包括糖尿病和肥胖症)中的用途。

在某些实施方案中，本文中提供了用于产生本文中描述的细胞或细胞系(例如，稳定地表达甜味受体的细胞或细胞系)的方法，包括下列步骤：

a)将包含编码甜味受体T1R2亚单位的核酸的第一载体、包含编码甜味受体T1R3亚单位的核酸的第二载体和任选的包含编码G蛋白的核酸的第三载体引入宿主细胞；

b)将检测甜味受体T1R2亚单位的表达的第一分子信标、检测甜味受体T1R3亚单位的表达的第二分子信标和任选的检测G蛋白的表达的第三分子信标引入步骤a)中产生的宿主细胞；和

c)分离表达T1R2亚单位、T1R3亚单位和任选的G蛋白的细胞。

在某些实施方案中，本文中提供了用于产生本文中描述的细胞或细胞系(例如，稳定地表达鲜味受体的细胞或细胞系)的方法，所述方法包括下列步骤：

a)将包含编码鲜味受体T1R1亚单位的核酸的第一载体、包含编码鲜味受体T1R3亚单位的核酸的第二载体和包含编码G蛋白的核酸的第三载体引入宿主细胞；

b)将检测鲜味受体T1R1亚单位的表达的第一分子信标、检测鲜味受体T1R3亚单位的表达的第二分子信标和任选的检测G蛋白的表达的第三分子信标引入步骤a)中产生的宿主细胞；和

c)分离表达T1R1亚单位、T1R3亚单位和任选的G蛋白的细胞。

在具体的实施方案中，本文中描述的方法(例如，用于产生稳定地表达甜味受体或鲜味受体的细胞或细胞系的方法)还包括从步骤c)中分离的细胞产生细胞系的步骤。在其它具体的实施方案中，宿主细胞：

a)是真核细胞；

b)是哺乳动物细胞；

c)不内源性表达至甜味受体或鲜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d)a)、b)和c)的任何组合。

在其它实施方案中，本文中描述的方法(例如，用于产生稳定地表达甜味受体或鲜味受体的细胞或细胞系的方法)还包括下列步骤：

a)培养细胞进行选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期；

b)在这些时程中定期地测定甜味受体或鲜味受体或其亚单位的表达，在RNA或蛋白质水平上测定表达；和

c)选择细胞或细胞系，所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内基本上稳定表达甜味受体或鲜味受体或其亚单位。

在其它实施方案中，本文中描述的方法(例如，用于产生稳定地表达甜味受体或鲜味受体的细胞或细胞系的方法)还包括步骤：

c)选择细胞或细胞系，所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期段中基本上稳定表达甜味受体或鲜味受体或其亚单位。

在某些实施方案中，使用功能测定进行甜味受体的蛋白质表达水平的测量。在某些实施方案中，分离步骤利用荧光激活的细胞分类器(Beckman Coulter、Miami、FL)。

在具体的实施方案中，本文中提供了用于鉴定甜味受体功能的调节剂的方法，所述方法包括将本文中描述的稳定地表达甜味受体的至少一个细胞或细胞系与至少一种测试化合物接触以及检测甜味受体功能的变化的步骤。在具体的实施方案中，调节剂选自由下列组成的组：甜味受体抑制剂、甜味受体拮抗剂、甜味受体阻断剂、甜味受体激活剂、甜味受体激动剂或甜味受体增强剂。在其它具体的实施方案中，甜味受体是人甜味受体。在其它具体的实施方案中，测试化合物是小分子、化学部分、多肽或抗体。在其它特定化合物中，测试化合物是化合物的文库。在其它具体的实施方案中，文库是小分子文库、组合文库、肽文库或抗体文库。在具体的实施方案中，调节剂对于甜味受体的酶促修饰形式具有选择性。

在具体的实施方案中，本文中提供了用于鉴定鲜味受体功能的调节剂的方法，包括将本文中描述的稳定地表达鲜味受体的至少一个细胞或细胞系与至少一种测试化合物接触以及检测鲜味受体功能的变化的步骤。在具体的实施方案中，调节剂选自由下列组成的组：鲜味受体抑制剂、鲜味受体拮抗剂、鲜味受体阻断剂、鲜味受体激活剂、鲜味受体激动剂或鲜味受体增强剂。在其它具体的实施方案中，鲜味受体是人鲜味受体。在其它具体的实施方案中，测试化合物是小分子、化学部分、多肽或抗体。在其它特定化合物中，测试化合物是化合物的文库。在其它具体的实施方案中，文库是小分子文库、组合文库、肽文库或抗体文库。在具体的实施方案中，调节剂对于鲜味受体的酶促修饰形式具有选择性。

在具体的实施方案中，本文中提供了通过本文中描述的方法(例如，用于鉴定甜味受体功能或鲜味受体功能的调节剂的方法)鉴定的调节剂。

在具体的实施方案中，本文中提供了本文中描述的细胞或细胞系(例如，稳定地表达甜味受体或鲜味受体的细胞或细胞系)，所述细胞或细胞系由本文中描述的用于产此类细胞或细胞系的方法产生。在此类方法的具体实施方案中，此类方法的细胞(例如，稳定地表达甜味受体或鲜味受体的细胞)具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质，并且此类方法包括下列步骤：

(a)提供多个表达编码味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)和任选的G蛋白的mRNA的细胞；

(b)将细胞单个地分散至单个培养器皿中，从而提供多个分离的细胞培养物；

(c)使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于对于每一个分离的细胞培养物而言条件基本相同，在该培养过程中将每一个细胞培养物中每孔的细胞数目标准化，并且其中分离的培养物按照相同的时间表进行传代；

(d)测定分离的细胞培养物的味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)或产生该受体的细胞的至少一种所需特征至少2次；和

(e)鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。在某些方面，本文中提供了产生味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)并且具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质的细胞或细胞系，所述细胞或细胞系由这样的方法产生。

在某些实施方案中，可从一群如本文中描述的细胞分离内源性表达甜味受体、鲜味受体和/或G蛋白的细胞。可将此类分离的细胞与本文中描述的方法和组合物(例如筛选方法和组合物的实验对象组)一起使用。

根据本发明的一个方面，对细胞或细胞系进行改造以稳定地表达苦味受体。在某些实施方案中，从引入细胞或细胞系的核酸表达苦味受体。在一些其它实施方案中，通过改造基因激活从内源核酸表达苦味受体。在某些实施方案中，细胞或细胞系稳定地表达至少一种其它苦味受体。在某些实施方案中，内源性表达至少一种其它苦味受体。在一些其它实施方案中，从引入细胞或细胞系的核酸表达至少一种其它苦味受体。在一些其它实施方案中，从引入细胞或细胞系的分离的核酸表达苦味受体和至少一种其它苦味受体。在一些其它实施方案中，苦味受体和至少一种其它苦味受体都从引入细胞或细胞系的单个核酸表达。

在某些实施方案中，细胞或细胞系稳定地表达内源G蛋白。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系稳定地表达异源G蛋白。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系稳定地表达内源G蛋白和异源G蛋白。在某些实施方案中，所述G蛋白是包含3个不同亚单位的异源多聚体G蛋白。在某些实施方案中，从引入细胞或细胞系的核酸表达异源多聚体G蛋白的至少一个亚单位。在一些其它实施方案中，从引入细胞或细胞系的不同核酸至少2个不同的亚单位。在一些其它实施方案中，从引入细胞或细胞系的相同核酸表达至少2个不同的亚单位。在一些其它实施方案中，3个不同的亚单位各自是从引入细胞或细胞系的相同核酸表达的。

在某些实施方案中，细胞系中的细胞是真核细胞。在一些其它实施方案中，细胞系中的细胞是哺乳动物细胞。在一些其它实施方案中，细胞系中的细胞不表达内源性苦味受体。在一些其它实施方案中，细胞系中的细胞是不表达内源性苦味受体的细胞类型的真核细胞。在一些其它实施方案中，细胞系中的细胞是不表达内源性苦味受体的细胞类型的哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞系中的细胞是人胚肾293T细胞。

在某些实施方案中，苦味受体是哺乳动物。在一些其它实施方案中，苦味受体是人。在一些其它实施方案中，苦味受体在其氨基端或羧基端不具有多肽标签。在一些其它实施方案中，苦味受体是在其氨基端或羧基端不具有多肽标签的哺乳动物苦味受体。在一些其它实施方案中，苦味受体是在其氨基端或羧基端不具有多肽标签的人苦味受体。

在某些实施方案中，细胞或细胞系在选自下组的测定中产生至少0.45的Z’值：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在选自下组的测定中产生至少0.5的Z’值：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在选自下组的测定中产生至少0.6的Z’值：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。

在某些实施方案中，细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达苦味受体至少2周。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达苦味受体至少4周。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达苦味受体至少6周。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达苦味受体至少3个月。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达苦味受体至少6个月。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达苦味受体至少9个月。

在某些实施方案中，苦味受体包含SEQ ID NOS：77-101中的任一个的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含与SEQ IDNOS：77-101中的任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸在严格条件下与包含SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸编码的氨基酸序列。

在某些实施方案中，苦味受体包含由SEQ ID NOS：51-75中的任一个的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由与SEQ ID NOS：51-75中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由核酸的序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在严格条件下与包含SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸的序列编码的氨基酸序列。

在某些实施方案中，苦味受体是功能性苦味受体。在某些实施方案中，细胞或细胞系当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。在某些实施方案中，异丙肾上腺素在利用细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。在某些实施方案中，细胞或细胞系具有大于1的信噪比。

根据本发明的另一个方面，提供了经改造以稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系的集合。在某些实施方案中，集合包括2个或更多个细胞或细胞系，每一个细胞或细胞系稳定地表达不同的苦味受体或其等位基因变体。在某些实施方案中，集合额外地包括经改造以稳定地表达具有已知配体的苦味受体的细胞或细胞系。在某些实施方案中，等位基因变体是单核苷酸多态性(SNP)。在一些其它实施方案中，每一个细胞或细胞系当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。在某些实施方案中，异丙肾上腺素在利用各个细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

在某些实施方案中，使细胞或细胞系匹配以共享相同的生理特性，从而允许平行加工。在某些实施方案中，生理特性是生长速率。在一些其它实施方案中，生理特性是与组织培养表面的附着。在一些其它实施方案中，生理特性是Z′因子。在一些其它实施方案中，生理特性是苦味受体的表达水平。

在本发明的一些其它实施方案中，集合包括2个或更多个细胞或细胞系，每一个细胞或细胞系稳定地表达相同的苦味受体或其等位基因变体。在某些实施方案中，集体额外地包含经改造以稳定地表达具有已知配体的苦味受体的细胞或细胞系。在某些实施方案中，等位基因变体是SNP。在一些其它实施方案中，每一个细胞或细胞系当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。在某些实施方案中，异丙肾上腺素在利用每一个细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

在某些实施方案中，使细胞或细胞系匹配以共享所相同生理特性，从而允许平行加工。在某些实施方案中，生理特性是生长速率。在一些其它实施方案中，生理特性是与组织培养表面的附着。在一些其它实施方案中，生理特性是Z′因子。在一些其它实施方案中，生理特性是苦味受体的表达水平。

根据本发明的另一个方面，提供了产生稳定地表达苦味受体的细胞的方法。该方法包括：a)将编码苦味受体的核酸引入多个细胞；b)将检测苦味受体的表达的分子信标引入步骤(a)中提供的多个细胞；和c)分离表达苦味受体的细胞。在某些实施方案中，方法还包括从步骤(c)中分离的细胞产生细胞系的步骤。在某些实施方案中，产生的细胞系在不具有任何抗生素选择的培养基中稳定地表达苦味受体至少2周。在一些其它实施方案中，产生的细胞系在无任何抗生素选择的培养基中稳定地表达苦味受体至少4周。在一些其它实施方案中，产生的细胞系在无任何抗生素选择的培养基中稳定地表达苦味受体至少6周。在一些其它实施方案中，产生的细胞系在无任何抗生素选择的培养基中稳定地表达苦味受体至少3个月。在一些其它实施方案中，产生的细胞系在无任何抗生素选择的培养基中稳定地表达苦味受体至少6个月。在一些其它实施方案中，产生的细胞系在无任何抗生素选择的培养基中稳定地表达苦味受体至少9个月。

在某些实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞是真核细胞。在一些其它实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞是哺乳动物细胞。在一些其它实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞不表达内源性苦味受体。在一些其它实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞是不表达内源性苦味受体的细胞类型的真核细胞。在一些其它实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞是不表达内源性苦味受体的细胞类型的哺乳动物细胞。在某些实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞是人胚肾293T细胞。

在某些实施方案中，苦味受体是哺乳动物苦味受体。在一些其它实施方案中，苦味受体是人苦味受体。在一些其它实施方案中，苦味受体在其氨基端或羧基端不具有多肽标签。在一些其它实施方案中，苦味受体是在其氨基端或羧基端不具有多肽标签的哺乳动物苦味受体。在一些其它实施方案中，苦味受体是在其氨基端或羧基端不具有多肽标签的人苦味受体。

在某些实施方案中，苦味受体包含SEQ ID NOS：77-101中的任一个的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含与SEQ IDNOS：77-101中的任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由在严格条件下与包含SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由作为SEQID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸编码的氨基酸序列。

在某些实施方案中，苦味受体包含由SEQ ID NOS：51-75中的任一个的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由与SEQ ID NOS：51-75中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由在严格条件下与包含SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交的核酸的序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸的序列编码的氨基酸序列。

在某些实施方案中，苦味受体是功能性苦味受体。在某些实施方案中，步骤(c)中分离的细胞当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。在某些实施方案中，异丙肾上腺素在利用所述细胞进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

在某些实施方案中，所述分离利用荧光激活的细胞分选器。

在某些实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞稳定地表达内源G蛋白。在一些其它实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞稳定地表达异源G蛋白。在本发明的一些其它实施方案中，用于产生稳定地表达苦味受体的细胞的细胞表达稳定地表达内源G蛋白和异源G蛋白。

在某些实施方案中，产生表达苦味受体的细胞系的方法还包括将编码G蛋白的核酸引入细胞。在某些实施方案中，在引入编码苦味受体的核酸之前将编码G蛋白的核酸引入所述细胞。在一些其它实施方案中，在引入编码苦味受体的核酸之后将编码G蛋白的核酸引入所述细胞。在一些其它实施方案中，在引入编码苦味受体的核酸的同时引入编码G蛋白的核酸。在某些实施方案中，编码苦味受体的核酸和编码G蛋白的核酸在单个载体上。在某些实施方案中，所述方法还包括在引入检测苦味受体的表达的分子信标之前将检测G蛋白的表达的分子信标引入细胞。在一些其它实施方案中，所述方法还包括在引入检测苦味受体的表达的分子信标之后将检测G蛋白的表达的分子信标引入细胞。在一些其它实施方案中，所述方法还包括将检测苦味受体的表达的分子信标和检测G蛋白的表达的分子信标同时引入细胞。在某些实施方案中，检测苦味受体的表达的分子信标和检测G蛋白的表达的分子信标是不同的分子信标。在一些其它实施方案中，检测苦味受体的表达的分子信标和检测G蛋白的表达的分子信标是相同的分子信标。在某些实施方案中，所述方法还包括在分离表达苦味受体的细胞之前分离表达G蛋白的细胞，从而分离表达苦味受体和G蛋白的细胞。在一些其它实施方案中，所述方法还包括在分离表达苦味受体的细胞之后分离表达G蛋白的细胞，从而分离表达苦味受体和G蛋白的细胞。在一些其它实施方案中，所述方法还包括同时分离表达苦味受体的细胞和表达G蛋白的细胞，从而分离表达苦味受体和G蛋白的细胞。

根据本发明的另一个方面，鉴定苦味受体功能的调节剂的方法包括：a)将稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系与测试化合物接触；和b)检测苦味受体的功能的变化。在某些实施方案中，检测利用测量细胞内游离钙的测定。在某些实施方案中，使用一种或多种钙敏感性荧光染料、荧光显微镜和任选的荧光板读取器测量细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。在一些其它实施方案中，使用一种或多种钙敏感性荧光染料通过实时成像监控细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。

在某些实施方案中，细胞或细胞系中的细胞是真核细胞。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系中的细胞是哺乳动物细胞。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系中的细胞不表达内源性苦味受体。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系中的细胞是不表达内源性苦味受体的细胞类型的真核细胞。在一些其它实施方案中，细胞或细胞系中的细胞是不表达内源性苦味受体的细胞类型的哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞系中的细胞是人胚肾293T细胞。

在某些实施方案中，苦味受体包括SEQ ID NOS：77-101中的任一个的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含与SEQ IDNOS：77-101中的任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由在严格条件下与含有SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由作为SEQID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸编码的氨基酸序列。

在某些实施方案中，苦味受体包含由SEQ ID NOS：51-75中的任一个的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由与SEQ ID NOS：51-75中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由在严格条件下与含有SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交的核酸的序列编码的氨基酸序列。在一些其它实施方案中，苦味受体包含由作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸的序列编码的氨基酸序列。

在某些实施方案中，细胞或细胞系细胞内游离钙浓度发生变化。在某些实施方案中，异丙肾上腺素在利用细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有1nM至20nM的EC50值。

在某些实施方案中，测试化合物是苦味受体抑制剂。在某些实施方案中，所述方法还包括在将细胞或细胞系与测试化合物接触之前将细胞或细胞系与苦味受体的已知激动剂接触。在一些其它实施方案中，所述方法还包括在将细胞或细胞系与测试化合物接触的步骤的同时将细胞或细胞系与苦味受体的已知激动剂接触。

在某些实施方案中，测试化合物是苦味受体激动剂。在某些实施方案中，所述方法还包括在将细胞或细胞系与测试化合物接触之前将细胞或细胞系与苦味受体的已知抑制剂接触。在一些其它实施方案中，所述方法还包括在与将细胞或细胞系与测试化合物接触的步骤的同时将细胞或细胞系与苦味受体的已知抑制剂接触。

在某些实施方案中，测试化合物是小分子。在某些实施方案中，测试化合物是化学部分。在某些实施方案中，测试化合物是多肽。在某些实施方案中，测试化合物是抗体。在某些实施方案中，测试化合物是食物提取物。

在本发明的另外的方面中，鉴定苦味受体功能的调节剂的方法包括a)将细胞系的集合与不同测试化合物的文库接触，其中所述细胞系的集合包括2个或更多个细胞系，每一个细胞系稳定地表达相同的苦味受体或其等位基因变体，并且其中将每一个细胞系与文库中的一个或多种测试化合物接触；和b)检测由每一个细胞系稳定地表达的苦味受体或其等位基因变体的功能的变化。在某些实施方案中，所述检测利用测量细胞内游离钙的测定。在某些实施方案中，使用一种或多种钙敏感性荧光染料、荧光显微镜和任选的荧光板读取器测量细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。在一些其它实施方案中，使用一种或多种钙敏感性荧光染料通过实时成像监控细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。

在某些实施方案中，文库是小分子文库。在某些实施方案中，文库是组合文库。在某些实施方案中，文库是肽文库。在某些实施方案中，文库是抗体文库。

在某些实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)之前或与之同时将细胞系的集合与已知的苦味受体激动剂接触。在一些其它实施方案中，所述方法还包括在步骤(a)之前或与之同时将细胞系的集合与已知的苦味受体抑制剂接触。

根据本发明的另一个方面，鉴定苦味受体功能的调节剂的方法包括：a)将细胞系的集合与测试化合物接触，其中细胞系的集合包括2个或更多个细胞系，每一个细胞系稳定地表达不同的苦味受体或其等位基因变体；和b)检测由每一个细胞系稳定地表达的苦味受体的功能的变化。在某些实施方案中，所述检测利用测量细胞内游离钙的测定。在某些实施方案中，使用一种或多种钙敏感性荧光染料、荧光显微镜和任选的荧光板读取器测量细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。在一些其它实施方案中，使用一种或多种钙敏感性荧光染料通过实时成像监控细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。

在某些实施方案中，在某些实施方案中，测试化合物是小分子。在某些实施方案中，测试化合物是化学部分。在某些实施方案中，测试化合物是多肽。在某些实施方案中，测试化合物是抗体。在某些实施方案中，测试化合物是食物提取物。

根据本发明的另一个方面，通过方法产生改造成随着时间推移以一致的水平稳定地表达苦味受体的细胞，所述方法包括下列步骤：a)提供多个表达编码苦味受体的mRNA的细胞；b)将细胞单个地分散至单个培养器皿中，从而提供多个分离的细胞培养物；c)使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养所述细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于对于每一个分离的细胞培养物而言条件基本相同，在该培养过程中将每个分离的细胞培养物的细胞数目标准化，并且其中将分离的培养物按照相同的方案传代；d)测定分离的细胞培养物以测量苦味受体的表达至少2次；和e)鉴定在两个测定中都以一致的水平表达苦味受体的分离的细胞培养物，从而获得所述细胞。

在某些实施方案中，可从如本文中描述的细胞群体分离内源性表达苦味受体的细胞。可将此类分离的细胞与本文中描述的方法和组合物(例如筛选方法和实验对象组)一起使用。

在某些实施方案中，本发明提供了用于确定调节蛋白质复合物的化合物的化学空间的方法，其中所述方法包括：

a)将多个化学上不同的化合物分别与已进行改造以表达蛋白质复合物的细胞接触；

b)测定化合物对蛋白质复合物的活性的效应；

c)使步骤b)中获得的效应与化合物的结构共性相关。

在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定调节蛋白质复合物的化合物之间的结构共性的方法，其中所述方法包括：

(a)按照上述方法的步骤a)和b)鉴定调节蛋白质复合物的化合物；

(b)使用各化合物的分子代表和各化合物的活性谱构建每一种所述化合物的结构-活性关系(SAR)模型，其中每一种所述化合物的所述分子代表包括各化合物的结构描述符(descriptor)，其中每一个所述活性谱包括各化合物对蛋白质复合物的生物活性的效应的定量测量，并且其中每一种所述SAR模型将各化合物的结构特征与各化合物的活性谱相关；

(c)基于各化合物的所述SAR模型，鉴定与各化合物的活性谱相关的每一种所述化合物的一个或多个结构特征；和

(d)从步骤(c)中鉴定的每一种所述化合物的一个或多个结构特征中鉴定所述化合物所共有的至少一种结构特征。

在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定调节蛋白质复合物的化合物中的结构共性的方法，其中所述方法包括：

(a)分别将多种候选化合物与已进行改造以表达所述蛋白质复合物的细胞接触；

(b)测定所述多种化合物的每一种候选化合物对所述蛋白质复合物的活性的效应，以提供每一种所述候选化合物的活性谱，其中每一种所述活性谱包括各候选化合物对蛋白质复合物的生物活性的效应的定量测量；

(c)基于所述候选化合物的活性谱，鉴定调节所述蛋白质复合物的活性的一种或多种候选化合物；

(d)使用各候选化合物的分子代表和各候选化合物的活性谱构建步骤(c)中鉴定的每一种所述一种或多种候选化合物的结构-活性关系(SAR)模型，其中每一种所述一种或多种化合物的所述分子代表包括各候选化合物的结构描述符，并且其中每一种所述SAR模型将各候选化合物的结构特征与各候选化合物的活性谱相关；

(e)基于各候选化合物的所述SAR模型，鉴定每一种所述一种或多种候选化合物的与各候选化合物的活性谱相关的一个或多个结构特征；和

(f)从步骤(e)中鉴定的每一种所述各候选化合物的一个或多个结构特征中鉴定所述一种或多种候选化合物所共有的至少一种结构特征。

在更具体的实施方案中，每一种所述化合物的所述分子代表还包括各化合物的物理化学数据、各化合物的空间数据、各化合物的拓扑学数据或其组合。

在更具体的实施方案中，蛋白质复合物是苦味受体。

在更具体的实施方案中，所述构建每一种所述化合物的所述SAR模型包括应用回归方法来确定各化合物的所述分子代表与各化合物的所述活性谱之间的关系。

在更具体的实施方案中，每一种所述化合物的所述SAR模型独立地是受体依赖性自由能力场QSAR(FEFF-QSAR)模型、不依赖于受体的三维QSAR(3D-QSAR)或受体依赖性或不依赖于受体四维QSAR(4D-QSAR)。

在某些方面，本文中提供了可用于本文中描述的方法的试剂盒。具体地，本文中提供了包括一种或多种稳定地表达一种或多种复杂靶标的细胞或细胞系的试剂盒。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包括本文中描述的一种或多种信号探针。在具体的实施方案中，试剂盒可包括一个或多个编码一种或多种复杂靶标的载体。在具体的实施方案中，试剂盒包括一种或多种用于基于细胞的功能测定(例如，钙流测定、膜电位测定)的染料以筛选并且选择稳定地表达一种或多种复杂靶标的细胞。

在某些方面，本文中提供了包括一个或多个容器的试剂盒，所述容器填充有本文中描述的一种或多种试剂和/或细胞例如本文中提供的一种或多种细胞、载体和/或信号探针。任选地此类容器可以附带包括试剂盒中的组分的使用说明书的简介。

附图说明

图1-3各自是可根据本发明使用的计算机程序模块的示意图。

图4包括4个图表，每一个图表显示数种化合物的剂量反应曲线，针对表达NaV α、β1和β2亚单位的4种不同的NaV 1.7细胞系测试每一种所述化合物。

图5是显示表达NaV α、β1和β2亚单位的不同NaV 1.7细胞系对不同剂量的由框分组的不同化合物的应答的表。

图6是表示在基于表达鲜味受体(RNA)的细胞的测定后获得的数据的条形图，在所述测定中用12.5mM果糖(甜味激动剂)或25mMMSG(鲜味激动剂)处理表达鲜味受体的细胞并且在不同条件下进行培养，在该图中举例说明了来自在此类条件的3个条件(1、2和“最终”)中测试的相同细胞的等分试样的测定结果。

图7是表达鲜味受体T1R1和T1R3亚单位和Ga15蛋白的本发明的细胞系的定量基因表达分析的图示。从细胞系提取总RNA以用于使用T1R1、T1R3及Ga15的基因特异性引物和探针进行的基因表达的TaqMan分析。显示了相对于对照细胞的相对表达水平。

图8显示分析在培养9个月后细胞系中鲜味受体表达的稳定性的代表性凝胶。将单终点RT-PCR(Single endpoint RT-PCR)用于估量表达鲜味受体的细胞系的1和9个月的培养物中T1R1、T1R3和Ga15基因的表达。还进行利用或不用逆转录酶(″+RT″或″-RT″)以及使用对照细胞(″对照″)或只使用水(″无″)的样品的应答，并且作为阳性对照，使用质粒编码的新霉素抗性基因(″neo″)的表达。箭头标示其中预期为阳性结果的应答。由于反应的数目很多，因此将来自不同凝胶的数据以数字并置排列。T1R3的数据显示于其自已的图表中，因为这些反应需要独立的PCR条件。

图9是在进行基于表达鲜味受体的细胞的测定后产生的一系列代表性反应迹线。使用单独的缓冲液作为对照(加框的孔)和在剩余的孔中使用33mM的鲜味受体激动剂MSG，进行基于表达鲜味受体的细胞的测定。细胞系产生大于0.8的Z’值。

图10是表示在基于表达鲜味受体的细胞的测定中使用鲜味受体激动剂MSG进行剂量反应曲线实验后获得的数据的线形图。将表达鲜味受体的细胞系和对照细胞系的反应作为激动剂浓度的函数作图。

图11是在于不同浓度的MSG(1mM-100mM，从右至左)和增强剂IMP(0mM-30mM、从下至上)存在的情况下进行基于表达鲜味受体的细胞的测定后产生的一系列代表性反应迹线。

图12是在于不同浓度的环己基氨基磺酸钠存在的情况下进行基于表达鲜味受体的细胞的测定后产生的一系列代表性反应迹线。

图13是显示在一系列浓度的苦味提取物(x-轴)存在的情况下天然(圆圈)和标记的(方块)人苦味受体的不同功能活性(y-轴上的“测定反应”)的图。

图14是显示表达人苦味受体的细胞系对于功能受体应答显示高至89％阳性比率的表。每一种细胞表示96孔板中的孔。黑色框表示无细胞存在/存在的细胞太少。白色框表示存在的细胞，但没有激动剂信号高于该孔的本底信号。灰色框表示存在的细胞，其中激动剂信号高于该孔的本底信号。

图15是(1)按照本发明的方法分离的表达苦味受体的细胞系(上图)和(2)进行药物选择的细胞(下图)中苦味受体对苦味激动剂的应答的实时成像的一系列荧光显微照片。

图16是显示25种人苦味受体-Ga15细胞系中对异丙肾上腺素的相对应答的剂量反应曲线的图。

图17是显示广泛调节的、适度调节的如在瞬时转染测定中鉴定的选择性苦味受体的表。

图18是显示不同化合物在25种不同人苦味受体上的活性的表，所述活性是在基于功能细胞的测定中测量的并且表示为高于受体的基线活性的百分比活性。

图19是显示使用天然细胞系(上行)和标记的细胞系(下行)的不同苦味受体分配的表。

图20是表示使用12.5mM果糖(甜味激动剂)或25mM MSG(鲜味激动剂)作为测试化合物进行的基于表达甜味受体(RNA)的细胞的测定的条形图。在不同的条件下生长培养物，在该图中举例说明了来自在这些条件的3个条件(1、2和“最终”)中测试的相同细胞的等分试样的测定结果。将测定反应标准化为对照细胞的值。

图21是表达甜味受体人T1R2和T1R3亚单位(分别为SEQ IDNOS：31和32)和小鼠Ga15蛋白(SEQ ID NO：33)的本发明的细胞系的定量基因表达分析的图示。从细胞系提取总RNA并且使用人T1R2和T1R3及小鼠Ga15的基因特异性引物和探针通过TaqMan对总RNA进行基因表达分析。显示了高于对照细胞的相对表达水平。

图22显示分析培养9个月后本发明的细胞系中甜味受体表达的稳定性的代表性凝胶。使用单终点RT-PCR在表达甜味受体的细胞系的1和9个月的培养物中估量人T1R2、人T1R3和小鼠Ga15基因表达。还进行利用或不用逆转录酶(″+RT″或″-RT″)以及使用对照细胞(″对照″)或只使用水(″无″)样品的应答，并且作为阳性对照，使用质粒编码的新霉素抗性基因(″neo″)的表达。箭头标示其中预期为阳性结果的泳道。由于反应数目很多，将来自不同凝胶的数据数字化地并置在一起。人T1R3亚单位的数据显示于其自已的图表中，因为这些反应需要独立的PCR条件。

图23是在交替孔中以75mM的甜味受体的已知激动剂果糖、在其它孔中以单独用作对照的缓冲液进行基于表达甜味受体的细胞的测定(使用本发明的细胞)后产生的一系列代表性反应迹线。细胞系产生大于0.8的Z’值。

图24(A-C)是表示在基于表达甜味受体的细胞的测定(使用本发明的细胞)中使用甜味受体激动剂进行的不同剂量反应实验中获得的数据的一系列线形图。(A)将表达甜味受体的细胞系对天然热量性甜味料(caloric sweetener)的应答作为激动剂浓度的函数作图。(B)基于表达甜味受体的细胞的测定中普通人造甜味料的剂量反应曲线。(C)基于表达甜味受体的细胞的测定中天然高强度甜味料的剂量反应曲线。

图25是在使用本发明的细胞进行基于表达甜味受体的细胞的测定后产生的一系列代表性反应迹线。与使用大多数激动剂所观察到的典型钟形GPCR反应相反，蜜叶糖激动剂在钙流FDSS测定中显示延迟的反应。

图26(A-B)描绘了T1R2的基因组基因座。图26A描绘了T1R2基因座在染色体1内的位置。图26B描绘了T1R2基因的一个可能的内含子-外显子编码结构。从Univresity of California(Santa Cruz)的基因组浏览器获得信息。对应于T1R2的外显子和内含子在数字上以5′至3′方向显示。外显子编号以黑色显示，内含子编号以灰色显示。从Univresity of California(Santa Cruz)的基因浏览器获得信息。

图27(A-B)描绘了T1R3的基因组基因座。图27A描述了T1R3基因座在染色体1内的位置。从Univresity of California(Santa Cruz)的基因组浏览器获得信息。图27B描绘了T1R3基因的一个可能的内含子-外显子编码结构。相应T1R3的外显子和内含子在数字上以5′至3′方向显示。外显子编号以黑色显示，内含子编号以灰色显示。示出了标度和染色体位置。从Univresity of California(Santa Cruz)的基因浏览器获得信息。

图28(A-B)描绘了与本底相比较的本发明的细胞对果糖的添加(至15mM的终浓度)的基于功能性细胞的应答的代表性迹线。与对照细胞(灰色迹线)相比较，测试从单个分离的细胞培养的细胞(黑色迹线)。所述细胞显示更高的对果糖的应答，如通过从测试和对照细胞样品中扣除对照反应或本底所显示。基于细胞的测定被设计成使用荧光钙信号传导染料报告钙流。将荧光测定反应沿Y-轴作用图，沿X-轴标示时间。箭头指示加入果糖时的时间点。图28A描绘了与对照相比较来自从单个HuTu细胞培养的细胞的迹线。图28B描绘了与对照相比较来自从单个H716细胞培养的细胞的迹线。图28C描绘了与对照相比较来自从单个293T细胞培养的细胞的迹线。

图29(A-B)描绘了与本底相比较，表达人气味受体的细胞对新洋茉莉醛(Helional)和对叔丁基苯丙醛(Bourgeonal)的基于功能性细胞的应答的代表性迹线。图29A描绘了与作为对照的DMSO媒介物本底信号相比较，本文中描述的表达人气味受体OR3A1的细胞系对新洋茉莉醛(至4.5mM的终浓度)的基于功能性细胞的应答的代表性迹线。将测试(黑色)和对照(灰色)迹线重叠。所述细胞显示高于本底的对新洋茉莉醛的应答。基于细胞的测定被设计成使用荧光钙信号传导染料报告钙流。将荧光测定反应沿Y-轴作图，沿X-轴标示时间。箭头标示加入新洋茉莉醛或DMSO的时间点。

图29B描绘了与作为对照的DMSO媒介物本底信号相比较，本文中描述的表达人气味受体OR1D2的细胞系对对叔丁基苯丙醛(至0.3mM的终浓度)的基于功能性细胞的应答的代表性迹线。将测试(黑色)和对照(灰色)迹线重叠。所述细胞显示高于本底的对对叔丁基苯丙醛的应答。基于细胞的测定被设计成使用荧光钙信号传导染料报告钙流。将荧光测定反应沿Y-轴作图，沿X-轴标示时间。箭头标示加入对叔丁基苯丙醛或DMSO的时间点。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中所使用的全部技术和科学术语具有与由本发明属于的领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。尽管下面描述了示例性方法和材料，但是与本文中描述的相似或等同的方法和材料也可用于实践或测试本发明。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。

本文提及的所有出版物和其它参考文献通过引用整体并入本文。尽管本文引用了许多文件，但这种引用并不构成这些文件中的任一篇形成本领域的普通一般知识的部分的承认。

本说明书和权利要求自始至终，单词“包括”或变体例如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。材料、方法和例子仅是示例性的并且不意欲是限制性的。

为了可更容易地理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义示于整个详细说明中。

术语“稳定的”或“稳定表达的”意欲使本发明的细胞和细胞系与瞬时表达蛋白质的细胞区分，如术语“稳定表达”和“瞬时表达”可以由本领域普通技术人员所理解。如本文中所使用的，“不在相同类型的细胞中表达”包括不在相同类型的任何其它细胞中，或至少99％的相同类型的细胞中，或至少98％的相同类型的细胞中，或至少97％的相同类型的细胞中，或至少96％的相同类型的细胞中，或至少95％的相同类型的细胞中，或至少94％的相同类型的细胞中，或至少93％的相同类型的细胞中，或至少92％的相同类型的细胞中，或至少91％的相同类型的细胞中，或至少90％的相同类型的细胞中，或至少85％的相同类型的细胞中，或至少80％的相同类型的细胞中，或至少75％的相同类型的细胞中，或至少70％的相同类型的细胞中，或至少60％的相同类型的细胞中，或至少50％的相同类型的细胞中表达。

如本文中所使用的，目的“功能”RNA或蛋白质是在基于细胞的测定中具有大于1∶1的信噪比的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于2的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于3的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于4的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于5的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于10的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于15的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于20的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于30的信噪比。在某些实施方案中，目的“功能”RNA或蛋白质具有大于40的信噪比。在某些实施方案中，信噪比改变不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在某些实施方案中，在实验之间信噪比改变不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在某些实施方案中，在实验之间信噪比改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在某些实施方案中，在实验的2至20个不同重复之间信噪比改变不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在某些实施方案中，在实验的2至20个不同重复之间信噪比改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在某些实施方案中，对于从1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至40、40至50、50至60、60至70或超过70天(其中细胞处于连续培养中)进行测试的细胞而言，信噪比改变不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在某些实施方案中，对于从1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至30、30至40、40至50、50至60、60至70或超过70天(其中细胞处于连续培养中)进行测试的细胞而言，信噪比改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在某些实施方案中，功能性目的蛋白质或RNA具有天然存在或内源性表达的蛋白质或RNA的一种或多种生物活性。

术语“细胞系”或“克隆细胞系”指其为单一起源细胞的后代的细胞群体。如本文所使用的，细胞系在体外在细胞培养中维持，并且可以以等分试样冷冻来建立克隆细胞库。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”描述用于使一种或多种核酸探针与核酸样品杂交且洗掉未与样品中的靶核酸特异性结合的探针的温度和盐条件。严格条件是本领域普通技术人员已知的，并且可以在例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中发现。水性和非水性的方法在方案中描述并且任一种可以被使用。严格杂交条件的一个例子是在6X SSC中在约45℃下杂交，随后在0.2X SSC、0.1％SDS中在60℃下的至少一次洗涤。严格杂交条件的另一个例子是在6X SSC中在约45℃下杂交，随后在0.2X SSC、0.10％SDS中在65℃下的至少一次洗涤。严格杂交条件还包括在0.5M磷酸钠、7％SDS中在65℃下杂交，随后在0.2X SSC、1％SDS下在65℃下的至少一次洗涤。

与氨基酸和/或核酸序列相关的短语“等同百分比”或“同一性百分比”指在至少2个不同序列之间的相似性。同一性百分比可以通过标准比对算法进行测定，例如，由Altshul等人描述的Basic LocalAlignment Tool(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.，215：403-410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.，48：444-453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.，4：11-17)。一组参数可以是具有缺口罚分12、缺口延伸罚分4和移码缺口罚分5的Blosum 62评分矩阵。2个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers和W.Miller的算法((1989)CABIOS，4：11-17)进行测定，所述算法已并入ALIGN程序(版本2.0)内，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。同一性百分比通常通过比较相似长度的序列进行计算。

蛋白质分析软件使相似氨基酸序列相匹配，其中使用对各种置换、缺失或其它修饰(包括保守氨基酸置换)指定的相似性量度。例如，GCG Wisconsin Package(Accelrys，Inc.)包含诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以与缺省参数一起用于测定紧密相关的多肽之间(例如来自不同物种的同源多肽)或野生型蛋白质及其突变蛋白质之间的序列同一性。参见例如，GCG版本6.1。多肽序列也可以使用FASTA进行比较，使用缺省或推荐参数。GCG版本6.1中的程序FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。

就同一性比较的多肽序列的长度一般将是至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，一般至少约28个残基，优选超过约35个残基。就同一性比较的DNA序列的长度一般将是至少约48个核酸残基，通常至少约60个核酸残基，更通常至少约72个核酸残基，一般至少约84个核酸残基，优选超过约105个核酸残基。

与氨基酸或核苷酸序列相关的短语“大体上如所展示的”、“大体上同一的”或“大体上同源的”意指相关氨基酸或核苷酸序列与比较序列相同或与其具有不显著的差异(例如，保守氨基酸置换或编码此类置换的核酸)。无显著差异包括少量的氨基酸变化，例如指定区域的50个氨基酸序列或编码此类序列的核酸中的1或2个置换。

调节剂包括改变目的蛋白质例如味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体)的活性的任何物质或化合物。调节剂可以是激动剂(增强剂或激活剂)或拮抗剂(抑制剂或阻断剂)，包括部分激动剂或拮抗剂、选择性激动剂或拮抗剂以及反激动剂，并且还可以是变构调节剂。即使物质或化合物的调节活性在不同条件或浓度下或就不同形式的目的蛋白质例如味觉受体(例如苦味受体、鲜味受体或甜味受体)而言改变，它也是调节剂。在其它方面，调节剂可改变另一种调节剂影响目的蛋白质例如味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体)的功能的能力。在具体的实施方案中，调节剂可正面或负面地改变味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体的结构、构象、生物化学或生物物理性质或功能性。

术语″增强剂″、″激动剂″或″激活剂″是增加目的蛋白质例如味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体)的一种或多种活性的化合物或物质。在具体的实施方案中，在味觉受体的语境中的术语″增强剂″、″激动剂″或″激活剂″是指增加与味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体)相关的下游信号传导反应的化合物或物质。在具体的实施方案中，增加味觉受体活性可导致细胞内分子的量或分布或作为苦味受体的细胞内信号传导途径的部分的酶的活性的变化。细胞内分子的实例包括但不限于游离钙、环磷酸腺苷(cAMP)、单磷酸肌醇、二磷酸肌醇或三磷酸肌醇。酶的实例包括但不限于腺苷酸环化酶、磷脂酶C、G蛋白偶联受体激酶。

术语″抑制剂″、″拮抗剂″或″阻断剂″是指降低或阻断目的蛋白质例如味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体)的一种或多种活性的化合物或物质。在具体的实施方案中，在味觉受体的语境中的术语″抑制剂″、″拮抗剂″或″阻断剂″是指减弱与味觉受体(例如，苦味受体、鲜味受体或甜味受体)相关的下游信号传导反应的化合物或物质。在具体的实施方案中，降低味觉受体活性可导致细胞内分子的量或分布的变化或作为苦味受体的细胞内信号传导途径的部分的酶的活性的变化。细胞内分子的实例包括但不限于游离钙、环磷酸腺苷(cAMP)、单磷酸肌醇、二磷酸肌醇或三磷酸肌醇。酶的实例包括但不限于腺苷酸环化酶、磷脂酶C、G蛋白偶联受体激酶。

甜味受体是存在于许多哺乳动物组织(包括口、肺和肠的上皮细胞)中的蛋白质。不受理论束缚，我们认为甜味受体失调或功能障碍可与许多疾病状态(包括糖尿病和肥胖症)相关。

短语″功能性甜味受体″是指这样的甜味受体，所述甜味受体包含至少T1R2和T1R3亚单位，并且以与细胞(所述细胞正常地表达该受体而无需对该细胞进行基因改造来产生该受体)中产生的甜味受体相似的方式(即至少50％、60％、70％、80％、90％和95％相同)响应已知的激活剂例如果糖、葡萄糖、蔗糖、莫内林(monellin)/神秘果蛋白(miraculin)、罗汉果甜苷(mogroside)、steviva、莱鲍迪苷A(rebaudiosideA)、糖精、阿斯巴甜、环己基氨基磺酸钠、三氯蔗糖、山梨糖醇、乙酰舒泛K或匙羹藤(Gymnema Sylvestre)或已知的抑制剂例如4，6-二氯-4，6-双脱氧-α-D-乳酸吡喃糖苷甲酯(MAD-diCI-Gal)、PNP/拉克替醇(lactisole)(可以以不同浓度差异地作用)、匙羹藤酸1、北拐枣皂苷(hoduloside)、枣素(ziziphin)和武靴藤多肽(gurmarin)。甜味受体行为可通过例如生理活性或药理反应来测定。生理活性包括但不限于G蛋白和相关下游信号传导的激活。药理反应包括但不限于受体的抑制、激活和调节。可以例如在监控当G_αq蛋白被激活的甜味受体激活时细胞内钙从内质网释放的测定中测定此类应答。

鲜味受体是存在于许多哺乳动物组织(包括口、肺和肠的上皮细胞)中的蛋白质。不受理论束缚，我们认为鲜味受体失调或功能障碍可与许多疾病状态(包括糖尿病和肥胖症)相关。

短语″功能性鲜味受体″是指这样的鲜味受体，所述鲜味受体包含至少T1R1和T1R3亚单位，并且以与细胞(所述细胞正常地表达该受体而无需对该细胞进行基因改造来产生该受体)中产生的鲜味受体相似的方式(即至少50％、60％、70％、80％、90％和95％相同)响应已知的激活剂例如谷氨酸单钠(MSG)或已知的抑制剂例如拉克替醇(已知其在特定的浓度时用作鲜味受体抑制剂)或PMP(2-(4-甲氧基苯氧基)-丙酸)。鲜味受体行为可通过例如生理活性或药理反应来测定。生理活性包括但不限于G蛋白和相关下游信号传导的激活。药理反应包括但不限于受体的抑制、激活和调节。可以例如在监控当G_αq蛋白被激活的鲜味受体激活时细胞内钙从内质网释放的测定中测定此类应答。

短语″功能性苦味受体″是指以基本上与细胞(所述细胞正常地表达该苦味受体而无需改造)中的苦味受体相似的方式响应已知的激活剂或已知抑制剂的苦味受体。苦味受体行为可通过例如生理活性或药理反应来测定。生理活性包括但不限于苦味的感觉。药理反应包括但不限于当将苦味受体与调节剂接触时，细胞内分子的量或分布的变化或者作为苦味受体的细胞内信号传导途径的部分的酶的活性的变化。例如，药理反应可包括当苦味受体被激活时细胞内游离钙的增加，或者当苦味受体被阻断时细胞内游离钙的减少。

如本文中所使用的术语″苦味受体″是指在味觉受体细胞表面上表达并且通过第二信使途径介导苦味感觉的G蛋白偶联受体的任何一种。

″异源的″或″所引入的″目的蛋白质例如味觉受体亚单位(例如，苦味受体亚单位、鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白意指目的蛋白质例如味觉受体亚单位(例如，苦味受体亚单位、鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白由引入宿主细胞的核酸编码。

″基因激活的″目的蛋白质例如味觉受体亚单位(例如，苦味受体亚单位、鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白意指编码亚单位或蛋白质的内源核酸通过表达控制序列的引入并且与该核酸的有效连接而被激活以进行表达。

本发明首次提供了由符合关于稳定表达功能性目的RNA或功能性目的蛋白质的细胞的急切需要的细胞产生的新型细胞和细胞系，所述目的蛋白质包括复杂蛋白质例如异源多聚体蛋白质和关于其的配体未知的蛋白质。本发明的细胞和细胞系适合于其中需要目的RNA或蛋白质的一致的功能表达的任何用途。申请人已产生了符合这种描述的细胞系，用于各种蛋白质，单个亚单位和异源多聚体(包括异源二聚体和具有超过2个不同亚单位的蛋白质)，包括膜蛋白质、细胞溶质蛋白质和分泌蛋白质，以及这些蛋白质的各种组合。

目的蛋白质的实例包括但不限于：受体例如，(例如，细胞因子受体、免疫球蛋白受体家族成员、配体门控离子通道、蛋白激酶受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、细胞核激素受体和其它受体)、信号传导分子(例如，细胞因子、生长因子、肽类激素、趋化因子、膜结合的信号传导分子和其它信号传导分子)、激酶(例如，氨基酸激酶、碳水化合物激酶、核苷酸激酶、蛋白激酶和其它激酶)、磷酸酶(例如，碳水化合物磷酸酶、核苷酸磷酸酶、蛋白磷酸酶和其它磷酸酶)、蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和其它蛋白酶)、调节分子(例如，G蛋白调节因子、大G蛋白、小GTP酶、激酶调节剂、磷酸酶调节剂、蛋白酶抑制剂和其它酶调节因子)、钙结合蛋白(例如，膜联蛋白、钙调素相关蛋白和其它选择性钙结合蛋白)、转录因子(例如，细胞核激素受体、基础转录因子、碱性螺旋-环-螺旋转录因子、creb转录因子、hmg盒转录因子、同源盒转录因子、其它转录因子、转录辅因子和锌指转录因子)、核酸结合蛋白(例如，解旋酶、DNA连接酶、DNA甲基转移酶、RNA甲基转移酶、双链DNA结合蛋白、限制性内切酶、复制起点结合蛋白、逆转录酶、核糖核蛋白、核糖体蛋白质、单链DNA结合蛋白、着丝粒DNA结合蛋白、染色质/染色质-结合蛋白、DNA糖基酶、DNA光修复酶、DNA聚合酶持续因子、DNA链配对蛋白(DNA strand-pairing protein)、DNA拓扑异构酶、DNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的RNA聚合酶、损坏的DNA结合蛋白(damaged DNA-binding protein)、组蛋白、引发酶、内切核糖核酸酶、脱氧核糖核酸外切酶、核糖核酸外切酶、翻译延伸因子、翻译起始因子、翻译释放因子、mRNA聚腺苷酸化因子、mRNA剪接因子、其它DNA结合蛋白类、其它RNA结合蛋白类和其它核酸结合蛋白质类)、离子通道(例如，阴离子通道、配体门控离子通道、电压门控离子通道和其它离子通道)、转运蛋白(例如，阳离子转运蛋白、ATP-结合盒(ABC)转运蛋白、氨基酸转运蛋白、碳水化合物转运蛋白和其它转运蛋白)、转移/载体蛋白(例如，载脂蛋白、线粒体载体蛋白和其它转移/载体蛋白)、细胞粘着分子(例如，cam家族附着分子、钙粘蛋白和其它细胞粘着分子)、细胞骨架蛋白(例如，肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白、肌动蛋白结合动力蛋白、非动力肌动蛋白结合蛋白、其它肌动蛋白家族细胞骨架蛋白、中间纤维、微管家族细胞骨架蛋白和其它细胞骨架蛋白质类)、细胞外基质(例如，细胞外基质糖蛋白、细胞外基质连接蛋白、细胞外基质结构蛋白和其它细胞外基质)、细胞连接蛋白质(例如，间隙连接蛋白、紧密连接蛋白和其它细胞连接蛋白质类)、合酶、合成酶、氧化还原酶(例如，脱氢酶、羟化酶、氧化酶、加氧酶、过氧化物酶、还原酶和其它氧化还原酶类)、转移酶(例如，甲基转移酶、乙酰基转移酶、酰基转移酶、糖基转移酶、核苷酸基转移酶、磷酸化酶、转醛醇酶、转氨酶、转酮醇酶和其它转移酶类)、水解酶(例如，去乙酰化酶、脱氨酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶、糖苷酶、脂肪酶、磷酸二酯酶、焦磷酸酶、淀粉酶和其它水解酶类)、裂解酶(例如，腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶、醛缩酶、脱羧酶、脱水酶、水合酶和其它裂合酶类)、异构酶(例如，差向异构酶/消旋酶、变位酶和其它异构酶类)、连接酶(例如，DNA连接酶、泛素蛋白连接酶和其它连接酶类)、防御/免疫蛋白(例如，抗菌反应蛋白、补体组分、免疫球蛋白、免疫球蛋白受体家族成员、主要组织相容性复合体抗原和其它防御和免疫蛋白)、膜运输蛋白质(例如，膜运输调节蛋白质、SNARE蛋白、小泡外被蛋白(vesicle coat protein)和其它膜运输蛋白质类)、侣伴蛋白(例如，伴侣蛋白、hsp 70家族伴侣蛋白、hsp 90家族伴侣蛋白和其它伴侣蛋白)、病毒蛋白(例如，病毒外壳蛋白和其它病毒蛋白质类)、髓磷脂蛋白、其它辅助功能蛋白(miscellaneous function protein)、贮藏蛋白、结构蛋白、表面活性剂和跨膜受体调节/接头蛋白。蛋白质和其功能的其它实例包括在Paul D.Thomas，Michael J.Campbell，Anish Kejariwal，Huaiyu Mi，BrianKarlak，Robin Daverman，Karen Diemer，Anushya Muruganujan，ApurvaNarechania.2003.PANTHER：a library of protein families andsubfamilies indexed by function.Genome Res.，13：2129-2141(其在此通过引用并入本文)中鉴定的蛋白质和其功能。

GPCR的实例包括但不限于：

A类GPCR，包括但不限于：5-羟色胺受体(例如，HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR1E、HTR1F、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR4、HTR5A、HTR6和HTR7)、毒蕈碱乙酰胆碱受体(例如，CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4和CHRM5)、腺苷受体(例如，ADORA1、ADORA2A、ADORA2B和ADORA3)、α-肾上腺受体(例如，ADRA1A、ADRA1B、ADRA1D、ADRA2A、ADRA2B和ADRA2C)、β-肾上腺受体(例如，ADRB1、ADRB2和ADRB3)、过敏毒素受体(例如，GPR77、C5R1和C3AR1)、血管紧张素受体(例如，AGTR1和AGTR2)、Apelin受体(例如，AGTRL1)、胆汁酸受体(例如，GPBAR1)、铃蟾肽受体(例如，NMBR、GRPR和BRS3)、缓激肽受体(例如，BDKRB1和BDKRB2)、大麻素受体(例如，CNR1和CNR2)、趋化因子受体-白细胞介素(例如，8IL8RA和IL8RB)、趋化因子受体(例如，CXCR3、CXCR4、CXCR5、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CX3CR1、XCR1和CXCR6)、胆囊收缩素受体(例如，CCKAR和CCKBR)、多巴胺受体(例如，DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5)、内皮素受体(例如，EDNRA和EDNRB)、雌激素受体(例如，GPER)、甲酰肽受体(例如，FPR2、FPR3和FPR1)、游离脂肪酸受体(例如，FFAR1、FFAR3、FFAR2和GPR42)、甘丙肽受体(例如，ALR1、GALR2和GALR3)、葛瑞林受体(例如，GHSR)、糖蛋白激素受体(例如，FSHR、LHCGR和TSHR)、促性腺激素释放激素受体(例如，GNRHR和GNRHR2)、组胺受体(例如，HRH1、HRH2、HRH3和HRH4)、KiSS1-源性肽受体(例如，KISS1R)、白三烯受体(例如，LTB4R2、FPRL1、OXER1、LTB4R、CYSLTR1和CYSLTR2)、溶血磷脂质受体(例如，LPAR1、LPAR2、LPAR3、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4和S1PR5)、黑色素聚集激素受体(例如，MCHR1和MCHR2)、黑皮质素受体(例如，MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R)、褪黑激素受体(例如，MTNR1A和MTNR1B)、促胃动素受体(例如，MLNR)、神经介素U受体(例如，NMUR1和NMUR2)、神经肽FF/神经肽AF受体(例如，NPFFR1和NPFFR2)、神经肽S受体(例如，NPSR1)、神经肽W/神经肽B受体(例如，NPBWR1和NPBWR2)、神经肽Y受体(例如，NPY1R、NPY2R、PPYR1和NPY5R)、神经降压肽受体(例如，NTSR1和NTSR2)、烟酸受体家族(例如，GPR109B、GPR109A和GPR81)、非信号传导7TM趋化因子结合蛋白(例如，DARC、CCBP2和CCRL1)、阿片类物质受体(例如，OPRM1、OPRD1、OPRK1和OPRL1)、阿立新受体(例如，HCRTR1和HCRTR2)、P2Y受体(例如，P2RY1、P2RY2、P2RY4、P2RY6、P2RY11、P2RY12、P2RY14和P2RY13)、肽P518受体(例如，QRFPR)、血小板活化因受体(例如，PTAFR)、激动素原(Prokineticin)受体(例如，PROKR1和PROKR2)、催乳素-释放肽受体(例如，PRLHR)、前列腺素受体(例如，PTGDR、PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4、PTGFR、PTGIR、TBXA2R和GPR44)、蛋白酶激活受体(例如，凝血酶(F2R))、蛋白酶激活受体(例如，F2RL1、F2RL2和F2RL3)、松弛素家族肽受体(例如，RXFP1、RXFP2、RXFP3和RXFP4)、生长抑素受体(例如，SSTR2、SSTR5、SSTR3、SSTR1和SSTR4)、速激肽受体(例如，TACR1、TACR2和TACR3)、促甲状腺激素释放激素受体(例如，TRHR)、微量胺受体(例如，TAAR1)、乌洛滕生受体(例如，UTS2R)、加压素和催产素受体(例如，AVPR1A、AVPR2、AVPR1B和OXTR)、A类孤儿受体(例如，GPR82、GPR182、CCRL2、CMKLR1、CMKOR1、GPR183、GPR1、GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR23、GPR25、GPR26、GPR27、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR92、GPR101、GPR119、GPR120、GPR132、GPR135、GPR139、GPR141、GPR142、GPR146、GPR148、GPR149、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR160、GPR161、GPR171、GPR173、GPR174、GPR162、LGR4、LGR5、LGR6、MAS1、MAS1L、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、OPN3、OPN5、OXGR1、P2RY10、P2RY5、P2RY8、SUCNR1、TAAR2、TAAR3、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9和GPR42)；

B类GPCR，包括但不限于：钙敏感受体(Calcium-sensingreceptor)(例如，CASR和GPRC6A)、GABA-B受体(例如，GABBR1和GABBR2)、GPRC5受体(例如，GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C和GPRC5D)、亲代谢性谷氨酸盐受体(例如，GRM1、GRM2、GRM3、GRM4、GRM5、GRM6、GRM7和GRM8)、C类孤儿受体(例如，GPR156、GPR158、GPR179、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C和GPRC5D)；

C类GPCR，包括但不限于：降钙素受体(例如，CALCR/CT、AMY1、AMY2、AMY3、CALCRL、CGRP、AM1和AM2)、促皮质素释放因子受体(例如，CRHR1和CRHR2)、胰高血糖素受体家族例如，GCGR、GLP1R、GLP2R、GIPR、SCTR和GHRHR)、甲状旁腺激素受体(例如，PTH1R和PTHR2)、VIP和PACAP受体(例如，ADCYAP1R1、VIPR1和VIPR2)、B类孤儿受体(例如，Bal1、BAl2、BAl3、CD97、CELSR1、CELSR2、CELSR3、ELTD1、EMR1、EMR2、EMR3、EMR4、GPR56、GPR64、GPR97、GPR110、GPR111、GPR112、GPR113、GPR114、GPR115、GPR116、GPR123、GPR124、GPR125、GPR126、GPR128、GPR133、GPR143、GPR144、GPR157、LPHN1、LPHN2、LPHN3和GPR98)；

D类GPCR，包括但不限于真菌交配信息素受体(例如，STE2和STE3)；

E类GPCR，包括但不限于cAMP受体(例如，盘基网柄菌属(Dictyostelium))；

F类GPCR，包括但不限于卷曲受体(frizzled receptor)(例如，FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10和SMO)；

和

未分类的GPCR(例如，OPCML、OGFR、OGFRL1和OPRS1)。

电压门控离子通道的实例包括但不限于：

钙激活钾通道，包括但不限于KCNMA1、KCNN1、KCNN2、KCNN3、KCNN4、KCNT1、KCNT2和KCNU1；

CatSper和两孔通道，包括但不限于CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3、CATSPER4、TPCN1和TPCN2；

环核苷酸调节的通道，包括但不限于CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3和HCN4；

内向整流钾通道，包括但不限于KCNJ1、KCNJ2、KCNJ12、KCNJ4、KCNJ14、KCNJ3、KCNJ6、KCNJ9、KCNJ5、KCNJ10、KCNJ15、KCNJ16、KCNJ8、KCNJ11和KCNJ13；

瞬时型感受器电位通道，包括但不限于TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2，TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、MCOLN1、MCOLN2、MCOLN3、PKD2、PKD2L1、PKD2L2、TRPV1、TRPV2、TRVP3、TRPV4、TRPV5和TRPV6；

2-P钾通道(Two-P potassium channels)、包括但不限于KCNK1、KCNK2、KCNK3、KCNK4、KCNK5、KCNK6、KCNK7、KCNK9、KCNK10、KCNK12、KCNK13、KCNK15、KCNK16、KCNK17和KCNK18；

电压门控钙通道，包括但不限于CACNA1S、CACNA1C、CACNA1D、CACNA1F、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1E、CACNA1G、CACNA1H和CACNAII；

电压门控钾通道，包括但不限于KCNA1、KCNA2、KCNA3、KCNA4、KCNA5、KCNA6、KCNA7、KCNA10、KCNB1、KCNB2、KCNC1、KCNC2、KCNC3、KCNC4、KCND1、KCND2、KCND3、KCNF1、KCNG1、KCNG2、KCNG3、KCNG4、KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、KCNV1、KCNV2、KCNS1、KCNS2、KCNS3、KCNH1、KCNH5、KCNH2、KCNH6、KCNH7、KCNH8、KCNH3和KCNH4；

电压门控钠通道，包括但不限于SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A和SCN11A；和

其它电压门控离子通道，包括但不限于KCNE1、KCNE1L、KCNE2、KCNE3、KCNIP1、KCNIP2、KCNIP3、KCNIP4、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、CNMB3L和KCNMB4。

配体门控离子通道的实例包括但不限于：

5-羟色胺受体亚单位，包括但不限于5HT3Acapo、5HT3Ahosa、5HT3Amumu、5HT3Amupu、5HT3Aorcu、5HT3Apatr、5HT3Arano、5HT3Bhosa、5HT3Bmumu、5HT3Borcu、5HT3Bpatr、5HT3Brano、5HT3Chosa、5HT3Cpatr、5HT3Dhosa、5HT3Dpatr、5HT3Ehosa、5HT3gaga和5HTmod1cael；5-HT受体包括：5-HT1A；5-HT1B；5-HT1D；5-HT1E；5-HT1F；5-HT2A；5-HT2B；5-HT2C；5HT4剪接同种型a、b、c、d、e、f、g、n；5-HT5A；5-HT6；5-HT7剪接形式a、b、c。

乙酰胆碱受体亚单位包括但不限于ACHa10gaga、ACHa10hosa、ACHa10mumu、ACHa10patr、ACHa10rano、ACHa1anga、ACHa1apca、ACHa1ataru、ACHa1axela、ACHa1bota、ACHa1btaru、ACHa1bxela、ACHa1cafa、ACHa1dare、ACHa1gaga、ACHa1hevi、ACHa1hosa、ACHa1lomi、ACHa1mumu、ACHa1mype、ACHa1naha、ACHa1nana、ACHa1nate、ACHa1patr、ACHa1rano、ACHa1toca、ACHa1toma、ACHa2anga、ACHa2apca、ACHa2apgo、ACHa2dare、ACHa2gaga、ACHa2hevi、ACHa2hosa、ACHa2lomi、ACHa2mamu、ACHa2mumu、ACHa2mype、ACHa2patr、ACHa2rano、ACHa2taru、ACHa3anga、ACHa3apme、ACHa3bota、ACHa3caau、ACHa3drme、ACHa3gaga、ACHa3hevi、ACHa3hosa、ACHa3lomi、ACHa3mamu、ACHa3mumu、ACHa3mype、ACHa3patr、ACHa3rano、ACHa3taru、ACHa4anga、ACHa4drme、ACHa4gaga、ACHa4hosa、ACHa4mamu、ACHa4mumu、ACHa4mype、ACHa4patr、ACHa4rano、ACHa4taru、ACHa5anga、ACHa5drme、ACHa5gaga、ACHa5hosa、ACHa5mamu、ACHa5mumu、ACHa5mype、ACHa5patr、ACHa5rano、ACHa6ataru、ACHa6btaru、ACHa6drme、ACHa6gaga、ACHa6hosa、ACHa6mamu、ACHa6mumu、ACHa6patr、ACHa6rano、ACHa7_1hevi、ACHa7_2hevi、ACHa7anga、ACHa7ataru、ACHa7bota、ACHa7btaru、ACHa7ctaru、ACHa7dare、ACHa7drme、ACHa7gaga、ACHa7hosa、ACHa7mamu、ACHa7mumu、ACHa7patr、ACHa7rano、ACHa7rasp、ACHa8ataru、ACHa8btaru、ACHa8gaga、ACHa9ataru、ACHa9btaru、ACHa9ctaru、ACHa9dare、ACHa9dtaru、ACHa9gaga、ACHa9hosa、ACHa9mumu、ACHa9patr、ACHa9rano、ACHaassu、ACHacr10cael、ACHacr11cael、ACHacr12cael、ACHacr13cael、ACHacr14cael、ACHacr15cael、ACHacr16cael、ACHacr17cael、ACHacr18cael、ACHacr19cael、ACHacr20cael、ACHacr21cael、ACHacr22cael、ACHacr23cael、ACHacr2cael、ACHacr3cael、ACHacr4cael、ACHacr5cael、ACHacr6cael、ACHacr7cael、ACHacr8cael、ACHacr9cael、ACHahaco、ACHal1acdo、ACHal1scgr、ACHalsdrme、ACHalsmase、ACHalyst、ACHarddrme、ACHb1ataru、ACHb1bota、ACHb1btaru、ACHb1hevi、ACHb1hosa、ACHb1mase、ACHb1mumu、ACHb1patr、ACHb1rano、ACHb1toca、ACHb1xela、ACHb2caau、ACHb2gaga、ACHb2hosa、ACHb2mamu、ACHb2mumu、ACHb2patr、ACHb2rano、ACHb3acaau、ACHb3adare、ACHb3bcaau、ACHb3gaga、ACHb3hosa、ACHb3mamu、ACHb3mumu、ACHb3patr、ACHb3rano、ACHb4bota、ACHb4gaga、ACHb4hosa、ACHb4mamu、ACHb4mumu、ACHb4patr、ACHb4rano、ACHb4taru、ACHb5taru、ACHb6taru、ACHb7taru、ACHblomi、ACHblyst、ACHc04c3_2cael、ACHc15a7_1cael、ACHcg7589drme、ACHclyst、ACHcup4cael、ACHdbota、ACHddare、ACHdeg3cael、ACHdgaga、ACHdhosa、ACHdlyst、ACHdmumu、ACHdpatr、ACHdrara、ACHdtaru、ACHdtoca、ACHdxela、ACHeat2cael、ACHebota、ACHehosa、ACHelyst、ACHemumu、ACHepatr、ACHerara、ACHetaru、ACHexela、ACHf11c7_1cael、ACHf17e9_7cael、ACHf17e9_8cael、ACHf18g5_4cael、ACHf21a3_7cael、ACHf58h7_3cael、ACHflyst、ACHgbota、ACHggaga、ACHghosa、ACHglyst、ACHgmumu、ACHgpatr、ACHgrara、ACHgtaru、ACHgtoca、ACHgxela、ACHhlyst、ACHilyst、ACHjIyst、ACHklyst、ACHIev1cael、ACHIIyst、ACHnaapca、ACHr03e1_3cael、ACHr13a5_4cael、ACHronvo、ACHsaddrme、ACHsbddrme、ACHssu1osci、ACHssu2osci、ACHt01h10_1cael、ACHt01h10_2cael、ACHt01h10_3cael、ACHt01h10_5cael、ACHt01h10_6cael、ACHt01h10_7cael、ACHt05b4_1cael、ACHtar1trco、ACHunc29cael、ACHunc38cael、ACHunc63cael、ACHy44a6e_1cael、ACHy57g11c_2cael、ACHy57g11c_49cael、ACHy58g8a_1cael、ACHy73b6bl_26cael和ACHy73f8a_30cael；

GABAA受体亚单位，包括但不限于GABa1bota、GABa1gaga、GABa1hosa、GABa1mumu、GABa1rara、GABa2bota、GABa2hosa、GABa2mumu、GABa2rara、GABa3bota、GABa3hevi、GABa3hosa、GABa3mumu、GABa3rara、GABa4bota、GABa4hosa、GABa4mumu、GABa4rara、GABa5hosa、GABa5rara、GABa6caau、GABa6hosa、GABa6mumu、GABa6rara、GABb1bota、GABb1hosa、GABb1mumu、GABb1rasp、GABb2dare、GABb2hosa、GABb2mumu、GABb2rasp、GABb3gaga、GABb3hosa、GABb3mumu、GABb3rasp、GABb4gaga、GABbdrme、GABblyst、GABbseof、GABc09g5_1cael、GABc27h5_4cael、GABc39b10_2cael、GABc53d6_3cael、GABdhosa、GABdmumu、GABdrara、GABehosa、GABemumu、GABerano、GABf09c12_1cael、GABf11h8_2cael、GABf47a4_1cael、GABf55d10_5cael、GABf58g6_4cael、GABggaga、GABghosa、GABgmumu、GABgrano、GABg2bota、GABg2gaga、GABg2hosa、GABg2mumu、GABg2rara、GABg3hosa、GABg3mumu、GABg3rano、GABg4gaga、GABg4hosa、GABg4mumu、GABgbr2cael、GABgrddrme、GABhg1haco、GABk10d6_1cael、GABphosa、GABpmumu、GABr1amoam、GABr1bmoam、GABr1hosa、GABr1mumu、GABr1rano、GABr2amoam、GABr2bmoam、GABr2hosa、GABr2mumu、GABr2rara、GABr3hosa、GABr3moam、GABr3mumu、GABr3rano、GABrdlaeae、GABrdlceca、GABrdldrme、GABt20b12_9cael、GABt21f2_1cael、GABt24d8_1cael、GABthosa、GABtmumu、GABtrano、GABunc49bcael、GABunc49cael和GABzlyst；

甘氨酸/组胺受体亚单位，包括但不限于GLYa1dare、GLYa1hosa、GLYa1mumu、GLYa1rano、GLYa2dare、GLYa2hosa、GLYa2mumu、GLYa2rano、GLYa3dare、GLYa3hosa、GLYa3moam、GLYa3mumu、GLYa3rano、GLYa4adare、GLYa4bdare、GLYa4hosa、GLYa4mumu、GLYbdare、GLYbhosa、GLYbmumu、GLYbrano和HIScl1drme；

ATP受体亚单位，包括但不限于ATPp2x1hosa、ATPp2x1rano、ATPp2x2capo、ATPp2x2hosa、ATPp2x2mumu、ATPp2x2rano、ATPp2x3hosa、ATPp2x3mumu、ATPp2x3rano、ATPp2x4bota、ATPp2x4gaga、ATPp2x4hosa、ATPp2x4mumu、ATPp2x4orcu、ATPp2x4rano、ATPp2x5bota、ATPp2x5hosa、ATPp2x5mumu、ATPp2x5rano、ATPp2x6hosa、ATPp2x6mumu、ATPp2x6rano、ATPp2x7bota、ATPp2x7hosa、ATPp2x7mumu、ATPp2x7rano和ATPp2xscma；

谷氨酸受体亚单位，包括但不限于GLU1_1arth、GLU1_2arth、GLU1_3arth、GLU1_4arth、GLU2_1arth、GLU2_2arth、GLU2_3arth、GLU2_4arth、GLU2_5arth、GLU2_6arth、GLU2_7arth、GLU2_8arth、GLU2_9arth、GLU3_1arth、GLU3_2arth、GLU3_3arth、GLU3_4arth、GLU3_5arth、GLU3_6arth、GLU3_7arth、GLUd1hosa、GLUd1mumu、GLUd1rano、GLUd2hosa、GLUd2mumu、GLUd2rano、GLUglr10cael、GLUglr1cael、GLUglr2cael、GLUglr4cael、GLUglr5cael、GLUglr6cael、GLUglr7cael、GLUglr8cael、GLUglr9cael、GLUk10d3_1cael、GLUka1hosa、GLUka1mumu、GLUka1rano、GLUka2hosa、GLUka2mumu、GLUka2rano、GLUka4mumu、GLUkbpacaau、GLUkbpansp、GLUkbpbcaau、GLUkbpgaga、GLUkbprapi、GLUkbpxela、GLUnr1anpl、GLUnr1aple、GLUnr1caau、GLUnr1drme、GLUnr1hosa、GLUnr1mumu、GLUnr1rano、GLUnr1susc、GLUnr1xela、GLUnr2ahosa、GLUnr2amumu、GLUnr2arano、GLUnr2bhosa、GLUnr2bmumu、GLUnr2brano、GLUnr2chosa、GLUnr2cmumu、GLUnr2crano、GLUnr2dhosa、GLUnr2dmumu、GLUnr2drano、GLUnr3ahosa、GLUnr3amumu、GLUnr3arano、GLUnr3bhosa、GLUnr3bmumu、GLUnr3brano、GLUr0、GLUr1gaga、GLUr1hosa、GLUr1moch、GLUr1mumu、GLUr1rano、GLUr2acorni、GLUr2borni、GLUr2coli、GLUr2gaga、GLUr2hosa、GLUr2mumu、GLUr2rano、GLUr3aormo、GLUr3caau、GLUr3coli、GLUr3gaga、GLUr3hosa、GLUr3mumu、GLUr3rano、GLUr4caau、GLUr4coli、GLUr4gaga、GLUr4hosa、GLUr4mumu、GLUr4rano、GLUr5daae、GLUr5hosa、GLUr5mumu、GLUr5rano、GLUr6hosa、GLUr6mumu、GLUr6rano、GLUr6xela、GLUr7hosa、GLUr7mumu、GLUr7rano、GLUrldrme、GLUrllAdrme、GLUrllBdrme、GLUrlllyst、GLUrllyst、GLUrk1lyst、GLUcl3cael、GLUclacael、GLUclbcael、GLUclbhaco、GLUcldrme、GLUclhaco、GLUclxcael和GLUclxonvo。

其它通道蛋白的实例包括但不限于：

ENaC/DEG家族蛋白，包括但不限于SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G、SCNN1D、ACCN2、ACCN1、ACCN3、ACCN4和ACCN5；

水通道蛋白类(Aquaporins)，包括但不限于AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP7P1、AQP7P2、AQP7P3、AQP7P4、AQP8、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12A和AQP12B；以及

氯化物通道，包括但不限于CLCA1、CLCA2、CLCA3P、CLCA4、CLCC1、CLCF1、CLCN1、CLCN2、CLCN3、CLCN4、CLCN5、CLCN6、CLCN7、CLCNKA和CLCNKB。

膜载体/转运蛋白的实例包括但不限于：

蛋白质的ABCC家族、包括但不限于ABCA1、ABCA2、ABCA3、ABCA4、ABCA5、ABCA6、ABCA7、ABCA8、ABCA9、ABCA10、ABCA11P、ABCA12、ABCA13、ABCA17P、ABCB1、ABCB4、ABCB5、ABCB6、ABCB7、ABCB8、ABCB9、ABCB10、ABCB10P1、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC6P1、ABCC6P2、ABCC8、ABCC9、ABCC10、ABCC11、ABCC12、ABCC13、ABCD1、ABCD1P1、ABCD1P2、ABCD1P3、ABCD1P4、ABCD2、ABCD3、ABCD4、ABCE1、ABCF1、ABCF2、ABCF3、ABCG1、ABCG2、ABCG4、ABCG5、ABCG8、TAP1、TAP2、CFTR TAPBP和TAPBPL；

蛋白质的可溶性载体家族，包括但不限于SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A3P1、SLC2A3P2、SLC2A3P4、SLC2A4、SLC2A4RG、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC2AXP1、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A1AP、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A6P、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10P、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC6A21P、SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A5P1、SLC7A6、SLC7A6OS、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A3P、SLC9A3P2、SLC9A3P3、SLC9A3P4、SLC9A3R1、SLC9A3R2、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9A10、SLC9A11、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC15A5、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A1P1、SLC20A2、SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12.SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A18AS、SLC22A20、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC24A6、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A5P1、SLC25A5P2、SLC25A5P3、SLC25A5P4、SLC25A5P5、SLC25A5P6、SLC25A5P7、SLC25A5P8、SLC25A5P9、SLC25A6、SLC25A6P1、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A15P、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19、SLC25A20、SLC25A20P、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37、SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A1P、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3，SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、LC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、SLC48A1、SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1和SLCO6A1；

ATP转运蛋白，包括但不限于ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B1、ATP1B2、ATP1B3、ATP1B3P1、ATP1B4、ATP1L1、ATP2A1、ATP2A2、ATP2A3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4、ATP2C1、ATP2C2、ATP3、ATP4A、ATP4B、ATP5A1、ATP5AL1、ATP5AP1、ATP5AP2、ATP5AP3、ATP5AP4、ATP5B、ATP5BL1、ATP5BL2、ATP5C1、ATP5C2、ATP5D、ATP5E、ATP5EP1、ATP5EP2、ATP5F1、ATP5G1、ATP5G2、ATP5G3、ATP5GP1、ATP5GP2、ATP5GP3、ATP5GP4、ATP5H、ATP5HP1、ATP5I、ATP5J、ATP5J2、ATP5J2LP、ATP5J2P2、ATP5J2P3、ATP5J2P4、ATP5J2P5、ATP5J2P6、ATP5L、ATP5LP1、ATP5LP2、ATP5LP3、ATP50、ATP5S、ATP5SL、ATP6AP1、ATP6AP1L、ATP6AP2、ATP6V1A、ATP6V1B1、ATP6V1B2、ATP6V1C1、ATP6V1C2、ATP6V1D、ATP6V1E1、ATP6V1E2、ATP6V1EL1、ATP6V1EP1、ATP6V1EP2、ATP6V1F、ATP6V1G1、ATP6V1G2、ATP6V1G3、ATP6V1GP1、ATP6V1GP2、ATP6V1H、ATP6V0A1、ATP6V0A2、ATP6V0A4、ATP6V0B、ATP6V0C、ATP6V0D1、ATP6V0D2、ATP6V0E1、ATP6V0E2、ATP7A、ATP7B和ATP8A1；以及

脂肪酸结合蛋白，包括但不限于FABP1、FABP2、FABP3、FABP3P2、FABP4、FABP5、FABP5L1、FABP5L2、FABP5L3、FABP5L4、FABP5L5、FABP5L6、FABP5L7、FABP5L8、FABP5L9、FABP5L10、FABP5L11、FABP5L12、FABP6、FABP7、FABP9和FABP12；

胰岛素样生长因子、包括但不限于IGF1、IGF1R、IGF2、IGF2AS、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、IGF2R、IGFALS、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5、IGFBP6、IGFBP7、IGFBPL1、IGFL1、IGFL1P1、IGFL1P2、IGFL2、IGFL3、IGFL4和IGFN1；

转化生长因子，包括但不限于TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TGFBRAP1、TGFBRE、LEFTY1、LEFTY2、BMPR1A、BMPR1APS1、BMPR1APS2、BMPR1B、BMPR2、ACVR1、ACVR1B、ACVR1C、ACVR2A、ACVR2B和ACVRL1；

细胞核受体、包括但不限于NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1H5P、NR1I1、NR1I2、NR1I3、NR1I4、NR2A1、NR2A2、NR2B1、NR2B2、NR2B3、NR2C1、NR2C2、NR2C2AP、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C1P、NR3C2、NR3C3、NR3C4、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRAP、NRARP、NR0B1、NR0B2、NRBF2、NRBP1、NRBP2、NRCAM、NRIP1、NRIP2和NRIP3；

维A酸受体、包括但不限于RARA、RARB、RARG、RARRES1、RARRES2和RARRES3；

受体酪氨酸激酶孤儿受体和RAR相关蛋白，包括但不限于ROR1、ROR2、RORA、RORB和RORC；

过氧化物酶体增殖物激活受体，包括但不限于PPARA、PPARD、PPARG、PPARGC1A和PPARGC1B；

甲状腺激素受体、包括但不限于THRA、THRAP3、THRAP3L、THRB和THRSP；

雌激素受体、上皮剪接调节蛋白和雌激素相关受体，包括但不限于ESR1、ESR2、ESRP1、ESRP2、ESRRA、ESRRAP1、ESRRAP2、ESRRB和ESRRG；

成红细胞白血病病毒癌基因，包括但不限于ERBB2、ERBB2IP、ERBB3、ERBB4和EGFR；

血小板源性生长因子，包括但不限于PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD、PDGFRA、PDGFRB和PDGFRL；

成纤维细胞源性生长因子、包括但不限于FGFR1、FGFR10P、FGFR10P2、FGFR2、FGFR3、FGFR3P、FGFR4、FGFR6和FGFRL1；

潜在转化生长因子β结合蛋白，包括但不限于LTBP1、LTBP2、LTBP3和LTBP4；

维生素载体蛋白、包括但不限于RBP1、RBP2、RBP3、RBP4、RBP5、RBP7、RBPJ、RBPJL、RBPJP1、RBPJP2、RBPJP3、RBPJP4、RBPMS、RBPMS2和RBPMSLP；

类固醇激素合成急性调节蛋白，包括但不限于STAR、STARD3、STARD3NL、STARD4、STARD5、STARD6、STARD7、STARD8、STARD9、STARD10、STARD13和STARP1；

甾醇载体蛋白，包括但不限于SCP2和SCPEP1；

糖脂转运蛋白，包括但不限于GLTP、GLTPD1、GLTPD2和GLTPP1；以及

其它转运蛋白例如CETP。

目的蛋白质的其它实例包括但不限于：

T细胞受体β常数1，包括但不限于TRBC1、TRBC2、TRBD1、TRBD2、TRBJ1-1、TRBJ1-2、TRBJ1-3、TRBJ1-4、TRBJ1-5、TRBJ1-6、TRBJ2-1、TRBJ2-2、TRBJ2-2P、TRBJ2-3、TRBJ2-4、TRBJ2-5、TRBJ2-6、TRBJ2-7、TRBV1、TRBV2、TRBV3-1、TRBV3-2、TRBV4-1、TRBV4-2、TRBV4-3、TRBV5-1、TRBV5-2、TRBV5-3、TRBV5-4、TRBV5-5、TRBV5-6、TRBV5-7、TRBV5-8、TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-4、TRBV6-5、TRBV6-6、TRBV6-7、TRBV6-8、TRBV6-9、TRBV7-1、TRBV7-2、TRBV7-3、TRBV7-4、TRBV7-5、TRBV7-6、TRBV7-7、TRBV7-8、TRBV7-9、TRBV8-1、TRBV8-2、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2、TRBV10-3、TRBV11-1、TRBV11-2、TRBV11-3、TRBV12-1、TRBV12-2、TRBV12-3、TRBV12-4、TRBV12-5、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV17、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV20OR9-2、TRBV21-1、TRBV21OR9-2、TRBV22-1、TRBV22OR9-2、TRBV23-1、TRBV23OR9-2、TRBV24-1、TRBV24OR9-2、TRBV25-1、TRBV25OR9-2、TRBV26、TRBV26OR9-2、TRBV27、TRBV28、TRBV29-1、TRBV29OR9-2、TRBV30、TRBVA、TRBVAOR9-2、TRBVB和TRBVOR9；

解离素类，包括但不限于ADAM1、ADAM2、ADAM3A、ADAM3B、ADAM5P、ADAM6、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM21P、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM32、ADAM33、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS20、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ADAMTSL4和ADAMTSL5；

整联蛋白，包括但不限于ITGA1、ITGA2、ITGA2B、ITGA3、ITGA4、ITGA5、ITGA6、ITGA7、ITGA8、ITGA9、ITGA10、ITGA11、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGAW、ITGAX、ITGB1、ITGB1BP1、ITGB1BP2、ITGB1BP3、ITGB2、ITGB3、ITGB3BP、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、ITGB8和ITGBL1；

细胞附着分子，包括但不限于NCAM1、NCAM2、VCAM1、ICAM1、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、PECAM1、L1CAM、CHL1、MAG、CADM1、CADM2、CADM3和CADM4；

人气味受体，包括但不限于OR10A1、OR10A3、OR10A4、OR10A5、OR10A6、OR10A7、OR10C1、OR10C2、OR10D4、OR10G2、OR10G3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR10H5、OR10J1、OR10J3、OR10J5、OR10J6、OR10K1、OR10K2、OR10Q1、OR10R2、OR10S1、OR10T2、OR10V1、OR10Z1、OR11A1、OR11G2、OR11H1、OR11H4、OR11H6、OR11H7P、OR11L1、OR12D3、OR13A1、OR13C2、OR13C3、OR13C4、OR13C5、OR13C7、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13E2、OR13F1、OR13G1、OR13H1、OR13J1、OR14A16、OR14A2、OR14C36、OR14J1、OR1A1、OR1A2、OR1A2、OR1B1、OR1C1、OR1D2、OR1D4、OR1D5、OR1E1、OR1E2、OR1E2、OR1E5、OR1E5、OR1E6、OR1E7、OR1F1、OR1F10、OR1F11、OR1F12、OR1F2、OR1G1、OR1I1、OR1J1、OR1J2、OR1J2、OR1J4、OR1J5、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L4、OR1L6、OR1L8、OR1M1、OR1M1、OR1N1、OR1N2、OR1N3、OR1Q1、OR1S1、OR1S2、OR2A1、OR2A10、OR2A19、OR2A20、OR2A21、OR2A4、OR2A42、OR2A5、OR2A6、OR2A7、OR2AE1、OR2AJ1、OR2AK2、OR2B1、OR2B2、OR2B3、OR2B6、OR2B9、OR2C1、OR2D1、OR2D2、OR2D3、OR2F1、OR2F2、OR2F3、OR2G2、OR2G3、OR2H1、OR2H2、OR2H3、OR2J2、OR2J3、OR2K1、OR2K2、OR2L1、OR2L2、OR2L3、OR2L5、OR2L8、OR2M1、OR2M2、OR2M4、OR2S2、OR2T1、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2V1、OR2V2、OR2V3、OR2W1、OR2W3、OR2Y1、OR2Z1、OR3A1、OR3A2、OR3A3、OR3A4、OR4A15、OR4A16、OR4A4、OR4A5、OR4B1、OR4C12、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C6、OR4D1、OR4D2、OR4D5、OR4D6、OR4D9、OR4E2、OR4F10、OR4F15、OR4F16、OR4F16、OR4F17、OR4F18、OR4F19、OR4F3、OR4F6、OR4K1、OR4K13、OR4K14、OR4K15、OR4K17、OR4K2、OR4K3、OR4K5、OR4L1、OR4M1、OR4M2、OR4N2、OR4N4、OR4N5、OR4P4、OR4Q3、OR4S1、OR4X1、OR4X2、OR51A2、OR51A4、OR51A7、OR51B2、OR51B4、OR51D1、OR51E1、OR51E2、OR51F2、OR51G1、OR51G2、OR51H1、OR51I1、OR51l2、OR51L1、OR51M1、OR51Q1、OR51S1、OR51T1、OR52A1、OR52A2、OR52B2、OR52B4、OR52B4、OR52B4、OR52B6、OR52D1、OR52E2、OR52E4、OR52E5、OR52E6、OR52E8、OR52H1、OR52I1、OR52I2、OR52J3、OR52K1、OR52K2、OR52L1、OR52L2、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52N5、OR52P1、OR52R1、OR56A4、OR56A6、OR56B2、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AC2、OR5AK2、OR5AK3、OR5AN1、OR5AP2、OR5AR1、OR5AS1、OR5AU1、OR5AU1、OR5B13、OR5B16、OR5B17、OR5B2、OR5B3、OR5C1、OR5D13、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5G3、OR5H1、OR5H2、OR5H6、OR5I1、OR5K1、OR5K2、OR5L1、OR5L2、OR5M1、OR5M10、OR5M11、OR5M11、OR5M3、OR5M3、OR5M8、OR5M9、OR5P2、OR5P3、OR5T2、OR5T3、OR5V1、OR6A1、OR6B1、OR6B2、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6F1、OR6J2、OR6K3、OR6K6、OR6M1、OR6N1、OR6N2、OR6P1、OR6Q1、OR6S1、OR6T1、OR6V1、OR6X1、OR6Y1、OR7A10、OR7A17、OR7A2、OR7A5、OR7C1、OR7C2、OR7D2、OR7D2、OR7D4P、OR7E102、OR7E120、OR7G1、OR7G2、OR7G3、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8B8、OR8D1、OR8D2、OR8D4、OR8G1、OR8G2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR9A2、OR9A4、OR9G1、OR9G4、OR9G5、OR9I1、OR9K2和OR9Q1；以及

冈比亚按蚊(anopheles gambiae)气味受体，包括但不限于IOR100、IOR101、IOR102、IOR103、IOR104、IOR105、IOR106、IOR107、IOR108、IOR109、IOR110、IOR111、IOR112、IOR113、IOR114、IOR115、IOR116、IOR117、IOR118、IOR119、IOR120、IOR121、IOR122、IOR123、IOR124、IOR125、IOR126、IOR127、IOR49、IOR50、IOR51、IOR52、IOR53、IOR54、IOR55、IOR56、IOR57、IOR58、IOR59、IOR60、IOR61、IOR62、IOR63、IOR64、IOR65、IOR66、IOR67、IOR68、IOR69、IOR70、IOR71、IOR72、IOR73、IOR74、IOR75、IOR76、IOR77、IOR78、IOR79、IOR80、IOR81、IOR82、IOR83、IOR84、IOR85、IOR86、IOR87、IOR88、IOR89、IOR90、IOR91、IOR92、IOR93、IOR94、IOR95、IOR96、IOR97、IOR98、IOR99、ORL7077、ORL7078、ORL7079、ORL7080、ORL7081、ORL7082、ORL7083、ORL7084、ORL7085、ORL7086、ORL7087、ORL7088、ORL7089、ORL7090、ORL7091、ORL7092、ORL7093、ORL7094、ORL7095、ORL7096、ORL7097、ORL7098、ORL7099、ORL7100、ORL7101、ORL7102、ORL7103、ORL7104、ORL7105、ORL7106、ORL7107、ORL7108、ORL7109、ORL7110、ORL7111、ORL7112、ORL7113、ORL7114、ORL7115、ORL7116、ORL7117、ORL7118、ORL7119、ORL7120、ORL7121、ORL7122、ORL7123、ORL7124、ORL7125、TPR2307、TPR2308、TPR2309、TPR2310、TPR2312、TPR2314、TPR2315、TPR2316、TPR2317、TPR2318、TPR2319、TPR2320、TPR2321、TPR2321、TPR698、TPR699、TPR700、TPR701、TPR702、TPR703、TPR704、TPR705、TPR706、TPR707、TPR708、TPR709、TPR710、TPR711、TPR712、TPR713、TPR714、TPR715、TPR716、TPR717、TPR718、TPR719、TPR720、TPR721、TPR722、TPR723、TPR724、TPR725、TPR725、TPR726、TPR727、TPR728、TPR729、TPR730、TPR731、TPR732、TPR733、TPR734、TPR735、TPR736、TPR737、TPR738、TPR739、TPR740、TPR741、TPR742、TPR743、TPR744、TPR745、TPR746、TPR747、TPR748、TPR749、TPR750、TPR751、TPR752、TPR753、TPR754、TPR755、TPR756、TPR757、TPR758、TPR759、TPR760、TPR761、TPR762、TPR763、TPR764、TPR765、TPR766、TPR767、TPR768、TPR769、TPR770、TPR771和TPR772。

目的蛋白质的其它实例可见于下文中的表7-22。在具体的实施方案中，可表达表7-22中所列的蛋白质的剪接形式和/或SNP。在具体的实施方案中，可在细胞中共表达表7-22中所列的任何蛋白质的任何组合。

在一个方面中，本发明的细胞和细胞系适合用于基于细胞的测定。此类细胞和细胞系随着时间推移一致性且可重现性地表达目的蛋白质，因此在此类测定中特别有利。

在另一个方面中，本发明提供了适合于产生生物分子的细胞和细胞系。用于该用途的细胞和细胞系的特征在于，例如具有功能或能够变得具有功能的蛋白质或多肽的一致表达。本发明还提供了用于产生稳定地表达RNA或目的蛋白质的细胞和细胞系。通过使用本发明的方法，可产生表达功能性形式的任何所需蛋白质，包括复合蛋白质例如多聚体蛋白质(例如，异源多聚体蛋白质)和具有细胞毒性的蛋白质的细胞和细胞系。本文中公开的方法使得可能产生在本发明之前未曾产生的稳定地表达功能性蛋白质的经改造的细胞和细胞系。不受理论束缚，据认为，因为所述方法允许在任何所需条件组下研究非常大量的细胞或细胞系，所以其使得可能鉴定原本不能在更小的群体中产生或不能以其它方式被发现的并且最适合于在所需条件下表达功能性形式的所需蛋白质的稀有细胞。不受理论束缚，许多目的RNA和蛋白质在特化细胞(例如，特定组织的细胞、特化组织的细胞、特化功能的细胞、具有特化细胞区域或区室的细胞、感觉细胞、神经元、味蕾、上皮细胞、干细胞、癌细胞、肌肉细胞、眼睛的细胞、产生抗体的细胞、产生高水平蛋白质的细胞以及本文中公开的各种细胞类型)中正常表达。特化细胞可为目的RNA或蛋白质的非细胞毒性或天然功能性或生理表达提供专门的生物或细胞环境、背景或基因组成。例如，特化细胞可为目的RNA或蛋白质的充足、适当或最佳表达、化学计量、产量、折叠、装配、翻译后修饰、靶向、膜整合、分泌、功能、药理学或生理学提供因子，包括辅助因子或伴侣分子或特化细胞区室。对细胞或细胞系进行改造以表达它们非正常表达的目的RNA或蛋白质可导致在其中既未重现也未接近用于目的RNA或蛋白质的最佳表达或功能而无相关细胞毒性的这些条件下产生细胞或细胞系。

可被改造以表达目的RNA或蛋白质的细胞的许多群体由遗传上多样的单个细胞的群体组成，在所述群体中甚至染色体的数目在细胞间可以变化。包含在这些群体中的稀有细胞(与此类群体的普通细胞相比较的)可提供对于在细胞群体的普通细胞中非正常表达的目的RNA或蛋白质的天然或非细胞毒性表达、功能、药理学或生理学来说是足够的、优选的、高于平均值的、改良的或最佳的生物或细胞环境或背景或基因组成。

在某些实施方案中，本发明允许分析数百万个经改造以包含目的RNA或蛋白质的细胞群体的单个细胞，使得可快速或个别地检测或分离与目的RNA或蛋白质的表达相容的单个细胞，即使这仅代表细胞群体中稀有的细胞。在某些实施方案中，可以检测并分离与目的RNA或蛋白质的能存活的、非细胞毒性、功能性或天然的表达相容的稀有细胞，所述目的RNA或蛋白质通常在经改造以表达目的RNA或蛋白质的细胞群体的普通细胞中导致细胞毒性或细胞死亡。在某些实施方案中，根据本发明，从经改造以表达目的RNA或蛋白质的细胞群体中检测到或分离出的各个阳性细胞可包含不同的绝对或相对水平的各个目的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，各个阳性细胞还可提供或包含不同的细胞或遗传背景(例如，不同数目的染色体或染色体片段、基因、基因序列、表达谱或内源性表达的蛋白质或RNA(包括mRNA或siRNA)，或目的RNA或蛋白质的辅助因子)作为目的RNA或蛋白质的表达或功能的细胞背景。在某些实施方案中，本发明提供了对于与能够在培养中维持分离的细胞的新型方法偶联的目的RNA或蛋白质的表达呈阳性的许多经改造的细胞的分离。在某些实施方案中，可使用对于所有维持的细胞而言基本上相同的条件进行分离的细胞在培养中的维持。在某些实施方案中，这反过来使得能够在培养中随着时间推移测试(包括功能测试)分离的细胞以鉴定和产生功能稳定的细胞或细胞系(其包含表达的目的RNA或蛋白质的所需或提高的表达、功能、生理学或药理学)。在某些实施方案中，通过分离、维持和功能测试对于目的RNA或蛋白质的表达呈阳性的许多细胞，所述方法允许鉴定或产生功能性、存活地且稳定地表达所述目的RNA或蛋白质(甚至是在经改造以表达目的RNA或蛋白质的细胞群体的普通细胞中非正常表达的目的RNA或蛋白质)的细胞。

事实上，在某些实施方案中，所述方法经发现导致之前被认为当在经改造的细胞中表达时具有细胞毒性的RNA或蛋白质的功能性和稳定表达，这证明了所述方法可用于产生细胞的功效，所述细胞包含之前不能在经改造的细胞中建模的此类蛋白质的非细胞毒性表达和功能所必需的并且与之相容的条件。

在另外的方面，本发明提供了细胞系的相匹配实验对象组，即针对一个或多个生理特性匹配的克隆细胞系的集合。因为本发明的方法允许在相同的条件下维持和表征大量细胞系，所以可以鉴定具有相似生理特性的任何数目的细胞系。通过使用本发明的方法，可能制备包含任何所需数目的细胞系的相匹配实验对象组或补足。可在相同的条件(包括细胞密度)下维持此类相匹配实验对象组，并且因此对于高通量筛选和其中需要比较且鉴定细胞系之间的差异的其它用途有用。还在本发明内的是针对生长速率匹配的细胞系的相匹配实验对象组。

在另一个方面中，本发明提供了用于产生细胞或细胞系的方法，所述细胞或细胞系表达具有先前未知功能和/或关于其的配体先前未得到鉴定的蛋白质。这样的蛋白质可以是已知的天然存在的蛋白质、之前未知的天然存在的蛋白质、已知的天然存在的蛋白质的之前未知的形式或任何前述蛋白质的修饰形式。

任何所需细胞类型可用于本发明的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。细胞可以以它们的天然状态或不以其天然状态表达目的蛋白质。可以使用的真核细胞包括但不限于真菌细胞例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。可以使用的动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞。原代或永生化细胞可以衍生自真核生物体的中胚层、外胚层或内胚层。细胞可以是内皮细胞、表皮细胞、间充质细胞、神经细胞、肾细胞、肝细胞、造血细胞或免疫细胞。例如，细胞可以是肠隐窝或绒毛细胞、克拉拉细胞、结肠细胞、肠细胞、杯状细胞、肠嗜铬细胞、肠内分泌细胞。在本发明中有用的哺乳动物细胞包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、山羊、绵羊、猪、啮齿类动物(包括大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠)、有袋动物、兔、犬和猫。细胞可以是分化细胞或干细胞，包括胚胎干细胞。

本发明的细胞可以是原代的、转化的、致癌转化的、病毒转化的、永生化的、条件转化的、外植体、组织切片的细胞、动物、植物、真菌、原生生物、古细菌和真细菌、哺乳动物、鸟类、鱼类、爬虫类动物、两栖类动物和节肢动物、禽类、鸡、爬行动物、两栖动物、蛙、蜥蜴、蛇、鱼、蠕虫、鱿鱼、龙虾、海胆、海参、海鞘、苍蝇、鱿鱼、水螅、节肢动物、甲虫类、鸡、七鳃鳗、稻鱼(ricefish)、斑胸草雀、河豚和斑马鱼的细胞。

此外，细胞例如血液/免疫细胞、内分泌(甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)、GI(口、胃、肠)、肝、胰腺、胆囊、呼吸道(肺、气管、咽)、软骨、骨、肌肉、皮肤、毛发、泌尿道(肾、膀胱)、生殖(精子、卵子、睾丸、子宫、卵巢、阴茎、阴道)、感觉(眼、耳、鼻、口、舌、感觉神经元)，血液/免疫细胞例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞；粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红血细胞(网织红细胞)、肥大细胞、凝血细胞/巨核细胞、树突状细胞；内分泌细胞例如甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)，神经系统细胞例如：胶质细胞(星形胶质细胞、小神经胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星形细胞、核链细胞、伯特彻氏细胞、脑下垂体(促性腺细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺细胞、亲驱体细胞、催乳激素细胞)、呼吸系统细胞例如肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞；循环系统细胞例如心肌细胞、周细胞；消化系统细胞例如胃(胃主细胞、胃壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝(肝细胞、肝巨噬细胞)、胰腺(β细胞、α细胞)、胆囊；软骨/骨/肌肉/外皮系统细胞例如成骨细胞、骨细胞、破骨细胞，牙齿细胞(成牙骨质细胞、成釉质细胞)，软骨细胞：成软骨细胞、软骨细胞、皮肤/毛发细胞：丝胞(trichocyte)、角化细胞、黑色素细胞、肌肉细胞：肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞，泌尿系统细胞例如足细胞、肾小球旁细胞、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞例如精子、支持细胞、莱迪希细胞、卵子、卵泡细胞；感觉细胞例如柯蒂氏器细胞、嗅觉上皮、温度敏感性感觉神经元、梅克尔细胞、嗅觉感受器神经元、疼痛敏感性神经元、感光细胞、味蕾细胞、前庭器官的毛细胞、颈动脉体细胞用于制备本发明的细胞或细胞系。

有用的植物细胞包括根、茎和叶细胞，植物组织包括分生组织、薄壁组织、厚角组织、厚壁组织，分泌组织、木质部、韧皮部、表皮、周皮(树皮)。

用于本发明的细胞和细胞系的细胞还包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、确定的神经元细胞系、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤、成纤维细胞、横纹肌肉瘤、背根神经节细胞、NS0细胞、CV-1(ATCC CCL70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCCCCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、HEK-293(ATCC CRL1573)和PC12(ATCC CRL-1721)、HEK293T(ATCC CRL-11268)、RBL(ATCCCRL-1378)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、MDCK(ATCC CCL-34)、SJ-RH30(ATCC CRL-2061)、HepG2(ATCC HB-8065)、ND7/23(ECACC92090903)、CHO(ECACC 85050302)、Vero(ATCC CCL 81)、Caco-2(ATCC HTB 37)、K562(ATCC CCL 243)、Jurkat(ATCCTIB-152)、Per.C6(Crucell，Leiden，The Netherlands)、Huvec(ATCC人原代PCS 100-010、小鼠CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH-7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC CRL 10852)、A549(ATCCCCL 185)、IMR-90(ATCC CCL 186)、MCF-7(ATC HTB-22)、U-2OS(ATCC HTB-96)、T84(ATCC CCL 248)或任何确定的细胞系(极化的或非极化的)或可从储库例如美国典型培养物中心(ATCC，10801University Blvd.Manassas，Va.20110-2209USA)或欧洲细胞培养物中心(ECACC，Salisbury Wiltshire SP40JGEngland)获得的任何细胞系。

此外，用于本发明的方法的细胞是易于在含血清培养基、不含血清培养基、无任何动物源性产物的完全已知培养基中生长的哺乳动物细胞和可将其从此类条件之一转换至另一种条件的细胞。

本发明的细胞包括已向其中引入了编码目的蛋白质的核酸(或在异源多聚体蛋白质的情况下，编码蛋白质的一个或多个亚单位的核酸)的细胞。经改造的细胞还包括已向其中引入了用于转录激活编码目的蛋白质的内源序列(或用于转录激活编码异源多聚体蛋白质的一个或多个亚单位的内源序列)的核酸的细胞。经改造的细胞还包括包含编码目的蛋白质的核酸的细胞，所述目的蛋白质可通过与激活化合物接触或在翻译后修饰之后、或用酶(包括但不限于蛋白酶)处理后或与所述酶接触后而被激活。经改造的细胞还包括上述的组合，即，从所引入的编码其的核酸表达异源多聚体蛋白质的一个或多个亚单位并且通过基因激活表达蛋白质的一个或多个亚单位的细胞。

可使用已知的方法将任何核酸引入细胞。用于将核酸引入细胞的技术在众所周知的并且可被本领域普通技术人员容易地理解。所述方法包括但不限于转染、病毒递送、蛋白质或肽介导的插入、共沉淀法、基于脂质的递送试剂(脂转染)、细胞转染剂、脂多胺递送、树状大分子递送剂、电穿孔或机械递送。转染剂的实例是GENEPORTER、GENEPORTER2、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX-10、TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LT1、TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAISHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CLONFECTIN和METAFECT

当引入两种或更多种核苷酸序列，例如编码异源多聚体蛋白质的两个或更多个亚单位的序列或编码两种或更多种不同目的蛋白质的序列时，可将序列引入到相同的载体上，或优选引入到分离的载体上。DNA可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其混合物。在某些实施方案中，编码目的蛋白质或部分目的蛋白质的核酸不包括另外的序列，使得表达具有与蛋白质的生理功能相比较可改变细胞的功能的另外氨基酸的蛋白质。

在某些实施方案中，与编码野生型蛋白质的核酸序列相比较，编码目的蛋白质的核酸包含一个或多个置换、插入、突变或缺失。在包括含有突变的核酸的实施方案中，突变可以是随机突变或定点突变。此类核酸变化可以导致或可以不导致氨基酸置换。在某些实施方案中，核酸是编码目的蛋白质的核酸的片段。作为片段或具有此类修饰的核酸编码保留目的蛋白质的至少一种生物学特性的多肽。

本发明还包括稳定地表达下列核酸的细胞和细胞系：其序列与编码目的蛋白质的“野生型”序列具有至少约85％同一性的核酸、或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸。在某些实施方案中，与那些序列相比较，序列同一性为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。本发明还包括这样的细胞和细胞系，其中编码目的蛋白质的核酸在严格条件下与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸杂交。

在某些实施方案中，细胞或细胞系包含编码蛋白质的核酸序列，与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸比较，所述核酸序列包括至少一个置换。置换可以包括小于10、20、30或40个核苷酸，或高达或等于1％、5％、10％或20％的核苷酸序列。在某些实施方案中，被置换的序列可以与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸基本等同(例如与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)，或是在严格条件下能够与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸杂交的序列。

在某些实施方案中，细胞或细胞系包含编码蛋白质的核酸序列，所述核酸序列包括来自野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸的插入或缺失。插入或缺失可以小于10、20、30或40个核苷酸，或高达或等于1％、5％、10％或20％的核苷酸序列。在某些实施方案中，插入或缺失的序列可以与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸基本等同(倒如与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)，或是在严格条件下能够与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸杂交的序列。

在某些实施方案中，核酸置换或修饰导致氨基酸改变，例如氨基酸置换。例如，目的野生型蛋白质的氨基酸残基或衍生自除人外的物种的对应氨基酸可以由保守或非保守置换替换。在某些实施方案中，原始氨基酸序列与经修饰的氨基酸序列之间的序列同一性可以相差约1％、5％、10％或20％，或不同于与其基本等同的序列(例如与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有与亲本氨基酸残基具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的另一个氨基酸残基置换的那种置换。在其中2个或更多个氨基酸序列彼此相差保守性置换的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整以校正置换的保守性质。用于进行此类调整的方法是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。

拥有具有相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可选地，保守氨基酸置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中公开的PAM250对数可能性矩阵中具有正值的任何改变。“适度保守的”替换是在PAM250对数可能性矩阵中具有非负值的任何改变。

目的蛋白质中的保守修饰将产生具有与未修饰的蛋白质的功能和化学特征相似的(即，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％相同)的功能和化学特征的蛋白质。

在一个实施方案中，宿主细胞是胚胎干细胞，所述干细胞然后用作产生产目的蛋白质的转基因动物的基础。将稳定地表达功能性目的蛋白质的胚胎干细胞直接植入生物体，或可将其细胞核转移入其它受体细胞，然后可将它们植入，或可将它们用于产生转基因动物。在某些实施方案中，可以以所需短暂和/或组织特异性表达在动物中表达所述蛋白质。

如将被本领域普通技术人员所理解的，适合用于选择的宿主细胞的任何载体可用于将编码目的蛋白质的核酸引入宿主细胞。当将超过一种载体用于例如引入两个或更多个不同的亚单位或两种或更多种目的蛋白质时，所述载体可以是相同类型或可具有不同类型。

可用于将核酸引入宿主细胞的载体的实例包括但不限于质粒、病毒(包括逆转录病毒和慢病毒)、粘粒、人造染色体，其可包括例如pCMVScript、pcDNA3.1Hygro、pcDNA3.1neo、pcDNA3.1puro、pSV2neo、pIRES puro、pSV2zeo。可用于产生本发明的细胞和细胞系的示例性哺乳动物表达载体包括：pFN11A(BIND)

pGL4.31、pFC14A(

7)CMVpFC14K(

7)CMV

pFN24A(

7)CMVd3pFN24K(

7)CMVd3

HaloTag^TM pHT2、pACT、pAdVAntage^TM、

pBIND、

增强子、

启动子、pCI、pCMVTNT^TM、pG5luc、pSI、pTARGET^TM、pTNT^TM、pF12A RM

pF12K RMpRegneo、pYES2/GS、pAd/CMV/V5-DEST

载体、pAd/PL-DEST^TM

载体、

pDEST^TM27载体、

pEF-DEST51载体、

pcDNA^TM-DEST47载体、pCMV/Bsd载体、pEF6/HisA、B和C、pcDNA^TM6.2-DEST、pLenti6/TR、pLP-AcGFP1-C、pLPS-AcGFP1-N、pLP-IRESneo、pLP-TRE2、pLP-RevTRE、pLP-LNCX、pLP-CMV-HA、pLP-CMV-Myc、pLP-RetroQ和pLP-CMVneo。

在某些实施方案中，载体包含表达控制序列例如组成型或条件型启动子，优选使用组成型启动子。本领域普通技术人员将能够选择此类序列。例如，适当的启动子包括但不限CMV、TK、SV40和EF-1α。在某些实施方案中，启动子是诱导型启动子、温度调节型启动子、组织特异性启动子、阻抑型启动子、热激型启动子、发育型启动子、细胞谱系特异性启动子、真核生物启动子、原核生物启动子或短暂启动子或上述任一种或多种的未修饰的或诱变的、随机化的、改组的序列的组合或重组。在其它实施方案中，通过基因激活或附加体表达目的蛋白质。

在某些实施方案中，载体缺乏可选择标记或抗药基因。在其它实施方案中，载体任选地包含编码可选择标记(例如赋予药物或抗生素抗性的蛋白质或更常见地对细胞施加选择压力的任何产物)的核酸。当使用超过一种载体时，各载体具有相同或不同的抗药性或其它选择压力标记。如果超过一种抗药性或选择压力标记相同，那么可通过提高药物的水平来实现同时选择。适当的标记对于本领域普通技术人员来说是众所周知的，并且包括但不限于赋予对下列物质的任一种抗性的多肽产物：新霉素/G418、嘌呤霉素、潮霉素、博来霉素(Zeocin)、氨甲喋呤和杀稻瘟菌素。虽然药物选择(或使用任何其它适当的选择标记的选择)不是产生本发明的细胞和细胞系的必需步骤，但其可用于富集稳定转染的细胞的转染的细胞群体，前提是转染的构建体经设计赋予抗药性。如果使用信号探针进行表达目的蛋白质的细胞的随后选择，那么转染后过早的选择可导致一些可能只是被瞬时转染而非稳定转染的阳性细胞。然而，该效应可通过使充足的细胞传代以允许稀释转染的细胞中的瞬时表达来降至最低程度。

可使用本领域普通技术人员已知的多种化合物或处理来将选择压力施用于细胞。不受理论束缚，可通过将细胞与对于细胞生长、细胞周期的进行或成活力为最适度以下或有害的条件接触来施加选择压力，使得选择与不耐受或不抗这些条件的细胞相比较，耐受或抗这些条件的细胞。可用于施加或施用选择压力的条件包括但不限于减缓或阻止细胞生长或生物学构建块的合成的抗生素、药物、诱变剂、化合物、中断RNA、DNA或蛋白质合成的化合物、细胞生长或活力所必需的营养物、氨基酸、碳水化合物或化合物从细胞生长或培养基中的除去或限制、处理例如在对于细胞生长为最适度以下的条件例如在最适度以下的温度、大气条件(例如，二氧化碳、氧气或氮或湿度的百分数)或在营养贫乏的培养基条件下细胞的生长或维持。不受理论束缚，选择压力可用于选择赋予或编码对选择压力的抗性或耐受性的标记、因子或基因。例如，(i)首先可将细胞群体与赋予对选择压力的抗性或耐受性的这样的标记、因子或基因接触或将其引入所述细胞，使得每一个细胞可吸收或经修饰以包含不同水平的所述标记、因子或基因或不包含所述标记、因子或基因，和(ii)然后可将群体与所述标记、因子或基因赋予对其的抗性或耐受性的选择压力接触，使得包含所述标记、因子或基因的细胞包含与不包含所述标记、因子或基因的细胞相比较的生长优势。不受理论束缚，包含升高的水平的标记、因子或基因的细胞将显示按比例增加的对相应选择压力的耐受性。选择压力可用于选择包含所需性质、与所述性质相关的目的RNA或蛋白质、具有赋予对相应选择压力的耐受性或抗性的标记、因子或基因的RNA或蛋白质的细胞。不受理论束缚，可通过在选择过程中施用按比例增加的水平或量的选择压力来选择具有按比例升高的水平的期望性质、目的RNA或蛋白质的细胞。如果想要包含多个性质、RNA或蛋白质的细胞，那么此类性质、RNA或蛋白质中的每一种可以与赋予对相同或不同形式的选择压力的抗性的相关标记、因子或基因相关，并且可将使用所有此类选择压力的选择用于选择包含所有所需性质、目的RNA或蛋白质的细胞。在选择具有所需性质、目的RNA或蛋白质的细胞后，可在相同的、升高的或降低的水平、浓度、剂量或处理的在选择过程中使用的选择压力下维持选择的细胞。在一些情况下，选择压力的水平、浓度、剂量或处理的周期性增加可用于选择扩增包含相应地不断升高的水平的期望性质、目的RNA或蛋白质的细胞。在一些情况下，在使用选择压力选择细胞后，使用降低的水平、浓度、剂量或处理的选择压力维持选择的细胞以帮助确保被选择的期望性质、RNA或蛋白质在维持的细胞中得到保持。

所使用的选择压力的水平可由本领域普通技术人员来测定。这可以例如通过进行杀菌曲线实验(kill curve experiment)来进行，在所述实验中在不断升高的水平、剂量、浓度或处理的选择压力和针对阴性细胞选择的时间范围(仅在或优先在所需时间范围内(例如，1至24小时、1至3天、3至5天、4至7天、5至14天、1至3周、2至6周、1至2个月、1至3个月、4、5、6、7、8、9或超过10个月))下测试对照细胞和包含抗性标记、因子或基因的细胞。可使用的选择压力的确切水平、浓度、剂量或处理取决于所使用的细胞、其本身所需性质、赋予对选择压力的抗性或耐受性的标志物、因子或基因，以及在被选择的细胞中所需期望性质的水平，并且本领域普通技术人员可容易地理解如何基于这些考虑测定适当的范围。在一些情况下，在选择后，将低于1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的选择过程中使用的水平、浓度、剂量或处理的选择压力用于选择的细胞的随后维持。在其中使用多个不同的选择压力的一些情况下，可在选择的细胞的随后维持中将在选择过程中使用的各选择压力的水平、浓度、剂量或处理例如降低至低于在其本身选择过程中所使用的1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。在某些实施方案中，选择此类降低的水平、浓度、剂量或处理使得经选择包含所需性质、RNA或蛋白质的细胞在培养中随着时间推移继续包含所需性质。在某些实施方案中，在于培养中维持细胞一段时间的过程中使用至多防止选择的细胞中所需性质丢失或减少所必需的水平、浓度、剂量或处理，例如以使细胞与对细胞有害的任何可能的效应的接触降至最低程度，所述有害效应因使用比细胞保持依据其而选择所述细胞的性质、RNA或蛋白质所必需的更高的水平、浓度、剂量或处理引起。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系能够保持在不存在选择压力的情况下针对其(例如，目的蛋白质或RNA的表达)选择所述细胞的性质、RNA或蛋白质至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120或150天。可在与选择过程中使用的水平、浓度、剂量或处理的选择压力相比较相同的、升高的或降低的水平、浓度、剂量或处理的选择压力存在的情况下培养此类细胞和细胞系。可在任何不存在选择压力的情况下培养此类细胞和细胞系。在其中水平、浓度、剂量或处理降低的情况下，它们可分别被降低至低于选择过程中使用的水平、浓度、剂量或处理的1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。在其中细胞和细胞系表达超过一种目的蛋白质或RNA，并且使用不同的选择压力选择各目的蛋白质或RNA的表达的情况下，在选择后细胞和细胞系的培养过程中可独立地选择各选择压力的水平、浓度、剂量或处理，例如，各选择压力在细胞培养中可被独立地选择为不存在，或与在选择过程中使用的其各自的水平、浓度、剂量或处理相比较处于相同的或升高的或降低的水平、浓度、剂量或处理。在其中水平、浓度、剂量或处理被降低的情况下，它们可被降低至在选择过程中使用的各自水平、浓度、剂量或处理的1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列还包含标签。此类标签可编码例如HIS标签、myc标签、血凝素(HA)标签、蛋白质C、VSV-G、FLU、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白、FLAG、BCCP、麦芽糖结合蛋白标签、Nus-标签、Softag-1、Softag-2、Strep-标签、S-标签、硫氧还蛋白、GST、V5、TAP或CBP。标签可用作测定蛋白质表达水平、细胞内定位、蛋白质间相互作用、目的蛋白质的调节或蛋白质的功能。标签还可用于纯化或分级分离蛋白质。

在表达目的RNA的细胞和细胞系的情况中，RNA可以是任何类型的RNA、包括反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、转运RNA(tRNA)、结构RNA、核糖体RNA、核不均RNA(hnRNA)和核内小RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、采取茎-环结构的RNA、采取发夹结构的RNA、包含单链RNA的RNA、包含双链RNA的RNA、结合蛋白质的RNA、结合荧光化合物的RNA、具有生物活性的RNA、编码生物活性产物的RNA、催化RNA、RNA寡核苷酸、可介导RNAi的RNA或可调节至少第二RNA的水平或活性的RNA。

在其中本发明的细胞和细胞系表达功能性目的蛋白质的实施方案中，所述蛋白质可以是任何蛋白质，包括但不限于单链蛋白质、多链蛋白质、异源多聚体蛋白质。在多聚体蛋白质的情况下，在某些实施方案中，细胞是表达组成天然蛋白质的所有亚单位。所述蛋白质可具有“野生型”序列或可以是变体。在某些实施方案中，细胞表达蛋白质，所述蛋白质包含一个或多个亚单位的变体，包括等位基因变体、剪接变体、截短变体、同种型、不同化学计量的亚单位、亚单位的不同装配体、差别折叠的形式、差异活性形式、具有不同功能性的形式、具有不同结合性质的形式、与不同辅助因子缔合的形式、在不同细胞背景中表达的形式、在不同细胞遗传背景中表达的形式、在具有不同内源性表达谱的细胞中表达的形式、差异定位的形式、嵌合形式或化学修饰的形式、酶促修饰的形式、翻译后修饰的形式、糖基化形式、蛋白酶解形式、嵌合亚单位和包含氨基酸置换(保守或非保守的)、修饰的氨基酸(包括化学修饰的氨基酸)和非天然存在的氨基酸的突变形式及其组合。由本发明的细胞或细胞系表达的异源多聚体蛋白质可包含来自2个或更多个物种的亚单位，例如来自目的蛋白质的物种同源物的亚单位。

在某些实施方案中，本发明的细胞表达两种或更多种功能性目的蛋白质。根据本发明，此类表达可来自编码全部或部分的目的蛋白质的核酸的引入，来自从内源序列激活全部或部分的目的蛋白质的转录的核酸的引入或来自其任何组合。所述细胞可表达任何所需数量的目的蛋白质。在各种实施方案中，细胞表达3、4、5、6种或更多种目的蛋白质。例如，本发明包括稳定地表达目的途径中的功能性蛋白质或来自交叉途径(包括酶促途径、信号传导途径调节途径等)的蛋白质的细胞和细胞系。在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系稳定地表达参与目的生物学途径的一种或多种功能性RNA和/或蛋白质，例如，生物学途径的蛋白质和/或RNA组分以及生物学途径的蛋白质和/或RNA调节剂和/或其一种或多种组分。在某些实施方案中，生物学途径由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45种或至少50种蛋白质组分组成。在某些实施方案中，生物学途径由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45种或至少50种RNA组分组成。其中功能性蛋白质可由本发明的细胞和细胞系稳定地表达的生物学途径的实例包括但不限于：2-花生四烯酰基甘油生物合成途径、5-羟色胺生物合成途径、5-羟色胺降解途径、5ht1型受体介导的信号传导途径、5ht2型受体介导的信号传导途径、5ht3型受体介导的信号传导途径、5ht4型受体介导的信号传导途径、乙酸盐利用途径、腺嘌呤和次黄嘌呤补救途径、肾上腺素和去甲肾上腺素生物合成途径、丙氨酸生物合成途径、尿囊素降解途径、α肾上腺素能受体信号传导途径、阿尔茨海默氏病-淀粉样蛋白分泌酶途径、阿尔茨海默氏病-早老素途径、氨基丁酸降解途径、花生四烯酰乙醇胺生物合成途径、花生四烯酰乙醇胺降解途径、雄激素/雌激素/孕酮生物合成途径、血管生成途径、通过G蛋白和β-抑制蛋白进行的血管紧张素ii-刺激的信号传导途径、细胞凋亡信号传导途径、精氨酸生物合成途径、抗坏血酸盐降解途径、天冬酰胺和天冬氨酸盐生物合成途径、ATP合成途径、由神经生长因子介导的轴突导向、由信号素介导的轴突导向、由slit/robo介导的轴突导向、B细胞活化途径、β肾上腺素能受体信号传导途径、β2肾上腺素能受体信号传导途径、β3肾上腺素能受体信号传导途径、生物素生物合成途径、血液凝固途径、安非他酮降解途径、钙粘蛋白信号传导途径、肉毒碱代谢途径、细胞周期途径、胆固醇生物合成途径、分支酸生物合成途径、昼夜节律钟系统途径、钴胺生物合成途径、辅酶A生物合成途径、辅酶A结合连接的肉毒碱代谢途径、促皮质素释放因子受体信号传导途径、半胱氨酸生物合成途径、通过rho GTP酶进行的细胞骨架调控、新嘌呤生物合成途径、新嘧啶脱氧核糖核苷酸生物合成途径、新嘧啶核糖核苷酸生物合成途径、DNA复制、多巴胺受体介导的信号传导途径、EGF受体信号传导途径、内源大麻素信号传导途径、内皮素信号传导途径、脑啡肽释放途径、fas信号传导途径、fgf信号传导途径、黄素生物合成途径、甲酰基四氢甲酸生物合成途径、果糖半乳糖代谢途径、GABA-b受体ii信号传导途径、γ-氨基丁酸合成途径、由RNA聚合酶I进行的普通转录、普通转录调控、谷氨酰胺谷氨酸盐转变途径、糖酵解途径、hedgehog信号传导途径、血红素生物合成途径、异源三聚体G-蛋白信号传导途径-gi α和gs α介导的途径、异源三聚体G-蛋白信号传导途径-gq α和go α介导的途径、异源三聚体G-蛋白信号传导途径-视杆外节光转导途径、组胺h1受体介导的信号传导途径、组胺h2受体介导的信号传导途径、组胺合成途径、组氨酸生物合成途径、亨廷顿病、通过hif激活产生的缺氧反应、由趋化因子和细胞因子信号传导途径介导的炎症、胰岛素/igf途径-分裂原活化蛋白激酶激酶/map激酶级联、胰岛素/igf途径-蛋白激酶B信号传导级联、整联蛋白信号传导途径、干扰素-γ信号传导途径、白细胞介素信号传导途径、离子型谷氨酸盐受体途径、异亮氨酸生物合成途径、jak/stat信号传导途径、亮氨酸生物合成途径、硫辛酸生物合成途径、赖氨酸生物合成途径、甘露糖代谢途径、代谢型谷氨酸受体组i途径、代谢型谷氨酸受体组ii途径、代谢型谷氨酸受体组iii途径、甲硫氨酸生物合成途径、柠檬酸甲酯循环、甲基丙二酸途径、mRNA剪接、毒蕈碱乙酰胆碱受体1和3信号传导途径、毒蕈碱乙酰胆碱受体2和4信号传导途径、正-乙酰基葡糖胺代谢、尼古丁降解途径、烟碱乙酰胆碱受体信号传导途径、notch信号传导途径、o-抗原生物合成途径、阿片类物质强啡肽原途径、阿片类物质前脑啡肽途径、阿片类物质阿黑皮素原途径、鸟氨酸降解途径、氧化性应激反应途径、催产素受体介导的信号传导途径、p38mapk途径、p53途径、通过葡萄糖剥夺进行的p53途径、p53途径反馈环1、p53途径反馈环2、泛酸生物合成途径、帕金森病、PDGF信号传导途径、磷酸戊糖途径、肽多糖生物合成途径、乙酸苯酯降解途径、苯丙氨酸生物合成途径、苯乙胺降解途径、苯丙酸盐降解途径、pi3激酶途径、纤溶酶原激活级联、脯氨酸生物合成途径、prpp生物合成途径、嘌呤代谢、磷酸吡哆醛补救途径、5-磷酸吡哆醛生物合成途径、嘧啶代谢、丙酮酸代谢、ras途径、s-腺苷甲硫氨酸生物合成途径、补救嘧啶脱氧核糖核苷酸类、补救嘧啶核糖核苷酸类、丝氨酸甘氨酸生物合成途径、琥珀酸盐至丙酸盐转化、硫酸盐同化途径、突触囊泡运输、T细胞活化途径、TCA循环、四氢叶酸酯生物合成途径、TGF-β信号传导途径、硫胺生物合成途径、硫胺代谢、苏氨酸生物合成途径、促甲状腺激素释放激素受体信号传导途径、toll受体信号传导途径、通过bzip转录因子产生的转录调节、三酰基甘油代谢、色氨酸生物合成途径、酪氨酸生物合成途径、泛素蛋白酶体途径、缬氨酸生物合成途径、加压素合成途径、VEGF信号传导途径、维生素B6生物合成途径、维生素B6代谢、维生素D代谢和途径、wnt信号传导途径以及黄嘌呤和鸟嘌呤补救途径。

其中功能蛋白质可由本发明的细胞和细胞系稳定地表达的生物途径的其它实例包括但不限于下列生物过程：氨基酸代谢(例如，氨基酸生物合成、氨基酸分解代谢，氨基酸代谢调节、氨基酸转运和其它氨基酸代谢)、转运(例如，氨基酸转运、碳水化合物转运、维生素/辅因子转运、阴离子转运、阳离子转运、脂质和脂肪酸转运、核苷、核苷酸和核酸转运、磷酸盐转运、细胞外转运和输入、小分子转运和其它转运)、细胞凋亡(例如，细胞凋亡的诱导、细胞凋亡的抑制、其它细胞凋亡以及其它细胞凋亡过程)、血液循环和气体交换、碳水化合物代谢(例如，糖类转运、二糖代谢、糖异生、糖原代谢、醣酵解、单糖代谢、其它糖类代谢、其它多糖代谢、磷酸戊糖支路、碳水化合物代谢和三羧酸途径的调节)、细胞粘着、细胞周期(例如，细胞周期控制、DNA复制、有丝分裂和其它细胞周期过程)、细胞增殖和分化、细胞结构和运动、辅酶和辅基代谢(例如，辅酶代谢、卟啉代谢、喋呤代谢、维生素/辅因子转运、维生素生物合成、维生素分解代谢和其它辅酶和辅基代谢)、发育过程(例如，外胚层发育、前轴建立/后轴建立、背/腹轴的确定、胚胎发生、内胚层发育、受精、减数分裂、中胚层发育、区段特化、性别决定、卵子发生、精子生成和运动以及其它发育过程)、电子传递(例如，铁氧还蛋白代谢、氧化磷酸化和其它电子传递途径)、动态平衡(钙离子动态平衡、葡萄糖动态平衡、生长因子动态平衡和其它动态平衡活性)、免疫和防御(例如，抗氧化作用和自由基去除、B细胞-和抗体-介导的免疫、血液凝固、补体介导的免疫、细胞因子/趋化因子介导的免疫、解毒、粒细胞介导的免疫、干扰素介导的免疫、巨噬细胞介导的免疫、天然杀伤细胞介导的免疫、应激反应、T细胞介导的免疫和其它免疫及防御方法)、细胞内蛋白质运输(例如，胞吐、胞吞、一般性小囊泡运输、溶酶体运输、线粒体运输、细胞核运输、过氧化物酶体运输和其它细胞内蛋白质运输)、脂质、脂肪酸和类固醇代谢(例如，酰基-Coa代谢、脂肪酸β-氧化、脂肪酸生物合成、脂肪酸去饱和作用、脂质及脂肪酸结合、脂质及脂肪酸运输、脂质代谢以及其它脂质、脂肪酸和类固醇代谢、磷脂代谢、脂质调控、脂肪酸和类固醇代谢、胆汁酸代谢、胆固醇代谢、类固醇激素代谢和其它类固醇代谢)、肌肉收缩、神经元活性(例如，动作电位传播、神经-神经突触传递、神经肌肉突触传递、神经递质释放和其它神经元活性)、氮代谢(例如，一氧化氮生物合成、氮利用和其它氮代谢)、非脊椎动物的过程(non-vertebrate process)、核苷、核苷酸和核酸代谢(例如，DNA复制、DNA降解、DNA重组、DNA修复、染色质包装和重塑、环核苷酸的代谢、核苷、核苷酸和核酸的运输、其它核苷、核苷酸和核酸的代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA分解代谢、RNA定位、核苷的调节、核苷酸代谢、反转录、RNA代谢、tRNA代谢、mRNA加帽、mRNA末端加工和稳定性、mRNA多腺苷酸化、mRNA剪接、普通mRNA转录活性、其它mRNA转录、mRNA转录延伸、mRNA转录起始、mRNA转录调节和mRNA转录终止)、肿瘤发生(例如，癌基因、肿瘤抑制基因和其它肿瘤发生相关过程)、磷酸盐代谢(例如，磷酸盐运输、聚磷酸盐生物合成、聚磷酸盐分解代谢、磷酸盐代谢和其它磷酸盐代谢的调节)、蛋白质代谢和修饰(例如，蛋白酶解、氨基酸活化和其它蛋白质代谢、蛋白质生物合成、蛋白质复合体装配、蛋白质折叠、翻译调节、蛋白质ADP-核糖基化、蛋白质乙酰化、蛋白质二硫键异构酶反应、蛋白质糖基化、蛋白质甲基化、蛋白质磷酸化、蛋白质-脂质修饰)、蛋白质靶向和定位(例如，不对称蛋白质定位和其它蛋白质靶向和定位)、感官知觉(例如，嗅觉、味觉、听觉、痛觉、信息素反应、视觉和其它感官知觉)、硫代谢(例如，硫氧化还原代谢和其它硫代谢)、细胞通讯(例如，细胞粘着介导的信号传导、细胞外基质蛋白质介导的信号传导、配体介导的信号传导和类固醇激素介导的信号传导)、细胞表面受体介导的信号传导(例如，细胞因子和趋化因子介导的信号传导、G-蛋白质介导的信号传导、受体蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶信号途径、受体蛋白质酪氨酸激酶信号传导途径和其它受体介导的信号途径)、细胞内信号传导级联(例如，钙介导的信号传导、jak-stat级联、JNK级联、MAPKKK级联、NF-κB级联、NO介导的信号传导和其它细胞内信号传导级联)和其它信号传导过程。

本文中公开的各种生物学途径的蛋白质和/或RNA组分以及它们彼此之间的关系对于本领域普通技术人员来说是已知的并且可见于例如英特网上的KEGG途径数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。

在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系表达至少一种参与生物学途径的功能性RNA或蛋白质。在某些实施方案中，表达目的RNA或蛋白质的本发明的细胞或细胞系还表达生物学途径的至少一种功能性RNA或蛋白质组分。在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系表达生物学途径的至少一种功能性RNA或蛋白质组分，所述RNA或蛋白质可以在或可以不在未经改造的相同类型的细胞或细胞系中表达。在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系表达足以在细胞或细胞系中赋予生物学途径的至少一种活性的生物学途径的至少两种功能性RNA或蛋白质组分，在本文中也称为“功能生物学途径的表达”。在某些实施方案中，生物学途径的表达可包括生物学途径的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种组分的表达。在某些实施方案中，生物学途径的表达可包括生物学途径的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或所有组分的表达。其中生物学途径非天然存在的细胞或细胞系中的生物学途径的至少一种功能性RNA或蛋白质组分的表达可导致细胞或细胞系中功能性生物学途径的至少一种活性的重构。其中生物学途径天然存在的细胞或细胞系中的生物学途径的至少一种功能性RNA或蛋白质组分的表达可导致细胞或细胞系中功能性生物学途径的至少一种活性的增加。其中生物学途径天然存在的细胞或细胞系中的生物学途径的至少一种功能性RNA或蛋白质组分的表达可导致细胞中途径的网络或总体活性的改变。在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系中表达的目的蛋白质可被修饰、翻译后修饰、糖基化或通过生物学途径的至少一种RNA或蛋白质组分的共表达而改变。在某些实施方案中，目的蛋白质是IgG或抗体并且途径是糖基化途径。在某些实施方案中，各自表达相同的目的蛋白质(例如抗体)的细胞系的实验对象组中的细胞系表达生物学途径(例如，糖基化途径)的至少一种RNA或蛋白质组分。在某些实施方案中，生物学途径的至少一种功能RNA或蛋白质组分可与细胞中表达的目的蛋白质相互作用(例如，短暂地或长期地修饰、改变、糖基化或结合)。然而，表达的功能性蛋白质之间的蛋白质间相互作用不是必需的。例如，本发明的细胞和细胞系可表达通过作为相同生物学途径的组分而彼此相关的两种或更多种功能性蛋白质，虽然所述两种或更多种功能性蛋白质可以不直接彼此相互作用。生物学途径可以天然存在于或可以不天然存在于表达生物学途径的两种或更多种功能性蛋白质组分的本发明的细胞或细胞系中。在第一种情况下，生物学途径的两种或更多种功能性蛋白质组分的表达可导致细胞或细胞系中生物学途径的至少一活性的增加。在后一种情况下，生物学途径的两种或更多种功能性蛋白质组分的表达可导致细胞或细胞系中整个生物学途径的至少一种活性的重构。在某些实施方案中，生物学途径的至少一种或多种组分可由细胞或细胞系天然表达。

在某些实施方案中，本发明提供了稳定地表达参与目的生物学途径的至少一种功能性蛋白质的细胞或细胞系，其中在不存在选择压力的情况下培养细胞或细胞系并且其中细胞或细胞系一致地表达如本文中所述的至少一种功能性蛋白质。可根据本发明使用的生物学途径的实例包括但不限于，参与未折叠蛋白质应答(″UPR″)的那些生物学途径；细胞生长、细胞生存、细胞死亡、细胞健康；蛋白质表达、产生、折叠、分泌、膜整合、修饰或翻译后修饰(包括糖基化或酶促修饰)；与其它细胞类型相比较，在抗体产生性细胞、哺乳动物腺细胞、涎细胞或高度表达经改造的蛋白质的细胞中富集的或更高度表达或活跃的途径。

本文中描述的任何细胞可用作表达参与生物学途径的功能性RNA或蛋白质的宿主细胞。可用于表达参与生物学途径的至少一种功能性RNA或蛋白质的细胞的实例包括但不限于：CHO、CHOK1、CHOKiSV、PerC6、NS0、293、293T和昆虫细胞。在某些实施方案中，CHO细胞可用于表达UPR途径的至少一种组分。在某些实施方案中，CHO细胞可用于表达糖基化途径的至少一种组分。在一些其它实施方案中，此类细胞还可表达被糖基化的目的蛋白质(例如，抗体)。

在某些实施方案中，在将编码或激活参与生物学途径的功能性目的蛋白质的转录的核酸引入宿主细胞之前，宿主细胞不表达途径的任何组分。在其它实施方案中，在将编码或激活参与生物学途径的功能性目的蛋白质的转录的核酸引入宿主细胞之前，宿主细胞表达途径的至少1、2、5、10、15、20或至少25种组分。

在某些实施方案中，除了表达生物学途径的一种或多种功能性蛋白质组分外，本发明的细胞和细胞系还表达一种或多种功能性蛋白质，所述功能性蛋白质例如通过影响生物学途径中的一种或多种功能性蛋白质组分的表达或功能来调节生物学途径和/或至少一种其组分。此类效应可包括但不限于：生物学途径中一种或多种功能性蛋白质的翻译后修饰(例如，糖基化)、产率、折叠、装配和/或分泌。可参与生物学途径(例如，参与UPR、细胞生存、蛋白质生产、折叠、装配、修饰、糖基化、蛋白酶解、分泌、至细胞的膜的整合、细胞表面呈递或此类途径的组合)的基因或RNA(包括突变的、剪接的和加工的形式)以及由此类基因或RNA编码的表达产物的实例包括但不限于：剪接的ATF6a、IRE1a、IRE1b、PERCDC、ATF4、YYI、NF-YA、NF-YB、NF-YC、剪接的XBP1和EDEM1(UPR基因)；NRF2、HERP、XIAP、GADD34、PPI a、b和g以及DNAJC3(关闭基因)；剪接的BLIMP-1和XBP1(B细胞中表达的基因)；CRT(CaBP3)、CNX、ERp57(PDIA3)、BiP、BAP、ERdj3、CaBP1、GRP94(CaBP4)、ERp72(PDIA4)和亲环蛋白B(折叠/分泌基因-I类伴侣分子)；BiP、BAP、ERdj3、CaBP1、GRP94(CaBP4)、ERp72(PDIA4)和亲环蛋白B(2类伴侣分子)；SDF2-L(糖基化基因)；ERO1a和b、ERAD、甘露糖苷酶1、HRD1(氧化基因)；STC1和2、SERCA1和2、COD1(钙泵)；INO1、SREBP1DC、SREBP2DC和PYC(脂肪生成/代谢基因)；Sec61Pa、b和g(运输/膜整合基因)；以及Bcl-2sp、Bcl-xL、Bim、Ku70、VDAC2、BAP31和4-3-3(细胞生存/抗细胞凋亡基因)。

在某些实施方案中，除了第一目的蛋白质或功能性生物学途径或其一种或多种组分的表达外，本发明的细胞和细胞系还表达至少第二目的蛋白质，其中第二目的蛋白质的表达受第一目的蛋白质或功能性生物学途径或其一种或多种组分的表达影响或被其改变。此类效应的实例包括但不限于在mRNA转录、剪接、运输、蛋白质翻译、翻译后修饰(例如，糖基化)和蛋白质运输、折叠、装配、膜整合、分泌和总产量(产率)水平上的效应。例如，第一目的蛋白质或功能性生物学途径或其一种或多种组分的表达可导致增加的或更高效的或正确的第二目的蛋白质的mRNA转录、剪接、运输、蛋白质翻译、翻译后修饰(例如糖基化)以及蛋白质运输、折叠、装配、膜整合、分泌和/或总体产量(产率)。在某些实施方案中，第二目的蛋白质是生物制品。在下文中进一步提供了生物制品的实例。在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系共表达抗体和糖基化途径。

在某些实施方案中，特别地，由方法中使用的细胞或细胞系表达的蛋白质是关于其的功能细胞系先前在这样的细胞类型(所述细胞类型在未进行细胞或基因改造的情况下通常不表达所述蛋白质)的细胞中未获得的蛋白质。不受理论束缚，认为此类细胞系迄今仍不可能的某些原因包括：蛋白质是高度复杂的或仅在未进行细胞或基因改造的特化或稀有的细胞中表达并且如果不制备大量表达蛋白质的细胞，仍不可能鉴定其中蛋白质可以被适当表达、装配、修饰、定位、赋予功能、与辅助因子缔合或与细胞毒性无关的可能稀有的经改造的细胞之一；或因为没有已知的蛋白质配体或调节剂用于鉴定表达功能形式的蛋白质的细胞或细胞系；或因为当在其天然背景外表达时，例如在未天然表达其的背景中，蛋白质是细胞毒性的。

可制备一致地表达任何目的蛋白质的本发明的细胞和细胞系，所述目的蛋白质包括但不限于位于细胞质中的蛋白质、与细胞的至少一种膜整合或结合的蛋白质、细胞表面定位的蛋白质或分泌的蛋白质或此类蛋白质的任何组合。此类蛋白质包括异源多聚体离子通道、配体门控的(例如GABA A受体)、离子通道(例如CFTR)、异源多聚体离子通道、电压门控的(例如NaV)、异源多聚体离子通道、非配体门控的(上皮钠通道，ENaC)、异源二聚体GPCR(例如阿片类受体、味觉受体，包括甜、鲜和苦味受体)、其它GPCR、孤儿GPCR、GCC、阿片类受体、生长激素受体、雌激素/hgh、核或膜结合的TGF受体、PPAR核激素受体、烟碱/Ach和免疫受体例如B细胞/T细胞受体、化学感受受体例如酸、凉、冷、温、热、脂肪、脂肪酸或脂质的味道或感觉、奶味、触摸、疼痛、口感和刺痛感的受体。

本发明的细胞和细胞系可表达功能性蛋白质，包括表7-22中所列的任何蛋白质或蛋白质的组合(哺乳动物G蛋白、人孤儿GPCR、人阿片类受体、人嗅觉受体、犬嗅觉受体、蚊子嗅觉受体、其它异源多聚体受体和GABA受体)。

本发明的细胞和细胞系具有使得它们对于这样的任何用途特别有利的许多属性，所述任何用途中希望细胞随着时间推移一致地表达功能性目的蛋白质。术语“稳定的”或“一致的”当应用于蛋白质的表达和蛋白质的功能时，意欲使本发明的细胞和细胞系和具有瞬时表达或可变功能的细胞区分，如由本领域普通技术人员应当理解的术语“稳定表达”和“瞬时表达”。本发明的细胞或细胞系可具有功能蛋白质的稳定或一致的表达至少2-4天，所述稳定或一致的表达具有小于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20％的改变。

在某些实施方案中，可将本发明的细胞或细胞系的稳定性与瞬时表达相区别。

在某些实施方案中，可在不存在针对一种或多种目的RNA或蛋白质的选择压力的情况下维持本发明的细胞或细胞系的稳定性。在某些实施方案中，与正常使用的或在将编码目的RNA或蛋白质的核酸引入经改造的细胞群体后立即使用的或在选择具有扩增的拷贝数的核酸的细胞或细胞系的方法中正常使用的水平或量相比较，可在最低或降低的水平或量的选择压力或药物下维持本发明的细胞或细胞系的稳定性。

在某些实施方案中，与可在相同细胞类型的一般或大多数细胞中产生的细胞或细胞系中达到的正常水平相比较，在本发明的细胞或细胞中观察到的稳定性的水平更高。

在某些实施方案中，在本发明的细胞或细胞中观察到的稳定性的水平的特征在于：与可在相同细胞类型的一般或大多数细胞中产生的细胞或细胞系中达到的正常值相比较，目的RNA或蛋白质的表达水平、活性或功能的更低的可变性。

在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系中目的RNA或蛋白质的表达的稳定性的持续时间的长度与可在相同细胞类型的一般或大多数细胞中达到的正常值相比较更长。

在某些实施方案中，可在观察到的与目的RNA或蛋白质的表达相关的细胞毒性最低或不存在(与在相同细胞类型的正常或大多数细胞中达到的值相比较)下维持本发明的细胞或细胞系的稳定性。

在某些实施方案中，可在培养中随着时间推移目的RNA或蛋白质的功能形式、功能、生理学、药理学、装配、定位、翻译后修饰、糖基化、酶促修饰、蛋白质水解修饰或目的RNA或蛋白质的化学计量的变化最小或无变化(与可在相同类型的正常或大多数细胞中达到的值相比较)下维持本发明的细胞或细胞系的稳定性。在某些实施方案中，可通过在基于细胞的测定中使用调节目的RNA或蛋白质的表达或功能的化合物表征细胞或细胞系的药理特性或反应来测定此类性质。

在各种实施方案中，本发明的细胞或细胞系表达功能性目的RNA或蛋白质，即，在生长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200天后，细胞的功能一致，其中一致的表达或一致的功能是指，经2至4天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；经5至15天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％或12％；经16至20天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％；经21至30天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；经30至40天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经41至45天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经55至75天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％；经75至100天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经101至125天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经126至150天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经151至175天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经176至200天的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经200天以上的连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。

在各种实施方案中，本发明的细胞或细胞系是稳定的，即，细胞或细胞系保持一致的目的RNA或蛋白质的表达、量、产率、功能或活性至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200天，其中“一致的”是指目的RNA或蛋白质的表达水平、量、产量、功能或活化经2至4天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；经5至15天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％或12％；经16至20天的连续细胞培养中，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％；经21至30天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；经30至40天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经41至45天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过45至50天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经过55至75天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％；经75至100天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经101至125天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经126至150天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经151至175天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经176至200天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经200天以上的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。

在各种实施方案中，本发明的细胞或细胞系是稳定的，即，细胞或细胞系保持一致的至少两种目的RNA或蛋白质的表达、量、产量、功能或活性至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200天，其中“一致的”是指目的RNA或蛋白质的表达水平、化学计量、量、产量、功能或活性经2至4天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；经5至15天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％或12％；经16至20天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％；经21至30天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；经30至40天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经41至45天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经55至75天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％；经75至100天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经101至125天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经126至150天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经151至175天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经176至200天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经200天以上的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。

可以选择具有所需性质并且稳定表达功能蛋白质的细胞。可以选择可以检测出的任何所需性质。本领域普通技术人员应知道此类特征。作为非限制性例子，此类性质包括：

脆性，形态和与固体表面的附着，通过胰蛋白酶或细胞解离试剂的单分散性，对自动化培养条件的适应性，在含血清条件下的表现，在无血清条件下的表现，对无血清悬浮条件的可转换性，形成凝块的倾向，在传代后形成单分散的细胞层的倾向，恢复力，在不同力量的流动添加步骤下保持与生长室表面附着的倾向，未破碎的核，细胞内空泡的缺乏，微生物污染的缺乏，支原体属的缺乏，病毒污染的缺乏，克隆形成能力，细胞在孔内的肉眼可见物理性质的一致性，关于在室温以下/室温/室温以上生长的倾向，关于耐受各种温度以各种时间段的倾向，细胞平衡摄取质粒/寡核苷酸/荧光探针/肽/蛋白质/化合物的倾向，细胞经受住与DMSO/EtOH/MeOH、有机溶剂/洗涤剂一起温育的倾向，细胞经受住维持的UPR诱导的倾向，细胞经受住暴露于DTT的倾向，细胞被病毒/慢病毒/粘粒载体感染的倾向，所需RNA/蛋白质的内源性表达或其缺乏，染色体数目，染色体异常，顺应在5/6/7/8/9pH下生长，对UV/诱变剂/辐射的耐受性，在改变/人工/按比例增加的生长条件(即包括反应器)下维持上述特征的能力。

本发明的细胞和细胞系具有与由常规方法产生的细胞和细胞系相比较增强的性质。例如，本发明的细胞和细胞系具有增强的表达稳定性和/或表达水平，即使当在无选择压力(包括例如抗生素或其它药物)的情况下于培养中维持时。在其它实施方案中，本发明的细胞和细胞系在各种测定中具有高的Z’值。在另外其它的实施方案中，本发明的细胞和细胞系与更常规地进行改造的细胞相比较，在它们的生理学相关的蛋白质活性的表达的背景中得到改善。这些性质增强并且改善本发明的细胞和细胞系用于任何用途的能力，无论在鉴定调节剂的测定中、用于细胞疗法、用于蛋白质生产还是任何其它用途，并且改善经鉴定的调节剂的功能属性。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系的进一步有利性质是它们在药物或其它选择压力不存在或减少的情况下稳定地表达目的蛋白质，所述药物或选择压力是常用的或可在将编码目的蛋白质的核酸引入细胞后立即使用的或可在选择具有扩增的拷贝数的核酸的细胞的方法中使用的药物或选择压力。不受理论束缚，与非正常表达目的RNA或蛋白质的细胞类型的细胞中目的RNA或蛋白质的表达相关的细胞毒性可反映：在经改造的细胞中未得到接近或重现对于目的RNA或蛋白质的非细胞毒性表达是充分的条件。在某些实施方案中，与此类目的RNA或蛋白质的表达相关的细胞毒性降低或缺乏的经改造的细胞是优选的，因为细胞毒性的降低或不存在可以表明已达到用于目的RNA或蛋白质的表达或功能的改善的条件。在某些实施方案中，经改造的细胞或细胞系可表达不天然表达的或在细胞或基因改造不存在的情况下、相同细胞类型中、在不存在相关细胞毒性下不天然表达的目的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，经改造的细胞或细胞系可表达在细胞或基因改造不存在的情况下在相同类型的细胞中不天然地功能性或正确地表达、折叠、装配、修饰、翻译后修饰、定位的或不具有活性的目的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，本发明的方法导致包含目的RNA或蛋白质的功能性、稳定的、有活力的或非细胞毒性的表达的细胞或细胞系，之前认为所述目的RNA或蛋白质当在相同细胞类型的一般或大多数细胞中表达时具有细胞毒性。因此，在优选实施方案中，在无任何选择压力的情况下在培养中维持本发明的细胞和细胞系。在其它实施方案中，在任何药物或抗生素不存在的情况下维持细胞和细胞系。如本文所使用的，细胞维持指在它们已如对于蛋白质表达所述进行选择后培养细胞。维持不指在细胞分选前在选择压力(例如抗生素)下生长细胞的任选步骤，在所述细胞分选中，引入细胞内的标记允许富集混合群体中的稳定转染株。

本发明的细胞和细胞系的无药物和无选择压力的细胞维持提供了许多优点。例如，抗药性细胞可能不以足够的水平表达共转染的目的转基因，因为选择依赖于已吸收抗药基因并且含有或不含转基因的细胞的存活。此外，细胞毒性或维持目的RNA或蛋白质的表达或功能的药物选择或其它选择压力的需要表明未达到目的RNA或蛋白质的表达或功能所需的最佳条件。此外，选择药物和其它选择压力通常是致诱变的或以其它方式干扰细胞的生理学，导致在基于细胞的测定中的偏差结果。例如，选择药物可减少对细胞凋亡的易感性(Robinson等人，Biochemistry，36(37)：11169-11178(1997))，增加DNA修复和药物代谢(Deffie等人，Cancer Res.48(13)：3595-3602(1988))，增加细胞pH(Thiebaut等人，J Histochem Cytochem.38(5)：685-690(1990)；Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993)；Simon等人，Proc Natl Acad Sci USA.91(3)：1128-1132(1994))，降低溶酶体和内涵体pH(Schindler等人，Biochemistry.35(9)：2811-2817(1996)；Altan等人，J Exp Med.187(10)：1583-1598(1998))，减小质膜电位(Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993))，增加质膜对氯化物(Gill等人，Cell.71(1)：23-32(1992))和ATP(Abraham等人，Proc Natl Acad SciUSA.90(1)：312-316(1993))的电导，以及增加小囊泡运输的速率(Altan，Proc Natl Acad Sci USA.96(8)：4432-4437(1999))。因此，本发明的细胞和细胞系允许不含由选择压力引起的假象的筛选测定。在某些优选实施方案中，在细胞分选之前或之后，本发明的细胞和细胞系不与选择压力因素例如抗生素一起培养，使得即使当未从富集的细胞群体开始时，也通过分选来分离具有所需性质的细胞和细胞系。

在表达和表达水平(RNA或蛋白质)的背景中，与通过常规方法产生的细胞和细胞系相比较，本发明的细胞和细胞系具有增强的稳定性。为了鉴定具有此类稳定表达特征的细胞和细胞系，经过时程测量细胞或细胞系的目的蛋白质表达，并且比较表达水平。稳定细胞系将在该时程自始至终继续表达(RNA或蛋白质)。在本发明的某些方面，时程可以是至少1周、2周、3周等，或至少1个月、或至少2、3、4、5、6、7、8或9个月，或其间的任何时间长度。

经分离的细胞和细胞系可以例如通过PCR、RT-PCR、qRT-PCR和单终末点RT-PCR进行进一步表征，以测定被表达(RNA)的绝对量和相对量(在多亚单位蛋白质或多种目的蛋白质的情况下)。优选地，多亚单位蛋白质的亚单位的扩增水平在本发明的细胞和细胞系中基本上是相同的。

在其它实施方案中，随着时间推移测定功能性目的蛋白质的表达。在这些实施方案中，通过比较功能测定经过时程的结果来测量稳定表达。基于功能测定的细胞和细胞系的测定提供鉴定这样的细胞和细胞系的益处，所述细胞和细胞系不仅稳定表达蛋白质(RNA或蛋白质)，还稳定产生且适当加工(例如，翻译后修饰、亚单位装配和在细胞内的定位)蛋白质，以产生功能蛋白质。

本发明的细胞和细胞系具有提供具有高重现性的测定(如由其Z′因子证明)的进一步有利性质。参见Zhang JH，Chung TD，OldenburgKR，“A Simple StatisticalParameter for Use in Evaluationand Validationof High Throughput ScreeningAssays.”J.Biomol.Screen.1999；4(2)：67-73，所述文献通过引用整体并入本文。Z’值涉及细胞或细胞系的品质，因为它反映细胞或细胞系将一致地响应调节剂的程度。Z’是考虑到跨越多孔平板对参考化合物的功能应答的信噪比范围和信号变异性(即，从孔到孔之间)的统计计算。使用得自具有阳性对照的多个孔和具有阴性对照的多个孔的数据计算Z’。根据下面方程式将其组合的标准差的比乘以3至差异因子，用1减去其平均值以得到Z’

Z′因子＝1-((3δ_阳性对照+3δ_阴性对照)/(μ_阳性对照-μ_阴性对照))

如果因子为1.0，这将指示具有理论最大Z′的理想测定，无变异性和无限的动态范围。如本文所使用的，“高Z′”指具有至少0.6、至少0.7、至少0.75或至少0.8、或0.6至1.0之间的任何小数的Z′因子。在复杂靶标的情况下，高Z′意指至少0.4或更大的Z′。接近于0的得分是不希望的，因为它指示在阳性和阴性对照之间存在重叠。在工业中，对于简单的基于细胞的测定，多达0.3的Z′得分被视为边缘得分，在0.3至0.5之间的Z′得分被视为可接受的，并且超过0.5的Z′得分被视为极佳的。无细胞或生物化学测定可以接近关于基于细胞的系统的得分，因为更高的Z′得分而趋于更低，但基于Z′细胞的系统是复杂的。

如本领域普通技术人员应认识到的，使用表达甚至单链蛋白质的常规细胞的基于细胞的测定通常也未达到高于0.5至0.6的Z′。即使在本领域中得到报告，由于其添加的复杂性，具有多亚单位蛋白质的改造表达(来自所引入的编码序列或基因激活)的细胞也将更低。此类细胞对于在测定中的使用是不可靠的，因为结果将不是可重现的。另一方面，本发明的细胞和细胞系具有更高的Z′值，并且有利地在测定中产生一致的结果。事实上，本发明的细胞和细胞系提供用于高通量筛选(HTS)相容测定的基础，因为它们一般具有与常规产生的细胞不同的值。在本发明的某些方面，细胞和细胞系导致至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z′。对于本发明的细胞和细胞系，甚至至少0.3-0.4的Z′值也是有利的，因为目的蛋白质是多基因靶标。在本发明的其它方面，即使在细胞维持多次传代后，例如，在5-20代之间(包括在5和20之间的任何整数)，本发明的细胞和细胞系也导致至少0.7、至少0.75或至少0.8的Z′。在本发明的某些方面，在维持1、2、3、4或5周或2、3、4、5、6、7、8或9个月的细胞和细胞系中，包括其间的任何时间段，细胞和细胞系导致至少0.7、至少0.75或至少0.8的Z′。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系表达目的蛋白质，其中一个或多个生理特性随着时间推移基本上保持不变。

生理特性包括除了目的蛋白质的表达外的任何可观察到的、可检测的或可测量的细胞或细胞系的性质。

在某些实施方案中，目的蛋白质的表达可改变一个或多个生理特性。生理特性的改变包括因目的蛋白质的表达而引起的生理特性的任何变化，例如，生理特性的刺激、活化或增强，或生理特性的抑制、阻断或减弱。不受理论束缚，在此类实施方案中，一个或多个一致的生理特性表明目的蛋白质的功能性表达也保持一致。在具体的实施方案中，在下文中更详细论述的与味觉受体(例如，甜味受体、鲜味受体或苦味受体)相关的一个或多个一致物理性质可用于监控功能性味觉受体的表达。

不受理论束缚，本发明提供了在一致培养条件下培养多个表达目的蛋白质的细胞或细胞系的方法，其中可选择具有目的蛋白质的一种或多种所需性质(例如稳定表达)和/或一种或多种基本上一致的生理特性的细胞或细胞系。

在一些其中可测量生理特性的实施方案中，将生理特性测定为在多个细胞或细胞系的多个细胞中测量的生理特性的平均值。在某些具体的实施方案中，测量至少10、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000或至少10,000,000个细胞的生理特性，并且平均值随着时间推移基本上保持一致。

在某些实施方案中，通过测量多个细胞或细胞系的多个细胞的生理特性来测定生理特性的平均值，其中细胞处于细胞周期的不同时间段。在其它实施方案中，使细胞在细胞周期上同步。

在某些实施方案中，在单个细胞水平上观察、检测、测量或监控生理特性。在某些实施方案中，生理特性随着时间推移在单个细胞水平上保持基本上一致。

在某些实施方案中，如果生理特性在12小时的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在1天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在2天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在5天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在10天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在20天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在30天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在40天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在50天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在60天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在70天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在80天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在90天的时间内改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性随着时间推移保持基本上一致。在某些实施方案中，如果生理特性在1代、2代、3代、5代、10代、25代、50代或100代的过程中改变不超过0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过50％，那么生理特性在一时间内保持基本上一致。

细胞生理特性的实例包括但不限于：生长速率、大小、形状、形态学、体积；DNA、RNA、蛋白质、脂质、离子、糖类或水的特征或含量；内源性的、经改造的、所引入的、被基因激活的或所有基因、RNA或蛋白质的表达或含量；对附着、悬浮、含血清、不含血清、不含动物组分、振荡、静止或生物反应器生长条件下的生长的倾向性或适应性；对在芯片、阵列、微阵列、载玻片、平皿、板、多孔板、高密度多孔板、培养瓶、滚瓶、袋或罐中或其上生长中的倾向性或适应性；对使用人工或自动化或机器人细胞培养方法的生长的倾向性或适应性；至少一个细胞的细胞器、区室或膜，包括但不限于细胞质、细胞核仁、细胞核、核糖体、粗面内质网、高尔基体、细胞骨架、光面内质网、线粒体、液泡、细胞溶胶、溶酶体、中心粒、叶绿体、细胞膜、浆细胞膜、核膜、核被膜、小囊泡(例如，分泌小泡)或至少一个细胞器的膜的丰度、水平、数量、量或组成；已获得或具有获得由一个或多个特定细胞类型或分化的、未分化的或去分化的细胞类型所共享的至少一种功能或基因表达特征(一个或多个基因的)的能力或倾向性，所述细胞类型包括但不限于：干细胞、多能性细胞、全能细胞或特化细胞或组织特异性细胞，包括：肝、肺、皮肤、肌肉(包括但不限于：心肌、骨骼肌、纹状体肌)、胰、脑、睾丸、卵巢、血液、免疫系统、神经系统、骨骼、心血管系统、中枢神经系统、胃肠道、胃、甲状腺、舌、胆囊、肾、鼻、眼、指甲、毛发的细胞、味蕾细胞或味细胞、神经元、皮肤细胞、胰细胞、血液细胞、免疫细胞、红细胞、白细胞、杀伤T细胞、内分泌细胞、分泌细胞、肾细胞、上皮细胞、内皮细胞、人、动物或植物细胞之一；吸收天然或合成化学品或分子，包括但不限于核酸、RNA、DNA、蛋白质、小分子、探针、染料、寡核苷酸(包括修饰寡核苷酸)或荧光寡核苷酸的能力或性能；抗负面影响细胞生长、功能或活力的化学品或物质的负面或有害作用的抗性或能力，包括但不限于：对感染、药物、化学品、病原体、去垢剂、UV、不利条件、冷、热、极端温度、振荡、扰动、涡旋、氧气的缺乏或低水平、营养物的缺乏或低水平、毒素、毒液类、病毒或对细胞或细胞生长具有不利影响的化合物、处理或试剂的抗性；用于体外测试、基于细胞的测定、生物化学或生物学测试、植入、细胞治疗或二次测定，包括但不限于：大规模细胞培养、小型化细胞培养、自动化细胞培养、机器人细胞培养、标准化细胞培养、药物发现、高通量筛选、基于细胞的测定、基于功能细胞的测定(包括但不限于膜电位测定、钙流测定、报告分子测定、G蛋白受体测定)、ELISA、体外测定、体内应用、二次测试、化合物测试、结合测定、淘选测定、抗体淘选测定、噬菌体展示、成像研究、显微成像测定、免疫荧光研究、RNA、DNA、蛋白质或生物制品产生或纯化、疫苗开发、细胞疗法、至生物体、动物、人或植物的植入、由细胞分泌的因子的分离、cDNA文库的制备或病原体、病毒或其它试剂的感染；以及其它可观察到的、可测量的或可检测的生理特性例如：至少一种代谢产物、脂质、DNA、RNA或蛋白质的生物合成；染色体沉默、激活、异染色质化、常染色质化(euchromoatinization)或重组；基因表达、基因沉默、基因剪接、基因重组或基因激活；RNA产生、表达、转录、加工、剪接、运输、定位或修饰；蛋白质生产、表达、分泌、折叠、装配、运输、定位、细胞表面呈递、至细胞或细胞器膜中的分泌或整合；蛋白质修饰包括但不限于翻译后修饰、加工、酶促修饰、蛋白酶解、糖基化、磷酸化、去磷酸化；细胞分裂，包括有丝分裂、减数分裂或分裂或细胞融合；高水平RNA或蛋白质产量或产率。

可使用本领域内已知的常规测定观察、检测或测量生理特性，所述测定包括但不限于参考指南和手册例如Current Protocols series中描述的测试和方法。该系统包括不同领域中的常用方案并且可通过Wiley Publishing House获得。此类参考指南中的方案举例说明了可用于观察、检测或测量细胞的生理特性的方法。本领域普通技术人员可容易地认识到此类方法的任一种或多种方法可用于观察、检测或测量本文中公开的生理特性。

可用于测量细胞区室或细胞器(包括但不限于细胞中的核糖体、线粒体、ER、rER、高尔基体、TGN、小囊泡、内涵体和质膜)的水平、活性或内容物的许多标记、染料或报告分子(包括表达为包含自发荧光蛋白的融合蛋白的蛋白质标记)与单个活细胞的测试相容。在某些实施方案中，可使用荧光激活细胞分选或细胞分选器。在某些实施方案中，可在分离、测试或产生包含目的RNA或蛋白质的细胞或细胞系的同时、之后或之前使用此类标记、染料或报告分子测试经分离或产生的包含目的RNA或蛋白质的细胞或细胞系。在某些实施方案中，一种或多种细胞区室或细胞器的水平、活性或内容物可与目的RNA或蛋白质的提高的、增加的、天然的、非细胞毒性的、有活力的或最佳的表达、功能、活性、折叠、装配修饰、翻译后修饰、分泌、细胞表面呈递、膜整合、药理学、产率或生理学相关。在某些实施方案中，可分离细胞或细胞系，所述细胞或细胞系包含与目的RNA或蛋白质的提高的、增加的、天然的、非细胞毒性的、有活力的或最佳的表达、功能、活性、折叠、装配修饰、翻译后修饰、分泌、细胞表面呈递、膜整合、药理学、产率或生理学相关的至少一种细胞区室或细胞器的水平、活性或内容物。在某些实施方案中，可分离细胞或细胞系，所述细胞或细胞系包含目的RNA或蛋白质和与目的RNA或蛋白质的提高的、增加的、天然的、非细胞毒性的、有活力的或最佳的表达、功能、活性、折叠、装配修饰、翻译后修饰、分泌、细胞表面呈递、膜整合、药理学、产率或生理学相关的至少一种细胞区室或细胞器的水平、活性或内容物。在某些实施方案中，使用细胞分选或荧光激活细胞分选进行细胞的分离。

在某些实施方案中，可在分离、测试或产生经改造以包含目的RNA或蛋白质的细胞或细胞系的同时、之前或之后，将可被改造以包含目的RNA或蛋白质的不同细胞的群体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200种另外的核酸序列接触，向所述细胞群体中引入所述核酸序列或对所述细胞群体进行改造以包含所述核酸序列。在某些实施方案中，所述另外的核酸可选自由下列组成的组：编码未折叠蛋白质应答(UPR)的调节剂的RNA、DNA或基因；在UPR中或以UPR的状态被调节的RNA、DNA或基因；调节细胞生长、细胞生存、细胞死亡、细胞健康的RNA、DNA或基因；调节RNA或蛋白质的表达、产生、折叠、分泌、产率、膜整合、修饰或翻译后修饰(包括糖基化或酶促修饰)的RNA、DNA或基因；与其它细胞类型相比较在抗体产生性细胞中富集的RNA、DNA或基因。

在某些实施方案中，细胞中至少一种核酸的表达可与目的RNA或蛋白质的提高的、增加的、天然的、非细胞毒性的、有活力的或最佳的表达、功能、活性、折叠、装配修饰、翻译后修饰、分泌、细胞表面呈递、膜整合、药理学、产率或生理学相关。在某些实施方案中，可分离包含至少一种核酸的细胞或细胞系，所述核酸与目的RNA或蛋白质的提高的、增加的、天然的、非细胞毒性的、有活力的或最佳的表达、功能、活性、折叠、装配修饰、翻译后修饰、分泌、细胞表面呈递、膜整合、药理学、产率或生理学相关。在某些实施方案中，在分离、测试或产生经改造以包含目的RNA或蛋白质的细胞或细胞系的同时、之前或之后，将可经改造以包含目的RNA或蛋白质的不同细胞的群体与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175或200种另外的核酸序列接触，向所述细胞群体中引入所述核酸序列或对所述细胞群体进行改造以包含所述核酸序列，并且可分离细胞或细胞系，所述细胞或细胞系包含目的RNA或蛋白质和与目的RNA或蛋白质的提高的、增加的、天然的、非细胞毒性的、有活力的或最佳的表达、功能、活性、折叠、装配修饰、翻译后修饰、分泌、细胞表面呈递、膜整合、药理学、产率或生理学相关的至少一种细胞区室或细胞器的水平、活性或内容物。在某些实施方案中，使用细胞分选或荧光激活细胞分选进行细胞的分离。

可使用方法和测试(包括测序、PCR方法(包括PCR、RT-PCR、qRT-PCR、RACE)、杂交方法(包括northern和southern印迹法)、FISH、原位杂交、显微术(包括荧光、电子、共焦或免疫荧光显微术)或阵列或微阵列测试例如基因芯片或蛋白质阵列)测试细胞或由细胞制得的制备物以分析DNA、RNA、蛋白质的含量、组织、表达或特征谱，例如以鉴定其表达影响、有益于或有害于靶的表达(例如通过影响其功能性、有活力或稳定的表达)或细胞生理特性的一个或多个基因的表达谱。在某些实施方案中，进行此类测试以鉴定影响、有益于或有害于目的蛋白质或目的生理特性的功能性、有活力或稳定的表达的一个或多个内源因子。

可使用方法和测试(包括离心、超速离心、漂浮(floating)、蔗糖梯度、HPLC、FPLC、亚细胞分级分离、代谢产物分析、化学组成分析、染色体分散、DAPI标记、NMR、酶测定、ELISA)来测试细胞或由细胞制得的制备物以分析或表征细胞内容物(包括代谢产物、DNA、RNA、蛋白质、膜、脂质、碳水化合物或细胞器)；

可使用测序、抗体结合ELISA或活性测定来测试由细胞产生的蛋白质以估量其序列、功能、形式、折叠、膜整合、丰度、产率、翻译后修饰、糖基化、磷酸化、切割、蛋白酶解或降解。

可通过测试细胞生长、有丝分裂、减数分裂、基因整合、基因激活、基因引入或基因表达或沉默来测试和表征细胞。在某些实施方案中，进行此类测试以鉴定任何转基因在细胞的基因组中的整合位置。

在某些实施方案中，可将根据本发明的细胞或细胞系的表达谱(例如，基因表达或蛋白质表达的谱)与参照细胞或细胞系的表达谱相比较。本领域普通技术人员已知的任何方法可用于测量一个或多个核酸或氨基酸序列的表达谱。示例性方法是基因芯片、蛋白质芯片等。在某些实施方案中，测定基因组中至少0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的基因的表达。在某些实施方案中，测定细胞中至少0.1％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的核酸或氨基酸序列。在某些实施方案中，测定基因组中至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个或超过100个基因的表达。在某些实施方案中，测定细胞中至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个或超过100个核酸或氨基酸序列。

在某些实施方案中，参照细胞或细胞系是从其产生根据本发明的细胞或细胞系的宿主细胞。在其它实施方案中，细胞或细胞系和参照细胞或细胞系来源于相同的亲本克隆。在某些实施方案中，细胞或细胞系和参照细胞或细胞系来源于相同的亲本细胞。在其它实施方案中，参照细胞或细胞系是将根据本发明的细胞或细胞系设计成与之接近的细胞类型的细胞或细胞系。此类细胞类型包括但不限于：表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基细胞(干细胞)、指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基细胞(nail bed basal cell)(干细胞)、毛干髓质细胞(medullary hair shaft cell)、皮质毛干细胞(cortical hair shaft cell)、表皮毛干细胞(cuticular hair shaft cell)、表皮毛根鞘细胞(cuticular hair rootsheath cell)、亨勒层的毛根鞘细胞、亨勒层的毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞(干细胞)、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端型尿道和阴道的复层扁平上皮的表层上皮细胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、远端型尿道和阴道的上皮细胞的基细胞(干细胞)、泌尿上皮细胞(内膀胱和尿道)、唾液腺粘液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌中的冯埃布纳腺细胞(von Ebner′sgland cell)(清洗味蕾)、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳中的耵聍腺细胞(ceruminous gland cell)(蜡分泌)、外泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外泌汗腺明细胞(小分子分泌)、顶泌汗腺细胞(香气分泌，性激素敏感的)、眼睑中的莫耳腺细胞(特化汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)、鼻中的鲍曼腺细胞(bowman′s gland cell)(清洗嗅上皮)、十二指肠中的十二指肠腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液组分，包括精子游动所需的果糖)、前列腺细胞(分泌精液组分)、尿道球腺细胞(粘液分泌)、Bartholin腺细胞(阴道润滑物质分泌)、尿道腺细胞(粘液分泌)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸和消化道的孤立杯状细胞(粘液分泌)、胃粘膜粘液细胞(粘液分泌)、胃腺产酶细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠的帕内特细胞(溶菌酶分泌)、肺脏II型肺细胞(表面活性物质分泌)、肺克拉拉细胞、垂体前叶细胞、亲躯体细胞、催乳素细胞、甲状腺激素细胞、促性腺物质、促皮质激素细胞、中间垂体细胞(intermediate pituitary cell)、分泌型促黑素细胞激素、大细胞神经分泌细胞(分泌型催产素和/或分泌型加压素)、肠和呼吸道细胞(分泌血清素、分泌内啡肽、分泌生长抑素、分泌促胃液素、分泌分泌素、分泌胆囊收缩素、分泌胰岛素、分泌胰高血糖素和/或分泌铃蟾肽)、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、肾上腺分泌型类固醇激素(盐皮质激素类和糖皮质激素类)、分泌睾酮的睾丸的莱迪希细胞、卵泡分泌雌激素的卵泡的卵泡膜内层细胞、分泌孕酮的破裂卵泡的黄体细胞(粒层黄体细胞和膜黄体细胞)、肾小球旁细胞(肾素分泌)、肾的致密斑细胞、肾脏极周细胞、肾的肾小球膜细胞、肝细胞(肝细胞)、白脂肪细胞、褐色脂肪细胞、肝脂肪细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、髓袢细段细胞(loopof Henle thin segment cell)、肾远端小管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡细胞(肺的衬里空气间层(lining air space of lung))、胰管细胞(泡心细胞)、无横纹的导管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等的)例如主细胞和暗细胞、导管细胞(精囊、前列腺等的)、肠刷状缘细胞(具有微绒毛)、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、输精小管无纤毛细胞、附睾主细胞、附睾基细胞、血管和淋巴血管内皮有孔细胞、血管和淋巴血管内皮连续细胞、血管和血管和淋巴血管内皮脾细胞、滑膜细胞(内关节腔，透明质酸分泌)、浆膜细胞(内腹膜、胸膜和围心腔)、鳞状细胞(耳的衬里外淋巴隙)、鳞状细胞(耳的衬里内淋巴隙)、具有微绒毛的内淋巴囊柱状细胞(耳的衬里内淋巴隙)、不具有微绒毛的内淋巴囊柱状细胞(耳的衬里内淋巴隙)、暗细胞(耳的衬里内淋巴隙)、前庭膜细胞(耳的衬里内淋巴隙)、血管纹基细胞l(耳的衬里内淋巴隙)、血管纹边缘细胞(耳的衬里内淋巴隙)、克劳狄乌斯细胞(耳的衬里内淋巴隙)、贝特彻氏细胞(耳的衬里内淋巴隙)、脉络丛细胞(脑脊髓液分泌)、柔脑膜鳞状上皮细胞、眼的色素沉着睫状体上皮细胞、眼的无色素睫状体上皮细胞、角膜内皮细胞、呼吸道纤毛细胞、输卵管纤毛细胞(雌性中)、子宫内膜纤毛细胞(雌性中)、睾丸网纤毛细胞l(雄性中)、输精小管纤毛细胞(雄性中)、中枢神经系统的具纤毛的室管膜细胞(内脑腔)、成釉上皮细胞(牙釉质分泌)、耳的前庭器官的半月平面上皮细胞(蛋白聚糖分泌)、考蒂器官齿间上皮细胞(分泌覆盖毛细胞的覆膜)、疏松结缔组织成纤维细胞、角膜成纤维细胞(角膜基质细胞)、肌腱成纤维细胞、骨髓网状组织成纤维细胞、其它非上皮细胞成纤维细胞、周细胞、椎间盘的髓核细胞、成牙骨质细胞/牙骨质细胞(牙根骨样牙骨质分泌)、成牙质细胞(ontoblast)/odontocyte(牙齿牙本质分泌)、透明软骨软骨细胞、纤维软骨软骨细胞、弹性软骨软骨细胞、成骨细胞/骨细胞、骨原细胞(成骨细胞的干细胞)、眼的玻璃体的透明细胞、耳的外淋巴隙的星状细胞、肝脏星状细胞(伊东细胞)、胰腺星状细胞、骨骼肌细胞(例如红骨骼肌细胞(慢)、白骨骼肌细胞(快)、中间骨骼肌细胞、肌梭的核袋细胞和肌梭的核链细胞、卫星细胞(干细胞)、心肌细胞(例如普通心肌细胞、结节心肌细胞和浦肯野纤维细胞)、平滑肌细胞(各种类型)、虹膜的肌上皮细胞、外分泌腺的肌上皮细胞、红细胞(红血球)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮郎格罕斯细胞、破骨细胞(骨骼中)、树突状细胞(淋巴组织中)、小胶质细胞(中枢神经系统中)、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤性T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定向祖细胞(各种类型)、考蒂器官的听觉外毛细胞、嗅上皮的基细胞(嗅觉神经元的干细胞)、冷敏感性初级感觉神经元、热敏感性初级感觉神经元、表皮的Merkel细胞(触摸传感器(touch sensor))、嗅觉受体神经元、痛敏感性初级感觉神经元(不同类型)、眼中视网膜的感光细胞(例如光受体视杆细胞(photoreceptor rodcells)、眼的光受体蓝敏感视锥细胞、眼的光受体绿敏感视锥细胞、眼的光受体红敏感视锥细胞、本体感受性初级感觉神经元(各种类型))、触摸敏感性初级感觉神经元(不同类型)、I型颈动脉体细胞(血液PH传感器)、二型颈动脉体细胞((血液PH传感器)、耳的前庭器官的I型毛细胞(加速和重力)、耳的前庭器官的II型毛细胞(加速和重力)、I型味蕾细胞、胆碱能神经细胞(各种类型)、肾上腺素能神经元细胞(各种类型，肽能神经细胞(各种类型)、考蒂器官的内柱细胞、考蒂器官的外柱细胞、考蒂器官的内指细胞、考蒂器官的外指细胞、考蒂器官的边缘细胞、考蒂器官的Hensen细胞、前庭器官支持细胞、I型味蕾支持细胞、嗅上皮支持细胞、施万细胞(Schwann cell)、卫星细胞(包围周围神经细胞体)、肠神经胶质细胞、星形胶质细胞(各种类型)、神经元细胞(许多类型，仍然未良好地分类)、少突胶质细胞、纺锤体神经元、晶状体前上皮细胞、含晶体蛋白的晶状体纤维细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞，精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、卵泡细胞、Sertoli细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞和间质肾细胞。例如，如果细胞或细胞系中表达的目的蛋白质是通常在特定类型神经元中表达的离子通道，那么参照细胞可以是该特定类型的神经元。特定类型的神经元包括但不限于：感觉神经元、中枢神经系统的神经元、单极神经元、假单极神经元、双极神经元、多极神经元、Golgi I型神经元(Golgi I neurons)、锥体细胞、浦肯野细胞、前角细胞、Golgi II型神经元(Golgi II neurons)、颗粒细胞、篮细胞、贝茨细胞、巨大运动神经元、中型多棘神经元、伦肖细胞、α运动神经元、传入神经元、传出神经元、运动神经元和中间神经元。

在某些实施方案中，参照细胞是正常表达或功能性表达目的RNA或蛋白质而未进行基因改造的细胞类型的细胞。在某些实施方案中，参照细胞是具有稳定地表达目的RNA或蛋白质的能力的细胞。在某些实施方案中，参照细胞是具有表达目的RNA或蛋白质而无相关细胞毒性的能力的细胞。

在另外的方面中，本发明提供了用于产生本发明的细胞和细胞系的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：

a)提供多种细胞，其至少两种表达目的RNA或编码目的蛋白质的mRNA；

b)将细胞单个地分散至单个培养器皿，从而提供多个分离的细胞培养物；

c)使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述培养法的特征在于对于每一个分离的细胞培养物而言条件基本相同，在该培养过程中，将每一个分离的细胞培养物的细胞数目标准化，并且其中将分离的培养物按照相同的时间表传代；

d)测定分离的细胞培养物的目的RNA或目的蛋白质的至少一种所需特征至少2次；和

e)鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

根据该方法，细胞在所需培养条件组下进行培养。条件可以是任何所需条件。本领域普通技术人员应当了解在一组培养条件内包括何种参数。例如，培养条件包括但不限于：培养基(基础培养基(DMEM、MEM、RPMI、无血清、含血清、完全化学组分限定的、无动物衍生的组分)，单价和二价离子(钠、钾、钙、镁)浓度，加入的另外组分(氨基酸、抗生素、谷氨酰胺、葡萄糖或其它碳源、HEPES、通道阻断剂、其它靶标的调节剂、维生素、微量元素、重金属、辅因子、生长因子、抗凋亡试剂)，新鲜或条件培养基，具有HEPES、pH、特定营养素耗尽或限制性的(氨基酸、碳源))，分裂/传代前允许细胞达到的汇合水平，细胞的饲养层，或γ辐射的细胞，CO₂，三气系统(氧、氮、二氧化碳)，湿度，温度，静止或利用振荡器等，这将是本领域普通技术人员众所周知的。

可以为了方便或为了细胞的特定所需用途选择细胞培养条件。有利地，本发明提供了最佳地适合于特定所需用途的细胞和细胞系。即，在其中在用于特定所需用途的条件下培养细胞的本发明的实施方案中，选择在用于所需用途的条件下具有所需特征的细胞。

作为举例说明，如果细胞将在其中希望细胞是粘附的测定中在平板中使用，那么可以选择在测定的条件下显示粘附的细胞。类似地，如果细胞将用于蛋白质生产，那么细胞可以在适合于蛋白质生产的条件下进行培养，并且针对关于这个用途的有利性质进行选择。

在某些实施方案中，方法包括测量分离的细胞培养物的生长速率的额外步骤。可使用本领域普通技术人员众所周知的多种技术方法的任何方法测定生长速率。此类技术包括但不限于测量ATP、细胞汇合、光散射、光密度(例如，对于DNA，OD260)。优选地，使用使培养物在选择的培养条件之外花费的时间量最少的方法测定生长速率。

在某些实施方案中，测量细胞汇合，并且根据汇合值计算生长速率。在某些实施方案中，在测量细胞汇合前使细胞分散并且去除凝块用于改善的准确度。用于使细胞单分散的方法是众所周知的，并且可以例如通过向待测量的培养物中加入分散剂来实现。分散剂是众所周知的且容易获得的，并且包括但不限于，酶促分散剂例如胰蛋白酶，以及非酶促细胞解离剂，包括但不限于基于EDTA的分散剂。使用用于这个用途的商购可得的软件例如HAMILTON VECTOR，根据汇合日期可以计算生长速率。例如使用自动化微板读取器的自动化汇合测量是特别有用的。测量汇合的平板读取器是商购可得的，并且包括但不限于，CLONE SELECT IMAGER(Genetix)。一般地，在计算生长速率前进行细胞汇合的至少2次测量。用于测定生长速率的汇合值的数目可以是方便的或适合于培养的任何数目。例如，汇合可以经过例如1周、2周、3周或任何时间段且以任何所需频率测量多次。

当生长速率是已知的时，根据该方法，通过生长速率的相似性将多个分离的细胞培养物分成组。通过将培养物分组到生长速率框内，可以一起处理组中的培养物，从而提供减少培养物之间的变异的另一个标准化水平。例如，框中的培养物可以同时进行传代，同时用所需试剂进行处理等等。此外，功能测定结果一般依赖于测定孔中的细胞密度。在某些实施方案中，单个克隆的真实比较仅通过使其铺板且以相同密度进行测定来完成。分组成特定生长速率同期组群(cohorts)使得克隆能够以特定密度铺板，这允许它们以高通量形式在功能上进行表征。

每个组中的生长速率范围可以是任何方便的范围。选择允许细胞同时被传代且避免细胞数目的频繁重新标准化的生长速率范围是特别有利的。生长速率组可以包括非常窄的范围以用于紧密分组，例如，在彼此1小时内的平均倍增时间。但根据该方法，范围可以彼此多达2小时、多达3小时、多达4小时、多达5小时或多达10小时或甚至更广泛的范围。当框中的生长速率不相同使得某些培养物中的细胞数目增加得比其它的更快时，出现关于重新标准化的需要。为了维持用于框中的所有培养物的基本等同的条件，必须定期取出细胞以重新标准化跨越框的数目。生长速率越不等，就需要越频繁地重新标准化。

在步骤d)中，细胞和细胞系可以就任何生理特性进行测试且选择，所述生理特性包括但不限于：由基因组编码的细胞过程的改变；由基因组调节的细胞过程的改变；染色体活性模式的改变；染色体沉默模式的改变；基因沉默模式的改变；基因激活模式或效率的改变；基因表达模式或效率的改变；RNA表达模式或效率的改变；RNAi表达模式或效率的改变；RNA加工模式或效率的改变；RNA转运模式或效率的改变；蛋白质翻译模式或效率的改变；蛋白质折叠模式或效率的改变；蛋白质装配模式或效率的改变；蛋白质修饰模式或效率的改变；蛋白质转运模式或效率的改变；使膜蛋白质转运至细胞表面的模式或效率的改变；生长速率的改变；细胞大小的改变；细胞形状的改变；细胞形态的改变；RNA含量％的改变；蛋白质含量％的改变；含水量％的改变；脂质含量％的改变；核糖体含量的改变；线粒体含量的改变；ER质量的改变；质膜表面积的改变；细胞体积的改变；质膜的脂质组成的改变；核被膜的脂质组成的改变；质膜的蛋白质组成的改变；核被膜的蛋白质组成的改变；分泌囊泡数目的改变；溶酶体数目的改变；空泡数目的改变；细胞关于下述的能力或潜力的改变：蛋白质生产，蛋白质分泌，蛋白质折叠，蛋白质装配，蛋白质修饰，蛋白质的酶促修饰，蛋白质糖基化，蛋白质磷酸化，蛋白质去磷酸化，代谢产物生物合成，脂质生物合成，DNA合成，RNA合成，蛋白质合成，营养素吸收，细胞生长，有丝分裂，减数分裂，细胞分裂，去分化，转化成干细胞，转化成多潜能细胞，转化成全能细胞，转化成任何器官(即，肝、肺、皮肤、肌肉、胰腺、脑、睾丸、卵巢、血液、免疫系统、神经系统、骨、心血管系统、中枢神经系统、胃肠道、胃、甲状腺、舌、胆囊、肾、鼻、眼、趾甲、毛发、味蕾)的干细胞类型，转化成分化的任何细胞类型(即，肌肉、心肌、神经元、皮肤、胰腺、血液、免疫、红血细胞、白血细胞、杀伤T细胞、肠内分泌细胞、味觉、分泌细胞、肾、上皮细胞、内皮细胞，还包括可以用于引入核酸序列的已列举的任何动物或人细胞类型)，摄取DNA，摄取小分子，摄取荧光探针，摄取RNA，与固体表面附着，适应无血清条件，适应无血清悬浮条件，适应按比例增加的细胞培养，用于大规模细胞培养的用途，用于在药物开发中使用，用于在高通量筛选中使用，用于在基于功能细胞的测定中使用，用于在膜电位测定中使用，用于在钙流测定中使用，用于在G蛋白受体测定中使用.用于在基于报告细胞的测定中使用，用于在ELISA研究中使用，用于在体外测定中使用，用于在体内应用中使用，用于在二次测试中使用，用于在化合物测试中使用，用于在结合测定中使用，用于在淘选测定中使用，用于在抗体淘选测定中使用，用于在成像测定中使用，用于在显微成像测定中使用，用于在多孔平板中使用，用于适应自动化细胞培养，用于适应小型化自动化细胞培养，用于适应大规模自动化细胞培养，用于适应在多孔平板(6、12、24、48、96、384、1536或更高密度)中的细胞培养，用于在细胞芯片中使用，用于在载玻片上使用，用于在玻璃载玻片上使用，用于在载玻片或玻璃载玻片上的微阵列，用于免疫荧光研究，用于在蛋白质纯化中使用，用于在生物制品生产中使用，用于在工业酶生产中使用，用于在用于研究的试剂生产中使用，用于在疫苗开发中使用，用于在细胞疗法中使用，用于在植入动物或人内使用，用于在由细胞分泌的因子分离中使用，用于cDNA文库的制备，用于RNA的纯化，用于DNA的纯化，用于经由病原体、病毒或其它因子感染，用于对经由病原体、病毒或其它因子感染的抵抗力，用于对药物的抵抗力，用于在自动化小型化细胞培养条仵下维持的适合性，用于在蛋白质生产中用于表征，包括：蛋白质晶体学、疫苗开发、免疫系统的刺激、抗体生产或抗体的产生或测试。本领域普通技术人员将容易认识到用于上文列出的特性中的任何一种的合适测试。

可用于表征本发明的细胞和细胞系和/或本发明的相匹配实验对象组的测试包括但不限于：氨基酸分析、DNA测序、蛋白质测序、NMR、蛋白质转运的测试、核质运输的测试、蛋白质的亚细胞定位的测试、核酸的亚细胞定位的测试、显微镜分析、亚显微分析、荧光显微镜术、电子显微镜术、共焦显微镜术、激光消融技术、细胞计数和透析。本领域普通技术人员理解使用任何上列测试的方法。

当产生细胞或细胞系的集合或实验对象组例如以用于药物筛选时，可匹配集合或实验对象组中的细胞或细胞系，使得它们在一个或多个选择性生理特性方面相同(包括基本相同)。本说明书中“相同的生理特性”意指选择的生理特性在集合或实验对象组中的成员之间足够相似以至于细胞的集合或实验对象组在药物筛选测定中可产生可靠的结果；例如，药物筛选测定中读数的变化因例如测试化合物对表达不同形式的蛋白质的细胞的不同生物活性而产生，而非因细胞中固有的变化产生。例如，可使细胞或细胞系匹配以具有相同的生长速率，即，在细胞集合或实验对象组的成员之间具有不超过1、2、3、4或5个小时差异的生长速率。在某些实施方案中，这可以通过例如根据它们的生长速率将细胞框并成5、6、7、8、9或10个组，然后使用来自相同或不同框并组的细胞产生实验对象组来实现。在某些实施方案中，可根据生长速率将细胞框并成11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个组。在某些实施方案中，可根据生长速率将细胞框并成至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或超过100个组。在某些实施方案中，细胞系的实验对象组可包括基于它们的生长速率框并入相同组的细胞系。在某些实施方案中，细胞系的实验对象组可包括基于它们的生长速率被框并入不同组的细胞系。测定细胞生长速率的方法在本领域内是众所周知的。还可匹配实验对象组中的细胞或细胞系以具有相同的Z′因子(例如，差异不超过0.1的Z因子)、蛋白质表达水平(例如，相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或30％的CFTR表达水平)、RNA表达水平、与组织培养表面的附着等。可将匹配的细胞和细胞系在例如通过自动化平行加工获得的相同条件下培养，以维持选择的生理特性。在某些实施方案中，可基于细胞或细胞系的生理特性(包括但不限于生长速率)将本发明的细胞或细胞系框并入组中。在某些实施方案中，细胞或细胞系的相匹配实验对象组可包括根据细胞的至少一种生理特性(包括但不限于生长速率)分组的一个或多个框的细胞或细胞系。

在一个实施方案中，就相同组的条件下的生长速率使实验对象组匹配。这样的实验对象组(在本文中也称为相匹配实验对象组)是在广泛的基于细胞的研究中高度期望使用的，在所述研究中期望比较两个或更多个细胞系之间的实验变数效果。就生长速率匹配的细胞系随着时间推移保持基本相同的每孔细胞数目，从而减小了生长条件例如实验对象组中细胞系之间的营养物含量的变化。

根据本发明，相匹配实验对象组可以具有在任何所需范围内的生长速率，依赖于许多因素，包括细胞的特征、实验对象组的预期用途、实验对象组的大小、培养条件等。此类因素将是本领域普通技术人员容易理解的。

生长速率可以通过任何合适和方便的方法进行测定，唯一要求是相匹配实验对象组的所有细胞系的生长速率通过相同方法进行测定。用于测定生长速率的众多方法是已知的，如本文所描述的。

本发明的相匹配实验对象组可以包括任何数目的克隆细胞系。实验对象组中的克隆细胞系的最大数目对于每个用途和用户都不同，并且可以与可以维持的一样多。在各种实施方案中，实验对象组可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个克隆细胞系，例如至少12个、至少15个、至少20个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少48个、至少50个、至少75个、至少96个、至少100个、至少200个、至少300个、至少384个、至少400个或更多个克隆细胞系。在某些实施方案中，相匹配实验对象组可包括至少100、150、200、250、300、350、400、350、500、550、600、650、700、750、800、850、900或1,000个克隆细胞系。在其它实施方案中，相匹配实验对象组可包括至少1,100、1,250、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个克隆细胞系。在其它实施方案中，相匹配实验对象组可包括至少11,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个克隆细胞系。在其它实施方案中，相匹配实验对象组可包括至少100,000、150,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000个克隆细胞系或超过1,000,000个克隆细胞系。在其它实施方案中，相匹配实验对象组可包括至少1,000个克隆细胞系。

根据本发明，实验对象组包括多个克隆细胞系，即，从不同的单个亲本细胞产生的多个细胞系。在某些实施方案中，细胞系的实验对象组中的多个细胞具有相同的类型。在某些实施方案中，细胞系的实验对象组中的多个细胞系具有至少2个不同的类型。任何所需细胞类型可用于产生相匹配实验对象组。实验对象组可包括所有相同细胞类型的细胞系或不同细胞类型的细胞系。

实验对象组中的克隆细胞系稳定表达一种或多种目的蛋白质。稳定表达可以是任何时间段，其适合于实验对象组的所需用途，但最低限度地，足够长以允许在相匹配实验对象组中选择和使用。

相匹配实验对象组的克隆细胞系可全都表达相同的一种或多种目的蛋白质或实验对象组中的一些克隆细胞系可表达不同的目的蛋白质。

在某些实施方案中，相匹配实验对象组包括表达不同目的蛋白质的一个或多个克隆细胞系。即，实验对象组中的第一克隆细胞系可表达第一目的蛋白质，实验对象组中的第二克隆细胞系可表达第二目的蛋白质，第三细胞系可表达第三目的蛋白质等，对应于与需要的一样多的不同目的蛋白质。不同的目的蛋白质可以是目的蛋白质的不同同种型、等位基因变体、剪接变体或突变(包括但不限于突变的或截断的序列)、不同的亚单位化学计量、不同的亚单位装配、差异折叠的形式、差异活性形式、具有不同功能性的形式、具有不同结合性质的形式、与不同辅助因子结合的形式、在不同细胞背景中表达的形式、在不同细胞遗传背景中表达的形式、在具有不同内源性表达谱的细胞中表达的形式、差异定位的形式、嵌合或化学修饰形式(包括酶促修饰的形式、翻译后修饰的形式、糖基化形式、蛋白酶解的形式)或其组合。在某些实施方案中，不同的蛋白质可以是蛋白质的功能确定的组例如苦味受体的实验对象组或激酶的实验对象组的成员。在某些实施方案中，不同的蛋白质可以是相同的或相关的信号传导途径的部分。在包括异源多聚体蛋白质(包括异源二聚体)的其它实验对象组中，实验对象组可包括亚单位的两种或更多种不同组合直到亚单位的所有可能组合。组合可包括亚单位序列变体、亚单位同种型组合、亚单位的种间组合和亚型形式的组合。

作为举例说明，γ-氨基丁酸(GABA)A受体通常包含两个α亚单位、两个β亚单位和一个γ亚单位。存在6个α同种型、5个β同种型、4个γ同种型和1个δ、1个π和1个θ和1个ε亚单位。本发明包括含有此类亚单位的任一种的两个或更多个组合的实验对象组，包括包含α、β、γ、δ、π、ε和θ亚单位的每一种可能组合的实验对象组。此外，GABA受体家族还包括GABA_B和GABA_C受体。本发明还包括包含GABA_A、GABA_B和GABAc亚单位的任何组合的实验对象组。在某些实施方案中，此类实验对象组包括人GABA亚单位。在其它实施方案中，哺乳动物GABA受体实验对象组可包括非人灵长类动物(例如，食蟹猴)GABA受体、小鼠、大鼠或人GABA受体实验对象组或其混合物。

在另外的实例中，本发明涉及一个或多个上皮钠通道(ENaC)实验对象组，包括任何哺乳动物ENaC实验对象组例如非人灵长类动物(例如，食蟹猴)ENaC、小鼠、大鼠或人ENaC实验对象组或其混合物。与GABA受体一样，完整的EnaC包含多个亚单位：α或δ、β和γ。本发明包括具有至少两个不同的ENaC亚单位的组合的实验对象组并且还包括ENaC亚单位的所有可能组合，包括来自不同物种的亚单位的组合、同种型、等位基因变体、SNP、嵌合亚单位、包含修饰和/或非天然氨基酸的形式以及化学修饰的(例如酶促修饰的)亚单位的组合。本发明还包括包含国际申请PCT/US09/31936中所示的任何EnaC形式的实验对象组，该国际申请通过引用整体并入本文。

在另外的具体实施方案中，25个苦味受体的相匹配实验对象组包括表达表10中所列的天然(无标签)功能性苦味受体的细胞系。在某些实施方案中，就生长速率匹配实验对象组。在某些实施方案中，就生长速率和另外的目的生理特性匹配实验对象组。在某些实施方案中，平行产生和/或平行筛选实验对象组中的细胞系。

实验对象组及其用途的进一步示例性但非限制性例子是下述：气味受体(昆虫、犬、人、臭虫)的实验对象组，例如对于香味的概况分析或调节剂的发现；表达与测试肽融合的基因的细胞的实验对象组，即发现作用于使负荷(cargo)内在化到细胞内的肽，所述负荷例如蛋白质，包括单克隆抗体或非蛋白质药物(负荷可以是报道分子，例如GFP或AP)。关于这个实施方案，可以将来自这个实验对象组的细胞的上清液加入其它细胞中，用于评估内在化。在此类实施方案中，实验对象组可以包括不同细胞类型以评估细胞类型特异性递送。表达不同单克隆抗体重链/轻链组合的细胞系实验对象组以鉴定活性抗体或单克隆抗体。抗体实验对象组还可以提供单克隆抗体的一系列衍生化形式，以鉴定具有改善特征的那种，例如在血清中的稳定性、结合亲和力等。另外一个实验对象组可以用于在多种信号传导分子(例如不同G蛋白)的存在下表达靶蛋白。另外一种类型的实验对象组可以用于测试靶蛋白的变体的改善的活性/稳定性。实验对象组可以包括单核苷酸多态性(SNP)或其它突变形式的靶蛋白，以选择作用于亚组、许多形式或所有形式的调节剂。其它实验对象组可以用于限定测试化合物对于蛋白质家族或蛋白质同种型(例如GABA_A或其它CNS离子通道)的活性模式。差异作用的化合物随后可以用于进一步研究中，以测定相对应亚单位组合在体内的功能/作用/定位。测试化合物可以是在临床中失败的已知调节剂或具有不利的脱靶效应的那种，以测定可能与此类效应相关的亚单位组合。另外其它的实验对象组可以在HTS中用于平行筛选，用于可靠评估化合物对多种靶亚型的活性，以帮助发现对所需靶有活性的化合物和具有最低限度脱靶效应的化合物。

实验对象组可包括已进行改造以表达任何所需蛋白质组的细胞并且所有此类实验对象组均包括在本发明中。

实验对象组可包括已进行改造以表达任何所需实验对象组的RNA的细胞并且所有此类实验对象组均包括在本发明中。

在某些实施方案中，本发明提供了细胞或细胞系的实验对象组，其中所述实验对象组包括多个各自表达不同气味受体的细胞或细胞系。此类气味受体的实验对象组可用于产生目的化合物或组合物的气味活性谱。化合物或组合物的气味活性谱是指化合物或组合物对多个气味受体的活性的效应。为了产生目的化合物或组合物的气味活性谱，将化合物或组合物与多个各自表达不同气味受体的细胞或细胞系接触。

在某些实施方案中，气味受体细胞的实验对象组用于鉴定改变、增强或减弱化合物或组合物的气味活性谱的化合物。预测被鉴定为改变、增强或减弱另一种化合物或组合物的气味活性谱的化合物改变、增强或减弱另一种化合物或组合物的嗅觉效应。

在某些实施方案中，气味受体细胞的实验对象组用于鉴定具有与目的化合物或组合物相似的气味活性谱的化合物。预测被鉴定为具有与目的化合物或组合物相似的气味活性谱的化合物具有与其它化合物或组合物相似的嗅觉效应，即，闻起来相似或相同。可如下所述比较气味活性谱。

有用的气味受体包括但不限于表10-12中所示的嗅觉受体。在某些实施方案中，气味受体是I类人嗅觉受体和II类人嗅觉受体或其组合。本发明的气味受体组可具有至少2、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、1500、2000种或至少2500种不同的各自表达不同气味受体的细胞或细胞系。不同的气味受体可以是不同物种或相同物种的气味受体。在某些实施方案中，用于本发明的细胞、实验对象组和方法的气味受体可由假基因编码。

目的化合物或组合物对气味受体的活性可通过本领域普通技术人员已知的任何技术来测量。测量目的化合物或组合物对气味受体活性的效应的测定包括但不限于：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、成像测定、钙流测定、膜电位测定、高通量筛选测定、荧光测定和上述测定的组合。用于本发明的方法的任何测定可以以高通量形式进行。

本文中公开的任何细胞或细胞系可用于产生根据本发明的气味受体的实验对象组。在某些实施方案中，用于产生气味受体的实验对象组的宿主细胞可以是已经测试并且经证实内源性表达信号传导或其它为气味受体的功能性表达所需的蛋白质因子的细胞。通过测试(包括RT-PCR和微阵列法(包括基因芯片分析))对细胞进行的RNA或蛋白质表征可用于鉴定此类细胞。

在某些实施方案中，本发明的细胞的实验对象组包括多种细胞或细胞系，其中每一种细胞或细胞系已进行改造以表达一种或多种昆虫气味受体。所得的细胞的实验对象组可用于基于细胞的测定来表征气味，以及用于高通量筛选(″HTS″)以鉴定气味受体的调节剂。

在某些实施方案中，细胞或细胞系的实验对象组可包括来自一个物种(例如，一种蚊子)的气味受体的全部或亚组。细胞或细胞系的实验对象组可包括来自至少两个不同昆虫种的至少一种气味受体。可使用来自任何昆虫种的昆虫气味受体，包括传播人或动物疾病的昆虫、困扰农作物或对植物造成农业损害或破坏的昆虫，包括但不限于蚊子、蟑螂、甲虫、臭虫(bed bugs)、蛾、蝴蝶、苍蝇、蚂蚁、蟋蟀、蜜蜂、黄蜂、果蝇、壁虱(tick)、虱(lice)、genital lice、全蝎、马陆、蜈蚣、蝗虫(grasshoppers)、螳螂和蜘蛛。将蛋白质鉴定为嗅觉受体的常用方法基于对已知嗅觉受体的序列比较。在某些实施方案中，基于细胞的测定还可用于测试跨膜蛋白对已知的挥发性或有气味的化合物的反应性，以确定其作为气味受体的作用。

可针对本文中提供的实验对象组测试吸引或驱逐昆虫的物质(包括化合物和提取物)以鉴定其活性受测试化合物调节的反应性受体。可从例如植物、花、食物(例如，奶酪)、动物、烟、废弃物、分泌物、汗(包括人汗，例如，男性的汗或女性的汗)、工业产品、天然和合成化学品和生物制剂收集所述物质。可针对一个亚组或所有的气味受体细胞系测试物质以鉴定化合物对全部测试受体的活性谱。由针对气味受体细胞系测试物质而产生的活性模式可用于表征、“采集指纹”或用作诊断。

HTS可用于筛选包含经鉴定响应物质的昆虫气味受体的细胞系或实验对象组，以鉴定具有相似的、增强的或减弱的活性的其它物质。HTS可用于筛选包含响应物质的昆虫气味受体的细胞系或实验对象组以鉴定在所述物质存在的情况下调节、阻断或增强受体的活性的化合物。HTS可用于筛选包含不响应物质的气味受体的细胞系或实验对象组，以鉴定在该物质存在的情况下导致受体的响应或活性的化合物。

在某些实施方案中，本发明的方法用于鉴定具有与已知物质(例如，已知化合物)相似的对昆虫气味受体的活性的化合物或其混合物。在更具体的实施方案中，本发明的方法用于鉴定模拟DEET和/或其它昆虫驱虫剂和引诱剂的气味受体活性的化合物。在某些实施方案中，将本发明的方法用于鉴定可用作昆虫驱虫剂的化合物。在某些实施方案中，被鉴定为昆虫驱虫剂的化合物是挥发性的并且对环境、人、动物和/或农作物无毒的。在某些实施方案中，将本发明的方法用于鉴定可用作昆虫引诱剂的化合物。在某些实施方案中，被鉴定为昆虫引诱剂的化合物是挥发性化合物并且对环境、人、动物和/或农作物无毒。此类昆虫引诱剂可用于昆虫捕获。在某些实施方案中，昆虫引诱剂或驱虫剂可以对特定昆虫种类有特效的。

在具体的实施方案中，将本发明的方法用于鉴定阻断特定物质对一种或多种气味受体的活性的化合物或化合物的混合物。在更具体的实施方案中，将所述方法用于鉴定阻断受体对汗液、人或动物分泌物或它们的组分或二氧化碳的应答的化合物。

在某些实施方案中，将本发明的方法用于鉴定增强特定物质(例如，特定化合物)对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物，例如吸引或驱逐昆虫的化合物。

在某些实施方案中，将本发明的方法用于鉴定改变特定物质(例如，特定化合物)对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物。在其它实施方案中，本发明的方法可用于鉴定至少2种化合物的组合，其中所述至少2种化合物只有当组合时才激活气味受体，并且其中至少2种化合物的每一种不单独地激活气味受体。受体可以是检测昆虫驱虫剂或昆虫引诱剂的受体。

在某些实施方案中，将本发明的方法用于产生获自男性和/或女性的人汗液样品和此类样品的级分或从此类样品分离的化合物的气味活性谱，以鉴定反应性受体，并且将该数据与其它数据(包括例如针对一个或多个昆虫种类测试相同物质的结果)相比较，以鉴定与昆虫驱逐或吸引相关的活性或化合物。

在某些实施方案中，本发明的方法用于测试和比较至少两个样品的气味活性谱。在具体的实施方案中，样品可以是从不同植物、植物或动物的不同种，或从不同的花获得的挥发物。然后将不同样品的气味活性谱相比较来鉴定反应受体(例如，其活性受不同样品影响的那些受体)。反应性受体是样品的化学组成的指示剂。待比较的样品的气味活性谱的相似性是不同样品的化学相似性量度。

在某些实施方案中，本发明的方法用于鉴定许多具有相似活性的化学上不同的化合物，将其组合或相继使用或引入来应对可使得至少一种化合物失效的潜在的昆虫适应或进化。

可产生各自包含一种或多种人气味受体的细胞系的实验对象组以用于基于细胞的测定来表征气味以及用于HTS来鉴定气味受体调节剂。

可针对人气味受体的实验对象组测试包含具有香气、臭味、香味或芳香的化合物或提取物的物质以鉴定其活性受测试物质调节的反应性受体。可从植物、花、食物、动物、香烟、烟草、块菌、麝香(musk)、香草、薄荷、废弃物、分泌物、汗液(包括人汗液，例如男性汗液或女性汗液)、工业产品、天然和合成化学品以及生物制剂(包括疾病组织和肿瘤)收集化合物或混合物。可针对一个亚组或所有的人气味受体细胞系测试化合物以鉴定化合物对所有测试受体的活性谱。由针对人气味受体细胞系测试物质而产生的活性模式可用于表征、“采指纹”或用作诊断。

HTS可用于筛选包括经鉴定响应物质的人气味受体的细胞系或实验对象组来鉴定具有相似的、增强的或减弱的活性的其它物质。HTS可用于筛选包括响应物质的人气味受体的细胞系，来鉴定在所述物质存在的情况下调节、阻断或增强受体的活性的化合物。HTS可用于筛选包括不响应物质的人气味受体的细胞系来鉴定在所述物质存在的情况下导致受体的应答或活性的化合物。

气味受体实验对象组的示例性用途包括：

鉴定具有与已知的物质相似的对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物，例如可模拟麝香的活性的合成化合物。

鉴定阻断已知的物质对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物，例如阻断具有恶臭的物质(人或动物汗液)的化合物。

鉴定增强已知的物质对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物，例如模拟玫瑰花的香气或牛排的香味的化合物。

鉴定改变已知的物质对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物，例如在物质(例如烟草烟雾)存在的情况下导致检测恶臭的受体激活(所述物质通常可能不产生该效应)的化合物。

鉴定改变已知的物质对一种或多种气味受体的活性的化合物之一或化合物的混合物，例如在物质(例如恶臭物质)存在的情况下导致检测所需香气的受体激活的化合物，所述物质是例如通常可激活其它受体而不激活对应于所需香气的受体的物质。

表征获自男性和女性的人汗液样品和此类样品的级分或从此类样品分离的化合物以鉴定反应性受体，并且使该数据与其它数据(包括例如人心理物理学研究)相关以鉴定与感觉到的恶臭或吸引相关的活性或化合物。

测试一组可被比较的样品(例如获自不同种的玫瑰花的香气，或获自不同花的香气或一种物质的级分)以鉴定响应此类香气的共同或特异性受体。

本文中描述的细胞、实验对象组和方法可用于来自其它物种的气味受体，所述物种包括但不限于：选自下组的哺乳动物种类：人类、非人灵长类、牛科动物、猪科动物、猫科动物、大鼠、有袋动物、鼠科动物、犬科动物、羊、山羊、兔、豚鼠和仓鼠；或选自下组的昆虫种类：蚊科，包括按蚊属(冈比亚按蚊和所有蚊子亚种、伊蚊属(包括埃及斑蚊和所有亚种)、库蚊属和伊蚊属、蚋属、黑蝇、白蛉属、白蛉子(sand flies)、虻虫、马蝇、Chryops、斑虻、舌蝇属、采采蝇、蚤目、蚤、客蚤属、病蚤属、半翅目、锥猎蝽属和红猎蝽属(猎蝽)、虱目、吸吮虱、Pediculus humanis、虱、黑蝇、恙螨属、眼潜蝇(Eye Gnats)、厩蝇、鹿和马蝇、蚜虫、飞蝗、飞虱、牧草虫、苍蝇、鳞翅类、线虫类、同翅目、鞘翅目、螨(Mites)、白蚁、蟑螂(cockroaches)(包括德国蟑螂)、蚂蚁、蚜科、蝗科、Fulgoromorpha、蜡蝉总科、蓟马科、管蓟马科、卷蛾科、夜蛾科、野螟科、夜蛾科、菜蛾科、螟蛾科、异皮线虫科、粉虱科、叶甲科、拟步甲科、象甲总科、谷类象鼻虫(grainweevil)、谷象(Sitophilus granarius)、米象(rice weevil)、米象(Sitophilusoryzae)、紫花苜蓿、苜蓿叶象甲、豌豆上的果核象甲、豆种子上的豌豆象、菜豆象、叶螨科、鼻白蚁科、Kolotermitidae、蠊(Blattellidae)、蚁科、甲虫和臭虫以及娥。

可通过计算气味活性谱之间的关系，例如但不限于计算气味活性谱之间的相似性量度来比较目的化合物的气味活性谱与标志性气味活性谱。标志性气味活性谱可以是数据库中的一组气味活性谱之一。标志性气味活性谱可以是历史特征谱。目的化合物的气味活性谱可包括代表化合物对实验对象组中两种或更多种气味受体的活性的效应的被测量。每一个标志性气味活性谱包括代表各化合物对实验对象组中两种或更多种气味受体的活性的效应的被测量。

在某些实施方案中，对应于标志性气味活性谱的各个化合物可与已知的气味相关。即，可组合各化合物对实验对象组中两种或更多种气味受体的活性的效应的被测量以产生可与已知的气味相关的标志性转录谱(transcript profile)。可将标志性气味活性谱的数据库存储在计算机可读存储介质上。在具体的实施方案中，数据库包含至少10个标志性气味活性谱、至少50个标志性气味活性谱、至少100个标志性气味活性谱、至少500个标志性气味活性谱、至少1,000个标志性气味活性谱、至少10,000个标志性气味活性谱s或至少50,000个标志性气味活性谱，每一个标志性气味活性谱包括至少2个、至少10个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1,000个、至少2000个、至少2500个、至少7500个、至少10,000个、至少20,000个、至少25,000个或至少35,000个组分的被测量。在上述实施方案中，可将目的化合物的气味活性谱与多个标志性气味活性谱相比较来确定与目的化合物的气味活性谱相关(例如，与之最相似)的一个或多个标志性气味活性谱，并且可将目的化合物表征为具有与对应于此类一个或多个标志性气味活性谱的各化合物相关的已知气味。

在其它实施方案中，目的化合物可与已知的气味相关。在上述实施方案中，可将目的化合物的气味活性谱与多个标志性气味活性谱相比较来确定与目的化合物的气味活性谱相关(例如，与之最相似的)的一个或多个标志性气味活性谱，并且对应于此类一个或多个标志性气味活性谱的各化合物可表征为具有与目的化合物相关的已知气味。

在某些实施方案中，可计算目的化合物的气味活性谱与存储在数据库中的多个标志性气味活性谱的每一个标志性气味活性谱之间的关系。可通过将代表目的化合物对实验对象组中两种或更多种气味受体的选择的活性的效应的目的化合物的气味活性谱中的被测量与相应的代表不同化合物对实验对象组中两种或更多种气味受体的相同选择的活性的效应的标志性气味活性谱中的被测量相比较来计算相关性。如果标志性气味活性谱中被测量在目的化合物的气味活性谱中被测量的约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％之内，那么目的化合物的气味活性谱可被认为与标志性气味活性谱相关。

如果目的化合物的气味活性谱与标志性气味活性谱之间的相似性量度高于预定阈值，那么目的化合物的气味活性谱被认为与标志性气味活性谱最相似。在具体的实施方案中，预定的阈值可确定为表示标志性气味活性谱中的被测量在目的化合物的气味活性谱中被测量的约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％之内的相似性量度的值。

在某些实施方案中，目的化合物的气味活性谱可表示为向量p，

p＝[p₁，...p_i，...p_n]

其中p_i是第i个组分的被测量，例如，目的化合物对实验对象组中给定的气味受体的第i个生物活性的效应。在具体的实施方案中，n大于2，大于10，大于100，大于200，大于500，大于1000，大于2000，大于2500，大于7500，大于10,000，大于20,000，大于25,000或大于35,000。每一个标志性气味活性谱也可表示为向量p。在计算相关性中，对于每一种组分i＝1...n，可将表示目的化合物的气味活性谱的向量中第i个组分的被测量与相应的代表标志性气味活性谱的向量的第i个组分的被测量相比较。

可按照本发明的方法使用本领域内用于测定两个数据集相关的概率的任何统计方法计算相关性，以鉴定在目的化合物的气味活性谱与标志性气味活性谱之间是否存在相关性。例如，可使用相似性量度sim(pi1，pi2)计算目的化合物的气味活性谱(pi1)与各标志性气味活性谱(pi2)之间的相关性。计算相似性量度sim(pi1，pi2)的一个方法是计算欧氏距离的负2次方。在可选的实施方案中，可使用除欧氏距离外的量度计算sim(pi1，pi2)，例如曼哈顿距离、切比雪夫距离、向量夹角、相关距离(correlation distance)、标准化的欧氏距离(standardizedEuclidean distance)、马哈拉诺比斯距离、平方皮尔逊相关系数(squaredPearson correlation coefficient)或明可夫斯基距离。在某些实施方案中，皮尔逊相关系数、平方欧氏距离、欧氏平方和(Euclidean sum of square)或平方皮尔逊相关系数用于测定相似性。可以例如使用AS(StatisticsAnalysis Systems Institute，Cary，North Carolina)或S-Plus(StatisticalSciences，Inc.，Seattle，Washington)计算此类量度。此类量度的使用描述于Draghici，2003，Data Analysis Tools for DNA Microarrays，Chapman & Hall，CRC Press London，第11章，为了该目的该文献由此通过引用整体并入本文。

还可基于等级计算相关性，其中x_i和y_i是按递升或递降数字顺序排列的被测量的值的等级。参见例如，Conover，PracticalNonparametric Statistics，第2版，Wiley，(1971)。Shannon互信息还可用作相似性量度。参见，例如，Pierce，An Introduction To InformationTheory：Symbols，Signals，and Noise，Dover(1980)，该文献通过引用整体并入本文。

可根据本申请中描述的方法训练本领域内已知的各种分类器，并且将其用于将目的化合物分类为具有气味。算法可用于产生能够使用目的化合物的气味活性谱预测目的化合物的气味的分类器。

在某些实施方案中，可训练分类器使用之前表征的化合物的标志性气味活性谱中的被测量和与之前表征的化合物相关的已知气味依据气味分类化合物。对应于标志性气味活性谱的各个化合物可与已知的气味相关。分类器可以是用于分类的算法，所述分类通过将无监督或有监督学习算法用于估计之前表征的化合物的标志性气味活性谱中的被测量和与之前表征的化合物相关的已知气味来进行。可使用分类器处理目的化合物的气味活性谱以依据气味分类所述目的化合物分类。即，可将分类器用于将目的化合物分类为具有一种或多种与用于训练分类的多个标志性气味活性谱相关的一个或多个已知的气味。

在某些实施方案中，可将目的化合物与已知的气味相关。在上述实施方案中，可训练分类器以基于目的化合物的气味活性谱鉴定可与目的化合物的已知气味相关的一个或多个标志性气味活性谱。分类器可以是用于分类的算法，所述分类通过将无监督或有监督学习算法用于估计各化合物的标志性气味活性谱中的被测量并且基于目的化合物的气味活性谱鉴定与目的化合物的已知气味相关的一个或多个标志性气味活性谱来进行。

本领域内已知的任何标准无监督或有监督学习技术可用于产生分类器。下面是本领域内已知的无监督和有监督算法的非限定实例。鉴于本申请的公开内容，本领域普通技术人员将理解其它模式分类或回归技术和算法可用于分类器并且本发明包括所有此类技术。

神经网络。在某些实施方案中，分类器使用神经网络进行学习。神经网络是两段回归(two-stage regression)或分类决策规则(classification decision rule)。神经网络具有分层的结构，其包括一层通过一层负荷与一层输出单元连接的输入单元(和偏差单元)。关于回归，输出单元层通常仅包括一个输出单元。然而，神经网络可以以无缝方式处理多个定量反应。

在多层神经网络中，存在输入单元(输入层)、隐匿单元(隐含层)和输出单元(输出层)。此外，存在单个与除了输入单元外的每一个单元连接的偏差单元。神经网络描述于Duda等人，2001，PatternClassification，第二版，John Wiley & Sons，Inc.，New York；和Hastie等人，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer-Verlag，New York，每一篇所述文献通过引用整体并入本文。神经网络也描述于Draghici，2003，Data Analysis Tools for DNA Microarrays，Chapman& Hall/CRC；和Mount，2001，Bioinformatics：sequence and genomeanalysis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，每一篇所述文献通过引用整体并入本文。下文中论述的是神经网络的一些示例性形式。

使用神经网络的基本方法是始于未经训练的网络，将训练模式呈递至输入层，然后通过网络传递信号并且在输出层测定输出量。然后将这些输出量与靶值相比较；任何差异对应于误差。对于分类，该误差可以是平方误差或交叉熵(偏差)。参见，例如Hastie等人，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer-Verlag，New York，该文献通过引用整体并入本文。

3个常用的训练方案是随机、分批和在线训练。在随机训练中，从训练组随机选择模式并且更新每一个模式呈递的网络权值。通过梯度下降法例如随机反向传播法(stochastic back-propagation)训练的多层非线性网络在通过网络拓扑确定的分类器中进行权值的最大似然估计。在分批训练中，在学习发生之前将所有模式呈现给网络。通常，在分批训练中，通过训练数据产生几个途径。在在线训练中，一次并且只有一次将各模型呈现给网络。

三层网络使用中经常出现的问题是用于网络的隐匿单元的最佳数目。三层网络的输入和输出的数目由待解决的问题确定。在本发明中，给定的神经网络的输入的数目将等于选择自Y的生物标志物的数目。神经网络的输出的数目通常将正好为1。如果神经网络中使用太多的隐匿单元，那么网络将具有太多的自由度并且如果训练时间太长，将存在网络过度拟合数据的危险。如果存在太少的隐匿单元，那么训练集不能得到学习。然而，一般来说，具有太多的隐匿单元比具有太少的隐匿单元更好。具有太少的隐匿单元，分类器可能不具有足够的灵活性来捕获数据中的非线性；具有太多的隐匿单元，如果使用如下所述的适当的规则化或修剪则可将额外的权重缩小至0。在典型的实施方案中，隐匿单元的数目为5至100的范围内的某个数，数目随输入的数目和训练案例的数目增加而增加。

聚类。在某些实施方案中，分类器使用聚类来进行学习。在某些实施方案中，将代表标志性气味活性谱的向量的选择组分i用于聚类气味活性谱。在某些实施方案中，在聚类之前，将被测量标准化以具有为0的均值和单位方差。

在整个训练群体中显示相似的被测量的模式的标志性气味活性谱倾向于聚类在一起。当向量依据特定的已知气味形成簇时，组分i的被测量的特定组合在本发明的该方面中可被认为是良好的分类器。参见，例如，Duda和Hart，Pattern Classification and Scene Analysis，1973，John Wiley & Sons，Inc.，New York(在下文中称为″Duda 1973″)的211-256页，该文献通过引用整体并入本文。如Duda 1973的部分6.7中所描述的，聚类问题被描述为数据集中发现自然分组之一。为了鉴定自然分组，要解决2个问题。首先，确定测量两个气味活性谱之间的相似性(或相异性)的方法。该量度(相似性量度)用于确保一个簇中的气味活性谱彼此之间比它们对于其它气味活性谱更相似。其次，确定使用相似性量度将数据分配至簇中的机制。

相似性量度论述于Duda 1973的部分6.7，其中提出了开始聚类研究的一个方法是确定距离函数和计算成对的气味活性谱之间的距离的矩阵。如果距离是相似性的良好量度，那么相同簇中气味活性谱之间的距离显著小于不同簇中气味活性谱之间的距离。然而，如Duda1973的第215页中所提及的，聚类不需要使用距离量度。例如，可使用非量度相似性函数s(x，x′)来比较两个向量x和x′。常规地，s(x，x′)是当x和x′以某种方式“相似”时其值最大的对称函数。在Duda 1973的第216页上提供了非量度相似性函数s(x，x′)的实例。

一旦已经选择测量数据集的点之前的“相似性”或“相异性”的方法，聚类需要测量数据的任何分区的聚类质量的标准功能。将标准功能极值化的数据集的分区用于聚类数据。参见，例如，Duda 1973的第217页。准则函数描述于Duda 1973的部分6.8中。更近以来，已出版了Duda等人，Pattern Classification，第2版，John Wiley & Sons，Inc.New York。第537-563页详细描述了聚类。关于聚类技术的其它信息可见于Kaufman和Rousseeuw，1990，Finding Groups in Data：AnIntroduction to Cluster Analysis，Wiley，New York，NY；Everitt，1993，Cluster analysis(第3版)，Wiley，New York，NY；和Backer，1995，Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis，Prentice Hall，UpperSaddle River，New Jersey。可用于本发明的具体的示例性聚类技术包括但不限于层次聚类(hierarchical clustering)(利用最近邻算法、最远邻法、平均联接算法(average linkage algorithm)、质心算法(centroidalgorithm)或平方和算法(sum-of-squares algorithm)的凝聚聚类)、K-均值聚类、模糊K均值聚类算法和Jarvis-Patrick聚类。

主组分分析。在某些实施方案中，使用主组分分析来学习分类器。主组分分析是通过将数据转换成概括数据的特征的一组新变量(主组分)来降低数据集的维数的经典技术。参见，例如，Jolliffe，1986，Principal Component Analysis，Springer，New York，该文献通过引用整体并入本文。主组分分析也描述于Draghici，2003，Data AnalysisTools for DNA Microarrays，Chapman & Hall/CRC，该文献通过引用整体并入本文。下列是主组分分析的非限定性实例。

使主组分(PC)不相关并且按顺序排列，从而使得第k个PC在PC之间具有第k个最大方差。可将第k个PC解释为使数据点的投影的方差最大以使得其与第k-1个PC正交的方向。前几个PC捕获数据集中的大多数方差。相反，通常假定最后几个PC只捕获数据中的残留‘噪声’。

在一个使用PCA学习分类器的方法中，可以以上文中针对聚类所描述的相同方式构建代表标志性气味活性谱的向量。事实上，其中每一个向量代表标志性气味活性谱的向量组可被视为矩阵。在某些实施方案中，该矩阵在弗里-威尔逊法中表示单体的定性二元描述(Kubinyi，1990，3D QSAR in drug design theory methods andapplications，Pergamon Press，Oxford，pp 589-638，由此通过引用整体并入本文)，并且分布在使用PCA最大压缩的空间中，使得第一主组分(PC)可能捕获最大量的方差信息，第二组组分(PC)捕获第二大量的全部方差信息，依此类推直至矩阵中的所有方差信息都被考虑。

然后，将每一个向量(其中每一个向量代表训练群体的成员(例如标志性气味活性谱))作图。许多不同类型的图是可能的。在某些实施方案中，制作一维图。在该一维图中，将来自训练群体的每一个成员的第一主组分的值作图，预期对应于气味的气味活性谱将聚类在第一主组分值的一个范围内并且对应于另一种气味的谱将聚类在第一主组分值的第二范围内。

在某些实施方案中，将训练群体的成员针对超过一个主组分作图。例如，在某些实施方案中，将训练群体的成员在二维图上作图，其中第一维是第一主组分，第二维是第二主组分。

最近邻分析。在某些实施方案中，使用最近邻分析来学习分类器。最近邻分类器是基于记忆的并且不需要分类器拟合。给定查询点x₀，鉴定在距离上与x₀最近k个训练点x_(l)，r，...，k，然后使用k最近邻法分类点x₀。可随机中断联系。在某些实施方案中，将特征空间中的欧几里德距离用于将距离测定为：

d_(i)＝||x_(i)-x_o||。

一般地，当使用最近邻算法时，将用于计算线性判别的来自Y的丰度数据标准化以具有均值0和方差1。在本发明中，将训练群体的成员随机分入训练组和测试组。例如，在一个实施方案中，将2/3的训练群体的成员放入训练组并且将1/3的训练群体的成员放入测试组。向量组分i的选择组合表示将训练组的成员在其中作图的特征空间。然后，计算训练组正确表征测试组的成员的能力。在某些实施方案中，对给定的向量组分i的组合进行最近邻计算数次。在每一次重复计算中，将训练群体的成员随机分配至训练组和测试组。

可改进最近邻规则以处理不等类的先验(unequal class priors)、非均衡性错分成本和特征选择。许多此类改进包括一些针对近邻的权重投票的形式。关于有关最近邻分析的更多信息，参见，例如，Duda，Pattern Classification，第2版，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer，New York，该文献由此通过引用整体并入本文。

线性判别分析。在某些实施方案中，使用线性差别分析来学习分类器。线性差别分析(LDA)试图基于某些目标性质将受试者分类至两个类别之一。换句话说，LDA测试实验中测量的目标属性是否预测目标的分类。LDA通常需要连续自变量和不连续类别依变量(categorical dependent variable)。在本发明中，整个训练群体的亚组中向量组分i的选择组合的丰度值用作必需的连续自变量。训练群体的每一个成员的性状亚组分类(例如，气味)用作不连续类别依变量。

LDA寻找通过使用分组信息使组间方差与组内方差的比率最大的变量的线性组合。无疑地，由LDA使用的线性权重依赖于整个训练组中向量组分i的被测量在气味组中分散的程度。在某些实施方案中，将LDA用于训练群体中成员的数据矩阵。然后，将训练群体的每一个成员的线性判别作图。理想地，代表气味的训练群体的那些成员将聚类至线性判别值的一个范围(例如，阴性)并且代表另一种气味的训练群体的那些成员将聚类至线性判别值的第二范围(例如，阳性)。当判别值的簇之间的分隔更大时，LDA被认为更成功。关于有关线性判别分析的更多信息，参见例如，Duda，Pattern Classification，第2版，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，The Elementsof Statistical Learning，Springer，New York；以及Venables & Ripley，1997，Modern Applied Statistics with s-plus，Springer，New York，每一篇所述文献通过引用整体并入本文。

二次判别分析。在某些实施方案中，使用二次判别分析来学习分类器。二次判别分析(QDA)采用相同的输入参数并且返回与LDA相同的结果。QDA使用二次方程而非线性方程来产生结果。LDA和QDA是可互换的，使用哪一个是支持分析的软件的选择和/或可获得性的问题。逻辑回归采用相同输入参数并且返回与LDA和QDA相同的结果。

支持向量机。在某些实施方案中，使用支持向量机来学习分类器。SVM描述于例如Cristianini和Shawe-Taylor，2000，An Introduction toSupport Vector Machines，Cambridge University Press，Cambridge；Boser等人，1992，″A training algorithm for optimal margin classifiers″，Proceedings of the 5^th Annual ACM Workshop on ComputationalLearning Theory，ACM Press，Pittsburgh，PA，pp.142-152；Vapnik，1998，Statistical Learning Theory，Wiley，New York；Mount，2001，Bioinformatics：sequence and genome analysis，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，Duda，PatternClassification，第2版，2001，John Wiley & Sons，Inc.；和Hastie，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer，New York；以及Furey等人，2000，Bioinformatics 16，906-914，每一篇所述文献通过引用整体并入本文。当用于分类时，SVM将一组给定的二进制标记数据训练数据与与它们距离最远的超平面分开。对于其中非线性分离是不可能的情况，SVM可与自动实现至特征空间的非线性映射。由SVM在特征空间中发现的超平面对应于输入空间中的非线性决策边界。关于有关支持向量机的更多信息，参见例如Furey等人，2000，Bioinformatics 16，第906-914页，其通过引用整体并入本文。

决策树。在一个实施方案中，分类器是决策树。决策树通常描述于Duda，2001，Pattern Classification，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，pp.395-396，其通过引用整体并入本文。可使用的一个具体的算法是分类和回归树(CART)。其它具体的算法包括但不限于ID3、C4.5、MART和随机森林(Random Forests)。CART、ID3和C4.5各自描述于Duda，2001，Pattern Classification，John Wiley & Sons，Inc.，New York，第396-408页和第411-412页，该文献通过引用整体并入本文。CART、MART和4.5也描述于Hastie等人，2001，The Elementsof Statistical Learning，Springer-Verlag，New York，第9章，该文献通过引用整体并入本文。Random Forests技术描述于Breiman，1999，″Random Forests-Random Features″，Technical Report 567，StatisticsDepartment，University of California at Berkeley，September 1999，该文献通过引用整体并入本文。

除了其中每一个分裂(split)基于相应的向量组分i的被测量或向量组分i的相对被测量的单变量决策树外，分类器可以是多变量决策树。在这样的多变量决策树中，一些或全部决策实际上包括多个向量组分i的被测量的线性组合。多变量决策树描述于Duda，2001，PatternClassification，John Wiley & Sons，Inc.，New York，pp.408-409，该文献通过引用整体并入本文。

多元自适应回归样条法(Multivariate adaptive regression splines)。可用于学习成对概率函数gpq(X，Wpq)的另一个方法使用多元自适应回归样条法(MARS)。MARS是用于回归的自适应过程，并且十分适合于由本发明提出的高维问题。MARS可被视为逐步线性回归的推广或CART法的改进以提高CART在回归设置中的性能。MARS描述于Hastie等人，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer-Verlag，New York，pp.283-295，该文献通过引用整体并入本文。

重心分类器技术。在一个实施方案中，使用最近邻重心分类器技术。对于不同的气味，这样的技术计算由训练群体(标志性气味活性谱)中向量组分i的平均被测量给定的重心，然后将代表目的化合物的向量分配至其重心最近的类中。该方法与k-均值聚类相似，除了簇被已知的类替代。该方法的示例性实现是微阵列的预测分析或PAM。参见例如Tibshirani等人，2002，Proceedings of the National Academy ofScience USA 99；6567-6572，该文献通过引用整体并入本文。

回归。在某些实施方案中，分类器是回归分类器，例如逻辑回归分类器。这样的回归分类器包括用于构建分类器的每一个气味活性谱的系数。在此类实施方案中，使用例如最大似然法计算回归分类器的系数。在这样的计算中，使用载体组分i的被测量。

其它方法。在某些实施方案中，使用k-最近邻法(k-NN)、人工神经网络(ANN)、参数线性方程、参数二次方程、朴素贝页斯分析(naiveBayes analysis)、线性判别分析、决策树或径向基函数(Radial BasisFunction)来学习分类器。

本发明的一些实施方案提供了包含图1中显示的任何或所有程序模块的计算机程序产品。程序模块的方面在下文中进一步描述。

在某些实施方案中，本发明提供了细胞或细胞系或者细胞或细胞系的实验对象组，所述细胞或细胞系表达生物制品，例如分泌的蛋白质。分泌的蛋白质可包括抗体或其活性片段，例如，包含重链和轻链的抗体、单链抗体、在免疫系统中具有活性的蛋白质、IgA、IgD、IgE、IgG和IgM蛋白或其活性片段、酶、凝固因子或激素或相应任何此类蛋白质的片段的蛋白质。生物制品还可包括FDA批准的生物制品药物、已知的生物制品、具有治疗活性的蛋白质或治疗性生物制品。生物制品和它们的商品名的实例包括但不限于：卡那奴单抗(Canakinumab)(Maris)、肉毒毒素A(Dysport)、戈利木单抗(Golimumab)(Simponi)、罗米司亭(Romiplostim)(NPLATE)、赛妥珠单抗(Certolizumab Pegol)(Cimzia)、列洛西普(Rilonacept)(Arcalyst)、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(Mircera)、依库珠单抗(Soliris)、帕尼单抗(Vectibix)、艾杜硫酸酯酶(idursulfase)(Elaprase)、兰尼单抗(ranibizumab)(Lucentis)、阿葡糖苷酶α(Myozyme)、阿巴西普(Orencia)、加硫酶(Naglazyme)、帕利夫明(帕利夫明(Kepivance))、那他珠单抗(Tysabri)、贝伐珠单抗(安维汀)、西妥昔单抗(爱必妥)、若莫单抗(Verluma)、卡罗单抗喷地肽(ProstaScint)、阿法依泊汀(细胞生成素α、阿法依伯汀)、technetium fanolesomab(NeutroSpec)、阿西莫单抗(CEA-Scan)、阿法达贝泊汀((Aranesp)、尿激酶(雅激酶)、替伊莫单抗(泽娃灵)、利妥昔单抗(美罗华)、阿地白介素(Proleukin)、地尼白介素(Ontak)、培门冬酶(培加帕酶)、非格司亭(Neupoen)、奥普瑞白介素(Neumega)、培非司亭(Nuelasta)、沙格司亭(Leukine)、帕利夫明(Kepivance)、曲妥珠单抗(Herceptin)、西妥昔单抗(Eribitux)、天门冬酰胺酶(Elspar)、拉布立酶(Elitek)、阿仑珠单抗(Campath)、托西莫单抗(Bexxar)、帕利珠单抗(Synagis)、干扰素α-2a(Roferon-A)、聚乙二醇干扰素α-2b(Peg-lntron)、聚乙二醇干扰素α-2a(Pegasys)、干扰素α-2b(Intron A)、复合α干扰素(Infergen)、聚乙二醇干扰素α-2a(CopasysCopegus)、达克珠单抗(Zenapax)、巴利昔单抗(Simulect)、莫罗莫那-CD3(Orthocolone、OKT3)、干扰素-γ1b(Actimmune)、替加色罗α-激活的(Xigris)、胶原酶(Santyl)、贝卡普勒明(Regranex)、依法珠单抗(Raptiva)、阿来法塞(Amevive)、干扰素α-n3(Alferon N)、加硫酶(Naglazyme)、阿加糖酶β(Fabrazyme)、拉罗尼酶(Aldurazyme)、英利昔单抗(Remicade)、阿巴他塞(Orencia)、阿那白滞素(Kineret)、阿达木单抗(Humira)、依那西普(Enbrel)、奥马珠单抗(Xolair)、脱氧核糖核酸α(阿法链道酶)、那他珠单抗(Tysabri)、干扰素β-1-a(Rebif)、B型肉毒毒素(Myobloc)、A型肉毒杆菌毒素(Botox)、干扰素β-1-b(利比)、干扰素β-1-a(Avonex)、替奈普酶(TNKase)、链激酶(Streptase)、Reeplase(Retavase)、阿昔单抗(ReoPro)、阿替普酶(Cathflo Activase，激活酶)、epo α(Abseamed、Binocrit)、艾杜糖-2-硫酸酯酶(Elaprase)、胰岛素(Exubera)、HPV疫苗(Gardasil)、哌加他尼(pegaptanib)(Macugen)、人酸性-a-葡萄糖苷酶(Myozyme)、加硫酶(Naglazyme)、人体生长激素(Omnitrope)、甲状旁腺素(Preotach)、人生长激素(Valtropin)、抗凝血酶(Atryn)、来自HPV的主要衣壳L1蛋白(Cervarix)、促红细胞生成素α(Epotein alfa hexal)、美卡舍明人IGF-1(Increlex)、甲氧基聚乙二醇-β依泊汀(Mlrcera)、促滤泡素α/lutrophin α倍孕力(Pergoveris)、epoietinζ(Retacrit、Silapo)、利巴韦林和干扰素α-2b(Rebetron联合疗法)、阿糖脑苷酶(西利酶)、伊米苷酶(Cerezyme)、人胰岛素(优泌林、诺和灵)、生长激素(Humatrope，Nutropin/Nutropin AQ)、舍莫瑞林(Geref)、人蛋氨生长素(Protopin)、人血白蛋白(Albutein)和吉妥珠单抗(Mylotarg)。

可使用依据任何性质表征克隆的已知的测试选择具有最适合于分泌蛋白质表达的性质的细胞和细胞系，所述性质包括但不限于：翻译后加工或修饰、产量、百分比活性产物、某些性质的稳定性(例如，通过随着时间推移测试本文中描述的性质)和化学计量(例如，通过RT-PCR或蛋白质分析)。

分泌蛋白质的翻译后加工或修饰可通过本领域内已知的测试来表征，以选择导致分泌蛋白质产物的特定或所需形式的细胞系和条件，所述测试包括但不限于蛋白质测序、质谱法、测试糖基化或磷酸化的方法或化学基团或残基的共价添加。可设计或选择细胞和细胞系来表达影响分泌产物的翻译后加工或修饰的一个或多个因子，例如通过引入对应于催化翻译后加工或修饰的酶的序列或通过测试细胞系以选择内源性表达此类酶或经基因激活以表达此类酶的细胞系来进行。

具有最大分泌产物的产量或产率的细胞和细胞系可通过使用估计分泌的蛋白质产物的水平的方法例如使用ELISA法(例如，检测FC片段以估计抗体产率的ELISA)测试分离的克隆来产生。

导致与分泌产物的总产量相比较最大百分比的活性分泌蛋白质的细胞和细胞系可通过使用估量蛋白质的活性或结合的方法，例如通过使用活性测定、功能测定或结合测定例如基于功能细胞的测定、利用包含结合表位的捕获试剂的ELISA、二次测试、动物研究或用于测量蛋白质的结合或活性的试验测试分离的克隆来产生。

额外地被最优化以在不含动物组分的培养基条件中和/或悬浮条件(如用于按比例放大生产的反应器中所使用的)中生长的细胞系可以通过操作用于在此类和/或相似条件下进行细胞系产生的方法或通过在此类所需条件下测试克隆以鉴定具有所需性质的那些细胞系来产生。在某些实施方案中，额外地被最优化以在补充有通常延迟或阻碍细胞生长的化合物的培养基中生长的细胞系可通过选择在此类条件下与相同类型的大多数细胞相比较显示正常或提高的生长的细胞来产生。

在某些实施方案中，表达根据本发明的目的蛋白质的细胞或细胞系可用于产生目的蛋白质。本文中包括了使用具有某些有利于蛋白质生产的生理特性和/或已进行改造以表达一种或多种蛋白质表达辅助因子的细胞产生蛋白质的方法。在某些实施方案中，进一步修饰和/或选择如本文中所描述的一致且可重现地表达(例如，进行选自：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月的时间段)目的蛋白质的细胞以提供改善的用于蛋白质生产的环境。在某些实施方案中，经改造以表达目的蛋白质和蛋白质表达辅助因子的细胞可用于产生目的蛋白质。在某些更具体的实施方案中，一致且可重现地表达目的蛋白质和/或蛋白质表达辅助因子。

在某些实施方案中，目的蛋白质是生物制品，例如用于治疗用途的抗体。可按照本文中描述的方法产生任何目的蛋白质或其片段，包括但不限于膜蛋白、跨膜蛋白、结构蛋白、膜锚定蛋白质、细胞表面受体、分泌蛋白质、细胞溶胶蛋白质、异源多聚体蛋白质、同源多聚体蛋白质、二聚体蛋白质、单体蛋白质、翻译后修饰的蛋白质、糖基化蛋白质、磷酸化蛋白质和蛋白酶解加工的蛋白质。此类蛋白质的具体实例包括但不限于抗体(包括抗体片段例如Fab和Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fv、dAb等、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、重链、轻链和所有抗体种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、酶、凝血因子、激素、细胞因子、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)和转运蛋白。其它示例性生物制品包括本文上文中公开的生物制品。

在某些实施方案中，有利于蛋白质生产的细胞产生比参照细胞多至少1％，2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、250％、500％或至少1000％的目的蛋白质。在某些实施方案中，有利于蛋白质生产的细胞产生具有比参照细胞中表达的相同目的蛋白质活性高至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、250％、500％或至少1000％的目的蛋白质。活性可以是指例如对目的蛋白质的结合伴侣的酶促活性或结合活性或治疗活性。在某些实施方案中，有利于蛋白质生产的细胞产生目的蛋白质，其中相对于参照细胞，多分泌至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、250％、500％或至少1000％的目的蛋白质。在某些实施方案中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或至少99％的目的蛋白质位于其中目的蛋白质在表达目的蛋白质而未进行基因改造的细胞中所位于的亚细胞区室中。估量细胞中蛋白质表达的参数包括蛋白质产量的定量/分析、加工、修饰、细胞内定位或分泌、最佳折叠/加工的总蛋白质的百分比。参照细胞可以是从其产生表达目的蛋白质的细胞的宿主细胞。本文中公开的任何细胞可用作参照细胞。

可使用本领域内已知的方法表征按照本文中提供的方法产生的蛋白质，所述方法包括蛋白质测序、质谱法、免疫细胞化学、分析糖基化和/或磷酸化的程度或类型的方法以及用于确定化学基团/或残基至产生的蛋白质的共价添加的方法。

可使用本领域内已知的方法(例如ELISA)鉴定最大的蛋白质总量的细胞。此外，可使用检测蛋白质的活性或蛋白质的结合的测定例如活性测定、功能测定、结合测定(例如，ELISA)、二次测试、动物研究或基于细胞的测定来鉴定导致与蛋白质的总产量相比较活性蛋白质的最大百分比的细胞。

在某些实施方案中，使用测试蛋白质测试表达目的蛋白质的细胞中蛋白质的表达，其中如果测试蛋白质以比参照细胞中的水平更高的水平表达，那么预测相同细胞中目的蛋白质以比参照细胞更高的水平表达。测试蛋白质可包括任何蛋白质，膜蛋白、跨膜蛋白、膜锚定蛋白、细胞表面受体、分泌蛋白、细胞溶胶蛋白、异源多聚体蛋白质、同源多聚体蛋白质、二聚体蛋白质、单体蛋白质、翻译后修饰的蛋白质、被糖基化/磷酸化/蛋白水解加工的蛋白质以及上述的任何可能的组合。在某些实施方案中，特定的测试蛋白质可包括抗体、离子通道、GPCR、转运蛋白。可只用一种或多种测试蛋白质测试细胞。在多种测试蛋白质的情况下，它们可以具有一个或多个类型(例如，多种GPCR，或仅一种GPCR、离子通道或抗体)。

可使用本领域内已知的方法、本文中描述的方法或其组合鉴定具有有利于蛋白质产生的生理特性的细胞(例如，具有增加的内质网质量的细胞)以及已进行改造以针对蛋白质生产被最优化(例如，通过引入编码有益于蛋白质生产的蛋白质的基因)的细胞。在鉴定了此类细胞后，可培养所述细胞并且可按照本文中描述的方法产生稳定地表达一个或多个编码有益于蛋白质生产的蛋白质的基因的细胞系。可通过在选择有利于蛋白质生产的细胞之前或之后引入转基因或通过基因激活将此类细胞系进行改造以表达目的蛋白质。然后可使用本领域内已知的方法和/或本文中描述的方法鉴定产生目的蛋白质的细胞。

具有有利于蛋白质生产的生理特性的细胞包括但不限于具有提高的活力、增加的细胞大小、增加的内源性表达的蛋白质的产量、增加的线粒体活性、提高的稳定性和维持针对其选择它们的性质的能力、增加的参与蛋白质加工的一种或多种细胞器(例如，内质网和核糖体)的大小以及增加的参与蛋白质加工的一种或多种细胞器(例如，溶酶体和内涵体)的含量的细胞。可将此类生理特性与参照细胞或参照细胞的历史值相比较。

可使用与荧光标记的探针的标准方法组合的FACS分析来鉴定有利于蛋白质生产的生理特性的细胞。具体地，将某些生理特性的标记用于定量与蛋白质表达相关的生理特性并且将其与参考细胞相比较。此类标记包括检测与蛋白质表达相关的细胞结构例如核糖体、线粒体、ER、rER、高尔基体、TGN、小囊泡、内涵体和质膜的分子。此类标记可以是荧光染料。例如，某些细胞器的活性，例如线粒体活性可通过测定荧光代谢物来进行估量。可使用报告细胞器/区室的活性(例如线粒体活性，或糖至蛋白质上的整合(这例如可使用荧光凝集素来检测))的荧光代谢物。对一种或多种参与蛋白质加工的细胞器特异的蛋白质标记可表达为与自发荧光蛋白质标签例如绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白；并且可用荧光探针标记膜蛋白和/或分泌蛋白。可将针对内源性表达的蛋白质探针(例如抗体)用作细胞器/区室的输出的标记。具体来说，异源多聚体膜蛋白可用作细胞内蛋白质表达活性的读出。

不受理论束缚，如通过FACS测量的荧光的增加可表明细胞具有有利于蛋白质生产的性质，并且可分离此类细胞以待将来使用。除了此类标准技术外，本文中描述的方法也可用于鉴定天然具有有利于蛋白质生产的生理特性的细胞。例如，可根据本文中描述的方法使用与内质网标志物(例如，ERp29、细胞色素P450、NADPH-细胞色素c还原酶、钙网蛋白)的靶序列互补的信号传导探针，以鉴定具有增加的内质网大小的细胞。显示如通过FACS测量的高度荧光的细胞可能具有增加的ER大小和/或含量，并且因此可具有有利于蛋白质生产的性质。

在一个实施方案中，鉴定具有有利于蛋白质生产的生理特性的细胞，然后将其用于开发用于产生目的蛋白质的稳定的细胞系。在另一个实施方案中，对细胞进行改造以表达目的蛋白质，然后鉴定表达目的蛋白质的细胞。然后鉴定表达目的蛋白质并且额外地具有有利于蛋白质生产的生理特性的细胞。然后将此类细胞用于开发产生目的蛋白质的稳定的细胞系。

在示例性实施方案中，用编码目的蛋白质的核酸转染细胞；将能够检测核酸转录的荧光寡核苷酸引入细胞；将针对与蛋白质表达相关的生理特性的标记的荧光探针引入细胞；选择表达目的蛋白质并且具有增加的与蛋白质表达相关的生理特性的水平的细胞。然后可建立一致地且可重现性地表达目的蛋白质的细胞系。

可对用于本文中提供的蛋白质生产的方法的细胞进行改造以表达蛋白质表达辅助因子或两种或更多种蛋白质表达辅助因子的组合。在某些实施方案中，对细胞进行改造以表达剪接变体、突变体或蛋白质表达辅助因子的片段。在某些实施方案中，对细胞进行改造以表达至少2、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100或150种蛋白质表达辅助因子。示例性蛋白质表达辅助因子包括：调节未折叠蛋白质应答(UPR)的蛋白质和编码在UPR中被调节的蛋白质的基因(例如，ATF6α(剪接的)、IRE1α、IRE1β、PERCΔC、ATF4、YYI、NF-YA、NF-YB、NF-YC、XBP1(剪接的)、EDEM1)的蛋白质的基因；编码关闭由UPR诱导的细胞凋亡途径的蛋白质(例如，NRF2、HERP XIAP、GADD34、PPIα、PPIβ、PPIγ、DNAJC3)的基因；编码影响细胞生长、细胞存活、细胞死亡和细胞大小的蛋白质的基因；B细胞基因(例如，BLIMP-1、XBP1(剪接的))；编码参与蛋白运输的蛋白质(例如，Sec61Pα、Sec61Pβ、Sec61Pγ)的基因；编码参与糖基化的蛋白质(例如，SDF2-L)的基因；编码参与氧化的蛋白质(例如，ERO1α，ER01β的基因；编码抗细胞凋亡蛋白质(例如，Bcl-2sp、Bcl-xL、Bim trunk.Mut.、Ku70、14-3-3q mut.、VDAC2、BAP31mut.)的基因；编码参与内质网相关降解的蛋白质(例如，甘露糖苷酶1、HRD1)的基因；编码参与钙运输的蛋白质(例如，STC1、STC2、SERCA1、SERCA2、COD1)的基因；编码参与于脂肪生成/代谢的蛋白质(例如，INO1、PYC、SREBP1ΔC、SREBP2ΔC)的基因；以及编码参与蛋白质折叠和分泌(例如，CRT(CaBP3)、CNX、ERp57(PDIA3)、BiP、BAP、ERdj3、CaBP1、GRP94(CaBP4)、ERp72(PDIA4)、亲环素B)、蛋白质装配、蛋白质至膜中的整合、蛋白质的细胞表面呈递和蛋白质的翻译后修饰的蛋白质的基因。在具体的实施方案中，对细胞进行改造以表达参与UPR的基因的任一个或其组合。在另一个具体实施方案中，对细胞进行改造以表达参与UPR的基因的任一个或其组合以及编码已知有益于蛋白质生产的蛋白质的至少一种其它基因。可使用调节UPR或在UPR中被调节的基因；改变细胞生长、活力、细胞凋亡、细胞死亡、细胞大小的基因；编码参与蛋白质折叠、装配、膜整合、细胞表面呈递或分泌、翻译后修饰(包括糖基化/磷酸化/蛋白酶解)的伴侣分子或因子的基因。在某些实施方案中，蛋白质表达辅助因子改变细胞的生理特性。

表达编码已知有益于蛋白质生产的蛋白质的基因之一或其组合的细胞的鉴定可使用本文中描述的方法来实现，例如，可产生结合目的基因/mRNA中的靶序列的信号探针，然后通过FACS分析进行证实目的基因/mRNA的存在。

在示例性实施方案中，用编码目的蛋白质的第一核酸和编码蛋白质表达辅助因子的第二核酸转染细胞；将能够检测第一核酸的转录的荧光寡核苷酸和能够检测第二核酸的转录的荧光寡核苷酸引入细胞；选择表达目的蛋白质的细胞和蛋白质表达辅助因子的细胞。然后可建立一致地且可重现地表达目的蛋白质的细胞系。还可针对与如上所述的蛋白质表达相关的生理性质进一步测试细胞系。

在一个实施方案中，首先对细胞进行改造以表达蛋白质表达辅助因子；建立表达蛋白质表达辅助因子的细胞系，然后对细胞系的细胞进行改造以表达目的蛋白质。在另一个实施方案中，首先对细胞进行改造以表达目的蛋白质；建立表达目的蛋白质的细胞系，然后对细胞系的细胞进行改造以表达蛋白质表达辅助因子。在另一个实施方案中，同时对细胞进行改造以表达目的蛋白质和蛋白质表达辅助因子。然后可如本文中所述建立一致地且可重现地表达目的蛋白质和/或蛋白质表达辅助因子的细胞系。

在某些实施方案中，提供多个已进行改造以表达目的蛋白质的细胞。然后对此类细胞进行改造以表达蛋白质表达辅助因子和/或通过使用上文所述的与蛋白质表达相关的生理特性的标记从多个细胞中选择最有利于蛋白质表达的细胞。

在某些实施方案中，可按照本文中提供的方法最优化细胞系以在不含动物组分的培养基和/或悬浮条件(如在用于按比例放大生产的反应器中所使用的)中生长。在某些更具体的实施方案中，可最优化细胞系以在包含减缓生长的组分的培养基中生长。

在其它示例性实施方案中，提供了用于蛋白质生产的方法，其包括(i)鉴定具有利于蛋白质生产的生理特性的细胞；(ii)对所述细胞进行改造以表达目的蛋白质；(iii)产生稳定地表达目的蛋白质的细胞系；(iv)在适合于目的蛋白质生产的条件下培养细胞；和(v)分离目的蛋白质。

在另一个实施方案中，提供了用于蛋白质生产的方法，其包括(i)向细胞中引入至少一个编码蛋白质表达辅助因子的基因；(ii)鉴定表达蛋白质表达辅助因子的细胞；(iii)对细胞进行改造以表达目的蛋白质；(iv)产生稳定地表达目的蛋白质的细胞系；(v)在适合于目的蛋白质的产生的条件下培养细胞；和(vi)分离目的蛋白质。

在另一个实施方案中，提供了用于蛋白质生产的方法，其包括(i)向细胞中引入至少一个编码蛋白质表达辅助因子的基因；(ii)鉴定表达蛋白质表达辅助因子的细胞；(iii)鉴定具有有利于蛋白质生产的生理特性的细胞；(iv)对细胞进行改造以表达目的蛋白质；(v)产生稳定地表达目的蛋白质的细胞系；(vi)在适合于目的蛋白质生产的条件下培养细胞；和(vii)分离目的蛋白质。在本实施方案的一个方面中，相继地进行步骤(ii)和(iii)。在另一个方面中，同时进行步骤(ii)和(iii)。

在另一个实施方案中，提供了用于蛋白质生产的方法，其包括(i)向细胞中引入至少一个编码蛋白质表达辅助因子的基因和对细胞进行改造以表达目的蛋白质；(ii)鉴定表达蛋白质表达辅助因子和目的蛋白质的细胞；(iii)产生稳定地表达蛋白质表达辅助因子和目的蛋白质的细胞系；(iv)在适合于目的蛋白质生产的条件下培养细胞；和(v)分离目的蛋白质。

在另一个实施方案中，提供了用于蛋白质生产的方法，所述方法包括(i)将编码蛋白质表达辅助因子的至少一个基因引入细胞并且对所述细胞进行改造以表达目的蛋白质；(ii)鉴定表达蛋白质表达辅助因子和目的蛋白质的细胞；(iii)鉴定具有有利于蛋白质生产的生理特性的细胞；(iv)产生一致且可重现地表达蛋白质表达辅助因子和目的蛋白质的细胞系；(v)在适合于目的蛋白质生产的条件下培养所述细胞；以及(vi)分离目的蛋白质。在本实施方案的一个方面，相继地进行步骤(ii)和(iii)。在另一个方面中，同时进行步骤(ii)和(iii)。

可用于产生适合于蛋白质生产的细胞的宿主细胞包括原代细胞和永生化细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞可以是例如CHO细胞、NS0细胞、PerC6细胞、酵母细胞、昆虫细胞、293细胞、CACO细胞、HUVEC、CHOK1、CHOKiSV、NS0、293T细胞和昆虫细胞。

在某些实施方案中，在1、2或5周内产生或能够产生每升0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1至1.5、1.5至2.0、2.0至2.5、2.5至3.0、3.0至3.5、3.5至4.0、4.0至4.5、4.5至5.0、5.0至5.5、5.5至6.0、6.5至7.0、7.0至7.5、7.5至8.0、8.0至8.5、8.5至9.0、9.0至9.5、9.5至10.0、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、17至18、18至19、19至20、20至25或超过25克目的蛋白的细胞或细胞系。在某些实施方案中，在2、3、4、5、6、7、8或9个月内产生产每升0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1至1.5、1.5至2.0、2.0至2.5、2.5至3.0、3.0至3.5、3.5至4.0、4.0至4.5、4.5至5.0、5.0至5.5、5.5至6.0、6.5至7.0、7.0至7.5、7.5至8.0、8.0至8.5、8.5至9.0、9.0至9.5、9.5至10.0、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、17至18、18至19、19至20、20至25或超过25克目的蛋白质的细胞或细胞系。在某些实施方案中，细胞在1、3、4、5、6、7、8、9、10个月内是稳定的，其中蛋白质的水平改变不超过30％。在某些实施方案中，细胞在连续培养中在1年、2年或更长时间内是稳定的，其中蛋白质的水平改变不超过30％。在某些实施方案中，目的蛋白质为可用于临床应用的生物制品或蛋白质。在某些实施方案中，目的蛋白质是抗体。在某些实施方案中，目的蛋白质是被修饰、翻译后修饰或糖基化的。在某些实施方案中，由细胞产生的蛋白质被细胞经过改造而包含的第二蛋白质修饰、翻译后修饰或糖基化。

在某些实施方案中，本发明提供了在短时间段中产生匹配现有生物制品产品的性质的等价生物制品产品(例如，生物等价的或生物相似的生物制品)的方法。

通过顺次、平行或两者的组合产生用于实验对象组的不同细胞系，可以产生本发明的相匹配实验对象组。例如，可以单独制备每个细胞系并且随后使它们相匹配。更优选地，为了使细胞系之间的差异降到最低，顺次产生的细胞系可以在相同阶段或传代数时冷冻，并且平行解冻。更加优选地，平行制备细胞系。在某些实施方案中，可通过使用基本上相同的条件、方案或细胞培养步骤产生实验对象组的每一个细胞系来产生相匹配实验对象组。

在优选实施方案中，实验对象组中的细胞系平行进行筛选或测定。

根据本发明，相匹配实验对象组的细胞系维持在相同细胞培养条件下，包括但不限于相同培养基、温度等。实验对象组中的所有细胞系以相同频率进行传代，所述相同频率可以是任何所需频率，依赖于许多因素，包括细胞类型、生长速率。如应理解的，为了维持从实验对象组的细胞系到细胞系之间基本相等的细胞数目，应定期标准化细胞数目。

根据该方法，细胞可以以任何细胞培养形式进行培养，只要细胞或细胞系在测量生长速率的步骤前在单个培养物中分散。例如，为了方便起见，细胞可以最初合并用于在所需条件下培养，并且随后单个细胞分离成1个/细胞或器皿。

细胞可以以任何方便的细胞数目在多孔组织培养平板中进行培养。此类平板是可容易地商购获得的，并且是本领域普通技术人员众所周知的。在某些实施方案中，细胞可以优选在小瓶中或以任何其它方便的形式培养，各种形式将是技术人员已知的，并且是可容易地商购获得的。

在包括测量生长速率的步骤的实施方案中，在测量生长速率前，使细胞培养足够长的时间以使它们适应培养条件。如技术人员应当理解的，时间的长度将随许多因素而改变，所述因素例如细胞类型、所选择的条件、培养形式，并且可以是从1天到数天、1周或更长时间的任何时间量。

优选地，多个分离的细胞培养物中的每个单个培养物维持在下文讨论的基本等同的条件下，包括标准化的维持时间表。该方法的另一个有利特征是可以同时维持大量单个培养物，使得可以鉴定具有所需性状组的细胞，即使非常罕见。由于这些及其它原因，根据本发明，使用自动化细胞培养方法培养多个分离的细胞培养物以使条件对于每个孔基本等同。自动化细胞培养防止了人工细胞培养固有的不可避免的变异性。

任何自动化细胞培养系统都可以在本发明的方法中使用。许多自动化细胞培养系统是商购可得的，并且是技术人员众所周知的。在某些实施方案中，此类系统可适合用于自动化或标准化细胞或细胞系的多个分离的培养物的培养。在某些实施方案中，此类系统可适合用于在基本上相同的条件下自动化或标准化细胞或细胞系的多个分离的培养物的培养。在某些实施方案中，此类系统可适合用于在基本上相同的条件下自动化或标准化细胞或细胞系的多个分离的培养物的平行培养。在某些实施方案中，此类系统可适合用于自动化或标准化细胞或细胞系的多个分离的培养物的培养，使得在培养过程中维持细胞的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或50种以上的生理特性。在某些实施方案中，此类系统可适合用于自动化或标准化细胞或细胞系的多个分离的培养物的培养，使得细胞或细胞系稳定地表达目的RNA或目的蛋白质。在某些实施方案中，此类系统可适合用于自动化或标准化细胞或细胞系的多个分离的培养物的培养，使得维持细胞的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50种或50种以上的生理特性并且使得细胞或细胞系稳定地表达目的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，自动化系统是机器人系统。优选，系统包括独立移动的通道、多通道头(例如96-尖端头)和夹子或择优挑选臂以及HEPA过滤装置以在操作过程中保持无菌。移液器中的通道数目应适合于培养形式。方便的移液器具有例如96或384个通道。此类系统是已知且商购可得的。例如，MICROLAB STAR^TM仪器(Hamilton)可以用于本发明的方法中。自动化系统应能够执行多种所需细胞培养任务。此类任务将是本领域普通技术人员已知的。它们包括但不限于：去除培养基、替换培养基、添加试剂、细胞洗涤、去除洗涤溶液、加入分散剂、从培养器皿中取出细胞、将细胞加入培养器皿中等等。

本发明的细胞或细胞系的产生可包括许多分离的细胞培养物。然而，由所述方法提供的优点随着细胞数目的增加而增加。不存在可以在该方法中利用的细胞或分离的细胞培养物的数目的理论上限。根据本发明，分离的细胞培养物的数目可以是2个或更多个，但更优选为至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个分离的细胞培养物，例如至少12个、至少15个、至少20个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少48个、至少50个、至少75个、至少96个、至少100个、至少200个、至少300个、至少384个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个、至少500,000个或更多个。

在某些实施方案中，如所述培养的本发明的细胞和细胞系是先前已对于目的核酸选择为阳性的细胞，所述目的核酸可以是编码全部或部分目的蛋白质的所引入核酸，或激活编码全部或部分目的蛋白质的序列的转录的所引入核酸。在某些实施方案中，如本文中所述培养的细胞是其中至少两种已针对目的RNA或编码目的蛋白质的RNA选择为阳性的细胞。

为了制备本发明的细胞和细胞系，可使用例如美国专利6,692,965和WO/2005/079462中描述的技术。这两篇文献都通过引用整体并入本文。这个技术提供数百万细胞的实时评估，从而使得任何所需数目的克隆(从数百个到数千个克隆)。使用细胞分选技术，例如流式细胞术细胞分选(例如用FACS机器)或磁性细胞分选(例如用MACS机器)，1个细胞/孔可以以高统计可靠性自动地存放于培养器皿(例如96孔培养平板)中。技术的速度和自动化允许容易地分离多基因重组细胞系。在某些实施方案中，集合对于所需信号是阳性的细胞(即，表达所需RNA的细胞)。然后可将这样的集合物进行第二轮选择。在某些实施方案中，将所述细胞的集合物经历总共至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25轮或至少50轮选择。

使用该技术，使用信号传导探针，也称为分子信标或荧光探针，可以检测出关于目的蛋白质的RNA序列。在某些实施方案中，包含编码序列的载体具有编码RNA标签序列的另外序列。“标签序列’是指其为经表达的RNA或待通过信号传导探针检测的RNA的部分的核酸序列。信号传导探针可以检测出多种RNA序列，其中任何一种都可以用作标签，包括编码肽的那些和上文描述的蛋白质标签。通过将探针设计为包括与标签的序列互补的部分，信号传导探针可以针对标签。标签序列可以是质粒的3′非翻译区，其与目的蛋白质的转录物一起共转录，并且包括用于信号传导探针结合的靶序列。标签序列可以与基因的信使的蛋白质编码部分一起在框内或与其一起在框外，取决于是否希望给产生的蛋白质加上标签。因此，标簦序列不必被翻译用于通过信号传导探针检测。标签序列可以包括相同或不同的多种靶序列，其中一种信号传导探针与每种靶序列杂交。标签序列可以定位在编码目的基因的RNA内，或标签序列可以定位在5′-或3′-非翻译区内。标签序列可以是具有二级结构的RNA。结构可以是三臂连接结构。在某些实施方案中，信号传导探针检测在目的蛋白质的编码序列内的序列。标签序列可包含经化学修饰的核苷酸。可如2005年9月1日公布的国际专利申请公开No.WO2005/079462(申请No.PCT/US05/005080)中所述产生和使用标签序列。

在DNA构建体转染到细胞内和后续药物选择(如果使用)后，或在基因激活后，其各自靶向不同的标签序列且差异标记的分子信标(例如荧光探针)可以引入细胞内，并且流式细胞术细胞分选器用于分离对于其信号为阳性的细胞(可以执行多轮分选)。在一个实施方案中，流式细胞术细胞分选器是FACS机器。还可以使用MACS(磁性细胞分选)或使用激光激活的分析和加工的阴性细胞的激光消融。还可以使用其它荧光平板读取器，包括与高通量筛选相容的那些。信号阳性细胞摄取一种或多种所引入序列的至少一个拷贝，并且可以将它整合到其基因组内。随后鉴定引入关于目的蛋白质的信使的细胞。例如，编码序列可以整合到细胞中的基因组的不同位置处。所引入序列的表达水平可以基于拷贝数或整合位点而改变。此外，可以获得包括目的蛋白质的细胞，其中一种或多种所引入核酸是附加型(episomal)的或起因于基因激活。

用于本发明的信号传导探针在本领域内是已知的并且通常是包含与靶序列互补的序列和信号发射系统的寡核苷酸，所述与靶序列互补的序列和信号发射系统这样排列以使当探针未结合靶序列时无信号发射并且当探针与靶序列结合时发射信号。作为非限定性示例，信号传导探针可包含位于探针上的荧光基团和猝灭剂，从而使得猝灭剂与荧光基团在未结合的探针上结合在一起。当探针与靶序列结合时，猝灭剂与荧光基团分离，从而导致信号的发射。例如国际公开案WO/2005/079462描述了可用于本发明的细胞和细胞系的产生的许多信号传导探针。上述将核酸引入细胞的方法可用于引入信号传导探针。

在使用标签序列的情况下，各载体(在使用多个载体的情况下)可包含相同或不同的标签序列。无论标签序列是否相同，信号传导探针都可包含不同的信号发射物例如具有不同颜色的荧光基团等，使得各亚单位的表达可被分别检测。作为举例说明，特异性检测第一目的RNA(例如，mRNA、siRNA或RNA寡核苷酸)的信号传导探针可包含红色荧光基团，检测第二目的RNA(例如，mRNA、siRNA或RNA寡核苷酸)的探针可包含绿色荧光基团，以及检测第三目的RNA(例如，mRNA、siRNA或RNA寡核苷酸)的探针可包含蓝色荧光基团。本领域普通技术人员知道用于在三重转染的细胞中利用信号传导探针差异地检测3个亚单位的表达的其它方法。

在一个实施方案中，信号传导探针设计为与编码目的蛋白质的RNA的部分或5’或3’非翻译区的部分互补。即使设计为识别目的信使RNA的信号传导探针能够检测虚假地内源性表达的靶序列，与由经转染的细胞产生的目的序列的比例相比较，这些的比例也是这样的，使得分选器能够区分2种细胞类型。

目的蛋白质的表达水平可以从细胞到细胞之间或从细胞系到细胞系之间不等。由于表观遗传学事件例如DNA甲基化以及基因沉默和转基因拷贝的丧失，细胞或细胞系中的表达水平还可以随着时间推移而下降。这些变异可以归于各种因素，例如由细胞摄取的转基因的拷贝数、转基因的基因组整合的位点、和在基因组整合后转基因的完整性。可以使用FACS或其它细胞分选方法(即MACS)评估表达水平。可以使用引入信号传导探针的另外轮次，例如以测定对于它们最初分离的任何一种或多种RNA，随着时间推移细胞是否保持阳性且至何种程度。

任选地，可以制备用于一个或多个生长速率组的培养物的一个或多个复制组。在某些情况下，冷冻一个或多个生长框的复制组例如以充当冷冻原种可以是有利的。然而，根据该方法，冷冻细胞原种可以按需要随时制备以及在其生产过程中的任何点和许多点上进行制备。用于冷冻细胞培养物的方法是本领域普通技术人员众所周知的。例如，复制组可以在任何温度下冷冻，例如在-70℃至-80℃下。在一个实施方案中，温育细胞直至达到70-100％汇合。接下来，抽吸培养基并且将90％FBS和10％培养基的溶液加入平板中，隔离并且冷冻。

本发明考虑了使用不同培养条件用任何数目的复制组执行该方法。即，该方法可以用在第一组培养条件下的第一多个(组)分离的细胞培养物和用在不同于第一种条件的第二组条件下培养的第二组分离的细胞培养物构成，对于任何所需数目的条件组依此类推。使用不同条件组的方法可以同时或顺次执行或两者的组合(例如同时2个组随后为2个更多的组，等等)。

用于选择具有目的蛋白质的一致功能表达的细胞的本文所述方法的一个优点是，细胞通过功能而不是通过特定核酸在细胞中的存在进行选择。包括编码目的蛋白质的核酸的细胞可能不表达它，或即使产生蛋白质，由于许多原因，蛋白质也可能不是有功能的，或与“天然”功能(即在天然表达蛋白质的其正常背景中在细胞中的功能)相比较具有改变的功能。通过基于功能选择细胞，本文描述的方法使得能够鉴定新型功能形式。例如，可以鉴定在相同测定中具有多种程度功能的多种细胞，例如用相同的测试化合物或用一系列化合物。差异功能提供了一系列功能“特性”。此类特性如用于鉴定差异影响蛋白质的不同功能形式的化合物。此类化合物用于鉴定蛋白质在特定组织或疾病状态等中的功能形式。

用于生产本发明的细胞和细胞系(包括表达复合蛋白或多个目的蛋白质的细胞)的方法的另外的优点是可以在比通过常规方法明显更少的时间内产生细胞。例如，依赖于许多因素(包括功能测定所需的细胞数目、生长速率框并是否完成和其它因素)，表达可证实具有功能的蛋白质的细胞可以在少至2天或1周内生产，但即使2周、3周、1个月、2个月、3个月或甚至6个月的生产时间也明显快于通过常规方法可以达到的，甚至对于复合蛋白或多个蛋白而言。

在另一个方面，本发明提供了使用本发明的细胞和细胞系的方法。本发明的细胞和细胞系可以用于需要功能性目的蛋白质的任何应用中。细胞和细胞系可以用于例如体外基于细胞的测定或体内测定中，在所述体内测定中，将细胞植入动物(例如；非人动物)中，以例如筛选调节剂；产生蛋白质以用于晶体学和结合研究；以及研究化合物选择性和剂量、受体/化合物结合动力学和稳定性、和受体表达对细胞生理学(例如，电生理学、蛋白质运输、蛋白质折叠和蛋白质调节)的效应。本发明的细胞和细胞系可以在敲低(knockdown)研究中用于检查目的蛋白质的作用。

本发明的细胞和细胞系还可以用于鉴定可溶性生物制品竞争剂，用于功能测定，生物淘选(例如，使用噬菌体展示文库)，基因芯片研究以评估基因表达中所产生的改变，双杂交研究以鉴定蛋白质一蛋白质相互作用，特异性亚单位在细胞系中的敲低以评估其作用，电生理学，蛋白质运输的研究，蛋白质折叠的研究，蛋白质调节的研究，针对蛋白质的抗体的产生，针对蛋白质的探针的分离，针对蛋白质的荧光探针的分离，蛋白质的表达对总体基因表达/加工的作用的研究，蛋白质的表达对总体蛋白质表达和加工的作用的研究，和蛋白质的表达对细胞结构、性质、特征的作用的研究。

本发明的细胞和细胞系进一步用于表征目的蛋白质(DNA、RNA或蛋白质)，包括DNA、RNA或蛋白质化学计量学、蛋白质折叠、装配、膜整合或表面呈递、构象、活性状态、激活电位、应答、功能和基于细胞的测定功能，其中目的蛋白质包括多基因系统、复合物或途径，无论这些的所有组分是由引入细胞内的一种或多种靶基因提供，还是由所引入和内源性表达的序列的任何组合提供。

已进行改造以表达多聚体(二聚化、三聚化或更高级的多聚化)蛋白质的一个或多个亚单位的细胞和细胞系可产生该多聚体蛋白质的不同形式。本发明提供了区别具有不同形式的多聚体蛋白质的细胞的方法。多聚体蛋白质的功能形式可随下述因素而变化：细胞的生理状态、靶的可选择的剪接或翻译后修饰(包括蛋白酶解)、其与辅助或相互作用因子的结合或其折叠、装配或在细胞膜中的整合。不同亚单位的装配和化学计量还增加了异源多聚体靶的可能功能形式的数目。功能形式可在它们对测试化合物的应答或它们随着时间推移的活性的动力学方面不同。表达不同功能形式的多聚体蛋白质的细胞的比较分析允许鉴定包含特定功能形式的细胞。

在某些实施方案中，多聚体蛋白质是至少两个蛋白质亚单位的物理或生物化学缔合。在某些实施方案中，多聚体蛋白质是一个蛋白质亚单位与蛋白质亚单位的辅助因子的物理或生物化学缔合。在某些实施方案中，多聚体蛋白质具有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚单位。亚单位可以是相同的多肽或不同的多肽或其组合。多聚体蛋白质可以是本文中公开的任何多聚体蛋白质。

可通过测试一种或多种化合物对细胞系中靶活性的效应来确定表达目的靶的细胞系的如本文中所述的功能活性或药理特性。根据此类药理特性分组或分类克隆可用于产生代表靶的每一种可能形式的细胞系的实验对象组。可通过饱和筛选，即通过测试至少许多细胞系(以使由其药理特性确定的每一种形式由至少2、3、5、10、25、50或至少100个细胞系代表)来寻求所有可能功能形式的代表。

在某些实施方案中，在细胞周期的特定点(例如，M、S、G₁或G₂期)测定化合物对目的靶的效应。在另一个实施方案中，在随着时间推移(例如在1、5、10、15、20、30、40、50秒内；在1、5、10、15、20、30、40、50分钟内；在1、5、10、15、20小时内；1、2、5、10、20、30天内或在1、2、5、10个月内)监控化合物对目的靶的效应。

在某些实施方案中，对于异源多聚体蛋白质，可使用各自包含所有亚单位的多个细胞系产生多个异聚目的蛋白质的药理特性，即，每个细胞系一个特性。细胞系之间的生理学特性的差异区分了异聚目的蛋白质的不同形式，例如亚单位的可变装配或化学计量。

对表达不同或少于所有亚单位的细胞的比较可用于确定单个亚单位的功能性。

其中不同的亚单位组合可获得并且可进行功能性测试的异源多聚体蛋白质的实例包括但不限于：

GABA(A)受体异源多聚体组合(参见，例如，Olsen和Sieghart，″International Union of Pharmacology.LXX.Subtypes ofy-Aminobutyric Acid_A Receptors：Classification of the Basis of SubunitComposition，Pharmacology，and Function.Update″，PharmacologicalReviews，60：243-260，2008，该文献通过引用整体并入本文)：

GABA(A)亚单位包括但不限于、GABRA1(αi)、GABRA2(α2)、GABRA3(α3)、GABRA4(α4)、GABRA5(α5)、GABRA6(α6)、GABRB1(β1)、GABRB2(β2)、GABRB3(β3)、GABRG1(γ1)、GABRG2(γ2)、GABRG3(γ3)、GABRD(δ)、GABRE(ε)、GABRP(π)和GABRQ(θ)；

GABA(A)亚单位组合包括但不限于α1β2γ2、α2βγ2、α3βγ2、α4βγ2、α4β2δ、α4β3δ、α5βγ2、α6βγ2、α6β2δ、α6β3δ、ρ、α1β3γ2、α1βδ、α5β3γ2、αβlγ、αβ1δ、αβ、α1α6βγ、α1α6βδ、ρ1、ρ2、ρ3、αβγ1、αβγ3、αβθ、αβε和αβπ；

nAChR异源多聚体受体组合(参见，例如，Gotti，Zoli和Clementi，″Brain nicotinic acetylcholine receptors：native subtypes and theirrelevance″，Trends in Pharmacological Sciences，27：482-491，2006，和N.Millar Neuropharmacology第56卷，Issue 1，2009年1月，第237-246页，其全部内容通过引用整体并入本文)：

nAChR亚单位包括但不限于CHRNA1(α1)、CHRNA2(α2)、CHRNA3(α3)、CHRNA4(α4)、CHRNA5(α5)、CHRNA6(α6)、CHRNA7(α7)、CHRNA8(α8)、CHRNA9(α9)、CHRNA10(α10)、CHRNB1(β1)、CHRNB2(β2)、CHRNB3(β3)、CHRNB4(β4)、CHRND(δ)和CHRNE(ε)；

nAChR亚单位组合包括但不限于α1β1γδ、α1β1δ、α1β1δε、α2α4β2、α2α5β2、α2β2、α2β4、α2α6β2、α3α4β2、α3α4α6β2、α3α5β2、α3α3β4、α3α5β2β4、α3α5β4、α3α6β2、α3β2、α3β3、α3β2β3、α3β2β4、α3β2β4、α3β4、α4α5β2、α4α6β2β3、α4β2、α4β4、α6β2、α6β2β3、α6α4β2、α6β2β3α6β3β4、α6β4、α7、α7α8、α8和α9α10；

5-HT₃异聚受体(参见，例如，N.M.Barnes等人，Neuropharmacology 56(2009)273-284，其通过引用整体并入本文)：

5-HT₃亚单位包括但不限于HTR3A(A)、HTR3B(B)、HTR3C(C)、HTR3D(D)和HTR3E(E)；

5-HT₃亚单位组合包括但不限于AB、AC、AD和AE；

甘氨酸异聚受体(参见，例如，JW Lynch Neuropharmacology56(2009)303-309，其通过引用整体并入本文)：

甘氨酸受体亚单位包括但不限于GLRA1(α1)、GLRA2(α2)、GLRA3(α3)、GLRA4(α4)和GLRB(β)；

甘氨酸受体亚单位组合包括但不限于、α1α3，α1β，α2β，α3β和α4β；

谷氨酸异聚受体(参见，例如，Perrais，Neuropharmacology56(2009)131-140；Jane，Neuropharmacology 56(2009)90-113；和W.Lu、Neuron，62，(2009)2，254-268，其通过引用整体并入本文)：

谷氨酸受体亚单位包括但不限于GRIK1(K1)、GRIK2(K2)、GRIK3(K3)、GRIK5(K5)、GRIM(A1)、GRIA2(A2)和GRIA3(A3)；

谷氨酸受体亚单位组合包括但不限于K2K3、K1K2、K1K5、K2K5、A1A2、A1A3和A2A3；

ATP-门控P2X异聚受体(参见，例如，M.F.Jarvis，B.S.Khakh，Neuropharmacology 56(2009)208-215；和S Robertson，Current Opinionin Neurobiology 11，2001，378-386，其通过引用整体并入本文)：

ATP-门控P2X受体亚单位包括但不限于P2RX1(X1)、P2RX2(X2)、P2RX3(X3)、P2RX4(X4)、P2RX5(X5)、P2RX6(X6)和P2RX7(X7)；

ATP-门控P2X受体亚单位组合包括但不限于X1/X2、X1/X4、X1/X5、X2/X3、X2/X6、X4/X6和X4/X7；

味觉受体：

味觉受体亚单位包括但不限于TAS1R1(T1R1)、TAS1R2(T1R2)、TAS1R3(T1R3)；

味觉受体亚单位组合包括但不限于T1R2/T1R3(甜味受体)、T1R1/T1R3(鲜味受体)；

GPCR异源多聚体，例如GPCR异源二聚体(参见，例如，Prinster，Hague和Hall，″Heterodimerization of G Protein-Coupled Receptors：Specificity and Functional Significance″，Pharmacological Reviews，57：289-298，2005，其全部内容通过引用整体并入本文)，包括但不限于：HTR1B(5-HT1B)/HTR1D(5HT1D)、ADORA1(腺苷A1)/DRD1(多巴胺D1)、ADORA1(腺苷A1)/P2RY1(P2Y1)、ADORA1(腺苷A1)/GRM1(mGluR1{α})、ADORA2a(腺苷A2A)/DRD2(多巴胺D2)、ADORA2a(腺苷)/GRM5(mGluR5)、AGTR1(血管紧张素1)/AGTR2(血管紧张素2)、AGTR1(血管紧张素1)/ADRB2({β}2AR)、AGTR1(血管紧张素1)/BDKRB2(缓激肽B2)、CASR(钙敏感受体)/GRM1(mGluRI)、CASR(钙敏感受体)/GRM5(mGluR5)、CCR2/CXCR4、CCR2/CCR5、CCR5/OPRD1(阿片类受体δ)、CCR5/OPRK1(阿片类受体κ)、CCR5/OPRM1(阿片类受体μ)、CCKRA(胆囊收缩素A)/CCKRB(胆囊收缩素B)、DRD1(多巴胺D1)/DRD2(多巴胺D2)、DRD2(多巴胺D2)/SSTR5、DRD2(多巴胺D2)/DRD3多巴胺D3、EDNRA(内皮缩血管肽A)/EDNRB(内皮缩血管肽B)、GABABR1/GABABR2、MTNR1A(褪黑激素MT1)/MTNR1B(褪黑激素MT2)、CHRM2(毒蕈碱型M2)/CHRM3(毒蕈碱型M3)、OXTR(缩宫素)/AVPR1A(加压素V1a)、OXTR(缩宫素)/AVPR2(加压素V2)、S1PR1(S1P1)/S1PR2(S1P2)、S1PR1(S1P1)/S1PR3(S1P3)、SSTR1/SSTR5、SSTR2A/SSTR3、SSTR2A/OPRM1(μ-OPR)、TACR1(P物质)/OPRM1(μ-OPR)、TRHR1/TRHR2、AVPR1A(加压素V1a)/AVPR2(加压素V2)、ADRA1B(α1BAR)/ADRA1A(α1AAR)、ADRA1B(α1BAR)/HRH1(组胺H1)、ADRA1B(α1BAR)/ADRA1D(α1DAR)、ADRA1D(α1DAR)/ADRB2D(β2AR)、ADRA2A(α2AAR)/ADRB1(β1AR)、ADRA2A(α2AAR)/OPRM1(μ-OPR)、ADRB1(β1AR)/ADRB2(β2AR)、ADRB2(β2AR)/OPRD1(δ-OPR)、ADRB2(β2AR)/OPRK1(K-OPR)、ADRB2(β2AR)/ADRB3(β3AR)、ADRB2(β2AR)/M71-OR、OPRK1(K-OPR)/OPRD1(δ-OPR)和OPRM1(μ-OPR)/OPRD1(δ-OPR)；

电压门控性钙通道(CaV)多亚单位复合物(参见，例如WA Catterall等人Pharmacol Rev 200557411-425，以及J Arikkath和K Campbell，Current Opinion in Neurobiology 2003，13：298-307，其全部内容通过引用整体并入本文)：

CaV亚单位包括但不限于CACNA1S(α_1s)、CACNA1C(α_1c)、CACNA1D(α_1D)、CACNA1F(α_1F)、CACNA1A(α1_A)、CACNA1B(α_1B)、CACNA1E(α₁E)、CACNB1(β1)、CACNB2(β2)、CACNB3(β3)、CACNB4(β4)、CACNA2D1(α2δ)、CACNG1(γ1)和CACNG2(γ2)；

CaV亚单位组合包括但不限于α_1Sβ_1aα₂δγ₁、α_1Sβ_1aα₂δ、α_1Cβ₂α₂δγ、α_1Cβ₃α₂δγ、α_1Dβα₂δ、α_1Fβ₃α₂δ、α_1Fβ₂α₂δ、α_1Aβ₃α₂δ、α_1Aβ₄α₂δ、α_1Aβ₃α₂δγ₁、α_1Aβ₃α₂δγ₂、α_1Aβ₄α₂δγ₁、α_1Aβ₄α₂δγ₂、α_1Bβ₁α₂δ、α_1Bβ₃α₂δ、α_1Bβ₄α₂δ、α_1Bβ₃α₂δγ₂和α_1Eβα₂δ；

电压门控性钠通道(NaV)多亚单位复合物(参见，例如WACatterall等人，Pharmacol.Rev.，200557397-409，其通过引用整体并入本文)：

NaV亚单位包括但不限于SCN1A(α1)、SCN2A(α2)、SCN3A(α3)、SCN4A(α4)、SCN5A(α5)、SCN8A(α6)、SCN9A(α7)、SCN1B(β1)、SCN2B(β2)、SCN3B(β3)和SCN4B(β4)；

NaV亚单位组合包括但不限于α₁/β₁、α₁/β₂、α₁/β₃、α₁/β₄、α₁/β₁/β₂、α₁/β₁/β₃、α1/β₁/β₄、α₁/β₂/β₃、α₁/β₂/β₄、α₁/β₃/β₄、α₂/β₁、α₂/β₂、α₂/β₃、α₂/β₄、α₂/β₁/β₂、α₂/β₁/β₃、α₂/β₁/β₄、α₂/β₂/β₃、α₂/β₂/β₄、α₂/β₃/β₄、α₃/β₁、α₃/β₃、α₄/β₁、α₅/β₁、α₅/β₂、α₅/β₃、α₅/β₄、α₅/β₁/β₂、α₅/β₁/β₃、α₅/β₁/β₄、α₅/β₂/β₃、α₅/β₂/β₄、α5/β₃/β₄、α₆/β₁、α₆/β₂、α₆/β₁/β₂、α₇/β₁、α₆/β₂2和α₇/β₁/β₂；

内向整流性钾通道-异聚/多亚单位复合物(参见，例如，Y Kubo等人Pharmacol.Rev.，200557509-526，其通过引用整体并入本文)：

内向整流性钾通道亚单位包括但不限于KCNJ2(K_ir2.1)、KCNJ12(K_ir2.2)、KCNJ4(K_ir2.3)、KCNJ14(K_ir2.4)、KCNJ3(K_ir3.1)、KCNJ6(K_ir3.2)、KCNJ9(K_ir3.3)、KCNJ5(K_ir3.4)和KCNJ10(K_ir4.1)；

内向整流性钾通道亚单位组合包括但不限于下表(表1)中所列的组合：

表1

电压门控性钾通道-异聚/多亚单位复合物(参见，例如，G Gutman等人Pharmacol.Rev.，200557473-508，其通过引用整体并入本文)：

电压门控性钾通道亚单位包括但不限于KCNA1(K_v1.1)、KCNA2(K_v1.2)、KCNA3(K_v1.3)、KCNA5(K_v1.5)、KCNA6(K_v1.6)、KCNA10(K_v1.8)、KCNB1(K_v2.1)KCNB2(K_v2.2)、KCNC4(K_V3.4)、KCND1(K_V4.1)、KCND2(K_v4.2)、KCND3(K_v4.3)、KCNF1(K_v5.1)KCNG1(K_V6.1)、KCNG2(K_v6.2)、KCNG3(K_V6.3)、KCNG4(K_v6.4)、KCNQ1(K_V7.1)、KCNQ2(K_v7.2)、KCNQ3(K_V7.3)、KCNQ4(K_v7.4)、KCNQ5(K_v7.5)、KCNV1(K_V8.1)、KCNV2(K_v8.2)、KCNS1(K_v9.1)、KCNS2(K_v9.2)、KCNS3(K_v9.3)、KCNH1(K_v10.1)、KCNH5(K_v10.2)、KCNH2(K_v11.1)、KCNH6(K_v11.2)、KCNH7(K_v11.3)、KCNAB1(K_vβ1)、KCNAB2(K_vβ2)、KCNAB3(K_vβ3)、KCNE1(minK)、KCNE2(MiRP1)、KCNE3(MiRP2)、KCNE4(MiRP3)、KCNE1L(KCNE1样)、KCNIP1、KCNIP2、KCNIP3和KCNIP4；

电压门控性钾通道亚单位组合包括但不限于下表(表2)中所列的组合：

表2

钙激活性钾通道-异聚体和多亚单位复合物(参见，例如，A Wei等人Pharmacol.Rev.，2005；57：463-472，其通过引用整体并入本文)：

钙激活钾性通道亚单位包括但不限于KCNMA1(K_Ca1.1)、KCNN1(K_Ca2.1)、KCNN2(K_Ca2.2)、KCNN3(K_Ca2.3)、KCNN4(K_Ca3.1)、KCNT1(K_Ca4.1)、KCNT2(K_Ca4.2)和KCNU1(K_Ca5.1)；

钙激活性钾通道亚单位组合包括但不限于下表(表3)中所列的亚单位组合：

表3

瞬时受体电位通道-异聚/多亚单位复合物(参见，例如，DEClapham等人Pharmacol.Rev.，2005；57(4)：427-450，其通过引用整体并入本文)：

瞬时受体电位通道亚单位包括但不限于TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPV-5、TRPM1和TRPM1-S；

瞬时受体电位通道亚单位组合包括但不限于下表(表4)中所列的那些：

表4

环核苷酸-调节性通道-异聚/多亚单位复合物(参见，例如，FHofmann等人Pharmacol.Rev.，2005；57(4)：455-462，其通过引用整体并入本文)；

环核苷酸-调节性通道亚单位包括但不限于CNGA、CNGB1a、CNGA2、CNGB1b、CNGA4、CNGA3、CNGB3、CNG4A和CNGA1；

环核苷酸-调节性通道亚单位组合包括但不限于CNGA1/CNGB1a、CNGA2/CNGB1b/CNGA4、CNGA3/CNGB3、CNG4A/CNGA2/CNGB1b、CNGB1a/CNGA1、CNGB1b/CNGA2/CNGA4和CNGB3/CNGA3；

上皮钠通道/退化蛋白-异聚/多亚单位复合物(参见，例如，AStaruschenko等人Biophys J，2005；88，3966-3975，H Yamamura等人European J Pharm.，2008，600，32-36，和S Kellenberger和L SchildPhysiol Rev，2002，82，735-767，所述文献全部内容通过引用整体并入本文)：

上皮钠通道/退化蛋白亚单位包括但不限于SCNN1A(ENaCα)、SCNN1B(β)、SCNN1G(γ)、SCNN1D(ENaCδ)、ACCN1、(ASIC2，两个剪接变体2a和2b)、ACCN3(ASIC3)；

上皮钠通道/退化蛋白亚单位组合包括但不限于ENaCαβγ、ENaCαδβγ、ENaCδβγ、ASIC2a/ASIC2b、ASIC2a/ASIC3和ASIC2b/ASIC3。

对于上文所列的异聚体蛋白质和本文中其它地方公开的异聚体蛋白质，可存在多得多的待确定的亚单位的组合。包含上文所列的组合的细胞系可用作针对可表达新型组合的那些细胞系的参照，从而使得可确定新型组合。例如，可利用各自表达一组相同亚单位的不同细胞系对一组相同化合物的不同反应特性来表征不同的亚单位组合。参见例如，下文中的实施例23。

用于由大基因家族确定的异源多聚体靶(例如，GABA或乙酰胆碱离子通道)的方法的大规模应用允许所有可能的亚单位组合或其亚组的多个细胞系进行交叉竞争分析。

在某些实施方案中，将基因激活用于本发明的方法、细胞和细胞系。在例如国际申请公开案WO 94/12650(其通过引用整体并入本文)中描述了基因激活。在某些实施方案中，可将同源重组用于遗传修饰细胞中编码ENaC(上皮钠通道)、GABA_A(γ-氨基丁酸A型)、NaV(电压门控钠离子通道)、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)或GCC(鸟苷酸环化酶C)的受体或受体亚单位的一个或多个内源基因的调控区，使得所述遗传修饰导致相对于遗传修饰前细胞中受体或受体亚单位的表达水平增加的EnaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或受体亚单位的表达。在某些实施方案中，所述遗传修饰导致表达增加至少10％、50％、100％、500％、1000％、5000％或至少10,000％。在某些实施方案中，细胞在基因激活前以本底水平表达受体或受体亚单位。

在某些实施方案中，通过同源重组引入启动子来与对于细胞是内源的ENaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位的编码序列有效连接。启动子可以是组成型活性启动子。具体地，启动子可以是在细胞中具有组成型活性的启动子。在其它实施方案中，启动子是条件启动子。可用于此类方法的细胞已在上文中进行了描述。在某些实施方案中，可将启动子随机插入细胞的基因组。然后可将荧光寡核苷酸用于选择其中随机插入的启动子激活目的RNA的表达的细胞。在某些实施方案中，目的RNA可以是ENaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位的RNA。在某些实施方案中，将调控DNA元件例如增强子或阻遏物在随机位置上插入基因组并且选择其中目的RNA被上调或下调的细胞。

在某些实施方案中，将同源重组用于将DNA引入细胞的基因组，从而使得内源基因得到表达。在某些实施方案中，内源基因可以是编码ENaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位的基因。在某些实施方案中，所引入的DNA包含可选择标记例如编码抗生素抗性的基因(例如，DHFR)。在某些实施方案中，在细胞的基因组中扩增内源基因。在某些实施方案中，扩增内源基因，使得细胞的基因组包含2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝、5个拷贝、6个拷贝、7个拷贝、8个拷贝、9个拷贝、10个拷贝、至少2个拷贝、至少5个拷贝、至少10个拷贝、至少15个拷贝、至少20个拷贝或至少25个拷贝的内源基因。在某些实施方案中，选择具有扩增的基因的稳定功能性表达的细胞。

还可修饰调控序列并且通过下文中描述的遗传变异方法实现表达。可在细胞系中产生遗传变异性，随后使用本文中描述的荧光探针选择表达ENaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位的细胞。

在某些实施方案中，在应用基因激活或产生遗传变异性之前细胞表达ENaC、GABAA、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位。然后将基因激活和/或遗传变异性的产生和选择用于产生和选择细胞，所述细胞表达另一种受体或相同受体的至少一个另外的亚单位和/或具有降低的受体或一个或多个受体亚单位(所述受体或亚单位在应用基因激活或产生遗传变异性之前被表达)的表达水平。

在某些实施方案中，辅助因子也在细胞中表达。辅助因子可在无遗传修饰的细胞中表达；辅助因子可表达为转基因；或可如上所述通过基因激活和/或产生基因变异性以及选择来表达辅助因子。辅助因子可以是促进目的受体或受体亚单位的转录和/或翻译和/或折叠和/或亚细胞定位和/或功能的因子。辅助因子可促进多亚单位受体的装配。

在某些实施方案中，本文中提供了表达完整受体或表达目的多亚单位受体的1、2、3、4或5个亚单位的细胞系。目的多亚单位受体可以是EnaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体或苦味受体。在某些实施方案中，受体和目的多亚单位受体的任何亚单位都不从转基因表达。在某些实施方案中，目的多亚单位受体的1、2、3、4或5个亚单位不从转基因表达。在某些实施方案中，完整受体或目的多亚单位受体的1、2、3、4或5个亚单位从编码受体或受体亚单位的内源基因的扩增的基因组区域表达。

在某些实施方案中，将基因组DNA转染或显微注射进入一群细胞，然后选择表达目的RNA的细胞。在某些实施方案中，目的RNA可以是EnaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体或苦味受体的受体或一个或多个亚单位。基因线DNA可获自表达目的RNA的细胞。在某些实施方案中，基因组DNA的供体细胞和受体细胞来自相同的物种。在某些实施方案中，供体细胞与受体细胞来自不同物种。

在某些实施方案中，基因组DNA的供体细胞可以是人、小鼠、昆虫、狗、驴、马、大鼠、豚鼠、鸟类或猴的细胞。在某些实施方案中，引入来自2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同物种的基因组DNA。在某些更特定的实施方案中，基因组DNA的不同供体物种具有目的基因的直向同源物。在其它实施方案中，供体物种不具有目的基因的直向同源物。

在某些实施方案中，基因组DNA片段是基因组的确定的区域并且包括目的基因。在某些实施方案中，基因组DNA片段大小为至少1kb、5kb、10kb、100kb、500kb或1000kb。

可使用本领域普通技术人员已知的任何方法从细胞提取基因组DNA。用于分离基因组DNA的示例性方法描述于Short Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人(编者)，John Wiley & Sons，Inc.，1999的单元2.2中。在某些实施方案中，非常温和地处理基因组DNA以避免DNA的剪切。在其它实施方案中，剪切基因组DNA以获得更小的DNA片段。在某些实施方案中，用不含DNA酶的蛋白酶处理DNA以从DNA除去任何蛋白质性质的物质。在其它实施方案中，不用蛋白酶处理基因组DNA，相反小心不要扰动与基因组DNA结合的蛋白质。在某些实施方案中，用不含DNA酶的RNA酶处理DNA。

可使用本领域普通技术人员已知的任何方法将基因组DNA引入细胞。在某些实施方案中，将基因组DNA转染进入细胞。在更具体的实施方案中，使用脂转染将基因组DNA转染进入细胞。用于将基因组DNA引入细胞的示例性方法描述于Short Protocols in MolecularBiology，Ausubel等人(编者)，John Wiley & Sons，Inc.，1999的第9章中。

可通过确定表达目的RNA的细胞的数目来确定有待引入细胞的基因组DNA的最佳量。在某些实施方案中，每细胞所引入的基因DNA的量对应于至少1个基因组的当量、至少10^-1个基因组的当量、至少10^-2个基因组的当量、至少10^-3个基因组的当量、至少10^-4个基因组的当量、至少10^-5个基因组的当量、至少10^-6个基因组的当量、至少10^-7个基因组的当量。在某些实施方案中，每细胞所引入的基因组DNA的量对应于至多1个基因组的当量、至多10^-1个基因组的当量、至多10^-2个基因组的当量、至多10^-3个基因组的当量、至多10^-4个基因组的当量、至多10^-5个基因组的当量、至多10^-6个基因组的当量、至多10^-7个基因组的当量。

在某些实施方案中，可通过本领域普通技术人员已知的任何方法扩增基因组DNA。在某些更具体的实施方案中，通过全基因扩增来扩增基因组DNA。

可使用任何方法来鉴定和分离其中已引入基因组DNA的那些细胞。在某些实施方案中，将编码标记基因的DNA与基因组DNA同时引入细胞。对于标记基因呈阳性的细胞也包含基因组DNA。可使用本领域普通技术人员已知的任何标记基因。标记基因的示例性实例包括其基因产物赋予细胞对特定抗生素的抗性(例如，新霉素抗性)的基因、其基因产物使得细胞能够在缺乏该细胞生长通常需要的物质的培养基上生长的基因或其产物编码可视标记的基因。可用于本发明的方法的可视标记是例如GFP。其中已引入编码可视标记的DNA和基因组DNA的细胞可使用FACS来分离。

在某些实施方案中，使用显微注射将基因组DNA引入细胞。

在某些实施方案中，将基因组DNA的片段引入载体以扩增基因组DNA。此类载体包括但不限于噬菌体、粘粒或YAC。本领域普通技术人员已知的任何方法可用于包装和扩增基因组DNA。

在某些实施方案中，本文中提供了以与非重组生物中目的多亚单位受体的亚单位的化学计量相同的亚单位的化学计量表达目的多亚单位受体的细胞系，其中所述细胞系所源自的细胞不表达目的多亚单位受体。在某些实施方案中，本文中提供了表达受体的细胞系，包括表达多亚单位受体的细胞系，其中细胞系中受体的药理特性匹配受体在通常于生物中表达靶的细胞中的药理特性。目的受体或多亚单位受体可以是例如ENaC、GABAA、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC。在某些实施方案中，细胞系在如上文中所述的不存在选择压力的情况下稳定地表达受体或多亚单位受体。

在某些方面中，本发明提供了用于鉴定、分离和富集天然存在并且表达ENaC、GABAA、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位的细胞的方法。在某些实施方案中，天然存在的细胞天然表达ENaC、GABAA、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或一个或多个受体亚单位。

在某些实施方案中，本文中描述的方法依赖于天然存在的遗传变异性和多样性。在某些实施方案中，分离的细胞由不超过细胞群体中的1/10、1/100、1/1000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或1/10,000,000的细胞代表。细胞的群体可以是从生物收获的原代细胞。在某些实施方案中，还可使用本领域普通技术人员已知的自然方法增加遗传变异性和多样性。可对宿主细胞进行用于产生或增加遗传变异性和/或多样性的任何适当的方法。不受理论束缚，这样的遗传变异性的产生在编码例如ENaC、GABAA、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或受体亚单位的基因的调控区中产生修饰。然后可如上所述选择表达此类亚单位的细胞。在某些实施方案中，内源性表达目的蛋白质的细胞分离自已经历至少50、100、500、750或至少1000次传代或已经历至少1、2、5或10个月或至少1、2、5、10年的连续培养的克隆细胞。

在其它实施方案中，可通过将细胞暴露于紫外光和/或X射线(例如，γ-射线)来获得遗传变异性。还可通过将基因组DNA、cDNA和/或mRNA引入细胞群体的细胞来在一群细胞中获得遗传变异性。在特定的实施方案中，如上所述引入基因组DNA的片段。在特定的实施方案中，引入基因组DNA的文库。在特定的实施方案中，引入cDNA文库。在特定的实施方案中，引入表达DNA文库。在某些实施方案中，基因组DNA、cDNA和/或mRNA源自与受体细胞的细胞类型不同的细胞类型。在具体的实施方案中，基因组DNA、cDNA和/或mRNA源自味觉细胞。

在其它实施方案中，可通过将细胞与EMS(甲烷磺酸乙酯)接触来获得遗传变异性。在某些实施方案中，可通过将细胞与诱变剂、致癌物或化学试剂接触来获得遗传变异性。此类试剂的非限定性实例包括脱氨试剂例如亚硝酸、嵌入剂和烷化剂。此类试剂的其它非限定性实例包括溴、叠氮化钠和苯。

在具体的实施方案中，可通过将细胞与最适度以下的生长条件例如低氧、低营养物、氧化胁迫或低氮接触来获得遗传变异性。

在某些实施方案中，导致DNA损伤或降低DNA复制或修复(例如错配修复)的保真度的酶可用于增加遗传变异性。在某些实施方案中，使用参与DNA修复的酶的抑制剂。在某些实施方案中，使用降低参与DNA复制的酶的保真度的化合物。在某些实施方案中，将导致DNA损伤和/或降低DNA复制或修复的保真度的蛋白质引入细胞(共表达、注射、转染、电穿孔)。

与某些条件或试剂接触的持续时间视使用的条件或试剂而定。在某些实施方案中，数秒或数分钟的接触是足够的。在其它实施方案中，数小时、数天或数月的接触是必需的。本领域普通技术人员将知道可使用的条件的持续时间和强度。

不受理论束缚，增加遗传变异性的方法在基因的启动子区域中产生突变或改变，其中所述突变或改变导致基因的转录调控例如基因激活的变化，其中所述基因比具有未改变的启动子区域的基因更高度地表达。在某些实施方案中，所述基因编码ENaC、GABAA、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC的受体或受体亚单位。通常，启动子区域包括调节基因转录的转录起始位点的基因组DNA序列上游，并且可包括最小启动子和/或增强子和/或阻遏区。启动子区域的范围可从约20个碱基对(bp)至约10,000个bp或更多。在具体的实施方案中，增加基因变异性的方法在目的基因的内含子中产生突变或改变，所述突变或改变导致基因的转录调节例如基因激活的变化，其中所述基因比具有未改变的内含子的基因被更高度地表达。在某些实施方案中，修饰非转录基因组DNA。例如，可添加、缺失或修饰启动子、增强子或修饰因子或阻遏区。在这些情况下，处于经修饰的调控区的控制下的转录物的转录可用作读出。例如，如果缺失阻遏物，那么对被阻遏物抑制的基因的转录物测试增加的转录水平。

在某些实施方案中，可通过定点诱变或同源重组突变细胞或生物的基因组。在某些实施方案中，可使用寡核苷酸或三重螺旋介导的重组。参见，例如，Faruqi等人，2000，Molecular and Cellular Biology20：990-1000和Schleifman等人2008，Methods Molecular Biology435：175-90。

在某些实施方案中，荧光寡核苷酸探针或分子信标可用于选择其中遗传修饰是成功的细胞，即其中表达转基因或目的基因的细胞。为了鉴定其中诱变或同源重组事件是成功的细胞，可使用与诱变的或重组的转录物特异性杂交的荧光寡核苷酸。在某些实施方案中，其中选择内源性表达目的蛋白质的细胞并且所述细胞是不表达目的蛋白质的细胞类型的细胞，可使用与编码目的蛋白质的RNA特异性杂交的荧光寡核苷酸来分离表达所需蛋白质的细胞。可如2004年2月17发布的Shekdar等人的美国专利No.6,692,965和以WO/2005/079462公开的国际申请No.PCT/US2005/005080中所描述的进行细胞的分离。在某些实施方案中，将对于所需信号是阳性的细胞(即，表达所需RNA的细胞)集合。然后可将这样的集合物经历第二轮选择。在某些实施方案中，将细胞的集合物经历总共至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25轮或至少50轮选择。

经改造以表达多聚体蛋白质的细胞和细胞系可包含多个不同功能形式的多聚体蛋白质。经改造从而包含多聚体蛋白质复合物的相同细胞或细胞系，当其在不同细胞培养条件下培养时，可包含不同功能形式或不同比例的相同或不同的功能性形式。培养条件可在温度、营养物浓度、血清添加、离子浓度、细胞密度、细胞周期的同步化、pH、酸度、碳酸化、大气条件、二氧化碳百分比、振荡、搅拌、紫外光暴露、代谢产物、血清、氨基酸、糖、碳水化合物、蛋白质、脂质、去垢剂、生长因子、辅因子、维生素、诱变剂、化学品、化合物或痕量金属的活性或浓度方面变化。经改造从而包含相同靶的不同细胞或细胞系可包含不同功能形式或不同比例的相同或不同功能形式。描述的方法可用于在相同或不同细胞培养条件下培养的经改造从而包含相同或不同多聚体蛋白质的细胞或细胞系的比较分析。

在某些实施方案中，用于表征多聚体蛋白质和产生表达不同形式的目的多聚体蛋白质的细胞或细胞系的方法的不同细胞或细胞系是本文中描述的细胞或细胞系例如，具有基本上一致的生理特性的细胞或细胞系、表达不包含蛋白质标签的目的蛋白质的细胞或细胞系或在功能测试中具有至少0.4的Z’因子的细胞或细胞系，或在不存在选择压力的情况下培养的细胞或细胞系，或其任何组合。在某些实施方案中，在基本上相同的培养条件下平行地维持待使用的不同细胞或细胞系。本文中描述的机器人方法可用于维持和操作表达不同形式的目的多聚体蛋白质的细胞或细胞系。在某些实施方案中，本发明提供了从所引入的编码所述目的多聚体蛋白质或其一个或多个亚单位的核酸表达多聚(二聚、三聚或更高级的多聚化)目的蛋白质的细胞或细胞系，其中在不存在选择压力的情况下培养细胞和/或其中如本文中所述一致地表达蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供了产生包括多个细胞系的细胞系的实验对象组方法，其中多个细胞系的每一个细胞系合成不同形式的目的多聚体蛋白质。在上文中进一步公开了多聚目的蛋白质。不受理论束缚，多聚体蛋白质的不同形式相异在于例如它们的亚单位组合、单个亚单位的翻译后修饰和/或亚细胞定位(例如，相对于细胞骨架；对于跨膜蛋白：膜整合/定位、退出内质网、退出高尔基体；以及对于分泌的蛋白质：退出内质网、退出高尔基体)。在某些实施方案中，可通过始于宿主细胞的特定克隆或品系，然后改造该宿主细胞以表达目的多聚体蛋白质的一个或多个亚单位来产生此类实验对象组。在某些实施方案中，引入编码一个或多个亚单位的转基因。在其它实施方案中，利用基因激活。可通过本领域普通技术人员已知的任何方法选择已被成功地改造以表达一个或多个亚单位的细胞。在某些实施方案中，使用荧光寡核苷酸或分子信标(参见，例如，公开为WO/2005/079462的国际申请No.PCT/US2005/005080)选择阳性细胞。从已鉴定的细胞建立细胞系。在某些实施方案中，从相同的材料(例如，相同的宿主亲代克隆、用于改造一个或多个亚单位的表达的相同核酸)和相同的方案(例如，相同的细胞培养方法、相同的基因改造方法)产生所得的细胞系。不受理论束缚，所得的细胞系在任何转基因在宿主细胞的基因组中的插入位点方面和/或在任何转基因在基因组中飞拷贝数目方面可变化。令人惊讶地，发现所得的细胞系可合成不同形式的多聚体蛋白质。合成不同形式的多聚体蛋白质的细胞系可通过建立各细胞系的药理特性来鉴定。针对某些化合物在各种细胞系中测试它们对多聚体蛋白质的效应。可随着时间推移监控活性。可建立剂量-反应曲线。在某些实施方案中，每细胞系测试至少2、5、10、25、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、7500种或至少10000种不同的化合物以产生由特定细胞系合成的多聚体蛋白质的药理指纹。然后将所得的各细胞系的药理指纹相互比较。如果药理指纹基本上相同，那么细胞系中多聚体蛋白质的形式相同。如果药理指纹基本上不同，那么此类细胞系中多聚体蛋白质的形式不同。

在某些实施方案中，如果多聚体蛋白质的反应性质对于每一种化合物是相同的(例如，被激活、被抑制或无作用)，那么所述形式相同。

在其它实施方案中，如果对于每一种化合物反应的性质在0％、25％、10％、5％、1％或0.5％的界限内相同，那么所述形式相同。

在某些实施方案中，如果多聚体蛋白质的反应的性质对于至少一种化合物是不同的(例如，被激活、被抑制或无作用)，那么所述形式不相同。在某些实施方案中，如果多聚体蛋白质的反应的性质对于至少50％、25％、10％、5％、1％或0.5％的测试的化合物是不同的(例如，被激活、被抑制或无作用)，那么所述形式是不同的。在其它实施方案中，如果对于至少1种化合物反应的量不在至少50％、25％、10％、5％、1％或0.5％的界限内，那么所述形式是不同的。在其它实施方案中，如果对于至少50％、25％、10％、5％、1％或0.5％的测试化合物反应的量不在至少50％、25％、10％、5％、1％或0.5％的界限内，那么所述形式是不同的。可将本领域普通技术人员已知的任何算法用于定量和比较不同细胞系中多聚体蛋白质的药理指纹。

在某些实施方案中，可通过比较第一亚单位的药理特性、第二亚单位的药理特性以及混合亚单位的药理特性来分类共表达第一亚单位和第二亚单位的细胞中目的生物活性多聚体蛋白质的组合。第一亚单位药理特性可包括表示化合物对多聚体蛋白质的生物活性的效应的被测量，因为其在表达多聚体蛋白质的第一亚单位但不表达第二亚单位的细胞中表达。第二亚单位药理特性可包括表示化合物对多聚体蛋白质的生物活性的效应的被测量，因为其在表达多聚体蛋白质的第二亚单位但不表达第一亚单位的细胞中表达。混合亚单位药理特性可包括表示化合物对多聚体蛋白质的生物活性的效应的被测量，因为其在表达多聚体蛋白质的第一和第二亚单位的细胞中表达。在某些实施方案中，可将生物活性目的多聚体蛋白质分类为(i)第一亚单位的同源二聚体，如果第一亚单位药理特性与混合亚单位药理特性的具有高度相似性，并且第二亚单位药理特性与混合亚单位药理特性具有低相似性的话；(ii)第二亚单位的同源二聚体，如果第二亚单位药理特性与混合亚单位药理特性具有高度相似性，并且第一亚单位药理特性与混合亚单位药理特性具有低相似性的话；(iii)第一亚单位与第二亚单位的异二聚体，如果第一亚单位药理特性与混合亚单位药理特性具有低相似性，并且第二亚单位药理特性与混合亚单位药理特性具有低相似性的话；或(iv)第一亚单位的同源二聚体与第二亚单位的同源二聚体的组合，如果混合亚单位药理特性是第一亚单位药理特性与第二亚单位药理特性的组合的话。

在另一个实施方案中，可通过将目的细胞的药理特性与第一亚单位药理特性、第二亚单位药理特性和混合亚单位药理特性相比较来分类共表达第一亚单位和第二亚单位的细胞中生物活性目的多聚体蛋白质的组成。在某些实施方案中，生物活性目的多聚体蛋白质可被分类为(i)第一亚单位的同源二聚体，如果所述第一药理特性与所述第二亚单位药理特性具有低相似性并且与所述第一亚单位药理特性和所述混合亚单位药理特性都具有高度相似性的话；(ii)第二亚单位的同源二聚体，如果所述第一药理特性与所述第一亚单位药理特性具有低相似性并且与所述第二亚单位药理特性和所述混合亚单位药理特性都具有高度相似性的话；(iii)第一亚单位和第二亚单位的异源二聚体，如果所述第一药理特性与所述第一亚单位药理特性具有低相似性，与所述第二亚单位药理特性具有低相似性以及与所述混合亚单位药理特性具有低相似性的话；或(iv)第一亚单位的同源二聚体和第二亚单位的同源二聚体的组合，如果所述第一药理特性与所述混合亚单位药理特性具有高度相似性，并且所述第一药理特性为所述第一亚单位药理特性和所述第二亚单位药理特性的组合的话。

在某些实施方案中，可通过将来自表达目的亚单位的细胞的药理特性与来自不表达目的亚单位的细胞的药理特性相比较来表征细胞中亚单位对多聚体蛋白质的生物活性的效应。在某些实施方案中，可将测试药理特性与基础药理特性相比较来表征该效应。在上述实施方案中，测试药理特性可包括表示化合物在表达预先选择的亚单位的组合并且此外还表达目的亚单位的细胞中对具有生物活性的多聚体蛋白质的效应的被测量；基础药理特性可包括表示该化合物在表达预先选择的亚单位的组合但不表达目的亚单位的细胞中对具有生物活性的多聚体蛋白质的效应的被测量。目的亚单位不是预先选择的亚单位的组合的亚单位之一。如果测试药理特性与基础药理特性具有低相似性，那么可将目的亚单位表征为对多聚体蛋白质的生物活性具有效应，或如果测试药理特性与基础药理特性具有高相似性，那么可将其表征为对多聚体蛋白质的生物活性无效应。

可通过计算药理特性之间的相关性，例如但不限于计算药理特性之间的相似性量度来比较药理特性。

在某些实施方案中，如果药理特性之一的被测量在另一个药理特性的被测量的约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％之内，那么认为两个药理特性相关。

在某些实施方案中，如果两个药理特性之间计算的相似性的量度高于预定的阈值，则可认为它们彼此具有高相似性，或如果两个药理特性之间计算的相似性的量度低于预定的阈值，则可认为它们彼此具有低相似性。在某些实施方案中，可将预定的阈值确定为表示药理特性之一的被测量在另一个药理特性的被测量的约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％之内的相似性的量度的值。

在某些实施方案中，目的化合物的药理特性可表示为向量p，

p＝[p₁，...p_i，...p_n]

其中p_i是第i个组分的被测量，例如，化合物对表达多聚体蛋白质的目的亚单位的细胞的第i个生物活性的效应。在某些实施方案中，n大于2，大于10，大于100，大于200，大于500，大于1000，大于2000，大于2500，大于7500，大于10,000，大于20,000，大于25,000或大于35,000。每一个药理特性也可表示为向量p。在计算相关性中，对于每一种组分i＝1...n，可将表示目的化合物的药理特性的向量中第i个组分的被测量与相应的代表药理特性的向量的第i个组分的被测量的相比较。然而，存在许多可计算相关性的方法。事实上，可按照本发明的方法使用本领域内用于测定两个数据集相关的概率的任何统计方法来鉴定在目的化合物的药理特性与药理特性之间是否存在相关性。例如，可使用相似性量度sim(pi₁，pi₂)计算目的化合物的药理特性(pi₁)与各药理特性(pi₂)之间的相关性。计算相似性量度sim(pi1，pi2)的一个方法是计算欧氏距离的负2次方。在可选择的实施方案中，可使用除欧氏距离外的量度计算sim(pi1，pi2)，例如曼哈顿距离、切比雪夫距离、向量夹角、相关距离、标准化的欧氏距离、马哈拉诺比斯距离、平方皮尔逊相关系数或明可夫斯基距离。在某些实施方案中，将皮尔逊相关系数、平方欧氏距离、欧氏平方和或平方皮尔逊相关系数用于测定相似性。可以例如使用AS(Statistics AnalysisSystems Institute，Cary，North Carolina)或S-Plus(Statistical Sciences，Inc.，Seattle，Washington)计算此类量度。此类量度的使用描述于Draghici，2003，Data Analysis Tools for DNA Microarrays，Chapman &Hall，CRC Press London，第11章，该文献通过引用整体并入本文。

还可基于等级计算相关性，其中x_i和y_i是按递升或递降数字顺序排列的被测量的值的等级。参见例如，Conover，PracticalNonparametric Statistics，第2版，Wiley，(1971)。Shannon互信息还可用作相似性量度。参见，例如，Pierce，An Introduction To InformationTheory：Symbols，Signals，and Noise，Dover，(1980)，其通过引用整体并入本文。

本发明的一些实施方案提供了包含图2中显示的任何或所有程序模块的计算机程序产品。程序模块的方面在下文中进一步描述。

可将本领域普通技术人员已知的任何测定用于测定目的多聚体蛋白质的活性，从而建立药理指纹。程序模块的实施例在下文中进一步描述。可以以高通量形式进行用于本发明的方法的任何测定。

在某些实施方案中，本发明的实验对象组可用于HTS或与药物化学组合使用以测试和鉴定对一个或一组靶具有选择性的化合物；具体地，以鉴定其活性特异于目的多聚体蛋白质的特定形式或具有特定的活性模式或活性谱的化合物。可将二次测定包括使用化合物的体内测试用于测定相应靶在体内的存在、作用和功能，或其作为生物标志物的相关性(测试方法是多种多样的，包括脑成像研究、动物研究、结合研究、行为模式、PET扫描、NMRI等)。

本发明提供用于表征多聚体蛋白质的组成。不受理论束缚，特征在于功能性标准的多聚体蛋白质可反映多聚体蛋白质的特定化学计量或不同的特定化学计量的组合或水平。在某些实施方案中，多聚体蛋白质在已进行改造以表达多聚体蛋白质的细胞中表达。

在某些实施方案中，使用本发明的方法测定二聚体的组成。

在某些实施方案中，本发明的方法允许确定特定细胞中的二聚体是a)第一亚单位的同源二聚体；b)第二亚单位的同源二聚体；或c)第一与第二亚单位的异二聚体。例如，这样的方法可包括下列步骤：

步骤A)测试不表达第二亚单位的细胞中第一亚单位的活性。

步骤B)测试不表达第一亚单位的细胞中第二亚单位的活性。

步骤C)在表达第一和第二亚单位的细胞中测试第一亚单位和第二亚单位的活性。

比较步骤A、B和C中获得的活性，然后推断表达第一和第二亚单位的细胞中二聚体蛋白质的组合。如果步骤A中测定的活性等于步骤C中测定的活性，那么在共表达第一和第二亚单位的细胞中形成的二聚体是第一亚单位的同源二聚体。如果步骤B中测定的活性等于步骤C中测定的活性，那么在共表达第一和第二亚单位的细胞中形成的二聚体是第二亚单位的同源二聚体。如果步骤A中测定的活性和步骤B中测定的活性都与步骤C中测定的活性不同，那么在共表达第一和第二亚单位的细胞中形成的二聚体是第一与第二亚单位的异源二聚体。如果步骤C中测定的活性是步骤A和步骤B中观察到的活性的组合，那么共表达第一和第二亚单位的细胞产生第一亚单位的同源二聚体和第二亚单位的同源二聚体。

在某些实施方案中，测量随着时间推移化合物的活性谱。

可采用类似步骤来测定三聚体和具有更高级的多聚化的其它多聚体蛋白质的亚单位组合。在某些实施方案中，本发明提供了包括多个细胞系的细胞系的实验对象组，其中已使用相同的方案和相同的宿主细胞对多个细胞系的每一个细胞系进行改造以表达多聚体蛋白质的相同亚单位，其中所产生的多聚体蛋白质在细胞系之间不同。多聚体蛋白质之间的差异可在于：不同的亚单位组合、不同的亚单位化学计量、不同的翻译后修饰(包括蛋白酶解)和/或一个或多个亚单位的不同剪接。不受理论束缚，细胞系之间多聚体蛋白质的差异可以例如因被引入细胞的引入序列的亚单位的不同插入位置或拷贝数而导致。在某些实施方案中，通过测量至少2、5、10、50、100、250、500、1000、2000、5000或至少10,000种化合物对多聚体蛋白质的活性产生药理特性来表征多聚体蛋白质。将每一个细胞系的此类药理特性彼此比较。如果药理特性相同，那么预测多聚体蛋白质的组成相同。如果药理特性不同，那么预测多聚体蛋白质的组成不同。

在某些实施方案中，本发明提供了细胞系的实验对象组，其中每一个实验对象组包括多个细胞系，其每一个细胞系表达由上述不同药理特性定义的不同多聚体蛋白质，其中使用相同的方案和相同的宿主细胞产生不同的细胞系。在某些实施方案中，可使用基本上相同的细胞培养方案。在某些实施方案中，可平行地或在不同的时间但使用一致的或相似的细胞、条件或方案处理实验对象组中的细胞系。

在某些实施方案中，可将所述方法用于从不同宿主细胞系产生的克隆。在某些具体的实施方案中，宿主细胞系相异在于它们的基因表达谱。在此类实施方案中，可将不同细胞系用于表征特定辅因子或内源提供的因子对目的多聚体蛋白质的某些形式的形成的效应。

在特定的实施方案中，可通过将表达多聚体蛋白质的细胞与激活或抑制多聚体蛋白质的化合物接触来测试多聚体蛋白质的活性。

在某些实施方案中，测定在某些条件下多聚体蛋白质的活性谱。不受理论束缚，有人认为相同的条件对多聚体蛋白质的不同形式可具有不同的效应。例如，针对多个不同条件测试它们对多聚体蛋白质的效应。示例性条件包括：温度、细胞培养基中的离子浓度、CO₂浓度、细胞密度、细胞周期的同步化、pH、酸度、碳酸化、大气条件、二氧化碳百分比、振荡、搅拌、紫外光暴露、代谢产物、营养物、血清、氨基酸、糖、碳水化合物、蛋白质、脂质、去垢剂、生长因子、辅因子、维生素、诱变剂、化学品、化合物或痕量金属的活性或浓度。然后可将活性谱用于推断多聚体蛋白质的组成。

在某些实施方案中，测定多聚体蛋白质的药理特性。例如，针对多个不同的化合物测试它们对多聚体蛋白质的效应。示例性化合物包括已知调节蛋白质或相同种类或家族的蛋白质的化合物、已知在临床研究中具有副作用的化合物、具有临床功效的化合物、可具有药理活性的化合物、组合化学文库的化合物、化合物、合成化合物、天然化合物、肽、脂质、去垢剂、诱变剂、荧光化合物或聚合物。然后可将药理特性用于推断多聚体蛋白质的组成。

本发明使得能够产生表达目的蛋白质的多种细胞系。本发明的克隆细胞系将具有此种表达的不同绝对和相对水平。此类克隆的大型实验对象组可以用许多已知参考化合物依据活性进行筛选。以这种方式，每个经分离的细胞系将具有对测试化合物的应答的“指纹”，这代表蛋白质的差异功能表达的活性。细胞系随后可以基于对化合物的此类应答的相似性进行分组。可以选择代表每种功能上独特的表达谱的至少一个细胞系用于进一步研究。这些细胞系的集合随后可以用于筛选大量化合物。以这种方式，可以鉴定选择性调节蛋白质的一种或多种相对应独特功能形式的化合物。这些调节剂随后可以在次级测定中或在体内模型中进行测试，以测定何种在这些测定或模型中显示活性。在这种背景中，调节剂将用作参考化合物，以鉴定蛋白质的何种相对应功能形式可能存在或在所采用的次级测定或模型系统中起作用。此类测试可以用于测定可能在体内存在的蛋白质的功能形式以及可能是生理学相关的那些。此类调节剂可用于确定哪一种功能上独特的形式牵涉特定表型或生理功能例如疾病。

在某些实施方案中，本发明提供了产生针对体内目的生理特性的体外相关性(″IVC″)的方法。通过利用对不同蛋白质的体内生理特性建立化合物的活性谱例如化合物对不同蛋白质的生理特性的效应的特征谱来产生IVC。该活性谱表示体内生理特性，从而是生理特性的指纹的IVC。

在某些实施方案中，体外相关性是关于药物的负面副作用的体外相关性。在其它实施方案中，体外相关性是针对药物的有益效应的体外相关性。

在某些实施方案中，IVC可用于预测或证实目的化合物的一个或多个生理特性。可针对化合物测试其针对不同蛋白质的活性并且将所得到的活性谱与如本文中所述产生的IVC的活性谱相比较。具有与目的化合物的活性谱最相似的活性谱的IVC的生理特性被预测为和/或证实为目的化合物的生理特性。

在某些实施方案中，通过测定化合物针对不同蛋白质或生物学途径或其组合的活性来建立IVC。类似地，为了预测或证实化合物的生理活性，可针对不同蛋白质或生物学途径或其组合测试化合物的活性。

在某些实施方案中，本发明的方法可用于确定和/或预测和/或证实目的化合物引起特定生理效应的程度。在某些实施方案中，本发明的方法可用于确定和/或预测和/或证实目的化合物的生理效应的组织特异性。

可使用基因激活或引入转基因改造用于本发明的细胞系(参见，例如，PCT申请公开案WO/1994/012650)。可使用分子信标或荧光寡核苷酸鉴定表达目的蛋白质的细胞(参见，例如，2004年2月17日公布的Shekdar等人的美国专利No.6,692,965和公开为WO/2005/079462的国际申请No.PCT/US2005/005080)。在某些实施方案中，经改造的细胞或细胞系以表达作为多聚体蛋白质的部分的蛋白质亚单位。在某些更具体的实施方案中，经改造的细胞或细胞系以表达多聚体蛋白质的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个亚单位。在具体的实施方案中，针对多个细胞系产生活性谱，其中每一个细胞系已经改造以表达多聚体蛋白质的不同亚单位组合。

在某些实施方案中，用于产生IVC的方法的细胞或细胞系是如本文中描述的细胞或细胞系，例如具有基本上一致的生理特性的细胞或细胞系、表达不包含蛋白质标签的目的蛋白质的细胞或细胞系或在功能测试中具有至少0.4的Z’因子的细胞或细胞系或在不存在选择压力的情况下培养的细胞或细胞系，或其任何组合。在某些实施方案中，在基本上相同的培养条件下平行地维持使用的不同细胞或细胞系。本文中描述的机器人方法可用于维持和操作细胞或细胞系以产生IVC。在某些实施方案中，本发明提供了用于产生IVC的细胞或细胞系，其中在不存在选择压力的情况下培养细胞或细胞系并且其中所述细胞的至少一种蛋白质的表达在3个月内改变不超过1％、5％、10％、15％、20％、25％30％35％或40％。在某些实施方案中，至少一种蛋白质的表达在4、5、6或更多个月内改变不超过1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。

在更具体的实施方案中，通过使用经改造以表达多聚体蛋白质的细胞系在多个体外测定中测试化合物的活性来建立目的化合物的活性谱，其中至少两个细胞系表达不同的多聚体蛋白质。在特定的实施方案中，不同的多聚体蛋白质是多聚体蛋白质的不同亚单位组合。在某些更具体的实施方案中，通过针对至少0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、80％、90％、95％、98％或至少99％的多聚体蛋白质的可能亚单位组合测试目的化合物来产生IVC。在更具体的实施方案中，测试所有可能的亚单位组合。在某些实施方案中，测试至少5、10、25、50、100、150、200、250、500、1000、2500、5000、7500或至少10000个亚单位组合。

在某些实施方案中，不同细胞系的不同多聚体蛋白质是多聚体蛋白质的不同形式，其中不同形式差异在于亚单位的组合、化学计量、剪接和/或翻译后修饰，包括蛋白酶解。

在某些实施方案中，针对代表靶或相关靶的多个功能形式的实验对象组测试失效和成功的候选药物可用于使特定的靶与在临床中观察到的不利或不希望的副作用或治疗功效相关。该信息可用于在HTS中或在针对具有所需最小脱靶活性的药物的化合物开发过程中选择充分确定的靶。

在某些更具体的实施方案中，通过针对不同的表达多聚体蛋白质的不同亚单位组合的细胞系测试化合物来产生化合物的IVC。在更具体的实施方案中，此类多聚体蛋白质包括但不限于受体蛋白质复合物例如GABA_A、NaV、GABA_B、ENaC、甜味受体、鲜味受体和本文中描述的其它多聚体蛋白质。

在某些实施方案中，使用EnaC、GABA_A、NaV、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR或GCC产生IVC。如下文中所描述的，化合物的IVC可表示化合物对特定生理学参数的效应。在某些实施方案中，使用功能性磁共振成像(″fMRI″)测量生理学参数。也可使用其它成像方法。此类其它成像方法包括计算机断层摄影术(CT)；计算机轴向断层摄影术(CAT)扫描；超声光扩散光学成像(DOI)；扩散光学断层摄影术(DOT)；事件相关光学信号(EROS)；近红外光谱技术(NIRS)；磁共振成像(MRI)；脑磁图描记术(MEG)；正电子发射断层摄影术(PET)和单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。在某些实施方案中，如果IVC表示化合物对中枢神经系统(″CNS″)的效应，那么可建立在CNS中与fMRI模式相关的IVC。可在各种测试和模型(包括人和动物(例如家畜和宠物)测试模型)中产生与化合物的活性相关的IVC。在例如The Merck Manual，第18版(Hardcover)Mark H.Beers(作者)Robert S.Porter(编者)、Thomas V.Jones(编者)中列出了人疾病和障碍。在例如由美国精神病学协会(集体作者)编著的Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders DSM-IV-TR第4版(修订版本)中列出的精神病和障碍。

使用GABA产生的IVC可以是针对化合物对CNS障碍、焦虑、镇静、创伤后精神紧张性障碍(PTSD)、记忆、学习、孤独症、癫痫、酗酒、情绪障碍、CNS功能、CNS生理学、CNS发育和/或CNS老化的生理效应。生理效应可以是疾病的至少一个症状的增强或减轻。

可产生GABA的IVC，所述IVC是针对情绪、心境、心理状态、情感(feeling)、感觉或知觉，包括：快乐、满意、欣快、躁狂症、兴奋、预期、满足、焦虑、抑郁、愤怒、害怕、恐怖、怀疑、爱、恨、矛盾心态、情感淡漠、倦怠、内疚、热爱、悲伤、不愉快、暴躁、易怒、激励(drive)、动机、进攻性、敌意、大怒、傲慢、自信或缺乏自信、信心、缺乏信心、不安、踌躇；积极的、消极的、合作的、不合作的、有帮助的或无帮助的态度；自由感、幸福感、成就感、满足感(adequacy)、不满足感(inadequacy)或限制感；有魅力感、无魅力感、性感、不性感、喜爱感、厌恶感、可爱感、不可爱感、称心感或讨厌感；孤独感或被包括/包容感；归属或不归属社会团体的感；被困感、被欺骗感、被利用感、被误导感、被帮助感、被鼓励感、气馁感；考虑自杀感；冒险感、犯罪感、违法感、回避反应感；或犯谋杀罪感的。

还可产生针对激起积极或消极心境的感觉刺激的GABA的IVC。积极感觉刺激可包括气味感觉例如海风、森林、食物等。在某些实施方案中，可产生针对镇静或睡眠的IGABA的IVC，包括休息睡眠、连续睡眠、深睡眠、浅睡眠或快眼动睡眠(REM sleep)、休息睡眠、缺乏睡眠、失眠、睡眠障碍、睡眠紊乱或梦游、梦呓或梦食；记忆、学习、解释、分析、思考、记住、安置(placing)、产生联想、回忆过去的事件、短期记忆、长期记忆或认知；酒精依赖或成瘾或酗酒；CNS适应征、慢性疼痛、癫痫、惊厥、成瘾、依赖；内分泌/激素适应征、眨眼条件化范例、肺癌、前列腺癌、乳腺部和其它癌症和恶性肿瘤；葡萄糖代谢反应、缺氧症、前列腺素诱导的产热、心脏压力感受器反射和其它反射异常；以及精神障碍(包括孤独症)。

使用苦味受体产生的IVC可以是针对对肥胖症、糖吸收、类高血糖素多肽(GLP)分泌或血糖调节的生理效应的。所述生理效应可以是食欲、总体营养、营养物吸收的程度或速率、肥胖症(获得或消失)、糖吸收的程度或速率、GLP分泌或血糖调节的上调或下调。可选地，所述IVC还可与食物和/或药物中的苦味相关。

在某些实施方案中，可使用苦味受体产生IVC，其是针对胃肠中的活性(例如，GLP分泌或其它胃肠激素的分泌)、血糖控制或平衡、糖尿病、进食、饥饿、食欲、营养物吸收、体重减轻、能量的。在其它实施方案中，使用苦味受体产生IVC，其是针对饮料或食物成分或药物(包括非处方药和不同立体异构的药物)的所需或不希望的苦味/后味的；针对偏食的；针对进食障碍(例如食欲亢进、厌食症或节食)的；针对化合物的感觉或味道感觉的；或针对饮料或食物成分或药物的味道或苦味受体或GPCR的活性的质量控制的。在其它实施方案中，使用苦味受体产生的IVC可以是针对：响应活性化合物的神经元放电或CNS活性；恶心、呕吐(包括由药物或其它化合物引起的恶心例如，化学疗法诱发的恶心和呕吐(CINV))；化合物在非苦味GPCR上的活性；在口腔中具有活性但在其它地方无活性(例如，在胃肠中无活性)和反之亦然的苦味或苦味调节化合物。在某些实施方案中，以组织特异性的方式激活、抑制或调节苦味受体的化合物可用于调节血糖水平、葡萄糖水平、葡萄糖吸收和/或防止呕吐或CINV，其中调节活性在胃肠中是所需但在口腔中是不希望的。在某些实施方案中，只在口腔中具有活性的苦味调节化合物可用于其中胃肠中的生理活性是不希望的风味应用。

使用甜味受体产生的IVC可以是针对对食欲、营养、营养物吸收、肥胖症、糖吸收、GLP分泌或血糖调节的生理效应的。所述生理效应可以是食欲、总体营养、营养物吸收的程度或速率、肥胖症(获得或消失)、糖吸收的程度或速率、GLP分泌或血糖调节的上调或下调。

可使用甜味受体产生针对下列方面的IVC：甜味化合物、包括天然和人造高强度甜味剂(例如，糖精、阿司帕坦、环己氨基磺酸盐、罗汉果糖苷、蜜叶糖和其成分、乙酰舒泛K、纽甜(neotame)、三氯蔗糖和其混合物)的延迟/长时间持续/长期持续时间/后味或回味；针对偏食；针对进食障碍(例如食欲亢进、厌食症或节食)；胃肠中的活性(例如，GLP分泌或其它胃肠激素的分泌)、血糖控制或平衡、糖尿病、进食、饥饿、食欲、营养物吸收、体重减轻、能量；饮料或食物或药物成分(包括非处方药和不同异构形式的药物)的所需或不希望的苦味/后味；化合物的感觉或味道感觉；响应活性化合物的神经元放电或CNS活性；恶心/呕吐，包括由药物或其它化合物引起的恶心(例如CINV)；饮料、食物或药物成分的味道或GPCR触发活性的质量控制；在口腔中具有活性但在其它地方无活性(例如，在胃肠中无活性)和反之亦然的甜味或甜味调节化合物。在某些实施方案中，以组织特异性的方式激活、抑制或调节甜味受体的化合物可用于调节血糖水平、葡萄糖水平和/或防止呕吐或CINV，其中调节活性在胃肠中是所需但在口腔中是不希望的。在某些实施方案中，只在口腔中具有活性的苦味调节化合物可用于其中胃肠中的生理活性是不希望的风味应用。

如果将鲜味受体用于产生IVC，那么IVC可以是针对对食欲、营养、营养物吸收、肥胖症、糖吸收、GLP分泌、血糖调节或氨基酸吸收的生理效应的。所述生理效应可以是食欲、总体营养、营养物吸收的程度或速率、肥胖症(获得或消失)、糖吸收的程度或速率或GLP分泌或血糖调节的上调或下调。

可使用鲜味受体产生针对下列方面的IVC：偏食；进食障碍(例如食欲亢进、厌食症或节食)；胃肠中的活性(例如GLP分泌或其它胃肠激素的分泌)、血糖控制或平衡、糖尿病、进食、饥饿、食欲、营养物吸收、体重减轻或能量；饮料或食物成分或药物(包括非处方药和不同立体异构的药物)的所需或不希望的后味；化合物的感觉或味道感觉；响应活性化合物的神经元放电或CNS活性；恶心/呕吐，包括由药物或其它化合物引起的恶心(例如CINV)；饮料或食物或药物成分的味道或GPCR触发活性的质量控制；在口腔中具有活性但在其它地方无活性(例如，在胃肠中无活性)和反之亦然的鲜味或鲜味调节化合物。在某些实施方案中，以组织特异性的方式激活、抑制或调节鲜味受体的化合物可用于调节血糖水平、葡萄糖吸收和/或防止呕吐或CINV，其中调节活性在胃肠中所需但在口腔中是不希望的。在某些实施方案中，只在口腔中具有活性的鲜味调节化合物可用于其中胃肠中的生理活性是不希望的风味应用。

使用ENaC产生的IVC可以是针对化合物对COPD(慢性阻塞性肺疾病)、CF(囊性纤维化)、能育性、IBS(肠易激综合征)、克罗恩病、肺水肿或高血压的生理效应的。生理效应可以是疾病的恶化或疾病的至少一个症状的减轻或改善。IVC也可表示化合物的不同咸味。

还可使用ENaC产生针对下列方面的IVC：偏食；进食障碍(例如食欲亢进、厌食症或节食)；粘液的调节、分泌、质量、清除、产生、粘度或稠度；水的吸收、保留、平衡、通过或运输穿过上皮组织(特别是肺、肾、血管组织、眼、胃肠、小肠和大肠)；响应活性化合物的神经元放电或CNS活性；肺适应征；胃肠适应征例如结肠清洗(bowel cleansing)、肠易激综合征(IBS)、药物诱发性(即阿片类物质)便秘、卧床不起的患者的便秘/CIC、急性感染性腹泻、大肠杆菌、霍乱、病毒性胃肠炎、病毒性胃肠炎、轮状病毒、吸收不良综合征的调节、小儿腹泻(病毒、细菌、原生动物)、HIV或短肠综合征；能育性指标例如精子能动性或精子获能；女性生殖适应症、子宫颈粘液/阴道分泌物粘稠(即宫颈粘液过厚)；避孕，例如负面影响精子能动性或与精子能动性相关的子宫颈粘液质量；或口腔干燥、干眼、青光眼或流鼻水。

还可使用EnaC产生针对化合物的感觉或味觉感受的IVC。具体地，IVC可以是针对咸味例如镁、钠、钾和/或钙盐的味道的。盐可以具有不同抗衡离子例如硫酸盐、氯化物或其它卤化物、溴化物、磷酸盐、乳酸盐和其它盐类。在具体的实施方案中，盐是氯化钾或乳酸钾。在某些实施方案中，IVC表示不同盐的组合的味觉感受。

使用CFTR产生的IVC是针对化合物对COPD(慢性阻塞性肺疾病)、CF(囊性纤维化)、能育性、IBS(肠易激综合征)、克罗恩病、肺水肿或高血压的生理效应的。生理效应可以是疾病的恶化或疾病的至少一个症状的减轻或改善。IVC也可表示化合物的不同咸味。

还可使用CFTR产生针对下列方面的IVC：偏食；进食障碍(例如食欲亢进、厌食症或节食)；粘液的调节、分泌、质量、清除、产生、粘度或稠度；水的吸收、保留、平衡、通过或运输穿过上皮组织(特别是肺、肾、血管组织、眼、胃肠、小肠和大肠)；对化合物的感觉或味道感觉；响应活性化合物的神经元放电或CNS活性；肺适应征；胃肠适应征例如结肠清洗、肠易激综合征(IBS)、药物诱发性(即阿片类物质)便秘、卧床不起的患者的便秘/CIC、急性感染性腹泻、大肠杆菌、霍乱、病毒性胃肠炎、病毒性胃肠炎、轮状病毒、吸收不良综合征的调节、小儿腹泻(病毒、细菌、原生动物)、HIV或短肠综合征；能育性指标例如精子能动性或精子获能；女性生殖适应症、子宫颈粘液/阴道分泌物粘稠(即宫颈粘液过厚)；避孕例如负面影响精子能动性或与精子能动性相关的子宫颈粘液质量；或口腔干燥、干眼、青光眼或流鼻水；或内分泌适应征，即CF患者的胰腺功能。

使用NaV产生的IVC是针对对疼痛的生理效应的。所述生理效应可以是疼痛的加重或减轻。

使用NaV产生针对下列方面的IVC：疾病(包括慢性疼痛、急性疼痛、心脏疼痛、肌肉疼痛、骨疼痛、器官疼痛、疲劳、由过刺激、擦伤、身体损伤或内伤引发的疼痛、癌症引起的疼痛、物理性损伤引起的疼痛、感觉性疼痛、幻痛和衰弱性疼痛)；动作电位、神经元信号传导的产生或传播或神经元信息的传输；或肌肉或心脏适应征的或是针对化合物对肌肉或心肌的体内活性的。

使用GCC产生的IVC是针对下方面的IVC：胃肠适应征包括：便秘、IBS(肠易激综合征)包括IBS-C(便秘)、IBS-D(腹泻)或IBS-M(混合的)、慢性特发性便秘、阿片类物质或药物诱发性便秘、卧床不起的患者的便秘/CIC、急性感染性腹泻(例如，由细菌大肠杆菌、沙门氏菌(salmonella)、霍乱介导的，特别是旅行者腹泻)、病毒性胃肠炎、轮状病毒的临床适应征、吸收不良综合征的调节、小儿腹泻(病毒、细菌、原生动物)、短肠综合征、结肠炎(胶原性、淋巴细胞性)、克罗恩病、UC、憩室炎、囊性纤维化或溃疡(包括消化性溃疡)；粘膜和/或上皮液体吸收和分泌的调控/调节；肺适应征例如囊性纤维化、肾功能、心脏纤维化、心脏肥大、高血压、眼障碍(即常染色体显性色素性视网膜炎和利伯先天性黑矇)、生长障碍、身材矮小症、中风和其它血管损伤；CNS适应征例如记忆或抑郁；或炎症性障碍(即类风湿性关节炎)。

可将气味受体用于产生针对刺激积极或消极心境的感觉刺激的IVC。刺激积极心境的感觉刺激可包括令人愉快的气味例如海风、森林的气味或食物气味。刺激消极心境的感觉刺激可包括令人不愉快的气味。可产生针对感觉刺激的IVC，所述感觉刺激刺激下列积极或消极情绪：快乐、满意、欣快、躁狂症、兴奋、预期、满足、焦虑、抑郁、愤怒、害怕、恐怖、怀疑、爱、恨、矛盾心态、情感淡漠、倦怠、内疚、热爱、悲伤、不愉快、暴躁、易怒、激励、动机、进攻性、敌意、大怒、傲慢、自信或缺乏自信、信心、缺乏信心、不安、踌躇；积极的、消极的、合作的、不合作的、有帮助的或无帮助的态度；自由感、幸福感、成就感、满足感、不满足感或限制感；有魅力感、无魅力感、性感、不性感、喜爱感、厌恶感、可爱感、不可爱感、称心感或讨厌感；孤独感或被包括/包容感；归属或不归属社会团体的感；被困感、被欺骗感、被利用感、被误导感、被帮助感、被鼓励感、气馁感；考虑自杀感；冒险感、犯罪感、违法感、回避反应感；或犯谋杀罪感。

还可使用乙酰胆碱受体产生针对刺激积极或消极心境的感觉刺激的IVC。感染刺激包括但不限于气味。可产生针对感觉刺激的IVC，所述感觉刺激刺激下列积极或消极情绪、心境、心理状态、情感、感觉或知觉，包括：快乐、满意、欣快、躁狂症、兴奋、预期、满足、焦虑、抑郁、愤怒、害怕、恐怖、怀疑、爱、恨、矛盾心态、情感淡漠、倦怠、内疚、热爱、悲伤、不愉快、暴躁、易怒、激励、动机、进攻性、敌意、大怒、傲慢、自信或缺乏自信、信心、缺乏信心、不安、踌躇；积极的、消极的、合作的、不合作的、有帮助的或无帮助的态度；自由感、幸福感、成就感、满足感、不满足感或限制感；有魅力感、无魅力感、性感、不性感、喜爱感、厌恶感、可爱感、不可爱感、称心感或讨厌感；孤独感或被包括/包容感；归属或不归属社会团体的感；被困感、被欺骗感、被利用感、被误导感、被帮助感、被鼓励感、气馁感；考虑自杀感；冒险感、犯罪感、违法感、回避反应感；或犯谋杀罪感。

可产生乙酰胆碱受体的IVC，其是针对化合物对CNS障碍、焦虑、镇静、PTSD、记忆、学习、孤独症、癫痫、酗酒、情绪障碍、CNS功能、CNS生理学、CNS发育和/或CNS的老化的生理效应的。也可产生使用乙酰胆碱而产生的IVC，其针对下列方面：镇静或睡眠，包括休息睡眠、连续睡眠、深度睡眠、浅度睡眠或快眼动睡眠、休息睡眠、缺乏睡眠、失眠、睡眠障碍、睡眠紊乱或梦游、梦呓或梦食；记忆、学习、解释、分析、思考、记住、安置、产生联想、回忆过去的事件、短期记忆、长期记忆或认知；酒精依赖或成瘾或酗酒；CNS适应征、慢性疼痛、癫痫、惊厥、成瘾、依赖；内分泌/激素适应征、眨眼条件化范例、肺癌、前列腺癌、乳腺部和其它癌症和恶性肿瘤；葡萄糖代谢反应、缺氧症、前列腺素诱导的产热、心脏压力感受器反射和其它反射异常；以及精神障碍(包括孤独症)。

在某些实施方案中，改造用于所述方法的细胞或细胞系以表达本文中表6和7-22中所示的一种或多种蛋白质。

在某些实施方案中，IVC表示化合物在生物的组织、生物的器官、生物的细胞外基质、生物的系统(例如，生物的免疫系统)或整个生物中的生理特性。生物可以是脊椎动物。生物可以是哺乳动物。在更具体的实施方案中，生物是小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、驴、山羊、猴或人。生理特性可以是对特定细胞类型、组织、器官或器官系统的效应。例如，生理特性可以是对哺乳动物组织、健康组织、组织、患病组织、癌症组织、胚胎组织、成体组织、移植组织、器官组织、肝组织、神经元组织、胃肠组织、肌肉组织、脂肪组织、皮肤、泌尿生殖组织、神经元组织、中枢神经系统、心血管组织、内分泌系统、骨骼组织、骨组织、骨、免疫系统、器官、细胞或特化细胞以及本文中公开的任何其它细胞的效应。在某些实施方案中，生理特性是组织保护活性、抗炎活性、神经刺激或具有与物质或化合物的活性相似的活性，所述物质或化合物包括但不限于：金刚烷抗病毒剂、肾上腺素能支气管扩张药、用于高血压急症的试剂、用于肺动脉高压的试剂、抗阿米巴药、止痛合剂(analgesic combination)、镇痛药、雄激素类和合成类固醇、血管紧张素II抑制剂、减食欲药、抗酸剂、抗蠕虫药、抗血管生成的眼用制剂、抗感染药、抗心绞痛药、抗心律不齐药、止痛合剂、抗生素/抗肿瘤药、抗胆碱能止吐药、抗胆碱能帕金森病药、抗胆碱能支气管扩张药、抗胆碱药/镇痉药、抗凝血药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗糖尿病药合剂、止泻药、解毒药、止吐药/抗眩晕药、抗真菌剂、抗痛风药、抗组安剂、抗高血脂药、抗高血脂合剂、抗高血压药合剂(antihypertensive combination)、抗血尿酸过多剂、抗疟剂、抗疟药合剂(antimalarial combination)、喹啉类抗疟药、抗代谢药、抗偏头痛药、抗肿瘤药、解毒剂、抗肿瘤药干扰素类、抗肿瘤药单克隆抗体类、抗肿瘤药、抗帕金森病药、抗血小板剂、抗假单胞菌青霉素、抗银屑病药、抗精神病药、抗风湿药、防腐剂和杀菌剂、抗毒素类和抗蛇毒素类、抗结核病制剂、抗结核病合剂、镇咳药、抗病毒药、抗病毒合剂、抗病毒剂干扰素类、抗焦虑剂、镇静药和安眠药、胆汁酸多价螯合剂、支气管扩张药、心脏应激剂(cardiac stressingagent)、螯合剂、胆碱能肌肉兴奋剂、中枢神经系统兴奋剂、凝固改性剂(coagulation modifier)、避孕药、解充血药、消化酶类、利尿药、多巴胺能抗帕金森综合征药、酒精依赖中使用的药物、祛痰药、因子Xa抑制剂、脂肪酸衍生物抗惊厥药、功能性肠紊乱剂、胆石溶解药、全身麻醉药、泌尿生殖道药、GI刺激剂、葡萄糖升高剂、血小板糖蛋白、生长激素受体拮抗剂、造血干细胞动员剂(ematopoietic stem cellmobilizer)、肝素拮抗药、激素替代治疗、激素类/抗肿瘤药、免疫抑制剂、阳痿药(impotence agent)、体内诊断生物制品、肠促胰岛素类似物、正性肌力药、泻药、抗麻风药、局部可注射麻醉剂、肺表面活性物质、淋巴染色剂、溶酶体酶类、粘液溶解药、肌肉松弛药、散瞳药、青光眼眼用制剂、眼用润滑剂和冲洗法(irrigations)、杀精子药、血管扩张剂或血管升压类药物。

在某些实施方案中，IVC表示目的化合物对病毒、细菌、真菌或酵母的生理效应。此类化合物用作例如抗病毒、细菌、真菌或酵母的抗生素。

测试和/或证实目的化合物针对特定目的多聚体蛋白质的活性的测定依赖于多聚体蛋白质的生物活性。可以以高通量形式进行用于本发明的方法的任何测定。

示例性蛋白质、它们的参考文献和可能的测定示于下表(表5)中。此类实例是非限定性的，因为所列的测定可用于除了所列的靶以外的靶，并且所列的靶可利用除了所列的测定以外的其它测定来测试。

表5

可通过计算活性谱之间的相关性例如但不限于计算活性谱之间的相似性量度来比较目的化合物的活性谱与标志性活性。标记性活性谱可以是数据库中一组活性谱之一。标志性活性谱可以是历史谱。可将标记性活性谱的数据库存储在计算机可读存储介质上。在具体的实施方案中，数据库包括至少10个标记性活性谱、至少50个标记性活性谱、至少100个标记性活性谱、至少500个标记性活性谱、至少1,000个标记性活性谱、至少10,000个标志性活性谱或至少50,000个标记性活性谱，每一个标记性活性谱包括至少2个、至少10个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1,000个、至少2000个、至少2500个、至少7500个、至少10,000个、至少20,000个、至少25,000个或至少35,000个组分的被测量。目的化合物的活性谱可包括表示目的化合物对不同多聚体蛋白例如第一蛋白质亚单位和第二蛋白质亚单位的生物活性的效应的被测量。标志性活性谱提供了之前表征的化合物的已知生理特性的体外相关性。生理特性可以是药理性质例如但不限于药物的负面副作用或药物的有效效应。每一个标志性活性谱可包括表示各个之前表征的化合物对不同多聚体蛋白质例如多聚体蛋白质的第一蛋白质亚单位和第二蛋白质亚单位的生物活性的效应的被测量。在某些实施方案中，可计算目的化合物的活性谱与数据库中存储的多个标志性活性谱的每一个标志性活性谱之间的相关性。可通过将表示目的化合物对给定的多聚体蛋白质的生物活性的效应的目的化合物的活性谱中的被测量与表示之前表征的化合物对相同多聚体蛋白质的生物活性的效应的标志性活性谱的相应被测量来计算相关性。如果标志性活性谱中的被测量在目的化合物的活性谱中的被测量的约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％之内，那么目的化合物的活性谱可被认为与标志性活性谱相关。

如果目的化合物的活性谱与标志性活性谱之间的相似性的量度高于预定的阈值，则目的化合物的活性谱可认为与标志性活性谱最相似。在具体的实施方案中，可将预定的阈值确定为表示标志性活性谱中的被测量在目的化合物的活性谱中的被测量的约2％、约5％、约8％、约10％、约12％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％之内的相似性的量度的值。

在某些实施方案中，目的化合物的药理特性可表示为向量p，

p＝[p₁，...p_i，...P_n]

其中p_i是第i个组分的被测量，例如，目的化合物对给定的多聚体蛋白质的第i个生物活性的效应。在某些实施方案中，n大于2，大于10，大于100，大于200，大于500，大于1000，大于2000，大于2500，大于7500，大于10,000，大于20,000，大于25,000或大于35,000。每一个标志性活性谱也可表示为向量p。在计算相关性中，对于每一种组分i＝1...n，可将表示目的化合物的活性谱的向量中第i个组分的被测量与相应的代表活性谱的向量的第i个组分的被测量相比较。然而，存在许多可计算相关性的方法。事实上，可按照本发明的方法使用本领域内用于测定两个数据集相关的概率的任何统计方法来鉴定在目的化合物的活性谱与标志性活性谱之间是否存在相关性。例如，可使用相似性量度sim(pi₁，pi₂)计算目的化合物的活性谱(pi₁)与各标志性活性谱(pi₂)之间的相关性。计算相似性量度sim(pi₁，pi₂)的一个方法是计算欧氏距离的负2次方。在可选择的实施方案中，可使用除欧氏距离外的量度计算sim(pi1，pi2)，例如曼哈顿距离、切比雪夫距离、向量夹角、相关距离、标准化的欧氏距离、马哈拉诺比斯距离、平方皮尔逊相关系数或明可夫斯基距离。在某些实施方案中，将皮尔逊相关系数、平方欧氏距离、欧氏平方和或平方皮尔逊相关系数用于测定相似性。可以例如使用AS(Statistics Analysis SystemsInstitute，Cary，North Carolina)或S-Plus(Statistical Sciences，Inc.，Seattle，Washington)计算此类量度。此类量度的使用描述于Draghici，2003，Data Analysis Tools for DNA Microarrays，Chapman & Hall，CRCPress London，第11章，为此目的该文献通过引用整体并入本文。

可根据本申请中描述的方法训练本领域内已知的各种分类器，并且将其用于依据生理特性(例如但不限于药理性质)分类目的化合物。算法可用于产生能够使用目的化合物的活性谱预测目的化合物的生理特性的分类器。上文中描述了示例性分类器。在某些实施方案中，可使用之前表征的化合物的标志性活性谱中的被测量和与之前表征的化合物相关的已知生理特性训练分类器。

分类器可以是用于分类的算法，所述分类通过将无监督或有监督学习算法用于估计之前表征的化合物的标志性活性谱中的被测量和与之前表征的化合物相关的已知生理特性来进行。本领域内已知的任何标准无监督或有监督学习技术可用于产生分类器。下面是本领域内已知的无监督和有监督算法的非限定实例。鉴于本申请的公开内容，本领域普通技术人员将理解其它模式分类或回归技术和算法可用于分类器并且本发明包括所有此类技术。

神经网络。在上文中描述了神经网络(例如，两段回归或分类决策规则)。

聚类。在某些实施方案中，使用聚类来学习分类器。在某些实施方案中，将代表标志性活性谱的向量的选择组分i用于聚类活性谱。在某些实施方案中，在聚类之前，将被测量标准化以具有为0的均值和单位方差。

在整个训练群体中显示相似的被测量的模式的标志性活性谱倾向于聚类在一起。当向量聚类至生理特性中时，组分i的被测量的特定组合在本发明的该方面中可被认为是良好的分类器。聚类描述于Duda 1973的第211-256页。如Duda 1973的部分6.7中所描述的，聚类问题被描述为数据集中发现自然分组之一。为了鉴定自然分组，要解决2个问题。首先，确定测量两个活性谱之间的相似性(或相异性)的方法。该量度(相似性量度)用于确保一个簇中的活性谱彼此之间比它们对于其它活性谱更相似。其次，确定使用相似性量度将数据分配至簇中的机制。

相似性量度论述于Duda 1973的部分6.7，其中提出了开始聚类研究的一个方法是确定距离函数和计算成对的活性谱之间的距离的矩阵。如果距离是相似性的良好量度，那么相同簇中活性谱之间的距离显著小于不同簇中活性谱之间的距离。然而，如Duda 1973的第215页中所提及的，聚类不需要使用距离量度。例如，可使用非量度相似性函数s(x，x′)来比较两个向量x和x′。常规地，s(x，x′)是当x和x′以某种方式“相似”时其值为最大的对称函数。在Duda 1973的第216页上提供了非量度相似性函数s(x，x′)的实例。

在上文中还进一步论述了聚类的其它方面。

主组分分析(″PCA″)。在某些实施方案中，使用主组分分析来学习分类器。上文中论述了PCA。

在一个使用PCA学习分类器的方法中，可以以上文中针对聚类所描述的相同方式构建表示标志性活性谱的向量。事实上，其中每一个向量表示标志性活性谱的向量的组可被视为矩阵。在某些实施方案中，该矩阵在弗里-威尔逊法中表示单体的定性二元描述(Kubinyi，1990，3D QSAR in drug design theory methods and applications，PergamonPress，Oxford，pp 589-638，由此通过引用整体并入本文)，并且分布在使用PCA的最大压缩的空间中，从而使得第一主组分(PC)可能捕获最大量的方差信息，第二组组分(PC)捕获第二大量的全部方差信息，依此类推直至矩阵中的所有方差信息都被考虑。

然后，将每一个向量(其中每一个向量表示训练群体的成员(例如标志性活性谱))作图。许多不同类型的图是可能的。在某些实施方案中，制作一维图。在该一维图中，将来自训练群体的每一个成员的第一主组分的值作图。在该形式的图中，预期对应于生理特性的活性谱将聚类在第一主组分值的一个范围内并且对应于另一个生理特性的谱将聚类在第一主组分值的第二范围内。

最近邻分析。在上文中描述了最近邻分析。

线性判别分析。在某些实施方案中，使用线性差别分析来学习分类器。线性差别分析(LDA)试图基于某些目标性质将受试者分类至两个类别之一。换句话说，LDA测试实验中测量的目标属性是否预测目标的分类。LDA通常需要连续自变量和不连续类别依变量。在本发明中，整个训练群体的亚组中向量组分i的选择组合的丰度值(abundance value)用作必需的连续自变量。训练群体的每一个成员的性状亚组分类(例如，生理特性)用作不连续类别依变量。

LDA寻找通过使用分组信息使组间方差与组内方差的比率最大的变量的线性组合。无疑地，由LDA使用的线性权重依赖于整个训练组中向量组分i的被测量在生理特性组中分散的程度。在某些实施方案中，将LDA用于训练群体中成员的数据矩阵。然后，将训练群体的每一个成员的线性判别作图。理想地，代表生理特性的训练群体的那些成员将聚类至线性判别值的一个范围(例如，阴性)并且代表另一种生理特性的训练群体的那些成员将聚类至线性判别值的第二范围(例如，阳性)。当判别值的簇之间的分隔更大时，LDA被认为更成功。关于有关线性判别分析的更多信息，参见例如，Duda，PatternClassification，第2版，2001，John Wiley & Sons，Inc；和Hastie，2001，The Elements of Statistical Learning，Springer，New York；以及Venables & Ripley，1997，Modern Applied Statistics with s-plus，Springer，New York，每一篇所述文献通过引用整体并入本文。

二次判别分析。在上文中描述了二次判别分析。

支持向量机。在上文中描述了支持向量机。

决策树。在上文中描述了决策树。

多元自适应回归样条法。在上文中描述了多元自适应回归样条法。

重心分类器技术。在一个实施方案中，使用最近邻重心分类器技术。对于不同的生理性质，这样的技术计算由训练群体(标志性活性谱)中向量组分i的平均被测量给定的重心，然后将表示目的化合物的向量分配至其重心最近的类中。该方法与k-均值聚类相似，除了类被已知的类替代。该方法的示例性实现是微阵列的预测分析(PredictionAnalysis of Microarray)或PAM。参见例如Tibshirani等人，2002，Proceedings of the National Academy of Science USA 99；6567-6572，其通过引用整体并入本文。

回归。在某些实施方案中，分类器是回归分类器，例如逻辑回归分类器。这样的回归分类器包括用于构建分类器的每一个活性谱的系数。在此类实施方案中，使用例如最大似然法计算回归分类器的系数。在这样的计算中，使用载体组分i的被测量。

学习分类器的其它方法在上文中进行了进一步描述。

可如包括植入计算机可读存储介质中的计算机程序机制的计算机程序产品执行本发明。此外，可在一个或多个计算机或其它形式的装置中执行本发明的任何方法。装置的实例包括但不限于计算机和测量设备(例如，测定读取器(assay reader)或扫描仪)。此外，可在一个或多个计算机程序产品中执行本发明的任何方法。本发明的一些实施方案提供了编码本申请中公开的任何或所有方法的计算机程序产品。此类方法可存储在CD-ROM、DVD、磁盘存储产品或任何其它计算机可读数或程序存储产品上。此类计算机可读存储介质倾向于为可触摸的物理物体(与载波相反)。此类方法还可植入永久存储器例如ROM、一个或多个可编程芯片或一个或多个专用集成电路(ASIC)中。此类永久存储器可置于服务器，802.11通路点、802.11无线网桥/站、中继器、路由器、移动电话或其它电子设备中。还可通过因特网或者通过数字地或于载波上(很清楚载波的此类用途是用于分配而非存储)传输计算机数据信号(其中植入软件模块)电子地分配计算机程序产品中植入的此类方法。

本发明的一些实施方案提供了包含图3中显示的任何或所有程序模块的计算机程序产品。这些程序模块可存储在CD-ROM、DVD、磁盘存储产品或任何其它计算机可读数据或程序存储产品。还可将程序模块植入永久存储器例如ROM、一个或多个可编程芯片、一个或多个专用集成电路(ASIC)中。这样的永久存储器可置于服务器，802.11通路点、802.11无线连接/站、中继器、路由器、移动电话或其它电子设备中。还可通过因特网或否则通过数字地或于载波上传输计算机数据信号(其中植入软件模块)电子地分配计算机程序产品中的软件模块。

在具体的实施方案中，计算机程序提供了将所要求保护的方法的结果输出至用户、用户接口设备、计算机可读存储介质、监视器、本地计算机或作为网络的部分的计算机。此类计算机存储介质倾向于为可触摸的物理目体(与载波相反)。

本发明还提供了生产未充分表征的蛋白质的细胞系的方法。对于此类蛋白质，通常关于其对已知化合物的功能应答性质的信息很少。评估克隆活性的已确定的功能基准的此类缺乏可以是产生生理学相关细胞系中的一个挑战。上文描述的方法提供了获得生理学相关细胞系的途径，即使对于存在此类信息的缺乏时而未得到充分表征的蛋白质。通过寻找代表许多或所有功能形式的克隆，其可以起因于包括蛋白质的基因的表达，可以获得包括蛋白质的生理学相关形式的细胞系。

基于其对各种调节剂的应答，通过使蛋白质的体内形式的身份与蛋白质的已知形式的身份相关，本发明的细胞和细胞系可以用于鉴定目的蛋白质的不同形式在不同病理状态中的作用。这允许选择疾病或组织特异性调节剂用于与蛋白质相关的病理状态的高度靶向治疗。

为了鉴定调节剂.在其中预期蛋白质具有功能的条件下，使本发明的细胞或细胞系接触测试化合物，并且随后检测与合适对照例如未暴露于测试化合物的细胞相比较，蛋白质活性中的统计学显著改变(例如，p＜0.05)。还可以使用采用已知激动剂或拮抗剂和/或表达目的蛋白质的细胞的阳性和/或阴性对照。本领域普通技术人员应当理解各种测定参数例如信噪比可以得到最佳化。

在某些实施方案中，使本发明的一种或多种细胞或细胞系与多种测试化合物，例如测试化合物的文库接触。使用本发明的细胞系可以筛选此类测试化合物文库，以鉴定目的蛋白质的一种或多种调节剂。测试化合物可以是化学部分，包括小分子、多肽、肽、肽模拟物、抗体或其抗原结合部分、天然化合物、合成化合物、提取物、脂质、洗涤剂等。在抗体的情况下，它们可以是非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。抗体可以是包括重链和轻链的完全互补体的完整抗体或任何抗体的抗原结合部分，包括抗体片段(例如Fab和Fab、Fab’、F(ab’)，、Fd、Fv、dAb等)、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、重链或轻链可变区的全部或抗原结合部分。

在某些实施方案中，在与测试化合物接触之前，可通过用例如酶预处理来修饰本发明的细胞或细胞系，所述酶包括哺乳动物或其它动物的酶、植物的酶、细菌的酶、蛋白质修饰酶和脂质修饰酶。此类酶可包括例如激酶类、蛋白酶类、磷酸酶类、糖苷酶类、氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、连接酶类、细菌蛋白酶类、来自胃肠的蛋白酶类、来自GI道的蛋白酶类、唾液、口腔中的蛋白酶类、来自裂解细胞/细菌的蛋白酶等。可选择地，可将细胞和细胞系首先与测试化合物接触，然后进行酶处理以鉴定改变处理对蛋白质的修饰的化合物。

在某些实施方案中，在基于细胞的、功能性的高通量筛选(HTS)中，例如使用96孔、384孔、1536孔或更高密度的形式，测试大型化合物集合的蛋白质调节活性。在某些实施方案中，使用超过一种本发明的细胞或细胞系，可以筛选测试化合物或多种测试化合物，包括测试化合物文库。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系对于目的蛋白质的调节剂具有增加的敏感性。本发明的细胞和细胞系还响应对于蛋白质具有生理学范围EC₅₀或IC₅₀值的调节剂。如本文所使用的，EC₅₀指在细胞或细胞系中诱导半最大激活应答所需的化合物或物质的浓度。如本文所使用的，IC₅₀指在细胞或细胞系中诱导半最大抑制应答所需的化合物或物质的浓度。EC₅₀和IC₅₀值可以使用本领域众所周知的技术进行测定，例如使化合物或物质的浓度与表达蛋白质的细胞系的应答相关的剂量应答曲线。

本发明的细胞和细胞系的进一步有利的性质是，使用那些细胞和细胞系在起始筛选中鉴定的调节剂在次级功能测定中是有功能的。如本领域普通技术人员应认识到的，在起始筛选测定中鉴定的化合物一般必须是例如通过组合化学、药物化学或合成化学进行修饰的，用于其衍生物或类似物在次级功能测定中有功能。然而，由于本发明的细胞和细胞系的高生理学相关性，使用这些细胞和细胞系鉴定的许多化合物无需进一步修饰即是有功能的。在某些实施方案中，在起始测定中鉴定的至少25％、30％、40％、50％或更多的调节剂在次级测定中是有功能的。此外，本发明的细胞系在功能测定中表现与“黄金标准”测定相当。例如，表达GABA A受体的本发明的细胞系在膜电位测定和电生理学中表现基本上相同。

在本发明的其它方面中，根据本发明产生的分化的、成体的或特化细胞可用于产生干细胞。在某些实施方案中，可将通过本发明的方法鉴定的细胞(其中细胞类型或特化是分化的、成体的或特化细胞)去分化成干细胞，包括但不限于多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的全能性干细胞(″iPS″)、胚胎干细胞、癌症干细胞以及器官或组织特异性干细胞。去分化的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。参见，例如，Panagiotis A.Tsonis；Stem Cells fromDifferentiated Cells；Molecular Interventions 4：81-83，(2004)。可将从本发明的细胞或通过本发明的方法鉴定的细胞产生的干细胞去分化成去分化的成体的或特化细胞类型或特化的一个或多个细胞。

从本发明的细胞或通过本发明的方法鉴定的细胞产生的胚胎干细胞和iPS细胞可用于产生完整非人生物体例如小鼠。使用小鼠胚胎干细胞产生小鼠的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。参见，例如，Smith，″EMBRYO-DERIVED STEM CELLS：Of Mice andMen″，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2001，17：435-62，其通过引用整体并入本文。使用iPS细胞产生小鼠的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的。参见，例如，Kang等人，″iPS Cell Can Support Full-TermDevelopment of Tetraploid Blastocyst-Complemented Embryos″，CellStem Cell，Jul 22，2009[印刷前的电子版]和Zhao等人，、″iPS Cellproduce viable mice through tetraploid complementation″，Nature，July23，2009[印刷前的电子版]。

在某些实施方案中，可将通过本发明的方法鉴定的其中细胞类型或特化是分化的、成体的或特化细胞的本发明的细胞去分化成干细胞包括但不限于多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞(“iPS”)、胚胎干细胞、癌症干细胞和器官或组织特异性干细胞，然后可将所产生的干细胞分化成一种或多种分化的、成体的或特化细胞类型或特异性的细胞。

在某些实施方案中，可将通过本发明的方法鉴定的其中细胞类型或特化是分化的、成体的或特化细胞的本发明的细胞或细胞系去分化成胚胎干细胞或iPS细胞，然后可将所产生的干细胞用于产生完整生物例如小鼠。在某些实施方案中，可将通过本发明的方法鉴定的其中细胞类型或特异性是分化的、成体的或特化细胞的本发明的细胞去分化成胚胎干细胞或iPS细胞，然后可将所产生的干细胞用于产生完整生物例如小鼠，其中相同细胞类型或特异性的生物中的细胞包含就其选择本发明的细胞的相同性质例如目的蛋白质或RNA的表达。

在某些实施方案中，可使用包含RNA或蛋白质或RNA或蛋白质的功能或生理形式的特化细胞或组织类型的细胞来产生可用于产生生物例如小鼠的胚胎干细胞或iPS细胞，其中相同类型的生物的细胞或组织包含所述RNA或蛋白质或所述RNA或蛋白质的功能或生理形式。在某些实施方案中，所产生的生物包含相同种类的RNA或蛋白质。在其它实施方案中，所产生的生物包含不同种类的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，生物是小鼠并且RNA或蛋白质是人来源的RNA或蛋白质。在某些实施方案中，所产生的生物包含本发明的体外相关性。在某些实施方案中，所产生的生物可用于测试，包括临床前试验。在某些实施方案中，将所述测试或临床前试验用于预测测试化合物在人中的活性。

在其它方面中，本发明提供了用于产生体内生理特性的体外相关性的方法。体内生理特性的体外相关性包括一种或多种化合物对本发明的细胞或细胞系中表达(即，体外表达的)的一种或多种蛋白质或RNA的效应，其与所述一种或多种化合物对一种或多种体内药理性质的效应相关。不受理论束缚，如果发现测试化合物具有与参照化合物相比较相似或基本上相同的对一种或多种体外表达的蛋白质或RNA的效应，那么测试化合物可被认为与参照化合物相比较具有对一个或多个体内生理特性相似或基本上相同的效应，即，测试化合物被认为与参照化合物相比较具有相似或基本上相同的体外相关性(例如，至少90％相同)。在某些实施方案中，测试化合物被认为与对照化合物相比较具有相似或基本上相同的体外相关性(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％60％、70％、80％或90％相同)。体外相关性可包括化合物的一个或多个活性谱。

在其它方面中，由本发明的细胞或细胞系表达的蛋白质或多种蛋白质提供了体内目的蛋白质或多种体内目的蛋白质的体外相关性。本发明的细胞和细胞系在提供用于表达一种或多种蛋白质的完全相同的条件中可能不能完全在体内重现此类细胞，例如与在体内表达的蛋白质相比较，在本发明的细胞或细胞系中表达的蛋白质之间在翻译后修饰、折叠、装配、亚单位组合、转运和/或膜整合中可存在差异。此外，在测试体外表达的蛋白质的功能中使用的参数可能在体内不能完全重现这些参数，例如，体外进行的某些蛋白质功能测定可在被认为是非生理的某些pH或盐浓度下进行。然而，由本发明的细胞或细胞系表达的蛋白质可在这些非生理条件中具有生物活性并且可当在体外测定时可提供至少一种功能或药理或生理特性。这样的功能或药理或生理特性可对应于体内蛋白质。例如，在调节或改变与体内蛋白质相关的生理特性的化合物当在体外测定时可以能够改变由本发明的细胞或细胞系表达的相应蛋白质的生物活性，从而建立了由本发明的细胞或细胞系表达的蛋白质与体内表达的蛋白质之间的相关性，由本发明的细胞或细胞系表达的蛋白质被认为是体内表达的蛋白质的“体内相关物”。例如，我们已发现各自表达相同组的Nav亚单位(α、β1和β2)的不同细胞系可对相同组的化合物作出不同反应。参见，例如，下文中的实施例23。这些不同的功能特征表示这些细胞系中不同的亚单位组合，并且不同亚单位组合的每一个可被认为是相应的体内亚单位组合的体外相关性。此外，我们也已获得针对成组的表达苦味受体的细胞系的化合物活性的特征谱。感觉人味道的测试用于与化合物活性谱比较以判断哪个化合物模式针对实验对象组的活性与体内所需味道或后味相关。

除了对化合物的反应之外，还可通过将其它处理和/或条件用于由本发明的细胞表达的蛋白质来产生和/或分类本发明的体外相关性。例如，我们已通过蛋白酶解产生ENaC的体外相关性(例如，ENac的不同蛋白酶解形式的产生)，并且已通过应用不同的培养基条件产生甜味/鲜味受体的体外相关性。

体外相关性可包括一种蛋白质或多种蛋白质。这样的体外相关物可预测其相应的体内蛋白质的功能或活性。这样的体外相关性可用于高通量筛选以鉴定由本发明的细胞或细胞系表达的蛋白质的一种或多种生物活性(即，体外相关性)的调节剂，并且一些或所有由此鉴定为体内相物的化合物也可调节体内表达的蛋白质(例如，具有体内治疗效应)。在各种实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的在高通量测定中鉴定的所有化合物能够具有治疗效应。在某些实施方案中，体内相关物可包含至少2、3、4、5或6个亚单位。在某些实施方案中，体外相关性可以是异源多聚体。在某些实施方案中，体外相关性于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达。在某些实施方案中，体外相关性在细胞系中表达而不引起细胞毒性。在某些实施方案中，体外相关性在不内源性表达蛋白质或多种蛋白质的细胞中表达。

在某些实施方案中，根据本发明表达体外相关性的细胞或细胞系可用于例如通过将细胞或细胞系与测试化合物接触来鉴定体内目的蛋白质的调节剂；和检测与不与测试化合物接触的细胞中体外相关性的蛋白质或多个蛋白质的活性相比较，与测试化合物接触的细胞或细胞系中体外相关性的蛋白质或多个蛋白质的活性的变化，其中在存在的情况下与不存在的情况下相比产生活性的差异的化合物是体内目的蛋白质的调节剂。

在某些方面中，本发明提供了可用于本文中描述的方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括装有用于本文中描述的方法的一种或多种试剂的一个或多个容器。

在某些方面中，本文中提供了可用于本文中描述的方法的试剂盒。具体地，本文中提供了包括稳定地表达一种或多种复杂靶标的一个或多个细胞或细胞系的试剂盒。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包括一个或多个本文中描述的信号传导探针。在具体的实施方案中，试剂盒可包括编码一个或多个复杂靶标的一个或多个载体。在具体的实施方案中，试剂盒包括一种或多种用于基于功能细胞的测定(例如，钙流测定、膜电位测定)的染料以筛选和选择稳定地表达一个或多个复杂靶标的细胞。

在某些方面中，本文中提供了试剂盒，所述试剂盒包括装有本文中描述的一种或多种试剂和/或细胞例如本文中提供的一种或多种细胞、载体和/或信号传导探针的一个或多个容器。在某些实施方案中，本发明的试剂盒还包括对照试剂(例如，对照信号传导探针、染料、细胞和/或载体)，其中此类对照试剂可以是阳性对照或阴性对照试剂。任选地与此类容器相关的可以是包括使用试剂盒中的组分的说明书的简介。

甜味受体和鲜味受体

本发明涉及已进行改造以稳定地表达甜味受体的T1R2或T1R3亚单位以及任选的G蛋白的新型细胞和细胞系。本发明还涉及已进行改造以稳定地表达鲜味受体的T1R1和T1R3亚单位以及任选的G蛋白的新型细胞和细胞系。在某些实施方案中，在此类细胞和细胞系中产生的味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)是功能和生理学相关的。在其它方面中，本发明提供了制备和使用此类细胞和细胞系的方法。包含味觉受体例如鲜味受体或甜味受体的本发明的细胞和细胞系可用于鉴定味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)的调节剂。此类调节剂用于改变例如食物或药物的味道，并且用于治疗性治疗其中牵涉味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)的疾病(例如肥胖症和糖尿病)。

根据本发明的一些实施方案，用编码甜味受体T1R2亚单位的核酸和/或编码甜味受体T1R3亚单位的核酸单独地或双重地转染新型细胞和细胞系。在一些具体的实施方案中，用编码鲜味受体T1R1亚单位的核酸和/或编码鲜味受体T1R3亚单位的核酸单独地或双重地转染新型细胞和细胞系。其它亚单位可在细胞中从内源核酸表达。两个核酸(如果存在)可存在于相同或分离的载体中。在另一个实施方案中，用编码甜味受体T1R2亚单位、甜味受体T1R3亚单位和G蛋白的核酸单独地、双重地或三重地转染本发明的新型细胞和细胞系。在另一个实施方案中，用编码鲜味受体T1R1亚单位、鲜味受体T1R3亚单位和G蛋白的核酸单独地、双重地或三重地转染本发明的新型细胞和细胞系。如之前一样，核酸可存在于相同或分离的载体中。例如，可使用3个载体；可使用1个载体；可使用2个载体。其它亚单位和任选的G蛋白可在细胞中从内源核酸表达。在另一个实施方案中，新型细胞和细胞系通过基因激活使至少一个味觉受体亚单位(例如鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)激活以进行表达。必要时，另外的味觉受体亚单位(例如鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)和/或任选的G蛋白可从编码此类蛋白质的所引入的核酸序列表达或可以已从内源活性核酸表达。本发明的新型细胞系稳定地表达所引入的和/或基因激活的味觉受体亚单位(例如鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)和任选的G蛋白。

如上所述，在本发明的一些实施方案中，除了产生味觉受体例如鲜味受体或甜味受体的两个亚单位外，还改造本发明的细胞和细胞系以产生G蛋白。经改造的细胞和细胞系以产生G蛋白，因为它们在其被改造之前的状态中不产生G蛋白，所述G蛋白是从激活的味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)触发下游信号传导所必需的，或该细胞不能产生足够量的G蛋白以用于味觉受体诱导的信号传导，例如鲜味受体诱导的信号传导或甜味受体诱导的信号传导。

在第一方面中，本发明提供了表达味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)的细胞和细胞系，所述细胞和细胞系与由常规方法制备的细胞和细胞系相比较具有增强的性质。例如，本发明的味觉受体细胞和细胞系(例如鲜味味觉受体细胞和细胞系或甜味味觉受体细胞和细胞系)具有增强的表达稳定性和/或表达水平(即使当在无选择压力包括例如抗生素和其它药物的培养中维持时)。在其它实施方案中，本发明的细胞和细胞系在多种测定中具有高Z’值。在其它实施方案中，本发明的细胞和细胞系在它们的生理学相关的味觉受体活性(例如鲜味受体活性或甜味受体活性)的表达的背景中，与更常规地改造的细胞相比较得到改善。这些性质增强和改善待用于测定的本发明的细胞和细胞系鉴定味觉受体(例如鲜味受体和/或甜味受体)的调节剂和改善所鉴定的调节剂的功能属性的能力。

在各种实施方案中，本发明的细胞或细胞系以一致的表达水平表达鲜味受体T1R1和T1R3亚单位或甜味受体T1R2和T1R3亚单位至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200天或超过200天，其中一致的表达是指这样的表达水平，所述表达水平经过2至4天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％9％或10％；在5至15天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％或12％；经过16至20天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％；经过21至30天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；经过30至40天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过41至45天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过45至50天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过45至50天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经过50至55天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％或35％；经过55至75天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％；经过75至100天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过101至125天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过126至150天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过151至175天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过176至200天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过超过200天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。

根据本发明，由本发明的细胞或细胞系表达的味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)可来自任何哺乳动物，包括大鼠、小鼠、兔子、山羊、狗、牛、猪或灵长类动物。一起形成表达的甜味受体的T1R2和T1R3亚单位可来自相同的或不同的物种。例如，来自任何种类的甜味受体T1R2亚单位可与来自相同物种或来自任何其它物种的甜味受体T1R3亚单位在本发明的细胞或细胞系中共表达。同样地，一起形成表达的鲜味受体的T1R1和T1R3亚单位可来自相同的或不同的物种。例如，来自任何种类的鲜味受体T1R1亚单位可与来自相同物种或来自任何其它物种的鲜味受体T1R3亚单位在本发明的细胞或细胞系中共表达。类似地，在其中G蛋白也在本发明的细胞和细胞系中表达的实施方案中，G蛋白可来自任何物种。其中这些G蛋白是表7中提及的G蛋白。嵌合G蛋白(Ga15-Ga16；GNA15-GNA16)也可在本发明的细胞和细胞系中表达。来自任何物种的G蛋白可与来自任何物种的甜味受体T1R2亚单位共表达，可使用来自任何物种的甜味受体T1R3亚单位或三者的任何组合。在具体的实施方案中，甜味受体是人甜味受体并且优选通过人T1R2和T1R3亚单位来表征。在另一个具体实施方案中，鲜味受体是人鲜味受体并且优选通过人T1R1和T1R3亚单位来表征。本发明的一个方面提供了克隆细胞和细胞系的集合，所述克隆细胞和细胞系各自表达相同的味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)，或不同的味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)。集合可包括例如表达不同亚单位的组合或此类亚单位的全长或片段的细胞或细胞系。

编码味觉受体亚单位例如鲜味受体亚单位T1R1和T1R2或甜味受体亚单位T1R2和T1R3的核酸和编码任选的蛋白的核酸可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其混合物。在某些实施方案中，味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)亚单位编码核酸序列和任选的编码G蛋白的核酸序列还包含标签。此类标签可以编码例如HIS标签、myc标签、血凝素(HA)标签、蛋白质C、VSV-G、FLU、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白、FLAG、BCCP、麦芽糖结合蛋白标签、Nus-标签、Softag-1、Softag-2、Strep-标签、S-标签、硫氧还蛋白、GST、V5、TAP或CBP。标签可用作测定味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)亚单位和G蛋白表达水平、细胞内定位、蛋白质间相互作用、味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的调节或味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的功能。标签还可用于纯化或分级分离味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)或G蛋白。

在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系可包含核酸(SEQ IDNO：31)，其编码人甜味受体T1R2亚单位。在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系可包含核酸(SEQ ID NO：41)，其编码人鲜味受体T1R1亚单位。本发明的细胞或细胞系还可包含核酸(SEQ ID NO：32)，其编码人甜味受体或鲜味受体T1R3亚单位。在具体的实施方案中，本发明的细胞或细胞系包含编码T1R3和T1R1或T1R2的核酸。在其它实施方案中，除了编码T1R1和T1R3亚单位或T1R2和T1R3亚单位的核酸外，本发明的细胞或细胞系还可包含核酸序列(SEQ IDNO：33)。SEQ ID NO：33编码小鼠Ga15蛋白。在其它实施方案中，该G蛋白是人Ga15。参见SEQ ID NO：37。

在某些实施方案中，与编码野生型味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的核酸序列相比较，编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)和任选的G蛋白的核酸包含一个或多个置换、插入、突变或缺失。在包括含有突变的核酸的实施方案中，突变可以是随机突变或定点突变。此类核酸变化可以导致或可以不导致氨基酸置换。在某些实施方案中，核酸是编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的核酸的片段。作为片段或具有此类修饰的核酸编码多肽，所述多肽保留味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的至少一种生物性质，例如分别为其与其的其它亚单位一起激活G蛋白的能力或其被味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体)激活的能力。

本发明还包括稳定地表达编码亚单位的核酸的细胞和细胞系，所述核酸的序列与选自SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：32或或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸具有至少约85％同一性。在某些实施方案中，与此类亚单位序列相比较，亚单位编码序列的同一性为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。本发明还包括细胞和细胞系，在所述细胞和细胞系中，编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)的核酸在严格条件下与选自SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸的亚单位序列杂交。

在某些实施方案中，细胞或细胞系包含味觉受体亚单位编码核酸序列(例如，编码鲜味受体亚单位的核酸序列或编码甜味受体亚单位的核酸序列)，所述核酸序列与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸相比较包含至少一个置换。置换可包含少于10、20、30或40个核苷酸或多至或等于1％、5％、10％或20％核苷酸序列。在某些实施方案中，置换的序列可以与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸(例如，与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)基本上等同，或为能够在严格条件下与SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸杂交的序列。

在某些实施方案中，细胞或细胞系包含编码味觉受体亚单位的核酸序列(例如，编码鲜味受体亚单位的核酸序列或编码甜味受体亚单位的核酸序列)，所述核酸序列包含至SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸的插入或从其的缺失。插入或缺失可少于10、20、30或40个核苷酸或多至或等于1％、5％、10％或20％核苷酸序列。在某些实施方案中，插入或缺失的序列可与SEQID NO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸(例如，与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)基本上等同，或为能够在严格条件下与SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：32或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任一种相同的氨基酸序列的核酸杂交的序列。

如上所述，在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系任选地表达G蛋白例如小鼠Ga15蛋白(SEQ ID NO：36)或人Ga15蛋白(SEQ IDNO：37)。与编码甜味受体的T1R2和T1R3亚单位或鲜味受体的T1R1和T1R3亚单位的核酸序列一样，编码G蛋白的核酸序列(和G蛋白的氨基酸序列)可包括如上针对甜味受体亚单位所述的置换、缺失和插入。

在某些实施方案中，核酸置换或修饰导致氨基酸变化，例如氨基酸置换。例如，SEQ ID NO：34(人T1R2)、SEQ ID NO：35(人T1R3)、SEQ ID NO：42(鲜味人T1R1同种型1aa)、SEQ ID NO：43(鲜味人T1R1同种型2aa)、SEQ ID NO：44(鲜味人T1R1同种型3aa)、SEQ IDNO：45(鲜味人T1R1同种型4aa)的氨基酸残基或衍生自除人外的物种的对应氨基酸或SEQ ID NOS：36(小鼠Ga15)和37(人Ga15)和来自任何物种的G蛋白的氨基酸残基可被保守或非保守置换取代。在某些实施方案中，原始与经修饰的氨基酸序列之间的序列同一性可相差约1％、5％、10％或20％或不同于与其基本等同的序列(例如，与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有与亲本氨基酸残基具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的另一个氨基酸残基置换的那种。在其中2个或更多个氨基酸序列彼此相差保守置换的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。用于进行此类调整的方法是本领域技术人员众所周知的。用于进行该调整的方法对于本领域普通技术人员来说是众所周知的。参见，例如，Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。

拥有具有相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可选地，保守氨基酸置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中公开的PAM250对数可能性矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守的”替换是在PAM250对数可能性矩阵中具有非负值的任何变化。

亚单位T1R2和T1R3中的保守修饰将产生具有与未修饰的甜味受体的功能和化学特征相似的(即，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％相同)的功能和化学特征的甜味受体。亚单位T1R1和T1R3中的保守修饰将产生具有与未修饰的鲜味受体的功能和化学特征相似的(即，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％相同)的功能和化学特征的鲜味受体。这也适用于G蛋白。

用于产生本发明的细胞或细胞系的宿主细胞可以它们的天然状态表达一种或多种内源性味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或缺乏任何味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)的表达。这也适用于G蛋白。宿主细胞可以是原代细胞、精细胞或干细胞，包括胚胎干细胞。宿主细胞还可以是永生化细胞。原代或永生化宿主细胞可来源于真核生物的中胚层、外胚层或内胚层。宿主细胞可以是上皮细胞、表皮细胞、间质细胞、神经细胞、肾细胞、肝细胞、造血细胞或免疫细胞。例如，宿主细胞可以是血液/免疫细胞例如B细胞、T细胞(细胞毒性T淋巴细胞、天然杀伤性T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞、gd T细胞、天然杀伤细胞)；粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/多分叶核中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；内分泌细胞例如甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)；神经系统细胞例如胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞型神经分泌细胞、星状细胞、核链细胞、伯特彻氏细胞、垂体细胞(促性腺物质、促皮质激素分泌细胞、甲状腺促素细胞、亲躯体细胞、催乳激素细胞)、呼吸系统细胞例如肺细胞(I型肺泡細胞、II型肺泡細胞)、克拉拉细胞、杯状细胞；循环系统细胞(心肌细胞、周细胞)；消化系统细胞(胃(胃粘膜主细胞、胃壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝(肝细胞、肝巨噬细胞)、胰(β细胞、α细胞)、胆囊)；软骨/骨骼/肌肉/皮肤系统细胞例如成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙细胞(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞例如成软骨细胞、软骨细胞、皮肤/毛细胞例如丝胞、角质形成细胞；黑素细胞例如肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞；泌尿系统细胞例如足细胞、球旁细胞、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞例如精子、支持细胞、莱迪希细胞、卵子、卵泡细胞；感觉细胞例如柯蒂氏器细胞、嗅上皮、温度敏感性感觉神经元、梅克尔细胞、嗅觉受体神经元、痛敏神经元、感光细胞、味蕾细胞，前庭器官的毛细胞、颈动脉体细胞。宿主细胞可以是真核生物、原核生物、哺乳动物、鸟类、家禽、爬行动物、两栖动物、蛙、蜥蜴、蛇、鱼、蠕虫、鱿鱼、龙虾、海胆、海参、海鞘、苍蝇、水螅、节肢动物、甲虫类、鸡、七鳃鳗、稻鱼、斑胸草雀、河豚和斑马鱼的细胞。哺乳动物实例包括人、非人灵长类、牛科动物、猪科动物、猫科动物、大鼠、有袋动物、鼠科动物、犬科动物、羊、山羊、兔、豚鼠和仓鼠。宿主细胞还可以是非哺乳动物，例如酵母、昆虫、真菌、植物、真核生物和原核生物。此类宿主细胞可为测试味觉受体调节剂例如鲜味受体调节剂或甜味受体调节剂(由细胞产生的可与靶相互作用的表达产物不存在的可能性更大)提供更多样的背景。在优选实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。

可用于产生本发明的细胞或细胞系的宿主细胞的实例包括但不限于：人胚肾-293T细胞、已建立的神经元细胞系、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤、成纤维细胞、横纹肌肉瘤、背根神经节细胞、NS0细胞、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCCCRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、HEK-293(ATCC CRL1573)和PC12(ATCC CRL-1721)、HEK293T(ATCC CRL-11268)、RBL(ATCC CRL-1378)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、MDCK(ATCC CCL-34)、SJ-RH30(ATCCCRL-2061)、HepG2(ATCC HB-8065)、ND7/23(ECACC 92090903)、CHO(ECACC 85050302)、Vero(ATCC CCL 81)、Caco-2(ATCC HTB37)、K562(ATCC CCL 243)、Jurkat(ATCC TIB-152)、Per.C6(Crucell，Leiden，The Netherlands)、Huvec(ATCC人原代PCS 100-010、小鼠CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH-7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC CRL 10852)、A549(ATCC CCL 185)、IMR-90(ATCC CCL186)、MCF-7(ATC HTB-22)、U-2OS(ATCC HTB-96)、T84(ATCC CCL248)或任意已建立的细胞系(极化的或非极化的)或可从库例如美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801University Blvd.Manassas，Va.20110-2209USA)或欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection ofCell Cultures)(ECACC，Salisbury Wiltshire SP40JG England)获得的任意细胞系。

在一个实施方案中，宿主细胞是胚胎干细胞，其然后用作产生味觉受体例如鲜味受体或甜味受体的转基因动物的产生的基础。可将稳定地表达至少一种味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或两种受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或两个甜味受体亚单位)以及优选功能性味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的胚胎干细胞直接植入生物，可将它们的细胞核转移进行其它受体细胞，然后植入此类细胞，或可将它们用于产生转基因动物。在某些实施方案中，可以以所需时间和/或组织特异性表达在动物中表达一个或多个亚单位。

如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选宿主细胞一起使用的任何载体可以用于将编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的核酸引入宿主细胞。包含编码各种味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的核酸的载体可以是相同的类型或可以是不同的类型。可用于将编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的核酸引入宿主细胞的载体的实例包括但不限于质粒、病毒，包括逆转录病毒和慢病、粘粒、人造染色体，其可包括例如pFN11A(BIND)

pGL4.31、pFC14A(

7)CMV

pFC14K(

7)CMVpFN24A(

7)CMVd3

pFN24K(7)CMVd3

HaloTag^TMpHT2、pACT、pAdVAntage^TM、pBIND、

增强子、

启动子、pCI、pCMVTNT^TM、pG5luc、pSI、pTARGET^TM、pTNT^TM、pF12A

pF12K RM

pReg neo、pYES2/GS、pAd/CMV/V5-DEST

载体、pAd/PL-DEST^TM

载体、

pDEST^TM27载体、

pEF-DEST51载体、pcDNA^TM-DEST47载体、pCMV/Bsd载体、pEF6/His A、B和C、pcDNA^TM6.2-DEST、pLenti6/TR、pLP-AcGFP1-C、pLPS-AcGFP1-N、pLP-IRE Sneo、pLP-TRE2、pLP-RevTRE、pLP-LNCX、pLP-CMV-HA、pLP-CMV-Myc、pLP-RetroQ、pLP-CMVneo、pCMVScript、pcDNA3.1Hygro、pCDNA3.1neo、pcDNA3.1puro、PSV2neo、pIRESpuro、pSV2zeo。在某些实施方案中，载体包含表达控制序列例如组成型或条件型启动子，优选使用组成型启动子。本领域普通技术人员能够选择此类序列。例如，适当的启动子包括但不限于CMV、TK、SV40和EF-1α。在某些实施方案中，启动子是诱导型、温度调节型、组织特异性、阻遏型、热休克、发育、细胞谱系特异性、真核细胞、原核细胞或瞬时启动子，或上述任一种或多种的未修饰的经诱变处理的、随机化的、经改组的序列的组合或重组。在其它实施方案中，味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或超过一个所述亚单位(和任选的G蛋白)通过基因激活表达或附加地表达。

在某些实施方案中，载体缺乏可选择的标记或抗药基因。在其它实施方案中，载体任选地包含编码可选择的标记(例如赋予抗药性或抗生素抗性的蛋白质或更常见地对细胞施加选择压力的任何产物)的核酸。用于引入编码不同味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或G蛋白的序列的各载体具有相同或不同的抗药性或其它选择压力标记。如果超过一个抗药性或选择压力标记相同，可通过提高药物的水平来实现同时选择。适当的标记对于本领域普通技术人员来说是众所周知的，包括但不限于赋予对下列物质的任一种的抗性的多肽产物：新霉素/G418、嘌呤霉素、潮霉素、博来霉素、氨甲喋呤和杀稻瘟菌素。虽然药物选择(或使用任何其它适当的选择标记的选择)不是产生本发明的细胞和细胞系的必需步骤，但其可用于富集稳定地转染的细胞的转染的细胞群体，前提是转染的构建体经设计赋予抗药性。如果使用信号传导探针进行表达鲜味受体亚单位和任选的G蛋白或甜味受体亚单位和任选的G蛋白的细胞的随后选择，那么转染后过早的选择可导致一些可能只是被瞬时转染而非稳定转染的阳性细胞。然而，该效应可通过使充足的细胞传代以允许稀释转染的细胞中的瞬时表达来降至最低程度。

在某些实施方案中，用于引入编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)或任选的G蛋白的核酸的载体包含编码RNA标签序列的核酸序列。“RNA标签序列”是指为可被信号传导探针检测的表达的RNA或RNA的部分的核酸序列。信号传导探针可检测多个RNA序列。此类RNA中的任何RNA可用作标签。可通过设计探针以包含与标签的RNA序列互补的部分来使信号传导探针针对RNA标签。标签序列可以是被共转录的并且包含信号传导探针结合的靶序列的载体的3′非翻译区。从目的核酸产生的RNA可包括标签序列或标签序列可位于5′非翻译区或3′非翻译区。在某些实施方案中，标签不是从目的核酸产生的RNA的部分。标签序列可与目的核酸的信使的蛋白质编码部分一起存在于框内或与其一起不存在于框内，这视是否希望标记所产生蛋白质而定。因此，对于通过信号传导探针进行的检测，不必翻译标签序列。标签序列可包含相同或不同的多个靶序列，其中一个信号传导探针与各靶序列杂交。标签序列可编码具有二级结构的RNA。结构可以是三臂连接结构。可用于本发明的和可制备针对其的信号传导探针的标签序列的实例包括但不限于表位标签的RNA转录物，所述表位标签是例如HIS标签、myc标签、血凝素(HA)标签、蛋白质C、VSV-G、FLU、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白、FLAG、BCCP、麦芽糖结合蛋白标签、Nus-标签、Softag-1、Softag-2、Strep-标签、S-标签、硫氧还蛋白、GST、V5、TAP或CBP。如本文中所描述的，本领域普通技术人员可容易地制备和使用RNA标签序列。

为了制备本发明的细胞和细胞系，可使用例如美国专利6,692,965和国际专利申请WO/2005/079462中描述的方法。为了所有目的将这两个文献通过引用整体并入本文。这个技术提供数百万细胞的实时评估，使得可选择表达(即产生RNA)目的核酸序列的任何所需数目的克隆(从数百个到数千个克隆)。使用细胞分选技术，例如流式细胞术细胞分选(例如用FACS机器)或磁性细胞分选(例如用MACS机器)，1个所选细胞/孔可以以高统计可靠性自动地存放于培养器皿(例如96孔培养平板)中。技术的速度和自动化允许容易地分离多基因重组细胞系(即，表达味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的T1R2和T1R3亚单位以及任选的G蛋白的细胞系)。

通过使用所述技术，可使用信号传导探针(也称为分子信标或荧光探针)检测细胞或细胞系中表达的各味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(和任选的G蛋白)的RNA序列。在某些实施方案中，分子信号识别如上所述的靶序列。在另一个实施方案中，分子信标识别味觉受体(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(或G蛋白)本身内的序列。可通过设计探针以包含分别与标签或味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(或G蛋白)的RNA序列互补的部分来使信号传导探针针对RNA标签或味觉受体亚单位序列(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(或G蛋白序列)。

可通过众所周知的方法将编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)的核酸(和任选的编码G蛋白的核酸)，或编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(或G蛋白)和标签序列的序列以及任选的编码可选择的标记的核酸引入选择有宿主细胞。可使用本领域内众所周知的常规方法以相似的方式将基因激活序列引入细胞。方法包括但不限于转染、病毒递送、蛋白质或肽介导的插入、共沉淀法、基于脂质的递送试剂(脂转染)、细胞转染剂、脂多胺递送、树状大分子递送剂、电穿孔或机械递送。转染剂的实例是GENEPORTER、GENEPORTER2、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX-10、TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LT1、TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAISHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CLONFECTIN和METAFECTINE。可将味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)核酸序列(和潜在的编码G蛋白的核酸)整合在细胞的基因的不同位置。编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)和G蛋白的所引入的核酸的表达水平可基于整合的位点而变化。

在将编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)的序列或味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)基因激活序列引入宿主细胞(和任选的将G蛋白编码序列引入此类细胞或激活所述序列)并且任选地随后进行药物选择后，将分子信标(例如，荧光探针)引入细胞，然后将细胞分选术用于分离对于它们的信号，从而对于所需核酸序列的表达(RNA)呈阳性的细胞。本领域普通技术人员清楚地知道可依据任何所需表达水平门控该分选。必要时可进行多轮分选。在一个实施方案中，流式细胞分选器是FACS机器。还可使用MACS(磁性细胞分选术)或利用激光激活的分析和加工的阴性细胞的激光消融。根据本方法，检测并回收表达甜味受体亚单位T1R2和T1R3(和任选的G蛋白)或鲜味受体亚单位T1R1和T1R3(和任选的G蛋白)的细胞。

在本发明中有用的信号传导探针是本领蜮已知的，并且一般是包括与靶序列互补的序列和信号发射系统的寡核苷酸，所述信号发射系统如此安排，使得当探针不与靶序列结合时，无信号发射，并且当探针与靶序列结合时，发射信号。作为非限制性举例说明，信号传导探针可以包括如此定位在探针中的荧光团和猝灭剂，使得猝灭剂和荧光团在未结合的探针中被放在一起。在探针和靶序列之间结合后，猝灭剂和荧光团分离，导致信号的发射。例如国际公开案WO/2005/079462描述了可用于和优选用于本发明的细胞和细胞系的产生的许多信号传导探针。在使用标签序列的情况下，每一个味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(或任选的G蛋白)的载体可包含相同或不同的标签序列。无论标签序列是否相同，信号传导探针都可包含不同的信号发射物例如具有不同颜色的荧光基团等，使得各亚单位(和G蛋白)的表达(RNA)可被分别检测到。作为举例说明，特异性检测甜味受体T1R2mRNA或鲜味受体T1R1mRNA的信号传导探针可包含红色荧光基团，检测甜味/鲜味受体T1R3亚单位(RNA)的探针可包含绿色荧光基团以及任选地，检测G蛋白(RNA)的探针可包含黄色荧光基团。本领域普通技术人员知道用于在转染的细胞中利用信号传导探针差异地检测2个(或任选3个)表达的RNA的其它方法。

可通过本领域普通技术人员众所周知的许多方法的任何方法将编码信号传导探针的核酸引入选择的宿主细胞，所述方法包括但不限于转染、共沉淀法、基于脂质的递送试剂(脂转染)、细胞转染剂、脂多胺递送、树状大分子递送剂、电穿孔或机械递送。转染剂的实例是GENEPORTER、GENEPORTER2、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX-10、TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LT1、TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAISHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CLONFECTIN和METAFECTINE。

在一个实施方案中，信号传导探针设计为与编码味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)的RNA的部分或其5′或3′非翻译区的部分(或编码G蛋白的RNA的相似部分)互补。即使设计为识别目的信使RNA的信号传导探针能够检测虚假地内源性表达的靶序列，与由经转染的细胞产生的目的序列的比例相比较，这些的比例是这样的，使得分选器能够区分2种细胞类型。

在具体的实施方案中，还可设计和使用针对(例如，互补的)相同或其它编码外显子、非编码内含子或非编码非翻译序列内的其它序列的信号传导探针。在特定的实施方案中，还可使用针对信号传导途径包括甜味受体(例如，T1R2和T1R3)或鲜味受体(例如，T1R1和T1R3)的信号传导途径的组分的信号传导探针。

味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(和任选的G蛋白)的表达水平可在细胞间或细胞系之间变化。细胞或细胞系的表达水平还可因表观遗传学事件例如DNA甲基化和基因沉默以及转基因拷贝的丢失而随着时间推移降低。此类变化可归因于许多因素例如被细胞吸收的转基因的拷贝数、转基因的基因组整合位点以及在基因组整合后转基因的完整性。可使用FACS或其它细胞分选方法(即，MACS)估计表达水平。可以使用引入信号传导探针的另外轮次，例如以确定随着时间推移细胞是否对最初针对其分离所述细胞的RNA的任一种或多种保持阳性以及保持阳性至何种程度。

在具体的实施方案中，可以例如通过FACS，通过门控相对于整个细胞群体具有适当的荧光水平的细胞的亚组来分离对于至少一个信号传导探针具有不同的绝对或相对荧光水平的细胞。例如，可以通过例如FACS门控和分离前5％、前10％、前15％、前20％、前25％、前30％、前35％、前40％、前45％、前50％、前55％、前60％或前65％的对于特定信号传导探针(或信号传导探针的组合)具有最高荧光信号的细胞。在其它实施方案中，可通过例如FACS门控和分离前2％至3％、前5％至10％、前5％至15％、前5％至20％、前5％至30％、前40％至50％、前10％至30％、前10％至25％或前10％至50％的对于特定信号传导探针(或信号传导探针的组合)具有最高荧光信号的细胞。

一旦分离表达T1R1和T1R3或T1R2和T1R3(和任选的G蛋白)的RNA的细胞，就可将它们在任何条件下于培养基中培养足以产生和鉴定稳定地表达亚单位(和任选的G蛋白)(RNA或蛋白质)，更优选表达功能性味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)(和任选的G蛋白)的细胞的时间长度。在本发明的另一个实施方案中，在细胞分选和分离单个细胞之前或之后可使粘附细胞适应悬浮。在一个实施方案中，可将分离的细胞单个培养或集合以产生细胞群体。还可分开地培养单个或多个细胞系或集合所述细胞或细胞系。如果细胞或细胞系的混合物稳定地表达亚单位，更优选功能性味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)，那么可将其进一步分级分离直至鉴定具有该特征的细胞系或细胞系的组。这使得更容易维持大量细胞系而无需分开地维持每一个细胞系。因此，可从细胞或细胞系的集合物富集阳性细胞。对于所需性质或活性，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的富集的混合细胞是阳性的。

在另外的方面中，本发明提供了用于产生本发明的细胞和细胞系的方法。在一个实施方案中，方法包括下列步骤：

a)提供多个表达编码一种或多种味觉受体亚单位例如鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位和任选的G蛋白的mRNA的细胞；

b)将细胞单个地分散至单个培养器皿，从而提供多个分散的细胞培养物；

c)利用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于对于每一个分离的细胞培养物条件而言基本相同，在该培养过程中将每一个分离的细胞培养物中细胞的数目标准化，并且其中分离的培养物按照相同的时间表进行传代；

d)测定分离的细胞培养物的味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)的至少一种所需特征至少2次；和

e)鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

根据该方法，细胞在所需培养条件组下进行培养。条件可以是任何所需条件。本领域普通技术人员应当了解在一组培养条件内包括何种参数。例如，培养条件包括但不限于：培养基(基础培养基(DMEM、MEM、RPMI、无血清、含血清、完全化学组分限定的、无动物衍生的组分)，单价和二价离子(钠、钾、钙、镁)浓度，加入的另外组分(氨基酸、抗生素、谷氨酰胺、葡萄糖或其它碳源、HEPES、通道阻断剂、其它靶的调节剂、维生素、微量元素、重金属、辅因子、生长因子、抗凋亡试剂)，新鲜或条件培养基，具有HEPES，pH，特定营养素耗尽或限制性的(氨基酸、碳源))，分裂/传代前允许细胞达到的汇合水平.细胞的饲养层，或γ辐射的细胞，CO₂，三气系统(氧、氮、二氧化碳)，湿度，温度，静止或利用振荡器等，这将是本领域普通技术人员众所周知的。

在某些实施方案中，测量细胞汇合，并且根据汇合值计算生长速率。在某些实施方案中，在测量细胞汇合前使细胞分散并且去除凝块用于改善的准确度。用于使细胞单分散的方法是众所周知的，并且可以例如通过向待测量的培养物中加入分散剂来实现。分散剂是众所周知的且容易获得的，并且包括但不限于，酶促分散剂例如胰蛋白酶，或基于EDTA的分散剂。使用用于这个用途的商购可得的软件例如HAMILTON VECTOR，根据汇合日期可以计算生长速率。例如使用自动化微板读取器的自动化汇合测量是特别有用的。测量汇合的平板读取器是商购可得的，并且包括但不限于，CLONE SELECTIMAGER(Genetix)。一般地，在计算生长速率前进行细胞汇合的至少2次测量。用于测定生长速率的汇合值的数目可以是方便的或适合于培养的任何数目。例如，汇合可以经过例如1周、2周、3周或任何时间段且以任何所需频率测量多次。

当生长速率是已知的时，根据该方法，通过生长速率的相似性将多个分离的细胞培养物分成组。通过将培养物分组到生长速率框内，可以一起处理组中的培养物，从而提供减少培养物之间的变异的另一个标准化水平。例如，框中的培养物可以同时进行传代，同时用所需试剂进行处理等等。此外，功能测定结果一般依赖干测定孔中的细胞密度。单个克隆的真实比较仅通过使其涂铺且以相同密度进行测定来完成。分组成特定生长速率同期组群使得克隆能够以特定密度涂铺，这允许它们以高通量形式在功能上进行表征。

每个组中的生长速率范围可以是任何方便的范围。选择允许细胞同时被传代且避免细胞数目的频繁重新标准化的生长速率范围是特别有利的。生长速率组可以包括非常窄的范围以用于紧密分组，例如，在彼此1小时内的平均倍增时间。但根据该方法，范围可以彼此多达2小时、多达3小时、多达4小时、多达5小时或多达10小时或甚至更广泛的范围。当框中的生长速率不相同，从而使得某些培养物中的细胞数目增加得比其它的更快时，出现关于重新标准化的需要。为了维持用于框中的所有培养物的基本等同的条件，必须定期取出细胞以重新标准化跨越框的数目。生长速率越不等，就需要越频繁地重新标准化。

在步骤d)中，细胞和细胞系可以依据任何生理特性进行测试且选择，所述生理特性包括但不限于：由基因组编码的细胞过程的改变；由基因组调节的细胞过程的改变；染色体活性模式的改变；染色体沉默模式的改变；基因沉默模式的改变；基因激活模式或效率的改变；基因表达模式或效率的改变；RNA表达模式或效率的改变；RNAi表达模式或效率的改变；RNA加工模式或效率的改变；RNA转运模式或效率的改变；蛋白质翻译模式或效率的改变；蛋白质折叠模式或效率的改变；蛋白质装配模式或效率的改变；蛋白质修饰模式或效率的改变；蛋白质转运模式或效率的改变；使膜蛋白质转运至细胞表面的模式或效率的改变；生长速率的改变；细胞大小的改变；细胞形状的改变；细胞形态的改变；RNA含量％的改变；蛋白质含量％的改变；含水量％的改变；脂质含量％的改变；核糖体含量的改变；线粒体含量的改变；ER质量的改变；质膜表面积的改变；细胞体积的改变；质膜的脂质组成的改变；核被膜的脂质组成的改变；质膜的蛋白质组成的改变；核被膜的蛋白质组成的改变；分泌囊泡数目的改变；溶酶体数目的改变；空泡数目的改变；细胞关于下述的能力或潜力的改变：蛋白质生产，蛋白质分泌.蛋白质折叠，蛋白质装配，蛋白质修饰，蛋白质的酶促修饰，蛋白质糖基化，蛋白质磷酸化，蛋白质去磷酸化，代谢产物生物合成，脂质生物合成，DNA合成，RNA合成，蛋白质合成，营养素吸收，细胞生长，有丝分裂，减数分裂，细胞分裂，去分化，转化成干细胞，转化成多潜能细胞，转化成全能细胞，转化成任何器官(即，肝、肺、皮肤、肌肉、胰腺、脑、睾丸、卵巢、血液、免疫系统、神经系统、骨、心血管系统、中枢神经系统、胃肠道、胃、甲状腺、舌、胆囊、肾、鼻、眼、趾甲、毛发、味蕾)的干细胞类型，转化成分化的任何细胞类型(即，肌肉、心肌、神经元、皮肤、胰腺、血液、免疫、红血细胞、白血细胞、杀伤T细胞、肠内分泌细胞、味觉、分泌细胞、肾、上皮细胞、内皮细胞，还包括可以用于引入核酸序列的已列举的任何动物或人细胞类型)，摄取DNA，摄取小分子，摄取荧光探针，摄取RNA，与固体表面附着，适应无血清条件，适应无血清悬浮条件，适应按比例增加的细胞培养，用于大规模细胞培养的用途，用于在药物开发中使用，用于在高通量筛选中使用，用于在基于功能细胞的测定中使用，用于在膜电位测定中使用，用于在钙流测定中使用，用于在G蛋白受体测定中使用.用于在基于报告细胞的测定中使用，用于在ELISA研究中使用，用于在体外测定中使用，用于在体内应用中使用，用于在二次测试中使用，用于在化合物测试中使用，用于在结合测定中使用，用于在淘选测定中使用，用于在抗体淘选测定中使用，用于在成像测定中使用，用于在显微成像测定中使用，用于在多孔平板中使用，用于适应自动化细胞培养，用于适应小型化自动化细胞培养，用于适应大规模自动化细胞培养，用于适应在多孔平板(6、12、24、48、96、384、1536或更高密度)中的细胞培养，用于在细胞芯片中使用，用于在载玻片上使用，用于在玻璃载玻片上使用，用于在载玻片或玻璃载玻片上的微阵列，用于免疫荧光研究，用于在蛋白质纯化中使用，用于在生物制品生产中使用，用于在工业酶生产中使用，用于在用于研究的试剂生产中使用，用于在疫苗开发中使用，用于在细胞疗法中使用，用于在植入动物或人内使用，用于在由细胞分泌的因子分离中使用，用于cDNA文库的制备，用于RNA的纯化，用于DNA的纯化，用于经由病原体、病毒或其它因子感染，用于对经由病原体、病毒或其它因子感染的抵抗力，用于对药物的抵抗力，用于在自动化小型化细胞培养条仵下维持的适合性，用于在蛋白质生产中用于表征，包括：蛋白质晶体学、疫苗开发、免疫系统的刺激、抗体生产或抗体的产生或测试。本领域普通技术人员将容易认识到用于上文列出的特性中的任何一种的合适测试。在具体的实施方案中，一个或多个此类物理性质可以是一致的与味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)相关的物理性质并且可用于监控功能性味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)的表达。

可用于表征本发明的细胞和细胞系和/或本发明的相匹配实验对象组的测试包括但不限于：氨基酸分析、DNA测序、蛋白质测序、NMR、蛋白质运输的测试、核质运输的测试、蛋白质亚细胞定位的测试、核酸的亚细胞定位的测试、显微镜分析、亚显微分析、荧光显微镜术、电子显微镜术、共焦显微镜术、激光消融技术、细胞计数和透析。本领域普通技术人员理解使用任何上列测试的方法。

任何自动化细胞培养系统可用于本发明的方法。许多自动化系统是商购可得的并且为本领域普通技术人员所众所周知的。在某些实施方案中，自动化系统是机器人系统。优选，系统包括独立移动的通道、多通道头(例如96-尖端头)和夹子或择优挑选臂以及HEPA过滤装置以在操作过程中保持无菌。移液器中的通道数目应适合于培养形式。方便的移液器具有例如96或384个通道。此类系统是已知且商购可得的。例如，MICROLAB STAR^TM仪器(Hamilton)可以用于本发明的方法中。自动化系统应能够执行多种所需细胞培养任务。此类任务将是本领域普通技术人员已知的。它们包括但不限于：去除培养基、替换培养基、添加试剂、细胞洗涤、去除洗涤溶液、加入分散剂、从培养器皿中取出细胞、将细胞加入培养器皿中等等。

本发明的细胞或细胞泵的产生可以包括任何数目的分离的细胞培养物。然而，由该方法提供的优点随着细胞数目的增加而增加。不存在可以在该方法中利用的细胞或分离的细胞培养物的数目的理论上限。根据本发明，分离的细胞培养物的数目可以是2个或更多个，但更有利地是至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个分离的细胞培养物，例如至少12个、至少15个、至少20个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少48个、至少50个、至少75个、至少96个、至少100个、至少200个、至少300个至少384个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个、至少500,000个或更多个。

本发明的细胞和细胞系与由常规方法产生的细胞和细胞系相比较在表达和表达水平(RNA或蛋白质)的背景中具有增强的稳定性。为了鉴定具有此为稳定的表达特征的细胞和细胞系，经过时程测量细胞或细胞系的各味觉受体例如鲜味受体或甜味受体亚单位(和任选的G蛋白)的表达，然后比较所述表达水平。稳定的细胞系在整个时程中将持续表达(RNA或蛋白质)甜味受体T1R2和T1R3亚单位或鲜味受体T1R1和T1R3亚单位(和任选的G蛋白)。在本发明的一些方面中，时程可持续至少1周、2周、3周、4周、5周、6周等，或至少1个月或至少2、3、4、5、6、7、8或9个月或其间的任何时间长度。

还可以例如通过qRT-PCR和单终点RT-PCR表征分离的细胞和细胞系以确定被表达(RNA)的各味觉受体亚单位例如鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位(或G蛋白)的绝对量和相对量。优选，两个亚单位的扩增水平在本发明的细胞和细胞系中基本相同。

在其它实施方案中，随着时间推移测定功能性鲜味受体或甜味受体(和G蛋白)的表达。在此类实施方案中，通过比较功能测定经过时程的结果来测量稳定表达。基于功能测定的细胞和细胞系稳定性的测定提供了鉴定细胞和细胞系的益处，所述细胞和细胞系不仅稳定地表达鲜味受体的T1R1和T1R3亚单位或甜味受体的T1R2和T1R3亚单位(RNA和任选的G蛋白)，而且还稳定地产生且适当加工(例如，翻译后修饰、亚单位装配和细胞内定位)亚单位(和G蛋白)以产生功能性鲜味受体或甜味受体。

本发明的细胞和细胞系具有提供具有高重现性的测定(如由其Z′因子证明)的进一步有利性质。参见Zhang JH，Chung TD，OldenburgKR，“A Simple StatisticalParameter for Use in Evaluationand Validationof High Throughput ScreeningAssays.”J.Biomol.Screen.1999；4(2)：67-73，所述参考文献通过引用整体并入本文。Z’值涉及细胞或细胞系的品质，因为它反映细胞或细胞系将一致地响应调节剂的程度。Z’是考虑到跨越多孔平板对参考化合物的功能应答的信噪比范围和信号变异性(即，从孔到孔之间)的统计计算。使用得自具有阳性对照的多个孔和具有阴性对照的多个孔的数据计算Z’。根据下面方程式将其组合的标准差的比乘以3至差异因子，用1减去其平均值以得到Z′因子：

如果因子为1.0，这将指示具有理论最大Z′的理想测定，无变异性和无限的动态范围。如本文所使用的，“高Z′”指具有至少0.6、至少0.7、至少0.75或至少0.8、或0.6至1.0之间的任何小数的Z′因子。在复杂靶标例如味觉受体(例如鲜味受体或甜味受体)的情况下，高Z′意指至少0.4或更大的Z′。接近于0的得分是不希望的，因为它指示在阳性和阴性对照之间存在重叠。在工业中，对于简单的基于细胞的测定，多达0.3的Z′得分被视为边缘得分，在0.3至0.5之间的Z′得分被视为可接受的，并且超过0.5的Z′得分被视为极佳的。无细胞或生物化学测定可以接近关于基于细胞的系统的得分，因为更高的Z′得分而趋于更低，但基于Z′细胞的系统是复杂的。

如本领域普通技术人员应认识到的，使用表达甚至单链蛋白质的常规细胞的基于细胞的测定通常也未达到高于0.5至0.6的Z′。即使在本领域中得到报告，由于其添加的复杂性，具有多亚单位蛋白质的改造表达(来自所引入的编码序列或基因激活)的细胞也将更低。此类细胞对于在测定中的使用将是不可靠的，因为结果将不是可重现性的。另一方面，本发明的细胞和细胞系具有更高的Z′值，并且有利地在测定中产生一致的结果。事实上，表达味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的本发明的细胞和细胞系提供用于高通量筛选(HTS)相容测定的基础，因为它们一般具有高于常规产生的细胞的Z′值。在本发明的某些方面，细胞和细胞系导致至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z′。对于表达味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的细胞，甚至至少0.3-0.4的Z′值也是有利的，因为味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)是多基因靶标。在本发明的其它方面，即使在细胞维持多次传代后，例如，在5-20代之间，包括在5和20之间的任何整数，本发明的细胞和细胞系也导致至少0.7、至少0.75或至少0.8的Z′。在本发明的某些方面，在维持1、2、3、4或5周或2、3、4、5、6、7、8或9个月的细胞和细胞系中，包括其间的任何时间段，细胞和细胞系导致至少0.7、至少0.75或至少0.8的Z′。

本发明的细胞和细胞系的味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的其它有利性质是它们在药物或其它不存在选择压力的情况下稳定地表达甜味受体的T1R2和T1R3亚单位或鲜味受体的T1R1和T1R3亚单位。因此在优选实施方案中，在培养中维持本发明的细胞和细胞系而无需任何选择压力。在其它实施方案中，在无任何药物或抗生素的情况下维持细胞和细胞系。如本文中所使用的，细胞维持是指在如上所述依据它们的甜味受体亚单位或鲜味受体亚单位(和任选的G蛋白)表达选择它们后培养细胞。维持不是指在细胞分选之前在选择压力(例如，抗生素)下生长培养细胞的任选步骤，其中引入细胞的标记允许在混合群体中富集稳定的转染子。

本发明的细胞和细胞系的无药物和无选择压力的细胞维持提供了许多优点。例如，抗药性细胞可以不以充足的水平表达共转染的目的转基因，因为选择依赖于已摄取抗药基因并且含有或不含转基因的细胞的存活。此外，选择药物和其它选择压力因素通常是致诱变的或以其它方式干扰细胞的生理学，导致在基于细胞的测定中的偏差结果。例如，选择药物可降低对细胞凋亡的易感性(Robinson等人，Biochemistry，36(37)：11169-11178(1997))、增加DNA修复和药物代谢(Deffie等人，Cancer Res.48(13)：3595-3602(1988))、增加细胞pH(Thiebaut等人，J Histochem Cytochem.38(5)：685-690(1990)；Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993)；Simon等人，Proc NatlAcad Sci USA.91(3)：1128-1132(1994))、降低溶酶体和内涵体的pH(Schindler等人，Biochemistry.35(9)：2811-2817(1996)；Altan等人，J Exp Med.187(10)：1583-1598(1998))、减少质膜电位(Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993))、增加质膜对氯化物的电导(Gill等人，Cell.71(1)：23-32(1992))和ATP(Abraham等人，Proc NatlAcad Sci USA.90(1)：312-316(1993))以及增加小囊泡运输的速率(Altan等人，Proc Natl Acad Sci USA.96(8)：4432-4437(1999))。因此，本发明的细胞和细胞系允许不具有由选择药物引起的假象的筛选测定。在某些优选实施方案中，在细胞分选之前或之后，本发明的细胞和细胞系不与选择压力因素例如抗生素一起培养，使得即使当未从富集的细胞群体开始时，也通过分选来分离具有所需性质的细胞和细胞系。

在另一个方面，本发明提供了使用本发明的细胞和细胞系的方法。本发明的细胞和细胞系可用于需要功能性味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)任何应用。细胞和细胞系可用于例如体外基于细胞的测定或体内测定，在所述体内测定中，将细胞植入动物(例如，非人哺乳动物)以例如筛选味觉受体调节剂(例如，鲜味受体调节剂或甜味受体调节剂)；产生蛋白质以用于晶体学和结合研究；以及研究化合物的选择性和剂量、受体/化合物结合动力学和稳定性以及受体表达对细胞生理学(例如，电生理、蛋白质运输、蛋白质折叠和蛋白质调节)的效应。本发明的细胞和细胞系还可用于敲低研究以检查特定味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)的作用。

表达亚单位的多种组合的细胞和细胞系可分开地或一起用于鉴定味觉受体调节剂(例如，鲜味受体调节剂或甜味受体调节剂)。基于它们对多种调节剂的应答，通过使将味觉受体的体内形式的身份与味觉受体的已知形式的身份相关，可将细胞和细胞系用于鉴定味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的不同形式在不同味觉受体病理状态中的作用。这允许选择疾病或组织特异性味觉受体调节剂(例如，鲜味受体调节剂或甜味受体调节剂)用于此类味觉受体相关病理的高度靶向治疗。

为了鉴定味觉受体调节剂(例如，鲜味受体调节剂或甜味受体调节剂)，可将本发明的细胞或细胞系在其中预期味觉受体(例如，鲜味受体调节剂或甜味受体调节剂)具有功能的条件下与测试化合物接触，然后检测与适当的对照例如不与所述测试化合物接触的细胞相比较，味觉受体活性(例如，鲜味受体活性或甜味受体活性)的统计学上显著的变化(例如，p＜0.05)。还可以使用采用已知激动剂或拮抗剂和/或表达味觉受体亚单位(例如，鲜味受体亚单位或甜味受体亚单位)(和任选的G蛋白)的不同组合的细胞的阳性和/或阴性对照。在某些实施方案中，待检测和/或测量的味觉受体活性(例如，鲜味受体活性或甜味受体活性)是作为味觉受体激活(例如，鲜味受体激活或甜味受体激活)后下游信号传导事件的结果来自内质网的钙释放。本领域普通技术人员应当理解各种测定参数例如信噪比可以得到最佳化。

在某些实施方案中，可将本发明的一个或多个细胞或细胞系与多种测试化合物例如测试化合物的文库接触。可使用本发明的细胞系筛选此类测试化合物文库以鉴定味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的一个或多个调节剂。测试化合物可以是化学部分包括小分子、多肽、肽、肽模拟物、抗体或其抗原结合部分。在抗体的情况下，它们可以是非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。抗体可以是包含全互补的重链和轻链的完整抗体或任何抗体的抗原结合部分，包括抗体片段(例如Fab和Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fv、dAb等)、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、重链或轻链可变区的全部或抗原结合部分。

在某些实施方案中，在与测试化合物接触之前，可通过用例如酶预处理来修饰本发明的细胞或细胞系，所述酶包括哺乳动物或其它动物的酶、植物的酶、细菌的酶、蛋白质修饰酶和脂质修饰酶。此类酶可包括例如激酶类、蛋白酶类、磷酸酶类、糖苷酶类、氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、连接酶类、细菌蛋白酶类、来自胃肠的蛋白酶类、来自GI道的蛋白酶类、唾液、口腔中的蛋白酶类、来自lysol细胞/细菌的蛋白酶等。可选择地，可将细胞和细胞系首先与测试化合物接触，然后进行酶处理以鉴定改变通过处理产生的鲜味受体或甜味受体的修饰的化合物。

在某些实施方案中，在基于细胞的、功能性的高通量筛选(HTS)中，例如使用96孔、384孔、1536孔或更高密度的版式，测试大化合物集合的味觉受体调节活性(例如，鲜味受体调节活性或甜味受体调节活性)。在某些实施方案中，使用超过一种本发明的细胞或细胞系，可以筛选测试化合物或多种测试化合物，包括测试化合物文库。在表达人甜味受体的本发明的细胞或细胞系的情况下，可将细胞或细胞系与测试化合物接触来鉴定化合物，所述化合物调节甜味受体活性(增强或降低)以用于治疗疾病或状况，所述疾病或状况特征在于不希望的甜味受体活性或减少的所需甜味受体活性或不存在所需甜味受体活性。此外，根据本发明的方法，本发明的细胞或细胞系可用于鉴定增强或抑制甜味的化合物或物质以用于可摄取的物质。

在表达人鲜味受体的本发明的细胞或细胞系的情况下，可将细胞或细胞系与测试化合物接触来鉴定调节化合物，所述化合物调节鲜味受体活性(增强或降低)以用于治疗疾病或状况，所述疾病或状况的特征在于不希望的鲜味受体活性或减少的所需鲜味受体活性或不存在所需鲜味受体活性。此外，根据本发明的方法，本发明的细胞或细胞系可用于鉴定增强或抑制鲜味的化合物或物质以用于可摄取的物质。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系具有增强的对甜味受体的调节剂的敏感性。例如，细胞和细胞系响应所有已知种类的甜味化合物例如天然甜剂(例如，葡萄糖、果糖和蔗糖)、高强度甜味剂(例如，(例如，steviva、莱鲍迪苷、罗汉果苷)以及人造甜味剂(例如，阿斯巴甜、糖精和安赛蜜(acesulfamek))。参见例如，图23和24。本发明的细胞和细胞系也响应调节剂并且以对于甜味受体的生理范围EC₅₀或IC₅₀值激活G蛋白。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系具有增强的对鲜味受体的调节剂的敏感性。例如，本发明的细胞和细胞系响应所有已知种类的鲜味化合物例如MSG和环己基氨基磺酸钠。参见例如，图9-12。本发明的细胞和细胞系也响应调节剂并且以对于鲜味受体的生理范围EC₅₀或IC₅₀值激活G蛋白。

如本文中所使用的，EC₅₀是指诱导细胞或细胞系中半最大激活反应所需的化合物或物质的浓度。如本文中所使用的，IC₅₀是指诱导细胞或细胞系中半最大抑制反应所需的化合物或物质的浓度。可使用本领域内众所周知的技术测定EC₅₀和IC₅₀值，例如使化合物或物质的浓度与表达鲜味受体的细胞系或表达甜味受体的细胞系的反应相关的剂量-反应曲线。

本发明的细胞和细胞系的味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的其它有利性质是使用此类细胞和细胞系在初步筛选中鉴定的调节剂在次级功能测定例如吸吐法或品尝试验和感觉评估中具有功能。如本领域普通技术人员应认识到的，在起始筛选测定中鉴定的化合物一般必须是例如通过组合化学、药物化学或合成化学进行修饰的，用于其衍生物或类似物在次级功能测定中有功能。然而，由于本发明的表达本味觉受体(例如，鲜味受体或甜味受体)的细胞和细胞系的高生理学相关性，许多使用此类细胞和细胞系鉴定的化合物无需进一步修饰即是有功能的。

在某些方面中，本文中提供了利用存在于细胞中的天然存在的高度遗传多样性，有效地鉴定、选择和富集具有赋予所需性质(例如，功能性味觉受体例如甜味受体、鲜味受体或苦味受体的稳定和/或高度表达)的所需基因表达谱的细胞的方法。本方法可比常规方法更快且更有效地从遗传传上多样的细胞的集合鉴定、选择和富集具有改善的性质的细胞。在具体的实施方案中，未对细胞进行遗传修饰。在其它具体的实施方案中，本方法允许产生具有改善的性质(例如，功能性味觉受体例如甜味受体、鲜味受体或苦味受体的更稳定和/或更高的表达)的细胞的新型均一群体。

在某些实施方案中，本文中描述的方法包括选择天然存在的具有一种或多种所需性质(例如，功能性味觉受体例如甜味受体、鲜味受体或苦味受体的稳定和/或高度的表达)的细胞。在具体的实施方案中，本文中描述的方法包括选择在一个或多个味觉受体基因(例如，甜味受体基因或鲜味受体基因)中具有天然存在的变体或突变的细胞。

在具体的实施方案中，本文中描述的方法包括选择在基因的启动子区域或基因的非编码区域(例如，内含子、5′非翻译区和/或3′非翻译区)中具有天然存在变体或突变的细胞。基因的启动子区域或基因的非编码区中的变体或突变可导致基因产物的更高和/或更稳定的表达。在具体的实施方案中，已例如通过DNA的甲基化或乙酰化修饰了基因的启动子区域或基因的非编码区中的变体或突变。在特定的实施方案中，细胞包含影响对一个或多个目的基因的染色质重塑的表观遗传学修饰。表观遗传学修饰的非限定性实例包括但不限于乙酰化、甲基化、泛素化(ubiquitylation)、磷酸化和类泛素化(sumoylation)。

在某些其它实施方案中，本方法包括经历预处理的细胞。可将此类预处理暴露于阳光或紫外(UV)光、诱变剂例如甲烷磺酸乙酯(EMS)和化学试剂。在具体的实施方案中，此类预处理可包括对不希望的生长条件例如低氧或低营养物条件或有毒条件的暴露。

本文中描述的方法提供了鉴定和/或选择分离的细胞(例如，真核细胞)，所述分离的细胞表达一个或多个目的基因(例如，味觉受体亚单位基因，例如甜味受体亚单位基因、鲜味受体亚单位基因或苦味受体亚单位基因)。在某些实施方案中，作为遗传变异性的结果，目的基因以比其它细胞更高的水平表达。在特定的实施方案中，此处描述的方法包括(a)将一种或多种能够检测目的RNA(例如，能够与目的RNA的靶序列杂交的)的信号传导探针引入细胞(例如，真核细胞)；和(b)确定细胞(例如，真核细胞)是否包含目的RNA。此类方法还可包括定量目的RNA的水平。在具体的实施方案中，本文中描述的用于鉴定具有所需RNA表达谱的细胞的方法，其中所述方法包括：(a)将多个各自能够检测目的RNA的信号传导探针引入真核细胞(例如，真核细胞)；和(b)定量通过多个信号传导探针检测的RNA水平。可通过与参照群体相比较来测定所需基因表达谱。

在特定的实施方案中，本文中描述的方法包括(a)将一种或多种能够检测味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)的RNA的信号传导探针引入细胞(例如，真核细胞)；和(b)确定所述细胞(例如，真核细胞)是否包含味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)的RNA。此类方法还可包括定量味觉受体(例如，甜味受体或鲜味受体)的RNA的水平。在具体的实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定具有所需RNA表达谱的细胞，其中所述方法包括：(a)将多个各自能够检测多个目的RNA的信号传导探针引入真核细胞(例如，真核细胞)；和(b)定量通过多个信号传导探针检测的RNA水平。可通过与参照群体相比较来测定所需基因表达谱。在具体的实施方案中，多个目的RNA可包括下列RNA的任何组合：T1R1的RNA、T1R2的RNA、T1R3的RNA、G蛋白的RNA和与味觉受体相关的基因的RNA。在某些实施方案中，多个目的RNA包括T1R1的RNA和T1R3的RNA(和任选的G蛋白的RNA)。在某些实施方案中，多个目的RNA包括T1R2的RNA和T1R3的RNA(和任选的G蛋白的RNA)。

在具体的实施方案中，这样的方法还包括分别将定量的细胞RNA水平与参照细胞中的RNA水平相比较的步骤。在具体的实施方案中，多个信号传导探针包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、500、600、700、800、900或至少1000个信号传导探针。在某些实施方案中，翻译目的RNA。在其它实施方案中，不翻译目的RNA。在具体的实施方案中，目的RNA由味觉受体亚单位基因(例如，甜味受体亚单位基因、鲜味受体亚单位基因或苦味受体亚单位基因)编码。在具体的实施方案中，分离的细胞(例如，真核细胞)表达一种或多种重组目的RNA。

在具体的实施方案中，通过本文中描述的方法鉴定和/或选择的真核细胞未进行基因改造(例如，不重组地表达一个或多个转基因)。在其它实施方案中，通过本文中描述的方法鉴定和/或选择的真核细胞已进行了基因改造(例如，重组地表达一个或多个转基因)。在具体的实施方案中，此类细胞是体细胞或分化细胞。

在其它实施方案中，细胞包含所需基因表达谱。在某些实施方案中，通过基因工程或通过增加遗传变异性来获得所需基因表达谱。在具体的实施方案中，可基于与参照群体的基因表达谱的比较来测定所需基因表达谱。

在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以比平均异种细胞群体更高的水平表达目的RNA的细胞。在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以比平均异种细胞群体(例如，未分选的细胞系，例如，未分选的293T细胞系群体)更高的水平表达目的RNA(例如，甜味受体或鲜味受体的RNA)的细胞。在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择细胞，所述细胞以比平均异质性细胞群体(例如，未分选的细胞系，例如，未分选的293T细胞系群体)高至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的水平表达目的RNA(例如，甜味受体或鲜味受体的RNA)。在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择细胞，所述细胞以比平均异种细胞群体(例如，未分选的细胞系，例如，未分选的293T细胞系群体)高至少1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的水平表达目的RNA(例如，甜味受体或鲜味受体的RNA)。

在具体的实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以比平均异种细胞群体更低的水平表达目的RNA的细胞。示例性异种细胞群体可以是不同来源的混合细胞类型的细胞群体、遗传上异种的一个细胞类型的细胞的细胞群体或使用本文中描述的方法从其获得分离的细胞的一个特定细胞系的细胞群体。

在特定的实施方案中，使用本文中描述的方法分离的细胞是来自细胞系的细胞克隆。在某些实施方案中，使用本文中描述的方法分离的细胞是原代细胞。在某些实施方案中，使用本文中描述的方法分离的细胞是转化细胞。

在某些实施方案中，细胞不是人细胞。在具体的实施方案中，细胞是源自小鼠、大鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、马、鸡、蛙、蠕虫、昆虫(例如，苍蝇)、鱼、贝壳类或牛的细胞。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或真核细胞。在其它实施方案中，细胞是人细胞。在某些实施方案中，细胞是原代细胞。在其它实施方案中，细胞是转化细胞或细胞系的细胞克隆。

在具体的方面中，本文中提供了用于分离内源性表达甜味受体T1R2亚单位和/或甜味受体T1R3亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a)提供一群细胞；

b)将检测T1R2的表达的信号传导探针或分子信标引入细胞和/或将检测T1R3的表达的分子信标引入细胞；和

c)分离表达甜味受体T1R2亚单位和/或甜味受体T1R3亚单位的细胞。

在另一个具体的方面中，本文中提供了用于分离内源性表达甜味受体T1R2亚单位和甜味受体T1R3亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a)提供一群细胞；

b)将检测T1R2的表达的分子信标引入细胞和/或将检测T1R3的表达的分子信标引入细胞；和

在此类方法的具体实施方案中，已知细胞的群体不表达T1R2或T1R3。在此类方法的其它具体的实施方案中，分离的细胞中T1R2或T1R3的任何表达水平为细胞群体的平均细胞中的至少10倍、50倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍、2500倍、5000倍、7500倍、10000倍、50000倍或至少100000倍。可使用本领域普通技术人员已知的方法容易地测定味觉受体亚单位例如T1R2或T1R3的表达水平。

在具体的方面中，本文中提供了用于分离内源性表达鲜味受体T1R1亚单位和/或鲜味受体T1R3亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a)提供一群细胞；

b)将检测T1R1的表达的信号传导探针或分子信标引入细胞和/或将检测T1R3的表达的分子信标引入细胞；和

c)分离表达鲜味受体T1R1亚单位和/或鲜味受体T1R3亚单位的细胞。

在另一个具体的方面中，本文中提供了用于分离内源性表达鲜味受体T1R1亚单位和鲜味受体T1R3亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a)提供一群细胞；

b)将检测T1R1的表达的分子信标引入细胞和/或将检测T1R3的表达的分子信标引入细胞；和

在此类方法的具体实施方案中，已知细胞的群体不表达T1R1或T1R3。在此类方法的其它具体的实施方案中，分离的细胞中T1R1或T1R3的任何表达水平为细胞群体的平均细胞中的至少10倍、50倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍、2500倍、5000倍、7500倍、10000倍、50000倍或至少100000倍。可使用本领域普通技术人员已知的方法容易地测定味觉受体亚单位例如T1R1或T1R3的表达水平。

用于测定蛋白质表达水平的方法的非限定性实例包括免疫印迹(Western印迹)、流式细胞术或ELISA。用于测定RNA表达水平的方法的非限定性实例包括Northern印迹、RT-PCR和实时定量PCR。可测定通常一群细胞的此类蛋白质或RNA表达水平以测定群体的平均表达水平。

在此类方法的其它具体实施方案中，已在所述分离步骤之前增加了细胞群体的遗传变异性。在具体的实施方案中，本文中提供了按照这样的方法产生的分离的细胞。

苦味受体

本申请涉及已进行以表达一种或多种苦味受体的新型细胞和细胞系。在某些实施方案中，本发明的新型细胞或细胞系表达一种或多种功能性苦味受体。在其它方面中，本发明提供了制备和使用新型细胞和细胞系的方法。

根据本发明的一个实施方案，用编码天然苦味受体的核酸转染新型细胞和细胞系。在其它实施方案中，用编码天然苦味受体的等位基因变体(即，多态性)或突变的苦味受体的核酸转染新型细胞和细胞系。本发明的新型细胞系稳定地表达所引入的苦味受体.在另一个实施方案中，新型细胞和细胞系已通过基因激活使苦味受体被激活以进行表达。

在具体的实施方案中，新型细胞和细胞系作为工程基因激活(即内源基因的表达的激活)的结果表达内源性苦味受体，其中所述激活在无适当处理的细胞中不天然存在。工程基因激活可打开内源性苦味受体的表达，例如，在内源性苦味受体不在无适当处理的细胞系中表达的情况下。可选择地，工程基因激活可导致增加的内源性苦味受体的表达水平，例如，在细胞系中内源基因的表达水平在无适当处理时为极不希望的低，例如不足以在细胞系中进行苦味受体的功能测定的情况下。可选择地，工程基因激活可用于过表达内源性苦味受体，例如以用于从细胞系分离内源性苦味受体。工程基因激活可通过本领域内技术人员已知的许多方法实现。例如，可通过将表达转录因子或反式激活因子的核酸引入细胞处于组成型或诱导型启动子的控制下来过表达或诱导表达基因的转录的一个或多个转录因子或反式激活因子。如果已知内源基因处于诱导型启动子的控制之下，那么可通过将细胞与基因的已知诱导剂接触来诱导表达。此外，可将编码内源基因本身的核酸引入细胞以获得增加了基因表达的水平(因基因组中增加的拷贝数而导致的)。此外，可使用本领域内众所周知的技术例如RNAi敲低或甚至敲除由细胞表达的内源基因表达的某些已知的抑制剂，从而增加内源基因的表达。

可将包含苦味受体、其突变形式或其天然存在的等位基因变体的本发明的细胞和细胞系用于鉴定苦味受体功能的调节剂，包括特异于特定苦味受体的突变形式或天然存在的等位基因变体的调节剂。从而可将细胞和细胞系用于获得关于苦味受体的单个天然或突变形式或天然存在的等位基因变体的性质、活性和作用的信息，以及鉴定具有对于特定天然或突变形式或天然存在的等位基因变体或对于天然或突变形式或天然存在的等位基因变体的亚组的活性的苦味受体调节剂。此类调节剂用作靶向疾病状态或组织中差异修饰的苦味受体形式的治疗剂。因为体内苦味受体的多态性例如可促成不希望的活性或疾病状态，因此本发明的细胞和细胞系也可用于筛选用于治疗用途(其中可能期望突变形式或天然存在的等位基因变体的反应的改变)的调节剂。细胞和细胞系还用于鉴定只对苦味受体的天然或突变的形式或天然存在的等位基因变体的亚组具有活性的调节剂。

本发明也鉴定和解决产生表达稳定的苦味受体的细胞和细胞系中的困难。如本文中所公开的，我们已发现标记的苦味受体的表达导致苦味受体激动剂的不正确分配。已有人认为特定的标签、信号序列和/或伴侣分子是苦味受体至细胞表面的表达和/或转运所必需的(Reichling、Meyerhof和Behrens，J.Neurochem.106：1138-1148，2008)。这产生了两难困境并且可导致标记的受体的生理上无关的调节剂的鉴定。因此，本发明的生理学相关的细胞系也可促进孤儿苦味受体的配体的鉴定和不同受体-配体相互作用的特异性的分析。

在第一方面中，本发明提供了稳定地表达一种或多种苦味受体的细胞和细胞系。在某些实施方案中，表达的苦味受体在被激动剂激活时增加细胞内游离钙。在某些实施方案中，增强剂、激动剂或激活剂可以是小分子、化学部分、多肽、抗体或食物提取物。在其它实施方案中，表达的苦味受体在被拮抗剂抑制时减少细胞内游离钙。在某些实施方案中，抑制剂、拮抗剂或阻断剂可以是小分子、化学部分、多肽、抗体或食物提取物。增强剂、激动剂、激活剂、抑制剂、拮抗剂或阻断剂可作用于所有或特定亚组的苦味受体。在其它实施方案中，本发明的表达苦味受体的细胞和细胞系与由常规方法制备的细胞和细胞系相比较具有增强的性质。例如，表达苦味受体的细胞和细胞系具有增强的表达稳定性(即使当在无选择性抗生素存在的情况下培养时)和导致高Z’值。在其它方面中，本发明提供了制备和使用表达苦味受体的细胞和细胞系的方法。

在各种实施方案中，本发明的细胞或细胞系以一致的表达水平表达苦味受体至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200天或200天以上，其中一致表达是指这样的表达水平，所述表达水平：

经2至4天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％；经过5至15天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％或12％；经16至20天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％；经21至30天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；经30至40天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经41至45天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经45至50天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经50至55天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经50至55天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经55至75天的连续细胞培养，改变不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、35％或40％；经75至100天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经101至125天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经126至150天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过151至175天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过176至200天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经超过200天的连续细胞培养，改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。

根据本发明，由细胞或细胞系表达的苦味受体可来自任何哺乳动物，包括大鼠、小鼠、兔子、山羊、狗、牛、猪或灵长类动物。在优选实施方案中，苦味受体是人苦味受体。

在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系可包含：编码人TAS2R1的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)；编码人TAS2R3的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)；编码人TAS2R4的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)；编码人TAS2R5的核苷酸序列(SEQ ID NO：54)；编码人TAS2R7的核苷酸序列(SEQ ID NO：55)；编码人TAS2R8的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)；编码人TAS2R9的核苷酸序列(SEQ ID NO：57)；编码人TAS2R10的核苷酸序列(SEQ ID NO：58)、编码人TAS2R13的核苷酸序列(SEQID NO：59)、编码人TAS2R14的核苷酸序列(SEQ ID NO：60)、编码人TAS2R16的核苷酸序列(SEQ ID NO：61)、编码人TAS2R38的核苷酸序列(SEQ ID NO：62)、编码人TAS2R39的核苷酸序列(SEQ ID NO：63)、编码人TAS2R40的核苷酸序列(SEQ ID NO：64)、编码人TAS2R41的核苷酸序列(SEQ ID NO：65)、编码人TAS2R43的核苷酸序列(SEQ ID NO：66)、编码人TAS2R44的核苷酸序列(SEQ ID NO：67)、编码人TAS2R45的核苷酸序列(SEQ ID NO：68)、编码人TAS2R46的核苷酸序列(SEQ ID NO：69)、编码人TAS2R47的核苷酸序列(SEQ ID NO：70)、编码人TAS2R48的核苷酸序列(SEQ ID NO：71)、编码人TAS2R49的核苷酸序列(SEQ ID NO：72)、编码人TAS2R50的核苷酸序列(SEQ ID NO：73)、编码人TAS2R55的核苷酸序列(SEQ ID NO：74)；编码人TAS2R60的核苷酸序列(SEQ ID NO：75)；或其任何组合。

在某些实施方案中，本发明的细胞或细胞系可包含如下的多核苷酸序列：人TAS2R1(SEQ ID NO：77)；人TAS2R3(SEQ ID NO：78)；人TAS2R4(SEQ ID NO：79)；人TAS2R5(SEQ ID NO：80)；人TAS2R7(SEQ ID NO：81)；人TAS2R8(SEQ ID NO：82)；人TAS2R9(SEQ ID NO：83)；人TAS2R10(SEQ ID NO：84)；人TAS2R13(SEQ ID NO：85)；人TAS2R14(SEQ ID NO：86)；人TAS2R16(SEQ ID NO：87)；人TAS2R38(SEQ ID NO：88)；人TAS2R39(SEQ ID NO：89)；人TAS2R40(SEQ ID NO：90)；人TAS2R41(SEQ ID NO：91)；人TAS2R43(SEQ ID NO：92)；人TAS2R44(SEQ ID NO：93)；人TAS2R45(SEQ ID NO：94)；人TAS2R46(SEQ ID NO：95)；人TAS2R47(SEQ ID NO：96)；人TAS2R48(SEQ ID NO：97)；人TAS2R49(SEQ ID NO：98)；人TAS2R50(SEQ ID NO：99)；人TAS2R55(SEQ ID NO：100)；人TAS2R60(SEQ ID NO：101)；或其任何组合。

编码苦味受体的核酸可以是基因组DNA或cDNA。在某些实施方案中，与编码野生型苦味受体的核酸序列相比较，核酸包含一个或多个可以导致或可以不导致氨基酸置换的突变。在一些其它实施方案中，与在给定的群体中最频繁存在的编码特定苦味受体的核酸序列相比较，核酸包含一个或多个天然存在的等位基因变体。天然存在的等位基因变体包括天然存在的相同苦味受体的不同氨基酸序列，例如因等位基因变异或多态性而在给定的群体中观察到的相同苦味受体的不同氨基酸序列。

多态性是人基因中的普遍现象。存在于苦味受体基因内或附近的多态性可通过影响它们的表达或可通过例如上调或下调它们的表达水平或通过改变它们的氨基酸序列来改变它们的功能。表20显示独特的多态性的参考编号，包括与人TAS2R基因相关的单核苷酸多(″SNPs″)、各参考序列中SNP的位置和SNP的描述。可在美国国家生物技术信息中心(″NCBI″；Bethesda，MD)的单核苷酸多态性数据库(″dbSNP″)中检索所述参考编号。

已研究和记录了导致编码序列多样性的人苦味受体基因的等位基因变异。参见，例如，Ueda等人，″Identification of codingsingle-nucleotide polymorphisms in human taste receptor genes involvingbitter tasting″，Biochem Biophys Res Commun 285：147-151，2001；Wooding等人，″Natural selection and molecular evolution in PTC，abitter-taste receptor gene″，Am.J.Hum，Genet.74：637-646，2004；和Kim等人，″Worldwide haplotype diversity and coding sequence variationat human bitter taster receptor loci″，Human Mutation 26：199-204、2005。表21是不同人苦味受体的编码序列中的天然变异的列表。人苦味受体、它们的编码序列的SEQ ID NOS和蛋白质序列列于前3栏中。由它们的SEQ ID NOS标识的每一个编码序列内的核苷酸变化和它们的位置分别在“核苷酸变化”和“核苷酸变化的位置”下示于栏中。如由它们的SEQ ID NOS标识的每一个苦味受体内的氨基酸变化用单字母缩写显示于“描述”下的栏中。关于每一个相应的SEQ ID NO，它们的位置显示于“氨基酸变化的位置”下的栏中标示于栏中。此外，“描述”栏还包括可在NCBI的dbSNP被检索到的变异的标识符。″特征标识符″是由欧洲生物信息研究所(Cambridge、United Kingdom)托管的UniProt Protein Knowledgebase分配给一些变异的唯一且稳定的特征标识符。它们可在UniProt中被检索到。″NA″表示还没有由UniProt分配的标识符。

人味觉的变化是众所周知的现象。不希望受理论束缚，苦味的变化可与苦味受体的多态性相关。例如已使hTAS2R38(苯基硫脲(PTC的受体)中的多态性与检测丙硫氧嘧啶(PROP)的能力相关(Kim等人，″Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying tastesensitivity to phenylthiocarbamide″，Science 299：1221-1225，2003；Wooding等人，2004)。hT2R43基因的等位基因中的某些多态性使得人对天然植物化合物芦荟素和马兜铃酸的苦味非常敏感。不具有该等位基因的人在低浓度上尝不出此类化物的味道。相同hTAS2R43基因的等位基因的某些变异使得人对糖精的苦味更敏感。此外，密切相关的基因的(hTAS2R44的)等位基因的某些变异使得人对糖精的苦味更敏感。此外，一些人不具有某些hTAS2R基因，所述基因是造成个体之间味觉变化的原因。也已使苦味基因中的多态性与某些疾病的增加的风险相关。稳定地表达异源天然存在的苦味受体或其等位基因变体或多态性或非天然存在的具有一个或多个突变(例如，随机突变或位点专一突变)的其突变形式的细胞系全都在本发明的范围内。

在某些实施方案中，核酸是上文中提供的核酸序列的片段。作为片段或具有此类修饰的此类苦味受体保持苦味受体的至少一种生物性质，例如其增加细胞内游离钙的能力。本发明包括稳定地表达编码苦味受体的核苷酸序列的细胞和细胞系，所述核苷酸与本文中公开的序列具有至少约85％同一性。在某些实施方案中，与本文中提供的亚单位序列相比较，编码亚单位的序列的同一性为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。本发明还包括细胞和细胞系，在所述细胞和细胞系中编码苦味受体的核酸在严格条件下与本文中提供的编码相应苦味受体的核酸杂交。

在某些实施方案中，细胞或细胞系包含编码苦味受体的核酸序列，所述核酸序列包含与本文中提供的序列相比较至少一个但少于10、20、30或40个核苷酸，多至或等于核苷酸序列的1％、5％、10％或20％的置换或来自与其基本等同的序列(例如，与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或为能够在严格条件下与公开的序列杂交的序列)。在某些实施方案中，细胞或细胞系包含编码苦味受体的核酸序列，所述核酸序列与本文中提供的序列相比包含少于10、20、30或40个核苷酸，多至或等于核苷酸序列的1％、5％、10％或20％的插入或缺失或不同于与其基本等同的序列(例如，与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或为能够在严格条件下与公开的序列杂交的序列)。本文中描述的置换、插入和缺失可存在于本发明的细胞或细胞系的编码苦味受体的任一多核苷酸中。

在某些实施方案中，在核酸置换或修饰导致氨基酸变化例如氨基酸置换的情况下，天然氨基酸可被保守或非保守置换替代。在某些实施方案中，原始与经修饰的多肽序列之间的序列同一性可相差约1％、5％、10％或20％的多肽序列或不同于与其基本等同的序列(例如，与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列)。本领域普通技术人员将理解保守氨基酸置换是其中氨基酸侧链在结构和/或化学性质上相似的置换，并且所述置换不应当显著改变亲本序列的结构特征。在包括含有突变的核酸的实施方案中，突变可以是随机突变或位点专一突变。

保守修饰将产生具有与未修饰的苦味受体的功能和化学特征相似的功能和化学特征的苦味受体。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有与亲本氨基酸残基具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换的置换。一般地，保守氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此相差保守置换的情况下，可向上调整百分比序列同一性或相似性的程度以校正置换的保守性质。用于进行该调整的方法对于本领域普通技术人员来说是众所周知的。参见，例如，Pearson，MethodsMol.Biol.243：307-31(1994)。

拥有具有相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐以及天冬酰胺-谷氨酰胺。可选地，保守氨基酸置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中公开的PAM250对数可能性矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守的”替换是在PAM250对数可能性矩阵中具有非负值的任何变化。

在某些实施方案中，编码苦味受体的核酸序列还包含标签。此类标签可以编码例如HIS标签、myc标签、血凝素(HA)标签、蛋白质C、VSV-G、FLU、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白、FLAG、BCCP、麦芽糖结合蛋白标签、Nus-标签、Softag-1、Softag-2、Strep-标签、S-标签、硫氧还蛋白、GST、V5、TAP或CBP。标签可用作测定苦味受体表达水平、细胞内定位、蛋白质间相互作用、苦味受体的调节或苦味受体的功能。标签还可用于纯化或分级分离味觉受体。在某些实施方案中，标签是可从其标记的苦味受体切割的。这可通过例如在编码苦味受体的核酸中在标签与苦味受体之间引入特定蛋白酶切割位点，然后将由所述核酸表达的标记的苦味受体经历所述特定蛋白酶的处理来实现。

用于产生本发明的细胞或细胞系的宿主细胞可以以它们天然状态表达一种或多种内源性苦味受体或缺乏任何苦味受体的表达。在其中细胞或细胞系表达一种或多种其自己的苦味受体(也称为“内源性”苦味受体)的情况下，异源性苦味受体可以与细胞或细胞系的内源性苦味受体之一相同。可将例如编码对于细胞或细胞系是内源的苦味受体的核酸引入细胞或细胞系以增加编码苦味受体的基因在细胞或细胞系中的拷贝，使得苦味受体在细胞或细胞系中以比在无所引入的核酸的情况下更高的水平表达。宿主细胞可以是原代细胞、精细胞或干细胞，包括胚胎干细胞。宿主细胞还可以是永生化细胞。原代或永生化宿主细胞可来源于真核生物的中胚层、外胚层或内胚层。宿主细胞可以是上皮细胞、表皮细胞、间质细胞、神经细胞、肾细胞、肝细胞、造血细胞或免疫细胞。例如宿主细胞可以是肠隐窝或绒毛细胞、克拉拉细胞、结肠细胞、肠细胞、杯状细胞、肠嗜铬细胞、肠内分泌细胞。宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、哺乳动物细胞、人细胞、灵长类动物细胞、牛科动物细胞、猪科动物细胞、猫科动物细胞、啮齿类动物细胞、有袋动物细胞、鼠科动物细胞或其它细胞。宿主细胞也可以是非哺乳动物细胞，例如酵母、昆虫、真菌、植物、低等真核生物和原核生物细胞。此类宿主细胞可为测试苦味受体调节剂(由细胞提供的可与靶相互作用的表达产物不存在的可能性更大)提供更多样的背景。在优选实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可用于产生本发明的细胞或细胞系的宿主细胞的实例包括但不限于：人胚肾-293T细胞、已建立的神经元细胞系、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤成纤维细胞、横纹肌肉瘤细胞、背根神经节细胞、NS0细胞、CV-1(ATCC CCL70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCCCCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、HEK-293(ATCC CRL1573)和PC12(ATCC CRL-1721)、HEK293T(ATCC CRL-11268)、RBL(ATCCCRL-1378)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、MDCK(ATCC CCL-34)、SJ-RH30(ATCC CRL-2061)、HepG2(ATCC HB-8065)、ND7/23(ECACC92090903)、CHO(ECACC 85050302)、Vero(ATCC CCL 81)、Caco-2(ATCC HTB 37)、K562(ATCC CCL 243)、Jurkat(ATCCTIB-152)、Per.C6(Crucell，Leiden，The Netherlands)、Huvec(ATCC人原代PCS 100-010、小鼠CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH-7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC CRL 10852)、A549(ATCCCCL 185)、IMR-90(ATCC CCL 186)、MCF-7(ATC HTB-22)、U-2OS(ATCC HTB-96)、T84(ATCC CCL 248)或任何已建立的细胞系(极化的或非极化的)或可从库例如美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801University Blvd.Manassas，Va.20110-2209USA)或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，Salisbury Wiltshire SP40JG England)获得的任何细胞系。

在一个实施方案中，宿主细胞是胚胎干细胞，所述干细胞然后被用作产生转基因动物的基础。在某些实施方案中，可表达一种或多种具有时间和/或组织特异性表达的苦味受体。可将稳定地表达至少一种苦味受体(优选地功能性异源性苦味受体)的胚胎干细胞直接植入生物体，或可将其细胞核转移入其它受体细胞，然后可将它们植入，或可将它们用于产生转基因动物。

如本领域普通技术人员应理解的，适合于与所选宿主细胞一起使用的任何载体可用于将编码苦味受体的核酸引入宿主细胞。可用于将核酸引入宿主细胞的载体的实例包括但不限于质粒、病毒包括逆转录病毒和慢病毒、粘粒、人造染色体，其可包括例如pCMVScript、pcDNA3.1Hygro、pcDNA3.1neo、pcDNA3.1puro、pSV2neo、pIRESpuro、pSV2zeo。可用于产生本发明的细胞和细胞系的示例性哺乳动物表达载体包括：pFN11A(BIND)

pGL4.31、pFC14A(

7)CMV

pFC14K(

7)CMV

pFN24A(

7)CMVd3

pFN24K(

7)CMVd3

HaloTag^TMpHT2、pACT、pAdVAntage^TM、

pBIND、

增强子、

启动子、pCI、pCMVTNT^TM、pG5luc、pSI、pTARGET^TM、pTNT^TM、pF12A RM

pF12K RM

pReg neo，pYES2/GS、pAd/CMV/V5-DEST载体、pAd/PL-DEST^TM

载体、

pDEST^TM27载体、

pEF-DEST51载体、

pcDNA^TM-DEST47载体、pCMV/Bsd载体、pEF6/His A、B和C、pcDNA^TM6.2-DEST、pLenti6/TR、pLP-AcGFP1-C、pLPS-AcGFP1-N、pLP-IRESneo、pLP-TRE2、pLP-RevTRE、pLP-LNCX、pLP-CMV-HA、pLP-CMV-Myc、pLP-RetroQ和pLP-CMVneo。可用于将编码苦味受体的核酸引入宿主细胞的载体的实施例包括但不限于质粒、病毒(包括逆转录病毒和慢病毒)、粘粒、人造染色体，其可包括例如pCMVScript、pcDNA3.1Hygro、pcDNA3.1neo、pcDNA3.1puro、pSV2neo、pIRES puro、pSV2zeo、pFN11A(BIND)

pGL4.31、pFC14A(

7)CMVpFC14K(

7)CMVpFN24A(

7)CMVd3

pFN24K(

7)CMVd3

HaloTag^TM pHT2、pACT、pAdVAntage^TM、

pBIND、

对照、

增强子、

启动子、pCI、pCMVTNT^TM、pG5luc、pSI、pTARGET^TM、pTNT^TM、pF12A RM

pF12K RM

pRegneo、pYES2/GS、

载体、pAckPL-DEST^TM

载体、

pDEST^TM27载体、pEF-DEST51载体、

pcDNA^TM-DEST47载体、pCMV/Bsd载体、pEF6/HisA、B、& C、pcDNA^TM6.2-DEST、pLenti6/TR、pLP-AcGFP1-C、pLPS-AcGFP1-N、pLP-IRESneo、pLP-TRE2、pLP-RevTRE、pLP-LNCX、pLP-CMV-HA、pLP-CMV-Myc、pLP-RetroQ、pLP-CMVneo。在某些实施方案中，载体包含表达控制序列例如组成型或条件型启动子，优选使用组成型启动子。本领域普通技术人员将能够选择此类序列。例如，适当的启动子包括但不限CMV、TK、EF-1α。在某些实施方案中，启动子是诱导型、温度调节型、组织特异性、阻遏型、热休克、发育、细胞谱系特异性、瞬时启动子或上述任一种或多种的未修饰的或经诱变的、随机化的、改组的序列的组合或重组。在其它实施方案中，通过基因激活或当编码苦味受体的基因为附加体时表达苦味受体。优选组成型表达编码苦味受体的RNA或其突变形式或天然存在的等位基因变体。

在某些实施方案中，载体缺乏可选择标记或抗药基因。在其它实施方案中，载体任选地包含编码可选择标记(例如赋予药物或抗生素抗性的蛋白质)的核酸。可将选择压力用于细胞培养以选择具有所需序列或性状的细胞，并且这通常通过将目的多肽的表达与赋予细胞对相应选择试剂或压力的抗性的选择标记的表达相结合来实现。抗生素选择包括但不限于抗生素(例如，嘌呤霉素、新霉素、G418、潮霉素、博来霉素等)的使用。非抗生素选择包括但不限于营养物剥夺的使用、对选择温度的暴露和对诱变条件的暴露，其中选择标记可以是例如谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、oabain、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。编码不同苦味受体的序列的各载体可具有相同的或不同的抗药性或其它可选择的标记。如果超过一种抗药性标记相同，那么可通过提高药物的水平来实现同时选择。适当的标记对于本领域普通技术人员来说是众所周知的，包括但不限于赋予对下列物质之任一种的抗性的基因：新霉素/G418、嘌呤霉素、潮霉素、博来霉素、氨甲喋呤和杀稻瘟菌素。虽然药物选择(或使用任何其它适当的选择标记的选择)不是必需步骤，但其可用于从转染的细胞群体富集稳定地转染的细胞，只要转染的构建体经设计赋予抗药性即可。如果使用信号传导探针进行表达苦味受体的细胞的随后选择，那么转染后过早的选择可导致一些可能只是被瞬时转染而非稳定转染的阳性细胞。然而，这可通过使充足的细胞传代以允许稀释转染的细胞中的瞬时表达来降至最低程度。

在某些实施方案中，载体包含编码RNA标签序列的核酸序列。“标签序列”是指作为待通过信号传导探针检测的表达的RNA或RNA的部分的核酸序列。信号传导探针可检测多种RNA序列。这些RNA中的任一种可用作标签。可通过设计包含与标签的序列互补的部分的探针来使信号传导探针针对标签。在具体的实施方案中，信号传导探针针对(例如，互补)RNA的相同或不相同的编码外显子、非编码内含子或非编码非翻译序列。在具体的实施方案中，信号传导探针可针对信号传导途径包括苦味受体的信号传导途径的组分的RNA。标签序列可以是被共转录的并且包含信号传导探针结合的靶序列的质粒的3′非翻译区。编码目的基因的RNA可包括标签序列或标签序列可位于5′非翻译区或3′非翻译区。在某些实施方案中，标签不与编码目的基因的RNA在一起。标签序列可与基因的信使的蛋白质编码部分一起存在于框内或与其一起不存在于框内，这视是否希望标记所产生蛋白质而定。因此，不必翻译标签序列来通过信号传导探针进行检测。标签序列可包含相同或不同的多个靶序列，其中一个信号传导探针与各靶序列杂交。标签序列可编码具有二级结构的RNA。结构可以是三臂连接结构。可用于本发明的和可制备针对其的信号传导探针的标签序列的实例包括但不限于表位标签的RNA转录物，所述表位标签是例如HIS标签、myc标签、血凝素(HA)标签、蛋白质C、VSV-G、FLU、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白、FLAG、BCCP、麦芽糖结合蛋白标签、Nus-标签、Softag-1、Softag-2、Strep-标签、S-标签、硫氧还蛋白、GST、V5、TAP或CBP。如本文中所描述的，本领域普通技术人员可产生他或她自己的RNA标签序列。

在另一个方面中，本发明的细胞和细胞系稳定地表达G蛋白。存在两个G蛋白家族，异源三聚体G蛋白和单体G蛋白。异源三聚体G蛋白被G蛋白偶联受体(“GPCR”)激活，其包括3个亚单位：G_α、G_β和G_Y。如本文中所使用的，术语G蛋白包括此类亚单位的任一个例如G_α或其任何组合以及具有所有3个亚单位的异源三聚体G蛋白。在无活性状态中，G_α、G_β和G_Y形成三聚体。β和γ亚单位彼此紧密结合并且被称为β-γ复合物。在配体结合GPCR后G_α与G_βY分离。G_βY在其GDP-GTP交换后从G_α亚单位释放。G_βY复合物可激活其它第二信使或门控离子通道。Gα的4个家族包括：通过激活腺苷酸环化酶增加cAMP合成的G_s(刺激性)；抑制腺苷酸环化酶的G_i(抑制性)；G_12/13家族调节多种细胞运动过程(即细胞骨架、细胞连接)；以及G_q，其刺激钙信号传导和磷酸酯酶C。单体G蛋白与异源三聚体G蛋白的α亚单位同源。任何G蛋白可在本发明的细胞或细胞系中表达，包括但不限于转导蛋白(例如，GNAT1、GNAT2和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(t))、味导蛋白(例如，GNAT3鸟嘌呤核苷酸结合蛋白和α转导蛋白3)、人GNA15(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)α15(Gq类；异名GNA16)和小鼠Gα15以及它们的嵌合蛋白质例如Gα15-GNA15也称为Gα15-Gα16)。在优选实施方案中，G蛋白是小鼠Gα15(SEQ ID NO：102)。在另一个优选实施方案中，G蛋白是人GNA15(SEQ ID NO：50)或是由包含SEQ ID NO：76的核酸编码的人G蛋白。G蛋白也可以是任何哺乳动物G蛋白例如但不限于表7中所列的任何哺乳动物G蛋白。由细胞稳定地表达的G蛋白对于细胞可以是内源的。可选择地，G蛋白的稳定表达可以是编码G蛋白的核酸至细胞内稳定转染的结果。稳定地表达异源G蛋白的细胞在本领域内是已知的，例如HEK293/Gα15细胞(Chandrashekar等人，“T2Rsfunction as bitter taster receptors″，Cell 100：703-711，2000；Bufe等人，“The human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in rsponse toβ-glucopyranosides”，Na Genet 32：397-401)。在其它实施方案中，可将编码G蛋白的核酸和编码苦味受体的核酸相继地转染进入宿主细胞，可首先转染编码G蛋白的核酸或首先转染编码苦味受体的核酸。在其它实施方案中，可在相同或不同的载体上将编码G蛋白的核酸和编码苦味受体的核酸共转染进入宿主细胞。因此，同样地可相继地或同时地进行稳定地表达G蛋白和苦味受体的细胞的选择。可用于稳定地表达G蛋白的细胞或细胞系与可用于稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系相同，如上文中所解释的。用于转染G蛋白的载体任选地包含编码针对抗生素或非抗生素选择的可选择的标记的核酸，如上文中所解释的。

在本发明的一些实施方案中，本发明的细胞或细胞系共表达其它蛋白质与苦味受体。在优选实施方案中，所述其它蛋白质是至少一种其它味觉受体例如甜味(TAS1R2/TAS1R3)受体或鲜味(TAS1R1/TAS1R3)受体。可通过任何机制例如但不限于在宿主细胞中内源地或从载体外源地表达与苦味受体共表达的蛋白质。同样地，在本发明的其它实施方案中，可在细胞或细胞系中稳定地表达超过一种类型的苦味受体。

在另一个方面中，本发明的细胞和细胞系具有与由常规方法产生的细胞和细胞系相比较增强的稳定性。为了鉴定稳定的表达，在一段时程中测量细胞或细胞系的苦味受体的表达，然后比较表达水平。稳定的细胞系将继续在整个时程中持续表达苦味受体。在本发明的一些方面中，时程可持续至少1周、2周、3周、4周、5周、6周等，或至少1个月或至少2、3、4、5、6、7、8或9个月或其间的任何时间长度。还可以例如通过qRT-PCR和单终点RT-PCR表征分离的细胞和细胞系以测定被表达的苦味受体的绝对量和相对量。在某些实施方案中，通过在一段时程中比较功能测定的结合来测量稳定的表达。基于功能测定的稳定性的测量提供了鉴定不仅稳定地表达目的基因的mRNA而且还稳定地产生和正确地加工(例如，翻译后修饰、亚单位装配和细胞内的定位)由正确发挥功能的目的基因编码的蛋白质的克隆的益处。

本发明的细胞和细胞系具有提供具有高重现性的测定(如由其Z′因子证明)的进一步有利性质。参见Zhang JH，Chung TD，OldenburgKR，“A Simple StatisticalParameter for Use in Evaluationand ValidationofHigh Throughput ScreeningAssays.”J.Biomol.Screen.1999；4(2)：67-73，所述参考文献通过引用整体并入本文。Z’值涉及细胞或细胞系的品质，因为它反映细胞或细胞系将一致地响应调节剂的程度。Z’是考虑到跨越多孔平板对参考化合物的功能应答的信噪比范围和信号变异性(即，从孔到孔之间)的统计计算。使用得自具有阳性对照的多个孔和具有阴性对照的多个孔的数据计算Z’。根据下面方程式将其组合的标准差的比乘以3至差异因子，用1减去其平均值以得到Z′因子：

Z′因子＝1-((3δ阳性对照+3δ阴性对照)/(μ阳性对照-μ阴性对照))

理论最大Z’因子为1.0，这将指示，无变异性和无限的动态范围的理想测定。更低的分值(即，接近0的分值)是不希望的，因为其指示阳性与阴性对照之间存在重叠。在工业中，对于简单的基于细胞的测定，多达0.3的Z′得分被视为边缘得分，0.3至0.5的Z′得分表示为可接受的，并且超过0.5的Z′得分表示为极佳的。无细胞或生物化学测定可以接近关于基于细胞的系统的得分，因为更高的Z′得分而趋于更低，但基于Z′细胞的系统是复杂的。

本发明的细胞和细胞系具有反映它们在测定中有利地产生一致结果的能力的Z’值。本发明的表达苦味受体的细胞和细胞系为高通量筛选(HTS)相容性测定提供了基础，因为它们通常具有至少0.45的Z′值。在本发明的一些方面中，细胞和细胞系导致至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z′。在本发明的其它方面中，本发明的细胞和细胞系导致至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z′，维持多代例如5至20代，包括5至20代之间的任何整数代。在本发明的一些方面中，细胞和细胞系导致至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z′，维持1、2、3、4或5周或2、3、4、5、6、7、8或9个月，包括其间的任何时间段。

同样地根据本发明，可就细胞内游离钙水平表征表达天然存在的苦味受体或其天然存在的等位基因变体的形式的细胞和细胞系以及表达苦味受体的突变形式的细胞和细胞系。在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系表达具有“生理学相关的”活性的苦味受体。如本文中所使用的，生理学相关性是指表达苦味受体的细胞或细胞系的性质，其中苦味受体引起细胞内游离钙的增加(如当被激活时相同类型的天然存在的苦味受体所导致的那样)并且以与相同类型的天然存在的苦味受体被相同化合物调节时作出反应的方式相同的方式对调节剂作出反应。本发明的表达苦味受体的细胞和细胞系，包括苦味受体的一些突变形式和苦味受体的一些天然存在的等位基因变体，优选在适当的测定例如测量细胞内游离钙的测定中显示与通常表达天然苦味受体的细胞相当的功能。此类测定对于本领域普通技术人员来说是已知的(Nahorski，″Pharmacology of intracellular signaling pathways″，Brit.J.Pharm.147：S38-S45，2000))。此类比较用于测定细胞或细胞系的生理学相关性。使用经训练的品尝测试者的实验对象组的″吸吐法(sip-and-spit)″′品尝试验也可用于进一步证实本发明的细胞和细胞系中的苦味受体生理学相关性。使用通过筛选苦味受体的天然或突变形式或其天然存在的等位基因变体鉴定的调节剂的吸吐法品尝试验的结果可用于证实这些不同形式的生理学相关性。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系具有增强的对苦味受体的调节剂的敏感性。本发明的细胞和细胞系响应调节剂并且以对于苦味受体的生理范围EC50或IC50值增加细胞内游离钙。如本文中所使用的，EC50是指诱导细胞或细胞系中半最大激活反应所需的化合物或物质的浓度。如本文中所使用的，IC50是指诱导细胞或细胞系中半最大抑制反应所需的化合物或物质的浓度。可使用本领域内众所周知的技术测定EC50和IC50值，例如使化合物或物质的浓度与表达苦味受体的细胞系的反应相关的剂量-反应曲线。

源自苦味受体的生理学相关功能的本发明的表达苦味受体的细胞和细胞系的其它有利性质是在初步筛选中鉴定的调节剂在次级功能测定例如吸吐法或其它品尝试验或扫描响应味觉调节化合物的脑活性的功能磁共振成像(MRI)中具有功能。如本领域普通技术人员应认识到的，在起始筛选测定中鉴定的化合物一般必须是例如通过组合化学、药物化学或合成化学进行修饰的，用于其衍生物或类似物在次级功能测定中有功能。然而，由于表达本苦味受体的细胞和细胞系的高生理学相关性，许多由此鉴定的化合物无需修饰即是有功能的。

在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系的性质例如稳定性、生理学相关性、测定的重现性(Z′)或生理EC50或IC50值是可在特定的培养条件下获得的。在某些实施方案中，可以例如通过自动化来标准化和严格维持培养条件。培养条件可包括在其下培养细胞或细胞系的任何适当的培养，其可包括本领域内已知的条件。多种培养条件可导致对于任何苦味受体或它们的突变体或等位基因变体有利的生物性质。

在其它实施方案中，可在一个月或更短的时间内获得具有所需性质例如稳定性、生理学相关性、测定的重现性(Z′)或生理EC50或IC50值的本发明的细胞和细胞系。例如可在2、3、4、5或6天内，或在1、2、3或4周内或其之间任何长度的时间内获得细胞或细胞系。

本发明的一个方面提供了克隆细胞和细胞系的集合，所述克隆细胞和细胞系各自表达相同的苦味受体或不同的苦味受体，包括一种或多种苦味受体的不同的突变形式和天然存在的等位基因变体。集合可包括例如表达不同苦味受体的组合或苦味受体的突变形式、苦味受体的天然存在的等位基因变体或其任何组合的细胞或细胞系。集合还可包括表达相同苦味受体和不同G蛋白或苦味受体的任何可能的二聚体或其它多聚体包括异源多聚体或嵌合二聚体或多聚体的细胞或细胞系。

当产生细胞或细胞系的集合或实验对象组例如用于药物筛选时，集合或实验对象组中的细胞或细胞系可以这样相匹配，使得它们就一种或多种选择的生理特性而言是相同的(包括基本上相同的)。在这个背景中的“相同生理特性”意指所选择的生理特性在集合或实验对象组中的成员当中是足够相似的，使得细胞集合或实验对象组可以在药物筛选测定中产生可靠结果；例如，药物筛选测定中的读数的差异将是由于例如测试化合物对表达苦味受体的不同天然或突变形式或其等位基因变体的细胞的不同生物活性，而不是由于细胞中的固有差异。例如，细胞或细胞系可以相匹配以具有相同生长速率，即在细胞集合或实验对象组的成员中具有不超过1、2、3、4或5小时差异的生长速率。例如通过经由其生长速率将细胞框并成5、6、7、8、9或10个组，并且使用来自相同框并组的细胞产生实验对象组，可以实现这点。测定细胞生长速率的方法是本领域众所周知的。实验对象组中的细胞或细胞系还可以相匹配，以具有相同Z’因子(例如，相差不超过0.1的Z′因子)、苦味受体表达水平(例如，相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或30％的苦味受体表达水平)、与组织培养表面的附着等。相匹配的细胞和细胞系可以在通过例如自动化平行加工实现的等同条件下生长，以维持所选择的生理特性。

本发明的相匹配细胞实验对象组可用于例如鉴定对苦味受体具有确定活性的调节剂(例如，激动剂或拮抗剂)；表征不同在苦味受体或它们的等位基因变体或突变形式之间的化合物活性；鉴定只对一种类型的苦味受体或其等位基因变体或突变形式具有活性的调节剂；和鉴定只对一个亚组的苦味受体具有活性的调节剂。本发明的匹配的细胞实验对象组允许进行高通量筛选。花费数月完成的筛选现可在数周内完成。

为了制备本发明的细胞和细胞系，可使用例如美国专利6,692,965和国际专利公布WO/2005/079462中描述的技术。为了所有目的将这两个文献都通过引用整体并入本文。这个技术提供数百万细胞的实时评估，从而使得可以检测任何所需数目的克隆(从数百个到数千个克隆)。使用细胞分选技术，例如流式细胞术细胞分选(例如用FACS机器)或磁性细胞分选(例如用MACS机器)，1个细胞/孔可以以高统计可靠性自动地存放于培养器皿(例如96孔培养平板)中。技术的速度和自动化允许容易地分离多基因重组细胞系。

通过使用所述技术，可使用信号探针(也称为分子信标或荧光探针)检测每一个苦味受体的RNA序列。在某些实施方案中，分子信标识别如上所述的靶标签。在另一个实施方案中，分子信标识别苦味受体编码序列本身内的序列。通过设计包含分别与标签或苦味受体编码序列的RNA序列互补的部分的探针来使信号传导探针可针对RNA标签或苦味受体编码序列。此类相同的技术可用于检测G蛋白的RNA序列(如果使用的话)。

可利用众所周知的方法将包含编码苦味受体的序列、编码G蛋白的序列、标签序列或其任何组合以及任选地还包含编码可选择的标记的核酸的核酸引入选择的宿主细胞。用于将核酸引入细胞的技术在众所周知的并且可被本领域普通技术人员容易地理解。所述方法包括但不限于转染、病毒递送、蛋白质或肽介导的插入、共沉淀法、基于脂质的递送试剂(脂转染)、细胞转染剂、脂多胺递送、树状大分子递送剂、电穿孔或机械递送。转染剂的实例是GENEPORTER、GENEPORTER2、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX-10、TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LT1、TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAISHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLyFECT、TRANSMES SANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CLONFECTIN和METAFECTINE。

在将苦味受体编码序列并且任选地也将G蛋白编码序列引入宿主细胞，然后任选地随后进行药物选择后，将分子信标(例如，荧光探针)引入细胞并且将细胞分选术用于分离对于它们的信号呈阳性的细胞。分子信标也可用于鉴定苦味受体、G蛋白或两者的表达。如果鉴定两者的表达，那么可同时或相继地进行它们的鉴定。必要时，可进行多轮分选。在一个实施方案中，流式细胞分选器是FACS机器。还可使用MACS(磁性细胞分选)或利用激光激活分析和处理的阴性细胞的激光消融术。根据本方法，检测并且回收表达至少一种苦味受体的细胞。可将苦味受体(和任选的G蛋白)序列整合入细胞中的基因组的不同位置。所引入的编码苦味受体(和，如果所引入的G蛋白)的基因的表达水平可基于整合位点而变化。本领域普通技术人员应知道，可就所需表达水平(即，高于本底或在高于本底的特定水平上)门控分选。此外，可获得稳定的细胞系，其中一种或多种所引入的编码苦味受体或G蛋白的基因是附加型的。

在本发明中有用的信号传导探针是本领蜮己知的，并且一般是包括与靶序列互补的序列和信号发射系统的寡核苷酸，所述信号发射系统如此安排，使得当探针不与靶序列结合时，无信号发射，并且当探针与靶序列结合时，发射信号。作为非限制性举例说明，信号传导探针可以包括如此定位在探针中的荧光团和猝灭剂，以使猝灭剂和荧光团在未结合的探针中放在一起。在探针和靶序列之间结合后，猝灭剂和荧光团分离，导致信号的发射。例如国际公布WO/2005/079462描述了许多信号传导探针，其可以在本文的细胞和细胞系的产生中使用。上文对于将核酸引入细胞内描述的方法可以用于引入信号传导探针。在使用标签序列的情况下，如果在一个细胞中表达多个苦味受体，每一个苦味受体的载体或苦味受体和G蛋白的载体可包含相同或不同的标签序列。无论标签序列相同还是不同，信号传导探针可包含不同的信号发射物，例如具有不同颜色的荧光基团等，从而使得可分别地检测各个不同苦味受体和任选的G蛋白的表达(RNA)。作为举例说明，特异性检测一种苦味受体mRNA的信号传导探针可包含红色荧光基团，并且检测所引入的G蛋白(RNA)的探针可包含绿色荧光蛋白。同样地作为举例说明，特异性检测一种苦味受体mRNA的信号传导探针可包含红色荧光基团，特异性检测另一种苦味受体mRNA的信号传导探针可包含绿色荧光蛋白基团，以及特异性检测第三苦味受体的信号传导探针可包含黄色荧光基团。本领域普通技术人员知道利用信号传导探针在用多个苦味受体转染的细胞中差异检测多个苦味受体或苦味受体及G蛋白的表达的其它方法。

可通过本领域普通技术人员众所周知的许多方法的任何方法将编码信号传导探针的核酸引入选择的宿主细胞，所述方法包括但不限于转染、共沉淀法、基于脂质的递送试剂(脂转染)、细胞转染剂、脂多胺递送、树状大分子递送剂、电穿孔或机械递送。转染剂的实例是GENFPORTER、GENFPORTER2、LIPOFECTAMINF、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE6、FUGENE HD、TFX-10、TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENE SHUTTLE、TROJENE、GENE SILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LT1、TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAISHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMES SANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CLONFECTIN和METAFECTINE。

在一个实施方案中，信号传导探针设计为与编码目的蛋白质的RNA的部分或与它们的5′或3′非翻译区的部分互补。即使设计为识别目的信使RNA的信号传导探针能够检测虚假地内源性表达的靶序列，与由经转染的细胞产生的目的序列的比例相比较，这些的比例是这样的，使得分选器能够区分2种细胞类型。因此，包含编码苦味受体的核酸的构建体不需要和不包括编码荧光蛋白的序列。因此，异源荧光蛋白不在本发明的细胞中表达。本发明的细胞或细胞系稳定地表达异源天然苦味受体。虽然此类蛋白质标签/伴侣分子已用于许多苦味受体的表达以促进苦味受体至细胞表面的运输，但本发明的细胞和细胞系有利地在不具有新型苦味受体的细胞表面上功能表达所述苦味受体。

在本发明的另一个实施方案中，在细胞分选和分离单个细胞之前或之后可使粘附细胞适应悬浮。在其它实施方案中，可将分离的细胞单个培养或混合培养以产生细胞群体。还可分开地培养单个或多个细胞系或混合培养所述细胞或细胞系。如果细胞系的混合物产生所需活性或具有所需性质，还可将其进一步级分直至鉴定具有该效应的细胞系或细胞系的实验对象组。混合细胞或细胞系可使得更容易维持大量细胞系而无需分开地维持每一个细胞系。因此，对于阳性细胞而言，可以富集细胞或细胞系的混合物。富集的混合细胞可以至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％对于所需性质或活性是阳性的。

a)提供多个表达编码苦味受体的mRNA的细胞；

c)利用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于对于每一个分离的细胞培养物条件而言基本相同，在该培养过程中将每一个分离的细胞培养物中细胞的数目标准化，并且其中分离的培养物按照相同的方案传代；

d)测定分离的细胞培养物的苦味受体的至少一种所需特征至少2次；和

e)鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

在某些实施方案中，该方法包括测量分离的细胞培养物的生长速率的额外步骤。可以使用技术人员众所周知的多种技术方法中的任何方法测定生长速率。此类技术包括但不限于测量ATP、细胞汇合、光散射、光密度(例如，对于DNA，OD 260)。优选地，使用使培养物在所选择的培养条件外花费的时间量降到最低的方法测定生长速率。

在某些实施方案中，测量细胞汇合，并且根据汇合值计算生长速率。在某些实施方案中，在测量细胞汇合前使细胞分散并且去除凝块用于改善的准确度。用于使细胞单分散的方法是众所周知的，并且可以例如通过向待测量的培养物中加入分散剂来实现。分散剂是众所周知且容易获得的，并且包括但不限于，酶促分散剂例如胰蛋白酶，和基于EDTA的分散剂。使用用于这个用途的商购可得的软件例如HAMILTON VECTOR，根据汇合日期可以计算生长速率。例如使用自动化微板读取器的自动化汇合测量是特别有用的。测量汇合的平板读取器是商购可得的，并且包括但不限于，CLONE SELECTIMAGER(Genetix)。一般地，在计算生长速率前进行细胞汇合的至少2次测量。用于测定生长速率的汇合值的数目可以是方便的或适合于培养的任何数目。例如，汇合可以经过例如1周、2周、3周或任何时间段且以任何所需频率测量多次。

在步骤d)中，细胞和细胞系可以依据任何生理特性进行测试且选择，所述生理特性包括但不限于：由基因组编码的细胞过程的改变；由基因组调节的细胞过程的改变；染色体活性模式的改变；染色体沉默模式的改变；基因沉默模式的改变；基因激活模式或效率的改变；基因表达模式或效率的改变；RNA表达模式或效率的改变；RNAi表达模式或效率的改变；RNA加工模式或效率的改变；RNA转运模式或效率的改变；蛋白质翻译模式或效率的改变；蛋白质折叠模式或效率的改变；蛋白质装配模式或效率的改变；蛋白质修饰模式或效率的改变；蛋白质转运模式或效率的改变；使膜蛋白质转运至细胞表面的模式或效率的改变；生长速率的改变；细胞大小的改变；细胞形状的改变；细胞形态的改变；RNA含量％的改变；蛋白质含量％的改变；含水量％的改变；脂质含量％的改变；核糖体含量的改变；线粒体含量的改变；ER质量的改变；质膜表面积的改变；细胞体积的改变；质膜的脂质组成的改变；核被膜的脂质组成的改变；质膜的蛋白质组成的改变；核被膜的蛋白质组成的改变；分泌囊泡数目的改变；溶酶体数目的改变；空泡数目的改变；细胞关于下述的能力或潜力的改变：蛋白质生产，蛋白质分泌.蛋白质折叠，蛋白质装配，蛋白质修饰，蛋白质的酶促修饰，蛋白质糖基化，蛋白质磷酸化，蛋白质去磷酸化，代谢产物生物合成，脂质生物合成，DNA合成，RNA合成，蛋白质合成，营养素吸收，细胞生长，有丝分裂，减数分裂，细胞分裂，去分化，转化成干细胞，转化成多潜能细胞，转化成全能细胞，转化成任何器官(即，肝、肺、皮肤、肌肉、胰腺、脑、睾丸、卵巢、血液、免疫系统、神经系统、骨、心血管系统、中枢神经系统、胃肠道、胃、甲状腺、舌、胆囊、肾、鼻、眼、趾甲、毛发、味蕾)的干细胞类型，转化成分化的任何细胞类型(即，肌肉、心肌、神经元、皮肤、胰腺、血液、免疫、红血细胞、白血细胞、杀伤T细胞、肠内分泌细胞、味觉、分泌细胞、肾、上皮细胞、内皮细胞，还包括可以用于引入核酸序列的己列举的任何动物或人细胞类型)，摄取DNA，摄取小分子，摄取荧光探针，摄取RNA，与固体表面附着，适应无血清条件，适应无血清悬浮条件，适应按比例增加的细胞培养，用于大规模细胞培养的用途，用于在药物开发中使用，用于在高通量筛选中使用，用于在基于功能细胞的测定中使用，用于在膜电位测定中使用，用于在钙流测定中使用，用于在G蛋白受体测定中使用.用于在基于报告细胞的测定中使用，用于在ELISA研究中使用，用于在体外测定中使用，用于在体内应用中使用，用于在二次测试中使用，用于在化合物测试中使用，用于在结合测定中使用，用于在淘选测定中使用，用于在抗体淘选测定中使用，用于在成像测定中使用，用于在显微成像测定中使用，用于在多孔平板中使用，用于适应自动化细胞培养，用于适应小型化自动化细胞培养，用于适应大规模自动化细胞培养，用于适应在多孔平板(6、12、24、48、96、384、1536或更高密度)中的细胞培养，用于在细胞芯片中使用，用于在载玻片上使用，用于在玻璃载玻片上使用，用于在载玻片或玻璃载玻片上的微阵列，用于免疫荧光研究，用于在蛋白质纯化中使用，用于在生物制品生产中使用，用于在工业酶生产中使用，用于在用于研究的试剂生产中使用，用于在疫苗开发中使用，用于在细胞疗法中使用，用于在植入动物或人内使用，用于在由细胞分泌的因子分离中使用，用于cDNA文库的制备，用于RNA的纯化，用于DNA的纯化，用于经由病原体、病毒或其它因子感染，用于对经由病原体、病毒或其它因子感染的抵抗力，用于对药物的抵抗力，用于在自动化小型化细胞培养条仵下维持的适合性，用于在蛋白质生产中用于表征，包括：蛋白质晶体学、疫苗开发、免疫系统的刺激、抗体生产或抗体的产生或测试。本领域普通技术人员将容易认识到用于上文列出的特性中的任何一种的合适测试。在具体的实施方案中，一个或多个此类物理性质可以是一致的与苦味受体相关的物理性质并且可用于监控功能性苦味受体的表达。

可以用于表征本发明的细胞和细胞系和/或本发明的相匹配实验对象组的测试包括但不限于：氨基酸分析、DNA测序、蛋白质测序、NMR、用于蛋白质转运的测试、用于核质转运的测试、用于蛋白质的亚细胞定位的测试、用于核酸的亚细胞定位的测试、显微分析、亚显微分析、荧光显微镜检查、电子显微镜检查、共焦显微镜检查、激光消融技术、细胞计数和透析。技术人员应当了解如何使用上文列出的测试中的任何一种。

在包括测量生长速率的步骤的实施方案中，在测量生长速率之前，将细胞培养足够长的时间以使它们适应培养条件。如技术人员应当理解的，时间长度可随许多因素而改变，所述因素例如细胞类型、所选择的条件、培养形式，并且可以是从1天至数天、1周或更长时间的任何时间量。

优选地，多个分离的细胞培养物中的每个单个培养物维持在下文讨论的基本等同的条件下，包括标准化的维持时间表。该方法的另一个有利特征是可以同时维持大量单个培养物，从而使得可以鉴定具有所需性状组的细胞，即使非常罕见。由于这些及其它原因，根据本发明，使用自动化细胞培养方法培养多个分离的细胞培养物以使条件对于每个孔基本等同。自动化细胞培养防止了人工细胞培养固有的不可避免的变异性。

任何自动化细胞培养系统可用于本发明的方法。许多自动化系统是商购可得的并且为本领域普通技术人员所众所周知的。在某些实施方案中，自动化系统是器人系统。优选，系统包括独立移动的通道、多通道头(例如96-尖端头)和夹子或择优挑选臂以及HEPA过滤装置以在操作过程中保持无菌。移液器中的通道数目应适合于培养形式。方便的移液器具有例如96或384个通道。此类系统是已知且商购可得的。例如，MICROLAB STAR^TM仪器(Hamilton)可以用于本发明的方法中。自动化系统应能够执行多种所需细胞培养任务。此类任务将是本领域普通技术人员已知的。它们包括但不限于：去除培养基、替换培养基、添加试剂、细胞洗涤、去除洗涤溶液、加入分散剂、从培养器皿中取出细胞、将细胞加入培养器皿中等等。

本发明的细胞或细胞系的产生可包括任何数目的分离的细胞培养物。然而，由所述方法提供的优点随着细胞数目增加而增加。不存在可以在所述方法中利用的细胞或分离的细胞培养物的数目的理论上限。根据本发明，分离的细胞培养物的数目可以是2个或更多个，但更有利地是至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个分离的细胞培养物，例如至少12个、至少15个、至少20个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少48个、至少50个、至少75个、至少96个、至少100个、至少200个、至少300个、至少384个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个、至少500,000个或更多个。

表达苦味受体的本发明的细胞和细胞系的其它有利性质是它们在不存在药物选择压力的情况下稳定地表达一种或多种苦味受体。因此，在优选实施方案中，在无任何选择药物存在的情况下维持本发明的细胞和细胞系。在其它实施方案中，在无任何抗生素存在的情况下维持细胞和细胞系。如本文中所使用的，细胞维持是指在如上所述依据它们的苦味受体表达选择它们后培养所述细胞。维持不是指在细胞分选之前在选择药物(例如，抗生素)中培养细胞的任选步骤，其中引入细胞的抗药性标记允许富集稳定转染子在混合群体中。

无药细胞维持提供了许多优点。例如，抗药性细胞不总是以充足的水平表达共转染的目的转基因，因为选择依赖于已摄取抗药基因并且含有或不含转基因的细胞的存活。此外，选择药物通常是致诱变的或以其它方式干扰细胞的生理学，导致在基于细胞的测定中的偏差结果。例如，选择药物可降低对细胞凋亡的易感性(Robinson等人，Biochemistry，36(37)：11169-11178(1997))、增加DNA修复和药物代谢(Deffie等人，Cancer Res.48(13)：3595-3602(1988))、增加细胞pH(Thiebaut等人，J Histochem Cytochem.38(5)：685-690(1990)；Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993)；Simon等人，Proc NatlAcad Sci U S A.91(3)：1128-1132(1994))、降低溶酶体和内涵体的pH(Schindler等人，Biochemistry.35(9)：2811-2817(1996)；Altan等人，J Exp Med.187(10)：1583-1598(1998))、减少质膜电位(Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993))、增加质膜对氯化物的电导(Gill等人，Cell.71(1)：23-32(1992))和ATP(Abraham等人，Proc NatlAcad Sci USA.90(1)：312-316(1993))以及增加小囊泡运输的速率(Altan等人，Proc Natl Acad Sci USA.96(8)：4432-4437(1999))。因此，本发明的细胞和细胞系允许不具有由选择药物引起的任何假象的筛选测定。在某些优选实施方案中，在细胞分选之前或之后，本发明的细胞和细胞系不与选择压力因素例如抗生素一起培养，使得即使当未从富集细胞群体开始时，也通过分选来分离具有所需性质的细胞和细胞系。

苦味受体的表达水平可在细胞间或细胞系之间变化。细胞或细胞系的表达水平还可因表观遗传学事件例如DNA甲基化和基因沉默以及转基因拷贝的丢失而随着时间推移降低。此类变化可归因于许多因素例如被细胞吸收的转基因的拷贝数、转基因的基因组整合位点以及在基因组整合后转基因的完整性。可使用FACS或其它细胞分选方法(即，MACS)估计表达水平。可以使用引入信号传导探针的另外轮次，例如以确定随着时间推移细胞是否仍然对最初针对其分离所述细胞的RNA的任一种或多种保持阳性以及保持阳性至何种程度。

可能从可不再表达所有目的RNA的细胞重分离表达所有所需RNA的分离的容易性使得可能在无药物或最低浓度的药物存在的情况下维持细胞系。信号传导探针还可再用于之前产生的细胞或细胞系，例如以确定细胞是否仍然对最初针对其分离所述细胞的RNA的任一种或多种保持阳性或保持阳性至何种程度。

在另一个方面中，本发明提供了使用本发明的细胞和细胞系的方法。本发明的细胞和细胞系可用于需要功能性苦味受体的任何应用。细胞和细胞系可用于例如但不限于体外基于细胞的测定或其中将细胞植入动物(例如，非人哺乳动物)以例如筛选苦味受体调节剂的体内测定；估量物质的苦味；产生用于晶体学和结合研究的蛋白质；和研究化合物的选择性和剂量、受体/化合物结合动力学和稳定性以及受体表达对细胞生理(例如，电生理、蛋白质运输、蛋白质折叠和蛋白质调控)的效应。本发明的细胞和细胞系还可用于敲低研究以研究特定苦味受体或苦味受体的实验对象组的作用。

表达苦味受体的各种组合的细胞和细胞系可分开地或一起用于鉴定苦味受体调节剂，包括对特定苦味受体或苦味受体的突变形式或天然存在的等位基因变体特异的调节剂，以及用于获得关于各形式的活性的信息。

调节剂包括改变苦味受体或其突变形式或天然存在的等位基因变体的活性的任何物质或化合物。调节剂可以是苦味受体激动剂(增强剂或激活剂)或拮抗剂(抑制剂或阻断剂)，包括部分激动剂或拮抗剂、选择性激动剂或拮抗剂以及反激动剂，并且可以是变构调节剂。物质或化合物是调节剂，即使其调节活性在不同条件或浓度下或相对于苦味受体的不同形式而变化。在其它方面中，调节剂可改变另一种调节剂影响苦味受体的功能的能力。例如，不被拮抗剂抑制的苦味受体的形式的调节剂可使该形式的苦味受体易被拮抗剂抑制。

基于其对各种调节剂的反应，通过使苦味受体的体内形式的身份与苦味受体的已知形式的身份相关，本发明的细胞和细胞系可用于鉴定苦味受体的不同形式在不同的苦味受体病理状态中的作用。这允许选择疾病或组织特异性调节剂用于此类苦味受体相关病理或其它生理条件的高度靶向治疗。例如，因为许多天然存在的苦味化合物是有毒的，因此苦味受体可用作针对有毒食物化合物的摄入的警报传感器。胃肠粘膜中表达的苦味受体可能参与管腔中营养物和有害物质的功能检测和使肠准备吸收它们或起始保护反应。它们也可能通过激活肠-脑神经通路参与食物摄入的控制。因此，使用本发明的细胞系和方法鉴定的苦味受体调节剂可用于在许多背景中调节营养物的吸收，例如以控制食欲和/或减少肥胖者的肠中营养物的吸收，或控制肌肉的感觉和/或在营养不良者中从食物中增加营养物和/或能量的吸收。苦味受体调节剂还可用于鉴定苦味化合物，进一步表征苦味受体的影响结合性质的特定化学或结构基序或关键残基，鉴定被宽泛地、适度地或选择性地调节以进行配体结合的苦味受体，基于它们的结合谱确定苦味受体的组和亚组，使孤儿苦味受体脱孤，使用这些数据进行苦味受体的分子建模或药物设计以及确定各种苦味受体在哪个组织中具有活性。

为了鉴定苦味受体调节剂，可将本发明的新型细胞或细胞系在其中预期苦味受体具有功能的条件下与测试化合物接触，然后检测与适当的对照(例如不与所述测试化合物接触的细胞)相比较，苦味受体活性的统计学上显著的变化(例如，p＜0.05)。还可以使用采用已知激动剂或拮抗剂和/或表达不同苦味受体或其突变形式或天然存在的等位基因变体的细胞的阳性和/或阴性对照。在某些实施方案中，待检测和/或测量的苦味受体活性是细胞内游离钙水平的变化。本领域普通技术人员应当理解各种测定参数(例如信噪比)可以得到最佳化。

在其它相关方面中，本发明提供了鉴定其它GPCR的配体的方法。任何GPCR可用于该方法，包括但不限于哺乳动物或人GPCR以及孤儿或脱孤的GPCR。脱孤的GPCR的非限定性实例是阿片类物质(列于表9中)。可使用化合物或提取物文库筛选表达GPCR的细胞或细胞系以产生受体的表达谱。将具有相似谱的受体分组在一起并且利用化合物进行筛选以鉴定结合受体的配体。

在另外的方面中，本发明提供了鉴定孤儿苦味受体的配体的方法，即本发明提供了使苦味受体脱孤的方法。可使用化合物或提取物文库筛选表达不具有已知调节剂的苦味受体的细胞或细胞系以产生受体的表达谱。任选地，将具有相似谱(如果有的话)的受体分组在一起并且利用已知的苦味化合物进行筛选以鉴定结合受体的配体。一旦鉴定配体，可利用品尝试验进一步证实结果。有利地，本发明的细胞和细胞系稳定地表达天然(即，未标记的)苦味受体，因此使用本方法鉴定的配体是准确且相关的。在相关实施方案中，使苦味受体脱孤的方法可用于使任何孤儿GPCR(包括任何孤儿哺乳动物GPCR或任何孤儿人GPCR)例如表8中所列的孤儿GPCR脱孤。

在某些实施方案中，可将本发明的一个或多个细胞或细胞系包括细胞系的集合与多种测试化合物例如测试化合物的文库接触。可使用本发明的细胞系筛选测试化合物文库以鉴定一种或多种调节剂。测试化合物可以是化学部分，包括小分子、多肽、肽、肽模拟物、抗体或其抗原结合部分。在抗体的情况下，它们可以是非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。抗体可以是包含全互补的重链和轻链的完整抗体或任何抗体的抗原结合部分，包括抗体片段(例如Fab和Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fd、Fv、dAb等)、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、重链或轻链可变区的全部或抗原结合部分。

本发明的细胞或细胞系也可用于产生具有特殊变量的集合。例如，集合可包括：全都表达相同苦味受体和不同G蛋白以研究受体-G蛋白相互作用的细胞或细胞系；或表达多个内源性和/或异源性苦味受体以研究可能的异源多聚体的二聚化或形成的细胞或细胞系。本发明的细胞或细胞系的集合在优选实施方案中还可包括所有25种苦味受体。这样的实验对象组可用于确定化合物的中靶(on-target)对脱靶活性，或受体在纯苦味对相关(即，收敛性或金属性)味道中的作用。

本发明的细胞和细胞系可用于鉴定除了它们稳定表达的苦味受体外的GPCR途径的参与者。例如，可将表达不同G蛋白的核酸引入(瞬时或稳定地)表达相同异源性苦味受体并且优选不表达内源性苦味受体的细胞系的集合中的各细胞系。可通过例如检测将细胞与已知的苦味受体激动剂接触后细胞内游离钙的变化来测定此类G蛋白与由细胞系表达的苦味受体之间的任何相互作用。

在某些实施方案中，在基于细胞的功能性高通量筛选(HTS)中，例如使用96孔、384孔、1536孔或更高密度的版式，测试大化合物集合的苦味受体调节活性。在某些实施方案中，可使用本发明的超过一个细胞或细胞系(包括细胞系的集合)筛选测试化合物或多种测试化合物，包括测试化合物的文库。如果使用各自表达不同天然存在的或突变的苦味受体分子的多个细胞或细胞系，那么可鉴定对多个苦味受体或其突变形式或天然存在的等位基因变体有效的调节剂，或可选地对特定苦味受体或其突变形式或天然存在的等位基因变体特异并且不调节其它苦味受体或苦味受体的其它形式的调节剂。在表达人苦味受体的本发明的细胞或细胞系的情况下，可将细胞与测试化合物接触来鉴定化合物，所述化合物调节苦味受体活性(增强或降低)以用于治疗特征在于不希望的苦味受体活性或减少的所需苦味受体活性或不存在所需苦味受体活性的疾病或状况。

在某些实施方案中，在与测试化合物接触之前，可通过用例如酶包括哺乳动物或其它动物酶、植物酶、细菌酶、来自裂解的细胞的酶、蛋白质修饰酶、脂质修饰酶和口腔、胃肠道、胃或唾液中的酶进行预处理来修饰本发明的细胞或细胞系。此类酶可包括例如激酶、蛋白酶类、磷酸酶类、糖苷酶类、氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、连接酶类等。可选择地，可将细胞和细胞系首先与测试化合物接触，然后进行处理以鉴定改变处理对蛋白质的修饰的化合物。

在某些方面中，本文中提供了利用存在于细胞中的天然存在高度遗传多样性，并且有效地鉴定、选择和富集具有赋予所需性质(例如，功能性苦味受体的稳定和/或高度表达)的所需基因表达谱的细胞的方法。本方法可比常规方法更快且更有效地从遗传传上多样的细胞的集合鉴定、选择和富集具有改善的性质的细胞。在具体的实施方案中，未对细胞进行遗传修饰。在其它具体的实施方案中，本方法允许产生具有改善的性质(例如，功能性苦味受体的更稳定和/或更高的表达)的细胞的新型均一群体。

在某些实施方案中，本文中描述的方法包括选择具有一种或多种所需性质(例如，苦味受体的稳定和/或高度的表达)的天然存在的细胞。在具体的实施方案中，本文中描述的方法包括选择在一个或多个苦味受体亚单位基因中具有天然存在的变体或突变的细胞。

在具体的实施方案中，本文中描述的方法包括选择在苦味受体基因的启动子区域或苦味受体基因的非编码区(例如，内含子、5′非翻译区和/或3′非翻译区)中具有天然存在的变体或突变的分离细胞。苦味受体基因的启动子区域或苦味受体基因的非编码区中的变体或突变可导致基因产物的更高和/或更稳定的表达。在具体的实施方案中，苦味受体基因的启动子区域或苦味受体基因的非编码区已例如通过DNA的甲基化或乙酰化进行了修饰。在具体的实施方案中，细胞包括影响关于苦味受体基因的染色质重塑的表观遗传学修饰。表观遗传学修饰的非限定性实例包括但不限于乙烯化、甲基化、泛素化、磷酸化和磷酸化和类泛素化。

在某些其它实施方案中，本发明包括选择经历预处理的细胞。此类预处理可以是对日光或紫外(UV)光、诱变剂例如EMS(甲烷磺酸乙酯)和化学试剂的暴露。在具体的实施方案中，此类预处理可包括对不希望的生长条件例如低氧或低营养物条件或有毒条件的暴露。

本文中描述的方法提供了鉴定和/或选择表达一种或多种目的基因(例如，苦味受体亚单位基因)的细胞(例如，真核细胞)。在某些实施方案中，作为遗传变异性的结果，目的基因以比其它细胞更高的水平表达。

在特定的实施方案中，此处描述的方法包括(a)将一个或多个能够检测苦味受体的RNA的信号传导探针引入细胞(例如，真核细胞)；和(b)确定细胞(例如，真核细胞)是否包含苦味受体的RNA。此类方法还可包括定量苦味受体的RNA的水平。在具体的实施方案中，用于鉴定具有所需RNA表达谱的细胞的本文中描述的方法，其中所述方法包括：(a)将多个各自能够检测多个目的RNA的信号传导探针引入细胞(例如，真核细胞)；和(b)定量通过多个信号传导探针检测的RNA水平。可通过与参照群体相比较来测定所需基因表达谱。在特定的实施方案中，多个目的RNA可包括下列的RNA的任何组合：由SEQ ID NO：50-102中的任一个编码的RNA。

在具体的实施方案中，此类方法还包括分别将细胞的定量的RNA水平与参照细胞中的RNA水平比较的步骤。在具体的实施方案中，多个信号传导探针包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、500、600、700、800、900或至少1000个信号传导探针。在某些实施方案中，翻译目的RNA。在其它实施方案中，不翻译目的RNA。在具体的实施方案中，目的RNA由苦味受体亚单位基因编码。在具体的实施方案中，分离的细胞表达一种或多种重组目的RNA。

在具体的实施方案中，通过本文中描述的方法鉴定和/或选择的分离的细胞未曾进行基因改造(例如，不重组地表达一个或多个转基因)。在其它实施方案中，通过本文中描述的方法鉴定和/或选择的分离的细胞通常已进行了基因改造(例如，重组地表达一个或多个转基因)。在具体的实施方案中，此类细胞是体细胞或分化细胞。

在其它实施方案中，细胞包含所需基因表达谱。在某些实施方案中，所需基因表达谱可通过基因改造或通过增加遗传变异性来实现。在具体的实施方案中，所需基因表达谱可基于与参照群体的基因表达谱的比较来确定。

在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以比平均异种细胞群体(例如，未分选的细胞系群体，例如未分选的293T细胞群体)更高的水平表达目的RNA(例如，苦味受体的RNA)的细胞。在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以比平均异种细胞群体(例如，未分选的细胞系群体，例如未分选的293T细胞群体)高至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的水平表达目的RNA(例如，苦味受体的RNA)的细胞。在某些实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以为平均异异种细胞群体(例如，未分选的细胞系群体，例如未分选的293T细胞群体)的至少1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的水平表达目的RNA(例如，苦味受体的RNA)的细胞。

在具体的实施方案中，本文中描述的方法用于鉴定和/或选择以比平均异种细胞群体更低的水平表达目的RNA(例如，苦味受体的RNA)的细胞。示例性异种细胞群体可以是不同来源的混合细胞类型的细胞群体、遗传上异种的一种细胞类型的细胞的细胞群体或使用本文中描述的方法从其获得分离的细胞的一个特定细胞系的细胞群体。

在具体的实施方案中，使用本文中描述的方法分离的细胞是来自细胞系的细胞克隆。在某些实施方案中，使用本文中描述的方法分离的细胞是原代细胞。在某些实施方案中，使用本文中描述的方法分离的细胞是转化细胞。

在某些实施方案中，宿主细胞是人细胞人。在特定的实施方案中，细胞是来源于小鼠、大鼠、猴、狗、猫、猪、绵羊、山羊、马、鸡、蛙、蠕虫、昆虫(例如，苍蝇)、鱼、贝壳类或牛的细胞。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或真核细胞。在其它实施方案中，细胞是人细胞。在某些实施方案中，细胞是原代细胞。在其它实施方案中，细胞是转化细胞或细胞系的细胞克隆。

不受理论束缚，在它们作为苦味的作用中，苦味受体假定地已进化至将许多种具有潜在生理活性的化合物检测为具有苦味的。此类受体中的一些可在它们与更广泛的化学结构的结合或相互作用中比其它GPCR得到更宽泛的调节。因此，利用结构多样的化合物的文库测试苦味GPCR可用于鉴定与苦味受体相互作用或调节其的化合物。从而预测鉴定的化合物也调节其它GPCR的活性。

在某些更具体的实施方案中，不同的苦味受体例如表达至少2、5、10、50或至少100种不同苦味受体的细胞系的对象组可用于鉴定对于与此类苦味受体最紧密相关的其它GPCR的相关的化学空间。相反地，对于具有更低的与GPCR相互作用的概率的化合物，可以富集未发现与苦味受体相互作用的化学空间。

在某些实施方案中，根据此类方法的GPCR和非GPCR化学空间的定义可用于富集在HTS过程中可能命中的化学品文库，这取决于使用GPCR还是非GPCR。类似地，相同的信息可用于指导药物化学尝试，例如在可优化非GPCR靶的开发中的化合物以排除可成为不希望的与GPCR相互作用的基础的功能性。

可以以高通量形式进行用于本发明的方法的任何测定。

在某些实施方案中，如果蛋白质复合物是苦味受体，那么可使用钙动员试验测量苦味受体的活性。

化合物之间结构共性的鉴定

提供了用于鉴定调节蛋白质复合物的化合物之间的结构共性的系统和方法。在某些实施方案中，蛋白质复合物可以是细胞表达受体，其为G蛋白偶联受体。在具体的实施方案中，蛋白质复合物可以是苦味受体。可使用本文中公开的任何系统和方法鉴定调节蛋白质复合物的化合物。可以例如通过将许多候选化合物分别与已进行改造以表达蛋白质复合物的细胞接触，并且测定每一种候选化合物对蛋白质复合物的活性的效应来鉴定此类化合物，其中可使用各候选化合物对蛋白质复合物的生物活性的效应的多个定量测量来确定效应。在具体的实施方案中，可针对蛋白质复合物筛选候选化合物的文库以鉴定可调节蛋白质复合物的化合物。目的化合物对蛋白质复合物的效应可用活性谱来表示。此类定量测量的非限定性实例包括来源于本文中论述的测定的定量测量。每一种目的化合物可利用描述化合物的结构和其它性质的分子表示来表示。在具体的实施方案中，目的化合物的分子表示可包括在数学上描述化合物的结构特征的结构描述符。结构和其它类型的描述符在下文中进行描述。可使用结构-活性关系(SAR)模型来在数学上使目的化合物的一个或多个描述符与化合物的生物活性发生关系，如从化合物的活性谱观察到的。

提供了用于鉴定调节蛋白质复合物的化合物之间的结构共性的系统和方法，其可包括使用化合物的分子表示和其活性谱构建目的化合物的一个或多个SAR模型，基于该SAR模型鉴定与各自化合物的活性谱相关的每一个化合物的一个或多个结构特征，以及鉴定对每一个化合物鉴定的一个或多个结构特征中对于化合物是共同的至少一种结构特征。在具体的实施方案中，可利用各自化合物的分子表示和各自化合物的活性谱构建每一个目的化合物的SAR模型。在下文中论述结构-活性关系(SAR)模型。

根据SAR模型，可鉴定与各自化合物的活性谱相关的每一个目的化合物的一个或多个结构特征。从此类特征之中，可鉴定对于全部目的化合物是共同的一个或多个结构特征(结构共性)。在某些实施方案中，可利用计算机建模技术显现目的化合物的三维原子结构。在具体的实施方案中，可使用计算机建模技术显现目的化合物的结构共性。分子的三维结构可依赖于来自选择的分子的X射线晶体学分析或NMR成像的数据。力场数据可用于产生目的化合物的分子动力学的模型和/或结构共性。分子建模程序的实例为CHARMm和QUANTA程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)。

化合物的分子表示

目的化合物的分子表示可包括多个描述化合物的特征和性质的描述符。描述符可以是拓扑学、结构、物理化学和/或空间类型的描述符。给定的化合物可由多个描述符表示，包括化合物的亚结构组分或部分、化学官能团的距离、空间、2D或3D拓扑学、电化学、电生理和量子机械性能。在具体的实施方案中，目的化合物可由结构描述符表示。化合物的结构描述符的实例可包括但不限于原子类型、分子量(MW)、化合物中可旋转键(Rotlbond)的数目、氢键供体(H键供体)的数目、氢键受体(H键受体)的数目、手性中性(R或S)的数目、3D分子矩、亚结构性质、分子性质和量子机械性能。拓扑学描述符的非限定性实例包括Balaban指数(Jx)、κ形状指数、柔性、子图计数、连结性(connectivity)、Wiener指数、Zagreb指数、连接性指数、Hosoya指数和E状态键(E-sate key)。物理化学(或热力学)描述符的非限定性实例包括分配系数的对数(AlogP)、分配系数、原子类型值(atom-typevalue)(AlogP98)、辛醇/水分配系数(LogP)的对数、摩尔折射率(MR)和摩尔折射性(MolRef)。空间描述符的非限定性实例包括回旋半径(RadOfGyration)、Jurs电部分表面域(Jurs charged partial surface area)描述符(Jurs)、表面域投影(surface area projection)(阴影指数)、分子表面积(面积)、密度、分子体积(Vm)和主惯性矩(PMI)。电子描述符的非限定性实例包括电荷、原子极化率之和(Apol)、最高己占有分子轨道能(HOMO)、最低空余分子轨道能(lowest unoccupied molecularorbital energy)(LMMO)和超非定域性(Sr)。多种描述符的说明可见于称为QSAR描述符的网站，其可从The Scripps Research Institute(LaJolla CA)获得。定义还可见于例如面向Cerius2软件(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)或Accelrys QSAR软件产品(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)的网站。

可使用用于确定分子结构的计算机程序推断目的化合物的多个描述符的值。例如，可使用GRID程序(Molecular Discovery Ltd.，Middlesex，UK)确定已知结构的化合物上在能量上有利的结合位点，所述结合位点可在QSAR分析中用作描述符输入。同样地，进行QSAR分析的多个程序也可用于推断目的化合物的描述符的值，例如Accelrys QSAR软件产品(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)。在另一个实施例中，可用作目的化合物的描述符的信息可获自化合物结构的数据库，例如可Accelrys Chemicals Available for Purchase(CAP)数据库(Accelrys Inc.，San Diego，CA)。

结构和活性关系模型

SAR模型可用于在数据上使目的化合物的描述符与化合物的生物活性发生关系。目的化合物的生物活性可由化合物的活性谱提供。可使用描述符和算法的不同组合构建SAR模型来建立可用于分类其它化合物的模型。例如，预测一类调节蛋白质复合物的化合物的结构特征的SAR(其可使用一组彼此高度相似的训练化合物来构建)可用于分类据认为与训练组相似的其它化合物。

SAR算法可用于描述相关化学描述符与观察到的生物活性的潜能之间的数学关系，即，活性Y是描述符X的函数，[Y＝f(X)]。本领域内用于数据询问的任何算法可用于构建SAR模型。作为非限定性实例，可用于构建SAR模型的程序包括可进行普通多元回归(OMR)、逐步回归(SWR)、所有可能子集回归(PSR)和偏最小二乘(PLS)回归以及遗传算法(GA)的程序。在具体的实施方案中，化合物的SAR模型可采取线性方程式的形式：

A0+(A1M1)+(A2M2)+(A3M3)+...(AnMn)

其中参数M1至Mn是化合物的分子表示中的不同描述符，A0为常数，并且系数A1至An通过将参数M1至Mn的变化与化合物的生物活性(例如由活性谱提供的)拟合来计算。该SAR模型可使用本领域内的任何回归技术来拟合。例如，可使用普通多元回归来计算独立变量(例如，被采用来作为描述符的)与因变量(例如，被采用来作为活性谱的)的最小二乘法拟合。可用于例如通过进行定量结构-活性关系分析(QSAR)来提供SAR模型的软件的实例包括但不限于AccelrysQSAR软件(Accelrys Inc.，San Diego，CA)和Quasar 5，6D-QSAR软件产品(Biographies Laboratory 3R，Basel，Switzerland)。其它SAR模型描述于Selassie，CD.，“History of Quantitative Structure-ActivityRelationships”，Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第6版，第1卷：Drug Discovery，其通过引用整体并入本文。

可为目的化合物构建的SAR模型的实例包括但不限于受体依赖性自由能力场QSAR(FEFF-QSAR)、不依赖于受体的三维QSAR(3D-QSAR)和受体依赖性或不依赖于受体的四维QSAR(4D-QSAR)。

不依赖于受体的3D-QSAR。可用于提供使由化合物展示的特定性质的量级与化合物的一个或多个结构特征和/或物理性质相关的工具的方法是不依赖于受体的3D-QSAR分析。受体几何形状在不依赖于受体的3D-QSAR分析的进行中可以是未知的。不依赖于受体的QSAR可适用于一系列化学类似物，基于化合物共有共同的作用机制的假设，所述化学类似物的依赖性(即，生物活性)性质来源于一组分子内描述符。回归分析可用于将化合物的描述符与活性谱的不同量度拟合以进行不依赖于受体的3D-QSAR分析。

受体依赖性3D-QSAR。另一个方法可用使用受体依赖性3D-QSAR(也称为自由能力场QSAR(FEFF-QSAR)。关于受体依赖性3D-QSAR分析，受体几何形状是已知的。可计算自由能力场配体-受体结合能项，将其用作QSAR评分功能的独立变量。参见，例如，Tokarski和Hopfinger(1997)，J.Chem.Inf.Computer Sci.37：792-811，其通过引用整体并入本文。

受体依赖性或不依赖于受体的4D-QSAR。4D-QSAR模型可通过对一组训练化合物进行分子状态总体平均化(第四维)来利用3D-QSAR分析合并构象和比对自由度。在4D-QSAR分析中，就相互作用药效团的原理(IPE)而言，有人认为化合物活性的差异可与分子形状的玻尔兹曼平均空间分布的差异相关。可对一组训练化合物中的每一个化合物假定单个“活性”构象。可将4D-QSAR分析可与另外的分子设计应用(包括不依赖于受体的3D-QSAR和FEFF-QSAR模型)一起使用。4D-QSAR模型描述于Duca和Hopfinger(2001)，J Chem InfComput Sci 41(5)：1367-87，其通过引用整体并入本文。

仪器、计算机和计算机程序产品实现

可作为包括植入计算机可读存储介质中的计算机程序机制的计算机程序产品执行本发明。此外，可在一个或多个计算机或其它形式的装置中执行本发明的任何方法。装置的实例包括但不限于计算机和测量设备(例如，测定读取器或扫描仪)。此外，可在一个或多个计算机程序产品中执行本发明的任何方法。本发明的一些实施方案提供了编码本申请中公开的任何或所有方法的计算机程序产品。此类方法可存储在CD-ROM、DVD、磁盘存储产品或任何其它计算机可读数或程序存储产品上。此类计算机可读存储介质倾向于为可触摸的物理物体(与载波相反)。此类方法还可植入永久存储器例如ROM、一个或多个可编程芯片或一个或多个专用集成电路(ASIC)中。此类永久存储器可置于服务器，802.11通路点、802.11无线连接/站、中继器、路由器、移动电话或其它电子设备中。还可通过因特网或另外通过数字地或于载波上(很清楚载波的此类用途是用于分配而非存储)传输计算机数据信号(其中植入软件模块)电子地分配计算机程序产品中植入的此类方法。

本发明的一些实施方案提供了计算机程序产品。这些程序模块可存储在CD-ROM、DVD、磁盘存储产品或任何其它计算机可读数据或程序存储产品。还可将程序模块植入永久存储器例如ROM、一个或多个可编程芯片、一个或多个专用集成电路(ASIC)中。这样的永久存储器可置于服务器，802.11通路点、802.11无线连接/站、中继器、路由器、移动电话或其它电子设备中。还可通过因特网或另外通过数字地或于载波上传输计算机数据信号(其中植入软件模块)电子地分配计算机程序产品中的软件模块。

在具体的实施方案中，计算机程序提供了将所述方法的结果输出至用户、用户接口设备、计算机可读存储介质、监视器、本地计算机或作为网络的部分的计算机。此类计算机存储介质倾向于为可触摸的物理目体(与载波相反)。

可在下列非限定性实施例中进一步举例说明这些实施方案和本发明的其它实施方案。

实施例

实施例1产生稳定的表达GABAA的细胞系

产生表达载体

基于pCMV-SCRIPT(Stratagene)产生允许流水线克隆的质粒表达载体，并且包含用于转录和翻译目的基因的多种所需组分，包括CMV和SV40真核启动子；SV40和HSV-TK多腺苷酸化序列；多克隆位点；Kozak序列和新霉素/卡那霉素抗性盒。

步骤1：转染

我们转染293T和CHO细胞。该实施例聚焦在CHO细胞，其中CHO细胞用3种单独质粒以下述组合进行共转染：α1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)和α5β3γ2s(α5)，一种质粒编码人GABA α亚单位(SEQ ID NO：1-4)，一种质粒编码人GABAβ3亚单位(SEQ IDNO：5)并且另一种质粒编码人GABAγ2亚单位(SEQ ID NO：6)。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine2000、Oligofectamine、TFX试剂、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或Fecturin。

尽管药物选择在本发明的方法是任选的，我们还是包括一种药物抗性标记/质粒。序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的靶序列是GABA靶序列1(SEQ ID NO：7)、GABA靶序列2(SEQ ID NO：8)和GABA靶序列3(SEQ ID NO：9)。在这些实例中，包含GABA α亚单位基因的载体包含GABA靶序列1、包含GABA β亚单位基因的载体包含GABA靶序列2，并且包含GABAγ亚单位基因的载体包含GABA靶序列3。

步骤2：选择步骤

经转染的细胞在HAMF12-FBS中培养2天，随后含抗生素的HAMF12-FBS中14天。含抗生素的时期具有如下的加入培养基的抗生素：嘌呤霉素(3.5μg/ml)、潮霉素(150μg/ml)和G418/新霉素(300μg/ml)。

步骤3：细胞传代

在抗生素选择后，并且在引入荧光探针之前，将细胞在不存在抗生素的情况下传代6至18次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。

步骤4：细胞与荧光探针接触

收获细胞并且用GABA信号传导探针(SEQ ID NO：10-12)进行转染。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用以将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX reagents、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或F ecturin。

GABA信号传导探针1结合GABA靶序列1，GABA信号传导探针2结合GABA靶序列2并且GABA信号传导探针3结合GABA靶序列3。随后收集细胞用于分析且使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选(下文)。

通过信号传导探针检测的靶序列

GABA靶1

5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3′(SEQ ID NO：7)(α亚单位)

GABA靶2

5′-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3′(SEQ ID NO：8)(β亚单位)

GABA靶3

5′-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3′(SEQ ID NO：9)(γ亚单位)

信号传导探针

作为100μM贮备液供应

GABA信号传导探针1-结合(GABA靶1)

5′-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3猝灭-3′(SEQ ID NO：10)

GABA信号传导探针2-结合(GABA靶2)

5′-Cy5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3猝灭-3′(SEQ ID NO：11)

在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的QuasarDye(BioSearch)的相似探针。还应当指出在某些情况下使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。应当指出BHQ3可以由探针1或探针2中的BHQ2或金颗粒置换。

GABA信号传导探针3-结合(GABA靶3)

5′-Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGCBHQ1猝灭-3″(SEQ ID NO：12)

应当指出BHQ1可以由探针3中的BHQ2或Dabcyl置换。

步骤5：阳性细胞的分离

使细胞解离并且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离至有条形码的96孔板内。门控层次如下：门控层次：符合门(coincidence gate)＞单峰门(singlets gate)＞活门(live gate)＞分选门(Sort gate)。用这种门控策略，标记出三重阳性细胞的顶端0.04-0.4％用于分选到有条形码的96孔板内。

步骤6：步骤1-5和/或3-5的另外循环

重复步骤1-5和/或3-5以获得更大数目的细胞。完成步骤1-5的2个独立循环，并且对这些循环中的每一个，执行步骤3-5的至少3个内部循环用于独立循环的合计。

步骤7：细胞群体的长速率的估计

将平板转移至Hamilton Microlabstar自动化液体处理器。使细胞在2-3天条件生长培养基：新鲜生长培养基(生长培养基为Ham′sF12/10％FBS)的1∶1混合物中温育5-7天，其中补充有100单位青霉素/ml加上0.1mg/ml链霉素，并且随后使用0.25％胰蛋白酶通过胰蛋白酶消化进行分散，以使凝块降至最低，并且转移至新96孔平板。在克隆分散后，使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依赖报告的超过70％的汇合。在经过9天(在分散后第1和10天之间)每3次的天数时获得汇合测量，并且用于计算生长速率。

步骤8：根据生长速率估计框并细胞群体

根据步骤7中的分散步骤后10-11天之间的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期组群涂铺)。独立地收集框并且涂铺在个别96孔平板上以用于下游处理，并且可以存在超过一块靶平板/特定框。通过考虑生长速率的扩展且将覆盖细胞群体总数目的高百分比的范围归为同类来计算框。依赖于分选反复操作(参见步骤5)，使用具有1-4天分隔的5-6个生长框。因此每个框对应于在12-14.4小时之间的生长速率或群体倍增时间差，依赖于反复操作。

步骤9：重复涂铺以加快平行加工且提供严格QC

使平板在标准和固定条件(湿润的37℃、5％CO₂/95％空气)下在不含抗生素的Ham′s F12培养基/10％FBS中温育。使细胞的平板分开，以产生4组(组由关于所有生长框的所有平板组成-这些步骤确保起始组的4个重复)靶平板。高达2块靶平板组提交用于低温保存(参见下文)，并且其余组按比例放大，并且进一步重复涂铺，用于传代和用于功能测定实验。不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源用于每个独立执行的平板组。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质；加入到制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除跨越孔的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。

步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种

使至少2组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许每个组中的平板达到70至100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板使用Parafilm密封，并且随后用1至5cm泡沫分别围绕，并且放置至-80℃冷藏库中。

步骤11：用于产生VSF的起始转化步骤的方法和条件

其余平板组如步骤9中所述进行维持(上文)。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。

步骤12：校正生长速率的任何其余变异性的标准化方法

控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过跨越平板细胞数目的定期标准化，可以控制由于生长速率中的轻微差异导致的跨越平板的任何差异。

步骤13：细胞群体的表征

使细胞维持6-8周的细胞培养，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时程中，我们观察大小、形态、脆性、对胰蛋白酶消化或解离的应答、解离后的圆形/平均圆形度、活力百分比、朝向微汇合的趋势、或细胞维持的其它方面例如与培养平板表面的附着。

步骤14：细胞群体在VSF条件下的潜在功能性的评估

使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用膜电位测定试剂盒(Molecular Devices/MDS)。细胞在96或384孔平板中以多种不同密度进行测试并且分析应答。使用涂铺后的各个时间点，例如涂铺后12-48小时。还测试不同的涂铺密度的测定应答差异。

步骤15

比较来自在低和较高代数下执行的实验的功能应答，以鉴定经过3-9周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还指出注意随着时间推移改变的其它细胞特征，包括形态、朝向微汇合的趋势、和涂铺后与培养基质附着的时间。

步骤16

对符合功能和其它标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些细胞群体。所选择的细胞群体在更大的组织培养皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤用于一致和可靠地传代。这些包括不同的涂铺细胞密度、传代时间、培养皿大小/形式和包被、流体学最佳化、细胞解离最佳化(类型、所用体积和时间长度)、以及洗涤步骤。当经过培养中的4周过程每数天进行测定时，测定Z′得分最稳定的。

此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择显示一致生长、合适附着以及功能应答的最终细胞系和备份细胞系。

步骤17：细胞库的建立

与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻平板(参见上文)在37℃下解冻，用Ham′s F12/10％FBS洗涤2次，并且在湿润的37℃/5％CO₂条件下温育。细胞随后扩增2-3周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的细胞库，每个细胞系的库由各具有10,000,000细胞的25个小瓶组成。

步骤18

使用来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得的细胞，以证实它们符合它们最初就其进行选择的相同特征。

实施例2 GABA _A 细胞系响应GABA配体的验证

评估表达GABA_A(α1β3γ2s(α1)、(α2β3γ2s(α2)、(α3β3γ2s(α3)、和α5β3γ2s(α5)的亚单位组合)的CHO细胞系对内源GABA_A配体的应答。使用下述方案，通过测量响应GABA的GABA_A膜电位，评估细胞系与GABA的相互作用。

在测定前24小时，细胞在生长培养基(Ham’s F-12培养基加上FBS和谷氨酰胺)中在384孔平板中以10-25,000细胞/孔涂铺。去除培养基，随后添加在装载缓冲液(137mM NaCl、5mMKCl、1.25mMCaCl、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的膜电位染料，温育1小时，随后将平板装载到高通量荧光平板读取器(Hamamastu FDSS)上。使GABA配体在MP测定缓冲液(137mM NaCl、5mM葡萄糖酸钾、1.25mM CaCl₂、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释至所需浓度(需要时，产生GABA的连续稀释，所用浓度：3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM)，并且加入每个孔中。读取平板90秒。

表6(下文)证实所产生的细胞系的各自响应GABA配体。这些结果指示如预期的响应内源配体的所产生的GABA_A细胞系，对于在高通量筛选测定中使用是生理学相关的。此外，复制孔产生孔到孔之间的精确EC₅₀值，指示GABA_A细胞系的高重现性。使用膜电位测定产生的Z′值是α1β3γ2s 0.58、α2β3γ2s 0.67、α3β3γ2s 0.69和α5β3γ2s 0.62。

实施例3使用已知的GABA _A 调节剂另外验证GABA _A 细胞系

使用在荷包牡丹碱(已知拮抗剂)的测定缓冲液中以30μM、10μM、3μM、1μM、300nM、100nM、30nM的系列稀释，通过实施例2中描述的方法验证GABA_A细胞系和膜电位测定。

发现在GABA的EC₅₀浓度的存在下，荷包牡丹碱与所有4个GABA_A细胞系相互作用。这些结果指示如预期的响应GABA_A的这种已知调节剂的所产生的GABA_A细胞系，对于在高通量筛选测定中使用是生理学和药理学相关的。

实施例4使用膜电位测定就天然GABA _A 功能表征表达GABA _A 细胞系

评估表达GABA_A(α1β3γ2s(α1)、(α2β3γ2s(α2)、(α3β3γ2s(α3)、和α5β3γ2s(α5)的亚单位组合)的CHO细胞系与来自LOPAC 1280(Libraryof Pharmacologically Active Compounds)的1280种化合物的相互作用(Sigma-RBI产品编号L01280)。LOPAC 1280文库包含具有充分证明的药理学活性的高纯度、小有机配体。使用下述方案，通过测量响应测试化合物的GABA_A的膜电位，评估细胞系与测试化合物的相互作用。

在测定前24小时，细胞在生长培养基(Ham′s F-12培养基加上FBS和谷氨酰胺)中在384孔平板以10-25,000细胞/孔涂铺。去除培养基，随后添加在装载缓冲液(137mM NaCl，5mM KCl，1.25mMCaCl₂，25mM HEPES，10mM葡萄糖)中稀释的膜电位染料。温育为1小时，随后将平板装载到高能量荧光平板读取器(Hamamastu FDSS)上。使测试化合物在MP测定缓冲液(137mM NaCl，5mM葡萄糖酸钾，1.25mM CaCl₂，25mM HEPES，10mM葡萄糖)中稀释至所需浓度(需要时，产生每种测试化合物的连续稀释，所用浓度：3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM)，并且加入每个孔中。读取平板90秒。

结果

测量每种化合物针对所产生的GABA_A细胞系的活性，并且显示与GABA(内源配体)相似或更大活性的化合物评分为阳性命中。在筛选的1280种化合物中，34种激活至少一个细胞系(即，或者α1、α2、α3和α5)，以及如果不优于GABA。这些化合物中的17种与所产生的GABA_A细胞的相互作用在下述剂量应答研究中加以证实。需要GABA存在的调节剂、部分激动剂和低效力化合物不包括在列表中。

筛选测定鉴定LOPAC文库中的每种GABA_A激动剂：GABA(内源配体)、丙泊酚、异去甲槟榔次碱盐酸盐、蝇蕈醇氢溴化物、哌啶-4-磺酸、3-α，21-二羟基-5-α-孕烷-20-酮(神经类固醇)、5-α-孕烷-3α-醇-11，20-二酮(神经类固醇)、5-α-孕烷-3α-醇-20-酮(神经类固醇)和曲卡唑酯。结果指出所产生的GABA_A细胞系以生理学相关方式响应(例如，它们响应内源受体的激动剂)。测定关于这8种激动剂的EC₅₀值，并且包括在表6(下文)中。

筛选测定还鉴定了在LOPAC文库中未描述为GABA激动剂但已知具有与GABA_A相关的其它活性的4种化合物，注意到它们是：依他唑酯(磷酸二酯酶抑制剂)、雄酮(类固醇激素)、氯美扎酮(肌肉松弛药)和伊维菌素(已知影响氯通道的抗寄生虫药)。测定关于这4种化合物的EC₅₀值，并且概括于表6(下文)中。

筛选测定进一步鉴定了在LOPAC文库中迄今为止未知与GABA_A相互作用的4种化合物。这些新型化合物包括：双嘧达莫(dipyrimidole)(腺苷脱氨酶抑制剂)、氯硝柳胺(抗寄生虫药)tyrphosinA9(PDGFR抑制剂)和I-Ome-Tyrphosin AG 538(IGF RTK抑制剂)。测定关于这4种化合物的EC₅₀值，并且概括于表6(下文)中。

筛选测定的结果概括于表6中：

实施例5使用电生理学测定就天然GABA _A 功能表征GABA _A -CHO 细胞

使用下述电位钳法方案：将膜电位夹紧至-60mV的保持电位。通过增加浓度的GABA(0.10-100μM)的2秒应用激发电流，伴随用缓冲液的中间洗涤。

关于α2、α3和α5GABA_A细胞系响应100μM GABA，以及α1GABA_A细胞系响应增加浓度的GABA(以对数增量的0.10-100μM)的全细胞感受器电流跟踪，证实除上文描述的高通量筛选测定外，GABA_A细胞系还可以用于常规电生理学测定中。这些电生理学测定结果连同实施例2的膜电位测定，证实本文产生的GABA_A细胞系生理学和药理学相关性。电生理学被公认为检测GABA_A受体的调节剂的可靠方法。我们的数据指出使用膜电位测定，本发明的细胞系可以产生相似的可靠结果。现有技术的细胞系不够可靠或不够灵敏以有效利用比电生理学更便宜且快速的这种膜电位测定。因此，本发明的细胞系允许在比使用电生理学可获得的大得多的规模上的筛选(与使用电生理学小于100次/天相比较，使用膜电位测定10,000次测定/天)。

实施例6使用卤化物敏感的meYFP就天然GABA _A 功能的细胞内读数测定的表征

使用用于细胞内读数测定的下述方案，评估本发明表达GABA_A(α1β3γ2s(A1)、(α2β3γ2s(A 2)、(α3β3γ2s(A 3)、和α5β3γ2s(A 5)的亚单位组合)的CHO细胞系对测试化合物的应答。

在测定前24小时，细胞在生长培养基(Ham’s F-12培养加上FBS和谷氨酰胺)中在384孔平板中以10-25,000细胞/孔涂铺。去除培养基，随后添加装载缓冲液(135mM NaCl、5mM KCl、2mMCaCl₂、1mMMgCl₂、10mM HEPES、10mM葡萄糖)，并且温育1小时。随后将测定平板装载到FDSS(Hamamatsu Corporation)上。使测试化合物(例如，GABA配体)在测定缓冲液(150mM NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl₂、1mM MgCl₂、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释至所需浓度(需要时，产生每种测试化合物的连续稀释，所用有效浓度：3nM、10nM、30nM、100nM，300nM、1μM、3μM、10μM)，并且加入每个孔中。读取平板90秒。

响应增加浓度的GABA配体，GABA_A-meYFP-CHO细胞显示增加的meYFP信号猝灭。这种猝灭可以用于计算关于GABA激活的剂量应答曲线。通过细胞内读数测定产生的GABA剂量应答曲线类似于通过实施例3中描述的膜电位蓝色测定产生的曲线。这些数据证实本发明的细胞可以在细胞内读数测定中用于测定GABA_A的调节剂。

实施例7产生稳定的表达GC-C的细胞系

使用标准技术有编码人GC-C基因(SEQ ID NO：15)的质粒转染293T细胞。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于，LIPOFECTAMINE^TM、LIPOFECTAMINE^TM 2000、OLIGOFECTAMINE^TM、TFX^TM试剂、

DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURIN^TM。)

尽管药物选择在本发明的方法是任选的，我们还是在编码人GC-C基因的质粒中包括一种药物抗性标记。GC-C序列序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的靶序列是GABA靶序列1(SEQ ID NO：13)。在本实例中，包含GC-C基因的载体包含GC-C靶序列1。

经转染的细胞在DMEM-FBS中培养2天，随后在含500μg/ml潮霉素的DMEM-FBS中培养10天，然后在DMEM-FBS中进行剩余的时间，在加入信号传导探针之前在DMEM/10％FBS中总共进行4至5周(取决于哪个独立的分离)。

在抗生素上富集后，细胞在不存在抗生素选择的情况下传代8-10次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。

收获细胞并且用GC-C信号传导探针1(SEQ ID NO：14)转染，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINE^TM、LIPOFECTAMINE^TM2000、OLIGOFECTAMINE^TM、TFX^TM试剂、

DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURIN^TM。)随后使细胞解离且收集用于分析，并且使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。

通过GC-C信号传导探针1检测的GC-C靶序列1

5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3′(SEQ ID NO：13)

GC-C信号传导探针1

(作为100μM贮备液供应)

5′-Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2-3′(SEQ ID NO：14)

此外，在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的

(BioSearch)的相似探针。在某些实验中，使用5-MedC和2-氨基dAmixmer探针而不是DNA探针。

使细胞解离且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离到有条形码的96孔平板内。在小区FAM与Cy5相比较：0.3％活细胞中使用下述门控层次：

符合门→单峰门→活门→分选门。

重复上述步骤以获得更大数目的细胞。执行所有上述步骤的2个轮次。此外，对于独立转染轮次之一，细胞传代、与信号传导探针接触和通过荧光激活细胞分选器分离阳性细胞的步骤顺序执行总共2次。

将平板转移至MICROLAB STAR^TM(Hamilton Robotics)。使细胞在新鲜完全生长培养基和2天条件生长培养基的100μl 1∶1混合物中温育9天，其中补充有100U青霉素和0.1mg/ml锭霉素，通过胰蛋白酶消化分散2次，以使凝块降到最低，并且转移至新96孔平板。使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。在连续3天时获得汇合测量，并且用于计算生长速率。

根据在分散步骤后3天的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期群组涂铺)。4个生长框每一个分离到各自96孔平板内；某些生长框产生超过一块96孔平板。通过考虑生长速率的扩展且将覆盖细胞群体总数目的高百分比的范围归为同类来计算框。计算框以捕获生长速率中的12小时差异。

细胞可以具有小于1天到超过2周的倍增时间。为了加工同时可以根据生长速率合理框并的最分散的克隆，优选使用具有0.25-0.7天倍增时间/框的3-9个框。本领域普通技术人员应当理解，对于具体情况可以调整框的紧密度和框的数目，并且如果细胞依据其细胞周期进行同步，那么可以进一步调整框的紧密度和数目。

使平板在标准和固定条件(DMEM/FBS、37℃、5％CO₂)不含抗生素下温育。使细胞的平板分开，以产生5组96孔平板(3组用于冷冻，1组用于测定和1组用于传代)。对于平板组各自在工作流下游使用不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。

使1组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许组中的平板达到70-100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板用Parafilm分别密封，通过1-5cm泡沫材料围绕，并且放置到冷藏库中。

其余2组平板在如上所述的标准和固定条件下维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。

控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过跨越平板的细胞数目的标准化，控制由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异，并且在重新排列后3次传代发生。检测并消除其为异常值的细胞群体。

使细胞维持3-6周，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时程中，观察大小、形态、朝向微汇合的趋势、脆性、对胰蛋白酶消化的应答和胰蛋白酶消化后的平均圆形度、或细胞维持的其它方面例如与培养平板表面的附着和对流体添加后的喷出的抵抗力。

使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书：(http://www.assaydesigns.com/objects/catalog//product/extras/900-014.pdf)使用Direct Cyclic GMP EnzymeImmunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)。细胞在96或384孔平板中以4种不同密度进行测试并且分析应答。下述条件用于本发明的表达GC-C的细胞系：

克隆筛选：在测定前48小时汇合的96孔平板的1∶2和1∶3拆分，30分钟鸟苷蛋白处理。

剂量应答研究：20,000、40,000、60,000、80,000、120,000和160,000/孔的密度，30分钟鸟苷蛋白处理(参见实施例8)。

Z’研究：160,000和200,000/孔的密度，30分钟鸟苷蛋白处理(参见实施例10)。

比较来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答，以鉴定经过4-10周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还注意随着时间推移而改变的其它细胞特征。

对符合功能和其它标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些细胞群体。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤，例如不同的细胞密度；涂铺的时间、细胞培养传代的长度；细胞培养皿形式和包被；流体学最佳化，包括速度和剪力；传代时间；和洗涤步骤，用于一致和可靠传代。此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择这样的最终细胞系和备份细胞系(总共20个克隆).当根据这个过程且在这些条件下产生时，其显示合适附着/粘稠度和生长速率和甚至涂铺(缺乏微汇合)。

通过经由24孔、6孔和10cm皿在DMEM/10％FBS/HEPES/L-Glu中扩增来自重新排列的96孔平板的非冷冻群体，产生所选择的20个克隆各自3个小瓶的起始冷冻原种。与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻原种在37℃下解冻，用包含FBS的DMEM洗涤2次，并且以相同方式温育。细胞随后扩增2-4周的时间段。选择2个最终克隆。

使来自起始冷冻的一个克隆的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以证实它们符合它们最初依据其进行选择的相同特征。可以建立由20至超过100个小瓶组成的关于每个细胞系的细胞库。

还可以执行下述步骤以证实细胞系是活的、稳定的和有功能的：使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增；测试所得到的细胞，以测定它们是否符合它们最初依据其进行选择的相同特征。

实施例8细胞系就GC-C天然功能的表征

用于检测cGMP的竞争性ELISA用于表征在所产生的表达GC-C的细胞系中的天然GC-C功能。将表达GC-C的细胞维持在标准细胞培养条件下在达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)中并且在T175cm烧瓶中生长，所述DMEM补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺和HEPES。为了进行ELISA，将细胞涂铺到经包被的96孔平板(聚D-赖氨酸)内。

细胞处理和细胞裂解方案

细胞用无血清培养基洗涤2次，并且与1mM IBMX温育30分钟。随后将所需激活剂(即，鸟苷蛋白，0.001-40μM)加入细胞中，且温育30-40分钟。去除上清液，并且用TBS缓冲液洗涤细胞。用0.1N HCl裂解细胞。这随后为用0.1N HCI的裂解和在-20℃/室温下的冻/融循环。使化冻的裂解物(使样品在EppendorF管中在10,000rpm下旋转)离心，以使细胞碎片形成凝块。随后将澄清的上清裂解物转移至ELISA平板。

ELISA方案

除非另有说明，否则所有下述步骤都在室温下执行。ELISA平板在包被缓冲液(碳酸钠盐/碳酸氢钠盐缓冲液，最终为0.1M，pH 9.6)中用抗IgG抗体在4℃下包被过夜。随后用洗涤缓冲液(TBS-Tween20，0.05％)洗涤平板，随后阻断试剂添加。在37℃下与阻断试剂温育1小时，随后用洗涤缓冲液洗涤平板。随后加入兔抗cGMP多克隆抗体(Chemicon)，随后温育1小时和用洗涤缓冲液的后续洗涤。随后加入细胞裂解物，并且在后续添加cGMP-生物素缀合物(1和10nM 8-生物素-AET-cGMP(Biolog))前温育1小时。使平板温育2小时，并且随后用洗涤缓冲液洗涤。随后加入链霉亲和素碱性磷酸盐并且温育1小时，随后用洗涤缓冲液洗涤。使平板与PNPP底物(Sigma)温育至少1小时(优选2-5小时)。随后在SAFIRE^2TM平板读取器(Tecan)上读取在405nm处的吸光度。

当在ELISA中不使用细胞裂解物时(对照)，可见最大吸光度。用来自用100nM鸟苷蛋白(克隆)处理的所产生的表达GC-C的细胞系的细胞裂解物观察到吸光度中的减少(对应于增加的cGMP水平)。

使用Direct Cyclic GMP Enzyme Immunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.).还使在用100nM鸟苷蛋白处理的所产生的表达GC-C的细胞系中的cGMP水平与不表达GC-C的亲本细胞系对照样品的那种(未显示)相比较。与用鸟苷蛋白处理和未处理的亲本细胞相比较，表达GC-C的细胞系显示吸光度中更大的减少(对应于增加的cGMP水平)。

对于鸟苷蛋白剂量应答实验，在96孔平板中以20,000、40,000、60,000、80,000、120,000和160,000细胞/孔的密度涂铺的、所产生的表达GC-C的细胞系的细胞，用增加浓度的鸟苷蛋白攻击30分钟。使用SAFIRE^2TM平板读取器(Tecan)，检测作为cGMP水平中改变的函数的细胞应答(即，吸光度)(如使用Direct Cyclic GMPEnzymelmmunoassayKit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)测量的。随后作为鸟苷蛋白浓度的函数绘制数据，并且使用非线性回归分析使用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，产生1.1nM的EC₅₀值。与在其它细胞系中先前报告的相比较(3.5pmol/ml)(Fore等人，Endocr.140(4)：1800-1806(1999))。当用低浓度的鸟苷蛋白处理时，所产生的表达GC-C的细胞系显示更高水平的cGMP(6pmol/ml)，指示克隆的效力。

实施例9表达GC-C的细胞系Z′值的产生

使用直接竞争性ELISA测定计算关于所产生的表达GC-C的细胞系的Z′。使用Direct Cyclic GMP Enzyme Immunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)执行ELISA。具体地，对于Z′测定，在96孔测定平板中的24个阳性对照孔(以160,000或200,000细胞/孔的密度涂铺)用40μM鸟苷蛋白和IBMX在DMEM培养基中的GC-C激活混合物(cocktail)攻击30分钟。考虑96孔测定平板的体积和表面积，鸟苷蛋白的这个量产生与由Forte等人(1999)Endocr.140(4)，1800-1806使用的10μM可比较的浓度。包含在DMEM/IMBX中的克隆细胞的相等数目的孔用单独的媒介物(在不存在激活剂的情况下)进行攻击。使用SAFIRE^2TM平板读取器(Tecan)监控在2种条件中的吸光度(对应于cGMP水平)。计算在2种条件中的平均值和标准差，并且使用Zhang等人，J Biomol Screen，4(2)：67-73(1999))的方法计算Z′。所产生的表达GC-C的细胞系的Z′值测定为0.72。

实施例10短路电流测量

在培养嵌入物(Snapwell.Corning Life Sciences)上涂铺表达GC-C的细胞系(原代或永生化上皮细胞，例如肺、肠、乳房、子宫或肾)后7-14天，执行尤斯室(Ussing chamber)实验。在培养嵌入物上的细胞进行漂洗，固定在尤斯型器械(EasyMountChamber System，PhySLologic Instruments)上，并且用维持在37℃下的连续充气林格溶液(在O₂中的5％CO₂，pH 7.4)浸浴，所述林格溶液包含(以mM计)120NaCl、25NaHCO₃、3.3KH₂PO₄、0.8K₂HPO₄、1.2CaCl₂、1.2MgCl₂和10葡萄糖。使半室(hemichambers)与多通道电位和电流钳(VCC-MC8，Physiologic Instruments)连接。使用电极[琼脂桥接的(在IM KCl中的4％)Ag-AgCl]，并且使嵌入物电压夹紧至0mV。对于实验的持续时间，每10秒测量经上皮电流、电压和电阻。弃去具有＜200mOhms电阻的膜。这个次级测定可以提供在合适细胞类型(即，形成紧密连接的细胞)中，所引入的GC-C改变CFTR活性并且调节经上皮电流的证实。

实施例11产生稳定的表达CFTR的细胞系

产生表达构建体

基于pCMV-SCRIPT(Stratagene)产生允许流水线克隆的质粒表达载体，并且包含用于转录和翻译目的基因的多种所需组分，包括：CMV和SV40真核启动子；SV40和HSV-TK多腺苷酸化序列；多克隆位点；Kozak序列和药物抗性盒(即嘌呤霉素)。还可将氨苄青霉素或新霉素用于替代嘌呤霉素。随后将包含靶序列2(SEQ ID NO：138)的标签序列插入质粒的多克隆位点。然后使用Asc1和Pac1限制性内切核酸酶将编码人CFTR的cDNA盒亚克隆进入标签序列上游的多克隆位点。

产生细胞系

步骤1：转染

使用标准技术用编码人CFTR(SEQ ID NO：16)的质粒转染CHO细胞。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINE^TM 、LIPOFECTAMINE^TM2000、OLIGOFECTAMINE^TM、TFX^TM试剂、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURIN^TM。)

尽管药物选择对于产生本发明的细胞或细胞系是任选的，我们在质粒中包括一种药物抗性标记(即，嘌呤霉素)。CFTR序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码CFTR靶序列的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的靶序列是CFTR靶序列2(SEQ ID NO：138)，并且在这个实施例中，包含CFTR基因的载体包含CFTR靶序列2(SEQ ID NO：138)。

步骤2：选择

经转染的细胞在不含抗生素的Ham′s F12-FBS培养基(SigmaAldrich，St.Louis，MO)中生长2天，随后在含12.5μg/ml嘌呤霉素的Ham′s F12-FBS中10天。随后在加入信号传导探针前，对于其余时间，将细胞转移至不含抗生素的Ham′s F12-FBS培养基。

步骤3：细胞传代

在抗生素上富集后，细胞在不存在抗生素选择的情况下传代5-14次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。

步骤4：细胞与荧光探针接触

收获细胞并且使用标准技术用CFTR信号传导探针2(SEQ IDNO：139)进行转染。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINE^TM、LIPOFECTAMINE^TM2000、OLIGOFE CTAMINE^TM、TFX^TM试剂、

DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURIN^TM。)CFTR信号传导探针2(SEQ ID NO：139)结合CFTR靶序列2(SEQ ID NO：138)。随后收集细胞用于分析和使用荧光激活细胞分选器分选。

通过信号传导探针检测靶序列

CFTR靶序列1

5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3′(SEQ ID NO：17)

CFTR靶序列2

5′-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3′(SEQ ID NO：138)

信号传导探针

CFTR信号传导探针1(作为100μM贮备液供应)

5′-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2-3′(SEQ ID NO：18)

CFTR信号传导探针2(作为100μM贮备液供应)

5′-CY5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ2-3′(SEQ ID NO：139)

信号传导探针2中的BHQ2可由BHQ3或金颗粒置换。靶序列2和信号传导探针2可分别由靶序列1(SEQ ID NO：17)和信号传导探针1(SEQ ID NO：18)替代。

信号传导探针1的BHQ2可由BHQ3或金颗粒置换。

此外，在特定的针对靶序列1(SEQ ID NO：17)实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的

(BioSearch)的相似探针。在某些实验中，使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。非靶向的FAM标记的探针也用作装载对照。

步骤5：阳性细胞的分离

使细胞解离且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离到有条形码的96孔平板内。根据本领域内标准方法，在小区FAM与Cy5相比较：0.1-0.4％活细胞中使用下述门控层次：

符合门→单峰门→活门→分选门。

步骤6：步骤1-5和/或3-5的另外循环

重复步骤1-5和/或3-5以获得更大数目的细胞。执行步骤1-5的2个轮次，并且对于这些轮次中的每一个，执行步骤3-5的2个内部循环。

步骤7：细胞群体的生长速率的估计

将平板转移至Microlab Star(Hamilton Robotics)。使细胞在新鲜完全生长培养基和2-3天条件生长培养基的100μl 1∶1混合物中温育9天，其中补充有100单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。随后通过胰蛋白酶消化1或2次分散细胞，以使凝块降到最低，并且随后转移至新96孔平板。使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。获得在分散后1-10天之间连续天数时的汇合测量，并且用于计算生长速率。

步骤8：根据生长速率估计框并细胞群体

根据在步骤7中的分散步骤后小于2周的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期群组涂铺)。3个生长框每一个分离到各自96孔平板内；某些生长框产生超过一块96孔平板。通过考虑生长速率的扩展且将细胞群体总数目的高百分比归为同类来计算框。计算框以捕获生长速率中的12-16小时差异。

细胞可以具有小于1天到超过2周的倍增时间。为了加工同时可以根据生长速率合理框并的最分散的克隆，优选使用具有0.25-0.7天倍增时间/框的3-9个框。本领域普通技术人员应当理解，对于具体情况可以调整框的紧密度和框的数目，并且如果细胞就其细胞周期进行同步，那么可以进一步调整框的紧密度和数目。

步骤9：重复涂铺以加快平行加工且提供严格质量控制

使平板在标准和固定条件(即，Ham′s F12-FBS培养基、37℃/5％CO₂)不含抗生素下温育。使细胞的平板分开，以产生4组96孔平板(3组用于冷冻，1组用于测定和传代)。对于平板组各自使用不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。

步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种

使3组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许组中的平板达到70-100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板用Parafilm分别密封，通过1-5cm泡沫材料个别围绕，并且随后放置到-80℃冷藏库中。

步骤11：用于产生活的、稳定的和有功能的(VSF)细胞系的起始转化步骤的方法和条件

其余平板组如步骤9中所述进行维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。

步骤12：校正生长速率的任何其余变异性的标准化方法

控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过跨越平板的细胞数目的标准化，控制由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异，并旦在重新排列每8次传代后发生。检测且消除其为异常值的细胞群体。

步骤13：细胞群体的表征

在重新排列后使细胞在培养中维持6-10周，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时程中，我们观察大小、形态、朝向微汇合的趋势、脆性、对胰蛋白酶消化的应答和胰蛋白酶消化后的平均圆形度、或细胞维持的其它方面例如与培养平板表面的附着和对流体添加后的喷出的抵抗力作为常规内部质量控制的部分以鉴定强健的细胞。随后此类基准化的细胞被准许用于功能评估。

步骤14：细胞群体在VSF条件下的潜在功能性的评估

使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用膜电位染料试剂盒(Molecular Devices，MDS)。

细胞在384孔平板中以各种密度(即，12.5×10³至20×10³细胞/孔)进行测试并且分析应答。测试在细胞涂铺和测定读数之间的时间。还测试染料浓度。计算剂量应答曲线和Z′得分作为潜在功能性评估的部分。

还可以执行下述步骤(即，步骤15-18)以选择最终和备份活的、稳定的和有功能的细胞系。

步骤15：

比较来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答，以鉴定经过限定时间段(例如，3-9周)具有最一致应答的细胞。还注意随着时间推移而改变的其它细胞特征。

步骤16：

对符合功能和其它标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些细胞群体。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤(例如不同的细胞密度；涂铺的时间、细胞培养传代的长度；细胞培养皿形式和包被；流体学最佳化，包括速度和剪力；传代时间；和洗涤步骤)用于一致和可靠传代。

此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择这样的最终细胞系和备份细胞系，当根据这个过程且在这些条件下产生时，其显示合适附着/粘稠度、生长速率和甚至涂铺(缺乏微汇合)。

步骤17：细胞库的建立

与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻原种在37℃下解冻，用Ham′sF12-FBS洗涤2次，并且随后在Ham′s F12-FBS中温育。细胞随后扩增2-4周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的克隆的细胞库，对于低温保存的每个克隆细胞具有25个小瓶。

步骤18：

使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以确定它们是否符合它们最初依据其进行选择的相同特征。

实施例12就天然CFTR功能表征稳定的细胞系

我们使用高通量相容的荧光膜电位测定，以表征在所产生的稳定的表达CFTR的细胞中的天然CFTR功能。

稳定表达CFTR的CHO细胞系维持在标准细胞培养条件下在Ham′s F12培养基中，所述Ham′s F12培养基补充有10％胎牛血清和谷氨酰胺。在测定前1天，从原种平板中收获细胞并且涂铺到黑色透明底部的384孔测定平板内。使测定平板维持在37℃细胞培养温箱中在5％CO₂下22-24小时。随后从测定平板中去除培养基，且加入在装载缓冲液(137mM NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl₂、25mMHEPES、10mM葡萄糖)中稀释的蓝色膜电位染料(MolecularDeviceslnc.)，并且允许在37℃下温育1小时。随后将测定平板装载到荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上，并且加入在化合物缓冲液(137mM葡萄糖酸钠、5mM葡萄糖酸钾、1.25mM CaCl₂、25mMHEPES、10mM葡萄糖)中稀释的毛喉素和IBMX的混合物。

来自荧光膜电位测定的代表性数据显示在稳定的表达CFTR的CHO细胞系(细胞系1、M11、J5、E15和015)中可归于功能CFTR的离子流全部高于缺乏CFTR的对照细胞，如由测定应答指出的。

在稳定的表达CFTR的CHO细胞系(细胞系1、M11、J5、E15和O15)中可归于功能CFTR的离子流也全部高于瞬时CFTR转染的CHO细胞。通过将CHO细胞以5-16,000,000/10cm组织培养皿涂铺且在转染前使其温育18-20小时，产生瞬时CFTR转染的CHO细胞。将由脂质转染试剂和编码CFTR的质粒组成的转染复合物直接加入每个皿中。随后使细胞在37℃下在CO₂温育箱中温育6-12小时。在温育后，将细胞提取，涂铺到黑色透明底部的384孔测定平板内，并且使用上述荧光膜电位测定测定其功能。

对于毛喉素剂量应答实验，在384孔平板中以15,000细胞/孔的密度涂铺的，所产生的稳定的表达CFTR的细胞系，用增加浓度的毛喉素(己知的CFTR激动剂)进行攻击。通过荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)，随着时间推移监控作为细胞荧光中改变的函数的细胞应答。随后作为毛喉素浓度的函数绘制数据，并且使用非线性回归分析使用GraphPad Prism 5.0软件分析，产生256nM的EC₅₀值。所产生的表达CFTR的细胞系显示在其它细胞系中先前报告的毛喉素EC₅₀范围内(250-500nM)(Galietta等人，Am J Physiol Cell Physiol.281(5)：C1734-1742(2001))的毛喉素的EC₅₀值，指示克隆的效力。

实施例13依据基于CFTR细胞的测定确定Z′值

使用高通量相容的荧光膜电位测定计算关于所产生的稳定的表达CFTR的细胞系的Z′值。荧光膜电位测定方案基本上根据实施例12中的方案来执行。具体地，对于Z′测定，在384孔测定平板中的24个阳性对照孔(以15,000细胞/孔的密度涂铺)用毛喉素和IBMX的CFTR激活混合物进行攻击。相等数目的孔用单独且包含DMSO的媒介物(在不存在激活剂的情况下)进行攻击。使用荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)监控在2种条件中的细胞应答。计算在2种条件中的平均值和标准差，并且使用Zhang等人，J Biomol Screen，4(2)：67-73(1999)中公开的方法计算Z′。所产生的稳定的表达CFTR的细胞系的Z′值测定为高于或等于0.82。

实施例14CFTR调节剂的高通量筛选和鉴定

高通量相容的荧光膜电位测定用于筛选且鉴定CFTR调节剂。在测定前1天，从原种平板中收获细胞到不含抗生素的主长培养基内，并且涂铺到黑色透明底部的384孔测定平板内。使测定平板维持在37℃细胞培养温箱中在5％CO₂下19-24小时。随后从测定平板中去除培养基，并且加入在装载缓冲液(137mM NaCl、5mM KCl、1.25mMCaCl₂、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的蓝色膜电位染料(Molecular Devices Inc.)，并且使细胞在37℃下温育1小时。使测试化合物溶解于二甲亚砜中，在测定缓冲液(137mM葡萄糖酸钠、5mM葡萄糖酸钾、1.25mM CaCl₂、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释，随后装载到384孔聚丙烯微量滴定板内。将细胞和化合物平板装载到荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上，并且运行3分钟以鉴定测试化合物活性。仪器随后将以300nM-1μM浓度的毛喉素溶液加入细胞中，以允许观察先前加入的化合物的调节剂或阻断剂活性。通过测量在测试化合物加入细胞后和/或在后续激动剂加入后产生的荧光中的改变，测定化合物的活性。

实施例15使用短路电流测量就天然CFTR功能表征稳定的表达 CFTR的细胞系

在培养嵌入物(Snapwell，Coming Life Sciences)上涂铺表达CFTR的细胞系(原代或永生化上皮细胞，包括但不限于肺和肠)后7-14天，执行尤斯室实验。在培养嵌入物上的细胞进行漂洗，固定在尤斯型器械(EasyMount Chamber System，PhysiologicInstruments)上，并且用维持在37℃下的连续充气林格溶液(在O₂中的5％CO₂，pH 7.4)浸浴，所述林格溶液包含120mM NaCl、25mM NaHCO₃、3.3mM KH₂PO₄、0.8mM K₂HPO₄、1.2mM CaCl₂、1.2mM MgCl₂和10mM葡萄糖。使半室与多通道电位和电流钳(VCC-MC8，Physiologic Instruments)连接。使用电极[琼脂桥接的(在1M KCl中的4％)Ag-AgCl]，并且使嵌入物电压夹紧至0mV。对于实验的持续时间，每10秒测量经上皮电流、电压和电阻。弃去具有＜200mΩ电阻的膜。

实施例16使用电生理学测定就天然CFTR功能表征稳定的表达 CFTR的细胞系

虽然人工和自动化电生理学测定都已得到开发，并且两者都可以应用于测定这种系统，但下文描述的是关于人工膜片钳实验的方案。

以低密度进行接种细胞，并目在涂铺后2-4天使用。讲硼硅玻璃移液管进行火抛光以获得2-4megaΩ的尖端电阻。对电流取样且滤过低通路。细胞外(浸浴)溶液包含：150mM NaCl、1mM CaCl₂、1mMMgCl₂、10mM葡萄糖、10mM甘露醇和10mM TES，pH 7.4。移液管溶液包含：120mM CaCl、1mM MgCl₂、10mM TEA-C1、0.5mM EGTA、1mM Mg-ATP和10mM HEPES(pH7.3)。通过使膜电位在-80mV和-100mV之间交替来监控膜电导。通过应用以20-mV步幅在-100mV和+100mV之间的电压脉冲产生电流-电压关系。

实施例17产生稳定的表达NaV 1.7异源三聚体的细胞系产生表达构建体

基于pCMV-SCRIPT(Stratagene)产生允许流水线克隆的质粒表达载体，并且该质粒表达载体包含用于转录和翻译目的基因的各种所需组分，包括CMV和SV40真核启动子；SV40和HSV-TK多腺苷酸化序列；多克隆位点；Kozak序列和新霉素/卡那霉素抗性盒(或氨苄青霉素、潮霉素、嘌呤霉素、博来霉素抗性盒)。

细胞系的产生

步骤1：转染

293T细胞用3种单独质粒进行共转染，一种质粒编码人NaV 1.7α亚单位(SEQ ID NO：19)、一种质粒编码人NaV 1.7β1亚单位(SEQ IDNO：20)，并且一种质粒编码人NaV 1.7β2亚单位(SEQ ID NO：21)，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINE^TM、LIPOFECTAMINE^TM 2000、OLIGOFECTAMINE^TM、TFX^TM试剂、

DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURIN^TM。)

尽管药物选择对于产生本发明的细胞或细胞系是任选的，我们还是包括一种药物抗性标记/质粒。序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码NaV靶序列的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的NaV靶序列是NaV靶序列1(SEQ ID NO：22)、NaV靶序列2(SEQ ID NO：23)和NaV靶序列3(SEQ ID NO：24)。在这个例子中，包含NAV 1.7α亚单位基因的载体包含NaV靶序列1(SEQ ID NO：22)；包含NAV 1.7β1亚单位基因的载体包含NaV靶序列2(SEQ ID NO：23)；并且包含NaV 1.7β2亚单位基因的载体包含NaV靶序列3(SEQ ID NO：24)。

步骤2：选择

将经转染的细胞在DMEM-FBS培养基中生长2天，随后在含抗生素的DMEM-FBS培养基中培养10天。在含抗生素的期间时，将抗生素如下加入培养基中：嘌呤霉素(0.1μg/ml)、潮霉素(100μg/ml)和博来霉素(200μg/ml)。

步骤3：细胞传代

在抗生素上富集后，使细胞在不存在抗生素的情况下传代6-18次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。

步骤4：细胞与荧光探针接触

收获细胞并且用信号传导探针(SEQ ID NOS：25、26、27)进行转染，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINE^TM、LIPOFECTAMINE^TM2000、OLIGOFECTAMINE^TM、TFX^TM试剂、

DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURIN^TM。)

NaV信号传导探针1(SEQ ID NO：25)结合NaV靶序列1(SEQ IDNO：22)；

NaV信号传导探针2(SEQ ID NO：26)结合NaV靶序列2(SEQID NO：23)；和NaV信号传导探针3(SEQ ID NO：27)结合NaV靶序列3(SEQ ID NO：24)。随后使细胞解离且收集用于分析，并且使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。

通过信号传导探针检测的靶序列

下述靶序列用于NaV 1.7亚单位转基因。

NaV靶序列1

5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3′(SEQ ID NO：22)(NaV1.7α亚单位)

NaV靶序列2

5′-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3′(SEQ ID NO：23)(NaV1.7β1亚单位)

NaV靶序列3

5′-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3′(SEQ ID NO：24)(NaV1.7β2亚单位)

信号传导探针

作为100μM贮备液供应。

NaV信号传导探针1-这种探针结合靶序列1。

5′-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3

猝灭-3′(SEQ ID NO：25)

NaV信号传导探针2-这种探针结合靶序列2。

5′-Cy5.5CGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3

猝灭-3′(SEQ ID NO：26)

NaV信号传导探针3一这种探针结合靶序列3。

5′-Fam CGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1

猝灭-3′(SEQ ID NO：27)

NaV信号传导探针1和2中的BHQ3可以由BHQ2或金颗粒置换。NaV信号传导探针3中的BHQ1可以由BHQ2、金颗粒或DABCYL置换。

此外，在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的

Dye(BioSearch)的相似探针。在某些实验中，使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。

步骤5：阳性细胞的分离

标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入限定门内的细胞直接分离到96孔平板内。流式细胞术细胞分选这样进行操作，使得每个孔存放单个细胞。在选择后，细胞在缺乏药物的培养基中进行扩增。

在小区FAM与Cy5相比较：0.1-1.0％活细胞中使用下述门控层次：

符合门→单峰门→活门→分选门。

步骤6：步骤1-5和/或3-5的另外循环

重复步骤1-5和/或3-5以获得更大数目的细胞。执行步骤1-5的至少4个独立轮次，并且对于这些循环中的每一个，针对每个独立轮次执行步骤3-5的至少2个内部循环。

步骤7：细胞群体的生长速率的估计

将平板转移至Microlabstar 自动化液体处理器(HamiltonRobotics)。使细胞在新鲜完全生长培养基(DMEM/10％FBS)和2-3天条件生长培养基的1∶1混合物中温育5-7天，其中补充有100单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。随后通过胰蛋白酶消化分散细胞，以使凝块降到最低，并且转移至新96孔平板。在克隆分散后，使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。在经过9天(在分散后第1和10天之间)每3次的天数时获得汇合测量，并且用于计算生长速率。

步骤8：根据生长速率估计框并细胞群体

根据在步骤7中的分散步骤后10-11天之间的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期群组涂铺)。独立地收集框并且涂铺在个别96孔平板上以用于下游处理；某些生长框产生超过一块96孔平板。通过考虑生长速率的扩展且将细胞群体总数目的高百分比归为同类来计算框。依赖于步骤5中描述的分选反复操作，使用具有1-4天分隔的5-9个生长框。因此，每个框对应于在8-14.4小时之间的生长速率或群体倍增时间差，依赖于反复操作。

步骤9：重复涂铺以加快平行加工且提供严格质量控制

使平板在标准和固定条件(湿润的37℃、50％CO₂)下在不含抗生素的DMEM-10％FBS培养基中温育。使细胞的平板分开，以产生4组靶平板。这4组平板包括具有所有生长框的所有平板，以确保存在起始组的4个重复。多达3块靶平板组提交用于低温保存(在步骤10中描述)，并且其余组按比例排列，并且进一步重复涂铺，以用于传代和用于功能测定实验。不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源用于下游重复平板。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。

步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种

使3组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许组中的平板达到70-80％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和5％-10％DMSO。平板用Parafilm密封，通过1-5cm泡沫材料个别围绕，并且随后放置到80℃冷藏库中。

其余平板组如步骤9中所述进行维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。对于某些测定涂铺步骤，用细胞解离缓冲液(例如，CDB，Invitrogen或Cell Stripper，CellGro)而不是胰蛋白酶使细胞解离。

步骤12：校正生长速率的任何其余变异性的标准化方法

控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过每2-8次传代跨越平板的细胞数目的定期标准化，控制由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异。检测且消除其为异常值的细胞群体。

步骤13：细胞群体的表征

使细胞维持3-8周的细胞培养，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时程中，观察大小、形态、脆性、对胰蛋白酶消化或解离的应答、解离后的圆形/平均圆形度、活力百分比、朝向微汇合的趋势、或细胞维持的其它方面例如与培养平板表面的附着。

步骤14：细胞群体在VSF条件下的潜在功能性的评估

使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用膜电位测定试剂盒(Molecular Devices/MDS)，细胞在96或384孔平板中以多种不同密度进行测试并且分析应答。使用涂铺后的各个时间点，例如涂铺后12-48小时。还测试不同的涂铺密度的测定应答差异。

步骤15：

比较来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答，以鉴定经过3-9周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还注意随着时间推移而改变的其它细胞特征。

步骤16：

对符合功能和其它标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些细胞群体。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤，例如不同的涂铺细胞密度；传代时间；培养皿大小/形式和包被)；流体学最佳化；细胞解离最佳化(例如，类型；所用体积和时间长度)；以及洗涤步骤，用于一致和可靠传代。温度差异也用于标准化(例如30℃与37℃相比较)。

步骤17：细胞库的建立

与最终细胞系和备份细胞系相对应的上文描述的低传代冷冻平板在37℃下解冻，用DMEM-10％FBS洗涤2次，并且在湿润的37℃/5％CO₂条件下温育。细胞随后扩增2-3周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的细胞库，由15-20个小瓶组成。

步骤18：

还可以执行下述步骤以证实细胞系是活的、稳定的和有功能的。使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以测定它们是否符合它们最初依据其进行选择的相同特征。

实施例18表征在稳定的表达NaV 1.7的细胞系中异源NaV 1.7亚单位的相对表达

定量RT-PCR(qRT-PCR)用于测定在所产生的稳定的表达NaV1.7的细胞系中异源人NaV 1.7α、β1和β2亚单位的相对表达。使用RNA提取试剂盒(RNeasy MiniKit，Qiagen)纯化来自1-3×10⁶个哺乳动物细胞的总RNA。根据严格的DNA酶处理方案(TURBO DNA-freeKit，Ambion)完成DNA酶处理。使用逆转录试剂盒(SuperScript III，Invitrogen)，在具有1μg无DNA总RNA和250ng随机引物(Invitrogen)的20μL反应体积中执行第一链cDNA合成。不含逆转录酶的样品和不含RNA的样品用作阴性对照用于这个反应。合成在热循环仪(Mastercycler，Eppendorf)中在下述条件下完成：于25℃下进行5分钟，于50℃下进行60分钟；在70℃下进行15分钟，执行反应终止。

对于基因表达的分析，用于qRT-PCR的引物和探针(MGBTaqMan探针，Applied Biosystems)设计为对靶序列(SEQ ID NOS：22、23、24)特异性退火。对于样品标准化，使用对照(甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH))Pre-Developed Assay试剂(TaqMaN，Applied Biosystems)。使用在50μL反应体积中的40ng cDNA设置包括阴性对照和阳性对照(质粒DNA)的反应，一式三份。测定被表达的3个NaV 1.7亚单位各自的相对量。所有3个亚单位都在所产生的稳定的表达NaV 1.7的细胞系中成功表达。

实施例19使用电生理学测定就天然NaV功能表征稳定的表达NaV 1.7的细胞系

自动化膜片钳系统用于记录来自所产生的稳定的表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位的HEK293T细胞系的钠电流。下述示例性方案也可以用于QPatch、Sophion或Patchliner、Nanion系统。在室温下，细胞外林格溶液包含140mM NaCl、4.7mM KCl、2.6mM MgCl₂、11mM葡萄糖和5mM HEPES，pH7.4。细胞内林格溶液包含120mM CsF、20mM Cs-EGTA、1mM CaCl₂，1mM MgCl₂和10mM HEPES，pH 7.2。实验在室温下进行。

稳定表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位的细胞在如实施例17中所述的标准培养方案下生长。收获细胞且用连续搅拌保持悬浮高达4小时，在膜片的品质或能力方面无明显改变。使用标准膜片平板执行电生理学实验(全细胞)。膜片钳孔(芯片中微蚀刻的)直径约1μm，并且具有～2MΩ的电阻。使膜电位夹紧至-100mV的保持电位。

表征在HEK293T细胞中稳定表达的电压门控的人NaV 1.7钠通道的电流电压关系和失活特征。测量响应从-80mV到+50mV的20ms去极化脉冲的钠电流，具有-100mV的保持电位。表征对于峰钠通道电流所得到的电流-电压(I-V)关系。激活阈值是-35mV(激活的中点，Va＝-24.9mV+/-3.7mV))，并且在-10mV下获得最大电流幅度。绘制关于钠通道的失活图。使膜电位保持在-100mV的保持电位，随后转变成从-110mV到的+10mV条件电位共1000ms，并且最后在至0mV的步幅后测量电流。所得到的电流幅度指示处于失活状态的钠通道的部分。在比-85mV更负的电位下，通道占优势地处于关闭状态，而在超过-50mV的电位下，它们占优势地处于失活状态。曲线代表Boltzmann拟合，根据其关于稳态失活的V_1/2估计为-74mV。关于所产生的稳定的表达NaV 1.7的细胞系的电流-电压谱与先前报告的电流-电压谱(Va＝-28.0mV±1.1mV；V_1/2＝-71.3mV±0.8mV)(Sheets等人，J Physiol.581(Pt 3)：1019-1031.(2007))一致。

实施例20使用膜电位测定就天然NaV功能表征稳定的表达NaV 1.7 的细胞系

所产生的稳定的表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位的细胞维持在标准细胞培养条件下在达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)中，所述DMEM补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺和HEPES。在测定前1天，使用细胞解离缓冲液例如CDB(GIBCO)或细胞剥离器(Mediatech)从原种平板中收获细胞，并且以10,000-25,000细胞/孔涂铺到384孔测定平板中的生长培养基中。使测定平板维持在37℃细胞培养温箱中在5％CO₂下22-24小时。随后从测定平板中去除培养基，并且加入在装载缓冲液(137mM NaCl、5mM KCl、1.25mMCaCl₂、25mMHEPES、10mM葡萄糖)中稀释的蓝色荧光膜电位染料(MolecularDevices Inc.)。使细胞与蓝色膜电位染料在37℃下温育1小时。随后将测定平板装载到高通量荧光平板读取器(Hamamastu FDSS)上。荧光平板读取器测量每秒获得一次的细胞平板的图像中的细胞荧光，并且将数据显示为相对荧光单位。

测量稳定的表达NaV 1.7的细胞和对照细胞(即HEK293T亲本细胞)对缓冲液和通道激活剂(即，藜芦定和蝎子毒(SV))添加的测定应答。在第一个添加步骤(即，添加1)中，仅加入缓冲液，不加入测试化合物。需要时，测试化合物可以在这个步骤中加入。在第二个添加步骤中，其为钠通道激活剂的藜芦定和蝎子毒在测定缓冲液中稀释至所需浓度(即，25μM藜芦定和5-25μg/ml蝎子毒)，并且加入384孔聚丙烯微量滴定板内。结合后，藜芦定和蝎子毒蛋白质通过机制的组合调节电压门控的钠通道的活性，包括激活和失活动力学的改变。在稳定的表达NaV 1.7的细胞中所得到的钠通道的激活改变细胞膜电位，并且荧光信号增加。上述功能测定还可以用于表征测试化合物对于NaV 1.7离子通道的相对效力。

实施例21表征NaV 1.7a亚单位通过B亚单位的调节

α亚单位基因表达通过β亚单位的调节

通过处理独立质粒DNA或α和对照质粒的摩尔比(例如α∶β1∶β2＝1∶1∶1)，改造HEK293T细胞的库，以表达多种比例的α和β亚单位。在药物选择后，如实施例18中所述，用qRT-PCR评估6个不同细胞储库中的亚单位表达。比较性qRT-PCR指出与仅转染α亚单位和对照质粒相比较，当所有3个人NaV 1.7亚单位(即α，β1和β2)共转染时，在药物选择的细胞检测中的α亚单位表达增加。β亚单位转录物的存在影响α亚单位基因表达，证实共表达所有3个NaV 1.7亚单位对于生理学相关功能测定的重要性。

药理性质通过β亚单位的调节

基于细胞的膜电位测定用于测量稳定共表达所有3个NaV 1.7亚单位(即，α、β1和β2)的细胞，和仅稳定表达NaV 1.7α亚单位的对照细胞，对测试化合物的应答。2种化合物(即，C18和K21)在根据实施例20中的方案同时执行的膜电位测定中进行测试。特别地，对于这个实施例，测试化合物在第一个添加步骤中加入。

C18和K21增强克隆C44(表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位)的应答，并且阻断克隆C60(仅表达NaV 1.7α亚单位)的应答。对于2个克隆中的每一个，2种测试化合物的测定应答针对单独的缓冲液的应答进行标准化。

实施例22表征NaV 1.7的不同亚单位组合

基于膜电位细胞的测定用于测量对稳定地共表达所有3种NaV1.7亚单位(即，α、β1和β2)的不同细胞系对测试化合物的应答。在从对于NaV 1.7α、β1和β2亚单位的表达是阳性的细胞产生的4个细胞系上测试的一组化合物的剂量-反应分析(DRC)导致不同功能谱(图4)。发现多个细胞系包含与图4中显示的4个特征谱的各谱相似的特征谱。

基于它们在基于细胞的测定中的功能药理特性将约90个共表达所有3个NaV 1.7亚单位(即α、β1和β2)的细胞系分类，其中使用相同化合物测试每一个克隆细胞系(图5)。图5(框1-5)中的每一个簇代表具体相似活性的克隆的亚组。活性计算为最大信号抑制的百分比，如图5中对于每一个克隆细胞系所显示的。图5中的负数表示增强的百分比。

表7哺乳动物G蛋白、其家族和描述

注意：细胞可表达此类蛋白质的任何蛋白质的各种组合。

表8人孤儿GPCR，包括它们的基因符号和NCBI基因ID编号

表9人阿片样物质受体的列表

表10人嗅觉受体列表

表11犬嗅觉受体(它们的基因名称)列表

表12冈比亚按蚊嗅觉受体

注意：GPRor7/IOR55可与其他OR的每一个共表达。

表13受体列表

注意：细胞还可利用来自其他物种的相应序列来制备；这是受体的种类的示例性列表，并非所有家族或家族成员都列出，并且也可使用我们的方法在细胞中表达其他受体。

表14来自不同物种的GABA亚基

表15.人苦味受体列表

用于制备苦味受体细胞系的优选G蛋白包括但不限于小鼠Gα15和人GNA15。

表16甜味和鲜味受体

表17囊性纤维化跨膜电导调节剂

表18.鸟苷酸环化酶

表19.小鼠嗅觉受体列表

表20.与人苦味受体基因的多态性

(表20包括人TAS2R基因的每一个独特单核苷酸多态性(SNP)的序列编号、SNP在参照序列中的位置以及SNP的描述。)

表21.人苦味受体的编码序列中的等位基因变异

注意：表21中所有位置信息是指人TAS2R蛋白的规范序列。

表22.昆虫基因列表

还可将表22中所列的受体的人气味受体同源物与本发明的方法和组合物一起使用。

实施例23产生稳定的表达鲜味受体的细胞系

转染

HEK293T(ATCC CRL-11268)用3种单独质粒进行共转染，一种质粒编码T1R1(SEQ ID NO：41)，一种质粒编码T1R3(SEQ ID NO：32)并且另一种质粒编码信号传导分子(小鼠Gα15，SEQ ID NO：33)。尽管药物选择在本发明的方法是任选的，我们还是包括一种药物抗性标记/质粒。序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的靶序列是靶序列1(SEQ ID NO：28)、靶序列2(SEQ ID NO：29)和靶序列3(SEQ ID NO：30)。在这些实例中，T1R1基因载体包含靶序列3、T1R3基因载体包含靶序列1，并且Gα15基因载体包含靶序列2。常规地在含药物的培养基中选择细胞进行10-14天。

细胞与荧光探针接触

收获选择的细胞并且用信号传导探针(SEQ ID NO：38-40)进行转染。信号传导探针1结合标签序列1(SEQ ID NO：126)，信号传导探针2结合标签序列2(SEQ ID NO：127)并且信号传导探针3结合标签序列3(SEQ ID NO：128)。随后解离和收集细胞用于分析且使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用以将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX reagents、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或Fecturin。

信号传导探针1

5′-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3猝灭-3′

(SEQ ID NO：38)

信号传导探针2

5′-Cy5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3猝灭-3′

(SEQ ID NO：39)

信号传导探针3

5′-Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGCBHQ1猝灭-3′

(SEQ ID NO：40)

靶序列1，靶序列以粗体显示(鲜味)

AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTA

ATCTGGGCCCGGAAAGCCTTTTTCTCTGTGATCCGGTACAGTCCTTCTGC (SEQ ID NO：126)

靶序列2，靶序列以粗体显示(鲜味)

AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGAGGCAGGTGGACAGCTTGGTTCTAATATCTGGGCCCGGAAAGCGTTTAACTGATGGATGGAACAGTCCTTCT GC(SEQ ID NO：127)

靶序列3，靶序列以粗体显示(鲜味)

AAGGGCGAATTCGGATCCGCGGCCGCCTTAAGCTCGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAAT

ATCTGGGCCCGGAGATG(SEQ ID NO：128)

可使用其它靶序列和信号传导探针(参见，例如，如2005年9月1日公布的国际专利申请公开案No.WO2005/079462(申请号PCT/US05/005080)中所描述的)。例如，BHQ3可以由探针1或探针2中的BHQ1或金颗粒置换。应当指出BHQ1可以由探针3中的BHQ2或Dabcyl置换。可在某些实验中使用利用具有与Cy5相似的光谱性质的Quasar Dye(BioSearch)的相似探针。还应当指出在某些情况下使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。

阳性细胞的分离

标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离至有条形码的96孔板内。操作细胞分选，从而使得每孔放置单个细胞。在选择后，将细胞在不存在药物的培养基中进行扩增。

功能性转化

我们在多种生长条件(包括例如低葡萄糖DMEM培养基或在具有10％血清或无血清的无葡萄糖Leibovitz L-15培养基)中使用相同细胞和不同细胞的两个等分试样维持鲜味受体细胞(如上选择和扩增的)。将一些细胞维持在含有不同浓度的其它糖例如半乳糖的培养基中。随后我们就它们对鲜味配体适当地应答并且不对其它刺激物(即，糖)应答的能力表征在多种条件下维持的鲜味受体细胞系的细胞。

不期望受理论束缚，在不同培养基条件中的生长可以例如因基因表达水平、基因组组织和受体在细胞表面上的功能性表达的变化而功能性转化细胞。经评估并且经显示影响细胞的功能测定应答的不同培养基中的参数包括血清浓度(即低血清浓度和血清剥夺)、糖剥夺和测定板包被(例如，多聚D赖氨酸和层粘连蛋白)。这些结果显示当将细胞维持在不同培养基条件中时鲜味受体细胞系的细胞的特征可以不同。它们还显示通过荧光探针选择的不同细胞可具有不同的特征。我们表征通过荧光探针选择的细胞的一个实例示于图6中。如图6中所显示的，在不同条件(1、2和最终)中培养的相同细胞的等分试样显著不同地对鲜味(MSG)和甜味(果糖)配体应答。将条件1中培养的细胞涂铺在剥夺血清的低葡萄糖培养基中。将条件2中培养的细胞涂铺在含10％血清的低葡萄糖培养基中过夜，然后在测定前转换至剥夺血清的培养基中。将在条件1或2中培养的细胞涂铺在包被的板(Corning#3665)上。“最终”条件包括在包被的板(Corning#3300)上和具有血清剥夺的低葡萄糖培养基中高密度培养。条件1中培养的细胞对甜味激动剂的应答超过对鲜味激动剂的应答。条件2中培养的细胞对两种配体作出等同的应答。相反地，“最终”培养条件中培养的细胞对MSG强烈地应答但对果糖无应答。因此，这些细胞产生在生理上和药理上相关的鲜味受体。

实施例24就天然鲜味受体功能表征细胞系

1.基因表达的验证和定量

通过使用qRT-PCR，我们测定了在上述细胞(“最终”)中表达的每一个鲜味受体亚单位的相对量(RNA)。通过使用qRT-PCR，我们测定了表达的每一个鲜味受体亚单位的相对量。使用商购可得的RNA纯化试剂盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)从1-3×10⁶个哺乳动物细胞纯化总RNA。然后使用严格的DNA酶处理方案(TURBO DNA-free Kit；Ambion)处理RNA提取物。使用Reverse Transcriptase试剂盒(Superscript III，Invitrogen)，利用1μg无DNA的总RNA和250nG随机引物(Invitrogen)在20μL中进行第一链cDNA合成。该反应的阴性对照包括其中在cDNA合成步骤中不加逆转录酶或RNA的样品。在下列条件下在热循环仪(Mastercycler Eppendorf)中进行cDNA和PCR产物合成：在25℃下进行5分钟，在50℃下进行60分钟；在70℃下进行15分钟，执行反应终止。

为了分析基因表达(RNA)，使用针对T1R1、T1R3和小鼠Gα15cDNA的探针(MGB TaqMan probes，Applied Biosystems)。关于样品标准化对照，利用GAPDH、Pre-Developed TaqMaN Assay Reagents，Applied Biosystems。在50μL反应体积中利用40ng cDNA建立反应，包括阴性对照和阳性对照(质粒DNA)，一式三份。测定表达(RNA)的每一个鲜味受体亚单位的相对量。图7图解描述了结果并且显示所有3种核酸在鲜味受体细胞系中表达(RNA)。T1R1、T1R3和Gα15的表达水平分别为对照细胞中观察到的水平的约10,000、100和100,000倍。

将标准单终点RT-PCR法用于估计根据上述方案(“最终的”)产生鲜味受体细胞系的1和9个月培养物中T1R1、T1R3和Gα15的基因表达(RNA)。将细胞在24孔板版式中培养至80％汇合，收获细胞，然后使用商购可得的RNA制备试剂盒(RNAqueous kit，Ambion)分离RNA。按照商业第一链cDNA合成试剂盒(Superscript III kit，Invitrogen)的方案，利用oligo(dT)12，18引物将范围为5pg至5μg的纯化的总RNA用于进行逆转录。在第一链合成后，将对鲜味受体的亚单位的核酸(T1R1、T1R3)以及小鼠Gα15的核酸特异的oligo组独立地在PCR反应混合物(HotStart Taq)中组装。在45个循环的PCR后，利用琼脂糖凝胶电泳进一步分析扩增子样品。

在图8中举例说明了来自这些单终点RT-PCR实验的结果。图8描述了用于RT-PCR实验的琼脂糖凝胶的代表性照片。在1个月和更久的9个月的培养物中检测到所有编码鲜味受体的核酸的强烈表达(RNA)，这证明在“最终”条件下培养的本发明的细胞系的稳定性的异常水平。

2.调节剂的基于细胞的测定

在测定之前24小时将本发明的细胞以(75-125K)/孔于培养基(低葡萄糖DMEM或L15培养基，所述培养基补充有血清和标准生长添加剂)中接种在96孔板中。在温育后，去除生长培养基，将细胞置于无血清生长培养基中。将细胞温育2-3小时。然后去除培养基，然后给细胞加载钙敏感性荧光染料(钙-3，Molecular Devices Corp.)，将该染料稀释于鲜味测定缓冲液(130mM NaCl，1.1mM KH₂PO₄，1.3mMCaCl，20mM HEPES和3mM NaHPO₄*7H₂O)。将细胞在该培养基中温育1小时。将平板加载至高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上。将测试化合物在鲜味测定缓冲液中稀释至所需浓度并且加入各孔。检测钙流，进行90秒。将在如上缓冲液中稀释的激活剂(即MSG)以范围在10μM至100mM之间的终浓度加入各孔，然后记录相对荧光的变化，再进行另外90秒。

3.依据基于鲜味细胞的测定确定Z′和EC ₅₀ 值

为了测试鲜味受体应答在此类表达鲜味受体的细胞系中的功效，将已建立的鲜味受体激活剂谷氨酸单钠(MSG)在上述测定中用作测试化合物。将MSG(Sigma，G5889)以33mM的浓度加入测试孔，并且对照孔只接受缓冲液。在最终的测定条件中，如通过荧光平板读取器测量的钙流测量所报导的。(FLIPR3操作系统，Molecular Devices)。一个重复数次的测定中，细胞系具有0.8的Z’值。参见图9(一个示例性测定)。该Z’值表示所产生的表达鲜味受体的细胞在基于细胞的测定中识别MSG，并且可使用此类细胞可靠地且稳定地进行这些测定。

为了测试本发明的表达鲜味受体的细胞系中鲜味受体应答的灵敏度，通过向细胞中加入剂量不断增加的MSG，然后如上所述测量应答来进行剂量反应实验。在一个测定中(图10)，发现MSG在该细胞系中的EC₅₀值为22mM。这些结果表明在本发明的细胞系中产生的鲜味受体在本发明的表达鲜味受体的细胞系中展示了对已知鲜味受体配体的强敏感性。

实施例25已知的增强剂IMP和环己基氨基磺酸钠增强鲜味细胞系对MSG的反应

如上文中提及的，MSG是已知的鲜味受体配体。也已证明当将核苷酸肌苷单磷酸(IMP，Sigma)与MSG一起呈递时，其可用作鲜味受体信号传导的增强剂。通过使用上述测定方法，可将不断增加的MSG和不断增加的IMP浓度的基质阵用于细胞系，并且产生应答。图11显示，对于一个这样的测定，随着IMP浓度增加，在测试的MSG的各浓度上检测到更强的反应。

与MSG相似，环己基氨基磺酸钠(人造增甜剂)当其与对于甜味和鲜味受体共同的亚单位相互作用时可用途鲜味受体的激活剂。通过使用上述测定方案，利用不断增加的环己基氨基磺酸盐(Sigma)浓度的基质并且产生反应。图12显示，对于一个测定，随着环己基氨基磺酸盐浓度增加，检测更显著的反应。这与现有技术中描述的几个其它细胞系相反，所述细胞系在MSG不存在的情况下未检测到环己基氨基磺酸盐。

实施例26产生稳定的表达苦味受体的细胞系

步骤1-转化

293T细胞用2种单独质粒进行共转染，一种质粒编码TAS2R苦味受体(SEQ ID NO：77-101之一)，并且另一种质粒编码小鼠Gα15信号传导蛋白(SEQ ID NO：102)。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX试剂、Fugene 6、DOTAP/DOPE，Metafectine或F ecturin。尽管药物选择在本发明的方法是任选的，我们还是包括一种哺乳动物药物抗药标记/质粒。质粒使用CMV启动子以进行苦味受体基因或Gα15基因的表达。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在于各载体中，从而使得标签与载体所表达的蛋白质即苦味受体或Gα15一起转录。所利用的靶序列是靶序列1(SEQ ID NO：46)、靶序列2(SEQ ID NO：47)。在这些实例中，包含TAS2R基因的载体包含靶序列1，并且包含Gα15基因载体包含靶序列2。

步骤2：选择步骤

将经转染的细胞在含有胎牛血清(FBS)的达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)中培养2天，随后含抗生素的DMEM-FBS中培养14天。含抗生素的时期具有如下的加至培养基的抗生素：嘌呤霉素(0.15μg/ml)、潮霉素(100μg/ml)。

步骤3：细胞传代

在抗生素上富集后，并且在引入荧光信号传导探针之前，将细胞在不存在抗生素的情况下传代8(p5-p13)次以上，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。

步骤4：细胞与荧光探针接触

收获细胞并且用信号传导探针(SEQ ID NO：48和49)进行转染。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用以将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX reagents、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或F ecturin。

通过信号传导探针检测的靶序列

靶1

5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3′(SEQ ID NO：46)

靶2

5′-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3′(SEQ ID NO：47)

在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的QuasarDye(BioSearch)的相似探针。还应当指出在某些情况下使用5-MedC和2-氨基dAmixmer探针而不是DNA探针。

无规非靶向fam探针用作递送对照(未显示)。

信号传导探针

信号传导探针作为100μM贮备液供应。

信号传导探针1-结合靶1

5′-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ3猝灭-3′(SEQ ID NO：48)

信号传导探针2-结合靶2

5′-Cy5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3猝灭-3′(SEQ ID NO：49)

应当指出BHQ3可以由探针1或探针2中的BHQ1或金颗粒置换。

BHQ3可以由探针1或探针2中的BHQ2或金颗粒置换。

步骤5：阳性细胞的分离

使细胞解离并且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离至有条形码的96孔板内。门控层次如下：符合门＞单峰门＞活门＞分选门。用这种门控策略，标记出双重阳性细胞的顶端0.1-1.3％以用于分选到有条形码的96孔板。

步骤6：步骤1-5和/或3-5的另外循环

利用非常紧凑的定时逻辑对实验进行分期。作为该运动的部分，存在进行以使冗余的分选完成以及获得额外的克隆的步骤3-5的两个完全循环。

步骤7：细胞群体的生长速率的估计

将平板转移至Hamilton Microlabstar自动化液体处理器。使细胞在2-3天条件生长培养基：新鲜生长培养基(DMEM/10％FBS)的1∶1混合物中温育多达20天，其中所述混合物补充有100单位青霉素/ml加上0.1mg/ml链霉素。在分选后7至20天使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依赖报告的超过70％的汇合。在上文指定的时间内3次获得汇合测量，并且用于计算生长速率。

步骤8：根据生长速率估计框并细胞群体

根据分选后约20天的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期组群涂铺)。独立地收集框并且涂铺在个别96孔板上以用于下游处理，并且可以存在超过一块靶平板/特定框。通过考虑生长速率的扩展且将覆盖细胞群体总数目的高百分比(至少约90％(作为估计))的范围归为同类来计算框。在跨越不同苦味受体细胞系的框中使用具有1.2-3.5天平均分隔的5个生长框。因此，每个框对应于在约11小时的生长速率或群体倍增时间差。

细胞可具有少于1天至超过2周的倍增时间-以便处理同时可根据生长速率合理框并的最多样化的克隆，我们通常优选以0.25-0.7天倍增时间/框产生3-9个框。本领域普通技术人员能理解如何根据具体情况调整框的紧密度和框的数目，并且如果依据它们的细胞周期同步化细胞时，则可进一步调整框的紧密度和数目。

步骤9-重复涂铺以加快平行加工且提供严格质量控制

使平板在标准和固定条件(湿润的37℃、5％CO₂)下在不含抗生素的DMEM培养基/10％FBS中温育。使细胞的平板分开，以产生4组(组由具有所有生长框的所有平板组成，这些步骤确保存在起始组的4个重复)靶平板。多达3块靶平板组提交用于低温保存(参见下文)，并且其余组按比例排列，并且进一步重复涂铺，以用于传代和用于功能测定实验。不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源用于每一组平板。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。

步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种

使3组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许每个组中的平板达到70至100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板使用Parafilm密封，并且随后用1至5cm泡沫分别围绕，并且放置至-80℃冷藏库中。

步骤11：用于产生稳定细胞系的起始转化步骤的方法和条件

步骤12：重排列的平板中的细胞的功能性的测试

由于受体细胞对象的规模的原因，不使用标准化-相反而是快速测定生长重排列的平板的功能性作为第一优先权(重排列后3-5代之间)，并且鉴定25个苦味受体的每一个的反应者的亚组群体。

步骤13：细胞群体的表征

在分选后3.5至6周之间筛选克隆，并且在功能上重新测试顶端克隆，并且在分选后5至6周进行鉴定。使细胞维持达到6周的细胞培养，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时程中，我们观察大小、形态、脆性、对胰蛋白酶消化或解离的应答、解离后的圆形/平均圆形度、活力百分比、朝向微汇合的趋势、或细胞维持的其它方面例如与培养平板表面的附着。

步骤14：细胞群体的潜在功能性的评估

使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用钙动员染料试剂盒(钙3，Molecular Devices/MDS)。细胞在96或384孔板中以多种不同密度进行测试并且分析应答。使用涂铺后的各个时间点，例如涂铺后12-48小时。还测试不同的涂铺密度的测定应答差异。

比较来自在低或较高代数下执行的实验的功能应答，以鉴定分选后经过6-11周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还指出注意随着时间推移改变的其它细胞特征例如细胞解离后再附着的时间。

步骤16-细胞的进一步评估

对符合功能和其它标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些。所选择的细胞群体在更大的组织培养皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤用于一致和可靠地传代。这些包括不同的涂铺细胞密度、平板包被、传代时间、培养皿大小/形式和包被、流体学最佳化、细胞解离最佳化(例如，在细胞解离缓冲液(Invitrogen)对胰蛋白酶存在的情况下解离)、所使用的解离试剂的体积和解离的时间长度、以及洗涤步骤。谷氨酰胺浓度是用于培养基的剂量范围。此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择显示一致生长、一致(即不改变形态学)合适附着以及功能应答的最终细胞系和备份细胞系。

步骤17：细胞库的建立

与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻平板(参见上文)在37℃下解冻，用DMEM/10％FBS洗涤2次，并且在湿润的37℃/5％CO₂条件下温育。细胞随后扩增2-3周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的细胞库，每一个细胞系的库由25个小瓶组成。将细胞在50％DMEM/10％FBS、40％FBS和10％DMSO中冷冻保存，以用于进一步最佳化实验。

步骤18：细胞库的测试

使来自细胞库(包括已进行扩增和再冷冻的解冻的细胞系的冷冻贮备液)的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得的细胞，以证实它们符合它们最初依据其进行选择的相同特征。

实施例27就天然苦味受体功功能表征细胞系

为了鉴定和测量配体诱导的表达苦味受体的HEK293细胞的应答，通过测量受体触发的细胞内钙水平的变化来监控受体激活。将细胞在黑色透明底平板中于标准生长培养基中培养过夜或作为测定缓冲液(10mM HEPES，130mM NaCl，2mM CaCl₂，5mM KCl，1.2mMMgCl₂，10mM葡萄糖，pH 7.4)中的悬浮液加入黑色透明底平板中。将细胞在室温下与缓冲液中的免洗钙敏感性荧光染料钙-3(MolecularDevices Corp.)一起温育1小时。将细胞平板和测试化合物(0.01μM-100mM)置于高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)中，所述读取器在仪器向细胞中加入测试化合物之前、过程中和之后收集平板荧光的图像。图像的软件(Hamamatsu FDSS)分析报告了细胞平板中每一个孔的相对荧光的变化。

测定跨越25个苦味受体细胞系以及对照细胞的多种化合物和提取物(其中有许多报告为苦味的)以测定活性和脱孤。

实施例28瞬时转染的天然受体与标记的受体之间的功能差异

进行测定之前的天然和标记的受体的瞬时转染允许分析天然受体与标记的受体之间的功能差异。作为实例，在小鼠Gα15蛋白和天然T2R16苦味受体或具有来自小鼠视紫红质基因的N末端标签的相同受体的瞬时转染后48小时在人胚肾(HEK)293T细胞中进行功能测定。将细胞在室温下与缓冲液(10mM HEPES、130mM NaCl、2mMCaCl₂、5mM KCl、1.2mM MgCl₂、10mM葡萄糖、pH 7.4)中的免洗钙敏感性荧光染料钙-3(Molecular Devices Corp.)一起温育1小时。在Hamamatsu FDSS荧光平板读取器中测量苦味受体活性的测定反应，所述读取器在仪器加入一定范围的浓度(0.01μM-100μM)的苦味提取物之前、过程中和之后收集平板荧光的图像。FDSS软件分析图像并且报告细胞平板中每一孔的相对荧光的变化。

将结果作图于图13中。如图13中所示，苦味提取物选择性激活天然苦味受体至比含视紫红质标签的受体更大的程度。该结果表明天然人苦味受体和标签的人苦味受体显示不同功能活性，并且强调了基于表达天然蛋白质并且生理学相关的细胞的测定对于适当的受体分配和脱孤的重要性。

实施例29苦味受体的功能性克隆的产生的高成功率

成功率(所有分离的克隆中表达具有功能活性的受体的克隆的数目)是测定产生稳定细胞系的功效的至关重要的参数。我们进行我们使用实施例26中描述的方法分离的克隆的功能测定，并且发现大于80％的分离的克隆具有功能活性。

作为实例，将就特定人苦味受体T2R41的表达分离的个别克隆细胞系培养在96孔板的单个孔中，并且通过初步钙敏感染料加载测量确认每一个孔中活细胞的存在。不具有或具有低染料加载的孔被当作空白对照并且在图14中以黑色显示。随后测试细胞的功能性苦味受体对苦味提取物的添加的反应，通过受体介导的钙动员进行读出并且通过染料荧光的变化进行监控。包含细胞但显示少于2倍的高于初始荧光的信号的增加的孔被认为是阴性的并且在图14中以白色显示，然而具有高于2倍的增加的信号的孔以灰色显示。在该平板中，针对该苦味受体基因的表达而分离的64个克隆中，57个克隆(89％)显示显著的功能性苦味受体反应。

实施例30苦味受体反应的功能性实时成像

同质性是产生稳定细胞系中的另一个重要参数。我们使用苦味受体反应的功能性实时成像来测定使用实施例26中描述的方法分离的细胞与只通过药物选择发现的细胞相比较的同质性。在测定之前24小时，将表达苦味受体和G蛋白的细胞涂铺在96孔多聚D赖氨酸包被的黑色透明平板(Becton Dickinson)上。用在测定缓冲液(130NaCl，2mM CaCl，1.2mM MgCl₂，5mM KCl，10mM葡萄糖，10mM HEPES，pH 7.4)中稀释的钙敏感性荧光染料装载细胞。将细胞温育1小时，随后以适当的浓度使用苦味受体的已知激活剂。使用AxioVert 200EPI-荧光显微镜(Zeiss)，利用合适的滤光片记录细胞的钙流反应3分钟。使用MetaMorph6.3r7软件(Molecular Devices)分析数据。

检测分离的克隆细胞系中同源苦味受体的反应(图15，上方的照片)，如通过因苦味受体激活而引起的细胞内游离钙的增加所表示的。在相似地处理的药物选择的细胞的培养物中，在应用相同的激活剂后观察到测定反应的大量异质性(图15，下方的照片)。该结果显示产生本发明的表达苦味受体的细胞系的方法(即，实施例26)可选择遗传上和功能上一致的细胞群体。

实施例31表达苦味受体的细胞系中功能反应的一致性

因为苦味受体是G蛋白偶联受体(GPCR)，因此为了产生在不同化合物存在的情况下不同苦味受体之间苦味应答的有意义的比较，重要地测定不同细胞系中的G蛋白偶联功能一致性。跨越一系列浓度的G蛋白偶联激动剂的不同细胞系的相对反应应当是一致的。为了验证之，我们在利用不同浓度的异丙肾上腺素(一种在细胞中内源性表达的3-肾上腺素能受体的激动剂)的剂量反应曲线实验中测试表达不同人苦味受体和小鼠Gα15蛋白的所有25个细胞系的Gα15介导的受体反应的一致性。该内源受体当受刺激时，可偶联表达的Gα15并且诱发细胞内游离钙的变化。将百分比反应作为异丙肾上腺素浓度的函数作图，并且将结果进行曲线拟合以计算EC₅₀值(半最大受体激活的浓度)(参见图16)。通过比较跨越所有25个分离的克隆苦味细胞系，发现该EC₅₀值为4.9±0.41nM，与公开的文献值接近一致，并且在显示极小的细胞系间的偏差。

实施例32功能反应性宽泛调节的、适度调节的和选择性受体的鉴定

在基于功能细胞受体研究中测试使用本发明的方法(即，实施例26)产生的稳定地表达天然人苦味受体基因的细胞系以检测化学上多样的化合物的集合对它们的激活。诱发相应人苦味受体的剂量依赖性激活的物质1-12列于在图17中发现它们所激活的受体旁边。这允许鉴定宽泛调节、不太宽泛调节的以及狭窄调节的受体。

实施例33通过化合物文库激活的受体的鉴定

测试化合物文库针对25个人苦味受体细胞系的每一个的活性。在基于功能细胞的测定中产生关于加入化合物后受体活性的数据，并且将所述数据表示为高于受体的基线活性(即，在只加入缓冲液时的受体活性)的百分比活性。然后将各受体上各化合物的活性编码成在各受体上具有低(比基线活性高＜100％；白色)、中(比基线活性高101-500％；浅灰色)、高(比基线活性高501-1000％；深灰色)或极高(比基线活性高＞1001％，黑色)活性的加亮化合物(图18)。所得的模式提供了在苦味受体之间具有选择性或宽泛性活性的化合物(行)和显示对化学上多样的化合物组的宽泛的或选择性反应的受体(列)的图解表示。

实施例34具有与激动剂诱导的苦味受体活性的拮抗剂相似的功能活性的化合物的类似物的鉴定

为了测试基于表达苦味受体的细胞的测定鉴定具有相似功能活性的化合物的类似物的能力，测试已知的苦味阻断化合物的21个结构类似物的苦味受体的抑制激动剂诱导的活性的能力。比较抑制由激动剂诱导的苦味受体的活性的类似物的结构。从而，表达苦味受体的细胞系可帮助有效苦味受体拮抗剂的发现。

实施例35使用天然细胞系和标记的细胞系的不同受体的赋值

在实施例28中描述的瞬时转染后进行的功能测定显示天然和标记的人苦味受体具有不同的功能活性。这也使用表达天然苦味受体的细胞系与表达标记的苦味受体的细胞系相比较来验证。简而言之，利用表达天然苦味受体的稳定的细胞系，使用测量钙动员的基于功能细胞的受体测定来产生对糖精的苦味受体赋值。如Pronin等人，“Identification of Ligands for Two Human Bitter T2R Receptors”，Chem.Senses，29：583-593(2004)中所述，利用昆虫产生的具有N末端小鼠视紫红质标签序列的重组受体蛋白在对GTP水解的基于膜级分的无细胞测定中产生对糖精的苦味受体赋值。不同的赋值示于图19中。对相同苦味化合物的苦味受体赋值之间的差异突显了天然苦味受体是生理相关功能赋值的必要条件。

实施例36产生稳定的表达甜味受体的细胞系

转染

HEK293T(ATCC CRL-11268)用3种单独质粒进行共转染，一种质粒编码T1R2(SEQ ID NO：31)，一种质粒编码T1R3(SEQ ID NO：32)并且另一种质粒编码信号传导分子(小鼠Gα15，SEQ ID NO：33)。尽管药物选择在本发明的方法是任选的，我们还是包括一种药物抗性标记/质粒。序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的靶序列是靶序列1(SEQ ID NO：28，使用SEQ ID NO：123的靶序列)、靶序列2(SEQ ID NO：29，使用SEQ ID NO：124的靶序列)和靶序列3(SEQ ID NO：30，使用SEQ ID NO：125的靶序列)。在这些实例中，T1R2基因载体包含靶序列3、T1R3基因载体包含靶序列1，并且Gα15基因载体包含靶序列2。常规地在含药物的培养基中选择细胞进行10-14天。

细胞与荧光探针接触

收获选择的细胞并且用信号传导探针(SEQ ID NO：38-40)进行转染。信号传导探针1结合标签序列1，信号传导探针2结合标签序列2并且信号传导探针3结合标签序列3。随后解离和收集细胞用于分析且使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。

如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用以将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX reagents、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或F ecturin。

信号传导探针1

5′-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3猝灭-3′(SEQ ID NO：38)

信号传导探针2

5′-Cy5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3猝灭-3′(SEQ ID NO：39)

信号传导探针3

5′-Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGCBHQ1猝灭-3′(SEQ ID NO：40)

具有以粗体显示的靶序列的靶序列1(甜味)

AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAAT

ATCTGGGCCCGGAAAGCCTTTTTCTCTGTGATCCGGTACAGTCCTTCTGC(SEQ ID NO：123)

具有以粗体显示的靶序列的靶序列2(甜味)T

AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGAGGCAGGTGGACAGCTTGGTTCTAAT

ATCTGGGCCCGGAAAGCGTTTAACTGATGGATGGAACAGTCCTTCT GC (SEQ IDNO：124)

具有以粗体显示的靶序列的靶序列3(甜味)

AAGGGCGAATTCGGATCCGCGGCCGCCTTAAGCTCGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAAT

ATCTGGGCCCGGAGATG(SEQ ID NO：125)

可使用其它靶序列和信号传导探针(参见，例如，如2005年9月1日公布的国际专利申请公开案No.WO2005/079462(申请号PCT/US05/005080)中所描述的)。例如，BHQ3可以由探针1或探针2中的BHQl或金颗粒置换。应当指出BHQ1可以由探针3中的BHQ2或Dabcyl置换。可在某些实验中使用利用具有与Cy5相似的光谱性质的Quasar Dye(BioSearch)的相似探针。还应当指出在某些情况下使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。

阳性细胞的分离

标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离至96孔板内。操作细胞分选，从而使得每孔放置单个细胞。在选择后，将细胞在不存在药物的培养基中进行扩增。

功能性转化

我们在多种生长条件(包括例如低葡萄糖DMEM培养基或在具有10％血清或无血清的无葡萄糖Leibovitz L-15培养基)中使用相同细胞和不同细胞的等分试样维持甜味受体细胞(如上选择和扩增的)。将一些细胞维持在含有不同浓度的其它糖例如半乳糖的培养基中。随后我们依据它们对甜味配体适当地应答并且不对其它刺激物(MSG)应答的能力表征在多种条件下维持的甜味受体细胞系的细胞。

不期望受理论束缚，在不同培养基条件中的生长可以例如因基因表达水平、基因组组织和受体在细胞表面上的功能性表达的变化而功能性转化细胞。经评估并且经显示影响细胞的功能测定应答的不同培养基中的参数包括血清浓度(即低血清浓度和血清剥夺)、糖剥夺和测定板包被(例如，多聚D赖氨酸和层粘连蛋白)。这些结果显示当将细胞维持在不同培养基条件中时甜味受体细胞系的细胞的特征可以不同。它们还显示通过荧光探针选择的不同细胞可在相同生长条件下具有不同的特征。我们表征通过荧光探针选择的细胞的一个实例示于图20中。如图20中所显示的，在不同条件(1、2和最终)中培养的相同细胞的等分试样显著不同地对鲜味(MSG)和甜味(果糖)配体应答。将条件1中培养的细胞涂铺在剥夺血清的低葡萄糖培养基中。将条件2中培养的细胞涂铺在含10％血清的低葡萄糖培养基中过夜，然后在测定前转换至剥夺血清的培养基中。将在条件1或2中培养的细胞涂铺在包被的板(Corning#3665)上。“最终”条件包括在包被的板(Corning#3300)上和具有血清剥夺的低葡萄糖培养基中高密度培养。条件1和条件2中培养的细胞对鲜味激动剂的应答超过对甜味激动剂的应答。相反地，“最终”培养条件中培养的细胞对果糖强烈地应答但对MSG无应答。因此，这些细胞产生在生理上和药理上相关的甜味受体。

实施例37依据天然甜味受体功能产生细胞系

1.基因表达的验证和定量

通过使用qRT-PCR，我们测定了在上述细胞(“最终”)中表达的每一个鲜味受体亚单位的相对量(RNA)。使用商购可得的RNA纯化试剂盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)从1-3×10⁶个哺乳动物细胞纯化总RNA。然后使用严格的DNA酶处理方案(TURBO DNA-free Kit；Ambion)处理RNA提取物。使用Reverse Transcriptase试剂盒(Superscript III，Invitrogen)，利用1μG无DNA的总RNA和250nG随机引物(Invitrogen)在20μL中进行第一链cDNA合成。该反应的阴性对照包括其中在cDNA合成步骤中不加逆转录酶或RNA的样品。在下列条件下在热循环仪(Mastercycler Eppendorf)中进行cDNA和PCR产物合成：在25℃下进行5分钟，在50℃下进行60分钟；在70℃下进行15分钟，执行反应终止。

为了分析基因表达(RNA)，使用针对T1R2、T1R3和小鼠Gα15cDNA的探针(MGB TaqMan probes，Applied Biosystems)。关于样品标准化对照GAPDH，利用Pre-Developed TaqMaN Assay试剂，AppliedBiosystems。在50μL反应体积中利用40ng cDNA建立反应，包括阴性对照和阳性对照(质粒DNA)，一式三份。测定表达(RNA)的每一个甜味受体亚单位的相对量。图21图解描述了结果并且显示所有3种核酸在甜味受体细胞系中表达(RNA)。T1R2、T1R3和Gα15的表达水平分别为对照细胞中观察到的水平的约100,000、10和100,000倍。

将标准单终点RT-PCR法用于估计根据上述方案(“最终的”)产生的甜味受体细胞系的1和9个月培养物中T1R2、T1R3和Gα15的基因表达(RNA)。将细胞在24孔板版式中培养至80％汇合，收获细胞，然后使用商购可得的RNA制备试剂盒(RNAqueous kit，Ambion)分离RNA。按照商业第一链cDNA合成试剂盒(Superscript III kit，Invitrogen)的方案，利用oligo(dT)12，18引物将范围为5pg至5μg的纯化的总RNA用于进行逆转录。在第一链合成后，将对甜味受体的亚单位的核酸(T1R2、T1R3)以及小鼠Gα15的核酸特异的oligo组独立地在PCR反应混合物(HotStart Taq)中组装。在45个循环的PCR后，利用琼脂糖凝胶电泳进一步分析扩增子样品。

在图22中举例说明了来自这些单终点RT-PCR实验的结果。图22描述了用于RT-PCR实验的琼脂糖凝胶的代表性照片。在1个月和更久的9个月的培养物中检测到所有编码甜味受体的核酸的强烈表达(RNA)，这证明在“最终”条件下培养的本发明的细胞系的稳定性的异常水平。

2.调节剂的基于细胞的测定

在测定之前48小时将本发明的细胞在10cm培养皿中以高密度接种于生长培养基(低葡萄糖DMEM或L15培养基，所述培养基补充有血清和标准生长添加剂)中。将细胞从培养基质解离并且在测定之前24小时将其接种在96孔板中。去除培养基，然后加入钙敏感性荧光染料(钙-3，Molecular Devices Corp.)，将该染料稀释于甜味测定缓冲液(130mM NaCl，1.1mM KH₂PO₄，1.3mM CaCl₂，20mM HEPES和3mM NaHPO₄*7H₂O)。将细胞在该培养基中温育1小时。然后将平板加载在高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上。将测试化合物(即果糖(Sigma)、蔗糖(Sigma)、葡萄糖(Sigma)、乙酰舒泛K(Fluka)、糖精钠(Sigma)、环己基氨基磺酸钠(Aldrich)、steviva(Steviva BrandsInc.)、罗汉果苷(Slim Sweet，Trimedica)和山梨糖醇(Sigma))在甜味测定缓冲液中稀释并且加入各孔。检测钙流，进行90秒。将在如上缓冲液中稀释的激活剂(即MSG)以范围在10μM至100mM之间的终浓度加入各孔，然后记录相对荧光的变化，再进行另外90秒。

3.依据基于甜味细胞的测定确定Z′和EC ₅₀ 值

为了测试甜味受体应答在此类表达甜味受体的细胞中的功效，将已建立的甜味受体激活剂果糖在上述测定中用作测试化合物。将果糖以75mM的浓度加入测试孔(奇数列)，并且对照孔(偶数列)只接受缓冲液。在最终的测定条件中，如通过荧光平板读取器测量的钙流测量所报导的(FLIPR3操作系统，Molecular Devices)。一个重复数次的测定中，细胞具有0.8的Z’值。参见图23(一个示例性测定)。该Z’值表示所产生的表达甜味受体的细胞在基于细胞的测定中识别果糖，并且可使用此类细胞可靠地且稳定地进行这些测定。

为了测试本发明的表达甜味受体的细胞系中甜味受体应答的灵敏度，通过向细胞中加入剂量不断增加的多种甜味受体激动剂，然后如上所述测量应答来进行一系列剂量反应实验。在一个测定中(图24)，发现此类测试化合物的EC₅₀值如下：对于糖精低于1.5mM，对于蔗糖低于3.5mM，对于果糖低于4.3mM以及对于葡萄糖低于34.1mM。这些结果表明在本发明的细胞系中产生的甜味受体在本发明的表达甜味受体的细胞系中展示了对许多已知甜味受体配体的强敏感性。

在该测定中，还发现当将表达甜味受体的细胞与不同甜味剂接触时钙流反应曲线不同。如图25中举例说明的，由细胞对不同配体产生的反应的长度和强度可变化。例如，steviva显示比许多其它测试的甜味剂更长和更强的反应。这些结果暗示本发明的细胞和细胞系对于对某些高强度甜味剂例如steviva看到的甜味延迟(甜味的希望的持续)的测定是有用的。

实施例38内源性表达至少一个甜味受体亚单位的稳定的细胞系的产生和分离

信号传导探针的设计

设计针对对应于T1R2或T1R3基因座的序列的信号传导探针。所述信号传导探针针对表23中所列的编码外显子、非编码内含子或非编码非翻译序列。

信号传导探针S21、S22、S23、R2-3U1和R2-I1在5′末端包含Cy5.5荧光标记和在3′末端包含BHQ2猝灭剂。信号传导探针S31、S32、S33、R3-3U1和R3-I31在5′末端包含6-FAM荧光基团和在3′末端包含BHQ1。信号传导探针还可包含其它荧光基团或猝灭剂。合成信号传导探针，将其缀合至它们各自的标记并且在Genelink(Hawthorne，NY)进行纯化。

表23

图26和27描述了T1R2和T1R3基因座和内含子-外显子编码结构的图解表示法。可使用其它靶序列和信号传导探针(参见，例如，如2005年9月1日公布的国际专利申请公开案No.WO2005/079462(申请号PCT/US05/005080)中所描述的)。例如，BHQ1可以由探针3中的BHQ2或Dabcyl置换。还应当指出在某些情况下可使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。

将细胞与荧光探针接触

在分别的实验中用信号传导探针的下列组合之一转染HEK293T(ATCC CRL-11268)、HuTu(ATCC HTB-40)或H716(ATCCCCL-251)细胞：a)S21和S31，b)S21和S32，c)S21和S33，d)S22和S31，e)S22和S32，f)S22和S33，g)S23和S31，h)S23和S32，i)S23和S33，j)R2-3U1和R3-3U1，k)R2-3U1和R3-I31，l)R2-I1和R3-3U1以及m)R2-I1和R3-I31。将HEK 293T在含有10％胎牛血清(FBS)(Sigma#SAC1203C)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma G7513)和10mMHEPES(Sigma H0887)的达尔贝科改良的伊格尔培养基(Sigma#D5796)中维持，将HuTu细胞在含有10％FBS(Sigma#2442)、2mM L-谷氨酰胺(SigmaG7513)和1mM丙酮酸钠(Sigma#S8636)的伊格尔氏基本组分培养基(Sigma ##D5650)中维持以及将H716细胞在含有10％FBS(Sigma #F2442)的Roswell Park Memorial Institute 1640(Gibco#11875-093)中维持。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用以将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX reagents、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或F ecturin。

在不同的实验中，如下所述在引入荧光探针之前，用或不用诱变处理(例如，紫外光)处理HEK 293T细胞、HuTu细胞和H716细胞以诱导随机诱变或基因激活。将细胞以1.25×10⁶个细胞/ml重悬浮于无血清培养基中，然后将其暴露于紫外光辐照以从主要发射254nM波长的杀菌灯泡(Sylvania)递送1焦耳/m²/秒，进行15分钟。还可使用其它诱变处理(例如，通过与诱变剂例如甲烷磺酸乙酯(EMS)接触进行的化学诱变)。可将细胞与终浓度(例如，200μg/ml)的甲烷磺酸乙酯(EMS；Sigma)一起温育并且在它们转移至不存在EMS的培养基之前进行温育。

随后将细胞与信号传导探针接触，解离，并且使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)收集以进行测试。

阳性细胞的分离

根据流式细胞术领域中标准实践和本领域普通技术人员熟悉的标准分析方法用于门控或选择阳性发荧光的细胞。将荧光激活细胞分选术用于将归入所需门内或具有所需荧光的阳性发荧光的细胞直接分离至96孔板内。设置细胞分选参数以用于每孔放置一个细胞的分离。通过门控尖端1％的相对于整个群体具有最高荧光强度的细胞来分离与至少一个信号传导探针的不同绝对或相对荧光水平相关的经转染的细胞。

在分别的实验中，通过门控尖端0.1％的相对于整个群体具有最高信号强度的细胞来分离与至少一个信号传导探针的不同绝对或相对荧光水平相关的经转染的细胞。

分离单个细胞并且将其在如下所述的培养基中维持。对于每一种细胞类型，将等比例的其各自条件培养基和新鲜培养基组合使用。通过将每一种细胞类型在其各自的新鲜培养基中培养2天，收获，然后过滤培养基来制备条件培养基。分离单个地分离的HEK 293T细胞，并且将其维持在含有10％FB S(Sigma#SAC 1203C)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma G7513)、10mM HEPES(Sigma H0887)和1∶50稀释的青霉素/链霉素溶液(终浓度为100单位青霉素/100μg链霉素/mL)(Sigma#P4458)的达尔贝科改良的伊格尔培养基(Sigma#D5796)中。分离单个地分离的HuTu细胞，并且将其维持在10％FBS(Sigma#2442)、2mML-谷氨酰胺(SigmaG7513)、1mM丙酮酸钠(Sigma#S8636)和1∶50稀释的青霉素/链霉素溶液(终浓度为100单位青霉素/100μg链霉素/mL)(Sigma#P4458)的伊格尔氏基本组分培养基(Sigma##D5650)中。分离单个地分离的H716细胞，并且将其含有10％FBS(Sigma#F2442)和1∶50稀释的青霉素/链霉素溶液(终浓度为100单位青霉素/100μg链霉素/mL)(Sigma#P4458)的Roswell Park Memorial Institute1640(Gibco #11875-093)中。

使用机器人细胞培养法传代分离的细胞并且维持在96孔组织培养板中。具体地，将MICROLAB STAR^TM仪器用于进行许多自动化细胞培养任务(例如，去除培养基、替换培养基、添加试剂、细胞洗涤、去除洗涤溶液、加入分散剂、从培养器皿中取出细胞、将细胞加入培养器皿中等等)。也可使用其它细胞培养法，包括手工方法。随后在10cm组织培养皿中扩增细胞，使用标准手工组织培养技术(例如，去除培养基、细胞洗涤、添加培养基)进行培养。

在培养中扩增分离的细胞以产生来源于单个地分离的细胞的细胞群体。通过将它们培养在如下所述的它们各自的培养基中来扩增单个地分离的细胞。转移HEK 293T细胞以在含有10％胎牛血清(FBS)(Sigma#SAC1203C)、2mM L-谷氨酰胺(SigmaG7513)和10mMHEPES(Sigma H0887)的达尔贝科改良的伊格尔培养基(Sigma#D5796)中维持，转移HuTu细胞以在含有10％FBS(Sigma#2442)、2mM L-谷氨酰胺(SigmaG7513)和1mM丙酮酸钠(Sigma#S8636)的伊格尔氏基本组分培养基(Sigma##D5650)中维持。转移H716细胞在含有10％FB S(Sigma#F2442)的Roswell Park Memorial Institute 1640(Gibco#11875-093)中维持。

功能测试

随后使用基于功能细胞的测定依据它们对甜味配体反应的能力表征各自由单个分离的细胞的扩增产生的细胞的群体。在这些实验中使用15mM果糖。取决于细胞类型，如下所述使用不同的条件。

在测定前48小时，在10cm培养皿中以1200万至2000万个细胞的高密度将细胞接种在补充有10％血清(Sigma#SAC1203C)、4mML-谷氨酰胺(Sigma G7513)、10mM HEPES(Sigma H0887)和1∶50稀释的青霉素/链霉素溶液(终浓度为100单位青霉素/100μg链霉素/mL)(Sigma#P4458)的生长培养基L15培养基(Sigma#L5520)中。将细胞从培养基质解离并且在测定之前24小时将其以35,000个细胞/孔接种在384孔板中。18至24小时后除去培养基。随后向各孔加入稀释在甜味测定缓冲液(130mM NaCl，1.1mM KH₂PO₄，1.3mM CaCl₂，20mM HEPES和3mM NaHPO₄*7H₂O)中的钙敏感性荧光染料(Fluo-4，Invitrogen)。将细胞在该培养基中温育1小时。然后将平板加载在高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上。向各孔中加入甜味测定缓冲液和DMSO至0.2％DMSO的终浓度。在向各孔加入含有果糖的甜味测定缓冲液至15mM果糖的终浓度之前、过程中和之后检测钙流或测定反应。可任选地用钙敏感性荧光染料的猝灭剂进行测定。此类猝灭剂在本领域内是众所周知的，包括例如二苦胺(DPA)、酸性紫17(AV17)、二嗪黑(Diazine Black)(DB)、HLB30818、台盼蓝、溴酚蓝、HLB30701、HLB30702、HLB30703、硝嗪黄、硝基红、DABCYL(Molecular Probes)、QSY(Molecular Probes)、金属离子猝灭剂(例如，Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺)和碘离子。

可选地，在测定前24或48小时，从培养基质解离细胞，并且在384孔板中以2,500-20,000个细胞/孔的细胞密度将细胞接种在补充有10％血清(Sigma#SAC1203C)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma G7513)和1mM丙酮酸钠(Sigma#S8636)的伊格尔氏基本组分培养基(Sigma##D5650)或等部分的该培养基和L-15培养基(Sigma，L5520)的混合物中。18至52小时后除去培养基。随后向各孔加入稀释在甜味测定缓冲液(130mM NaCl，1.1mM KH₂PO₄，1.3mM CaCl₂，20mM HEPES和3mM NaHPO₄*7H₂O)中的钙敏感性荧光染料(Fluo-4，Invitrogen)。将细胞在该培养基中温育1小时。然后将平板加载在高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上。向各孔中加入甜味测定缓冲液和DMSO至0.2％DMSO的终浓度。在向各孔加入含有果糖的甜味测定缓冲液至15mM果糖的终浓度之前、过程中和之后检测钙流或测定反应。

可选地，将细胞沉淀，然后重悬浮于稀释在甜味测定缓冲液(130mM NaCl，1.1mM KH₂PO₄，1.3mM CaCl₂，20mM HEPES和3mMNaHPO₄*7H₂O)中的钙敏感性荧光染料(Fluo-4，Invitrogen)中。将细胞涂铺在384孔板中，并且在该培养基中温育1小时。随后将平板加载在高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上。向各孔中加入甜味测定缓冲液和DMSO至0.2％DMSO的终浓度。在向各孔加入含有果糖的甜味测定缓冲液至15mM果糖的终浓度之前、过程中和之后检测钙流或测定反应。

还可使用其它甜味受体(包括高强度天然和人造甜味剂以及天然和人造甜味剂)，例如蔗糖(Sigma)、葡萄糖(Sigma)、乙酰舒泛K(Fluka)、糖精钠(Sigma)，环己基氨基磺酸钠(Aldrich)、steviva(Steviva BrandsInc.)、罗汉果苷(Slim Sweet，Trimedica)和山梨糖醇(Sigma))。此外，其它味道配体包括苦味、鲜味、脂肪味、清爽味、辣味和酸味配体或促味剂以及具有未知或固有味道的化合物可用于测定甜味反应的选择性和特异性。此外，可在其它化合物(包括增强剂或阻断剂，例如甜味增强剂莱鲍迪苷-C RP44(RedPoint Bio)以及蔗糖素增强剂S2383(Senomyx)和蔗糖增强剂S5742(Senomyx))存在的情况下测试任何促味剂或配体。

此外，可使用其它培养基和温育步骤以及可使用其它平板版式例如96孔板和1536孔板。

通过在功能荧光钙流报告分子测定中监控细胞的反应或激活动力学，将从单个地分离的细胞培养的并且发现天然地和/或通过基因激活表达甜味受体的至少一个亚单位的许多细胞群体鉴定为具有对果糖的反应。参见，图8。图28A显示HuTu细胞对果糖反应。图28B显示H716细胞对果糖反应。图28C显示293T细胞对果糖反应。

高通量筛选

甜味激动剂和/或调节剂可通过利用高通量筛选(HTS)测试化合物对根据上述方法涂铺的细胞的效应来鉴定。向具有或不具有天然或合成的化合物文库或提取物或提取物级分的一种或多种组分或化合物的各孔中加入甜味测定缓冲液。DMSO或其它有机溶剂例如乙醇也用于帮助溶解化合物或提取物至低于5％DMSO(例如0.2％)的终浓度。检测钙流进行一段时间(例如，90秒)。随后向各孔中加入稀释在甜味测定缓冲液中的果糖或另一种甜味配体至终浓度(例如，15mM)。记录相对荧光的变化，进行另外一段时间(例如，90秒)。还将测试许多对照化合物。

重复该测试直至部分或全部化合物文库被筛选。分析数据以鉴定活性化合物。使用该测定方案或其它测定方案鉴定激动剂和调节剂，包括阻断剂、增强剂或变构调节剂。使用不同甜味配体的化合物的测试用于鉴定调节甜味受体对仅一种、全部或一个亚组的甜味配体的反应的化合物，例如具有选择性或泛活性的化合物。这通过相同化合物或化合物文库的独立高通量筛选(但在各筛选中使用一种或多种不同的甜味配体)来进行。

通过检查反应曲线的时间动力学(例如，衰减或量级或反应的速率)，可鉴定具有其它定性和定量效应的调节化合物。

品尝试验

按照本领域内中的和本领域普通技术人员熟悉的标准实践在人感觉试验中测试使用基于甜味细胞的测定鉴定的化合物。测试化合物的固有味道特征(例如，甜味、苦味、鲜味、酸味、清爽味或辣味以及后味)以及可被感觉的其它特性或性质例如口感、使麻木、疼痛、刺激和有刺痛感。评估具有和不具有化合物的样品以检测化合物的感觉性质。在一种或多种不同的形式或基质(包括液体、半固体、固体、粉末、片剂、胶囊、胶状物、喷雾剂、可溶条(dissolvable strip)、食品或饮品制剂)中进行测试。对含有或不含化合物的样品进行评价以检测该化合物的感知性质。可测试不同剂量的化合物。在某些实验中，在另外包含具有味道的其它化合物或组分的样品中测试化合物，并且估量这样的味道的感觉的变化、改变、增加、增强或抑制。可在被设计用以溶解其的试剂(包括醇例如乙醇、DMSO或其它溶剂)存在的情况下提供化合物。可加热、冷冻或在室温下测试样品。还可测试化合物的增强或阻断甜味或其它味道的能力。利用或不利用鼻夹进行感觉试验以鉴定任何气味相关的效应。使用“吸吐”模式进行品尝试验，其中将低浓度的化合物用于限制人暴露。品尝化合物以测定它们对一种或多种甜味配体和甜味剂的感觉的效应。可使用功能脑成像或其它成像试验(例如，磁共振成像)研究与化合物接触或评估化合物的人或动物受试者以使体内活性的模式与化合物发生关系。

实施例39产生稳定的表达气味受体的细胞系

步骤1-转染

293T细胞用2种单独质粒进行共转染，一种质粒编码人气味受体(SEQ ID NO：134-135之一)，并且另一种质粒编人Gα15信号传导蛋白(SEQ ID NO：133)。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX试剂、Fugene6、DOTAP/DOPE，Metafectine或Fecturin。尽管药物选择在本文中描述的方法是任选的，我们还是包括一种哺乳动物药物抗药标记/质粒。本文中使用的质粒包含CMV启动子以进行气味受体基因或Gα15基因的表达。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列(其包含靶序列)存在于各质体中，从而使得标签与气味受体或Gα15转录物共转录或与其融合。标签包含能够与信号传导探针杂交的靶序列。所利用的靶序列是靶序列1(SEQ ID NO：129)和靶序列2(SEQ IDNO：130)，并且所使用的靶序列是靶序列1(SEQ ID NO：136)和靶序列2(SEQ ID NO：137)。在这些实例中，编码气味基因的质粒包含靶序列1，并且编码Gα15基因的质粒包含靶序列2。

步骤2：选择步骤

经转染的细胞在含有胎牛血清(FBS)的达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)中培养2天，随后在含抗生素的DMEM-FBS中培养2周。含抗生素的时期具有如下的加入培养基的抗生素：嘌呤霉素(0.3μg/ml)和潮霉素(110μg/ml)、嘌呤霉素(0.15μg/ml)和潮霉素(75μg/ml)以及嘌呤霉素(0.05μg/ml)和潮霉素(18μg/ml)。

步骤3：细胞传代

在通过抗生素选择富集后，并且在引入荧光信号传导探针之前，将细胞在不存在抗生素的情况下传代3至15(p3-p15)次以上，以允许任何不稳定的表达减退的时间。

步骤4：细胞与荧光信号传导探针接触

收获细胞并且用信号传导探针(SEQ ID NO：131和132)进行转染。如本领域普通技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如，质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用以将核酸引入宿主细胞内的试剂的实例包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX reagents、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或Fecturin。

通过信号传导探针检测的靶序列

靶序列1

5′-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3′(SEQ ID NO：129)

靶序列1，靶序列以粗体显示(气味)

5′-AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGAGGCAGGTGGACAGGAAGGTTCTAAT

CATCTGGGCCCGGAAAGCCTTTTTCTCTGTGATCCGGTACAGTCCTTCTGC-3′(SEQ ID NO：136)

靶序列2

5′-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3′(SEQ ID NO：130)

靶序列2，靶序列以粗体显示(气味)

5′-AGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGAGGCAGGTGGACAGCTTGGTTCTAAT

ATCTGGGCCCGGAAAGCGTTTAACTGATGGATGGAACAGTCCTTCTGC-3′(SEQ IDNO：137)

信号传导探针

信号传导探针作为100μM贮备液供应。

信号传导探针1-结合靶1

5′-Quasar670GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2猝灭-3′(SEQ ID NO：131)

信号传导探针2-结合靶2

5′-Cy5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ2猝灭-3′(SEQ ID NO：132)

还应当指出在某些情况下使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。

在一些实验中无规非靶向6-fam探针用作递送对照(未显示)。

步骤5：阳性细胞的分离

使细胞解离并且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器(Beckman Coulter，Miami，FL)进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离至有条形码的96孔板内。门控层次如下：符合门＞单峰门＞活门＞分选门。用这种门控策略，标记出双重阳性细胞的顶端0.1-2％用于分选到有条形码的96孔板。

步骤6：步骤2-5和/或3-5的另外循环

利用非常紧凑的定时逻辑对实验进行分期。作为该方案的部分，进行步骤2-5或步骤3-5的两个完全循环以使冗余的分选完成以及获得额外的克隆。

步骤7-细胞群体的生长速率的估计

将平板转移至Hamilton Microlabstar自动化液体处理器。使细胞在2-3天条件生长培养基：新鲜生长培养基(DMEM/10％FBS)的1∶1混合物中温育达到20天，其中补充有100单位青霉素/ml加上0.1mg/ml链霉素。在分选后7至30天使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依赖报告的超过70％的汇合。在上文指定的时间内3次获得汇合测量，并且用于计算生长速率。

步骤8-根据生长速率估计框并细胞群体

根据分选后约20-30天的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期组群涂铺)。独立地收集框并且涂铺在个别96孔板上以用于下游处理，并且可以存在超过一块靶平板/特定框。通过考虑生长速率的扩展且将覆盖细胞群体总数目的高百分比(至少约30-90％(作为估计))的范围归为同类来计算框。在跨越不同气味味受体细胞系的框中使用具有约15-40小时平均分隔的9个生长框。因此每个框对应于在约1至5小时的生长速率或群体倍增时间差。

细胞可具有少于1天至超过2周的倍增时间-以便处理同时可根据生长速率合理框并的最多样化的克隆；我们通常优选以0.25-0.7天的倍增时间/框产生3-9个框。本领域普通技术人员能理解如何根据特具体情况调整框的紧密度和框的数目，并且如果依据它们的细胞周期同步化细胞时，则可进一步调整框的紧密度和数目。在该实例中，选择具有15至40小时的倍增时间的细胞系进行框并以增加框的紧密度。

步骤9-重复涂铺以加快平行加工且提供严格质量控制

使平板在标准和固定条件(湿润的37℃、5％CO₂/95％空气)下在含抗生素(100单位青霉素/ml加上0.1mg/ml链霉素)的DMEM培养基/10％FBS中温育。使细胞的平板分开，以产生4组(组由具有所有生长框的所有平板组成，这些步骤确保存在起始组的4个重复)靶平板。多达3块靶平板组提交用于低温保存(参见下文)，并且其余组按比例排列，并且进一步重复涂铺，以用于传代和用于功能测定实验。不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源用于每一组平板。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。

步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种

使2组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许每个组中的平板达到70至100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板使用

密封，并且随后用1至5cm泡沫分别围绕，并且放置至-80℃冷藏库中。

步骤11：用于产生稳定细胞系的起始转化步骤的方法和条件

其余2组平板组如步骤9中所述进行维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。

步骤12：重排列的平板中的细胞的功能性的测试

控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异通过跨越平板的细胞数目的标准化来控制，并且在重排列后每2-8次传代而产生。检测且消除其为异常值的细胞群体。

步骤13：细胞群体的表征

步骤14：细胞群体的潜在功能性的评估

使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用钙动员染料Fluo-4(Invitrogen)。将稳定地表达h-OR的HEK293T细胞系在标准细胞培养条件下维持在补充有10％胎牛血清和谷氨酰胺的DMEM培养基中。在测定前一天，从贮备液平板收获细胞并且将其涂铺在黑色透明底384孔测定板中。将测定板在5％CO₂下于37℃细胞培养箱中维持22-48小时。随后从测定板中除去培养基，加入稀释在缓冲液(130mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、1.2mM MgCl₂、10mM HEPES、10mM葡萄糖、pH 7.0)中的钙动员染料(Fluo-4，Invitrogen，Carlsbad，CA)且与稀释在上述缓冲液(130mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、1.2mM MgCl₂、10mM HEPES、10mM葡萄糖、pH 7.0)中的Trypan UltraBlue(ABD Bioquest，CA)作为猝灭剂一起在37℃下温育1小时。上述鉴定的猝灭剂可由本领域内众所周知的猝灭剂例如二苦胺(DPA)、酸性紫17(AV17)、二嗪黑(DB)、HLB30818、溴酚蓝、HLB30701、HLB30702、HLB30703、硝嗪黄、硝基红、DABCYL(Molecular Probes)、QSY(Molecular Probes)、金属离子猝灭剂(例如，Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺)和碘离子置换。随后将测定板加载在荧光板读取器(Hamamatsu FDSS)上并且加入溶解在上述缓冲液(130mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、，1.2mM MgCl₂、10mM HEPES、10mM葡萄糖、pH 7.0)中的激动剂(对于OR3A1为4.5mM洋茉莉醛(Helional)，对于OR1D2为0.3mM波洁洪醛(Bourgeonal)一图29A，29B)。细胞在384孔板中以多种不同密度进行测试并且分析应答。使用涂铺后的多个时间点，例如涂铺后12-48小时。还测试不同的涂铺密度的测定应答差异。

图29A描绘了与作为对照的DMSO媒介物本底信号相比较，表达人气味受体OR3A1的细胞对洋茉莉醛(至4.5mM的终浓度)的基于功能细胞的应答的代表性迹线。将测试和对照迹线重叠。图29A中提供的经设计使用荧光钙信号传导染料报告钙流的基于细胞的测定的结果表明，细胞显示高于本底的对洋茉莉醛的应答。

图29B描绘了与作为对照的DMSO媒介物本底信号相比较，表达人气味受体OR1D2的细胞对波洁洪醛(至0.3mM的终浓度)的基于功能细胞的应答的代表性迹线。将测试和对照迹线重叠。图29B中提供的经设计使用荧光钙信号传导染料报告钙流的基于细胞的测定的结果表明，细胞显示高于本底的对波洁洪醛的应答。

使来自在低和较高代数下执行的实验的功能应答相比较，以鉴定经过分选后6-40周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还指出注意随着时间推移改变的其它细胞特征，例如细胞解离后再附着所花的时间。

步骤16-细胞的进一步评估

对符合功能和其它标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些。所选择的细胞群体在更大的组织培养皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤用于一致和可靠地传代。这些包括不同的涂铺细胞密度、板包被、传代时间、培养皿大小/形式和包被、流体学最佳化、细胞解离最佳化(例如，在细胞解离缓冲液(Invitrogen)对胰蛋白酶存在的情况下解离)、所使用的解离试剂的体积和解离的时间长度)、以及洗涤步骤。此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择显示一致生长、一致(即不改变形态学)合适附着以及功能应答的最终细胞系和备份细胞系。

步骤17：细胞库的建立

步骤18-细胞库的测试

实施例40就天然气味受体功能表征细胞系

为了鉴定和测量配体诱导的表达气味受体的HEK293T细胞的应答，通过测量受体触发的细胞内钙水平的变化来监控受体激活。将细胞在黑色透明底平板中于标准生长培养基中培养过夜或作为测定缓冲液(130mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、1.2mM MgCl₂、10mMHEPES、10mM葡萄糖、pH 7.0)中的悬浮液加入黑色透明底平板中。将细胞在室温下与缓冲液中的免洗钙敏感性荧光染料钙-3(MolecularDevices Corp.)一起温育1小时，所述缓冲液具有作为猝灭剂并且稀释在上述缓冲液(130mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl₂，1.2mM MgCl₂，10mM HEPES，10mM葡萄糖，pH 7.0)中的Trypan Ultra Blue(ABDBioquest，CA)。上述鉴定的猝灭剂可由本领域内众所周知的猝灭剂例如二苦胺(DPA)、酸性紫17(AV17)、二嗪黑(DB)、HLB30818、台盼蓝、溴酚蓝、HLB30701、HLB30702、HLB30703、硝嗪黄、硝基红、DABCYL(Molecular Probes)、QSY(Molecular Probes)、金属离子猝灭剂(例如，Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺)和碘离子置换。将细胞平板和测试化合物(0.01μM-100mM)置于高通量荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)中，所述读取器在仪器向细胞中加入测试化合物之前、过程中和之后收集平板荧光的图像。图像的软件(Hamamatsu FDSS)分析报告了细胞平板中每一个孔的相对荧光的变化。

在气味受体细胞系之间以及在对照细胞中测定多种化合物和提取物(其中有许多报告为有气味的)以测定活性和脱孤。

实施例41表达气味受体的细胞系中功能应答的一致性

因为气味受体是G蛋白偶联受体(GPCR)，因此为了产生在不同化合物存在的情况下不同气味受体之间应答的有意义的比较，重要地测定不同细胞系中G蛋白偶联功能一致性。跨越一系列浓度的G蛋白偶联激动剂的不同细胞系的相对反应应当是一致的。为了验证之，我们在利用不同浓度的异丙肾上腺素(一种在细胞中内源性表达的3-肾上腺素能受体的激动剂)的剂量反应曲线实验中测试表达不同气味受体和小鼠Gα15蛋白的所有细胞系的Gα15介导的受体反应的一致性。该内源受体当受刺激时，可偶联表达的Gα15并且诱发细胞内游离钙的变化。将百分比反应作为异丙肾上腺素浓度的函数作图，并且将结果进行曲线拟合以计算EC₅₀值(半最大受体激活的浓度)(参见图16)。

实施例42功能反应性宽泛调节的、造度调节的和选择性受体的鉴定

在基于功能细胞受体的研究中测试使用本发明的方法(即，实施例39)产生的稳定地表达天然人气味受体基因的细胞系以检测化学上多样的化合物的集合对它们的激活。这允许鉴定宽泛调节、不太宽泛调节的以及狭窄调节的受体。

实施例43通过化合物文库激活的受体的鉴定

测试化合物文库针对气味受体细胞系的每一个的活性。在基于功能细胞的测定中产生关于加入化合物后受体活性的数据，并且将所述数据表示为高于受体的基线活性(即，在只加入缓冲液时的受体活性)的百分比活性。然后将各受体上各化合物的活性编码成在各受体上具有低(比基线活性高＜100％；白色)、中(比基线活性高101-500％；浅灰色)、高(比基线活性高501-1000％；深灰色)或极高(比基线活性高1001％以上，黑色)活性的加亮化合物。所得的模式用于提供在气味受体之间具有选择性或宽泛性活性的化合物(行)和显示对化学上多样的化合物组的宽泛的或选择性反应的受体(列)的图解表示。数据的分析用于利用目的测试化合物赋值或鉴定特定气味受体或气味受体活性的模式以及鉴定调节剂，包括阻断剂和增强剂。该数据的分析还可用于使气味受体活性的模式与相应的测试气味的生理效应发生关系。

实施例44具有与激动剂诱导的气味受体活性的拮抗剂相似的功能活性的化合物的类似物的鉴定

为了测试基于表达气味受体的细胞的测定鉴定具有相似功能活性的化合物的类似物的能力，测试已知的调节剂或调节化合物的结构类似物的抑制激动剂诱导的气味受体的受体活性的能力。比较抑制由激动剂诱导的气味受体的活性的类似物的结构。从而，表达气味受体的细胞系可帮助有效气味受体拮抗剂的发现。也通过操作测定以及测试和进行测定结果分析(这对于本领域普通技术人员来说是已知的)来鉴定具有不同活性(例如，增强、激动、阻断等)的调节剂。

上述本发明的实施方案旨在仅为示例性的，并且本领域普通技术人员将理解或能够只使用常规实验、本文中描述的特定方法的许多等同实验来确定。所有此类等同实验被认为在本发明的范围内并且被下列权利要求涵盖。此外，本领域普通技术人员将理解为了解释和声明操作序列必须以一些特定顺序列出，但本发明还包括除了这样的特定顺序以外的变化。

本文中引用的所有参考资料均通过引用整体并入本文，并且为了所有目的该引用的程度就如同各个公开案或专利或专利申请案已明确地且个别地通过引用整体并入本文。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于分离内源地表达甜味受体T1R2亚单位和/或甜味受体T1R3亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a.提供一群细胞；

b.将检测T1R2的表达的信号传导探针引入细胞和/或将检测T1R3的表达的分子信标引入细胞；

c.分离表达甜味受体T1R2亚单位和/或甜味受体T1R3亚单位的细胞。

2.一种用于分离内源性表达甜味受体T1R2亚单位和甜味受体T1R3亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a.提供一群细胞；

b.将检测T1R2的表达的分子信标引入细胞和/或将检测T1R3的表达的分子信标引入细胞；

3.权利要求1或2的方法，其中已知细胞的群体不表达T1R2或T1R3。

4.权利要求1或2的方法，其中分离的细胞中T1R2或T1R3的任何表达水平为细胞群体的平均细胞中的至少10倍、50倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍、2500倍、5000倍、7500倍、10000倍、50000倍或至少100000倍。

5.权利要求1或2的方法，其中在所述分离步骤之前已增加细胞群体中的遗传变异性。

6.根据权利要求1至5的任一项产生的分离的细胞。

7.一种内源性表达甜味受体T1R2亚单位和/或甜味受体T1R3亚单位的分离的细胞，其中所述分离的细胞来源于一群细胞并且其中分离的细胞中甜味受体T1R2亚单位和/或甜味受体T1R3亚单位的表达为细胞群体的平均细胞中的至少10倍、50倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍、2500倍、5000倍、7500倍、10000倍、50000倍或至少100000倍。

8.权利要求7的细胞，其中所述细胞群体是一群中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、已建立的神经元细胞系、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤成纤维细胞、横纹肌肉瘤细胞、背根神经节细胞、NS0细胞、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、HEK-293(ATCC CRL1573)和PCI2(ATCC CRL-1721)、HEK293T(ATCC CRL-11268)、RBL(ATCC CRL-1378)、SH-SY5Y(ATCCCRL-2266)、MDCK(ATCC CCL-34)、SJ-RH30(ATCC CRL-2061)、HepG2(ATCC HB-8065)、ND7/23(ECACC 92090903)、CHO(ECACC85050302)、Vero(ATCC CCL 81)、Caco-2(ATCC HTB 37)、K562(ATCC CCL243)、Jurkat(ATCC TIB-152)、Per.C6(Crucell，Leiden，The Netherlands)、Huvec(ATCC人原代PCS 100-010、小鼠CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH-7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC CRL 10852)、A549(ATCC CCL185)、IMR-90(ATCC CCL 186)、MCF-7(ATC HTB-22)、U-2OS(ATCCHTB-96)、T84(ATCC CCL 248)、原代细胞或永生化细胞。

9.权利要求7的细胞的培养物。

10.一种稳定地表达包含甜味受体T1R2亚单位和甜味受体T1R3亚单位的甜味受体的细胞或细胞系，其中至少一个亚单位的基因因编码亚单位的核酸至宿主细胞内的引入或已存在于宿主细胞中的编码亚单位的核酸的基因激活而产生，并且所述细胞或细胞系来源于所述宿主细胞。

11.一种稳定地表达包含甜味受体T1R2亚单位、甜味受体T1R3亚单位的甜味受体和G蛋白的细胞或细胞系，其中至少一个亚单位和G蛋白的表达因编码亚单位或G蛋白的核酸至宿主细胞内的引入或已存在于宿主细胞中的编码亚单位或G蛋白的核酸的基因激活而产生，并且所述细胞或细胞系来源于所述宿主细胞。

12.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中至少一个甜味受体亚单位从被引入宿主细胞的编码该亚单位的核酸表达。

13.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中至少一个甜味受体亚单位通过基因激活从存在于宿主细胞中的核酸表达。

14.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达甜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

15.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述宿主细胞是HEK-293细胞。

16.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味受体

a.是哺乳动物甜味受体；

b.是人甜味受体；

c.包含来自不同物种的亚单位；

d.包含为嵌合的一个或多个亚单位；

e.(a)-(d)的任何组合。

17.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味受体具有功能。

18.权利要求10或11的细胞或细胞系，其在测定中具有至少0.3的Z’值。

19.权利要求17的细胞或细胞系，其在测定中具有至少0.7的Z’值。

20.权利要求10或11的细胞或细胞系，其在不存在选择压力的情况下在培养基中稳定地表达甜味受体。

21.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味T1R2受体亚单位选自由下列组成的组：

a.包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的甜味受体亚单位；

b.包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的甜味受体亚单位；

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位；和

d.包含由与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：34的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位。

22.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味受体亚单位T1R2由选自下列的核酸编码：

a.包含SEQ ID NO：31的核酸；

b.包含编码含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸；

c.包含在严格条件下与a)或b)的核酸杂交的核苷酸序列的核酸；和

d.包含与SEQ ID NO：31或编码SEQ ID NO：34的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸。

23.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味受体T1R3亚单位选自由下列组成的组：

a.包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的甜味受体亚单位；

b.包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的甜味受体亚单位；

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位；和

d.包含由与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的甜味受体亚单位。

24.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味受体T1R3亚单位由选自下组的核酸编码：

a.包含SEQ ID NO：32的核酸；

b.包含编码含有SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸；

d.包含与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核苷酸序列的核酸。

25.权利要求11的细胞或细胞系，其中所述G蛋白选自由下列组成的组：

a.包含SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的G蛋白；

b.包含与SEQ ID NO：36或37或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的G蛋白；

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：33或编码SEQ ID NO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的G蛋白；和

d.包含由与SEQ ID NO：33或编码SEQ ID NO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列的G蛋白。

26.权利要求11的细胞或细胞系，其中所述G蛋白由选自下组的核酸编码：

a.包含SEQ ID NO：33的核酸；

b.包含编码SEQ ID NO：36或37的多肽或另一物种的对应氨基酸序列的核苷酸序列的核酸；

c.包含在严格条件下与a)或b)的核酸序列杂交的核苷酸序列的核酸和；

d.包含与SEQ ID NO：33或编码SEQ ID NO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸序列具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的核酸。

27.一种用于产生权利要求10或11的细胞或细胞系的方法，其包括下列步骤：

a.将包含编码甜味受体T1R2亚单位的核酸的第一载体、包含编码甜味受体T1R3亚单位的核酸的第二载体和任选的包含编码G蛋白的核酸的第三载体引入宿主细胞；

b.将检测甜味受体T1R2亚单位的表达的第一分子信标、检测甜味受体T1R3亚单位的表达的第二分子信标和任选的检测G蛋白的表达的第三分子信标引入步骤a)中产生的宿主细胞；和

c.分离表达T1R2亚单位、T1R3亚单位和任选的G蛋白的细胞。

28.权利要求27的方法，还包括从步骤c)分离的细胞产生细胞系的步骤。

29.权利要求27的方法，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达甜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.a)、b)和c)的任何组合。

30.权利要求27的方法，还包括下列步骤：

a.培养细胞进行选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期；

b.在这些时程中定期地测定甜味受体或其亚单位的表达，在RNA或蛋白质水平上测定所述表达；和

c.选择细胞或细胞系，所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内甜味受体或其亚单位的基本上稳定的表达。

31.权利要求27的方法，还包括下列步骤：

b.在这些时程中定期地测定甜味受体或其亚单位的表达，在RNA或蛋白质水平上测定表达；和

c.选择细胞或细胞系，所述细胞或细胞系特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内甜味受体或其亚单位的基本上相同的表达水平。

32.权利要求31的方法，其中使用功能测定进行甜味受体的蛋白质表达水平的测量。

33.权利要求27的方法，其中所述T1R2亚单位选自权利要求12a)至d)的亚单位，其中所述T1R3亚单位选自权利要求14a)至d)的亚单位并且其中G蛋白选自权利要求16a)至d)的蛋白质。

34.权利要求27的方法，其中由核酸编码的T1R2亚单位选自由权利要求13a)至d)的核酸编码的亚单位，其中T1R3亚单位选自由权利要求15a)至d)的核酸编码的亚单位并且其中G蛋白选自由权利要求17a)至d)的核酸编码的蛋白质。

35.权利要求27的方法，其中所述分离步骤利用荧光激活细胞分选器。

36.一种用于鉴定甜味受体功能的调节剂的方法，包括将权利要求6、10或11的至少一个细胞或细胞系与至少一种测试化合物接触并且检测甜味受体功能的变化的步骤。

37.权利要求36的方法，其中所述调节剂选自甜味受体抑制剂、甜味受体拮抗剂、甜味受体阻断剂、甜味受体激活剂、甜味受体激动剂或甜味受体增强剂。

38.权利要求36的方法，其中所述甜味受体是人甜味受体。

39.权利要求36的方法，其中所述测试化合物是小分子、化学部分、多肽或抗体。

40.权利要求36的方法，其中所述测试化合物是化合物的文库。

41.权利要求40的方法，其中所述文库是小分子文库、组合文库、肽文库或抗体文库。

42.权利要求36的方法，其中所述调节剂对于甜味受体的酶促修饰形式具有选择性。

43.通过权利要求36的方法鉴定的调节剂。

44.权利要求6、10或11的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内甜味受体的基本上相同的表达。

45.权利要求6、10或11的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内甜味受体的基本上稳定的表达水平。

46.权利要求45的细胞或细胞系，其中所述使用功能测定来测量所述表达水平。

47.权利要求6、10或11的细胞或细胞系，其通过权利要求27-35的任一项的方法产生。

48.一种用于产生权利要求10或11的细胞或细胞系的方法，其中所述细胞具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质，所述方法包括下列步骤：

a.提供多个表达编码甜味受体的亚单位和任选的G蛋白的mRNA的细胞；

b.将细胞单个地分散至单个培养器皿中，从而提供多个分离的细胞培养物；

c.使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法特征在于对于每一个分离的细胞培养物而言条件基本相同，在该培养过程中将每一个分离的细胞培养物中每孔的细胞数目标准化，并且其中所述分离的培养物按照相同的方案传代；

d.测定分离的细胞培养物的甜味受体或产生该受体的细胞的至少一种所需特征至少2次；和

e.鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

49.产生甜味受体并且具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质的细胞或细胞系，所述细胞或细胞系由权利要求48的方法产生。

50.稳定地表达包含鲜味受体T1R1亚单位和鲜味受体T1R3亚单位的鲜味受体的细胞或细胞系，其中至少一个所述亚单位的表达因编码亚单位的核酸至宿主细胞内的引入或已存在于宿主细胞中的编码亚单位的核酸的基因激活而产生，并且所述细胞或细胞系来源于所述宿主细胞。

51.稳定地表达包含鲜味受体T1R1亚单位、鲜味受体T1R3亚单位的鲜味受体和G蛋白的细胞或细胞系，其中至少一个亚单位和G蛋白的表达因编码亚单位或G蛋白的核酸至宿主细胞内的引入或已存在于宿主细胞中的编码亚单位或G蛋白的核酸的基因激活而产生，并且所述细胞或细胞系来源于所述宿主细胞。

52.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中至少一个鲜味受体亚单位从被引入宿主细胞的编码所述亚单位的核酸表达。

53.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中至少一个鲜味受体亚单位通过基因激活从存在于宿主细胞中的核酸表达。

54.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达鲜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

55.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述宿主细胞是HEK-293细胞。

56.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述鲜味受体

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.包含来自不同物种的亚单位；

d.包含为嵌合的一个或多个亚单位；

e.(a)-(d)的任何组合。

57.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述鲜味受体具有功能。

58.权利要求50或51的细胞或细胞系，其在测定中具有至少0.3的Z’值。

59.权利要求58的细胞或细胞系，其在测定中具有至少0.7的Z’值。

60.权利要求50或51的细胞或细胞系，其在不存在选择压力的情况下在培养基中稳定地表达鲜味受体。

61.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述鲜味T1R1受体亚单位选自由下列组成的组：

a.包含选自SEQ ID NO：42-45的氨基酸序列和另一物种的对应氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

b.包含与选自SEQ ID NO：42-45的氨基酸序列和另外的物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：41或编码选自SEQID NO：42-45的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；和

d.包含由与SEQ ID NO：41或编码SEQ ID NO：42-45的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位。

62.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述鲜味受体亚单位T1R1由选自下组的核酸编码：

a.包含SEQ ID NO：41的核酸；

b.包含编码含有选自SEQ ID NO：42-45的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸；

d.包含与SEQ ID NO：41或编码选自SEQ ID NO：42-45的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸。

63.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述鲜味受体T1R3亚单位选自由下列组成的组：

a.包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

b.包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：32或编码SEQ IDNO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；和

d.包含由与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少85％同一性的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位。

64.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述甜味受体T1R3亚单位由选自下组的核酸编码：

a.包含SEQ ID NO：32的核酸；

65.权利要求51的细胞或细胞系，其中所述G蛋白选自由下列组成的组：

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：33或编码SEQ IDNO：36或37的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的G蛋白；和

66.权利要求51的细胞或细胞系，其中所述G蛋白由选自下组的核酸编码：

a.包含SEQ ID NO：33或另一物种的对应氨基酸序列的核酸；

67.一种用于产生权利要求50或51的细胞或细胞系的方法，其包括下列步骤：

a.将包含编码鲜味受体T1R1亚单位的核酸的第一载体、包含编码鲜味受体T1R3亚单位的核酸的第二载体和任选的包含编码G蛋白的核酸的第三载体引入宿主细胞；

b.将检测鲜味受体T1R1亚单位的表达的第一分子信标、检测鲜味受体T1R3亚单位的表达的第二分子信标和任选的检测G蛋白的表达的第三分子信标引入步骤a)中产生的宿主细胞；和

c.分离表达T1R1亚单位、T1R3亚单位和任选的G蛋白的细胞。

68.权利要求67的方法，还包括从步骤c)中分离的细胞产生细胞系的步骤。

69.权利要求67的方法，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达鲜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.a)、b)和c)的任何组合。

70.权利要求67的方法，还包括下列步骤：

a.培养细胞，进行选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期；

b.在这些时程中定期地测定所述鲜味受体或其亚单位的表达，在RNA或蛋白质水平上测定所述表达；和

c.选择细胞或细胞系，所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内鲜味受体或其亚单位的基本上相同的表达。

71.权利要求67的方法，还包括下列步骤：

b.在这些时程中定期地测定鲜味受体或其亚单位的表达，在RNA或蛋白质水平上测定表达；和

c.选择细胞或细胞系，所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内鲜味受体或其亚单位的基本上相同的表达水平。

72.权利要求71的方法，其中使用功能测定进行所述鲜味受体的蛋白质表达水平的测量。

73.权利要求67的方法，其中所述T1R1亚单位选自权利要求12a)至d)的亚单位，其中所述T1R3亚单位选自权利要求14a)至d)的亚单位并且其中G蛋白选自权利要求16a)至d)的蛋白质。

74.权利要求67的方法，其中由核酸编码的T1R1亚单位选自由权利要求13a)至d)的核酸编码的亚单位，其中T1R3亚单位选自由权利要求15a)至d)的核酸编码的亚单位并且其中G蛋白选自由权利要求17a)至d)的核酸编码的蛋白质。

75.权利要求67的方法，其中所述分离步骤利用荧光激活细胞分选器。

76.一种用于鉴定鲜味受体功能的调节剂的方法，包括将权利要求50或51的至少一个细胞或细胞系与至少一种测试化合物接触并且检测所述鲜味受体功能的变化的步骤。

77.权利要求76的方法，其中所述调节剂选自鲜味受体抑制剂、鲜味受体拮抗剂、鲜味受体阻断剂、鲜味受体激活剂、鲜味受体激动剂或鲜味受体增强剂。

78.权利要求76的方法，其中所述鲜味受体是人鲜味受体。

79.权利要求76的方法，其中所述测试化合物是小分子、化学部分、多肽或抗体。

80.权利要求76的方法，其中所述测试化合物是化合物的文库。

81.权利要求80的方法，其中所述文库是小分子文库、组合文库、肽文库或抗体文库。

82.权利要求76的方法，其中所述调节剂对于鲜味受体的酶促修饰形式具有选择性。

83.通过权利要求76的分子鉴定的调节剂。

84.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内鲜味受体的基本上稳定的表达。

85.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系的特征在于在选自1至4周、1至9个月或其间的任何时间的一段时期内鲜味受体的基本上相同的表达。

86.权利要求85的细胞或细胞系，其中使用功能测定来测量所述表达水平。

87.权利要求50或51的细胞或细胞系，其通过权利要求18-26的任一项的方法产生。

88.一种用于产生权利要求50或51的细胞或细胞系的方法，其中所述细胞具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质，所述方法包括下列步骤：

a.提供多个表达编码鲜味受体的亚单位和任选的G蛋白的mRNA的细胞；

d.测定分离的细胞培养物的鲜味受体的或产生该受体的细胞的至少一种所需特征至少2次；和

e.鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

89.产生鲜味受体并且具有至少一种随着时间推移保持一致的所需性质的细胞或细胞系，所述细胞或细胞系通过权利要求88的方法产生。

90.经改造以稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系。

91.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体从被引入细胞或细胞系的核酸表达。

92.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体通过经改造的基因激活从内源核酸中表达。

93.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系稳定地表达至少一种其它苦味受体。

94.权利要求93的细胞或细胞系，其中至少一种其它苦味受体被内源性表达。

95.权利要求93的细胞或细胞系，其中至少一种其它苦味受体从被引入所述细胞或细胞系的核酸表达。

96.权利要求95的细胞或细胞系，其中所述苦味受体和至少一种其它苦味受体从被引入所述细胞或细胞系的分离的核酸表达。

97.权利要求95的细胞或细胞系，其中所述苦味受体和至少一种其它苦味受体都从被引入细胞或细胞系的单个核酸表达。

98.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系稳定地表达：

a.内源G蛋白；

b.异源G蛋白或

c.两者。

99.权利要求98的细胞或细胞系，其中所述G蛋白是包含3个不同亚单位的异源多聚体G蛋白，并且其中至少2个不同的亚单位从被引入所述细胞或细胞系的不同核酸表达。

100.权利要求98的细胞或细胞系，其中所述G蛋白是包含3个不同亚单位的异源多聚体G蛋白，并且其中3个不同的亚单位都从被引入所述细胞或细胞系的相同核酸表达。

101.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或所述细胞系中的细胞是：

a.真核细胞；

b.哺乳动物细胞；

c.不表达内源性苦味受体的细胞；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

102.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或所述细胞系中的细胞是人胚肾293T细胞。

103.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体：

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.在其氨基端或羧基端不具有多肽标签；

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

104.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系在选自下列的测定中产生至少0.45的Z’值：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。

105.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系在选自下列的测定中产生至少0.5的Z’值：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。

106.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系在选自下列的测定中产生至少0.6的Z’值：基于细胞的测定、基于荧光细胞的测定、高通量筛选测定、基于报告细胞的测定、基于G蛋白介导的细胞的测定和基于钙流细胞的测定。

107.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达所述苦味受体，进行选自至少2周、至少4周、至少6周、至少3个月、至少6个月和至少9个月的时间段。

108.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体包含选自下组的氨基酸序列：

a.SEQ ID NOS：77-101中的任一个；

b.与SEQ ID NOS：77-101中的任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；

c.由在严格条件下与包含SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列；和

d.由作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸编码的氨基酸序列。

109.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体包含由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列：

a.SEQ ID NOS：51-75中的任一个；

b.与SEQ ID NOS：51-75中的任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列；和

c.在严格条件下与包含SEQ ID NOS：51-75中的任一个的反向互补序列的核酸杂交的核酸的序列；和

d.作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸的序列。

110.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体是功能性苦味受体。

111.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。

112.权利要求111的细胞或细胞系，其中所述异丙肾上腺素在利用所述细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

113.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系具有大于1的信噪比。

114.权利要求90的细胞或细胞系的集合，其中所述集合包括2个或更多个细胞或细胞系，每个细胞或细胞系稳定地表达不同苦味受体或其等位基因变体。

115.权利要求114的集合，其中所述集合额外地包括经改造以稳定地表达具有已知配体的苦味受体的细胞或细胞系。

116.权利要求114的集合，其中其等位基因变体为SNP。

117.权利要求114的集合，其中所述细胞或细胞系中的每一个当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。

118.权利要求117的集合，其中所述异丙肾上腺素在利用各细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

119.权利要求114的集合，其中使所述细胞或细胞系匹配以共享相同生理特性，以允许平行加工。

120.权利要求119的集合，其中所述生理特性是生长速率。

121.权利要求119的集合，其中所述生理特性是对组织培养表面的附着。

122.权利要求119的集合，其中所述生理特性是Z′因子。

123.权利要求119的集合，其中所述生理特性是苦味受体的表达水平。

124.权利要求90的细胞或细胞系的集合，其中所述集合包括2个或更多个细胞或细胞系，每个细胞或细胞系稳定地表达相同苦味受体或其等位基因变体。

125.权利要求124的集合，其中所述集合额外地包括经改造以稳定地表达具有已知配体的苦味受体的细胞或细胞系。

126.权利要求124的集合，其中其等位基因变体为SNP。

127.权利要求124的集合，其中所述细胞或细胞系中的每一个当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。

128.权利要求127的集合，其中所述异丙肾上腺素在利用各细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

129.权利要求124的集合，其中使所述细胞或细胞系匹配以共享相同的生理特性，从而允许平行加工。

130.权利要求129的集合，其中所述生理特性是生长速率。

131.权利要求199的集合，其中所述生理特性是对组织培养表面的附着。

132.权利要求129的集合，其中所述生理特性是Z′因子。

133.权利要求129的集合，其中所述生理特性是苦味受体的表达水平。

134.一种产生稳定地表达苦味受体的细胞的方法，其包括：

a.将编码苦味受体的核酸引入多个细胞；

b.将检测苦味受体的表达的分子信标引入步骤(a)中提供的多个细胞；和

c.分离表达所述苦味受体的细胞。

135.权利要求134的方法，其还包括从步骤(c)中分离的细胞产生细胞系的步骤。

136.权利要求135的方法，其中所述产生的细胞系在无抗生素的培养基中稳定地表达所述苦味受体，进行选自至少2周、至少4周、至少6周、至少3个月、至少6个月和至少9个月的时间段。

137.权利要求134的方法，其中所述细胞是：

a.真核细胞；

b.哺乳动物细胞；

c.不表达内源性苦味受体的细胞；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

138.权利要求134的方法，其中所述细胞系中的细胞是人胚肾293T细胞。

139.权利要求134的方法，其中所述苦味受体：

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.在其氨基端或羧基端不具有多肽标签；

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

140.权利要求134的方法，其中所述苦味受体包含选自下组的氨基酸序列：

a.SEQ ID NOS：77-101中的任一个；

141.权利要求134的方法，其中所述苦味受体包含由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列：

a.SEQ ID NOS：51-75中的任一个；

142.权利要求134的方法，其中所述苦味受体是功能性苦味受体。

143.权利要求134的方法，其中所述步骤(c)中分离的细胞当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。

144.权利要求143的方法，其中所述异丙肾上腺素在利用所述细胞进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

145.权利要求143的方法，其中所述分离利用荧光激活细胞分选器。

146.权利要求143的方法，其中所述细胞稳定地表达内源G蛋白、异源G蛋白或两者。

147.权利要求143的方法，其还包括将编码G蛋白的核酸引入细胞：

a.在引入编码所述苦味受体的核酸之前；

b.在引入编码所述苦味受体的核酸之后；或

c.与引入编码所述苦味受体的核酸同时。

148.权利要求143的方法，其中编码所述苦味受体的核酸和编码所述G蛋白的核酸在单个载体上。

149.权利要求58的方法，其还包括将检测所述G蛋白的表达的分子信标引入细胞：

a.在引入检测所述苦味受体的表达的分子信标之前；

b.在引入检测所述苦味受体的表达的分子信标之后；或

c.与引入检测所述苦味受体的表达的分子信标同时。

150.权利要求149的方法，其中检测所述苦味受体的表达的分子信标与检测所述G蛋白的表达的分子信标是不同的分子信标。

151.权利要求58的方法，其还包括：

a.在分离表达所述苦味受体的细胞之前；

b.在分离表达所述苦味受体的细胞之后；或

c.与分离表达所述苦味受体的细胞的同时；

分离表达所述G蛋白的细胞，从而分离表达所述苦味受体和所述G蛋白的细胞。

152.一种鉴定苦味受体功能的调节剂的方法，其包括：

a.将稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系与测试化合物接触；和

b.检测所述苦味受体的功能的变化。

153.权利要求152的方法，其中所述检测利用测量细胞内游离钙的测定。

154.权利要求153的方法，其中使用一种或多种钙敏感性荧光染料、荧光显微镜和任选的荧光板读取器测量细胞内游离钙，并且其中至少一种荧光染料结合游离钙。

155.权利要求153的方法，其中通过使用一种或多种钙敏感性荧光染料实时成像监控所述细胞内游离钙，并且其中至少一种荧光染料结合游离钙。

156.权利要求152的方法，其中所述细胞或所述细胞系中的细胞是：

a.真核细胞；

b.哺乳动物细胞；

c.不表达任何内源性苦味受体的细胞；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

157.权利要求152的方法，其中所述细胞系中的细胞是人胚肾293T细胞。

158.权利要求152的方法，其中所述苦味受体：

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.在其氨基端或羧基端不具有多肽标签；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

159.权利要求152的方法，其中所述苦味受体包含选自下组的氨基酸序列：

a.SEQ ID NOS：77-101中的任一个；

160.权利要求152的方法，其中所述苦味受体包含由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列：

a.SEQ ID NOS：51-75中的任一个；

d.作为SEQ ID NOS：51-75中的任一个的等位基因变体的核酸t的序列。

161.权利要求152的方法，其中所述细胞或细胞系当与异丙肾上腺素接触时细胞内游离钙浓度发生变化。

162.权利要求161的方法，其中所述异丙肾上腺素在利用所述细胞或细胞系进行的剂量反应曲线中具有约1nM至约20nM的EC50值。

163.权利要求152的方法，其中所述测试化合物是苦味受体抑制剂。

164.权利要求153的方法，其还包括在将所述细胞或细胞系与所述测试化合物接触的步骤之前或同时将所述细胞或细胞系与苦所述味受体的已知激动剂接触。

165.权利要求152的方法，其中所述测试化合物是苦味受体激动剂。

166.权利要求165的方法，其还包括在将所述细胞或细胞系与所述测试化合物接触的步骤之前或同时将所述细胞或细胞系与所述苦味受体的已知抑制剂接触。

167.权利要求152的方法，其中所述测试化合物是小分子、化学部分、多肽、抗体或食物提取物。

168.一种鉴定苦味受体功能的调节剂的方法，其包括：

a.将细胞系的集合与不同测试化合物的文库接触，其中所述细胞系的集合包括2个或更多个细胞系，每一个细胞系稳定地表达相同的苦味受体或其等位基因变体，并且其中将每一个细胞系与文库中的一种或多种测试化合物接触；和

b.检测由每一个细胞系稳定地表达的苦味受体或其等位基因变体的功能的变化。

169.权利要求168的方法，其中所述检测利用测量或监控细胞内游离钙的测定。

170.权利要求169的方法，其中使用一种或多种钙敏感性荧光染料、荧光显微镜和任选的荧光板读取器测量细胞内游离钙，并且其中至少一种荧光染料结合游离钙。

171.权利要求169的方法，其中使用一种或多种钙敏感性荧光染料通过实时成像监控所述细胞内游离钙，并且其中至少一种荧光染料结合游离钙。

172.权利要求168的方法，其中所述文库是小分子文库、组合文库、肽文库或抗体文库。

173.权利要求168的方法，其中所述测试化合物是小分子、化学部分、多肽、抗体和食物提取物。

174.权利要求168的方法，其还包括在步骤(a)之前或与之同时将细胞系的集合与已知的苦味受体激动剂或抑制剂接触。

175.一种鉴定苦味受体功能的调节剂的方法，其包括：

a.将细胞系的集合与测试化合物接触，其中所述细胞系的集合包括2个或更多个细胞系，每一个细胞系稳定地表达不同的苦味受体或其等位基因变体；和

b.检测由每一个细胞系稳定地表达的苦味受体的功能的变化。

176.权利要求175的方法，其中所述检测利用测量或监控细胞内游离钙的测定。

177.权利要求176的方法，其中使用一种或多种钙敏感性荧光染料、荧光显微镜和任选的荧光板读取器测量所述细胞内游离钙，并且其中至少一种荧光染料结合游离钙。

178.权利要求176的方法，其中使用一种或多种钙敏感性荧光染料通过实时成像监控所述细胞内游离钙，其中至少一种荧光染料结合游离钙。

179.权利要求175的方法，其中所述测试化合物选自小分子、化学部分、多肽、抗体和食物提取物。

180.权利要求175的方法，其还包括在步骤(a)之前或与之同时将细胞系的集合与已知的苦味受体激动剂或抑制剂接触。

181.经改造随着时间推移以一致的水平稳定地表达苦味受体的细胞，所述细胞由包括下列步骤的方法制备：

a.提供多个表达编码所述苦味受体的mRNA的细胞；

c.使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养所述细胞，所述培养法的特征在于对于每一个分离的细胞培养物而言条件基本相同，在该培养过程中将每个分离的细胞培养物的细胞数目标准化，并且其中分离的培养物按照相同的方案传代；

d.测定分离的细胞培养物以测量所述苦味受体的表达至少2次；和

e.鉴定在两个测定中都以一致的水平表达所述苦味受体的分离的细胞培养物，从而获得所述细胞。

182.克隆细胞系的组合相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系具有相同类型，并且其中所述实验对象组中的至少2个细胞系表达目的多亚单位蛋白的亚单位的不同组合；并且其中所述实验对象组的克隆细胞系是相匹配的，使得将它们平行地在相同细胞培养条件下进行培养。

183.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系选自原代细胞和永生化细胞。

184.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系细胞是真核细胞并且选自由下列组成的组：真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、藻类、甲壳类动物细胞、节肢动物细胞、禽类细胞、爬行类动物细胞、两栖动物细胞、植物细胞、人、非人灵长类动物、牛科动物、猪科动物、猫科动物、大鼠、有袋动物、鼠科动物、犬科动物、绵羊、山羊、兔子、豚鼠、仓鼠。

185.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系中的细胞经改造以表达所述目的蛋白质。

186.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系中的细胞从编码蛋白质或在多聚体蛋白质的情况下编码蛋白质亚单位的所引入的核酸表达目的蛋白质。

187.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞从内源核酸表达所述目的蛋白质并且其中所述细胞经改造以激活内源蛋白质的转录，或在多聚体蛋白质的情况下，激活蛋白质亚单位的转录。

188.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括至少4个、至少6个或至少20个克隆细胞系。

189.权利要求182的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述多亚单位蛋白质选自由下列组成的组：离子通道、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体、抗体、生物制品和免疫受体。

190.表达至少一种目的RNA的细胞，其中所述目的RNA由所引入的核酸编码，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的RNA，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞并且其中RNA的表达在3个月内改变不超过30％。

191.权利要求190的细胞，其中所述RNA的表达在6个月内改变不超过30％。

192.表达至少一种目的蛋白质的细胞，其中所述目的蛋白质由所引入的核酸编码，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞并且其中所述蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％。

193.权利要求192的细胞，其中所述蛋白质的表达在6个月内改变不超过30％。

194.表达至少一种目的蛋白质的细胞，其中所述目的蛋白质不具有已知的配体或其中不存在检测所述目的蛋白质的功能表达的已知测定；并且其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签。

195.从所引入的编码至少一种目的蛋白质的核酸表达至少一种目的蛋白质的细胞，其中所述至少一种目的蛋白质改变细胞的生理特性，并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％。

196.表达目的蛋白质的细胞，其中所述细胞经改造以激活编码所述目的蛋白质的内源核酸的转录，其中所述目的蛋白质改变细胞的生理特性，并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％。

197.表达目的RNA的细胞，其中所述目的RNA由所引入的核酸编码，其中至少一种目的RNA改变细胞的生理特性，并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％。

198.从所引入的编码至少一种目的蛋白质的核酸表达至少一种目的蛋白质的细胞，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少500、2,500、5,000或100,000皮克蛋白质/细胞/天。

199.表达目的蛋白质的细胞，其中所述细胞经改造以激活编码目的蛋白质的内源核酸的转录，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少500、2,500、5,000或100,000皮克蛋白质/细胞/天。

200.权利要求195-199的任一项的细胞，其中在选自少于1周、少于2周、少于3周、少于4周、少于1个月、少于2个月、少于3个月、少于4个月、少于5个月、少于6个月、少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生所述细胞。

201.从所引入的编码至少一种目的蛋白质的核酸表达至少一种目的蛋白质的细胞，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在选自少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生所述细胞，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少0.5、1.0、5.0或10g/L的蛋白质。

202.表达目的蛋白质的细胞，其中所述细胞经改造以激活编码目的蛋白质的内源核酸的转录，所述细胞的特征在于其以生物活性或能够变成生物活性的形式产生目的蛋白质，其中在选自少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生所述细胞，并且其中所述细胞一致地且可重现性地表达至少0.5、1.0、5.0或10g/L的蛋白质。

203.权利要求201或202的细胞，其中在选自少于3个月、少于4个月或少于6个月的时间段中产生所述细胞。

204.权利要求195-203的任一项的细胞，其中所述蛋白质是单体蛋白质。

205.权利要求195-203的任一项的细胞，其中所述蛋白质是多聚体蛋白质。

206.权利要求195-203的任一项的细胞，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签或在不存在选择压力的情况下培养所述细胞，或其组合。

207.权利要求205的细胞，其中所述目的多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或至少6个亚单位。

208.权利要求205的细胞，其中所述目的多聚体蛋白质选自离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体、抗体、生物制品和免疫学受体。

209.权利要求205的细胞，其中所述目的多聚体蛋白质是离子通道并且细胞生理特性选自膜电位、UPR、细胞活力、提高蛋白质产量的能力、产率、折叠装配、分泌、至细胞膜内的整合、翻译后修饰、糖基化或其任何组合。

210.从权利要求195-209的任一项的细胞产生的细胞系。

211.一种鉴定目的蛋白质的调节剂的方法，其包括下列步骤：

a.将权利要求195至210的任一项的细胞与测试化合物接触；和

b.检测相比于未与所述测试化合物的细胞中蛋白质的活性，与所述测试化合物接触的细胞中目的蛋白质的活性的变化；其中与不存在的情况下相比较，在存在的情况下产生活性差异的化合物是所述目的蛋白质的调节剂。

212.细胞或克隆细胞系的相匹配实验对象组，其包括根据权利要求195-209的至少2种细胞或权利要求210的2个克隆细胞系，其中所述至少2种细胞或所述至少2个克隆细胞系是相匹配的，使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。

213.权利要求212的相匹配实验对象组，其中所述相匹配实验对象组包括权利要求195-209的至少10种细胞或权利要求210的10个克隆细胞系，并且至少10种细胞或10个克隆细胞系是相匹配的，使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。

214.权利要求213的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括权利要求195-209的至少100种细胞或权利要求210的至少100个，并且在相同细胞培养条件下平行地培养所述至少100种细胞或所述至少100个克隆细胞系。

215.克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系为相同类型并且包含第一和第二目的蛋白质；其中第一目的蛋白质在每一个克隆细胞系中是相同的；其中第二目的蛋白质是功能生物学途径的组分；并且其中：

a.所述实验对象组包括至少5个细胞系；

b.在少于6个月内产生所述实验对象组；

c.第一和第二目的蛋白质不具有蛋白质标签；

d.在不存在选择压力的条件下培养克隆细胞系；或

e.a)-d)的任何组合。

216.权利要求215的相匹配实验对象组，其中所述第一目的蛋白质是抗体并且所述功能生物学途径是糖基化途径。

217.一种用于产生体内生理特性的体外相关性的方法，其中所述方法包括：

a.将具有生理特性的化合物或多个化合物与表达第一目的蛋白质的第一细胞接触；

b.在功能测定中测定化合物或多个化合物对第一蛋白质的效应；

c.将所述化合物或多种化合物与表达第二目的蛋白质的第二细胞接触；

d.在功能测定中测定化合物或多个化合物对第二蛋白质的效应；

其中第一和第二蛋白质独立地i)不包含蛋白质标签；ii)一致地且可重现性地以适合用于功能测定的形式产生，使得所述细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，iii)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，iv)改变所述细胞的生理特性并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％；v)于在选择不存在的情况下培养的细胞中稳定地表达并且其中所述蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％，vi)在还表达另一种蛋白质的细胞中表达并且在不存在选择压力的情况下培养所述细胞或vii)其任何组合；以及

其中在步骤a)至d)中获得的特征谱提供了体内生理特性的体外相关性。

218.权利要求217的方法，其中第一和第二目的蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。

219.权利要求218的方法，其中所述多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

220.权利要求219的方法，其中所述多聚体蛋白质为异源多聚体蛋白质。

221.权利要求217-219的任一项的方法，其中：

a.第一和第二细胞在还包括至少一种其它细胞的细胞的实验对象组内；

b.所述细胞的实验对象组中的每一种细胞经改造以表达不同的蛋白质，并且将所述细胞与化合物或多种化合物接触；

c.在功能测定中测定化合物或多种化合物对所述细胞的实验对象组中的每一种细胞中表达的每一种蛋白质的效应；和

d.将每一种细胞中化合物或多种化合物的活性谱用于产生生理特性的体外相关性。

222.权利要求221的方法，其中每一种蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。

223.权利要求222的方法，其中所述多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

224.权利要求223的方法，其中所述多聚体蛋白质为异源多聚体蛋白质。

225.一种用于预测测试化合物的生理特性的方法，其中所述方法包括：

a.将所述测试化合物或多种测试化合物与表达根据权利要求217-220的第一目的蛋白质的第一细胞接触；

b.在功能测定中测定所述测试化合物或多种测试化合物对第一蛋白质的效应；

c.将测试化合物或多种所述测试化合物与表达根据权利要求217-220的第二目的蛋白质的第二细胞接触；

d.在功能测定中测定所述测试化合物或多种测试化合物对第二蛋白质的效应；

e.将在步骤a)至d)中获得的测试化合物的活性谱与如通过权利要求217的方法产生的体外相关性相比较。

其中第一和第二蛋白质独立地i)不包含蛋白质标签，ii)以适合用于功能测定的形式一致地且可重现性地产生，使得所述细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子的，iii)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，iv)改变所述细胞的生理特性并且其中所述细胞的生理特性在恒定的细胞培养条件下在3个月内改变不超过25％；v)于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达并且其中所述蛋白质的表达在3个月内改变不超过30％，vi)在还表达另一种蛋白质的细胞中表达并且在不存在选择压力的情况下培养所述细胞或vii)其任何组合；以及

其中如果测试化合物的活性谱与体外相关性的活性谱具有至少90％的相同，那么预测所述测试化合物或多种测试化合物具有体外相关性的生理特性。

226.一种用于证实测试化合物或多种测试化合物的生理特性的方法，其中所述方法包括：

a.将所述测试化合物或多种测试化合物与表达根据权利要求217的第一目的蛋白质的第一细胞接触；

c.将所述测试化合物或多种测试化合物与表达根据权利要求217的第二目的蛋白质的第二细胞接触；

e.将在步骤a)至d)中获得的测试化合物或多种测试化合物的活性谱与如通过权利要求217的方法产生的生理特性的体外相关性相比较，

其中如果测试化合物或多种测试化合物的活性谱与体外相关性的活性谱具有至少90％的相同，那么所述化合物被证实为具有生理特性。

227.权利要求225-226的任一项的方法，其中所述第一和第二蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。

228.权利要求227的方法，其中所述多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或至少6个亚单位。

229.权利要求228的方法，其中所述多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质。

230.权利要求225-229的任一项的方法，其中：

a.所述第一和第二细胞是还包括至少一种其它细胞的细胞的实验对象组中的细胞；

b.所述细胞的实验对象组中的每一种细胞经改造以表达不同的蛋白质，并且将所述细胞与所述测试化合物或多种测试化合物接触；

c.在功能测定中测定所述测试化合物或多种测试化合物对细胞的实验对象组中的每一种细胞中表达的每一种目的蛋白质的效应；和

d.将每一种细胞中测试化合物或多种测试化合物的活性谱用于与体外相关性的特征谱相比较。

231.权利要求230的方法，其中每一种蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。

232.权利要求231的方法，其中所述多聚体蛋白质包含至少2、3、4、5或至少6个亚单位。

233.权利要求233的方法，其中所述多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质。

234.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中所述第一多聚体目的蛋白质和第二多聚体目的蛋白质中的至少一个为异聚体蛋白质。

235.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中第一目的蛋白质和第二目的蛋白质中的至少一个是二聚体蛋白质。

236.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中第一目的蛋白质和第二目的蛋白质中的至少一个是三聚体蛋白质。

237.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中第一目的蛋白质和第二目的蛋白质是不同形式的多聚体蛋白质。

238.权利要求237的方法，其中所述多聚体蛋白质是GABA A受体。

239.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中所述第一或第二目的蛋白质中的至少一个是功能生物学途径的部分。

240.权利要求239的任一项的方法，其中所述功能生物学途径选自：糖基化、蛋白质合成、UPR、ER、核糖体、线粒体活性、RNA合成、翻译后修饰、细胞信号传导、细胞生长和细胞死亡。

241.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中所述生理特性是治疗效应。

242.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中所述生理特性是不利效应。

243.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中利用高通量筛选测定所述化合物或多种化合物对生理特性的效应。

244.权利要求217、221、225、226或230的任一项的方法，其中在计算机系统中执行步骤e)。

245.一种用于测定测试化合物或多种测试化合物的生理特性的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.接受所述测试化合物或多种测试化合物的第一活性谱，其中通过权利要求217或221的方法产生所述第一活性谱，并且其中所述第一活性谱提供了所述测试化合物或多种测试化合物的生理特性的体外相关性；

b.将所述第一活性谱与数据库中存储的多个标志性活性谱相比较以测定所述第一活性谱与所述多个标志性活性谱中的每一个所述标志性活性谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性活性谱提供了各已知化合物或多个已知化合物的已知的生理特性的体外相关性；

c.基于步骤(b)中测定的相似性量度确定与所述第一活性谱最相似的一个或多个标志性活性谱：

d.将与经测定与步骤(c)中的所述第一活性谱最相似的一个或多个标志性活性谱相关的已知生理特性鉴定为所述测试化合物或多种测试化合物的生理特性；

246.权利要求245的方法，其中如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性活性谱与所述第一活性谱最相似。

247.一种用于将测试化合物或多种测试化合物表征为与特定生理特性相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

b.将多个活性谱聚类，所述多个活性谱包括所述第一活性谱和多个标志性活性谱，其中每一个所述标志性活性谱为各已知化合物或多个已知化合物的已知的生理特性提供体外相关性；

c.鉴定所述多个标志性活性谱中与所述第一活性谱聚类的一个或多个标志性活性谱；和

d.将测试化合物或多种测试化合物表征为与各已知化合物或多个已知化合物的所述已知的生理特性相关，所述化合物的所述已知的生理特性对应于在步骤(c)中被鉴定为与所述第一活性谱聚类的一个或多个标志性活性谱；

248.一种使用分类器依据生理特性分类测试化合物或多种测试化合物的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.使用数据库中存储的多个标志性活性谱训练分类器以依据药理性质分类测试化合物或多种测试化合物，其中每一个所述标志性活性谱为各已知化合物或多个已知化合物的已知的生理特性提供了体外相关性；和

b.使用所述分类器处理由权利要求217或221的方法产生的第一活性谱以依据生理特性分类所述测试化合物或多种测试化合物；

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

249.一种使用分类器依据生理特性分类测试化合物或多种测试化合物的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.使用数据库中存储的多个标志性活性谱训练分类器以依据药理性质分类化合物或多种化合物，其中每一个所述标志性活性谱为各化合物的已知的体内药理性质提供了体外相关性；和

b.使用所述分类器处理由权利要求217或221的方法产生的第一活性谱以依据生理特性分类所述测试化合物或多种测试化合物，其中根据方法训练所述分类器，所述方法包括：

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

250.一种用于表征细胞中多聚体目的蛋白质的活性亚单位组合的方法，其中所述方法包括：

a.将表达目的多聚体蛋白质的第一亚单位的第一细胞与所述测试化合物或多种测试化合物接触；

b.将表达目的多聚体蛋白质的第二亚单位的第二细胞与所述测试化合物或多种测试化合物接触；

c.将表达目的多聚体蛋白质的第一亚单位和第二亚单位的第三细胞与所述测试化合物或多种测试化合物接触；

d.当所述多聚体蛋白质在第一细胞、第二细胞和第三细胞中表达时，在功能测定中测定所述测试化合物或多种测试化合物对多聚体蛋白质的效应；

e.推断第一和/或第二亚单位是否是生物活性多聚体蛋白质的部分；和

其中在步骤a)至d)中获得的特征提供了体内生理特性的体外相关性，

并且其中所述多聚体蛋白质的第一和第二亚单位独立不包含蛋白质标签，于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，或其任何组合。

251.权利要求250的方法，其中所述目的多聚体蛋白质是异源二聚体。

252.权利要求250的方法，其中所述目的多聚体蛋白质是异源三聚体。

253.一种用于表征细胞中多聚体目的蛋白质的活性亚单位组合的方法，其中所述方法包括：

a.将表达目的多聚体蛋白质的第一亚单位的第一细胞与测试化合物或多种测试化合物接触；

c.将表达目的多聚体蛋白质的第三亚单位的第三细胞与所述测试化合物或多种测试化合物接触；

d.将表达目的多聚体蛋白质的第一、第二和第三亚单位的第四细胞与所述测试化合物或多种测试化合物接触；

e.当所述目的多聚体蛋白质在第一细胞、第二细胞、第三细胞和第四细胞中表达时，在功能测定中测定所述测试化合物或多种测试化合物对多聚体蛋白质的效应；

f.推断第一、第二和/或第三亚单位是否是生物活性多聚体蛋白质的部分；

其中所述多聚体蛋白质的第一、第二和第三亚单位独立不包含蛋白质标签，于在不存在选择压力或其任何组合的情况下培养的细胞中表达。

254.权利要求253的方法，其中所述多聚体蛋白质是异源三聚体。

255.权利要求250的方法，其中所述多聚体蛋白质是GABA A受体。

256.细胞的实验对象组，其中所述实验对象组包括第一细胞和第二细胞，其中所述第一和第二细胞已进行改造以表达多聚体目的蛋白质的相同亚单位，其中所述第一细胞中目的多聚体蛋白质的生理特性与第二细胞中多聚体蛋白质的生理特性不同，并且其中第一和第二细胞源自相同的宿主细胞系；

其中所述目的多聚体蛋白质的亚单位不包含蛋白质标签，在不存在选择压力的条件下培养的细胞中表达，或其任何组合。

257.克隆细胞系的实验对象组，其中每一个细胞系已进行改造以表达目的多聚体蛋白质的相同亚单位，并且其中每一个细胞系中多聚体蛋白质的生理特性与所述实验对象组的另一个细胞系中目的多聚体蛋白质的生理特性不同，并且其中所述细胞系的实验对象组中的细胞系来源于相同的宿主细胞系；

其中所述目的多聚体蛋白质的亚单位不包含蛋白质标签，于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中表达，或其任何组合。

258.权利要求257的实验对象组，其中所述实验对象组包括2个细胞系。

259.权利要求257的实验对象组，其中所述实验对象组包括5个细胞系。

260.权利要求257的实验对象组，其中所述实验对象组包括10个细胞系。

261.权利要求257的实验对象组，其中所述目的多聚体蛋白质为NaV。

262.已进行改造以表达功能生物学途径的全部组成蛋白的细胞。

263.权利要求262的细胞，其中所述途径具有至少5个蛋白质组分。

264.权利要求262的细胞，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞。

265.权利要求262的细胞，其中所述生物学途径的组成蛋白质不包含蛋白质标签。

266.包括多个克隆细胞系的克隆细胞系的实验对象组，其中多个克隆细胞系的各克隆细胞系经改造以表达不同的气味受体；其中所述气味受体不包含蛋白质标签，或所述气味受体以适合用于功能测定的形式一致地且可重现性地产生，使得所述细胞在功能测定中具有至少0.4的Z’因子，或在不存在选择压力的情况下培养克隆细胞系，或其任何组合。

267.权利要求266的实验对象组，其中所述多个克隆细胞系包括至少10个细胞系。

268.权利要求266的实验对象组，其中所述不同气味受体是人气味受体或昆虫气味受体。

269.权利要求266的实验对象组，其中所述不同人气味受体选自OR10A1、OR10A3、OR10A4、OR10A5、OR10A6、OR10A7、OR10C1、OR10C2、OR10D4、OR10G2、OR10G3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR10H5、OR10J1、OR10J3、OR10J5、OR10J6、OR10K1、OR10K2、OR10Q1、OR10R2、OR10S1、OR10T2、OR10V1、OR10Z1、OR11A1、OR11G2、OR11H1、OR11H4、OR11H6、OR11H7P、OR11L1、OR12D3、OR13A1、OR13C2、OR13C3、OR13C4、OR13C5、OR13C7、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13E2、OR13F1、OR13G1、OR13H1、OR13J1、OR14A16、OR14A2、OR14C36、OR14J1、OR1A1、OR1A2、OR1A2、OR1B1、OR1C1、OR1D2、OR1D4、OR1D5、OR1E1、OR1E2、OR1E2、OR1E5、OR1E5、OR1E6、OR1E7、OR1F1、OR1F10、OR1F11、OR1F12、OR1F2、OR1G1、OR1I1、OR1J1、OR1J2、OR1J2、OR1J4、OR1J5、OR1K1、OR1L1、OR1L3、OR1L4、OR1L6、OR1L8、OR1M1、OR1M1、OR1N1、OR1N2、OR1N3、OR1Q1、OR1S1、OR1S2、OR2A1、OR2A10、OR2A19、OR2A20、OR2A21、OR2A4、OR2A42、OR2A5、OR2A6、OR2A7、OR2AE1、OR2AJ1、OR2AK2、OR2B1、OR2B2、OR2B3、OR2B6、OR2B9、OR2C1、OR2D1、OR2D2、OR2D3、OR2F1、OR2F2、OR2F3、OR2G2、OR2G3、OR2H1、OR2H2、OR2H3、OR2J2、OR2J3、OR2K1、OR2K2、OR2L1、OR2L2、OR2L3、OR2L5、OR2L8、OR2M1、OR2M2、OR2M4、OR2S2、OR2T1、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2V1、OR2V2、OR2V3、OR2W1、OR2W3、OR2Y1、OR2Z1、OR3A1、OR3A2、OR3A3、OR3A4、OR4A15、OR4A16、OR4A4、OR4A5、OR4B1、OR4C12、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C6、OR4D1、OR4D2、OR4D5、OR4D6、OR4D9、OR4E2、OR4F10、OR4F15、OR4F16、OR4F16、OR4F17、OR4F18、OR4F19、OR4F3、OR4F6、OR4K1、OR4K13、OR4K14、OR4K15、OR4K17、OR4K2、OR4K3、OR4K5、OR4L1、OR4M1、OR4M2、OR4N2、OR4N4、OR4N5、OR4P4、OR4Q3、OR4S1、OR4X1、OR4X2、OR51A2、OR51A4、OR51A7、OR51B2、OR51B4、OR51D1、OR51E1、OR51E2、OR51F2、OR51G1、OR51G2、OR51H1、OR51I1、OR5112、OR51L1、OR51M1、OR51Q1、OR51S1、OR51T1、OR52A1、OR52A2、OR52B2、OR52B4、OR52B4、OR52B4、OR52B6、OR52D1、OR52E2、OR52E4、OR52E5、OR52E6、OR52E8、OR52H1、OR52I1、OR5212、OR52J3、OR52K1、OR52K2、OR52L1、OR52L2、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52N5、OR52P1、OR52R1、OR56A4、OR56A6、OR56B2、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AC2、OR5AK2、OR5AK3、OR5AN1、OR5AP2、OR5AR1、OR5AS1、OR5AU1、OR5AU1、OR5B13、OR5B16、OR5B17、OR5B2、OR5B3、OR5C1、OR5D13、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5G3、OR5H1、OR5H2、OR5H6、OR5I1、OR5K1、OR5K2、OR5L1、OR5L2、OR5M1、OR5M10、OR5M11、OR5M11、OR5M3、OR5M3、OR5M8、OR5M9、OR5P2、OR5P3、OR5T2、OR5T3、OR5V1、OR6A1、OR6B1、OR6B2、OR6C1、OR6C2、OR6C3、OR6F1、OR6J2、OR6K3、OR6K6、OR6M1、OR6N1、OR6N2、OR6P1、OR6Q1、OR6S1、OR6T1、OR6V1、OR6X1、OR6Y1、OR7A10、OR7A17、OR7A2、OR7A5、OR7C1、OR7C2、OR7D2、OR7D2、OR7D4P、OR7E102、OR7E120、OR7G1、OR7G2、OR7G3、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8B8、OR8D1、OR8D2、OR8D4、OR8G1、OR8G2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR9A2、OR9A4、OR9G1、OR9G4、OR9G5、OR9I1、OR9K2、OR9Q1。

270.权利要求266的实验对象组，其中所述不同昆虫气味受体是蚊子气味受体，其选自IOR100、IOR101、IOR102、IOR103、IOR104、IOR105、IOR106、IOR107、IOR108、IOR109、IOR110、IOR111、IOR112、IOR113、IOR114、IOR115、IOR116、IOR117、IOR118、IOR119、IOR120、IOR121、IOR122、IOR123、IOR124、IOR125、IOR126、IOR127、IOR49、IOR50、IOR51、IOR52、IOR53、IOR54、IOR55、IOR56、IOR57、IOR58、IOR59、IOR60、IOR61、IOR62、IOR63、IOR64、IOR65、IOR66、IOR67、IOR68、IOR69、IOR70、IOR71、IOR72、IOR73、IOR74、IOR75、IOR76、IOR77、IOR78、IOR79、IOR80、IOR81、IOR82、IOR83、IOR84、IOR85、IOR86、IOR87、IOR88、IOR89、IOR90、IOR91、IOR92、IOR93、IOR94、IOR95、IOR96、IOR97、IOR98、IOR99、ORL7077、ORL7078、ORL7079、ORL7080、ORL7081、ORL7082、ORL7083、ORL7084、ORL7085、ORL7086、ORL7087、ORL7088、ORL7089、ORL7090、ORL7091、ORL7092、ORL7093、ORL7094、ORL7095、ORL7096、ORL7097、ORL7098、ORL7099、ORL7100、ORL7101、ORL7102、ORL7103、ORL7104、ORL7105、ORL7106、ORL7107、ORL7108、ORL7109、ORL7110、ORL7111、ORL7112、ORL7113、ORL7114、ORL7115、ORL7116、ORL7117、ORL7118、ORL7119、ORL7120、ORL7121、ORL7122、ORL7123、ORL7124、ORL7125、TPR2307、TPR2308、TPR2309、TPR2310、TPR2312、TPR2314、TPR2315、TPR2316、TPR2317、TPR2318、TPR2319、TPR2320、TPR2321、TPR2321、TPR698、TPR699、TPR700、TPR701、TPR702、TPR703、TPR704、TPR705、TPR706、TPR707、TPR708、TPR709、TPR710、TPR711、TPR712、TPR713、TPR714、TPR715、TPR716、TPR717、TPR718、TPR719、TPR720、TPR721、TPR722、TPR723、TPR724、TPR725、TPR725、TPR726、TPR727、TPR728、TPR729、TPR730、TPR731、TPR732、TPR733、TPR734、TPR735、TPR736、TPR737、TPR738、TPR739、TPR740、TPR741、TPR742、TPR743、TPR744、TPR745、TPR746、TPR747、TPR748、TPR749、TPR750、TPR751、TPR752、TPR753、TPR754、TPR755、TPR756、TPR757、TPR758、TPR759、TPR760、TPR761、TPR762、TPR763、TPR764、TPR765、TPR766、TPR767、TPR768、TPR769、TPR770、TPR771、TPR772。

271.一种用于产生测试化合物或组合物的气味活性谱的方法，其中所述方法包括：

a.将权利要求266的实验对象组与所述测试化合物或组合物接触；和

b.测量所述测试化合物或组合物对实验对象组中至少2种不同气味受体在功能测试中的活性的效应，

其中在步骤(b)中测量的活性提供了所述测试化合物或组合物的气味活性谱。

272.一种用于鉴定模拟第一测试化合物或组合物的气味的第二测试化合物的方法，其中所述方法包括：

a.将权利要求266的实验对象组与所述第二测试化合物接触；

b.测试所述第二测试化合物对实验对象组中至少2种气味受体在功能测定中的活性的效应；

c.将步骤(b)中获得的第二测试化合物的气味活性谱与第一测试化合物或组合物的气味活性谱相比较；其中，如果第二测试化合物的气味活性谱与第一测试化合物或组合物的气味活性谱相似，那么第二测试化合物模拟第一测试化合物或组合物的气味。

273.一种用于鉴定改变第一测试化合物或组合物的气味活性谱的第二测试化合物的方法，其中所述方法包括：

a.按照权利要求271的方法在第一测试化合物或组合物存在的情况下产生第二测试化合物的气味活性谱；

b.将步骤(a)中获得的气味活性谱与在第二测试化合物不存在的情况下是第一测试化合物或组合物的气味活性谱相比较；其中如果单独的第一测试化合物或组合物的气味活性谱与在第一测试化合物或组合物存在的情况下的第二测试化合物的气味活性谱不同，那么第二测试化合物改变了第一测试化合物或组合物的气味活性谱。

274.一种用于鉴定与测试化合物相关的气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.接受测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求271的方法产生；

b.将所述第一气味活性谱与数据库中存储的多个标志性气味活性谱相比较以测定所述第一气味活性谱与所述多个标志性气味活性谱中的每一个所述标志性气味活性谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各个具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；

c.基于步骤(b)中测定的相似性量度确定与所述第一气味活性谱最相似的一个或个多标志性气味活性谱；和

d.将与步骤(c)中经确定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱相关的气味鉴定为与所述已知化合物相关的气味；

275.权利要求274的方法，其中所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性气味活性谱与所述第一气味活性谱最相似。

276.一种用于将化合物表征为与特定气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.接受所述化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求271的方法产生；

b.将多个气味活性谱聚类，所述多个气味活性谱包括所述第一气味活性谱和多个标志性气味活性谱，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各个具有已知气味的已知化合物，并且其中所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；

c.鉴定所述多个标志性气味活性谱中与第一气味活性谱聚类的一个或多个标志性气味活性谱；和

d.将化合物表征为与所述已知的气味相关，所述气味与对应于在步骤(c)中被鉴定为与所述第一气味活性谱聚类的一个或多个标志性气味活性谱的各化合物相关；

277.一种使用分类器将测试化合物分类为具有气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.使用数据库中存储的多个标志性气味活性谱训练分类器以依据气味分类测试化合物，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；和

b.使用所述分类器处理由权利要求271的方法产生的所述化合物的第一气味活性谱以依据已知的气味分类所述化合物；

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

278.一种使用分类器将测试化合物分类为具有气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.使用所述分类器处理由权利要求271的方法产生的所述化合物的第一气味活性谱以依据已知的气味分类所述化合物，其中根据方法训练所述分类器，所述方法：

b.使用数据库中存储的多个标志性气味活性谱训练分类器以依据气味分类测试化合物，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；

其中在使用适当程序化的计算机上进行处理。

279.一种用于使一种或多种测试化合物与气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.接受第一测试化合物的测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求271的方法产生，并且其中所述第一测试化合物具有已知的气味；

b.将所述第一气味活性谱与数据库存储的多个标志性气味活性谱相比较，以测定所述第一气味活性谱与所述多个标志性气味活性谱中的每一个所述标志性气味活性谱谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；

c.基于步骤(b)中测定的相似性量度，确定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱；和

d.将对应于在步骤(c)中被测定与所述第一气味活性谱最相似的一个或多个标志性气味活性谱的各测试化合物表征为与所述已知的气味相关；

280.权利要求279的方法，其中如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性气味活性谱与所述第一气味活性谱最相似。

281.一种用于将一种或多种测试化合物表征为与特定气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.接受第一测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求271的方法产生，并且所述第一测试化合物具有已知的气味；

b.将多个气味活性谱聚类，所述多个气味活性谱包括所述第一气味活性谱和多个标志性气味活性谱，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；

d.将对应于在步骤(c)中被鉴定为与所述第一气味活性谱聚类的一个或多个标志性气味活性谱的各化合物表征为与所述已知的气味相关；

282.一种使用分类器将一种或多种测试化合物分类为具有气味的计算机实现的方法，其中所述方法包括：

a.使用所述分类器处理由权利要求271的方法产生的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱对应于具有已知气味的第一测试化合物，以将数据库中存储的多个标志性气味活性谱中的一个或多个标志性气味活性谱分类为具有所述已知气味，其中根据方法训练所述分类器，所述方法包括：

b.使用所述多个标志性气味活性谱训练所述分类器将所述一个或多个标志性气味活性谱分类为具有气味，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求271的方法产生；

其中在使用适当程序化的计算机上进行处理。

283.与体内目的蛋白质或多个目的蛋白质体外相关的蛋白质或多种蛋白质，其中所述体外相关性预示着体内表达的相应目的蛋白质或多个目的蛋白质的功能或活性；其中所述体外相关性是在体外非生理条件下表达的具有生物活性的蛋白质或多种蛋白质；其中所述体外相关性包括对应于体内目的蛋白质或多种蛋白质的至少一种功能或药理学或生理特性；并且其中至少10％的使用所述体外相关性在高通量筛选中鉴定的化合物能够具有体内治疗效应。

284.权利要求283的蛋白质，其中所述体外相关性包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

285.权利要求283的多个蛋白质，其中所述体外相关性的至少一种蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

286.权利要求283的蛋白质，其中所述体外相关性包括异源多聚体。

287.权利要求283的多个蛋白质，其中所述体外相关性的至少一个蛋白质包括异源多聚体。

288.权利要求283-287的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性的蛋白质或多个蛋白质不包含蛋白质标签。

289.权利要求283-288的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达。

290.权利要求283-289的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性在细胞系中表达而不引起细胞毒性。

291.权利要求283-290的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性于在不内源性表达蛋白质或多种蛋白质的细胞中表达。

292.表达权利要求283-291的任一项的蛋白质或多个蛋白质的细胞。

293.从权利要求292的细胞产生的细胞系。

294.一种用于鉴定体内目的蛋白质的调节剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a.将权利要求292的细胞与与测试化合物接触；和

b.检测相比于未与测试化合物接触的细胞中的体外相关性的蛋白质或多个蛋白质的活性，与所述测试化合物接触的细胞中的体外相关性的蛋白质或多个蛋白质的活性的变化；

295.通过权利要求294的方法鉴定的调节剂。

296.权利要求190、192、194、195-199、201-202、262和292的任一项的细胞，其中所述细胞是分化细胞。

297.权利要求190、192、194、195-199、201-202、262和292的任一项的细胞，其中所述细胞是去分化的细胞。

298.权利要求297的细胞，其中所述去分化的细胞是干细胞，其选自由下列组成的组：多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞。

299.一种产生干细胞的方法，其包括下列步骤：使分化细胞去分化成干细胞，其中所述分化细胞是权利要求296的细胞。

300.一种用于产生再分化的细胞的方法，其包括下列步骤：

a.使权利要求296的干细胞去分化以产生干细胞；和

b.将所述干细胞再分化以产生再分化的细胞。

301.权利要求299或权利要求300的方法，其中所述干细胞选自由下列组成的组：多能干细胞、多潜能性干细胞、全能干细胞、诱导的多潜能性干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞、器官特异性干细胞和组织特异性干细胞。

302.权利要求300的方法，其中所述再分化的细胞与权利要求296的细胞是不同的类型。

303.一种用于产生非人生物体的方法，包括下列步骤：

a.使权利要求296的细胞去分化，以产生干细胞，其中所述干细胞是胚胎干细胞或诱导的多潜能性干细胞；和

b.使干所述细胞再分化以产生非人生物体。

304.权利要求303的方法，其中所述生物是哺乳动物。

305.权利要求304的方法，其中所述哺乳动物是小鼠。

306.通过权利要求300的方法产生的再分化细胞。

307.通过权利要求303的方法产生的非人生物体。

308.权利要求307的非人生物体，其中所述生物是哺乳动物。

309.权利要求308的非人生物体，其中所述哺乳动物是小鼠。

310.权利要求218或权利要求227的方法，其中所述第一和第二目的蛋白质独立地选自由下列组成的组：ENaC、NaV、GABAA、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR和GCC。

311.权利要求231的方法，其中每一种蛋白质独立地选自由下列组成的组：ENaC、NaV、GABAA、甜味受体、鲜味受体、苦味受体、CFTR和GCC。

Claims

a.提供一群细胞；

6.根据权利要求1至5的任一项产生的分离的细胞。

8.权利要求7的细胞，其中所述细胞群体是一群中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、已建立的神经元细胞系、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤成纤维细胞、横纹肌肉瘤细胞、背根神经节细胞、NS0细胞、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、HEK-293(ATCC CRL1573)和PC12(ATCC CRL-1721)、HEK293T(ATCC CRL-11268)、RBL(ATCC CRL-1378)、SH-SY5Y(ATCCCRL-2266)、MDCK(ATCC CCL-34)、SJ-RH30(ATCC CRL-2061)、HepG2(ATCC HB-8065)、ND7/23(ECACC 92090903)、CHO(ECACC85050302)、Vero(ATCC CCL 81)、Caco-2(ATCC HTB 37)、K562(ATCC CCL243)、Jurkat(ATCC TIB-152)、Per.C6(Crucell，Leiden，The Netherlands)、Huvec(ATCC人原代PCS 100-010、小鼠CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH-7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC CRL 10852)、A549(ATCC CCL185)、IMR-90(ATCC CCL 186)、MCF-7(ATC HTB-22)、U-2OS(ATCCHTB-96)、T84(ATCC CCL 248)、原代细胞或永生化细胞。

9.权利要求7的细胞的培养物。

14.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达甜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

16.权利要求10或11的细胞或细胞系，其中所述甜味受体

a.是哺乳动物甜味受体；

b.是人甜味受体；

c.包含来自不同物种的亚单位；

d.包含为嵌合的一个或多个亚单位；

e.(a)-(d)的任何组合。

a.包含SEQ ID NO：31的核酸；

a.包含SEQ ID NO：32的核酸；

a.包含SEQ ID NO：33的核酸；

c.分离表达T1R2亚单位、T1R3亚单位和任选的G蛋白的细胞。

29.权利要求27的方法，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达甜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.a)、b)和c)的任何组合。

30.权利要求27的方法，还包括下列步骤：

31.权利要求27的方法，还包括下列步骤：

37.权利要求35的方法，其中所述调节剂选自甜味受体抑制剂、甜味受体拮抗剂、甜味受体阻断剂、甜味受体激活剂、甜味受体激动剂或甜味受体增强剂。

38.权利要求35的方法，其中所述甜味受体是人甜味受体。

39.权利要求35的方法，其中所述测试化合物是小分子、化学部分、多肽或抗体。

40.权利要求35的方法，其中所述测试化合物是化合物的文库。

42.权利要求35的方法，其中所述调节剂对于甜味受体的酶促修饰形式具有选择性。

43.通过权利要求35的方法鉴定的调节剂。

e.鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

54.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达鲜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

56.权利要求50或51的细胞或细胞系，其中所述鲜味受体

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.包含来自不同物种的亚单位；

d.包含为嵌合的一个或多个亚单位；

e.(a)-(d)的任何组合。

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：41或编码选自SEQ IDNO：42-45的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；和

a.包含SEQ ID NO：41的核酸；

c.包含在严格条件下与a)或b)的核酸杂交的核苷酸序列的核酸；和d.包含与SEQ ID NO：41或编码选自SEQ ID NO：42-45的氨基酸或另一物种的对应氨基酸序列的核酸具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸。

c.包含由在严格条件下与SEQ ID NO：32或编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列或另一物种的对应氨基酸序列的核酸杂交的核酸编码的氨基酸序列的鲜味受体亚单位；和

a.包含SEQ ID NO：32的核酸；

a.包含SEQ ID NO：33或另一物种的对应氨基酸序列的核酸；

c.分离表达T1R1亚单位、T1R3亚单位和任选的G蛋白的细胞。

68.权利要求[0207]的方法，还包括从步骤c)中分离的细胞产生细胞系的步骤。

69.权利要求[0207]的方法，其中所述宿主细胞：

a.是真核细胞；

b.是哺乳动物细胞；

c.不内源性表达鲜味受体的至少一个亚单位或G蛋白；或

d.a)、b)和c)的任何组合。

70.权利要求[0207]的方法，还包括下列步骤：

71.权利要求[0207]的方法，还包括下列步骤：

73.权利要求[0207]的方法，其中所述T1R1亚单位选自权利要求12a)至d)的亚单位，其中所述T1R3亚单位选自权利要求14a)至d)的亚单位并且其中G蛋白选自权利要求16a)至d)的蛋白质。

74.权利要求[0207]的方法，其中由核酸编码的T1R1亚单位选自由权利要求13a)至d)的核酸编码的亚单位，其中T1R3亚单位选自由权利要求15a)至d)的核酸编码的亚单位并且其中G蛋白选自由权利要求17a)至d)的核酸编码的蛋白质。

75.权利要求[0207]的方法，其中所述分离步骤利用荧光激活细胞分选器。

77.权利要求[0213]的方法，其中所述调节剂选自鲜味受体抑制剂、鲜味受体拮抗剂、鲜味受体阻断剂、鲜味受体激活剂、鲜味受体激动剂或鲜味受体增强剂。

78.权利要求[0213]的方法，其中所述鲜味受体是人鲜味受体。

79.权利要求[0213]的方法，其中所述测试化合物是小分子、化学部分、多肽或抗体。

80.权利要求[0213]的方法，其中所述测试化合物是化合物的文库。

82.权利要求[0213]的方法，其中所述调节剂对于鲜味受体的酶促修饰形式具有选择性。

83.通过权利要求[0213]的分子鉴定的调节剂。

e.鉴定在两个测定中都具有所需特征的分离的细胞培养物。

90.经改造以稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系。

98.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述细胞或细胞系稳定地表达：以稳定地表达苦味受体的细胞或细胞系。

a.内源G蛋白；

b.异源G蛋白或

c.两者。

a.真核细胞；

b.哺乳动物细胞；

c.不表达内源性苦味受体的细胞；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

103.权利要求90的细胞或细胞系，其中所述苦味受体：

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.在其氨基端或羧基端不具有多肽标签；

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

a.SEQ ID NOS：77-101中的任一个；

a.SEQ ID NOS：51-75中的任一个；

116.权利要求114的集合，其中其等位基因变体为SNP。

120.权利要求119的集合，其中所述生理特性是生长速率。

122.权利要求119的集合，其中所述生理特性是Z′因子。

126.权利要求124的集合，其中其等位基因变体为SNP。

130.权利要求129的集合，其中所述生理特性是生长速率。

132.权利要求129的集合，其中所述生理特性是Z′因子。

134.一种产生稳定地表达苦味受体的细胞的方法，其包括：

a.将编码苦味受体的核酸引入多个细胞；

c.分离表达所述苦味受体的细胞。

137.权利要求134的方法，其中所述细胞是：

a.真核细胞；

b.哺乳动物细胞；

c.不表达内源性苦味受体的细胞；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

139.权利要求134的方法，其中所述苦味受体：

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.在其氨基端或羧基端不具有多肽标签；

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

a.SEQ ID NOS：77-101中的任一个；

a.SEQ ID NOS：51-75中的任一个；

a.在引入编码所述苦味受体的核酸之前；

b.在引入编码所述苦味受体的核酸之后；或

c.与引入编码所述苦味受体的核酸同时。

a.在引入检测所述苦味受体的表达的分子信标之前；

b.在引入检测所述苦味受体的表达的分子信标之后；或

c.与引入检测所述苦味受体的表达的分子信标同时。

151.权利要求58的方法，其还包括：

a.在分离表达所述苦味受体的细胞之前；

b.在分离表达所述苦味受体的细胞之后；或

c.与分离表达所述苦味受体的细胞的同时；

152.一种鉴定苦味受体功能的调节剂的方法，其包括：

b.检测所述苦味受体的功能的变化。

a.真核细胞；

b.哺乳动物细胞；

c.不表达任何内源性苦味受体的细胞；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

158.权利要求152的方法，其中所述苦味受体：

a.是哺乳动物；

b.是人；

c.在其氨基端或羧基端不具有多肽标签；或

d.(a)、(b)和(c)的任何组合。

a.SEQ ID NOS：77-101中的任一个；

a.SEQ ID NOS：51-75中的任一个；

168.一种鉴定苦味受体功能的调节剂的方法，其包括：

175.一种鉴定苦味受体功能的调节剂的方法，其包括：

a.提供多个表达编码所述苦味受体的mRNA的细胞；

183.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系选自原代细胞和永生化细胞。

184.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系细胞是真核细胞并且选自由下列组成的组：真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、藻类、甲壳类动物细胞、节肢动物细胞、禽类细胞、爬行类动物细胞、两栖动物细胞、植物细胞、人、非人灵长类动物、牛科动物、猪科动物、猫科动物、大鼠、有袋动物、鼠科动物、犬科动物、绵羊、山羊、兔子、豚鼠、仓鼠。

185.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系中的细胞经改造以表达所述目的蛋白质。

186.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系中的细胞从编码蛋白质或在多聚体蛋白质的情况下编码蛋白质亚单位的所引入的核酸表达目的蛋白质。

187.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞从内源核酸表达所述目的蛋白质并且其中所述细胞经改造以激活内源蛋白质的转录，或在多聚体蛋白质的情况下，激活蛋白质亚单位的转录。

188.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括至少4个、至少6个或至少20个克隆细胞系。

189.权利要求[0079]的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述多亚单位蛋白质选自由下列组成的组：离子通道、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体、抗体、生物制品和免疫受体。

200.权利要求[0100]-[0104]的任一项的细胞，其中在选自少于1周、少于2周、少于3周、少于4周、少于1个月、少于2个月、少于3个月、少于4个月、少于5个月、少于6个月、少于7个月、少于8个月或少于9个月的时间段中产生所述细胞。

203.权利要求168或169的细胞，其中在选自少于3个月、少于4个月或少于6个月的时间段中产生所述细胞。

204.权利要求[0100]-203的任一项的细胞，其中所述蛋白质是单体蛋白质。

205.权利要求[0100]-203的任一项的细胞，其中所述蛋白质是多聚体蛋白质。

206.权利要求[0100]-203的任一项的细胞，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签或在不存在选择压力的情况下培养所述细胞，或其组合。

210.从权利要求[0100]-209的任一项的细胞产生的细胞系。

211.一种鉴定目的蛋白质的调节剂的方法，其包括下列步骤：

a.将权利要求[0100]至210的任一项的细胞与测试化合物接触；和

212.细胞或克隆细胞系的相匹配实验对象组，其包括根据权利要求[0100]-209的至少2种细胞或权利要求210的2个克隆细胞系，其中所述至少2种细胞或所述至少2个克隆细胞系是相匹配的，使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。

213.权利要求[0111]的相匹配实验对象组，其中所述相匹配实验对象组包括权利要求[0100]-209的至少10种细胞或权利要求210的10个克隆细胞系，并且至少10种细胞或10个克隆细胞系是相匹配的，使得在相同的细胞培养条件下平行地培养它们。

214.权利要求213的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括权利要求[0100]-209的至少100种细胞或权利要求210的至少100个，并且在相同细胞培养条件下平行地培养所述至少100种细胞或所述至少100个克隆细胞系。

a.所述实验对象组包括至少5个细胞系；

b.在少于6个月内产生所述实验对象组；

c.第一和第二目的蛋白质不具有蛋白质标签；

d.在不存在选择压力的条件下培养克隆细胞系；或

e.a)-d)的任何组合。

216.权利要求[0113]的相匹配实验对象组，其中所述第一目的蛋白质是抗体并且所述功能生物学途径是糖基化途径。

218.权利要求[0115]的方法，其中第一和第二目的蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。

221.权利要求[0115]-219的任一项的方法，其中：

a.将所述测试化合物或多种测试化合物与表达根据权利要求[0115]-220的第一目的蛋白质的第一细胞接触；

c.将测试化合物或多种所述测试化合物与表达根据权利要求[0115]-220的第二目的蛋白质的第二细胞接触；

e.将在步骤a)至d)中获得的测试化合物的活性谱与如通过权利要求[0115]的方法产生的体外相关性相比较。

a.将所述测试化合物或多种测试化合物与表达根据权利要求[0115]的第一目的蛋白质的第一细胞接触；

c.将所述测试化合物或多种测试化合物与表达根据权利要求[0115]的第二目的蛋白质的第二细胞接触；

e.将在步骤a)至d)中获得的测试化合物或多种测试化合物的活性谱与如通过权利要求[0115]的方法产生的生理特性的体外相关性相比较，

227.权利要求[0119]-[0121]的任一项的方法，其中所述第一和第二蛋白质独立地选自单体蛋白质或多聚体蛋白质。

230.权利要求[0119]-229的任一项的方法，其中：

234.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中所述第一多聚体目的蛋白质和第二多聚体目的蛋白质中的至少一个为异聚体蛋白质。

235.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中第一目的蛋白质和第二目的蛋白质中的至少一个是二聚体蛋白质。

236.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中第一目的蛋白质和第二目的蛋白质中的至少一个是三聚体蛋白质。

237.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中第一目的蛋白质和第二目的蛋白质是不同形式的多聚体蛋白质。

238.权利要求237的方法，其中所述多聚体蛋白质是GABA A受体。

239.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中所述第一或第二目的蛋白质中的至少一个是功能生物学途径的部分。

241.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中所述生理特性是治疗效应。

242.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中所述生理特性是不利效应。

243.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中利用高通量筛选测定所述化合物或多种化合物对生理特性的效应。

244.权利要求[0115]、221、[0119]、[0121]或230的任一项的方法，其中在计算机系统中执行步骤e)。

a.接受所述测试化合物或多种测试化合物的第一活性谱，其中通过权利要求[0115]或221的方法产生所述第一活性谱，并且其中所述第一活性谱提供了所述测试化合物或多种测试化合物的生理特性的体外相关性；

246.权利要求[0127]的方法，其中如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性活性谱与所述第一活性谱最相似。

b.使用所述分类器处理由权利要求[0115]或221的方法产生的第一活性谱以依据生理特性分类所述测试化合物或多种测试化合物；

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

b.使用所述分类器处理由权利要求[0115]或221的方法产生的第一活性谱以依据生理特性分类所述测试化合物或多种测试化合物，其中根据方法训练所述分类器，所述方法包括：

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

251.权利要求[0132]的方法，其中所述目的多聚体蛋白质是异源二聚体。

252.权利要求[0132]的方法，其中所述目的多聚体蛋白质是异源三聚体。

254.权利要求[0134]的方法，其中所述多聚体蛋白质是异源三聚体。

255.权利要求[0132]的方法，其中所述多聚体蛋白质是GABAA受体。

258.权利要求[0137]的实验对象组，其中所述实验对象组包括2个细胞系。

259.权利要求[0137]的实验对象组，其中所述实验对象组包括5个细胞系。

260.权利要求[0137]的实验对象组，其中所述实验对象组包括10个细胞系。

261.权利要求[0137]的实验对象组，其中所述目的多聚体蛋白质为NaV。

263.权利要求[0140]的细胞，其中所述途径具有至少5个蛋白质组分。

264.权利要求[0140]的细胞，其中在不存在选择压力的情况下培养所述细胞。

265.权利要求[0140]的细胞，其中所述生物学途径的组成蛋白质不包含蛋白质标签。

267.权利要求[0142]的实验对象组，其中所述多个克隆细胞系包括至少10个细胞系。

268.权利要求[0142]的实验对象组，其中所述不同气味受体是人气味受体或昆虫气味受体。

269.利要求[0142]的实验对象组，其中所述不同人气味受体选自OR10A1、OR10A3、OR10A4、OR10A5、OR10A6、OR10A7、OR10C1、OR10C2、OR10D4、OR10G2、OR10G3、OR10G4、OR10G7、OR10G8、OR10G9、OR10H1、OR10H2、OR10H3、OR10H4、OR10H5、OR10J1、OR10J3、OR10J5、OR10J6、OR10K1、OR10K2、OR10Q1、OR10R2、OR10S1、OR10T2、OR10V1、OR10Z1、OR11A1、OR11G2、OR11H1、OR11H4、OR11H6、OR11H7P、OR11L1、OR12D3、OR13A1、OR13C2、OR13C3、OR13C4、OR13C5、OR13C7、OR13C8、OR13C9、OR13D1、OR13E2、OR13F1、OR13G1、OR13H1、OR13J1、OR14A16、OR14A2、OR14C36、OR14J1、OR1A1、OR1A2、OR1A2、OR1B1、OR1C1、OR1D2、OR1D4、OR1D5、OR1E1、OR1E2、OR1E2、OR1E5、OR1E5、OR1E6、OR1E7、OR1F1、OR1F10、OR1F11、OR1F12、OR1F2、OR1G1、OR1I1、OR1J1、OR1J2、OR1J2、OR1J4、OR1J5、OR1K1、 OR1L1、OR1L3、OR1L4、OR1L6、OR1L8、OR1M1、OR1M1、OR1N1、OR1N2、OR1N3、OR1Q1、OR1S1、OR1S2、OR2A1、OR2A10、OR2A19、OR2A20、OR2A21、OR2A4、OR2A42、OR2A5、OR2A6、OR2A7、OR2AE1、OR2AJ1、OR2AK2、OR2B1、OR2B2、OR2B3、OR2B6、OR2B9、OR2C1、OR2D1、OR2D2、OR2D3、OR2F1、OR2F2、OR2F3、OR2G2、OR2G3、OR2H1、OR2H2、OR2H3、OR2J2、OR2J3、OR2K1、OR2K2、OR2L1、OR2L2、OR2L3、OR2L5、OR2L8、OR2M1、OR2M2、OR2M4、OR2S2、OR2T1、OR2T3、OR2T4、OR2T5、OR2T6、OR2T7、OR2T8、OR2V1、OR2V2、OR2V3、OR2W1、OR2W3、OR2Y1、OR2Z1、OR3A1、OR3A2、OR3A3、OR3A4、OR4A15、OR4A16、OR4A4、OR4A5、OR4B1、OR4C12、OR4C13、OR4C15、OR4C16、OR4C3、OR4C6、OR4D1、OR4D2、OR4D5、OR4D6、OR4D9、OR4E2、OR4F10、OR4F15、OR4F16、OR4F16、OR4F17、OR4F18、OR4F19、OR4F3、OR4F6、OR4K1、OR4K13、OR4K14、OR4K15、OR4K17、OR4K2、OR4K3、OR4K5、OR4L1、OR4M1、OR4M2、OR4N2、OR4N4、OR4N5、OR4P4、OR4Q3、OR4S1、OR4X1、OR4X2、OR51A2、OR51A4、OR51A7、OR51B2、OR51B4、OR51D1、OR51E1、OR51E2、OR51F2、OR51G1、OR51G2、OR51H1、OR51I1、OR5112、OR51L1、OR51M1、OR51Q1、OR51S1、OR51T1、OR52A1、OR52A2、OR52B2、OR52B4、OR52B4、OR52B4、OR52B6、OR52D1、OR52E2、OR52E4、OR52E5、OR52E6、OR52E8、OR52H1、OR52I1、OR5212、OR52J3、OR52K1、OR52K2、OR52L1、OR52L2、OR52N1、OR52N2、OR52N4、OR52N5、OR52P1、OR52R1、OR56A4、OR56A6、OR56B2、OR56B4、OR5A1、OR5A2、OR5AC2、OR5AK2、OR5AK3、OR5AN1、OR5AP2、OR5AR1、OR5AS1、OR5AU1、OR5AU1、OR5B13、OR5B16、OR5B17、OR5B2、OR5B3、OR5C1、OR5D13、OR5D14、OR5D16、OR5D18、OR5F1、OR5G3、OR5H1、OR5H2、OR5H6、OR5I1、OR5K1、OR5K2、OR5L1、OR5L2、OR5M1、OR5M10、OR5M11、OR5M11、OR5M3、OR5M3、OR5M8、OR5M9、OR5P2、OR5P3、OR5T2、OR5T3、OR5V1、OR6A1、OR6B1、OR6B2、OR6C1、 OR6C2、OR6C3、OR6F1、OR6J2、OR6K3、OR6K6、OR6M1、OR6N1、OR6N2、OR6P1、OR6Q1、OR6S1、OR6T1、OR6V1、OR6X1、OR6Y1、OR7A10、OR7A17、OR7A2、OR7A5、OR7C1、OR7C2、OR7D2、OR7D2、OR7D4P、OR7E102、OR7E120、OR7G1、OR7G2、OR7G3、OR8A1、OR8B12、OR8B2、OR8B3、OR8B4、OR8B8、OR8D1、OR8D2、OR8D4、OR8G1、OR8G2、OR8H1、OR8H2、OR8H3、OR8I2、OR8J1、OR8J3、OR8K1、OR8K3、OR8K5、OR9A2、OR9A4、OR9G1、OR9G4、OR9G5、OR9I1、OR9K2、OR9Q1。

270.利要求[0142]的实验对象组，其中所述不同昆虫气味受体是蚊子气味受体，其选自IOR100、IOR101、IOR102、IOR103、IOR104、IOR105、IOR106、IOR107、IOR108、IOR109、IOR110、IOR111、IOR112、IOR113、IOR114、IOR115、IOR116、IOR117、IOR118、IOR119、IOR120、IOR121、IOR122、IOR123、IOR124、IOR125、IOR126、IOR127、IOR49、IOR50、IOR51、IOR52、IOR53、IOR54、IOR55、IOR56、IOR57、IOR58、IOR59、IOR60、IOR61、IOR62、IOR63、IOR64、IOR65、IOR66、IOR67、IOR68、IOR69、IOR70、IOR71、IOR72、IOR73、IOR74、IOR75、IOR76、IOR77、IOR78、IOR79、IOR80、IOR81、IOR82、IOR83、IOR84、IOR85、IOR86、IOR87、IOR88、IOR89、IOR90、IOR91、IOR92、IOR93、IOR94、IOR95、IOR96、IOR97、IOR98、IOR99、ORL7077、ORL7078、ORL7079、ORL7080、ORL7081、ORL7082、ORL7083、ORL7084、ORL7085、ORL7086、ORL7087、ORL7088、ORL7089、ORL7090、ORL7091、ORL7092、ORL7093、ORL7094、ORL7095、ORL7096、ORL7097、ORL7098、ORL7099、ORL7100、ORL7101、ORL7102、ORL7103、ORL7104、ORL7105、ORL7106、ORL7107、ORL7108、ORL7109、ORL7110、ORL7111、ORL7112、ORL7113、ORL7114、ORL7115、ORL7116、ORL7117、ORL7118、ORL7119、ORL7120、ORL7121、ORL7122、ORL7123、ORL7124、ORL7125、TPR2307、TPR2308、TPR2309、TPR2310、TPR2312、TPR2314、TPR2315、TPR2316、 TPR2317、TPR2318、TPR2319、TPR2320、TPR2321、TPR2321、TPR698、TPR699、TPR700、TPR701、TPR702、TPR703、TPR704、TPR705、TPR706、TPR707、TPR708、TPR709、TPR710、TPR711、TPR712、TPR713、TPR714、TPR715、TPR716、TPR717、TPR718、TPR719、TPR720、TPR721、TPR722、TPR723、TPR724、TPR725、TPR725、TPR726、TPR727、TPR728、TPR729、TPR730、TPR731、TPR732、TPR733、TPR734、TPR735、TPR736、TPR737、TPR738、TPR739、TPR740、TPR741、TPR742、TPR743、TPR744、TPR745、TPR746、TPR747、TPR748、TPR749、TPR750、TPR751、TPR752、TPR753、TPR754、TPR755、TPR756、TPR757、TPR758、TPR759、TPR760、TPR761、TPR762、TPR763、TPR764、TPR765、TPR766、TPR767、TPR768、TPR769、TPR770、TPR771、TPR772。

a.将权利要求[0142]的实验对象组与所述测试化合物或组合物接触；和

a.将权利要求[0142]的实验对象组与所述第二测试化合物接触；

a.按照权利要求[0146]的方法在第一测试化合物或组合物存在的情况下产生第二测试化合物的气味活性谱；

a.接受测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

b.将所述第一气味活性谱与数据库中存储的多个标志性气味活性谱相比较以测定所述第一气味活性谱与所述多个标志性气味活性谱中的每一个所述标志性气味活性谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各个具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

275.权利要求[0149]的方法，其中所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性气味活性谱与所述第一气味活性谱最相似。

276.一种用于将化合物表征为与特定气味相关的计算机实现的方法，其中所述方法包括：a.接受所述化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

b.将多个气味活性谱聚类，所述多个气味活性谱包括所述第一气味活性谱和多个标志性气味活性谱，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各个具有已知气味的已知化合物，并且其中所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

a.使用数据库中存储的多个标志性气味活性谱训练分类器以依据气味分类测试化合物，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；和

b.使用所述分类器处理由权利要求[0146]的方法产生的所述化合物的第一气味活性谱以依据已知的气味分类所述化合物；

其中在使用适当程序化的计算机上执行步骤(a)和(b)。

a.使用所述分类器处理由权利要求[0146]的方法产生的所述化合物的第一气味活性谱以依据已知的气味分类所述化合物，其中根据方法训练所述分类器，所述方法：

b.使用数据库中存储的多个标志性气味活性谱训练分类器以依据气味分类测试化合物，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各具有已知气味的已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

其中在使用适当程序化的计算机上进行处理。

a.接受第一测试化合物的测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生，并且其中所述第一测试化合物具有已知的气味；

b.将所述第一气味活性谱与数据库存储的多个标志性气味活性谱相比较，以测定所述第一气味活性谱与所述多个标志性气味活性谱中的每一个所述标志性气味活性谱谱之间的相似性量度，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

280.权利要求[0161]的方法，其中如果所述相似性量度高于预定的阈值，那么所述一个或多个标志性气味活性谱与所述第一气味活性谱最相似。

a.接受第一测试化合物的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生，并且所述第一测试化合物具有已知的气味；

b.将多个气味活性谱聚类，所述多个气味活性谱包括所述第一气味活性谱和多个标志性气味活性谱，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

a.使用所述分类器处理由权利要求[0146]的方法产生的第一气味活性谱，其中所述第一气味活性谱对应于具有已知气味的第一测试化合物，以将数据库中存储的多个标志性气味活性谱中的一个或多个标志性气味活性谱分类为具有所述已知气味，其中根据方法训练所述分类器，所述方法包括：

b.使用所述多个标志性气味活性谱训练所述分类器将所述一个或多个标志性气味活性谱分类为具有气味，其中每一个所述标志性气味活性谱对应于各已知化合物，并且其中每一个所述标志性气味活性谱由权利要求[0146]的方法产生；

其中在使用适当程序化的计算机上进行处理。

283.与体内目的蛋白质或多个目的蛋白质体外相关的蛋白质或多种蛋白质，其中所述体外相关性预示着体内表达的相应目的蛋白质或多个目的蛋白质的功能或活性；其中所述体外相关性是在体外非生理条件下表达的具有生物活性的蛋白质或多种蛋白质；其中所述体外相关性包括对应于体内目的蛋白质或多种蛋白质的至少一种功能或药理或生理特性；并且其中至少10％的使用所述体外相关性在高通量筛选中鉴定的化合物能够具有体内治疗效应。

284.权利要求[0175]的蛋白质，其中所述体外相关性包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

285.权利要求[0175]的多个蛋白质，其中所述体外相关性的至少一种蛋白质包含至少2、3、4、5或6个亚单位。

286.权利要求[0175]的蛋白质，其中所述体外相关性包括异源多聚体。

287.权利要求[0175]的多个蛋白质，其中所述体外相关性的至少一个蛋白质包括异源多聚体。

288.权利要求[0175]-287的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性的蛋白质或多个蛋白质不包含蛋白质标签。

289.权利要求[0175]-288的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性于在不存在选择压力的情况下培养的细胞中稳定地表达。

290.权利要求[0175]-289的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性在细胞系中表达而不引起细胞毒性。

291.权利要求[0175]-290的任一项的蛋白质或多个蛋白质，其中所述体外相关性于在不内源性表达蛋白质或多种蛋白质的细胞中表达。

292.表达权利要求[0175]-291的任一项的蛋白质或多个蛋白质的细胞。

293.从权利要求292的细胞产生的细胞系。

a.将权利要求292的细胞与与测试化合物接触；和

295.通过权利要求294的方法鉴定的调节剂。

296.权利要求190、192、[0097]、[0100]-[0104]、201-202、[0140]和292的任一项的细胞，其中所述细胞是分化细胞。

297.权利要求190、192、[0097]、[0100]-[0104]、201-202、[0140]和292的任一项的细胞，其中所述细胞是去分化的细胞。

300.一种用于产生再分化的细胞的方法，其包括下列步骤：

a.使权利要求296的干细胞去分化以产生干细胞；和

b.将所述干细胞再分化以产生再分化的细胞。

303.一种用于产生非人生物体的方法，包括下列步骤：

b.使干所述细胞再分化以产生非人生物体。

304.权利要求303的方法，其中所述生物是哺乳动物。

305.权利要求304的方法，其中所述哺乳动物是小鼠。

306.通过权利要求300的方法产生的再分化细胞。

307.通过权利要求303的方法产生的非人生物体。

308.权利要求307的非人生物体，其中所述生物是哺乳动物。

309.权利要求308的非人生物体，其中所述哺乳动物是小鼠。