JP2016523512A - 苦味を修飾する化合物を特定するアッセイ - Google Patents

苦味を修飾する化合物を特定するアッセイ Download PDF

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Abstract

本発明は、本明細書に開示される、本出願者らによるＴＡＳ２Ｒ受容体ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４６およびＴＡＳ２Ｒ６０に対するアゴニストの発見に基づくものである。上記受容体にアゴニストを割り当てることによって、苦味を修飾する化合物を特定するアッセイが可能になる。例えば、本発明は、これらのアゴニストによる苦味を抑制する化合物を特定する方法を提供する。本発明はほかにも、これらのアゴニストによる苦味を選択的に抑制する化合物を特定する方法を提供する。本発明はさらに、これらのアゴニストによる苦味を模倣する化合物を特定する方法を提供する。本発明はこのほか、これらのアゴニストによる苦味を増強する化合物を特定する方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は苦味修飾物質を特定するアッセイに関する。
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年４月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／８１５，５９２号の優先権を主張するものである。優先出願の開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本願に付随する配列表は紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は００２２９８−００３６−ＷＯ１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔである。このテキストファイルは大きさが１１１，４１０バイトであり、２０１４年４月２３日に作成されたものである。
味覚、例えばヒトの味覚は少なくとも５種類の従来の味、すなわち甘味、酸味、塩味、苦味およびうま味（美味しい味）を感知することができる。植物、食物、食物成分および栄養素を含めた多くの栄養物には苦味物質が含まれ、かつ／または苦味がある。さらに、健康状態を維持または改善するのに重要な多くの医薬物質には苦味物質が含まれ、かつ／または苦味がある。コーヒー、ビールおよびダークチョコレートを含めた特定の食品および消費者製品には望ましい苦味があるが、多くの状況では、消費者はこのような苦味を嫌う。例えば、多くの消費者が特定の苦味物質および／または苦味の知覚を嫌って、望ましくない苦味物質または苦味のある食物または医薬品を避け、望ましくない苦味物質のレベルが軽減されている食物および医薬品や、苦味が少ないか苦みが全くない食物および医薬品を好む。このような望ましくない苦味物質を含み、かつ／望ましくない苦味がある製品に対する嫌忌は、口腔および／または消化管に存在する苦味受容体の活性化が仲介する苦味物質および／または苦味の知覚が原因であると考えられる。多くの場合、消費者が苦味物質および／または苦味を嫌うことから、苦味物質を含み、かつ／または苦味のある栄養素または保存剤を所望のレベルで使用できないため、食物の栄養価および安全性の向上が妨げられたり、阻止されたりする。ほかにも、一部の医薬品の苦味物質または苦味に対する嫌悪または嫌忌が、その医薬品を使用するために処方されたレジメンの順守に悪影響を及ぼす。
例えば、食品の生産に使用されるいくつかの添加剤、保存剤、乳化剤および食料品には苦味物質が含まれ、かつ／または苦味がある。このような添加剤、保存剤、乳化剤および食料品は食品の味に影響を及ぼし得る一方で、食品の保存期限、栄養価または食感の向上に重要なものでもある。例えば、高血圧および心血管疾患が増加する傾向にあるのは、西洋型食餌のナトリウム摂取量が多いことに一部原因があるとされてきた。したがって、塩化ナトリウムを塩味のある別の化合物で代用するのが望ましい。最もよく用いられている塩化ナトリウムの代用品は塩化カリウムであるが、一部の者には塩味のほかに苦味があると感じられる。塩化カリウムの苦味によって、苦味に感受性の高い者に望ましくない苦味を引き起こさずに食品中の塩化ナトリウムに代えて塩化カリウムを使用できる範囲が限られてくる。
また別のよく用いられる食品添加物の乳酸ナトリウムには、幅広い抗菌作用に加え、腐敗および病原菌の増殖を抑制する効果があり、食品（例えば、肉製品および家禽製品）の保存期限を延ばし、安全性を増大させるのによく用いられる。しかし、乳酸ナトリウムはそのナトリウム含有量のため、保存剤として望ましくない場合がある。乳酸ナトリウムの代わりに、これと同程度の抗菌性がある乳酸カリウムが用いられてきた。しかし、乳酸カリウムを用いても苦味が生じるため、望ましくない苦味を引き起こさずに食品中の乳酸ナトリウムに代えて乳酸カリウムを使用できる範囲が限られてくる。
さらに、肥満および糖尿病の発生率が上昇しているのは、食事の多くが糖摂取量の多いものであることに一部原因があるとされてきた。したがって、糖を甘味のある別の化合物で代用するのが望ましい。食品中の糖分を減らすのに使用し得る人工糖および天然糖による代用品を用いると苦味が生じることが多く、この場合も同じく、好ましくない苦味を引き起こさずに食品中の糖に代えてこれらの糖を使用できる範囲が限られてくる。例えば、よく用いられている糖の代用品にアセスルファムＫがあり、これにも甘味のほかに苦味がある。
理論に制限されるものではないが、苦味、甘味および旨味の味物質および化合物が通常、Ｇタンパク質共役受容体を介して味応答を誘発するのに対して、塩味および酸味の味物質および化合物は通常、イオンチャネルを介して味応答を誘発するとする仮説が提唱されている。苦味受容体は、苦味物質に応答して細胞内カルシウム濃度の変化を誘導するＧタンパク質共役受容体のＴＡＳ２Ｒ（Ｔ２Ｒとも呼ばれる）ファミリーに属する。ＴＡＳ２Ｒ受容体は味覚特異的Ｇタンパク質、ガストデューシンを介して作用する。ＴＡＳ２Ｒファミリーには少なくとも２５の異なるメンバーが存在し、苦味の知覚が複数の異なる味物質受容体の相互作用を含む複雑なものであることが示唆される。ＴＡＳ２Ｒメンバーの一部、例えばＴＡＳ２Ｒ６０は、リガンドが同定されていないオーファン受容体である。口腔および／または消化管の苦味受容体の活性化および／またはシグナル伝達を修飾することができる化合物には、消費者が苦味物質または苦味のレベルが高くなったことを知覚することによってこのような製品を嫌うことなく、食品および医薬品に苦味物質または苦味のある物質を所望のレベルで使用することを可能にする効果があると考えられる。いくつかの場合には、苦味受容体および苦味の遮断物質または修飾物質により、口腔および／または消化管に存在する苦味受容体および／または味覚伝達シグナル伝達機構を介した苦味物質および／または苦味の知覚を軽減し得る。
調理および製薬では従来、甘味剤および塩を含めた他の味物質を用いて苦味をマスクしていた。しかし、この方法は、場合によっては食品の他の味／風味／印象（例えば、苦味がない、または望ましい苦味がある）を変化させたり、マスクしたり、阻害したりすることがあるため、望ましくない、または不十分なものである。さらに、この方法でこのような食品または医薬品中に存在する苦味を完全にマスクすることができたことはほとんどない。このような理由から、マスキング剤の代わりに、またはこれに加えて苦味を軽減する化合物が好ましい。
したがって、苦味物質または苦味の知覚を除去する、修飾する、または軽減させるか、口腔および／または消化管の苦味受容体のこれに対応する活性化を低下させるために苦味物質を含むか苦味のある食品、消費者製品および医薬品に添加し得る化合物を特定するアッセイを提供するのが望ましい。同様に、他の苦味受容体を活性化しない化合物（すなわち、オフターゲット作用のある化合物）を特定するのが望ましい。
本発明は、本明細書に開示される、本出願者らによるＴＡＳ２Ｒ受容体ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４６およびＴＡＳ２Ｒ６０に対するアゴニストの発見に基づくものである。上記受容体にアゴニストを割り当てることによって、アゴニストに応答する苦味などの味を修飾する化合物を特定するアッセイが可能になる。例えば、本発明は、これらのアゴニストによる苦味を抑制する化合物を特定する方法を提供する。本発明はほかにも、これらのアゴニストによる苦味を選択的に抑制する化合物を特定する方法を提供する。本発明はさらに、これらのアゴニストによる苦味を模倣する化合物を特定する方法を提供する。本発明はこのほか、これらのアゴニストによる苦味を増強する化合物を特定する方法を提供する。
苦味を抑制する化合物を特定する方法
本発明の１つの態様は、カリウム塩による苦味を抑制する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞および第二の細胞を準備し、第一の細胞および第二の細胞がそれぞれ１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現し、第一の細胞と第二の細胞が同じ１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現すること；第一の細胞と、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；第二の細胞と、被験化合物および味物質とを接触させること；第一細胞および第二の細胞の苦味受容体活性化をアッセイすること；ならびに第一の細胞の苦味受容体活性化と、第二の細胞の苦味受容体活性化とを比較することを含み、第二の細胞の苦味受容体活性が第一の細胞の苦味受容体活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味の抑制物質である。カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択され得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞を準備すること；細胞と、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；苦味受容体活性化の第一のアッセイを実施すること；細胞を洗浄すること；細胞と、被験化合物および味物質とを接触させること；苦味受容体活性化の第二のアッセイを実施すること；ならびに第一のアッセイの苦味受容体活性化と、第二のアッセイの苦味受容体活性化とを比較することを含み、第二のアッセイの苦味受容体活性が第一のアッセイの苦味受容体活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味の抑制物質である。
本発明の別の態様は、カリウムイオンによる苦味を抑制する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞および第二の細胞を準備し、第一の細胞および第二の細胞がそれぞれ１つまたは複数のカリウムイオン応答性苦味受容体を発現し、第一の細胞と第二の細胞が同じ１つまたは複数のカリウムイオン応答性苦味受容体を発現すること；第一の細胞と、１つまたは複数のカリウムイオン応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；第二の細胞と、被験化合物および味物質とを接触させること；第一の細胞および第二の細胞の苦味受容体活性化をアッセイすること；ならびに第一の細胞の苦味受容体活性化と、第二の細胞の苦味受容体活性化とを比較することを含み、第二の細胞の苦味受容体活性が第一の細胞の苦味受容体活性よりも低い場合、被験化合物はカリウムイオンによる苦味の抑制物質である。カリウムイオン応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４から選択され得る。
いくつかの実施形態では、味物質はカリウム含有味物質または普遍的苦味化合物である。カリウム含有味物質は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。任意選択で、普遍的苦味化合物は安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである。
いくつかの実施形態では、味物質は、ＫＣl、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない。このような実施形態では、カリウム含有味物質は、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。
苦味を選択的に抑制する化合物を特定する方法
本発明の１つの態様は、カリウム塩による苦味を選択的に抑制する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルであって、各パネルが１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系を含み、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、各パネルが同じ細胞系を含む、パネルを準備すること；第一のパネルの各細胞系と、カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも２つを活性化する味物質とを接触させること；第二のパネルの各細胞系と、被験化合物および味物質とを接触させること；第一のパネルおよび第二のパネルの各細胞系の苦味受容体活性化をアッセイすること；ならびに第一のパネルの各細胞系の苦味受容体活性化と、第二のパネルの対応する細胞系の苦味受容体活性化とを比較することを含み、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系のうち少なくとも２つの細胞系について、第二のパネルの方が第一のパネルよりも苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味の選択的抑制物質である。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系のうち少なくとも３つの細胞系について、第二のパネルの方が苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制する。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系のうち少なくとも４つの細胞系について、第二のパネルの方が苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制する。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系のうち少なくとも５つの細胞系について、第二のパネルの方が苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制する。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系のうち少なくとも６つの細胞系について、第二のパネルの方が苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制する。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系のうち少なくとも７つの細胞系について、第二のパネルの方が苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制する。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する各細胞系について、第二のパネルの方が苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制する。いくつかの実施形態では、第一のパネルおよび第二のパネルの各細胞系は、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体は各パネルの少なくとも１つの細胞系に発現する。いくつかの実施形態では、第一のパネルの各細胞系を苦味受容体活性化のアッセイの後に洗浄しての第二の細胞系パネルとする。カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択され得る。
いくつかの実施形態では、味物質はカリウム含有味物質または普遍的苦味化合物である。カリウム含有味物質は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。任意選択で、普遍的苦味化合物は安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである。
いくつかの実施形態では、味物質は、ＫＣl、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない。このような実施形態では、カリウム含有味物質は、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。
苦味を模倣する化合物を特定する方法
本発明の１つの態様は、カリウム塩による苦味を模倣する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルであって、各パネルが１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系を含み、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、各パネルが同じ細胞系を含む、パネルを準備すること；第一のパネルの各細胞系と、ネガティブ対照とを接触させること；第二のパネルの各細胞系と、被験化合物とを接触させること；第一のパネルおよび第二のパネルの細胞系の苦味受容体活性化をアッセイすること；ならびに第一のパネルの各細胞系の苦味受容体活性化と、第二のパネルの対応する細胞系の苦味受容体活性化とを比較することを含み、被験化合物が第二のパネルと第一のパネルとで同じカリウム塩応答性苦味受容体の活性を誘導する場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を模倣する。いくつかの実施形態では、第一のパネルおよび第二のパネルの各細胞系は、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体は各パネルの少なくとも１つの細胞系に発現する。いくつかの実施形態では、第一のパネルの各細胞系を苦味受容体活性化のアッセイの後に洗浄して第二の細胞系パネルとする。いくつかの実施形態では、ネガティブ対照は、被験化合物を添加する前のアッセイ緩衝液である。カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択され得る。
苦味を増強する化合物を特定する方法
本発明の１つの態様は、カリウム塩による苦味を増強する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、それぞれ１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第一の細胞および第二の細胞を準備すること；第一の細胞と、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；第二の細胞と、被験化合物および味物質とを接触させること；第一の細胞および第二の細胞の苦味受容体活性化をアッセイすること；ならびに第一の細胞の苦味受容体活性化と、第二の細胞の苦味受容体活性化とを比較し、第二の細胞の苦味受容体活性の方が第一の細胞の苦味受容体活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味の増強物質であることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞を準備すること；細胞と、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；苦味受容体活性化の第一のアッセイを実施すること；細胞を洗浄すること；細胞と、被験化合物および味物質とを接触させること；苦味受容体活性化の第二のアッセイを実施すること；ならびに第一のアッセイの苦味受容体活性化と、第二のアッセイの苦味受容体活性化とを比較することを含み、第二のアッセイの苦味受容体活性の方が第一のアッセイの苦味受容体活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味の増強物質である。カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択され得る。
いくつかの実施形態では、味物質はカリウム含有味物質または普遍的苦味化合物である。カリウム含有味物質は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。任意選択で、普遍的苦味化合物は安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである。
いくつかの実施形態では、味物質は、ＫＣl、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない。このような実施形態では、カリウム含有味物質は、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。
上記のいずれかの方法では、カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも１つが任意選択で、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される。
上記のいずれかの方法では、苦味受容体がＧタンパク質と複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質は、Ｇｑタンパク質、αトランスデューシンまたはαガストデューシンである。任意選択で、Ｇｑタンパク質はＧα１５タンパク質である。
上記のいずれかの方法では、細胞内カルシウム濃度を測定することによって苦味受容体活性を決定し得る。いくつかの実施形態では、Ｆｌｕｏ−４またはＣａｌｃｉｕｍ−３色素などのカルシウム感受性蛍光色素を用いて細胞内カルシウム濃度を決定する。
上記のいずれかの方法では、方法の細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系に存在する。任意選択で、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルに存在する。
上記のいずれかの方法では、カリウム塩は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムまたは硫酸カリウムであり得る。
カリウム塩がＫＣlである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、ここではＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９の少なくとも一方が使用される。
カリウム塩がアセスルファムＫである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択され、ここではＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９の少なくとも一方が使用される。
カリウム塩が乳酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４６およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され得る。
カリウム塩が安息香酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され得る。
カリウム塩がソルビン酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され得る。
カリウム塩が硝酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０、任意選択でＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択され得る。
カリウム塩がリン酸カリウム（二塩基性）である場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０、任意選択でＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択され得る。
カリウム塩がグルコン酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択され得る。
カリウム塩が酢酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され得る。
カリウム塩が硫酸カリウムである場合、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され得る。
本明細書のいずれかの方法および実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ３８はＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８であり得る。
本発明の特定の実施形態を以下の番号を付した項に記載する：
１．カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法であって、
ａ）第一の細胞および第二の細胞を準備し、
各細胞が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現し、かつ
各細胞が同じ１つまたは複数の苦味受容体を発現することと；
ｂ）前記第一の細胞と、味物質とを接触させ、
味物質が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化することと；
ｃ）前記第二の細胞と、被験化合物および味物質とを接触させることと；
ｄ）前記第一の細胞および第二の細胞の苦味受容体活性化をアッセイすることと；
ｅ）前記第一の細胞の苦味受容体活性化と、前記第二の細胞の苦味受容体活性化とを比較することと
を含み、
カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、
前記第二の細胞の苦味受容体活性が前記第一の細胞の苦味受容体活性と異なる場合、被験化合物がカリウム塩による苦味の修飾物質である、
方法。
２．第一の細胞を苦味受容体活性のアッセイの後に洗浄して第二の細胞とする、項１に記載の方法。
３．カリウム塩による苦味を選択的に修飾する化合物を特定する方法であって、
ａ）第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルを準備し、
各細胞系が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現し、
各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、かつ
第一のパネルと第二のパネルが同じ細胞系を含むことと；
ｂ）第一のパネルの各細胞系と、味物質とを接触させ、
味物質がカリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも２つの受容体を活性化することと；
ｃ）第二のパネルの各細胞系と、被験化合物および味物質とを接触させることと；
ｄ）各細胞系の苦味受容体活性化をアッセイすることと
を含み、
カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、
カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも２つの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる場合、被験化合物がカリウム塩による苦味の選択的修飾物質である、
方法。
４．カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも３つの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる、項３に記載の方法。
５．カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも４つの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる、項３に記載の方法。
６．カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも５つの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる、項３に記載の方法。
７．カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも６つの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる、項３に記載の方法。
８．カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも７つの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる、項３に記載の方法。
９．カリウム塩応答性苦味受容体それぞれの受容体の苦味受容体活性が、第二のパネルと第一のパネルとを比較して異なる、項３に記載の方法。
１０．各パネルが、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択される苦味受容体を発現する細胞系を含み、
各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、
第一のパネルと第二のパネルが同じ細胞系を含む、
項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
１１．第一のパネルの細胞系を苦味受容体活性のアッセイの後に洗浄して第二の細胞系パネルとする、項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法であって、
ａ）細胞を準備し、
細胞が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現することと；
ｂ）前記細胞と、味物質とを接触させ、
味物質が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化することと；
ｃ）前記細胞の苦味受容体活性化をアッセイすることと；
ｄ）前記細胞を洗浄することと；
ｅ）前記細胞と、被験化合物および味物質とを接触させることと；
ｆ）前記細胞の苦味受容体活性化をアッセイすることと；
ｇ）段階（ｃ）の前記細胞の苦味受容体活性化と、段階（ｆ）の前記細胞の苦味受容体活性化とを比較することと
を含み、
カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、
段階（ｆ）の苦味受容体活性が段階（ｃ）の苦味受容体活性と異なる場合、被験化合物がカリウム塩による苦味の修飾物質である、
方法。
１３．被験化合物と味物質の存在下での苦味受容体活性が、被験化合物無しでの味物質の存在下での苦味受容体活性よりも低い場合、被験化合物がカリウム塩またはカリウムによる苦味の抑制物質である、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．被験化合物と味物質の存在下での苦味受容体活性が、被験化合物無しでの味物質の存在下での苦味受容体活性よりも高い場合、被験化合物がカリウム塩またはカリウムによる苦味の増強物質である、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１５．カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも１つの受容体が、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される、項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．味物質が、カリウム含有味物質または普遍的苦味化合物である、項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．カリウム含有味物質が、ＫＣｌ、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される、項１６に記載の方法。
１８．味物質が、ＫＣｌ、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない、項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
１９．カリウム含有味物質が、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される、項１８に記載の方法。
２０．苦味受容体が、Ｇタンパク質と複合体を形成している、項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
２１．前記Ｇタンパク質が、Ｇｑタンパク質、αトランスデューシンまたはαガストデューシンである、項２０に記載の方法。
２２．Ｇｑタンパク質がＧα１５タンパク質である、項２１に記載の方法。
２３．苦味受容体活性が、細胞内カルシウム濃度を測定することによって決定される、項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．カルシウム感受性蛍光色素を用いて細胞内カルシウムの濃度を決定する、項２３に記載の方法。
２５．カルシウム感受性蛍光色素がＦｌｕｏ−４またはＣａｌｃｉｕｍ−３色素である、項２４に記載の方法。
２６．前記第一の細胞および第二の細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系に存在する、項１〜２および項１１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．前記第一の細胞および第二の細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルに存在する、項１〜２および項１１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
２８．普遍的苦味化合物が、安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである、項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．カリウム塩がＫＣｌであり、カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される、項１〜１７および項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、項２９に記載の方法。
３１．カリウム塩がアセスルファムＫであり、カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される、項１〜１７および項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３２．ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、項３１に記載の方法。
３３．カリウム塩が乳酸カリウムであり、カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４６およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される、項１〜１７および項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３４．カリウム塩が安息香酸カリウムである、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３５．カリウム塩がソルビン酸カリウムである、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３６．カリウム塩が硝酸カリウムである、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３７．カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、項３６に記載の方法。
３８．カリウム塩がリン酸カリウム（二塩基性）である、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３９．カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される項３８に記載の方法。
４０．カリウム塩がグルコン酸カリウムであり、カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
４１．カリウム塩が酢酸カリウムであり、カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
４２．カリウム塩が硫酸カリウムである、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
４３．カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
４４．カリウム塩応答性苦味受容体をさらに含み、第二のカリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ６０である、項４３に記載の方法。
４５．カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
４６．ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容をさらに含む、項４５に記載の方法。
４７．カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
４８．ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、項４７に記載の方法。
４９．ＴＡＳ２Ｒ３８がＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８である、項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
様々なカリウム塩に対するＴＡＳ２Ｒ受容体の応答性をまとめた図である。 ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９がＫＣｌ（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この２つの受容体がＫＣｌの検出に適合していることが示唆される。ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０はＫＣｌに強い機能的応答を示すことが既に示されていた。参照により本明細書に組み込まれる未公開の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／６１４００号を参照されたい。 ＫＣｌ応答性受容体を発現する細胞系のＫＣｌ（丸）または溶媒（四角）の添加に応答したＫＣｌシグナル伝達の用量反応曲線を示す図である。Ｙ軸は、最も応答性が高い細胞系に対して相対的な機能的応答のレベル（蛍光強度（ＲＦＵ））を表す。Ｘ軸はｌｏｇＫＣｌ濃度（Ｍ）を表す。 ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９がアセスルファムＫ（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この２つの受容体がアセスルファムＫの検出に適合していることが示唆される。ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６およびＴＡＳ２Ｒ４４はアセスルファムＫに強い機能的応答を示すことが既に示されていた。参照により本明細書に組み込まれる未公開の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／６１４００号を参照されたい。 アセスルファムＫ応答性受容体を発現する細胞系のアセスルファムＫ（丸）または溶媒（四角）の添加に応答したアセスルファムＫシグナル伝達の用量反応曲線を示す図である。Ｙ軸は、最も応答性が高い細胞系に対して相対的な機能的応答のレベル（蛍光強度（ＲＦＵ））を表す。Ｘ軸はｌｏｇアセスルファムＫ濃度（Ｍ）を表す。 ８つの受容体が安息香酸カリウム（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この８つの受容体が安息香酸カリウムの検出に適合していることが示唆される。 安息香酸カリウム応答性受容体を発現する細胞系の安息香酸カリウム（丸）または溶媒（四角）の添加に応答した安息香酸カリウムシグナル伝達の用量反応曲線を示す図である。Ｙ軸は、最も応答性が高い細胞系に対して相対的な機能的応答のレベル（蛍光強度（ＲＦＵ））を表す。Ｘ軸はｌｏｇ安息香酸カリウム濃度（Ｍ）を表す。 ６つの受容体が酢酸カリウム（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この６つの受容体が酢酸カリウムの検出に適合していることが示唆される。 酢酸カリウム応答性受容体を発現する細胞系の酢酸カリウム（丸）または溶媒（四角）の添加に応答した酢酸カリウムシグナル伝達の用量反応曲線を示す図である。Ｙ軸は、最も応答性が高い細胞系に対して相対的な機能的応答のレベル（蛍光強度（ＲＦＵ））を表す。Ｘ軸はｌｏｇ酢酸カリウム濃度（Ｍ）を表す。 ８つの受容体がソルビン酸カリウム（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この８つの受容体がソルビン酸カリウムの検出に適合していることが示唆される。 ８つの受容体が硝酸カリウム（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この８つの受容体が硝酸カリウムの検出に適合していることが示唆される。ＴＡＳ２Ｒ６０の結果は予備試験のものである。 ７つの受容体がグルコン酸カリウム（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この７つの受容体がグルコン酸カリウムの検出に適合していることが示唆される。 ８つの受容体がリン酸カリウム（二塩基性）（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この８つの受容体がリン酸カリウム（二塩基性）の検出に適合していることが示唆される。ＴＡＳ２Ｒ６０の結果は予備試験のものである。 ８つの受容体が硫酸カリウム（２０ｍＭ）に強い機能的応答を示したことを示す図であり、この８つの受容体が硫酸カリウム（二塩基性）の検出に適合していることが示唆される。
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される本発明が十全に理解されるよう以下に詳細な説明を記載する。
本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、別途定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。以下に適切な方法および材料を記載するが、本発明を実施または検証するに当たっては、本明細書に記載されるものに類似するかこれと同等の方法および材料を用いることができる。材料、方法および実施例は単に例示的なものであって、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される刊行物、特許をはじめとする文書はいずれも、あらゆる目的においてその全体が参照により組み込まれる。
本明細書全体を通じて、「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形）という単語は、記載される整数または整数のグループを包含するとともに、他のいずれの整数または整数のグループも排除しないことを意味することが理解される。文脈により別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含するものとする。「〜以上」と「少なくとも〜」という用語は、本明細書では互換的に使用される。例えば、「２つ以上」と「少なくとも２つ」は互換的に使用され得る。同様に、「〜よりも低い」または「〜よりも高い」という用語は、本明細書では互換的に使用される。例えば、「ＡはＢよりも低い」と「ＢはＡよりも高い」は互換的に使用され得る。
「アゴニスト」、「増強物質」または「活性化物質」という用語は、苦味受容体活性を増大させることにより、苦味受容体の細胞内シグナル伝達経路の一部をなす細胞内分子の量もしくは分布または酵素の活性を変化させる化合物または物質を指す。細胞内分子の例としては、特に限定されないが、遊離カルシウム、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、イノシトール一リン酸、イノシトール二リン酸、イノシトール三リン酸が挙げられる。酵素の例としては、特に限定されないが、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼが挙げられる。
「アンタゴニスト」、「阻害物質」または「遮断物質」という用語は、苦味受容体活性を低下させることにより、苦味受容体の細胞内シグナル伝達経路の一部をなす細胞内分子の量もしくは分布または酵素の活性を変化させる化合物または物質を指す。細胞内分子の例としては、特に限定されないが、遊離カルシウム、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、イノシトール一リン酸、イノシトール二リン酸、イノシトール三リン酸が挙げられる。酵素の例としては、特に限定されないが、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼが挙げられる。本明細書で使用される阻害物質、アンタゴニストまたは遮断物質は、苦味受容体の全小集団または特定の小集団に作用し得る。阻害物質、アンタゴニストまたは遮断物質は、ＴＡＳ２Ｒ受容体の活性を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％低下させ得る。
「人工甘味剤」および「糖代替物」という用語は、甘味を付与するが糖よりも熱量エネルギーの少ない食品添加物を指す。いくつかの場合には、「人工甘味剤」または「糖代替物」の熱量エネルギーは無視できる程度のものである。
本明細書で使用される「苦い」または「苦味」という用語は、苦味物質を感知した後に生じる知覚または味覚を指す。以下のような属性が苦味一因となり得る：渋い、苦くて渋い、金属のような味がする、苦くて金属のような味がする、特に限定されないが冷凍焼けの味およびボール紙のような味を含めた異味、後味および望ましくない味がする、ならびに／あるいはこれらの任意の組合せ。当該技術分野では、「異味」という用語は多くの場合、「苦味」と同義であることが留意される。理論に制限されるわけではないが、この苦味の多様性は、苦味受容体が多数存在し、これらの受容体が異なる苦味物質を感知することを反映すると考えられる。本明細書で使用される苦味にはこのほか、苦味物質による苦味受容体の活性化が含まれる。本明細書で使用される苦味にはほかにも、苦味物質による苦味受容体の活性化とこれに続く下流シグナル伝達が含まれる。本明細書で使用される苦味にはこのほか、苦味物質による刺激後のシグナル伝達経路の活性化が含まれる。本明細書で使用される苦味にはさらに、苦味受容体による苦味物質の感知後にシグナル伝達によって生じる知覚が含まれる。本明細書で使用される苦味にはさらに、苦味受容体と苦味物質との接触後にシグナル伝達によって生じる知覚が含まれる。苦味は脳で知覚され得る。
「苦味受容体」という用語は、苦味物質が結合することができる受容体、通常は細胞表面受容体を指す。苦味受容体は口腔および／または口腔外組織、例えば、胃、腸および大腸を含めた消化管全体に存在する味細胞様のホルモン産生細胞に存在し得る。苦味受容体はこのほか、特に限定されないが、細胞ベースのアッセイまたは結合アッセイを含めたアッセイなどではｉｎ ｖｉｔｒｏで存在し得る。
「苦味物質」、「苦味リガンド」または「苦味化合物」という用語は、苦味受容体を活性化するか、これによって感知することができ、かつ／または対象に苦味の知覚をもたらす化合物を指す。「苦味物質」はこのほか、組み合わさって苦味受容体を活性化するか、これによって感知することができ、かつ／または対象に苦味の知覚をもたらす多様な化合物を指す。「苦味物質」はさらに、対象が摂取したときに酵素による修飾を受けて、苦味受容体を活性化するか、これによって感知することができ、かつ／または対象に苦味の知覚をもたらす化合物を指す。苦味の知覚には個人差がみられる得るため、「苦味物質」を、他の者が知覚する種類の苦味とは異なる種類の苦味をもたらす化合物とする可能性がある。苦味物質という用語はほかにも、苦味をもたらす化合物を指す。
「細胞系」または「クローン細胞系」という用語は、単一の起源細胞から生じた子孫のみからなる細胞集団を指す。本明細書で使用される細胞系は、細胞培養によりｉｎ ｖｉｔｒｏで維持され、一定分量を凍結させてクローン細胞のバンクを確立することができる。
「消費者製品」という用語は、対象が個人的に使用および／または消費するための健康および美容製品を指す。消費者製品は、特に限定されないが、液体、固体、半固体、錠剤、カプセル、トローチ、細片、粉末、ゲル、ガム、パスタ、スラリー、シロップ、エアロゾルおよびスプレーを含めた任意の形態で存在し得る。消費者製品の非限定的な例としては、栄養補助食品、栄養補給剤、リップスティック、リップバーム、石鹸、シャンプー、ガム、接着剤（例えば、歯科用接着剤）、練り歯磨き、経口鎮痛剤、口臭清涼剤、口腔洗浄剤、歯の漂白剤およびその他の歯磨き剤が挙げられる。
「接触（させること）」という用語は、アンタゴニスト、アゴニスト、修飾物質、味物質または被験化合物と、ポリペプチド（例えば、ＴＡＳ２Ｒ受容体）またはポリペプチドを発現する宿主細胞との間の任意の相互作用を指し、この相互作用では、任意の少なくとも２つの成分が液相中、例えば溶液中または懸濁液中で互いに独立し得るか、例えば、実質的に平面状の表面の形態または粒子、真珠などの形態の固相と結合し得る。ポリペプチドは、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５またはＴＡＳ２Ｒ６０であり得る。同様に、宿主細胞は、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５、ＴＡＳ２Ｒ６０またはその組合せを発現し得る。
「食事」という用語は、対象によって消費される食品および／または飲料品をまとめて指す。対象の「食事」にはほかにも、対象が摂取する任意の消費者製品または医薬組成物が含まれる。
「食用組成物」という用語は、通常は口腔を介した消費に適した組成物を指す（吸入などの非経口手段を介して消費される場合もある）。食用組成物は、特に限定されないが、液体、固体、半固体、錠剤、トローチ、粉末、ゲル、ガム、パスタ、スラリー、シロップ、エアロゾルおよびスプレーを含めた任意の形態で存在し得る。本明細書で使用される食用組成物には、食品、医薬組成物および消費者製品が含まれる。食用組成物という用語はほかにも、例えば、健康補助食品および栄養補給剤を指す。本明細書で使用される食用組成物にはこのほか、歯科用の治療剤、充填剤、充填材料、鋳型および研磨剤などの歯科専門家用製品を含めた、口腔内に入れても嚥下しない組成物が含まれる。「食べられる」という用語は同様の組成物を指し、一般に「食用」という用語の同義語として使用される。
「有効量」という用語は、所望の特性または結果をもたらすのに十分な量を指す。例えば、本発明のアッセイに用いる化合物の有効量とは、苦味物質を原因とする苦味の知覚を軽減することができる量のことである。通常、本発明のアッセイに用いる化合物の有効量とは、苦味物質による苦味受容体の活性化を阻害することができる量のことである。あるいは、本発明のアッセイに用いる化合物の有効量とは、別の苦味物質の非存在下で苦味受容体を活性化することができる量のことである。
「風味修飾物質」という用語は、食品などの食用組成物に添加したとき、食用組成物中に存在する風味（例えば、甘味、塩味、うま味、酸味または苦味）を修飾する（例えば、風味の知覚をマスクする、除去する、低下させる、軽減する、または増強する）化合物または化合物の混合物を指す。
「機能的苦味受容体」という語句は、操作しなくても苦味受容体を通常に発現する細胞の苦味受容体と実質的に同じ方法で既知の活性化物質または既知の阻害物質に応答する苦味受容体を指す。例えば、生理学的活性および薬理学的応答によって、苦味受容体の挙動を決定することができる。生理学的活性としては、特に限定されないが、苦味の感覚が挙げられる。薬理学的応答としては、特に限定されないが、苦味受容体が修飾物質と接触したときにみられる、苦味受容体の細胞内シグナル伝達経路の一部をなす細胞内分子の量もしくは分布または酵素の活性の変化が挙げられる。例えば、薬理学的応答としては、苦味受容体が活性化されたときの細胞内遊離カルシウムの増加または苦味受容体が遮断されたときの細胞内遊離カルシウムの減少を挙げ得る。
「修飾物質」という用語は、苦味受容体の構造、コンホメーション、生化学的特性、生物物理学的特性または機能性を正または負に変化させる化合物または物質を指す。修飾物質は、部分アゴニストまたはアンタゴニスト、選択的アゴニストまたはアンタゴニストおよび逆アゴニストを含めた苦味受容体アゴニスト（増強物質または活性化物質）またはアンタゴニスト（阻害物質または遮断物質）であり得、またアロステリック修飾物質であり得る。ある物質または化合物の修飾活性が、様々な条件または濃度、様々な形態、例えば天然型と変異型の苦味受容体および苦味受容体の様々な天然の対立遺伝子変異体（例えば、多型性によるもの）に応じて変化する場合、その物質または化合物は修飾物質である。本明細書で使用される修飾物質は、苦味受容体の活性、別の調節化合物に対する苦味受容体の応答または苦味受容体の選択性に影響を及ぼし得る。修飾物質はほかにも、別の修飾物質が苦味受容体の機能に影響を及ぼす能力を変化させ得る。修飾物質は、全小集団または特定の小集団に作用し得る。修飾物質としては、特に限定されないが、増強物質、活性化物質、阻害物質、アゴニスト、アンタゴニストおよび遮断物質が挙げられる。
本明細書で使用される「天然」タンパク質（例えば、苦味受容体）は、異種アミノ酸配列が付加も挿入もされていないタンパク質を指す。例えば、本明細書で使用される「天然苦味受容体」には、ポリペプチドレベルで発現するタグ配列を持たない苦味受容体が含まれる。本出願者らは、苦味受容体を天然苦味受容体と言うことによって、アミノ酸の置換、変異または欠失を含む苦味受容体変異体も、天然の受容体タンパク質または既知の受容体タンパク質のフラグメントまたはスプライス型である変異体も除外する意図はない。
「オフターゲット効果」という用語は、標的外の味覚受容体に対する目的外の修飾、活性化または阻害を指す。例えば、苦味修飾物質が苦味受容体の特定の小集団の活性を修飾することを目的とするものであると同時に、他の苦味受容体または甘味受容体およびうま味受容体などの他の味覚受容体の活性を修飾する場合、その苦味修飾物質はオフターゲット効果を示す。同様に、味覚修飾物質が苦味物質による苦味を修飾することを目的とする場合、それが別の味物質による味覚を修飾するか、それ自体が味覚をもたらせば、その味覚修飾物質はオフターゲット効果を示す。苦味修飾物質のオフターゲット効果によって、塩味、甘味、酸味、うま味および／またはその他の苦味の活性化または抑制が生じ得る。
「百万分率」および「ｐｐｍ」という用語は、食品業界で低い溶液濃度を指すのに使用される。例えば、溶質が溶媒１０００ｍｌ中１グラム存在すれば、濃度は１０００ｐｐｍであり、溶質が溶媒１０００ｍｌ中１０００分の１グラム（０．００１ｇ）存在すれば、濃度は１ｐｐｍである。したがって、１リットル当たり１ミリグラムの濃度（すなわち、１ｍｇ／Ｌ）が１ｐｐｍに相当する。
アミノ酸および／または核酸配列に関連する「〜パーセント同一である」または「パーセント同一性」という語句は、少なくとも２つの異なる配列間の類似性を指す。このパーセント同一性は標準的なアライメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌらによって記載されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３ ４１０）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズム（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４ ４５３）；またはＭｅｙｅｒｓらのアルゴリズム（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１ １７）によって決定することができる。パラメータの組は、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｕｍ ６２スコア行列であり得る。このほか、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）にＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性は通常、ほぼ同じ長さの配列を比較することによって計算され得る。保存的アミノ酸置換を含めた様々な置換、欠失をはじめとする修飾に割り当てられた類似性の尺度を用いたタンパク質解析ソフトウェアがほぼ同じ配列にマッチする。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）には、デフォルトパラメータとともに用いて異なる生物種の相同ポリペプチドなどの近縁ポリペプチドの間または野生型タンパク質とその変異体との間の配列同一性を決定することが可能な「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムが含まれている。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照されたい。ほかにも、ＦＡＳＴＡにデフォルトパラメータまたは推奨パラメータを用いてポリペプチド配列を比較することができる。ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１．ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）のプログラムでは、問い合わせ配列と検索配列との間で最も重複する領域のアライメントおよびパーセント同一性が得られる（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００））。同一性を比較するポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基超となる。同一性を比較するＤＮＡ配列の長さは一般に、少なくとも約４８核酸残基、通常少なくとも約６０核酸残基、より通常には少なくとも約７２核酸残基、典型的には少なくとも約８４核酸残基、好ましくは約１０５核酸残基超となる。
「苦味の知覚」、「塩味の知覚」、「風味の知覚」およびこれらと同類の用語は、対象が特定の味または風味に気付くことを指す。
「選択的苦味修飾物質」という用語は、他のいかなる味物質も修飾せず、それ自体も味覚をもたらさずに特定の苦味物質による苦味を修飾する化合物を指す。例えば、ＫＣlによる苦味を選択的に抑制する化合物は、他の苦味物質を含めた別の味物質による味覚を増大または減少させずにＫＣlによる苦味を減少させる。いくつかの実施形態では、選択的苦味修飾物質は、特定の苦味受容体または特定の苦味受容体の小集団に対するアゴニストまたはアンタゴニストである。例えば、ＫＣlによる苦味を選択的に抑制する化合物は、他の苦味受容体を含めた他のいかなる味覚受容体も活性化または抑制せずに、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０のうちの１つまたは複数の苦味受容体活性に拮抗する。
「安定な」または「安定に発現する」という用語は、「安定な発現」および「一過性発現」という用語が当業者によって理解される通り、本発明の細胞および細胞系と、一過性発現を示す細胞とを区別することを意図するものである。
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、１つまたは複数の核酸プローブと核酸試料とをハイブリダイズさせ、試料中の標的核酸と特異的に結合していないプローブを洗い流すための温度および塩の条件を表す。ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６にみることができる。この参考文献には水性および非水性の方法が記載されており、そのいずれも用いることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、約４５℃で６×ＳＳＣ、次いで０．２×ＳＳＣで少なくとも１回の洗浄、６０℃で０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションがある。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のまた別の例には、約４５℃で６×ＳＳＣ、次いで０．２×ＳＳＣで少なくとも１回の洗浄、６５℃で０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションがある。ストリンジェントな条件には、０．５Ｍリン酸ナトリウム、６５℃で７％ＳＤＳ、次いで０．２×ＳＳＣで少なくとも１回の洗浄、６５℃で１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションが含まれる。
「対象」という用語は哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は家庭用動物または実験動物であり、特に限定されないが、家庭で飼育するペット、例えばイヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモットおよびフェレットなどがこれに含まれる。いくつかの実施形態では、対象は家畜である。家畜の非限定的な例としては、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイおよびヤクが挙げられる。
「甘い風味」という用語は、例えば糖によって引き起こされる味覚を指す。甘い風味を引き起こす組成物の非限定的な例としては、ブドウ糖、ショ糖、果糖、サッカリン、シクラマート、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、スクラロース、アリテームおよびネオテームが挙げられる。組成物の甘い風味の量または甘味度は、例えば味覚試験によって決定することができる。
「普遍的苦味化合物」という用語は、２５種類すべての苦味受容体を活性化する化合物を指す。普遍的苦味化合物の非限定的な例としては、安息香酸デナトニウムおよびサッカリンデナトニウムが挙げられる。
本発明は、苦味を修飾する化合物を特定するアッセイを提供する。例えば、本発明は、カリウム塩、例えば特に限定されないが、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムなどによる苦味を抑制する化合物を特定する方法を提供する。本発明はほかにも、カリウム塩、例えば特に限定されないが、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムなどによる苦味を選択的に抑制する化合物を特定する方法を提供する。本発明はさらに、カリウム塩、例えば特に限定されないが、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムなどによる苦味を模倣する化合物を特定する方法を提供する。本発明はこのほか、カリウム塩、例えば特に限定されないが、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムなどによる苦味を増強する化合物を特定する方法を提供する。
苦味受容体を発現する細胞および細胞系
本発明は、１つまたは複数の苦味受容体を発現するか、これを発現するよう操作された細胞および細胞系を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに関する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、１つまたは複数の機能的苦味受容体を発現する。
本発明の一実施形態によれば、細胞および細胞系に苦味受容体をコードする核酸をトランスフェクトする。他の実施形態では、細胞および細胞系は内因性に苦味受容体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞および細胞系に苦味受容体の対立遺伝子変異体（すなわち、多型）または変異苦味受容体をコードする核酸をトランスフェクトする。本発明の細胞系は導入した苦味受容体を安定に発現し得る。別の実施形態では、細胞および細胞系は、遺伝子活性化による発現が活性化された苦味受容体を有する。いくつかの実施形態では、苦味受容体は天然苦味受容体である。
特定の実施形態では、細胞および細胞系は操作された遺伝子活性化、すなわち、内在遺伝子発現の活性化によって内因性苦味受容体を発現し、この活性化は適切な処理をしなければ細胞に自然に生じることはない。例えば、適切な処理をしなければ細胞系に内因性苦味受容体が発現しない場合、操作された遺伝子活性化が内因性苦味受容体の発現を駆動し得る。あるいは、例えば、適切な処理をしなければ細胞系の内在遺伝子の発現レベルが望ましくない程度に低い、例えば、細胞系で苦味受容体の機能アッセイを実施するのに十分ではない場合、操作された遺伝子活性化によって内因性苦味受容体の発現レベルが増大し得る。あるいは、例えば、細胞系から内因性苦味受容体を単離するために、操作された遺伝子活性化を用いて内因性苦味受容体を過剰発現させ得る。操作された遺伝子活性化は、当業者に公知の多数の手段によって達成することができる。例えば、遺伝子転写の１つまたは複数の転写因子またはトランスアクチベーターを、例えば、その転写因子またはトランスアクチベーターを発現する核酸を構成的プロモーターまたは誘導プロモーターの制御下で細胞内に導入することによって、過剰発現させるか、発現を誘導することができる。内在遺伝子が誘導プロモーターの制御下にあることがわかっている場合、細胞をその遺伝子の既知のインデューサーに曝露することによって発現を誘導することができる。さらに、内在遺伝子自体をコードする核酸を細胞内に導入し、ゲノム内のコピー数の増加によってその遺伝子の発現レベルを増大させることができる。さらに、当該技術分野で周知の技術、例えばＲＮＡｉを用いて、細胞が発現する内在遺伝子の発現に対する特定の既知の阻害因子を細胞内でノックダウンまたは場合によってはノックアウトすることによって、内在遺伝子の発現を増大させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞および細胞系は１つまたは複数の苦味受容体を安定に発現する。いくつかの実施形態では、発現される苦味受容体はアゴニストによって活性化されると、細胞内遊離カルシウムを増加させる。いくつかの実施形態では、増強物質、アゴニストまたは活性化物質は、小分子、化学的部分、ポリペプチド、抗体または食物抽出物であり得る。他の実施形態では、発現される苦味受容体はアンタゴニストによって阻害されると、細胞内遊離カルシウムを減少させる。いくつかの実施形態では、阻害物質、アンタゴニストまたは遮断物質は、小分子、化学的部分、ポリペプチド、抗体もしくは食物抽出物またはその一部であり得る。増強物質、アゴニスト、活性化物質、阻害物質、アンタゴニストまたは遮断物質は、苦味受容体の全小集団または特定の小集団に作用し得る。
本発明によれば、細胞または細胞系によって発現される苦味受容体は、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、イヌ、ウシ、ブタまたは霊長類を含めた任意の哺乳動物に由来するものであり得る。好ましい実施形態では、苦味受容体はヒト苦味受容体である。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、ヒトＴＡＳ２Ｒ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ７をコードするヌクレオチド配列（配列番号６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ８をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ９をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１０をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１３をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１４をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１６をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３８をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３９をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４０をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４３をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４４をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４５をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４７をコードするヌクレオチド配列（配列番号２１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４８をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４９をコードするヌクレオチド配列（配列番号２３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５０をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５５をコードするヌクレオチド配列（配列番号２５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ６０をコードするヌクレオチド配列（配列番号２６）；またはその任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つと９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、ＴＡＳ２Ｒ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つと９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、ＴＡＳ２Ｒ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つの成熟型を含むヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つの変異体であるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つのフラグメントであるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つのヌクレオチド配列タンパク質分解切断産物からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２〜２６のいずれか１つのオルソログであるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。このようなオルソログは当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２〜２６のいずれか１つと比較して５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の保存的置換を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、ヒトＴＡＳ２Ｒ１（配列番号２８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３（配列番号２９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４（配列番号３０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５（配列番号３１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ７（配列番号３２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ８（配列番号３３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ９（配列番号３４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１０（配列番号３５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１３（配列番号３６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１４（配列番号３７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１６（配列番号３８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３８（配列番号３９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３９（配列番号４０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４０（配列番号４１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４１（配列番号４２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４３（配列番号４３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４４（配列番号４４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４５（配列番号４５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４６（配列番号４６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４７（配列番号４７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４８（配列番号４８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４９（配列番号４９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５０（配列番号５０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５５（配列番号：５１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ６０（配列番号５２）；その任意の組合せをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、ＴＡＳ２Ｒ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、ＴＡＳ２Ｒ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つの成熟型をコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列の変異体であるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド配列タンパク質分解切断産物からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列のオルソログであるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。このようなオルソログは当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２８〜５２のいずれか１つと比較して５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の保存的アミノ酸置換を有するＴＡＳ２Ｒ受容体をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、ヒトＴＡＳ２Ｒ１（配列番号２８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３（配列番号２９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４（配列番号３０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５（配列番号３１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ７（配列番号３２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ８（配列番号３３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ９（配列番号３４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１０（配列番号３５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１３（配列番号３６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１４（配列番号３７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１６（配列番号３８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３８（配列番号３９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３９（配列番号４０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４０（配列番号４１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４１（配列番号４２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４３（配列番号４３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４４（配列番号４４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４５（配列番号４５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４６（配列番号４６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４７（配列番号４７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４８（配列番号４８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４９（配列番号４９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５０（配列番号５０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５５（配列番号５１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ６０（配列番号５２）；またはその任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つと９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含み、ＴＡＳ２Ｒ受容体はＴＡＳ２Ｒ受容体活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つと９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含み、ＴＡＳ２Ｒ受容体はＴＡＳ２Ｒ受容体活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つの成熟型からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つの変異体からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つのフラグメントからなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つのタンパク質分解切断産物からなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号２８〜５２のいずれか１つのオルソログからなる群より選択されるＴＡＳ２Ｒ受容体を含む。このようなオルソログは当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ受容体は、配列番号２８〜５２のいずれか１つと比較して５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下または１つ以下の保存的アミノ酸置換を有する。
苦味受容体をコードする核酸は、ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、核酸は、野生型苦味受容体をコードする核酸配列と比較したとき１つまたは複数の変異を含み、この変異はアミノ酸置換を生じても生じなくてもよい。いくつかの他の実施形態では、核酸は、所与の集団に最も高頻度にみられる特定の苦味受容体をコードする核酸配列と比較したとき、１つまたは複数の天然の対立遺伝子変異体を含む。天然の対立遺伝子変異体としては、天然の同じ苦味受容体の様々なアミノ酸配列、例えば、対立遺伝子変異または多型によって所与の集団にみられるアミノ酸配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、苦味受容体をコードする核酸はフラグメントである。いくつかの実施形態では、フラグメントは、ＴＡＳ２Ｒ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、フラグメントは、配列番号２〜２６の少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１２５ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも１７５ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも８５０ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドを含む。
多型はヒトゲノムによくみられる現象である。苦味受容体遺伝子内またはその付近に生じる多型は、例えば、その遺伝子の発現レベルをアップレギュレートもしくはダウンレギュレートすることによって、あるいはその遺伝子のアミノ酸配列を変化させることによって、その発現に影響を及ぼしたり、その機能を変化させたりする。付表１にヒトＴＡＳ２Ｒ遺伝子に関連する一塩基多型（「ＳＮＰ」）、各参照配列におけるＳＮＰの位置およびＳＮＰの説明を含め、固有の多型の参照番号が示されている。参照番号は、米国立生物工学情報センター（「ＮＣＢＩ」；Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の一塩基多型データベース（「ｄｂＳＮＰ」）で検索することができる。
コード配列の多様性を生じるヒト苦味受容体遺伝子の対立遺伝子変異が研究され、報告されている。例えば、Ｕｅｄａら，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｉｎｇ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８５：１４７−１５１，２００１；Ｗｏｏｄｉｎｇら，“Ｎａｔｕｒａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ＰＴＣ，ａ ｂｉｔｔｅｒ−ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ，” Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅｔ．７４：６３７−６４６，２００４；およびＫｉｍら，“Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｔ ｈｕｍａｎ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｏｃｉ”，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ２６：１９９−２０４，２００５を参照されたい。付表２は、様々なヒト苦味受容体のコード配列における天然の変異のリストである。ヒト苦味受容体、そのコード配列の配列番号およびタンパク質配列が最初の３列に記載されている。配列番号によって識別される各コード配列内のヌクレオチド変化およびその位置がそれぞれ「ヌクレオチド変化」および「ヌクレオチド変化の位置」の下の列に示されている。配列番号によって識別される各苦味受容体内のアミノ酸変化が「説明」の下の列に１文字の略号を用いて示されている。それぞれに対応する配列番号に対する位置が「アミノ酸変化の位置」の下の列に示されている。さらに、「説明」の列にはほかにも、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰで検索可能な上記変異の識別子が記載されている。「特徴識別子」は、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）が提供するＵｎｉＰｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅによって一部の変異に割り当てられた固有の安定な特徴である。これらはＵｎｉＰｒｏｔ内で検索することができる。「ＮＡ」は、未だＵｎｉＰｒｏｔによって特徴識別子が割り当てられていないことを表す。
ヒトの味覚にばらつきがあるのはよく知られた現象である。理論に束縛されることを望むものではないが、苦味のばらつきは苦味受容体の多型によるものであると考えられる。例えば、フェニルチオカルバミド（ＰＴＣ）の受容体ｈＴＡＳ２Ｒ３８の多型は、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）を感知する能力と関係があるとされている（Ｋｉｍら，“Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔａｓｔｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｉｄｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１２２１−１２２５，２００３；Ｗｏｏｄｉｎｇら，２００４）。ＴＡＳ２Ｒ３８遺伝子によくみられる多型にはＡ４９Ｐ、Ｖ２６２ＡおよびＩ２９６Ｖの３種類があり、これらが組み合わさって２種類のよくみられるハプロタイプと、数種類の極めてまれな他のハプロタイプを形成する。２種類のよくみられるハプロタイプはＡＶＩ（多くの場合「味盲」と呼ばれる）とＰＡＶ（多くの場合「有味者」と呼ばれる）である。この２種類のハプロタイプが様々に組み合わさってホモ接合体のＰＡＶ／ＰＡＶおよびＡＶＩ／ＡＶＩと、ヘテロ接合体のＰＡＶ／ＡＶＩが生じる。これらの遺伝子型がＰＴＣ味覚能のばらつきの最大８５％を占め得る。すなわち、ＴＡＳ２Ｒ３８ヘテロ接合体よりも２コピーのＰＡＶ多型を持つ者の方がＰＴＣに強い苦味を報告し、２コピーのＡＶＩ／ＡＶＩ多型性を持つ者は多くの場合、ＰＴＣが基本的に無味であると報告する。このような多型はＧタンパク質結合ドメインを変化させることによって味覚に影響を及ぼすとする仮説が立てられている。いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、ヒトＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８（配列番号５４）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号５５）を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、ヒトＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８（配列番号５４）を含み得る。
さらに、人口のある小集団は天然植物性化合物のアロインおよびアリストロキア酸の苦味に対する感度が極めて高く、ＭＡＳ２Ｒ４３遺伝子の特定の多型を受け継いでいる。この対立遺伝子を持たない者は、低濃度のこれらの化合物の味を感じない。ＭＡＳ２Ｒ４３感度対立遺伝子があるとほかにも、サッカリンの苦味に対する感度が高くなる。さらに、ＭＡＳ２Ｒ４３感度対立遺伝子に近縁の特定のＭＡＳ２Ｒ４４対立遺伝子があっても、サッカリンの苦味に対する感度が高くなる。人口のいくつかの集団は特定のＭＡＳ２Ｒ遺伝子を持たず、これが味覚の個人差の一因となっている。苦味遺伝子の多型はこのほか、疾患、例えば糖尿病（ＴＡＳ２Ｒ９）およびアルコール依存症（ＴＡＳ２Ｒ１６）のリスク増大と関係があるとされている。天然の異種苦味受容体、その対立遺伝子変異体もしくは多型または天然に存在しない１つもしくは複数の変異（例えば、ランダム変異もしくは部位特異的変異）を有するその変異型を安定に発現する細胞および細胞系を用いるアッセイはいずれも、本発明の範囲内にある。
苦味受容体、その変異型またはその天然の対立遺伝子変異体を含む細胞および細胞系を用いて、特定の苦味受容体変異型または天然の対立遺伝子変異体に特異的な修飾物質を含めた苦味受容体機能の修飾物質を特定することができる。したがって、細胞および細胞系を用いて、苦味受容体の個々の天然型もしくは変異体型または天然の対立遺伝子変異体の特性、活性および役割に関する情報を入手し、特定の天然型もしくは変異型または天然の対立遺伝子変異体あるいは特定の天然型もしくは変異型または天然の対立遺伝子変異体の小集団に対して活性のある苦味受容体修飾物質を特定することができる。このような修飾物質は、病的な状態または組織の様々に改変された苦味受容体型を標的とする治療剤として有用である。ｉｎ ｖｉｖｏの苦味受容体の多型は、例えば、望ましくない活性または病的状態の一因となり得るため、本発明の細胞および細胞系はほかにも、変異型または天然の対立遺伝子変異体の応答を変化させることが望まれ得る治療に使用する修飾物質をスクリーニングするのに用いることができる。細胞および細胞系はこのほか、苦味受容体の天然型もしくは変異型または天然の対立遺伝子変異体のごく一部に対してのみ活性のある修飾物質を特定するのに有用である。
細胞または細胞系の作製に使用する宿主細胞は、その天然の状態で、１つまたは複数の内因性の苦味受容体を発現しても、苦味受容体を全く発現しなくてもよい。細胞または細胞系が「内因性苦味受容体」とも呼ばれるそれ自体の苦味受容体を１つまたは複数発現する場合、異種苦味受容体はその細胞または細胞系の内因性苦味受容体（１つまたは複数）のうちの１つと同じ受容体であり得る。例えば、細胞または細胞系に内因性の苦味受容体をコードする核酸をその細胞または細胞系に導入して、細胞または細胞系に核酸を導入しない場合よりも高いレベルで苦味受容体が発現するように細胞または細胞系の苦味受容体をコードする遺伝子のコピー数を増加させ得る。宿主細胞は、初代細胞、胚細胞または胚性幹細胞を含めた幹細胞であり得る。宿主細胞はこのほか、不死化細胞であり得る。初代宿主細胞または不死化宿主細胞は、真核生物の中胚葉層、外胚葉層または内胚葉層に由来するものであり得る。宿主細胞は、内皮細胞、上皮細胞、間葉系細胞、神経細胞、腎細胞、肝細胞、造血細胞または免疫細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、腸腺窩細胞または絨毛細胞、クララ細胞、結腸細胞、腸細胞、杯細胞、腸クロム親和性細胞、腸内分泌細胞であり得る。宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ネコ細胞、げっ歯類細胞、有袋類、マウス細胞をはじめとする細胞であり得る。宿主細胞はこのほか、非哺乳動物、例えば酵母、昆虫、真菌、植物、下等真核生物および核生物などであり得る。このような宿主細胞により、苦味受容体修飾物質を試験するためのバックグラウンドが多様になり、標的と相互作用し得る細胞によって生じる発現産物が存在しない可能性が高くなり得る。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。本発明の細胞または細胞系の作製に使用し得る宿主細胞の例としては、特に限定されないが：ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞、樹立された神経細胞系、褐色細胞腫、神経芽腫線維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳ０細胞、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）およびＰＣ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣヒト初代ＰＣＳ １００−０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、Ｕ−２ ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４８）もしくは任意の樹立された細胞系（極性細胞または非極性細胞）またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ０ＪＧ Ｅｎｇｌａｎｄ）などの保管機関から入手可能な任意の細胞系が挙げられる。
当業者に理解されるように、宿主細胞に使用するのに適した任意のベクターを用いて、宿主細胞にＴＡＳ２Ｒ受容体をコードする核酸を導入し得る。様々なＴＡＳ２Ｒ受容体を含むベクターは、同じタイプのものであっても、異なるタイプものであってもよい。ＴＡＳ２Ｒ受容体をコードする核酸を宿主細胞に導入するのに使用し得るベクターの例としては、特に限定されないが、プラスミド、レトロウイルスおよびレンチウイルスを含めたウイルス、コスミド、人工染色体が挙げられ、例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｚｅｏ、ｐＦＮ１１Ａ（ＢＩＮＤ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＧＬ４．３１、ｐＦＣ１４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＣ１４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ＨａｌｏＴａｇ（商標）ｐＨＴ２、ｐＡＣＴ、ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（商標）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｂａｓｉｃ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶＴＮＴ（商標）、ｐＧ５１ｕｃ、ｐＳＩ、ｐＴＡＲＧＥＴ（商標）、ｐＴＮＴ（商標）、ｐＦ１２Ａ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦ１２Ｋ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＲｅｇ ｎｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＡｄＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡｄ ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）、Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）、ｐＤＥＳＴ（商標）、２７Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）、ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）、ｐｃＤＮＡ（商標）−ＤＥＳＴ４７ベクター、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ６／Ｈｉｓ Ａ、Ｂおよびｃ、ｐｃＤＮＡ（商標）６．２−ＤＥＳＴ、ｐＬｅｎｔｉ６／ＴＲ、ｐＬＰ−ＡｃＧＦＰｌ−Ｃ、ｐＬＰＳ−ＡｃＧＦＰｌ−Ｎ、ｐＬＰ−ＩＲＥＳｎｅｏ、ｐＬＰ−ＴＲＥ２、ｐＬＰ−ＲｅｖＴＲＥ、ｐＬＰ−ＬＮＣＸ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−ＨＡ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ、ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱ、ｐＬＰ−ＣＭＶｎｅｏが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、恒常的プロモーターまたは条件的プロモーターなどの発現制御配列を含む。当業者にはしかるべき配列を選択することが可能であろう。例えば、適切なプロモーターとしては、特に限定されないが、ＣＭＶ、ＴＫ、ＳＶ４０およびＥＦ−１αが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、温度制御プロモーター、組織特異的プロモーター、抑制性プロモーター、熱ショックプロモーター、発生プロモーター、細胞系列特異的プロモーター、真核プロモーター、原核プロモーターもしくは一過性プロモーターまたは上記プロモーターのいずれか１つもしくは複数の未改変もしくは変異誘導配列、無作為化した配列、シャッフルした配列の組合せもしくは組換えである。他の実施形態では、遺伝子活性化によってＴＡＳ２Ｒ受容体を発現させ、ここでは、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに外来プロモーターを挿入して、その宿主細胞には通常発現しないＴＡＳ２Ｒ受容体遺伝子の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ受容体をコードする遺伝子はエピソーム性である。ＴＡＳ２Ｒ受容体をコードする核酸を恒常的に発現させるのが好ましい。
ＴＡＳ２受容体をコードする配列またはＴＡＳ２Ｒシグナル伝達経路の構成要素の配列と、任意選択で選択マーカーをコードする核酸とを含む核酸を、選択した宿主細胞に周知の方法により導入し得る。周知の方法としては、特に限定されないが、トランスフェクション、ウイルス送達、タンパク質もしくはペプチド仲介による挿入、共沈殿法、脂質系送達試薬（リポフェクション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、エレクトロポレーションまたは機械的送達が挙げられる。トランスフェクション試薬の例には、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＦＵＧＥＮＥ ６、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５０、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ，ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、ＧＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲＯＪＥＮＥ、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、ＵＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ２、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦＥＣＴ、ＲＮＡＩ ＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯＴＡＸＩ、ＧＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ、ＣＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ、ＪＥＴＰＥＩ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、ＰＯＬＹＦＥＣＴ、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧＥＲ、ＲＮＡｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−ＫＩＴ、ＣＬＯＮＦＥＣＴＩＮおよびＭＥＴＡＦＥＣＴＩＮＥが挙げられる。
別の態様では、細胞および細胞系はＧタンパク質を発現する。Ｇタンパク質にはヘテロ三量体Ｇタンパク質と単量体Ｇタンパク質の２つのファミリーがある。ヘテロ三量体Ｇタンパク質はＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）によって活性化され、Ｇα、ＧβおよびＧγの３つのサブユニットを含む。本明細書で使用されるＧタンパク質という用語は、上記サブユニットのうちのいずれか１つ、例えばＧαまたはその任意の組合せのほか、３種類すべてのサブユニットを有するヘテロ三量体Ｇタンパク質を包含する。不活性な状態では、Ｇα、ＧβおよびＧγが三量体を形成する。βサブユニットとγサブユニットは互いに密接に結合し、ベータ−ガンマ複合体を呼ばれる。リガンドがＧＰＣＲに結合するとＧαがＧβγから分離する。Ｇβγ複合体はそのＧＤＰ−ＧＴＰ交換後にＧαサブユニットから解離する。Ｇβγ複合体は他のセカンドメッセンジャーまたはゲートイオンチャネルを活性化し得る。Ｇアルファの４つのファミリーには、アデニル酸シクラーゼを活性化することによってｃＡＭＰ合成を増大させるＧｓ（刺激性）；アデニル酸シクラーゼを阻害するＧｉ（抑制性）；様々な細胞運動過程（すなわち、細胞骨格、細胞間結合）を調節するＧ１２／１３ファミリー；ならびにカルシウムシグナル伝達およびホスホリパーゼＣを刺激するＧｑが含まれる。単量体Ｇタンパク質はヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニットと相同である。本発明の細胞または細胞系には、特に限定されないが、トランスデューシン（例えば、ＧＮＡＴ１、ＧＮＡＴ２およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｔ））、ガストデューシン（例えば、ＧＮＡＴ３グアニンヌクレオチド結合タンパク質およびαトランスデューシン３）、ヒトＧＮＡ１５（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）α１５（Ｇｑクラス；ＧＮＡ１６と同義）およびマウスＧα１５とそのキメラタンパク質、例えばＧα１５−ＧＮＡ１５（Ｇａ１５−Ｇａ１６としても知られる）を含めた任意のＧタンパク質を発現させ得る。好ましい実施形態では、Ｇタンパク質はマウスＧα１５（配列番号５３）である。別の好ましい実施形態では、Ｇタンパク質はヒトＧＮＡ１５（配列番号１）または配列番号２７を含む核酸によってコードされるヒトＧタンパク質である。このほかＧタンパク質は、任意の哺乳動物Ｇタンパク質、例えば特に限定されないが、付表３に記載される任意の哺乳動物Ｇタンパク質などであってもよい。細胞に安定に発現するＧタンパク質は、その細胞に内因性のものであり得る。あるいは、Ｇタンパク質の安定な発現は、Ｇタンパク質をコードする核酸を細胞内に安定にトランスフェクトした結果であり得る。異種Ｇタンパク質を安定に発現する細胞が当該技術分野で公知であり、例えばＨＥＫ２９３／Ｇα１５細胞がある（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，“Ｔ２Ｒｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，Ｃｅｌｌ １００：７０３−７１１，２０００；Ｂｕｆｅら，“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＴＡＳ２Ｒ１６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｅ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ”，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３２：３９７−４０１）。他の実施形態では、Ｇタンパク質をコードする核酸と苦味受容体をコードする核酸を、そのいずれかを先にトランスフェクトする形で連続して宿主細胞にトランスフェクトすることができる。他の実施形態では、Ｇタンパク質をコードする核酸と苦味受容体をコードする核酸を同じベクターまたは異なるベクターで宿主細胞に共トランスフェクトすることができる。したがって、Ｇタンパク質と苦味受容体の両方を安定に発現する細胞の選択を連続的にも、同時にも同様に実施することができる。上で説明した通り、Ｇタンパク質を安定に発現させるのに使用し得る細胞または細胞系は、苦味受容体を安定に発現させるのに使用し得る細胞または細胞系と同じである。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、他のタンパク質と苦味受容体（１つまたは複数）を共発現する。好ましい実施形態では、他のタンパク質は、甘味（ＴＡＳ１Ｒ２／ＴＡＳ１Ｒ３）受容体またはうま味（ＴＡＳ１Ｒ１／ＴＡＳ１Ｒ３）受容体などの少なくとも１つの他の味覚受容体である。いくつかの実施形態では、本発明の細胞系パネルは、苦味受容体を発現する細胞系と、甘味（ＴＡＳ１Ｒ２／ＴＡＳ１Ｒ３）受容体またはうま味（ＴＡＳ１Ｒ１／ＴＡＳ１Ｒ３）受容体などの他の味覚受容体を発現する細胞系とを含む。苦味受容体と共発現させるタンパク質は、任意の機序によって、例えば特に限定されないが、宿主細胞で内因性に、またはベクターから異種性に発現させ得る。このほか、本発明の他の実施形態では、２つ以上のタイプの苦味受容体を細胞または細胞系に安定に発現させ得る。
このほか本発明によれば、天然型の苦味受容体またはその天然の対立遺伝子変異体を発現する細胞および細胞系ならびに変異型の苦味受容体を発現する細胞および細胞系を細胞内遊離カルシウムレベルについて特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、「生理学的に妥当な」活性のある苦味受容体を発現する。本明細書で使用される生理学的妥当性は、細胞または細胞系が苦味受容体を発現し、その苦味受容体が同じタイプの天然苦味受容体が活性化されたときと同じように細胞内遊離カルシウムの増加を引き起こし、同じタイプの天然苦味受容体が同じ化合物によって修飾されて応答するのと同じように修飾物質に応答するという特性を指す。いくつかの変異型の苦味受容体および苦味受容体のいくつかの天然の対立遺伝子変異体を含めた本発明の苦味受容体発現細胞および細胞系は、細胞内遊離カルシウムを測定するアッセイなどの適切なアッセイで天然苦味受容体を通常発現する細胞と同等の機能を示すのが好ましい。このようなアッセイは当業者に公知である（Ｎａｈｏｒｓｋｉ，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ，” Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１４７：Ｓ３８−Ｓ４５，２０００）。このような比較を用いて細胞または細胞系の生理学的妥当性を判定する。ほかにも、一団の訓練を受けた味覚試験者による「口に含んで吐き出す」味覚試験（ｓｉｐ ａｎｄ ｓｐｉｔ ｔａｓｔｅ ｔｅｓｔ）を用いて本発明の細胞および細胞系の苦味受容体の生理学的妥当性をさらに検証し得る。天然型もしくは変異型の苦味受容体またはその天然の対立遺伝子変異体のスクリーニングにより特定された修飾物質を使用する口に含んで吐き出す味覚試験（ｓｉｐ ａｎｄ ｓｐｉｔ ｔａｓｔｅ ｔｅｓｔ）の結果を用いて、これらの様々な型の生理学的妥当性を検証することができる。
いくつかの実施形態では、細胞および細胞系は、苦味受容体に対する生理学的範囲のＥＣ５０値またはＩＣ５０値で修飾物質に応答し細胞内遊離カルシウムを増加させる。本明細書で使用されるＥＣ５０は、細胞または細胞系に最大の半分の活性化応答を誘導するのに必要な化合物または物質の濃度を指す。本明細書で使用されるＩＣ５０は、細胞または細胞系に最大の半分の抑制応答を誘導するのに必要な化合物または物質の濃度を指す。ＥＣ５０値およびＩＣ５０値は、当該技術分野で周知の技術、例えば、化合物または物質の濃度と苦味受容体発現細胞系の応答とを相関させる用量反応曲線を用いて決定し得る。
苦味受容体発現細胞および細胞系の作製には、例えば、米国特許第６，６９２，９６５号および国際公開第２００５／０７９４６２号に記載されている技術を用いることができる。上記文書はともに、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。この技術では、数百万の細胞をリアルタイムで評価して任意の所望の数のクローン（数百〜数千のクローン）を選択することができる。フローサイトメトリーによる細胞選別（例えば、ＦＡＣＳ機器を用いるもの）または磁気細胞分離（例えば、ＭＡＣＳ機器を用いるもの）などの細胞選別技術を用いれば、１ウェル当たり１個の細胞を高い統計的信頼度で自動的に培養容器（９６ウェル培養プレートなど）に入れることができる。技術の加速化および自動化により多重遺伝子細胞系の分離が容易になる。苦味受容体発現細胞および細胞系の作製にこのほか、例えば、国際公開第２００９／１０２５６９号および同第２０１０／０８８６３３号ならびに未公開の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／６１４００号に記載されている技術を用いることができる。上記文書はそれぞれ、あらゆる目的においてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。この技術では、生理学的特性の適合した細胞および細胞系を作製する方法が自動化される。このような方法を用いて、有力な苦味受容体修飾物質のハイスループットなスクリーニングに適した細胞系パネルを作製し得る。
技術を用いれば、分子ビーコンまたは蛍光発生プローブとも呼ばれるシグナル伝達プローブを用いて各苦味受容体のＲＮＡ配列を検出し得る。いくつかの実施形態では、分子ビーコンは上記のように標的タグ配列を認識する。別の実施形態では、分子ビーコンは、苦味受容体コード配列自体の中にある配列を認識する。シグナル伝達プローブがタグ配列または苦味受容体コード配列のＲＮＡ配列に相補的な部分を含むよう設計することによって、ＲＮＡタグ配列または苦味受容体コード配列それぞれにシグナル伝達プローブを方向付け得る。Ｇタンパク質を用いる場合、これらと同じ技術を用いてＧタンパク質のＲＮＡ配列を検出し得る。
苦味を修飾する化合物を特定する方法
一態様では、本発明は、苦味を修飾する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、苦味受容体修飾物質をスクリーニングするアッセイ（例えば、機能アッセイまたは結合アッセイ）；物質の苦味を評価するアッセイ；結晶構造解析および結合試験のためのタンパク質を作製するアッセイ；ならびに化合物の選択性と用量、受容体／化合物結合の速度と安定性および受容体発現が細胞生理（例えば、電気生理、タンパク質輸送、タンパク質フォールディングおよびタンパク質調節）に及ぼす影響を検討するアッセイである。
いくつかの実施形態では、細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは上述の苦味受容体発現細胞および細胞系を用いるものである。様々な組合せの苦味受容体を発現する細胞および細胞系を別個にまたは一緒に用いて、特定の苦味受容体または苦味受容体の変異型もしくは天然の対立遺伝子変異体に特異的なものを含めた苦味受容体修飾物質を特定し、個々の型の活性に関する情報を得ることができる。
修飾物質には、苦味受容体またはその変異型もしくは天然の対立遺伝子変異体の活性を変化させる任意の物質または化合物が含まれる。修飾物質は、部分アゴニストまたはアンタゴニスト、選択的アゴニストまたはアンタゴニストおよび逆アゴニストを含めた苦味受容体アゴニスト（増強物質または活性化物質）またはアンタゴニスト（阻害物質または遮断物質）であり得、またアロステリック修飾物質であり得る。ある物質または化合物の修飾活性が様々な条件もしくは濃度下で、または苦味受容体の様々な型（例えば、変異型および天然の対立遺伝子変異体）に対して変化する場合でも、その物質または化合物は修飾物質である。他の態様では、修飾物質が別の修飾物質の能力を変化させて苦味受容体の機能に影響を及ぼし得る。例えば、アンタゴニストによって阻害されない型の苦味受容体に対する修飾物質により、その型の苦味受容体がアンタゴニストによる阻害を受けるようになり得る。
細胞および細胞系を用いて、様々な修飾物質に対する応答に基づき苦味受容体のｉｎ ｖｉｖｏの型の特性と、既知の型の苦味受容体の特性とを関連させることによって、様々な苦味受容体の病態における様々な型の苦味受容体の役割を特定し得る。これにより、このような苦味受容体による病態をはじめとする生理学的状態の高度に標的化した治療に疾患特異的または組織特異的苦味受容体修飾物質を選択することが可能になる。例えば、多くの天然の苦味化合物には毒性があるため、苦味受容体が毒性のある食物化合物を摂取しないよう警告するセンサーとしての役割を果たし得る。胃腸粘膜に発現する苦味受容体は、内腔の栄養素および有害物質の機能的検出に関与し、消化管にそれを吸収するか、防御的応答を開始する準備をさせる可能性が考えられる。上記受容体はこのほか、消化管と脳を結ぶ神経経路の活性化を介した摂餌量の制御に関与している可能性が考えられる。したがって、多数の状況において栄養摂取量を調節する、例えば、肥満患者の食欲を制御し、かつ／またはその消化管での栄養摂取量を減少させる、あるいは栄養不良患者の空腹感を制御し、かつ／または食物からの栄養素および／またはエネルギーの摂取量を増大させるのに本発明の細胞系および方法を用いて特定された苦味受容体修飾物質を用い得る。苦味受容体修飾物質はこのほか、苦味化合物を特定し、さらに苦味受容体の結合特性に影響を及ぼす個別の化学的もしくは構造的モチーフまたは重要な残基の特徴を明らかにし、リガンドとの結合に広範囲に、適度にまたは選択的に反応できる苦味受容体を特定し、苦味受容体をその結合プロファイルに基づいてグループおよびサブグループを定め、オーファン苦味受容体を脱オーファン化し、このようなデータを苦味受容体の分子モデリングまたは薬物設計に使用し、様々な苦味受容体が活性を示す組織を明らかにすることに有用であり得る。
苦味受容体修飾物質を特定するため、苦味受容体を発現する細胞または細胞系を苦味受容体が機能的であると予想される条件下で被験化合物に曝露した後、適切な対照、例えば、被験化合物に曝露しない細胞と比較した苦味受容体活性の統計的に有意な変化（例えばｐ＜０．０５）を検出し得る。このほか、既知のアゴニストまたはアンタゴニストならびに／あるいは異なる苦味受容体またはその変異型もしくは天然の対立遺伝子変異体を発現する細胞を用いる陽性対照ならびに／あるいは陰性対照を使用し得る。いくつかの実施形態では、検出および／または測定する苦味受容体活性は細胞内遊離カルシウムレベルである。当業者であれば、様々なアッセイパラメータ、例えばシグナルとノイズの比を最適化し得ることを理解するであろう。
さらなる態様では、本発明はオーファン苦味受容体のリガンドを特定する方法を提供する、すなわち、本発明は苦味受容体を脱オーファン化する方法を提供する。既知の修飾物質を用いなくても苦味受容体を発現する細胞または細胞系に化合物または抽出物のライブラリーを用いてスクリーニングし、その受容体の発現プロファイルを作成し得る。任意選択で、ほぼ同じプロファイルを有する受容体（存在する場合）をまとめて既知の苦味化合物でスクリーニングし、受容体（１つまたは複数）と結合するリガンド（１つまたは複数）を特定する。リガンドが特定されたら、その結果を味覚試験でさらに検証し得る。任意選択で、細胞および細胞系が天然の（すなわち、タグを付けていない）苦味受容体を安定に発現すれば、この方法を用いて特定されるリガンドを正確で妥当なものとする。
いくつかの実施形態では、細胞系のコレクションを含めた１つまたは複数の細胞または細胞系を被験化合物に曝露する。いくつかの実施形態では、細胞系のコレクションを含めた１つまたは複数の細胞または細胞系を複数の被験化合物、例えば被験化合物のライブラリーに曝露する。本発明の細胞系を用いて被験化合物のライブラリーをスクリーニングし、１つまたは複数の修飾物質を特定することができる。被験化合物は、小分子を含めた化学的部分、植物の抽出物または断片、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体またはその抗原結合部分であり得る。抗体の場合、抗体は非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。抗体は、完全な重鎖と軽鎖を含むインタクト抗体または任意の抗体の抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、重鎖もしくは軽鎖可変領域の全体もしくは抗原結合部分を含めた抗原結合部分であり得る。
いくつかの実施形態では、細胞系のコレクションを含めた１つまたは複数の細胞または細胞系を苦味物質の存在下で１つの被験化合物または複数の被験化合物に曝露する。いくつかの実施形態では、苦味物質は苦味受容体のある小集団を活性化する「特異的苦味物質」である。いくつかの実施形態では、苦味物質は各苦味受容体を活性化する「普遍的苦味化合物」である。普遍的苦味化合物の非限定的な例としては、安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムが挙げられる。苦味物質による苦味受容体活性の誘導を減少させる被験化合物は、その苦味物質の阻害物質である。苦味物質による苦味受容体活性の誘導を増大させる被験化合物は、苦味物質の増強物質である。
一部の苦味修飾物質および被験化合物はオフターゲット効果を示し得る。苦味修飾物質または被験化合物が選択的苦味修飾物質であり、オフターゲット効果を示さないのが好ましい。
細胞または細胞系のコレクションを用いて本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施し得る。好ましい実施形態では、細胞または細胞系のコレクションは、２５種類の苦味受容体および／またはその変異体をそれぞれ発現する細胞または細胞系を含む。このようなパネルを用いて、化合物のオンターゲット活性とオフターゲット活性または純粋な苦味とこれに関連する味（すなわち、渋味または金属のような味）における受容体の役割を明らかにし得る。
いくつかの実施形態では、例えば、９６ウェルウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルまたはそれ以上のプレートフォーマットを用いる細胞ベースの機能的ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）で多数の化合物のコレクションを苦味受容体修飾活性について試験する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞系のコレクションを含めた２つ以上の細胞または細胞系を用いて、１つの被験化合物または被験化合物のライブラリーを含めた複数の被験化合物をスクリーニングし得る。それぞれが異なる天然の苦味受容体分子または変異苦味受容体分子を発現する複数の細胞または細胞系を用いれば、複数の苦味受容体またはその変異型もしくは天然の対立遺伝子変異体に効果的な修飾物質あるいは特定の苦味受容体またはその変異型もしくは天然の対立遺伝子変異体に特異的であり、他の苦味受容体または他の型の苦味受容体を修飾しない修飾物質を特定することができる。ヒト苦味受容体を発現する細胞または細胞系の場合、細胞を被験化合物に曝露して、望ましくない苦味受容体活性を特徴とする疾患もしくは病態または望ましい苦味受容体活性の低下もしくは欠如を特徴とする疾患もしくは病態の治療に使用する、苦味受容体活性を修飾する（増大させるか、低下させる）化合物を特定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系を被験化合物に曝露する前に、例えば、哺乳動物をはじめとする動物酵素、植物酵素、細菌酵素、細胞を溶解して得られた酵素、タンパク質修飾酵素、脂質修飾酵素および口腔、消化管、胃または唾液中の酵素を含めた酵素で前処理することによって修飾し得る。このような酵素としては、例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げ得る。あるいは、細胞および細胞系を最初に被験化合物に曝露した後、処理を実施し、その処理によって苦味受容体の修飾を変化させる化合物を特定し得る。
ＧＰＣＲ活性化を確認および測定するアッセイは当該技術分野で周知である。例えば、「Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｉｅｓ）」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９９；第１版；ＨａｇａおよびＢｅｒｓｔｅｉｎ編を参照されたい。本発明の方法にＧＰＣＲ活性化を検出する任意の適切なアッセイを用いて、有力な苦味受容体修飾物質による苦味受容体の活性化に対する効果を評価し得る。このようなアッセイの例としては、イオン感受性または膜電位蛍光指示薬が挙げられる。上記色素は静止状態では膜透過性であるため、細胞に曝露すると濃度勾配によって細胞内に侵入する。細胞内に入ると、細胞内酵素が色素を膜不透過性型に変換して捕捉する。このほか膜不透過性型の色素は通常、例えば遊離細胞内カルシウに対する感度が高く、特定の強度または波長の光で刺激すると、カルシウムとの結合によって色素が蛍光性になる。したがって、カルシウムと結合する膜透過性色素を用いて、ＧＰＣＲ活性化に応答した細胞内カルシウム放出を測定し得る。このような色素としては、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ ｂｌｕｅ、ｃｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ Ｖｉｏｌｅｔ、Ｑｕｉｎ−２、Ｑｕｅｓｔ Ｆｌｕｏ−８Ｈ（商標）、Ｑｕｅｓｔ Ｆｌｕｏ−８Ｌ（商標）、Ｑｕｅｓｔ Ｆｌｕｏ ８（商標）、Ｑｕｅｓｔ Ｒｈｏｄ−４（商標）、セレンテラジンおよびＣａｌｃｉｕｍ−３が挙げられる。特定の実施形態では、Ｆｌｕｏ−４またはＣａｌｃｉｕｍ−３の蛍光を用いてＧＰＣＲ活性化を測定する。いくつかの実施形態では、アッセイ緩衝液（すなわち、負荷溶液）はプロベネシドを含まない。このような色素がカルシウム結合に応答して発する蛍光を、例えば蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光分光法および蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定することによって、細胞内カルシウムレベルを測定することができる。ほとんどの蛍光指示薬が、カルシウムに応答する光誘起電子移動系を組み込んだＢＡＰＴＡキレート剤に由来するものである。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＦＬＩＰＲ（登録商標）およびＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（商標）機器、Ｈａｍａｍａｔｓｕ社のＦＤＳＳおよびＢＭＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＮＯＶＯｓｔａｒ（商標）では、細胞内カルシウムレベルの変化を連続的にモニターすることによって、受容体活性の動態を時間依存性蛍光シグナルの形で読み取ることができる。したがって、上記機器によってＧＰＣＲ研究におけるカルシウムのハイスループットな測定が可能になる。
ほかにも、アデニル酸シクラーゼ活性、ＩＰ３／Ｃａ２＋シグナル伝達、ホスホリパーゼＣ／細胞内Ｃａ２＋シグナル伝達、ＧＴＰアーゼ活性、ＧＴＰ結合、マイクロフィジオメーター／バイオセンサーアッセイ（例えば、Ｈａｆｎｅｒ，２０００，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１５：１４９−１５８を参照されたい）、アラキノイド酸レベル（例えば、Ｇｉｊｏｎら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２０１４６−２０１５６を参照されたい）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰレベル（ラジオイムノアッセイによるものまたは結合タンパク質を用いるもの；例えば、ＨｏｒｔｏｎおよびＢａｘｅｎｄａｌｅ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：９１−１０５を参照されたい）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）レベル、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）レベル、タンパク質キナーゼＣ活性および／またはＭＡＰキナーゼ活性を測定することによってＧＰＣＲ活性を評価し得る。
味物質と苦味受容体の割当て
別の態様によれば、本発明は苦味物質と苦味受容体の割当てを提供する。のちの実施例に示されるように、カリウム塩、例えば特に限定されないが、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムなどは、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０などの苦味受容体を活性化する。したがって、「カリウム塩応答性苦味受容体」という語句は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体から選択されるグループの１つまたは複数の受容体を指す。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される。このような実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４のうちの少なくとも１つに加えて、ＴＡＳ２Ｒ６０をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される。このような実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ４４のうちの少なくとも１つに加えて、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０のうちの少なくとも１つをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される。このような実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４のうちの少なくとも１つに加えて、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ６０のうちの少なくとも１つをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される。このような実施形態では、カリウム塩応答性受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４のうちの少なくとも１つに加えて、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０のうちの少なくとも１つをさらに含み得る。好ましいカリウム塩応答性受容体としては、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４が挙げられる。実施例ではほかにも、カリウム塩が陰イオンとは無関係に、少なくともＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４を活性化することが示されている。したがって、「カリウムイオン応答性苦味受容体」という語句は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４から選択されるグループの１つまたは複数の受容体を指す。ＴＡＳ２Ｒ３８はＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８であるのが好ましい。
各カリウム塩は、それ自体の苦味受容体割当てのプロファイルを有し得る。例えば、ＫＣｌ応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体のうちの１つまたは複数の受容体をＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９の一方または両方、例えばＴＡＳ２Ｒ３９などと組み合わせて用いる。
さらに、アセスルファムＫ応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体のうちの１つまたは複数の受容体をＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９の一方または両方、例えばＴＡＳ２Ｒ３９などと組み合わせて用いる。
乳酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４６およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。
安息香酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。
ソルビン酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。
硝酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。任意選択で、硝酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体からなる群より選択され得る。
さらに、リン酸カリウム（二塩基性）応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。任意選択で、リン酸カリウム（二塩基性）応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体からなる群より選択され得る。
グルコン酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳＲ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳＲ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体からなる群より選択され得る。
酢酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。
硫酸カリウム応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ３８はＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８である。
カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法
別の態様によれば、本発明は、カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、カリウム塩によって苦味受容体の活性化を修飾、阻害または増強する化合物を特定するものである。いくつかの実施形態では、この方法は、カリウム塩とこれに続く下流シグナル伝達によって苦味受容体の活性化を修飾、阻害または増強する化合物を特定するものである。いくつかの実施形態では、この方法は、カリウム塩による刺激後のシグナル伝達経路の活性化を修飾、阻害または増強する化合物を特定するものである。いくつかの実施形態では、この方法は、カリウム塩による苦味の知覚を修飾、阻害または増強する化合物を特定するものである。カリウム塩は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０などの苦味受容体を活性化する。したがって、カリウム塩による１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体の活性化を修飾する化合物をカリウム塩による苦味の修飾物質とするべきである。いくつかの実施形態では、化合物は、カリウム塩による１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体の活性化を阻害する。このような実施形態では、化合物はカリウム塩による苦味の阻害物質である。いくつかの実施形態では、化合物は、カリウム塩による１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体の活性化を増強する。このような実施形態では、化合物はカリウム塩による苦味の増強物質である。いくつかの実施形態では、化合物は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する。このような実施形態では、化合物はカリウム塩による苦味を模倣する。いくつかの実施形態では、カリウム塩は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、上に開示される苦味を修飾する化合物を特定する方法のいずれかを、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質を用いて実施する。いくつかの実施形態では、味物質はカリウム含有味物質および普遍的苦味化合物から選択される。いくつかの実施形態では、カリウム含有味物質は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、普遍的苦味化合物は安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである。いくつかの実施形態では、味物質は、ＫＣl、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない。このような実施形態では、カリウム含有味物質は、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭまたは５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも３５ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも４５ｍＭまたは少なくとも５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭまたは少なくとも約５０ｍＭである。
いくつかの実施形態では、被験化合物は、２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。いくつかの実施形態では、被験化合物は、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。いくつかの実施形態では、被験化合物は、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。いくつかの実施形態では、被験化合物は、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。いくつかの実施形態では、被験化合物は、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。いくつかの実施形態では、被験化合物は、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。いくつかの実施形態では、被験化合物は、各カリウム塩応答性苦味受容体のカリウム塩誘導性活性化を修飾、阻害または増強する。
この節に記載されるカリウム塩による苦味を修飾する化合物の特定方法のいずれかでは、その方法に使用する苦味受容体は上記のようなＧタンパク質と複合体を形成し得る。上記の任意のＧタンパク質を使用し得る。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質は、Ｇｑタンパク質、αトランスデューシンまたはαガストデューシンである。いくつかの実施形態では、Ｇｑタンパク質はＧα１５タンパク質である。
この節に記載されるカリウム塩による苦味を修飾する化合物の特定方法のいずれかでは、上記の任意のアッセイを用いて苦味受容体活性を測定し得る。いくつかの実施形態では、細胞内カルシウム濃度を測定することによって苦味受容体活性を決定する。いくつかの実施形態では、カルシウム感受性蛍光色素を用いて細胞内カルシウム濃度を測定する。いくつかの実施形態では、カルシウム感受性蛍光色素は、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ ｂｌｕｅ、ｃｙｔｏＣａｌｃｅｉｎ Ｖｉｏｌｅｔ、Ｑｕｉｎ−２、Ｑｕｅｓｔ Ｆｌｕｏ−８Ｈ（商標）、Ｑｕｅｓｔ Ｆｌｕｏ−８Ｌ（商標）、Ｑｕｅｓｔ Ｆｌｕｏ ８（商標）、Ｑｕｅｓｔ Ｒｈｏｄ−４（商標）、セレンテラジンおよびＣａｌｃｉｕｍ−３から選択される。特定の実施形態では、カルシウム感受性蛍光色素はＦｌｕｏ−４またはＣａｌｃｉｕｍ−３である。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を準備すること；１つまたは複数の苦味受容体と、１つまたは複数の苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；１つまたは複数の苦味受容体の活性を測定すること；１つまたは複数の苦味受容体を洗浄すること；１つまたは複数の苦味受容体と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに１つまたは複数の苦味受容体の活性を測定することを含む。味物質に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性が、味物質および被験化合物に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性と異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を修飾するものである。味物質に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性が、味物質および被験化合物に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を抑制するものである。味物質に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性が、味物質および被験化合物に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を増強するものである。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。受容体と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、１つまたは複数の苦味受容体と被験化合物とを接触させるのは、１つまたは複数の苦味受容体と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、第一の１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体および第二の１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を準備すること；第一の１つまたは複数の苦味受容体と、１つまたは複数の苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；第一の１つまたは複数の苦味受容体の活性を測定すること；第二の１つまたは複数の苦味受容体と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに第二の１つまたは複数の苦味受容体の活性を測定することを含む。第一の１つまたは複数の苦味受容体の活性が、第二の１つまたは複数の苦味受容体の活性と異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を修飾するものである。第一の１つまたは複数の苦味受容体の活性が、第二の１つまたは複数の苦味受容体の活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を抑制するものである。第一の１つまたは複数の苦味受容体の活性が、第二の１つまたは複数の苦味受容体の活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のもう一つの苦味受容体を活性測定後に洗浄して第二の１つまたは複数の苦味受容体とする。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、第二の１つまたは複数の苦味受容体と被験化合物とを接触させるのは、第二の１つまたは複数の苦味受容体と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞を準備すること；細胞と、１つまたは複数の苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；１つまたは複数の苦味受容体の活性を測定すること；細胞を洗浄すること；細胞と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに１つまたは複数の苦味受容体の活性を測定することを含む。味物質に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性が、味物質および被験化合物に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性と異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を修飾するものである。味物質に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性が、味物質および被験化合物に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を抑制するものである。味物質に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性が、味物質および被験化合物に起因する１つまたは複数の苦味受容体の活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を増強するものである。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系に存在する。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルに存在する。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。細胞と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、細胞と被験化合物とを接触させるのは、細胞と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第一の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第二の細胞を準備すること；第一の細胞と、１つまたは複数の苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；第一の細胞の苦味受容体活性を測定すること；第二の細胞と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに第二の細胞の苦味受容体活性を測定することを含む。第一の細胞の苦味受容体活性が第二の細胞の苦味受容体活性と異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を修飾するものである。第一の細胞の苦味受容体活性が第二の細胞の苦味受容体活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を抑制するものである。第一の細胞の苦味受容体活性が第二の細胞の苦味受容体活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を増強するものである。いくつかの実施形態では、第一の細胞および第二の細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系に存在する。いくつかの実施形態では、第一の細胞および第二の細胞は１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルに存在する。いくつかの実施形態では、第一の細胞を苦味受容体活性の測定後に洗浄して第二の細胞とする。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、第二の細胞と被験化合物とを接触させるのは、第二の細胞と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第三の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第四の細胞を準備することをさらに含み；第三の細胞と第四の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第三の細胞および第四の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が第一の細胞および第二の細胞の苦味受容体と異なる。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第五の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第六の細胞を準備することをさらに含み；第五の細胞と第六の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第五の細胞および第六の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が、第一、第二、第三および第四の細胞の苦味受容体と異なる。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第七の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第八の細胞を準備することをさらに含み；第七の細胞と第八の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第七の細胞および第八の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が、第一、第二、第三、第四、第五および第六の細胞の苦味受容体と異なる。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第九の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十の細胞を準備することをさらに含み；第九の細胞と第十の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第九の細胞および第十の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八の細胞と異なる。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十一の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十二の細胞を準備することをさらに含み；第十一の細胞と第十二の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第十一の細胞および第十二の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九および第十の細胞の苦味受容体と異なる。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十三の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十四の細胞を準備することをさらに含み；第十三の細胞と第十四の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第十三の細胞および第十四の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一および第十二の細胞の苦味受容体と異なる。いくつかの実施形態では、この方法は、１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十五の細胞および１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する第十六の細胞を準備することをさらに含み；第十五の細胞と第十六の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が同じであり；かつ第十五の細胞および第十六の細胞の１つまたは複数の苦味受容体が、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三および第十四の細胞の苦味受容体と異なる。このような実施形態では、この方法は、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三および／または第十五の細胞と、１つまたは複数の苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；第三、第五、第七、第九、第十一、第十三および／または第十五の細胞の苦味受容体活性を測定すること；第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞の苦味受容体活性を測定することを含む。第三、第五、第七、第九、第十一、第十三および／または第十五の細胞の苦味受容体活性が、それぞれ第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞の苦味受容体活性と異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を修飾するものである。第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞の苦味受容体活性が、それぞれ第三、第五、第七、第九、第十一、第十三および／または第十五の細胞の苦味受容体活性よりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を抑制するものである。第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞の苦味受容体活性が、それぞれ第三、第五、第七、第九、第十一、第十三および／または第十五の細胞の苦味受容体活性よりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を増強するものである。いくつかの実施形態では、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五および／または第十六の細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系に存在する。いくつかの実施形態では、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五および／または第十六の細胞は、１つまたは複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルに存在する。いくつかの実施形態では、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三および／または第十五の細胞を苦味受容体活性の測定後に洗浄して、それぞれ第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞とする。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞と被験化合物とを接触させるのは、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四および／または第十六の細胞と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞系パネルを準備し、各細胞系が、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現すること；各細胞系と、２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；各細胞系の苦味受容体活性を測定すること；各細胞系を洗浄すること；各細胞系と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに各細胞系の苦味受容体活性を測定することを含む。味物質と接触させたときの２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が、味物質および被験化合物と接触させたときと比較して異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。味物質と接触させたときの２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が、味物質および被験化合物と接触させたときよりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。味物質と接触させたときの２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が、味物質および被験化合物と接触させたときよりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、パネルはマッチしたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルである。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。細胞系と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、各細胞系と被験化合物とを接触させるのは、各細胞系と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、それぞれが１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系を含む細胞系パネルを準備し、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現すること；各細胞系と、少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体を活性化する味物質とを接触させること；各細胞系の苦味受容体活性を測定すること；各細胞系を洗浄すること；各細胞系と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに各細胞系の苦味受容体活性を測定することを含む。いくつかの実施形態では、パネルの各細胞系は、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現する。味物質と接触させたときの少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が、味物質および被験化合物と接触させたときと比較して異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも４つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも６つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも７つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。味物質と接触させたときの少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が、味物質および被験化合物と接触させたときよりも高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、少なくとも３つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも４つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも６つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも７つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。味物質と接触させたときの少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が、味物質および被験化合物と接触させたときよりも低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも４つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも６つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも７つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、パネルはマッチしたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルである。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。細胞系と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、各細胞系と被験化合物とを接触させるのは、各細胞系と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルを準備し、各細胞系が、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、かつ第一のパネルと第二のパネルが同じ細胞系を含むこと；第一のパネルの各細胞系と、２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系を活性化する味物質とを接触させること；第一のパネルの各細胞系の苦味受容体活性を測定すること；第二のパネルの各細胞系と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに第二のパネルの各細胞系の苦味受容体活性を測定することを含む。第一のパネルの２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる。第一のパネルの２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が高い。第一のパネルの２つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、３つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、４つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、５つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、６つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、７つ以上のカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が低い。いくつかの実施形態では、第一のパネルおよび第二のパネルはマッチしたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルである。いくつかの実施形態では、第一の細胞系パネルの苦味受容体活性を測定した後にこれを洗浄して第二の細胞系パネルとする。換言すれば、第一の細胞系パネルと第二の細胞系パネルは、第一の測定段階と第二の接触段階との間に洗浄段階を挟んだ同じ細胞系パネルである。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。細胞系と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、第二のパネルの各細胞系と被験化合物とを接触させるのは、第二のパネルの各細胞系と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルを準備し、各パネルがカリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系を含み、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、かつ第一のパネルと第二のパネルが同じ細胞系を含むこと；第一のパネルの各細胞系と、少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系を活性化する味物質とを接触させること；第一のパネルの各細胞系の苦味受容体活性を測定すること；第二のパネルの各細胞系と、味物質および被験化合物とを接触させること；ならびに第二のパネルの各細胞系の苦味受容体活性を測定することを含む。いくつかの実施形態では、第一のパネルおよび第二のパネルの各細胞系は、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体は各パネルの少なくとも１つの細胞系に発現する。第一のパネルの少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも４つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも６つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも７つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系で苦味受容体活性が異なる場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に修飾するものである。第一のパネルの少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも３つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも４つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも５つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも６つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも７つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して高い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に抑制するものである。第一のパネルの少なくとも２つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも３つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも４つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも５つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも６つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの少なくとも７つのカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルの各カリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性が第二のパネルと比較して低い場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を選択的に増強するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルおよび第二のパネルはマッチしたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルである。いくつかの実施形態では、第一の細胞系パネルの苦味受容体活性を測定した後にこれを洗浄して第二の細胞系パネルとする。換言すれば、第一の細胞系パネルと第二の細胞系パネルは、第一の測定段階と第二の接触段階との間に洗浄段階を挟んだ同じ細胞系パネルである。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。細胞系と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。味物質と被験化合物は逐次的に加えても、同時に加えてもよい、すなわち、第二のパネルの各細胞系と被験化合物とを接触させるのは、第二のパネルの各細胞系と味物質とを接触させる前でも、接触と同時でも、接触させた後でもよい。
いくつかの実施形態では、カリウム塩による苦味の修飾物質を特定する上記いずれかの方法に用いる味物質はカリウム含有味物質または普遍的苦味化合物である。いくつかの実施形態では、カリウム含有味物質は、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、普遍的苦味化合物は安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである。いくつかの実施形態では、味物質は、ＫＣl、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない。このような実施形態では、カリウム含有味物質は、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭまたは５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、少なくとも０．１ｍＭ、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも３５ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも４５ｍＭまたは少なくとも５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、味物質の濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１５ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約３５ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約４５ｍＭまたは少なくとも約５０ｍＭである。
別の態様では、本発明は、カリウム塩による苦味を模倣する化合物を特定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルを準備し、各細胞系が、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択される苦味受容体を発現し、各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、かつ第一のパネルと第二のパネルが同じ細胞系を含むこと；第一のパネルの各細胞系とネガティブ対照とを接触させること；第一のパネルの各細胞系の苦味受容体活性を測定すること；第二のパネルの各細胞系と被験化合物とを接触させること；第二のパネルの各細胞系の苦味受容体活性を測定することを含む。被験化合物がカリウム塩応答性苦味受容体発現細胞系の苦味受容体活性を誘導する場合、被験化合物はカリウム塩による苦味を模倣するものである。いくつかの実施形態では、第一のパネルおよび第二のパネルはマッチしたｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルである。いくつかの実施形態では、第一の細胞系パネルの苦味受容体活性を測定した後にこれを洗浄して第二の細胞系パネルとする。換言すれば、第一の細胞系パネルと第二の細胞系パネルは、第一の測定段階と第二の接触段階との間に洗浄段階を挟んだ同じ細胞系パネルである。当業者であれば、このような実施形態では試験する順序は重要ではないことを認識するであろう。細胞系と被験化合物とを接触させるのは洗浄前でも洗浄後でもよい。いくつかの実施形態では、ネガティブ対照は被験化合物を加える前のアッセイ緩衝液である。
いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を２つ以上の異なるカリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、それぞれが異なるカリウム塩応答性苦味受容体を発現する２つ以上の細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を３つ以上の異なるカリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、それぞれが異なるカリウム塩応答性苦味受容体を発現する３つ以上の細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を４つ以上の異なるカリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、それぞれが異なるカリウム塩応答性苦味受容体を発現する４つ以上の細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を５つ以上の異なるカリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、それぞれが異なるカリウム塩応答性苦味受容体を発現する５つ以上の細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を６つ以上の異なるカリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、それぞれが異なるカリウム塩応答性苦味受容体を発現する６つ以上の細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を７つ以上の異なるカリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、それぞれが異なるカリウム塩応答性苦味受容体を発現する７つ以上の細胞と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を各カリウム塩応答性苦味受容体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、味物質および味物質と被験化合物を、各カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞と接触させることを含み、各細胞は異なる苦味受容体を発現する。
カリウム塩による苦味を修飾、抑制、増強または模倣する化合物を特定する方法が、ＴＡＳ２Ｒ４４またはＴＡＳ２Ｒ４４を発現する細胞と、味物質または被験化合物とを接触させることを含む、いくつかの実施形態では、この方法はほかにも、少なくとも１つの追加の苦味受容体または少なくとも１つの追加の苦味受容体を発現する細胞と、味物質または被験化合物とを接触させることを含み、少なくとも１つの追加の苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択される。
カリウム塩による苦味を修飾、抑制、増強または模倣する化合物を特定する方法が、ＴＡＳ２Ｒ３８またはＴＡＳ２Ｒ３８を発現する細胞と、味物質または被験化合物とを接触させることを含む、いくつかの実施形態では、この方法はほかにも、少なくとも１つの追加の苦味受容体または少なくとも１つの追加の苦味受容体を発現する細胞と、味物質または被験化合物とを接触させることを含み、少なくとも１つの追加の苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択される。
カリウム塩による苦味を修飾、抑制、増強または模倣する化合物を特定する方法が、ＴＡＳ２Ｒ３９またはＴＡＳ２Ｒ３９を発現する細胞と、味物質または被験化合物とを接触させることを含む、いくつかの実施形態では、この方法はほかにも、少なくとも１つの追加の苦味受容体または少なくとも１つの追加の苦味受容体を発現する細胞と、味物質または被験化合物とを接触させることを含み、少なくとも１つの追加の苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０から選択される。
上記いずれかの方法では、カリウム塩は、ＫＣｌ、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択され得る。さらに、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＫＣｌ応答性苦味受容体、乳酸カリウム応答性苦味受容体、アセスルファムＫ応答性苦味受容体、安息香酸カリウム応答性苦味受容体、ソルビン酸カリウム応答性苦味受容体、硝酸カリウム応答性苦味受容体、リン酸カリウム（二塩基性）応答性苦味受容体、グルコン酸カリウム応答性苦味受容体、酢酸カリウム応答性苦味受容体および硫酸カリウム応答性苦味受容体からなる群より選択され得る。
上記いずれかの方法では、カリウム塩応答性苦味受容体はカリウムイオン応答性苦味受容体であり得る。
上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも１つが、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される。
上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも１つが、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、ＫＣｌ応答性苦味受容体はＴＡＳ２Ｒ３８またはＴＡＳ２Ｒ３９である。このような実施形態では、ＫＣｌ応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ３８またはＴＡＳ２Ｒ３９に加えてＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０を含み得る。いくつかの実施形態では、アセスルファムＫ応答性苦味受容体はＴＡＳ２Ｒ３８またはＴＡＳ２Ｒ３９である。このような実施形態では、アセスルファムＫ応答性苦味受容体は、ＴＡＳ２Ｒ３８またはＴＡＳ２Ｒ３９に加えてＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６およびＴＡＳ２Ｒ４４を含み得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、カリウム塩による苦味を修飾、抑制、増強または模倣する被験化合物と、食料品、任意の食料品前駆材料または食料品の生産に用いる任意の添加物とを混合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、食料品はヒトが消費するためのものである。いくつかの実施形態では、食料品は動物、例えばペットまたは家畜などが消費するためのものである。いくつかの実施形態では、この方法は、カリウム塩による苦味を修飾、抑制、増強または模倣する被験化合物と、活性薬剤とを薬学的に許容される形態で混合することをさらに含む。
苦味を修飾する化合物を特定するための細胞系パネル
別の態様によれば、本発明は、苦味を修飾する化合物を特定するための細胞系パネルを提供する。
いくつかの実施形態では、細胞系パネルは、カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定するためのものである。いくつかの実施形態では、パネルは、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系を含む。いくつかの実施形態では、各カリウム塩応答性苦味受容体はパネルの少なくとも１つの細胞系に発現する。いくつかの実施形態では、パネルは、カリウム塩応答性苦味受容体を発現する細胞系から実質的になる。いくつかの実施形態では、細胞系パネルはネガティブ対照の細胞系をさらに含む。いくつかの実施形態では、ネガティブ対照は、カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法のネガティブ対照である。
細胞系パネルは、特に限定されないが、ＫＣl、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムを含めたカリウム塩による苦味を特定するためのものであり得る。したがって、カリウム塩応答性苦味受容体は、ＫＣｌ応答性苦味受容体、乳酸カリウム応答性苦味受容体、アセスルファムＫ応答性苦味受容体、安息香酸カリウム応答性苦味受容体、ソルビン酸カリウム応答性苦味受容体、硝酸カリウム応答性苦味受容体、リン酸カリウム（二塩基性）応答性苦味受容体、グルコン酸カリウム応答性苦味受容体、酢酸カリウム応答性苦味受容体および硫酸カリウム応答性苦味受容体からなる群より選択され得る。
実施例
本発明がさらに十全に理解されるよう以下の実施例を記載する。これらの実施例は単に説明を目的とするものであり、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
これらの分析を目的として、国際公開第２０１０／０８８６３３号（例えば、実施例２６を参照されたい）に記載されている２５の苦味受容体のパネルの小集団である８つの特異的苦味受容体を発現する細胞系パネルを用いた。したがって、パネルの各細胞系はヒト苦味受容体およびマウスＧα１５シグナル伝達タンパク質を発現するものであった。
以下の各実施例では次のような機能アッセイを用いた：
第１日：黒壁／透明底の９６ウェルプレート（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）に安定な細胞系を播種した。１ウェル当たり約４０Ｋの細胞を加え、細胞増殖培地（１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ、５１７８）、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｇ７５１３）を添加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５７９６））中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
第２日：増殖培地を廃棄し、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭグルコースを含有する緩衝液（ｐＨ７．０）に１×Ｃａ−３色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｒ８０９０）、１％ＤＭＳＯを含有する負荷溶液中、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。負荷溶液にプロベネシドは含めなかった。
機能アッセイ：色素を負荷した後、細胞プレートを蛍光プレートリーダー（例えば、ＦＤＳＳ６０００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ））に入れ、３×濃縮リガンド／アゴニストストック５０μｌを加えることにより受容体刺激を測定した。アゴニスト添加前の１０秒間およびアゴニストによる刺激後の１００〜２５０秒間、連続して蛍光をモニターした。
受容体活性化を以下のように定義する：
％活性化＝［（（最大シグナル蛍光強度−最小シグナル蛍光強度）−（最大対照蛍光強度−最小対照蛍光強度））／最大緩衝液蛍光強度−最小緩衝液蛍光強度）］×１００
機能的応答＝［（最大シグナル蛍光強度−最小シグナル蛍光強度）−（最大対照蛍光強度−最小対照蛍光強度）］
シグナル蛍光強度：リガンドの添加によってみられた蛍光強度の変化を指す
対照蛍光強度：緩衝液（ネガティブ対照）の添加によってみられた蛍光強度の変化を指す
リガンドおよび対照のカルシウムシグナルを刺激前の細胞の基底蛍光強度に正規化した。
濃度分析を実施し、以下の式を用いた非線形回帰によってＥＣ５０値を計算した：Ｙ＝下限値＋（上限値−下限値）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）×Ｈｉｌｌ勾配））、Ｘ＝投与量または濃度のｌｏｇ、Ｙ＝応答（Ｘの増加とともに増加する）、上限値＝最大シグナル値、下限値＝最小シグナル値。ＥＣ５０（最大有効濃度の半分）は、アゴニストから得ることが可能な有効な応答の最大値の５０％を生じるそのアゴニストのモル濃度を指す。
実施例１．カリウム塩によって通常活性化されるＴＡＳ２Ｒ苦味受容体
ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体はＫＣｌ刺激に特異的に応答することが既に示されていた。今回、さらに２つの苦味受容体、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）がＫＣｌに特異的に応答することが確認されたことにより（図２および３）、ＫＣｌによって特異的に活性化されるＴＡＳ２Ｒ苦味受容体が合計８つとなった。ＫＣｌに加えて、食品および飲料品への適用に関連するカリウム塩がほかにも多数存在する。他のカリウム塩の活性化プロファイルを明らかにするため、特定されている８つのＫＣｌ受容体のパネルを濃度２０ｍＭの乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、酢酸カリウム、硝酸カリウム、グルコン酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）および硫酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。図１に示されるように、１０種類のカリウム塩（ＫＣｌを含む）はいずれも、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４を活性化し、これは推定カリウム苦味受容体の「フィンガープリント」である。さらに、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０は、試験したカリウム塩のすべてではないが、その多くに特異的に応答した。
実施例２．ＫＣｌに応答するほかの苦味受容体の特定
ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体はＫＣｌ刺激に特異的に応答することが既に示されていた。今回、さらに２つの苦味受容体、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）がＫＣｌに特異的に応答することが確認された（図２および３）。ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）を発現する細胞系を２０ｍＭのＫＣｌに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図２に示されるように、２つの細胞系はともにＫＣｌ刺激に強く、かつ特異的に応答した。ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）によるＫＣｌ誘導性シグナル伝達の特徴をさらに明らかにするため、ＫＣｌの濃度を漸増させてこれらの受容体を刺激することによって各受容体のＫＣｌによる活性化を測定し、上記のようにＥＣ５０値を計算することによって、機能プロファイルを作成した。図３に示されるように、各細胞系のＥＣ５０値は約５〜１５ｍＭであった。
実施例３．アセスルファムＫに応答する苦味受容体の特定
ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体はアセスルファムＫ刺激に特異的に応答することが既に示されていた。今回、さらに２つの苦味受容体、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）がアセスルファムＫに特異的に応答することが確認された（図４および５）。ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）を発現する細胞系を２０ｍＭのアセスルファムＫに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図４に示されるように、２つの細胞系はともにアセスルファムＫ刺激に強く、かつ特異的に応答した。ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）によるアセスルファムＫ誘導性シグナル伝達の特徴をさらに明らかにするため、アセスルファムＫの濃度を漸増させてこれらの受容体を刺激することによって各受容体のアセスルファムＫによる活性化を測定し、上記のようにＥＣ５０値を計算することによって、機能プロファイルを作成した。図５に示されるように、各細胞系のＥＣ５０値は約５〜１０ｍＭであった。
実施例４．安息香酸カリウムに応答する苦味受容体の特定
安息香酸カリウムに感受性であり、安息香酸カリウムによる苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭの安息香酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。安息香酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳＲ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性を誘導した（図６および７）。ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳＲ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０による安息香酸カリウム誘導性シグナル伝達の特徴をさらに明らかにするため、安息香酸カリウムの濃度を漸増させてこれらの受容体を刺激することによって各受容体の安息香酸カリウムによる活性化を測定し、上記のようにＥＣ５０値を計算することによって、機能プロファイルを作成した。図７に示されるように、各細胞系のＥＣ５０値は約５〜１０ｍＭであった。
実施例５．酢酸カリウムに応答する苦味受容体の特定
酢酸カリウムに感受性であり、酢酸カリウムによる苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭの酢酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。酢酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性を誘導した（図８および９）。試験条件下では、酢酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）苦味受容体の活性もＴＡＳ２Ｒ３９苦味受容体の活性も誘導しなかった（図１）。ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０による酢酸カリウム誘導性シグナル伝達の特徴をさらに明らかにするため、酢酸カリウムの濃度を漸増させてこれらの受容体を刺激することによって各受容体の酢酸カリウムによる活性化を測定し、上記のようにＥＣ５０値を計算することによって、機能プロファイルを作成した。図９に示されるように、各細胞系のＥＣ５０値は約５〜１０ｍＭであった。
実施例６．ソルビン酸カリウムに応答する苦味受容体の特定
ソルビン酸カリウムに感受性であり、ソルビン酸カリウムによる苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭのソルビン酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図１０に示されるように、ソルビン酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳＲ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性を誘導した。
実施例７．硝酸カリウムに応答する苦味受容体の特定
硝酸カリウムに感受性であり、硝酸カリウムによる苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭの硝酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図１１に示されるように、硝酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳＲ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性を誘導した。ＴＡＳ２Ｒ６０のデータは予備試験のものである。
実施例８．グルコン酸カリウムに応答する苦味受容体の特定
グルコン酸カリウムに感受性であり、グルコン酸カリウムによる苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭのグルコン酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図１２に示されるように、グルコン酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４苦味受容体の活性を誘導した。試験条件下では、グルコン酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性は誘導しなかった。
実施例９．リン酸カリウム（二塩基性）に応答する苦味受容体の特定
リン酸カリウム（二塩基性）に感受性であり、リン酸カリウム（二塩基性）による苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭのリン酸カリウム（二塩基性）に別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図１３に示されるように、リン酸カリウム（二塩基性）はＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性を誘導した。ＴＡＳ２Ｒ６０のデータは予備試験のものである。
実施例１０．硫酸カリウムに応答する苦味受容体の特定
硫酸カリウムに感受性であり、硫酸カリウムによる苦味を仲介している可能性のある受容体の集団を特定するため、特定されている８つのＫＣｌ苦味受容体発現細胞系のパネルを２０ｍＭの硫酸カリウムに別個に、および同時に曝露した。上記蛍光レポーター系を用いた細胞内カルシウムの変化によって苦味受容体活性化を測定した。図１４に示されるように、硫酸カリウムはＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶ）、ＴＡＳＲ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体の活性を誘導した。
配列表
ヒトＧＮＡ１５
ＭＡＲＳＬＴＷＲＣＣＰＷＣＬＴＥＤＥＫＡＡＡＲＶＤＱＥＩＮＲＩＬＬＥＱＫＫＱＤＲＧＥＬＫＬＬＬＬＧＰＧＥＳＧＫＳＴＦＩＫＱＭＲＩＩＨＧＡＧＹＳＥＥＥＲＫＧＦＲＰＬＶＹＱＮＩＦＶＳＭＲＡＭＩＥＡＭＥＲＬＱＩＰＦＳＲＰＥＳＫＨＨＡＳＬＶＭＳＱＤＰＹＫＶＴＴＦＥＫＲＹＡＡＡＭＱＷＬＷＲＤＡＧＩＲＡＣＹＥＲＲＲＥＦＨＬＬＤＳＡＶＹＹＬＳＨＬＥＲＩＴＥＥＧＹＶＰＴＡＱＤＶＬＲＳＲＭＰＴＴＧＩＮＥＹＣＦＳＶＱＫＴＮＬＲＩＶＤＶＧＧＱＫＳＥＲＫＫＷＩＨＣＦＥＮＶＩＡＬＩＹＬＡＳＬＳＥＹＤＱＣＬＥＥＮＮＱＥＮＲＭＫＥＳＬＡＬＦＧＴＩＬＥＬＰＷＦＫＳＴＳＶＩＬＦＬＮＫＴＤＩＬＥＥＫＩＰＴＳＨＬＡＴＹＦＰＳＦＱＧＰＫＱＤＡＥＡＡＫＲＦＩＬＤＭＹＴＲＭＹＴＧＣＶＤＧＰＥＧＳＫＫＧＡＲＳＲＲＬＦＳＨＹＴＣＡＴＤＴＱＮＩＲＫＶＦＫＤＶＲＤＳＶＬＡＲＹＬＤＥＩＮＬＬ（配列番号１）
ＴＡＳ２Ｒ１ ＣＤＳ
ＡＴＧＣＴＡＧＡＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＴＧＧＣＴＣＧＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴＴＧＣＣＡＧＣＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＴＡＴＧＧＴＣＣＣＡＴＡＣＴＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＡＡＡＧＴＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＧＡ（配列番号２）
ＴＡＳ２Ｒ３ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＣＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＣＴＣＡＧＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＣＡＡＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＴＣＡＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＴＧＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＧＣＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＣＴＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＧＣＴＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＴＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＴＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＧＡＴＧＣＴＣＣＧＧＴＧＴＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＡＧ（配列番号３）
ＴＡＳ２Ｒ４ ＣＤＳ
ＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＡＡＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＴＡＧＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧＣＴＡＡＴＡＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＧＧＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号４）
ＴＡＳ２Ｒ５ ＣＤＳ
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ＴＡＳ２Ｒ７ ＣＤＳ
ＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＧＧＡＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴＴＧＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＴＧＣＧＴＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＣＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＡＧＧＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＧＣＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＧＣＴＧＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＣＡＴＡＴＣＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＴＡＴＴＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＧＡＣＡＴＧＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＧＴＡＡＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡ（配列番号６）
ＴＡＳ２Ｒ８ ＣＤＳ
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ＴＡＳ２Ｒ９ ＣＤＳ
ＡＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＴＡＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＡＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＡＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＧＣＴＡＧＴＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＣＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＡＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＡＡＴＡＴＡＴＣＧＣＡＣＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＣＣＣＴＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＡＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＣＡＧＧＧＴＴＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＡＴＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＴＴＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧ（配列番号８）
ＴＡＳ２Ｒ１０ ＣＤＳ
ＡＴＧＣＴＡＣＧＴＧＴＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＡＧＴＧＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＴＡＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＴＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＣＣＴＡＡＴＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＴＧＧＴＡＡＴＣＡＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＣＧＴＴＡＣＴＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＧＡＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＴＣＡＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＡＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＡＧ（配列番号９）
ＴＡＳ２Ｒ１３ ＣＤＳ
ＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＣＧＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＡＴＣＴＡＧＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＴＡＧＴＴＴＣＴＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＡＧＣＧＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＡＧＧＡＡＣＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＧＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＡＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＧＡＴＴＧＧＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＡＣＧＣＴＡＡＧＴＴＡＡＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＧＴＡＴＧＧＧＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡ（配列番号１０）
ＴＡＳ２Ｒ１４ ＣＤＳ
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ＴＡＳ２Ｒ１６ ＣＤＳ
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ＴＡＳ２Ｒ４３ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＣＴＡＣＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＡＧＣＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＴＡＴＣＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＴＴＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＡ（配列番号１７）
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ｔＡＳ２Ｒ４５ ＣＤＳ
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ＴＡＳ２Ｒ４６ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＡＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＡＣＴＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＧＴＡＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＡＧＴＡＴＡＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＣＴＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＴＣＡＴＧＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＡＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＣＴＧＡ（配列番号２０）
ＴＡＳ２Ｒ４７ ＣＤＳ
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ＴＡＳ２Ｒ４８ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡＡＡＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＡＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＡＣＧＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡＣＴＣＴＡＧＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＴＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＧＴＡＴＡＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＡＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡ（配列番号２２）
ＴＡＳ２Ｒ４９ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＧＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＣＴＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＡＡＧＡＧＴＧＴＡＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＣＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＧＴＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＡＴＴＡＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＧＴＣＴＡＡＴＣＡＴＡＴＣＧＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＧＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＴＡＧ（配列番号２３）
ＴＡＳ２Ｒ５０ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＧＴＡＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＴＴＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＧＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡＣＣＣＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＧＣＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＧＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＡＴＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＣＡＴＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＴＣＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧＣＴＧＡ（配列番号２４）
ＴＡＳ２Ｒ５５ ＣＤＳ
ＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＡＣＡＴＡＴＡＧＡＣＴＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＡＴＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＧＡＣＴＡＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＴＧＣＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＡＧＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＴＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＡＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＡＧＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＡＧＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＡＧＧＣＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＴＴＡＧＧＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＴＧＡ（配列番号２５）
ＴＡＳ２Ｒ６０ ＣＤＳ
ＡＴＧＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＡＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＣＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＡＧＧＧＧＣＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＴＧＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＡＡＴＧＴＡＴＣＡＧＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＧＧＡＡＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＡＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＣＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣＧＡＧＡＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＣＧＴＣＧＴＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＧＡ（配列番号２６）
ヒトＧＮＡ１５ ＣＤＳ
ＡＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＴＡＴＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＡＣＧＣＧＧＧＣＡＴＣＣＧＴＧＣＡＴＧＣＴＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣＡＴＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＣＧＴＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＴＴＴＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＡＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＣＧＣＧＣＧＴＧＴＡＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＣＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＡ（配列番号２７）
ＴＡＳ２Ｒ１
ＭＬＥＳＨＬＩＩＹＦＬＬＡＶＩＱＦＬＬＧＩＦＴＮＧＩＩＶＷＮＧＩＤＬＩＫＨＲＫＭＡＰＬＤＬＬＬＳＣＬＡＶＳＲＩＦＬＱＬＦＩＦＹＶＶＩＶＩＦＦＩＥＦＩＭＣＳＡＮＣＡＩＬＬＦＩＮＥＬＥＬＷＬＡＴＷＬＧＶＦＹＣＡＫＶＡＳＶＲＨＰＬＦＩＷＬＫＭＲＩＳＫＬＶＰＷＭＩＬＧＳＬＬＹＶＳＭＩＣＶＦＨＳＫＹＡＧＦＭＶＰＹＦＬＲＫＦＦＳＱＮＡＴＩＱＫＥＤＴＬＡＩＱＩＦＳＦＶＡＥＦＳＶＰＬＬＩＦＬＦＡＶＬＬＬＩＦＳＬＧＲＨＴＲＱＭＲＮＴＶＡＧＳＲＶＰＧＲＧＡＰＩＳＡＬＬＳＩＬＳＦＬＩＬＹＦＳＨＣＭＩＫＶＦＬＳＳＬＫＦＨＩＲＲＦＩＦＬＦＦＩＬＶＩＧＩＹＰＳＧＨＳＬＩＬＩＬＧＮＰＫＬＫＱＮＡＫＫＦＬＬＨＳＫＣＣＱ（配列番号２８）
ＴＡＳ２Ｒ３
ＭＭＧＬＴＥＧＶＦＬＩＬＳＧＴＱＦＴＬＧＩＬＶＮＣＦＩＥＬＶＮＧＳＳＷＦＫＴＫＲＭＳＬＳＤＦＩＩＴＴＬＡＬＬＲＩＩＬＬＣＩＩＬＴＤＳＦＬＩＥＦＳＰＮＴＨＤＳＧＩＩＭＱＩＩＤＶＳＷＴＦＴＮＨＬＳＩＷＬＡＴＣＬＧＶＬＹＣＬＫＩＡＳＦＳＨＰＴＦＬＷＬＫＷＲＶＳＲＶＭＶＷＭＬＬＧＡＬＬＬＳＣＧＳＴＡＳＬＩＮＥＦＫＬＹＳＶＦＲＧＩＥＡＴＲＶＴＥＨＦＲＫＫＲＳＥＹＹＬＩＨＶＬＧＴＬＷＹＬＰＰＬＩＶＳＬＡＳＹＳＬＬＩＦＳＬＧＲＨＴＲＱＭＬＱＮＧＴＳＳＲＤＰＴＴＥＡＨＫＲＡＩＲＩＩＬＳＦＦＦＬＦＬＬＹＦＬＡＦＬＩＡＳＦＧＮＦＬＰＫＴＫＭＡＫＭＩＧＥＶＭＴＭＦＹＰＡＧＨＳＦＩＬＩＬＧＮＳＫＬＫＱＴＦＷＭＬＲＣＥＳＧＨＬＫＰＧＳＫＧＰＩＦＳ（配列番号２９）
ＴＡＳ２Ｒ４
ＭＬＲＬＦＹＦＳＡＩＩＡＳＶＩＬＮＦＶＧＩＩＭＮＬＦＩＴＶＶＮＣＫＴＷＶＫＳＨＲＩＳＳＳＤＲＩＬＦＳＬＧＩＴＲＦＬＭＬＧＬＦＬＶＮＴＩＹＦＶＳＳＮＴＥＲＳＶＹＬＳＡＦＦＶＬＣＦＭＦＬＤＳＳＳＶＷＦＶＴＬＬＮＩＬＹＣＶＫＩＴＮＦＱＨＳＶＦＬＬＬＫＲＮＩＳＰＫＩＰＲＬＬＬＡＣＶＬＩＳＡＦＴＴＣＬＹＩＴＬＳＱＡＳＰＦＰＥＬＶＴＴＲＮＴＳＦＮＩＳＥＧＩＬＳＬＷＳＬＶＬＳＳＳＬＱＦＩＩＮＶＴＳＡＳＬＬＩＨＳＬＲＲＨＩＱＫＭＱＫＮＡＴＧＦＷＮＰＱＴＥＡＨＶＧＡＭＫＬＭＶＹＦＬＩＬＹＩＰＹＳＶＡＴＬＶＱＹＬＰＦＹＡＧＭＤＭＧＴＫＳＩＣＬＩＦＡＴＬＹＳＰＧＨＳＶＬＩＩＩＴＨＰＫＬＫＴＴＡＫＫＩＬＣＦＫＫ（配列番号３０）
ＴＡＳ２Ｒ５
ＭＬＳＡＧＬＧＬＬＭＬＶＡＷＥＦＬＩＧＬＩＧＮＧＳＬＷＷＳＦＲＥＷＩＲＫＦＮＷＳＳＹＮＬＩＩＬＧＬＡＧＣＲＦＬＬＱＷＬＩＩＬＤＬＳＬＦＰＬＦＱＳＳＲＷＬＲＹＬＳＩＦＷＶＬＶＳＱＡＳＬＷＦＡＴＦＬＳＶＦＹＣＫＫＩＴＴＦＤＲＰＡＹＬＷＬＫＱＲＡＹＮＬＳＬＷＣＬＬＧＹＦＩＩＮＬＬＬＴＶＱＩＧＬＴＦＹＨＰＰＱＧＮＳＳＩＲＹＰＦＥＳＷＱＹＬＹＡＦＱＬＮＳＧＳＹＬＰＬＷＦＬＶＳＳＧＭＬＩＶＳＬＹＴＨＨＫＫＭＫＶＨＳＡＧＲＲＤＶＲＡＫＡＨＩＴＡＬＫＳＬＧＣＦＬＬＬＨＬＶＹＩＭＡＳＰＦＳＩＴＳＫＴＹＰＰＤＬＴＳＶＦＩＷＥＴＬＭＡＡＹＰＳＬＨＳＬＩＬＩＭＧＩＰＲＶＫＱＴＣＱＫＩＬＷＫＴＶＣＡＲＲＣＷＧＰ（配列番号３１）
ＴＡＳ２Ｒ７
ＭＡＤＫＶＱＴＴＬＬＦＬＡＶＧＥＦＳＶＧＩＬＧＮＡＦＩＧＬＶＮＣＭＤＷＶＫＫＲＫＩＡＳＩＤＬＩＬＴＳＬＡＩＳＲＩＣＬＬＣＶＩＬＬＤＣＦＩＬＶＬＹＰＤＶＹＡＴＧＫＥＭＲＩＩＤＦＦＷＴＬＴＮＨＬＳＩＷＦＡＴＣＬＳＩＹＹＦＦＫＩＧＮＦＦＨＰＬＦＬＷＭＫＷＲＩＤＲＶＩＳＷＩＬＬＧＣＷＬＳＶＦＩＳＬＰＡＴＥＮＬＮＡＤＦＲＦＣＶＫＡＫＲＫＴＮＬＴＷＳＣＲＶＮＫＴＱＨＡＳＴＫＬＦＬＮＬＡＴＬＬＰＦＣＶＣＬＭＳＦＦＬＬＩＬＳＬＲＲＨＩＲＲＭＱＬＳＡＴＧＣＲＤＰＳＴＥＡＨＶＲＡＬＫＡＶＩＳＦＬＬＬＦＩＡＹＹＬＳＦＬＩＡＴＳＳＹＦＭＰＥＴＥＬＡＶＩＦＧＥＳＩＡＬＩＹＰＳＳＨＳＦＩＬＩＬＧＮＫＬＲＨＡＳＬＫＶＩＷＫＶＭＳＩＬＫＧＲＫＦＱＱＨＫＱＩ（配列番号３２）
ＴＡＳ２Ｒ８
ＭＦＳＰＡＤＮＩＦＩＩＬＩＴＧＥＦＩＬＧＩＬＧＮＧＹＩＡＬＶＮＷＩＤＷＩＫＫＫＫＩＳＴＶＤＹＩＬＴＮＬＶＩＡＲＩＣＬＩＳＶＭＷＮＧＩＶＩＶＬＮＰＤＶＹＴＫＮＫＱＱＩＶＩＦＴＦＷＴＦＡＹＬＮＭＷＩＴＴＣＬＶＦＹＦＬＫＩＡＳＳＳＨＰＬＦＬＷＬＫＷＫＩＤＭＷＨＷＩＬＬＧＣＦＡＩＳＬＬＶＳＬＩＡＡＩＶＬＳＣＤＹＲＦＨＡＩＡＫＨＫＲＮＩＴＥＭＦＨＶＳＫＩＰＹＦＥＰＬＴＬＦＮＬＦＡＩＶＰＦＩＶＳＬＩＳＦＦＬＬＶＲＳＬＷＲＨＴＫＱＩＫＬＹＡＴＧＳＲＤＰＳＴＥＶＨＶＲＡＩＫＴＭＴＳＦＩＦＦＦＦＬＹＹＩＳＳＩＬＭＴＦＳＹＬＭＴＫＹＫＬＡＶＥＦＧＥＩＡＡＩＬＹＰＬＧＨＳＬＩＬＩＶＬＮＫＬＲＱＴＦＶＲＭＬＴＣＲＫＩＡＣＭＩ（配列番号３３）
ＴＡＳ２Ｒ９
ＭＰＳＡＩＥＡＩＹＩＩＬＩＡＧＥＬＴＩＧＩＷＧＮＧＦＩＶＬＶＮＣＩＤＷＬＫＲＲＤＩＳＬＩＤＩＩＬＩＳＬＡＩＳＲＩＣＬＬＣＶＩＳＬＤＧＦＦＭＬＬＦＰＧＴＹＧＮＳＶＬＶＳＩＶＷＷＴＦＡＮＳＳＬＷＦＴＳＣＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＩＳＨＰＦＦＦＷＬＫＬＫＩＮＫＶＭＬＡＩＬＬＧＳＦＬＩＳＬＩＩＳＶＰＫＮＤＤＭＷＹＨＬＦＫＶＳＨＥＥＮＩＴＷＫＦＫＶＳＫＩＰＧＴＦＫＱＬＴＬＮＬＧＶＭＶＰＦＩＬＣＬＩＳＦＦＬＬＬＦＳＬＶＲＨＴＫＱＩＲＬＨＡＴＧＦＲＤＰＳＴＥＡＨＭＲＡＩＫＡＶＩＩＦＬＬＬＬＩＶＹＹＰＶＦＬＶＭＴＳＳＡＬＩＰＱＧＫＬＶＬＭＩＧＤＩＶＴＶＩＦＰＳＳＨＳＦＩＬＩＭＧＮＳＫＬＲＥＡＦＬＫＭＬＲＦＶＫＣＦＬＲＲＲＫＰＦＶＰ（配列番号３４）
ＴＡＳ２Ｒ１０
ＭＬＲＷＥＧＩＦＩＦＶＷＳＥＳＶＦＧＶＬＧＮＧＦＩＧＬＶＮＣＩＤＣＡＫＮＫＬＳＴＩＧＦＩＬＴＧＬＡＩＳＲＩＦＬＩＷＩＩＩＴＤＧＦＩＱＩＦＳＰＮＩＹＡＳＧＮＬＩＥＹＩＳＹＦＷＶＩＧＮＱＳＳＭＷＦＡＴＳＬＳＩＦＹＦＬＫＩＡＮＦＳＹＩＦＬＷＬＫＳＲＴＮＭＶＬＰＦＭＩＶＦＬＬＩＳＳＬＬＮＦＡＹＩＡＫＩＬＮＤＹＫＭＫＮＤＴＶＷＤＬＮＭＹＫＳＥＹＦＩＫＱＩＬＬＮＬＧＶＩＦＦＦＴＬＳＬＩＴＣＩＦＬＩＩＳＬＷＲＨＮＲＱＭＱＳＶＴＧＬＲＤＳＮＴＥＡＨＶＫＡＭＫＶＬＩＳＦＩＩＬＦＩＬＹＦＩＧＭＡＩＥＩＳＣＦＴＶＲＥＮＫＬＬＬＭＦＧＭＴＴＴＡＩＹＰＷＧＨＳＦＩＬＩＬＧＮＳＫＬＫＱＡＳＬＲＶＬＱＱＬＫＣＣＥＫＲＫＮＬＲＶＴ（配列番号３５）
ＴＡＳ２Ｒ１３
ＭＥＳＡＬＰＳＩＦＴＬＶＩＩＡＥＦＩＩＧＮＬＳＮＧＦＩＶＬＩＮＣＩＤＷＶＳＫＲＥＬＳＳＶＤＫＬＬＩＩＬＡＩＳＲＩＧＬＩＷＥＩＬＶＳＷＦＬＡＬＨＹＬＡＩＦＶＳＧＴＧＬＲＩＭＩＦＳＷＩＶＳＮＨＦＮＬＷＬＡＴＩＦＳＩＦＹＬＬＫＩＡＳＦＳＳＰＡＦＬＹＬＫＷＲＶＮＫＶＩＬＭＩＬＬＧＴＬＶＦＬＦＬＮＬＩＱＩＮＭＨＩＫＤＷＬＤＲＹＥＲＮＴＴＷＮＦＳＭＳＤＦＥＴＦＳＶＳＶＫＦＴＭＴＭＦＳＬＴＰＦＴＶＡＦＩＳＦＬＬＬＩＦＳＬＱＫＨＬＱＫＭＱＬＮＹＫＧＨＲＤＰＲＴＫＶＨＴＮＡＬＫＩＶＩＳＦＬＬＦＹＡＳＦＦＬＣＶＬＩＳＷＩＳＥＬＹＱＮＴＶＩＹＭＬＣＥＴＩＧＶＦＳＰＳＳＨＳＦＬＬＩＬＧＮＡＫＬＲＱＡＦＬＬＶＡＡＫＶＷＡＫＲ（配列番号３６）
ＴＡＳ２Ｒ１４
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ＴＡＳ２Ｒ１６
ＭＩＰＩＱＬＴＶＦＦＭＩＩＹＶＬＥＳＬＴＩＩＶＱＳＳＬＩＶＡＶＬＧＲＥＷＬＱＶＲＲＬＭＰＶＤＭＩＬＩＳＬＧＩＳＲＦＣＬＱＷＡＳＭＬＮＦＣＳＹＦＮＬＮＹＶＬＣＮＬＴＩＴＷＥＦＦＮＩＬＴＦＷＬＮＳＬＬＴＶＦＹＣＩＫＶＳＳＦＴＨＨＩＦＬＷＬＲＷＲＩＬＲＬＦＰＷＩＬＬＧＳＬＭＩＴＣＶＴＩＩＰＳＡＩＧＮＹＩＱＩＱＬＬＴＭＥＨＬＰＲＮＳＴＶＴＤＫＬＥＮＦＨＱＹＱＦＱＡＨＴＶＡＬＶＩＰＦＩＬＦＬＡＳＴＩＦＬＭＡＳＬＴＫＱＩＱＨＨＳＴＧＨＣＮＰＳＭＫＡＲＦＴＡＬＲＳＬＡＶＬＦＩＶＦＴＳＹＦＬＴＩＬＩＴＩＩＧＴＬＦＤＫＲＣＷＬＷＶＷＥＡＦＶＹＡＦＩＬＭＨＳＴＳＬＭＬＳＳＰＴＬＫＲＩＬＫＧＫＣ（配列番号３８）
ＴＡＳ２Ｒ３８
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ＴＡＳ２Ｒ３９
ＭＬＧＲＣＦＰＰＤＴＫＥＫＱＱＬＲＭＴＫＬＣＤＰＡＥＳＥＬＳＰＦＬＩＴＬＩＬＡＶＬＬＡＥＹＬＩＧＩＩＡＮＧＦＩＭＡＩＨＡＡＥＷＶＱＮＫＡＶＳＴＳＧＲＩＬＶＦＬＳＶＳＲＩＡＬＱＳＬＭＭＬＥＩＴＩＳＳＴＳＬＳＦＹＳＥＤＡＶＹＹＡＦＫＩＳＦＩＦＬＮＦＣＳＬＷＦＡＡＷＬＳＦＦＹＦＶＫＩＡＮＦＳＹＰＬＦＬＫＬＲＷＲＩＴＧＬＩＰＷＬＬＷＬＳＶＦＩＳＦＳＨＳＭＦＣＩＮＩＣＴＶＹＣＮＳＦＰＩＨＳＳＮＳＴＫＫＴＹＬＳＥＩＮＷＧＬＡＦＦＦＮＬＧＩＶＴＰＬＩＭＦＩＬＴＡＴＬＬＩＬＳＬＫＲＨＴＬＨＭＧＳＮＡＴＧＳＮＤＰＳＭＥＡＨＭＧＡＩＫＡＩＳＹＦＬＩＬＹＩＦＮＡＶＡＬＦＩＹＬＳＮＭＦＤＩＮＳＬＷＮＬＣＱＩＩＭＡＡＹＰＡＳＨＳＩＬＬＩＱＤＮＰＧＬＲＲＡＷＫＲＬＱＬＲＬＨＬＹＰＫＥＷＴＬ（配列番号４０）
ＴＡＳ２Ｒ４０
ＭＡＴＶＮＴＤＡＴＤＫＤＩＳＫＦＫＶＴＦＴＬＷＳＧＩＥＣＩＴＧＩＬＧＳＧＦＩＴＡＩＹＧＡＥＷＡＲＧＫＴＬＰＴＧＤＲＩＭＬＭＬＳＦＳＲＬＬＬＱＩＷＭＭＬＥＮＩＦＳＬＬＦＲＩＶＹＮＱＮＳＶＹＩＬＦＫＶＩＴＶＦＬＮＨＳＮＬＷＦＡＡＷＬＫＶＦＹＣＬＲＩＡＮＦＮＨＰＬＦＦＬＭＫＲＫＩＩＶＬＭＰＷＬＬＲＬＳＶＬＶＳＬＳＦＳＦＰＬＳＲＤＶＦＶＹＶＮＳＳＩＰＩＰＳＳＮＳＴＥＫＫＹＦＳＥＴＮＭＶＮＬＶＦＦＹＮＭＧＩＦＶＰＬＩＭＦＩＬＡＡＴＬＬＩＬＳＬＫＲＨＴＬＨＭＧＳＮＡＴＧＳＲＤＰＳＭＫＡＨＩＧＡＩＫＡＴＳＹＦＬＩＬＹＩＦＮＡＩＡＬＦＬＳＴＳＮＩＦＤＴＹＳＳＷＮＩＬＣＫＩＩＭＡＡＹＰＡＧＨＳＶＱＬＩＬＧＮＰＧＬＲＲＡＷＫＲＦＱＨＱＶＰＬＹＬＫＧＱＴＬ（配列番号４１）
ＴＡＳ２Ｒ４１
ＭＱＡＡＬＴＡＦＦＶＬＬＦＳＬＬＳＬＬＧＩＡＡＮＧＦＩＶＬＶＬＧＲＥＷＬＲＹＧＲＬＬＰＬＤＭＩＬＩＳＬＧＡＳＲＦＣＬＱＬＶＧＴＶＨＮＦＹＹＳＡＱＫＶＥＹＳＧＧＬＧＲＱＦＦＨＬＨＷＨＦＬＮＳＡＴＦＷＦＣＳＷＬＳＶＬＦＣＶＫＩＡＮＩＴＨＳＴＦＬＷＬＫＷＲＦＬＧＰＷＬＬＬＧＳＶＬＩＳＦＩＩＴＬＬＦＦＷＶＹＰＶＹＱＥＦＬＩＲＫＦＳＧＮＭＴＹＫＷＮＴＲＩＥＴＹＹＦＰＳＬＫＬＶＩＷＳＩＰＦＳＶＦＬＶＳＩＭＬＬＩＮＳＬＲＲＨＴＱＲＭＱＨＮＧＨＳＬＱＤＰＳＴＱＡＨＴＲＡＬＫＳＬＩＳＦＬＩＬＹＡＬＳＦＬＳＬＩＩＤＡＡＫＦＩＳＭＱＮＤＦＹＷＰＷＱＩＡＶＹＬＣＩＳＶＨＰＦＩＬＩＦＳＮＬＫＬＲＳＶＦＳＱＬＬＬＬＡＲＧＦＷＶＡ（配列番号４２）
ＴＡＳ２Ｒ４３
ＭＩＴＦＬＰＩＩＦＳＳＬＶＷＴＦＶＩＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＳＩＥＳＦＫＲＱＫＩＳＦＡＤＱＩＬＴＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＬＬＬＮＷＹＳＴＶＬＮＰＡＦＮＳＶＥＶＲＴＴＡＹＮＩＷＡＶＩＮＨＦＳＮＷＬＡＴＴＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＦＳＮＦＩＦＬＨＬＫＲＲＶＫＳＶＩＬＶＭＬＬＧＰＬＬＦＬＡＣＨＬＦＶＩＮＭＮＥＩＶＲＴＫＥＦＥＧＮＭＴＷＫＩＫＬＫＳＡＭＹＦＳＮＭＴＶＴＭＶＡＮＬＶＰＦＴＬＴＬＬＳＦＭＬＬＩＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＱＬＲＧＫＧＳＱＤＰＳＴＫＶＨＩＫＡＬＱＴＶＩＳＦＬＬＬＣＡＩＹＦＬＳＩＭＩＳＶＷＳＦＧＳＬＥＮＫＰＶＦＭＦＣＫＡＩＲＦＳＹＰＳＩＨＰＦＩＬＩＷＧＮＫＫＬＫＱＴＦＬＳＶＦＷＱＭＲＹＷＶＫＧＥＫＴＳＳＰ（配列番号４３）
ＴＡＳ２Ｒ４４
ＭＴＴＦＩＰＩＩＦＳＳＷＷＬＦＶＩＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＳＩＥＲＶＫＲＱＫＩＳＦＡＤＱＩＬＴＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＬＬＬＮＷＹＳＴＶＦＮＰＡＦＹＳＶＥＶＲＴＴＡＹＶＷＡＶＴＧＨＦＳＮＷＬＡＴＳＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＦＳＮＬＩＦＬＨＬＫＲＲＶＫＳＶＩＬＶＭＬＬＧＰＬＬＦＬＡＣＱＬＦＶＩＮＭＫＥＩＶＲＴＫＥＹＥＧＮＭＴＷＫＩＫＬＲＳＡＶＹＬＳＤＡＴＶＴＴＬＧＮＬＶＰＦＴＬＴＬＬＣＦＬＬＬＩＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＱＬＨＧＫＧＳＱＤＰＳＴＫＶＨＩＫＡＬＱＴＶＩＦＦＬＬＬＣＡＶＹＦＬＳＩＭＩＳＶＷＳＦＧＳＬＥＮＫＰＶＦＭＦＣＫＡＩＲＦＳＹＰＳＩＨＰＦＩＬＩＷＧＮＫＫＬＫＱＴＦＬＳＶＬＲＱＶＲＹＷ（配列番号４４）
ＴＡＳ２Ｒ４５
ＭＩＴＦＬＰＩＩＦＳＩＬＶＷＴＦＶＩＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＳＴＥＷＶＫＲＱＫＩＳＦＡＤＱＩＶＴＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＬＬＬＮＷＹＳＴＶＬＮＰＡＦＣＳＶＥＬＲＴＴＡＹＮＩＷＡＶＴＧＨＦＳＮＷＰＡＴＳＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＦＳＮＬＩＦＬＲＬＫＲＲＶＫＳＶＩＬＶＶＬＬＧＰＬＬＦＬＡＣＨＬＦＷＮＭＮＱＩＶＷＴＫＥＹＥＧＮＭＴＷＫＩＫＬＲＲＡＭＹＬＳＤＴＴＶＴＭＬＡＮＬＶＰＦＴＶＴＬＩＳＦＬＬＬＶＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＱＬＨＧＫＧＳＱＤＰＳＴＫＶＨＩＫＶＬＱＴＶＩＳＦＦＬＬＲＡＩＹＦＶＳＶＩＩＳＶＷＳＦＫＮＬＥＮＫＰＶＦＭＦＣＱＡＩＧＦＳＣＳＳＡＨＰＦＩＬＩＷＧＮＫＫＬＫＱＴＹＬＳＶＬＷＱＭＲＹ（配列番号４５）
ＴＡＳ２Ｒ４６
ＭＩＴＦＬＰＩＩＦＳＩＬＩＷＴＦＶＩＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＳＩＥＷＦＫＲＱＫＩＳＦＡＤＱＩＬＴＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＬＶＬＮＷＹＡＴＥＬＮＰＡＦＮＳＩＥＶＲＩＴＡＹＮＶＷＡＶＩＮＨＦＳＮＷＬＡＴＳＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＦＳＮＬＩＦＬＨＬＫＲＲＶＫＳＷＬＶＩＬＬＧＰＬＬＦＬＶＣＨＬＦＶＩＮＭＮＱＩＩＷＴＫＥＹＥＧＮＭＴＷＫＩＫＬＲＳＡＭＹＬＳＮＴＴＶＴＩＬＡＮＬＶＰＦＴＬＴＬＩＳＦＬＬＬＩＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＱＬＨＧＫＧＳＱＤＰＳＭＫＶＨＩＫＡＬＱＴＶＴＳＦＬＬＬＣＡＩＹＦＬＳＩＩＭＳＶＷＳＦＥＳＬＥＮＫＰＶＦＭＦＣＥＡＩＡＦＳＹＰＳＴＨＰＦＩＬＩＷＧＮＫＫＬＫＱＴＦＬＳＶＬＷＨＶＲＹＷＶＫＧＥＫＰＳＳＳ（配列番号４６）
ＴＡＳ２Ｒ４７
ＭＩＴＦＬＰＩＩＦＳＩＬＩＶＶＩＦＶＩＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＳＩＥＷＶＫＲＱＫＩＳＦＶＤＱＩＬＴＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＬＬＬＨＷＹＡＴＱＬＮＰＡＦＹＳＶＥＶＲＩＴＡＹＮＶＷＡＶＴＮＨＦＳＳＷＬＡＴＳＬＳＭＦＹＬＬＲＩＡＮＦＳＮＬＩＦＬＲＩＫＲＲＶＫＳＷＬＶＩＬＬＧＰＬＬＦＬＶＣＨＬＦＶＩＮＭＤＥＴＶＷＴＫＥＹＥＧＶＴＷＫＩＫＬＲＳＡＭＹＨＳＮＭＴＬＴＭＬＡＮＦＶＰＬＴＬＴＬＩＳＦＬＬＬＩＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＱＬＨＧＫＧＳＱＤＰＳＴＫＶＨＩＫＡＬＱＴＶＴＳＦＬＬＬＣＡＩＹＦＬＳＭＩＩＳＶＣＮＬＧＲＬＥＫＱＰＶＦＭＦＣＱＡＩＩＦＳＹＰＳＴＨＰＦＩＬＩＬＧＮＫＫＬＫＱＩＦＬＳＶＬＲＨＶＲＹＷＶＫＤＲＳＬＲＬＨＲＦＴＲＡＡＬＣＫＧ（配列番号４７）
ＴＡＳ２Ｒ４８
ＭＭＣＦＬＬＩＩＳＳＩＬＷＦＡＦＶＬＧＶＡＮＧＦＩＡＬＶＶＩＤＷＶＮＴＲＫＩＳＳＡＥＱＩＬＴＡＬＷＳＲＩＧＬＬＷＶＭＬＦＬＷＹＡＴＶＦＮＳＡＬＹＧＬＥＶＲＩＶＡＳＮＡＷＡＶＴＮＨＦＳＭＷＬＡＡＳＬＳＩＦＣＬＬＫＩＡＮＦＳＮＬＩＳＬＨＬＫＫＲＩＫＳＶＶＬＶＩＬＬＧＰＬＶＦＬＩＣＮＬＡＶＩＴＭＤＥＲＶＷＴＫＥＹＥＧＶＴＷＫＩＫＬＲＮＡＩＨＬＳＳＬＴＶＴＴＬＡＮＬＩＰＦＴＬＳＬＩＣＦＬＬＬＩＣＳＬＣＫＨＬＫＫＭＲＬＨＳＫＧＳＱＤＰＳＴＫＶＨＩＫＡＬＱＴＶＴＳＦＬＭＬＦＡＩＹＦＬＣＩＩＴＳＴＷＮＬＲＴＱＱＳＫＬＶＬＬＬＣＱＴＶＡＩＭＹＰＳＦＨＳＦＩＬＩＭＧＳＲＫＬＫＱＴＦＬＳＶＬＷＱＭＴＲ（配列番号４８）
ＴＡＳ２Ｒ４９
ＭＭＳＦＬＨＩＶＦＳＩＬＶＷＡＦＩＬＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＩＮＦＩＡＷＶＫＲＱＫＩＳＳＡＤＱＩＩＡＡＬＡＶＳＲＶＧＬＬＷＶＩＬＬＨＷＹＳＴＶＬＮＰＴＳＳＮＬＫＶＩＩＦＩＳＮＡＷＡＶＴＮＨＦＳＩＷＬＡＴＳＬＳＩＦＹＬＬＫＩＶＮＦＳＲＬＩＦＨＨＬＫＲＫＡＫＳＷＬＶＩＶＬＧＳＬＦＦＬＶＣＨＬＶＭＫＨＴＹＩＮＶＷＴＥＥＣＥＧＮＶＴＷＫＩＫＬＲＮＡＭＨＬＳＮＬＴＶＡＭＬＡＮＬＩＰＦＴＬＴＬＩＳＦＬＬＬＩＹＳＬＣＫＨＬＫＫＭＱＬＨＧＫＧＳＱＤＰＳＴＫＩＨＩＫＡＬＱＴＶＴＳＦＬＩＬＬＡＩＹＦＬＣＬＩＩＳＦＷＮＦＫＭＲＰＫＥＩＶＬＭＬＣＱＡＦＧＩＩＹＰＳＦＨＳＦＩＬＩＷＧＮＫＴＬＫＱＴＦＬＳＶＬＷＱＶＴＣＷＡＫＧＱＮＱＳＴＰ（配列番号４９）
ＴＡＳ２Ｒ５０
ＭＩＴＦＬＹＩＦＦＳＩＬＩＭＶＬＦＶＬＧＮＦＡＮＧＦＩＡＬＶＮＦＩＤＷＶＫＲＫＫＩＳＳＡＤＱＩＬＴＡＬＡＶＳＲＩＧＬＬＷＡＬＬＬＮＷＹＬＴＶＬＮＰＡＦＹＳＶＥＬＲＩＴＳＹＮＡＷＷＴＮＨＦＳＭＷＬＡＡＮＬＳＩＦＹＬＬＫＩＡＮＦＳＮＬＬＦＬＨＬＫＲＲＶＲＳＶＩＬＶＩＬＬＧＴＬＩＦＬＶＣＨＬＬＶＡＮＭＤＥＳＭＷＡＥＥＹＥＧＮＭＴＧＫＭＫＬＲＮＴＶＨＬＳＹＬＴＶＴＴＬＷＳＦＩＰＦＴＬＳＬＩＳＦＬＭＬＩＣＳＬＹＫＨＬＫＫＭＱＬＨＧＥＧＳＱＤＬＳＴＫＶＨＩＫＡＬＱＴＬＩＳＦＬＬＬＣＡＩＦＦＬＦＬＩＶＳＶＷＳＰＲＲＬＲＮＤＰＷＭＶＳＫＡＶＧＮＩＹＬＡＦＤＳＦＩＬＩＷＲＴＫＫＬＫＨＴＦＬＬＩＬＣＱＩＲＣ（配列番号５０）
ＴＡＳ２Ｒ５５
ＭＡＴＥＬＤＫＩＦＬＩＬＡＩＡＥＦＩＩＳＭＬＧＮＶＦＩＧＬＶＮＣＳＥＧＩＫＮＱＫＶＦＳＡＤＦＩＬＴＣＬＡＩＳＴＩＧＱＬＬＶＩＬＦＤＳＦＬＶＧＬＡＳＨＬＹＴＴＹＲＬＧＫＴＶＩＭＬＷＨＭＴＮＨＬＴＴＷＬＡＴＣＬＳＩＦＹＦＦＫＩＡＨＦＰＨＳＬＦＬＷＬＲＷＲＭＮＧＭＩＶＭＬＬＩＬＳＬＦＬＬＩＦＤＳＬＶＬＥＩＦＩＤＩＳＬＮＩＩＤＫＳＮＬＴＬＹＬＤＥＳＫＴＬＹＤＫＬＳＩＬＫＴＬＬＳＬＴＳＦＩＰＦＳＬＦＬＴＳＬＬＦＬＦＬＳＬＶＲＨＴＲＮＬＫＬＳＳＬＧＳＲＤＳＳＴＥＡＨＲＲＡＭＫＭＶＭＳＦＬＦＬＦＩＶＨＦＦＳＬＱＶＡＮＧＩＦＦＭＬＷＮＫＹＩＫＦＶＭＬＡＬＮＡＦＰＳＣＨＳＦＩＬＩＬＧＮＳＫＬＲＱＴＡＶＲＬＬＷＨＬＲＹＴＫＴＰＮＡＬＰＬ（配列番号５１）
ＴＡＳ２Ｒ６０
ＭＮＧＤＨＭＶＬＧＳＳＶＴＤＫＫＡＩＩＬＶＴＩＬＬＬＬＲＬＶＡＩＡＧＮＧＦＩＴＡＡＬＧＶＥＷＶＬＲＲＭＬＬＰＣＤＫＬＬＶＳＬＧＡＳＲＦＣＬＱＳＶＶＭＧＫＴＩＹＶＦＬＨＰＭＡＦＰＹＮＰＶＬＱＦＬＡＦＱＷＤＦＬＮＡＡＴＬＷＳＳＴＷＬＳＶＦＹＣＶＫＩＡＴＦＴＨＰＶＦＦＷＬＫＨＫＬＳＧＷＬＰＷＭＬＦＳＳＶＧＬＳＳＦＴＴＩＬＦＦＩＧＮＨＲＭＹＱＮＹＬＲＮＨＬＱＰＷＮＶＴＧＤＳＩＲＳＹＣＥＫＦＹＬＦＰＬＫＭＩＴＷＴＭＰＴＡＶＦＦＩＣＭＩＬＬＩＴＳＬＧＲＨＲＫＫＡＬＬＴＴＳＧＦＲＥＰＳＶＱＡＨＩＫＡＬＬＡＬＬＳＦＡＭＬＦＩＳＹＦＬＳＬＶＦＳＡＡＧＩＦＰＰＬＤＦＫＦＷＶＷＥＳ￥ＴＹＬＣＡＡＶＨＰＩＩＬＬＦＳＮＣＲＬＲＡＶＬＫＳＲＲＳＳＲＣＧＴＰ（配列番号５２）
マウスＧｎａ１５（Ｇα１５）
ＭＡＲＳＴＷＧＣＣＷＣＴＫＴＡＡＲＤＮＲＫＫＲＫＧＧＳＧＫＳＴＫＭＲＨＧＶＧＹＳＤＲＲＡＲＹＮＶＳＭＡＭＤＡＭＤＲＳＲＤＳＫＨＡＳＶＭＴＤＹＫＶＳＴＫＹＡＶＡＭＹＷＲＤＡＧＲＡＣＹＲＲＲＨＤＳＡＶＹＹＳＨＲＳＤＳＹＴＡＤＶＲＳＲＭＴＴＧＮＹＣＳＶＫＫＴＫＲＶＤＶＧＧＲＳＲＲＫＷＨＣＮＶＡＹＡＳＳＹＤＣＮＤＮＲＭＳＡＳＴＷＫＳＴＳＶＮＫＴＤＤＫＨＴＳＨＡＴＹＳＧＲＲＤＡＡＡＫＳＤＭＹＡＲＶＹＡＳＣＡＤＧＧＲＫＧＳＲＡＲＲＡＨＴＣＡＴＤＴＳＶＲＳＶＫＤＶＲＤＳＶＡＲＹＤＮ（配列番号５３）
ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶハプロタイプ）
ＭＬＴＬＴＲＩＲＴＶＳＹＥＶＲＳＴＦＬＦＩＳＶＬＥＦＡＶＧＦＬＴＮＡＦＶＦＬＶＮＦＷＤＷＫＲＱＰＬＳＮＳＤＣＶＬＬＣＬＳＩＳＲＬＦＬＨＧＬＬＦＬＳＡＩＱＬＴＨＦＱＫＬＳＥＰＬＮＨＳＹＱＡＩＩＭＬＷＭＩＡＮＱＡＮＬＷＬＡＡＣＬＳＬＬＹＣＳＫＬＩＲＦＳＨＴＦＬＩＣＬＡＳＷＶＳＲＫＩＳＱＭＬＬＧＩＩＬＣＳＣＩＣＴＶＬＣＶＷＣＦＦＳＲＰＨＦＴＶＴＴＶＬＦＭＮＮＮＴＲＬＮＷＱＩＫＤＬＮＬＦＹＳＦＬＦＣＹＬＷＳＶＰＰＦＬＬＦＬＶＳＳＧＭＬＴＶＳＬＧＲＨＭＲＴＭＫＶＹＴＲＮＳＲＤＰＳＬＥＡＨＩＫＡＬＫＳＬＶＳＦＦＣＦＦＶＩＳＳＣＡＡＦＩＳＶＰＬＬＩＬＷＲＤＫＩＧＶＭＶＣＶＧＩＭＡＡＣＰＳＧＨＡＡＶＬＩＳＧＮＡＫＬＲＲＡＶＭＴＩＬＬＷＡＱＳＳＬＫＶＲＡＤＨＫＡＤＳＲＴＬＣ（配列番号５４）
ＴＡＳ２Ｒ３８（ＰＡＶハプロタイプ）ＣＤＳ
ＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣＡＴＣＣＧＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＡＴＧＡＡＧＴＣＡＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＣＴＣＧＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＣＧＣＧＡＣＡＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＡＧＡＧＣＣＧＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＡ（配列番号５５）
Figure 2016523512
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Claims (49)

  1. カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法であって、
    ａ）第一の細胞および第二の細胞を準備し、
    各細胞が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現し、
    各細胞が同じ１つまたは複数の苦味受容体を発現することと；
    ｂ）前記第一の細胞と、味物質とを接触させ、
    前記味物質が１つまたは複数の前記カリウム塩応答性苦味受容体を活性化することと；
    ｃ）前記第二の細胞と、被験化合物および前記味物質とを接触させることと；
    ｄ）前記第一の細胞および前記第二の細胞の苦味受容体活性化をアッセイすることと；
    ｅ）前記第一の細胞の苦味受容体活性化と、前記第二の細胞の苦味受容体活性化とを比較することと
    を含み、
    前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、
    前記第二の細胞の苦味受容体活性が前記第一の細胞の苦味受容体活性と異なる場合、前記被験化合物がカリウム塩による苦味の修飾物質である、
    方法。
  2. 前記第一の細胞を、前記苦味受容体活性のアッセイの後に洗浄して前記第二の細胞とする、請求項１に記載の方法。
  3. カリウム塩による苦味を選択的に修飾する化合物を特定する方法であって、
    ａ）第一の細胞系パネルおよび第二の細胞系パネルを準備し、
    各細胞系が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現し、
    各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、かつ
    前記第一のパネルと前記第二のパネルが同じ細胞系を含むことと；
    ｂ）前記第一のパネルの各細胞系と、味物質とを接触させ、
    前記味物質が前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも２つの受容体を活性化することと；
    ｃ）前記第二のパネルの各細胞系と、被験化合物および前記味物質とを接触させることと；
    ｄ）各細胞系の苦味受容体活性化をアッセイすることと
    を含み、
    前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、
    前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも２つの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる場合、前記被験化合物がカリウム塩による苦味の選択的修飾物質である、
    方法。
  4. 前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも３つの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも４つの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる、請求項３に記載の方法。
  6. 前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも５つの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる、請求項３に記載の方法。
  7. 前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも６つの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる、請求項３に記載の方法。
  8. 前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも７つの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる、請求項３に記載の方法。
  9. 前記カリウム塩応答性苦味受容体それぞれの受容体の苦味受容体活性が、前記第二のパネルと前記第一のパネルとを比較して異なる、請求項３に記載の方法。
  10. 各パネルが、ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ３、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ５、ＴＡＳ２Ｒ７、ＴＡＳ２Ｒ８、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１０、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４０、ＴＡＳ２Ｒ４１、ＴＡＳ２Ｒ４３、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４５、ＴＡＳ２Ｒ４６、ＴＡＳ２Ｒ４７、ＴＡＳ２Ｒ４８、ＴＡＳ２Ｒ４９、ＴＡＳ２Ｒ５０、ＴＡＳ２Ｒ５５およびＴＡＳ２Ｒ６０苦味受容体からなる群より選択される苦味受容体を発現する細胞系を含み、
    各受容体が少なくとも１つの細胞系に発現し、
    前記第一のパネルと前記第二のパネルが同じ細胞系を含む、
    請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記第一のパネルの細胞系を、前記苦味受容体活性のアッセイの後に洗浄して前記第二の細胞系パネルとする、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. カリウム塩による苦味を修飾する化合物を特定する方法であって、
    ａ）細胞を準備し、
    前記細胞が１つまたは複数のカリウム塩応答性苦味受容体を発現することと；
    ｂ）前記細胞と、味物質とを接触させ、
    前記味物質が１つまたは複数の前記カリウム塩応答性苦味受容体を活性化することと；
    ｃ）前記細胞の苦味受容体活性化をアッセイすることと；
    ｄ）前記細胞を洗浄することと；
    ｅ）前記細胞と、被験化合物および前記味物質とを接触させることと；
    ｆ）前記細胞の苦味受容体活性化をアッセイすることと；
    ｇ）段階（ｃ）の前記細胞の苦味受容体活性化と、段階（ｆ）の前記細胞の苦味受容体活性化とを比較することと
    を含み、
    前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択され、
    段階（ｆ）の苦味受容体活性が段階（ｃ）の苦味受容体活性と異なる場合、前記被験化合物がカリウム塩による苦味の修飾物質である、
    方法。
  13. 前記被験化合物と前記味物質の存在下での苦味受容体活性が、前記被験化合物無しでの前記味物質の存在下での苦味受容体活性よりも低い場合、前記被験化合物がカリウム塩またはカリウムによる苦味の抑制物質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記被験化合物と前記味物質の存在下での苦味受容体活性が、前記被験化合物無しでの前記味物質の存在下での苦味受容体活性よりも高い場合、前記被験化合物がカリウム塩またはカリウムによる苦味の増強物質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記カリウム塩応答性苦味受容体のうち少なくとも１つの受容体が、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記味物質が、カリウム含有味物質または普遍的苦味化合物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記カリウム含有味物質が、ＫＣｌ、乳酸カリウム、アセスルファムＫ、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記味物質が、ＫＣｌ、乳酸カリウムまたはアセスルファムＫのいずれでもない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記カリウム含有味物質が、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、硝酸カリウム、リン酸カリウム（二塩基性）、グルコン酸カリウム、酢酸カリウムおよび硫酸カリウムからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記苦味受容体が、Ｇタンパク質と複合体を形成している、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記Ｇタンパク質が、Ｇｑタンパク質、αトランスデューシンまたはαガストデューシンである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記Ｇｑタンパク質がＧα１５タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記苦味受容体活性が、細胞内カルシウム濃度を測定することによって決定される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. カルシウム感受性蛍光色素を用いて細胞内カルシウムの濃度を決定する、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記カルシウム感受性蛍光色素が、Ｆｌｕｏ−４またはＣａｌｃｉｕｍ−３色素である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記第一の細胞および前記第二の細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系に存在する、請求項１〜２および請求項１１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第一の細胞および前記第二の細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞系パネルに存在する、請求項１〜２および請求項１１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記普遍的苦味化合物が、安息香酸デナトニウムまたはサッカリンデナトニウムである、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記カリウム塩がＫＣｌであり、前記カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される、請求項１〜１７および請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記カリウム塩がアセスルファムＫであり、前記カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ３９からなる群より選択される、請求項１〜１７および請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  32. ＴＡＳ２Ｒ１、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ１６およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記カリウム塩が乳酸カリウムであり、前記カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４、ＴＡＳ２Ｒ４６およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される、請求項１〜１７および請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記カリウム塩が安息香酸カリウムである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記カリウム塩がソルビン酸カリウムである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記カリウム塩が硝酸カリウムである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記カリウム塩がリン酸カリウム（二塩基性）である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される請求項３８に記載の方法。
  40. 前記カリウム塩がグルコン酸カリウムであり、前記カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記カリウム塩が酢酸カリウムであり、前記カリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ４４およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記カリウム塩が硫酸カリウムである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  44. 第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含み、前記第二のカリウム塩応答性苦味受容体がＴＡＳ２Ｒ６０である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４、ＴＡＳ２Ｒ３８およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  46. ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記カリウム塩応答性苦味受容体が、ＴＡＳ２Ｒ４、ＴＡＳ２Ｒ９、ＴＡＳ２Ｒ１３、ＴＡＳ２Ｒ１４およびＴＡＳ２Ｒ４４からなる群より選択される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  48. ＴＡＳ２Ｒ３８、ＴＡＳ２Ｒ３９およびＴＡＳ２Ｒ６０からなる群より選択される第二のカリウム塩応答性苦味受容体をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ＴＡＳ２Ｒ３８がＰＡＶ ＴＡＳ２Ｒ３８である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。

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