JP2010508041A - ヒトt2r受容体を特異的に活性化する苦味リガンドの同定およびヒト苦味モジュレータを同定するための関連アッセイ - Google Patents
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Abstract
【課題】 T2Rメンバーが苦味を制御することおよび胃腸機能におけるそれらの可能な役割の理解にかかわらず、ヒト苦味T2R味覚受容体を活性化する特異的リガンドを同定する必要性が存在する。異なるT2R、特にヒトT2Rの結合特性についてさらなる理解を深めることは、所望の味覚調節特性を有する、すなわち、特異的苦味化合物の味覚を遮断または抑制する化合物を選択するその使用をさらに促進するために、非常に有益であろう。
【解決手段】 本発明は、T2R味覚受容体ファミリーにおける特異的ヒト味覚受容体が、特定の苦味化合物に応答する、という発見に関する。また、本発明は、同一苦味リガンドとの機能的アッセイにおける、特異的hT2R9対立遺伝子およびそれらの異種の活性の発見にも関する。本発明は、特異的苦味リガンドおよび関連する化合物による、これらの味覚受容体の活性化を調節するリガンドを同定するためのアッセイにおける、これらのT2R受容体の使用にも関する。これらの化合物は、T2R関連の苦味を改変する(遮断する)ために、食物、飲料、化粧品、および医薬品において添加物として使用、および/またはそれらから除去され得る。また、T2Rリガンドは、T2R関連の胃腸および代謝機能を治療および調節する、ならびに胃腸および代謝疾患、例えば摂食障害、食物過敏、食物吸収、肥満、糖尿病、クローン病、セリアック病等を治療するための治療薬として使用され得る。
【選択図】 図1
【解決手段】 本発明は、T2R味覚受容体ファミリーにおける特異的ヒト味覚受容体が、特定の苦味化合物に応答する、という発見に関する。また、本発明は、同一苦味リガンドとの機能的アッセイにおける、特異的hT2R9対立遺伝子およびそれらの異種の活性の発見にも関する。本発明は、特異的苦味リガンドおよび関連する化合物による、これらの味覚受容体の活性化を調節するリガンドを同定するためのアッセイにおける、これらのT2R受容体の使用にも関する。これらの化合物は、T2R関連の苦味を改変する(遮断する)ために、食物、飲料、化粧品、および医薬品において添加物として使用、および/またはそれらから除去され得る。また、T2Rリガンドは、T2R関連の胃腸および代謝機能を治療および調節する、ならびに胃腸および代謝疾患、例えば摂食障害、食物過敏、食物吸収、肥満、糖尿病、クローン病、セリアック病等を治療するための治療薬として使用され得る。
【選択図】 図1
Description
本出願は、2006年11月1日出願の米国特許出願第11/555,617号(同様に2002年7月10日出願の米国特許出願第10/191,058号の一部継続出願であり、さらに、現在、米国特許第7,105,650号である、2001年4月5日出願の米国特許出願第09/825,882号の一部分である2003年12月1日出願の米国特許出願第10/742,209号の一部継続出願でもある)の優先権を主張するもの及び一部継続出願であり、これらの出願のすべては、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。これらの出願は、hT2Rの同定、および特異的T2Rを活性化するリガンドの同定のためのアッセイにおけるその使用に関する。これらのリガンドは、味覚知覚、特に苦味を調節するために有用である。
本発明は、苦味味覚に関与するT2Rファミリーにおける以前に報告された多くのヒトGタンパク質共役受容体(GPCR)を活性化する苦味化合物の解明に関する。具体的には、本発明は、hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76と特異的に結合し、活性化する苦味リガンドの発見に関与する。したがって、上記の同定されたヒトT2Rは、これらのリガンドおよび他のリガンドと関連する苦味を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するために使用され得る。
さらに具体的には、本発見は、オルソログ、スプライス変異、単一ヌクレオチド多型(SNPS)、およびその遺伝的に改変した変異体を含む該対象ヒト味覚受容体、そのフラグメント、もしくは変異形、またはキメラが、苦味リガンドの苦味を調節する(好ましくは遮断する)化合物、ならびに構造上関連する化合物、およびこれらの受容体を活性化する他の化合物を同定するためのアッセイ、好ましくはハイスループット細胞ベースのアッセイにおいて有用であることを示す。これらのアッセイを使用して同定された化合物は、その味覚を向上させるために、食物、飲料または医薬品において添加物として使用され得る。さらに、本発明は、対象T2Rを活性化する苦味化合物を減少または除去するように処置および作製される改良された食物、飲料および医薬品に関する。
また、本発明は、例えば、食物過敏、吸収、胃腸ホルモンおよびペプチド分泌の制御、輸送および吸収、舌および胃腸系における毒素に対する応答等の胃腸機能を調節することができる化合物を同定するための、ならびに摂食障害、糖尿病、肥満症等の胃腸および代謝疾患の治療するための治療的スクリーニングにおける、対象T2R遺伝子およびそれを発現する対応するポリペプチドおよび細胞の使用に関する。
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ヒトが認識できる基本的な味覚モダリティのうちの1つが苦味である。苦味の生理機能は、ごく最近までほとんど解明されていなかった。最近の研究により、味覚の生物学が明らかになり始めている(Lindemann,Nature(2001))。現在、苦味化合物の多くは、細胞表面受容体と相互作用することによって、苦味を生成することが知られている。これらの受容体は、細胞内Gタンパク質と相互作用する7つの膜貫通ドメイン受容体ファミリーに属する。T2Rと称されるGPCRの新規ファミリーは、ヒトおよびげっ歯類において同定されている(Adler et al.,Cell 100(6):693−702(2000);Chandrashekar et al.,Cell 100(6):703−711(2000);Matsunami H,Montmayeur J P,Buck L B.Nature 404(6778):601−4(2000))。主題発明前のいくつかの一連の根拠により、T2Rが苦味化合物に対する応答を媒介することが示唆された。第1に、T2R遺伝子は、舌および口蓋上皮の味覚受容体細胞のサブセットに特異的に発現される。第2に、ヒトT2R(hT2R1)のうちの1つに対する遺伝子は、ヒトにおける苦味化合物6−n−プロピル−2−チオウラシルに対する感受性と関係する染色体座内に位置している(Adler et al.,(Id.)(2000))。第3に、マウスT2R(mT2R5)のうちの1つは、マウスにおける苦味化合物シクロヘキシミドに対する感受性に関係する染色体座内に位置している。mT2R5は、味覚細胞内に特異的に発現し、苦味刺激伝達に関係するガストデューシン、Gタンパク質を活性化できることもまた示された(Wong et al.,Nature 381:796−800(1996))。mT2R5によるガストデューシン活性化は、シクロヘキシミドに応じてのみ生じる(Chandrashekar et al.,(Id.)(2000)。したがって、mT2Rファミリーは、マウスにおける苦味に対する応答を媒介し、一方、hT2Rファミリーは、ヒトにおける苦味に対する応答を媒介することが提示されている。1つのヒトT2Rのみが同定された苦味リガンドを有していると示唆され、hT2R4は、デナトニウムによって活性化されることが示された(Chandrashekar et al.,(Id.)2000)。しかしながら、研究で使用された有効なデナトニウム濃度(1.5mM)は、異常に高く、すなわち、ヒトに対するデナトニウムの既報告苦味閾値よりも105倍高かった(Saroli,Naturwissenschaften 71:428−429(1984))。したがって、特異的苦味リガンドは、いかなるhT2Rにも信ぴょう性をもって一致しなかった。また、各hT2Rは、多数の苦味リガンドを結合できることもまた示唆されている。この仮説は、hT2Rファミリーが24のみの同定されたメンバーから成り、それに対してヒトは、何百もの異なる化合物を苦味として認識できるという事実に基づいている。hT2Rの配列は、以前に報告されており、Zukerら(WO第01/18050 A2号,(2001))およびAdlerら(WO第01/77676 A1号(2001))による公開PCT出願に開示され、両方とも参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
T2R機能を研究することの難点の1つは、これらの受容体が、培養された哺乳類細胞株に容易に発現されないことである。T2R発現を改善するため、良好に発現されたGPCR、ロドプシンからのN末端配列が、T2R配列に付着された(Chandrashekar et al.,(Id.)2000)。このN末端タグは、利用可能な抗体に起因するタンパク質発現の容易な監視もまた可能にした。さらに、異なるN末端タグであるSSTR3タグ(Bufe et al.、Nat.Genet.32:397−400(2002))は、T2R発現を改善するために使用されている。ロドプシンタグの取り込みが、哺乳類細胞株における一部のT2Rの発現を改善させた一方で、それらの多くは、依然として機能的研究によって十分なほど発現されなかった。異なるアプローチにおいて、mT2R5は、昆虫Sf9細胞内にうまく発現され、生化学GTPγS結合アッセイを使用する機能的研究に使用された(Chandrashekar et al.,(Id.)2000)。
出願人の以前の特許出願、現在特許権を有する米国特許出願第09/825,882号において、出願者は、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R63、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、およびhT2R75を含む、多数の当時の新規ヒト味覚受容体に対する核酸配列およびポリペプチド配列を同定し、提供した。さらに、米国特許出願第10/628,464号において、出願者は、hT2R76としてその中で称される、別の同定された新規ヒト味覚受容体に対するポリペプチドおよびDNA配列を提供した。
また、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第10/191,058号において、出願者は、3つの異なるヒトT2Rを特異的に活性化するリガンドを発見した。また、出願者は、さらに他のヒトT2Rと特異的に結合する苦味リガンドをさらに同定し、関連アッセイを提供する、米国特許出願第11/455,693号を最近出願した。
また、本発明の実用性に関連して、T2RおよびT1R味覚受容体の両方が胃腸系に発現されることが報告されている。例えば、Wu et al.,Proc,Natl.Acad.Sci,USA 99(4):2392−7(2002)は、T2Rが、ガストデューシンおよびトランスデューシンサブユニットと同様に、腸管内分泌細胞(STC1細胞)内に発現されること、ならびにこれらの細胞が胃腸管の苦味リガンドに応答する可能性が高いことを報告している。また、苦味刺激は、腸管内分泌STC−1細胞においてCa++シグナル、およびコレシストキニン(CCK)放出を誘発することがChen et al.,Amer J.Physiol.Cell Physiol.291(4):C726−39(2006)によって報告されている。また、Rozengurt,A J Physiol Gastrointest Liver Physiol 291(2):G171−7(2006)は、腸内の味覚受容体が、消化機能、ならびにホルモンおよび/またはニュートロン経路の制御を送る分子に関与する可能性があること、ならびに有害な薬および生存応答の検出に影響を与える可能性があることを報告している。さらに、Sternini Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.292(2):G457−61(2007)は、腸内の味覚受容体が、分子過敏、栄養吸収、有害物質からの保護等の胃腸機能に関与し得ることを報告しており、さらに、これらの機構の理解が、栄養補給障害および炎症等の病状および状態と関係していることを示唆している。さらに、近年、Mace et al.,J Physiol.2007[Epub]によって、T2RおよびT1RがホスホリパーゼCベータ2、PLCベータ2を活性化すること、舌細胞内に存在するものと同様に、腸内に分子腸管過敏システムが腸内に存在する可能性と、味覚受容体を発現する刷子細胞または単生化学感覚細胞等の胃腸細胞が、GLUT2増加をもたらす可能性があり、栄養素感知、ならびに肥満症および糖尿病の治療における栄養素に影響を与える可能性があることが示唆されている。また、Cui et al,Curr Pharm Des.12(35):4591−600(2006)は、腸内に発現されるT1Rが、肥満症および糖尿病の治療における化合物、ならびに人工甘味料のためのアッセイに使用され得ることを示唆している。
しかしながら、報告、およびT2Rメンバーが苦味を制御することおよび胃腸機能におけるそれらの可能な役割の理解にかかわらず、ヒト苦味T2R味覚受容体を活性化する特異的リガンドを同定する必要性が存在する。異なるT2R、特にヒトT2Rの結合特性についてさらなる理解を深めることは、所望の味覚調節特性を有する、すなわち、特異的苦味化合物の味覚を遮断または抑制する化合物を選択するその使用をさらに促進するために、非常に有益であろう。また、胃腸機能および肥満症、糖尿病、食物吸収、食物過敏、摂食障害等の関連疾患を、治療および調節するために、ならびにGLUT2、コレシストキニン等の関連ホルモンおよびペプチドの制御における、化合物の同定を提供する。
その目的のために、本発明は、T2Rファミリー、特にhT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76における合計23のヒト味覚受容体を特異的に結合する、および/または活性化するリガンドの発見に関する。
これらの発見は、特異的苦味リガンドの存在下および非存在下において、特定のT2Rを発現する細胞を使用してT2Rの活性を測定した、細胞ベースのアッセイを使用してなされた。具体的には、以下に詳述するように、それらの表面上で上記の同定された特異的T2Rを発現し、該T2Rに機能的に結合するキメラGタンパク質をさらに発現するHEK細胞株を、細胞内カルシウム濃度の変化を検出した細胞ベースのアッセイにおいて使用し、特異的苦味化合物により特異的に活性化される一方、他のhT2Rは、類似条件下で活性化されないことが認められた。
したがって、本発明は、これらの苦味化合物および他の苦味化合物によって、これらの受容体の活性化を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するために、アッセイ、好ましくはハイスループットアッセイにおけるこれらのヒト味覚受容体の使用を包含する。
また、本発明は、苦味を引き出す化合物を同定するためのこれらの受容体の使用に関する。
さらに、本発明は、例えば、食物および栄養素過敏、食物吸収、消化ホルモンおよびペプチドの制御、毒素に対する応答等の胃腸機能を制御または調節する化合物を同定するための、ならびに肥満症、糖尿病等の胃腸または代謝疾患、およびIBD、セリアック病、クローン病等の炎症性または自己免疫性胃腸疾患を治療するための治療的スクリーニングアッセイにおける、対象T2Rおよびそれを発現する対応するポリペプチドおよび細胞の使用に関する。
本発明は、ヒトまたは他の味覚検査における同定された調節化合物の効果を評価し、苦味への同定された化合物の効果を評価するさらなるステップ、および/または特定の胃腸、消化もしくは代謝機能または疾患への同定された化合物の効果を評価する生体外もしくは生体内臨床試験をさらに含むアッセイもまた包含する。また、本発明は、風味または味覚モジュレータとしての、すなわち、苦味、例えば特定の飲料および食物または医薬品にともなう苦味を抑制するための、食物、飲料または医薬品における同定された化合物の使用を包含する。さらに、本発明は、苦味受容体を特異的に活性化する化合物を除去するように処置された食物、飲料および医薬品、例えば、本明細書に含まれる苦味化合物の量を除去または減少するように加工された食物および飲料の生成を包含する。その上さらに、本発明は、T2Rを含む代謝疾患、消化機能、および胃腸疾患を治療または予防するのに好適な同定された化合物を含有する医薬品を包含する。具体的には、本発明は、クローン病、セリアック病、肥満症、糖尿病、食物過敏、食物吸収、消化ホルモンまたはペプチド分泌等の状態を治療または調節するための医薬品を検討する。
発明の目的
発明の目的
本発明の目的は、これらのヒト苦味受容体を特異的に結合し、活性化することが認められる本明細書に開示される特異的苦味リガンドを含む、苦味リガンドによるhT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76から選択される少なくとも1つのhT2R、またはそのフラグメント、変異形、オルソログ、もしくはキメラの、活性化を活性化する、または遮断もしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の特定の目的は、クロラムフェニコール、クロロキン、シクロオクタノン、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、ギンゴライドA、ロメフロキサシン、N−メチルチオ尿素、ニトロサッカリン、メチルプレドニゾン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ペプチド−LPFNQL(配列番号51)、ペプチド−LPFSQL(配列番号52)、ペプチド−YQEPVLGPVRGVRGPFPIIV(配列番号53)、ペプチドPVLGPVRGFPIIV(配列番号54)、ペプチドPVRGPFPIIV(配列番号55)、ペプチドRGPFPIIV(配列番号56)、ピクリン酸、プレドニゾン、キニーネ、スルファメトキサゾール、チオアセトアニリド、チオカルバニリド、および他の構造上関連する、もしくは苦味化合物のうちの少なくとも1つによるhT2R1またはそのフラグメント、変異形、またはキメラの、活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の特定の目的は、2´アセチルピリジン、クロロキンもしくはロメフロキサシン、または他の構造上関連する、および苦味化合物のうちの少なくとも1つによるhT2R3またはそのフラグメント、オルソログ、変異形もしくはキメラの、活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、4−ベンジルピペリジン、クロロキン、塩酸ジルチアゼム、ジイソブチルアミン、2,6−ジメチルピペリジン、ドキセピン、塩酸ラベタロール、(−)ルピニン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ピレンゼピン二塩酸塩、プロカインアミド、キニーネ、ラニチジン、ストリキニーネ、テオブロミン、トラゾリン、トリメトプリム、およびL−トリプトファン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R4の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、ジメチルビグアナイド、1−メチル−2−キノリノン、オレウロペイン(oleuropein)、および2−ピコリン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R5への活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、2−アセチルピラジン、クロロキン、エチルピラジン、1−メチル−2−キノリノン、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、2−ピコリン、ピレンゼピン二塩酸塩、キニーネ、ストリキニーネ、トリメトプリムから選択される少なくとも1つの化合物、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物との、hT2R7の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、アセサルフェームK、2−アセチルピラジン、アロイン、アンドログラフォリド、アトロピン、クロラムフェニコール、シクロヘキシミド、シクロオクタノン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、マレイン酸エナラプリル、(−)エリスロマイシン、エチルピラジン、ファモチジン、ガバペンチン、ギンゴライドA、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、ロメフロキサシン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、ニトロフタレン、ニトロサッカリン、オレウロペイン(oleuropein)、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、N´−エチル−N´−フェニル尿素、ピクリン酸、ピレンゼピン二塩酸塩、プレドニゾン、キナクリン、ラニチジン、サッカリン、オクタ酢酸スクロース、ストリキニーネ、トリル尿素、およびトリメトプリムから選択される少なくとも1つの化合物、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物との、hT2R8の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、エチルピラジン、オフロキサシン、およびラニチジン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R9の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の特定の目的は、2−アセチルピラジン、アンドログラフォリド、アトロピン、ブルシン、4−ベンジルピペリジン、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、シンコニン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、シクロオクタノン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、ジイソブチルアミン、2,6−ジメチルピペリジン、ドキセピン、エドロホニウム、(−)エリスロマイシン、エチルピラジン、ファモチジン、ガバペンチン、ギンゴライドA、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、(−)ルピニン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、プロカインアミド、プレドニゾン、クァシン、キナクリン、キニーネ、ラニチジン、硫酸スパルテイン5水和物、オクタ酢酸スクロース、ストリキニーネ、トラゾリン、トリル尿素、トラピジル(trapidil)、トリメトプリム、および塩化物、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R10の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、2−アセチルピラジン、アトロピン、クラリスロマイシン、安息香酸デナトニウム、ドキセピン、エチルピラジン、オレウロペイン(oleuropein)、オキシフェノニウムHBr、およびキナクリン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R13の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、2−アセチルピラジン、アリストロキア酸、シクロオクタノン、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、2,6−ジメチルピペリジン、エリスロマイシン、エチルピラジン、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、ニトロナフタレン、ニトロサッカリン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、N´−エチル−N´−フェニル尿素、2−ピコリン、ピクリン酸、キニーネ、ストリキニーネ、テオブロミン、トリル尿素、およびトラピジル(trapidil)、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R14の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、2−アセチルピラジン、アミグダリン、アルブチン、リナマリン、およびD−(−)−サリシン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R16の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、2−アセチルピラジンまたはエチルピラジン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R44の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、2−アセチルピラジンまたはエチルピラジン、または他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R50の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、アセトアミノフェン、クロロキン、クラリスロマイシン、安息香酸デナトニウム、(−)エピカテキン、(−)エリスロマイシン、塩酸ラベタロール、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ピレンゼピン二塩酸塩、プロカインアミド、ラニチジン、ストリキニーネ、トリメトプリム、およびL−トリプトファン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R54の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、ドキセピン、リナマリン、塩化オキシブチニン、キニーネ、ストリキニーネ、およびトリメトプリム、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物への、hT2R55の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、アセサルフェームK、アロイン、アリストロキン酸、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、安息香酸デナトニウム、ニトロオキシビチニンクロライド、オキシフェノニウム、ペプチド−LPFNQL(配列番号51)、ペプチド−LPFSQL(配列番号52)、ピクリン酸、サッカリン、およびストリキニーネ、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R61の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
また、本発明の目的は、アセサルフェームK、アミノ−2−ノルボルナン−カルボン酸、アリストロキン酸、2,6−ジメチルピペリジン、キニーネ、ラニチジン、サッカリン、ストリキニーネ、およびL−トリプトファン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つ化合物による、hT2R64の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
また、本発明の目的は、2−アセチルピラジン、エチルピラジン、および1−メチル−2−キノリノン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R65の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
また、本発明の目的は、2−アセチルピラジン、アンドログラフォリド、エチルピラジン、および塩化オキシブチニン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R67の活性化および/または結合を遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
また、本発明の目的は、ニトロサッカリン、およびピクリン酸、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R71の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、アンドログラフォリド、アトロピン、ブルシン、4−ベンジルピペリジン、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、シンコニン、シプロフロキサシン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、ドキセピン、マレイン酸エナラプリル、エノキサシン、プレドニゾン、プロカインアミド、クァシン、キニーネ、ラニチジン、硫酸スパルテイン5水和物、ストリキニーネ、スルファメトキサゾール、トラピジル(trapidil)、およびトリメトプリム、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R75の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の別の目的は、ブルシン、ならびに他の構造上関連する、もしくは苦味化合物から選択される少なくとも1つの化合物による、hT2R76の活性化および/または結合を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定するアッセイを提供することである。
本発明の特定の目的は、アッセイにおいて、hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76のうちの少なくとも1つ、またはそのフラグメント、変異形、オルソログ、変異体もしくはキメラを含む、または発現する(安定的または過渡的に)細胞または細胞膜を使用し、上記の同定された苦味化合物、または別の構造上関連する、もしくは苦味化合物のうちの1つによる、該受容体のうちの少なくとも1つの活性化を活性化する、または遮断するもしくは調節する化合物を同定することである。
本発明のさらにより特定の目的は、前述の苦味化合物または別の構造上関連する、もしくは苦味化合物のうちの1つによる、前述のヒト味覚受容体のうちの1つの活性化を活性化する、または調節する、好ましくは遮断または抑制する化合物を検出するために、細胞内カルシウムの変化を検出する細胞ベースのアッセイにおいて、細胞、好ましくは哺乳類、両生類または昆虫細胞、例えば、Gα15、Gα16、ガストデューシン、またはそのキメラ、例えば、Gα16ガストデューシンもしくはトランスデューシンキメラGタンパク質等のそれと共役するGタンパク質を発現する、例えばHEK293T細胞等の細胞を使用することである。
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物味覚検査、好ましくはヒト味覚検査において、例えば、前述の同定された苦味化合物、または他の構造上関連する苦味化合物によって引き出される苦味を調節する、好ましくは抑制または遮断する同定された化合物を確認することである。
本発明の別の目的は、これらの味覚受容体を特異的に活性化する化合物によって引き出される苦味を抑制する、または遮断するために、本明細書に記載したアッセイにおいて同定された化合物を、組成物中の添加物または風味調整剤として利用することである。本発明の好ましい目的は、いくつかの食物、飲料、化粧品、および医薬品に存在する化合物の苦味を遮断するために、上記の同定されたヒトT2R受容体のうちの少なくとも1つの活性化を抑制する化合物を使用することである。
発明の詳細な説明
本発明を具体的に説明する前に、以下の定義が提供される。
本発明を具体的に説明する前に、以下の定義が提供される。
「T2R」ファミリーという用語は、多型変異形、対立遺伝子、変異体、およびホモログを含み、それらは(1)本明細書で以下に開示される、ならびに参照することによって本明細書に組み込まれるZuker(Id)(2001)およびAdler(Id.)(2001)のT2Rに対し、約25のアミノ酸、好ましくは50〜100アミノ酸の範囲にわたって、約30〜40%のアミノ酸配列同一性、さらに具体的には約40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99%のアミノ酸配列同一性を有する、(2)以下に開示のT2R配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原に対し生じる抗体、および保存的に修飾された変異形と特異的に結合する、(3)以下に開示のT2R DNA配列から成る群から選択された配列、および保存的に修飾された変異形と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする(少なくとも約100、任意に少なくとも約500〜1000の大きさのヌクレオチドで)(4)以下に開示のT2Rアミノ酸配列から成る群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約40%同一である配列を含む、または(5)記載のT2R配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される。
特に、これらの「T2R」は、本明細書に同定される苦味リガンド、ならびに他の構造上関連する化合物および苦味化合物と特異的に結合する、hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9A、hT2R9V、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76、として本明細書で言及され、本願に提供される核酸配列およびアミノ酸配列を有する味覚受容体GPCR、ならびにそれらの変異形、対立遺伝子、変異体、オルソログおよびキメラを含む。
図1の表に述べられるように、本明細書のhT2Rは、文献において別名で称されることもある。本明細書で出願者がT2R配列に言及する場合、Senomyxの命名法を意図する。
T2R遺伝子は、タンパク質およびDNAレベルの両方において実質的な配列分散を示すが、これまでに単離されたすべてのT2Rは、参照することにより本明細書に完全に組み込まれる、Adlerら(WO第01/77676 A1号(2001)およびZukerら(WO第01/18050 A2号)において、既に同定されたT2Rコンセンサス配列に対して、同一または少なくとも70〜75%の配列同一性を保有する特定の領域において特定のコンセンサス配列を含むことがわかっている。
位相的に、特定の化学感覚GPCRは、「N末端ドメイン」、「細胞外ドメイン」、7回膜貫通領域ならびに対応する細胞質および細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」、ならびに「細胞質領域」および「C末端領域」を有する(例えば、Hoon et al,Cell,96:541−51(1999);Buck & Axel,Cell,65:175−87(1991)を参照)。これらの領域は、疎水性および親水性ドメイン(例えば、Stryer,Biochemistry,(3rd ed.1988)を参照のこと。またdot.imgen.bcm.tmc.edu等に見られるもの等の、あらゆる多くのインターネットベースの配列分析プログラムも参照のこと。)を同定する配列分析プログラム等の当業者に既知の方法を使用し、構造的に同定することが可能である。これらの領域は、キメラタンパク質の製造、および例えば、リガンド結合アッセイ等の、本発明の体外アッセイに有用である。例えば、キメラT2Rは、1つのT2Rの細胞外領域と同じまたは異なる種の別のT2Rの膜貫通領域とを組み合わせることにより作製され得る。
したがって、「細胞外ドメイン」は、細胞膜から突出し、細胞の細胞外表面に露出されるT2Rポリペプチドのドメインを意味する。このような領域は、細胞の細胞外表面へ露出される「N末端ドメイン」ならびに、細胞の細胞外表面へ露出される膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち、膜貫通領域2と3との間、膜貫通領域4と5との間、および膜貫通領域6と7との間の細胞外ループを含み得る。「N末端ドメイン」は、N末端で始まり、膜貫通領域の開始点に近い領域へ延在する。これらの細胞外領域は、可溶性相および固相の両方の、体外リガンド結合アッセイにおいて有用である。さらに、以下に記載される膜貫通領域は、細胞外領域との組み合わせまたはそれのみで、リガンド結合に関与することが可能であり、したがって体外リガンド結合アッセイにおいても有用である。
本明細書の「T2R発現細胞」は、本発明によるヒトT2R配列を発現する組換え細胞、ならびに内在性T2R発現細胞を包含する。そのような細胞は、舌および胃腸系に含まれ、舌上に発現される味覚芽等の口腔の細胞、ならびに胃腸管の刷子細胞等の胃腸系および関連する臓器内の細胞、STC−1細胞等の腸内分泌細胞を含む。これらの細胞はまた、ガストデューシン、トランスデューシン、Galpha15またはGalpha16等のGタンパク質も発現し得る。特異的なT2Rを発現する細胞は、磁気ビーズ細胞単離法のFACS細胞分離等による既知の方法により同定および単離され得る。
7回膜貫通「領域」を含む「膜貫通ドメイン」は、原形質膜内に位置するT2Rポリペプチドのドメインを意味し、対応する細胞質性(細胞内)および細胞外ループを含み得、膜貫通「領域」としても言及される。7回膜貫通領域、ならびに細胞外および細胞性ループは、上記のKyte&Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105−32(1982))、または上記のStryerに記載の標準的な方法を使用して同定されることが可能である。
「細胞質ドメイン」は、例えば、「C末端ドメイン」および、例えば、膜貫通領域1と2との間、膜貫通領域3と4との間、および膜貫通領域5と6との間等の細胞内ループ膜貫通ドメインの細胞内ループの、細胞内部に面するT2Rタンパク質のドメインを意味する。「C末端ドメイン」は、最後の膜貫通領域の端部から、タンパク質のC末端に及び、通常細胞質内に位置する領域を意味する。
「7回膜貫通受容体」という用語は、原形質膜を7回貫通する7つの領域を有する、膜貫通タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する(したがって、7つの領域は、「貫通膜」またはTM IからTM VIIの「TM」ドメインと呼ばれる)。嗅覚器官および特定の味覚受容体ファミリーは、それぞれこのスーパーファミリーに属する。7回膜貫通受容体ペプチドは、以下にさらに詳しく述べるように、類似のおよび特徴的な第1の、第2の、および第3の構造を有する。
「リガンド結合領域」という用語は、膜貫通ドメインIIからVII(TM IIからVII)を実質的に組み込む化学感覚または味覚受容体由来の配列を意味する。該領域は、リガンド、さらに具体的には、味覚を引き出す化合物に結合する能力を有し得る。
「原形質膜転移ドメイン」または単に「転移ドメイン」という用語は、ポリペプチドコード配列のアミノ末端に組み込まれる際、非常に高い効率で、細胞原形質膜にハイブリッド(「融合」)タンパク質を「付与」または「転移」させることができるポリペプチドを意味する。例えば、当初は、7回膜貫通受容体であるヒトロドプシン受容体ポリペプチドのアミノ末端由来の特定の「転移ドメイン」を使用し得る。別の転移ドメインは、ウシロドプシン配列由来であり、また転移を促進するのに有用である。ロドプシン由来配列は、7回膜貫通型融合タンパク質を原形質膜に転移させるのに特に有効である。
「機能等価」とは、新しく翻訳されたタンパク質を、類似条件下において、原形質膜へ転移することにおけるドメインの能力および効率が、例えば、ロドプシン由来配列等の例示的な転移ドメインと同じように効率的であることを意味し、相対的効率は、本明細書に記載されるように、測定され(量的表現で)、比較され得る。本発明の範囲内に含まれるドメインは、20アミノ酸長転移ドメイン配列番号1と同じ効率性を有する新たな合成ポリペプチドを細胞(哺乳類、ゼノパス等)の原形質膜へ転移することにおけるその効率性について、一連のスクリーニングによって決定されることが可能である。
T2Rファミリーメンバーによって媒介される味覚伝達を調節する試験化合物のためのアッセイの文脈において、「機能的効果」という語句は、例えば、機能的、物理的、および化学的効果等の間接的または直接的に受容体の影響下にある任意のパラメータの測定値を含む。それは、体外、体内、および生体外でのリガンド結合、イオン流出の変化、膜電位、電流、転写、Gタンパク質結合、GPCRのリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達、受容体−リガンド相互作用、二次伝達物質の濃度(例えば、cAMP,cGMP,IP3,または細胞内Ca2+)を含み、また、神経伝達物質またはホルモンの放出の増加または減少等の他の生理学的効果も含む。
「機能的効果を測定すること」は、間接的または直接的にT2Rファミリーのメンバーの影響下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的、および化学的効果等を増加、または減少させる化合物についてのアッセイを意味する。そのような機能的効果は、当業者に既知の手段のいずれかにより測定されることが可能であり、例えば、分光特性(例えば、蛍光、吸収度,屈折率)、水力学的特性(例えば、形態)、クロマトグラフィー特性、または溶解特性の変化、パッチクランプ法、電圧感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、遊動性マーカー、卵母細胞T2R遺伝子発現;組織培養細胞T2R発現、T2R遺伝子の転写活性化、リガンドの結合アッセイ、電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化、イオン流出アッセイ、cAMP、cGMP、およびイノシトール三リン酸(IP3)等の細胞内二次伝達物質の変化、細胞内カルシウムのレベルの変化、神経伝達物質の放出等がある。
T2Rタンパク質受容体の「阻害剤」、「活性剤」、および「モジュレータ」は、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、およびそれらのホモログおよび模倣物等の、味覚伝達のための体外および体内アッセイを使用して同定される阻害分子、活性分子、または調節分子に言及するために互換的に使用される。阻害剤は、例えば、結合して、部分的または全体的に刺激を遮断し、活性を減少し、阻止し、遅延させ、味覚伝達を不活性化し、減感化し、または下方制御する、例えばアンタゴニスト等の化合物である。活性剤は、例えば、結合して、活性を刺激、増加、開始、活性化、促進、強化し、味覚伝達を敏感化、または上方制御する、例えばアゴニスト等の化合物である。モジュレータは、例えば、受容体と、活性剤または阻害剤と結合する細胞外タンパク質(例えば、エブネリンおよび疎水性キャリアファミリーの他のメンバー)、Gタンパク質;キナーゼ(例えば、ロドプシンキナーゼのホモログ、ならびに受容体の脱活性化および脱感作に関係するβアドレナリン受容体キナーゼ)、ならびに、やはり受容体を脱活性化および脱感作するアレスチン、との相互作用を変化させる化合物を含む。モジュレータは、例えば、変化した活性等のT2Rファミリーメンバーの遺伝的修飾物、ならびに、自然発生のおよび合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型化学分子等を含む。
阻害剤および活性剤についてのそのようなアッセイは、例えば、細胞または細胞膜において、発現T2Rファミリーメンバーを発現させること、例えば、苦味化合物等を調節する化合物の存在または非存在下において推定されるモジュレータ化合物を適用し、次いで上述のように味覚伝達における機能的効果を測定することを含む。潜在的な活性剤、阻害剤、またはモジュレータで処理されたT2Rファミリーメンバーを含む試料およびアッセイは、調節の程度を調べるために阻害剤、活性剤、またはモジュレータを含まない対照試料と比較される。対照試料(モジュレータで処理されない)は、100%相対T2R活性値が与えられる。対照に対するT2R活性値は約80%、任意に50%または25〜0%である場合、T2Rの阻害が達成されるとする。対照に対するT2R活性値が110%、任意に150%、任意に200〜500%、または1000〜3000%以上である場合、T2Rの活性化が達成されたとする。
本明細書で使用される「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、本発明の化合物がその自然な状態において通常伴うような他の異なる化合物が含まれていない状態を意味する。好ましくは、「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」とは、組成物が所定の試料の質量の、少なくとも0.5重量%、1重量%、5重量%、10重量%、または20重量%、および最も好ましくは少なくとも50重量%または75重量%を含むことを意味する。好ましい一実施形態において、これらの用語は、所定の試料の質量で少なくとも95重量%を含む本発明の化合物を意味する。本明細書において使用される、核酸またはタンパク質の「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質を意味する場合、哺乳動物の体内、特にヒトの体内に自然に発生する状態とは異なる精製または濃縮の状態を意味する。(1)他の関連する構造または化合物からの精製、または(2)哺乳類の体内、特にヒトの体内に通常関連しない構造または化合物との関連を含む、いかなる哺乳動物の体内、特にヒトの体内に自然に発生する状態よりも高い精製または濃縮も、「単離された」の意味の範囲内である。当業者に既知の様々な方法および手順に従い、本明細書に記載される、核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質のクラスは、単離、あるいは、通常自然に関連しない構造または化合物と関連させることができる。
本明細書において使用される、「単離された」という用語は、核酸またはポリペプチドを意味する場合、哺乳類の体内、特にヒトの体内に自然に発生する状態とは異なる精製または濃縮の状態を意味する。(1)他の自然発生的な関連する構造または化合物からの精製、または(2)体内に通常関連しない構造または化合物に関連するものを含む、いかなる体内に自然に発生する状態よりも高い任意の程度の精製または濃縮も、本明細書において使用される「単離された」の意味の範囲内である。当業者に既知の様々な方法および手順に従い、本明細書に記載される、核酸もしくはタンパク質は、単離、あるいは、通常自然に関連しない構造または化合物と関連させることができる。
本明細書において使用される、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に記載されるように、組換えまたは自然発現の核酸を生成または検出するためのいかなる適した増幅方法の使用をも意味する。例えば、本発明は、体外または生体内で、本発明の自然発生の(例えば、ゲノムまたはmRNA)または組換え(例えば、cDNA)核酸(例えば、本発明の味覚を引き出す化合物結合配列)を(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCRによる)増幅するための方法および試薬(例えば、特定のオリゴヌクレオチドプライマー対)を提供する。
「発現ベクター」という用語は、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む任意の細胞において、構成的または誘導的に、体外または生体内で、本発明の核酸配列を発現するための任意の組換え発現系を意味する。本用語は、線状または環状の発現系を含む。本用語は、エピソームのままであるか宿主細胞のゲノムに組み込まれている発現系を含む。発現系は、自己複製する能力を有するまたは有しない(すなわち、細胞において単に一過性の発現を駆動する)ものとすることができる。本用語は、組換え核酸の転写に必要な最小限の要素のみを含む組換え発現「カセット」を含む。
「ライブラリ」という用語は、異なる核酸またはポリペプチド分子の混合物である調製物を意味し、例えば、感覚を生成させる組換えのライブラリ、特に、縮重プライマー対との核酸の増幅により生成された味覚受容体リガンド結合領域もしくは増幅されたリガンド結合領域に組み込む単離されたベクターのコレクション等、または味覚受容体をコードする少なくとも1つのベクターでそれぞれ無作為にトランスフェクトされた細胞の混合物がある。
「核酸」または「核酸配列」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを意味する。この用語は、核酸類、すなわち天然のヌクレオチド類の既知の類似体を含むオリゴヌクレオチド類を包含する。また、この用語は、合成骨格を有する核酸類似構造も包含する。
他の指示がない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異形(例えば縮重コドン置換体)および相補配列、ならびに明示されたその配列をも暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば、1つ以上の選択されたコドンの第3の位置を混合基および/またはデオキシイノシン残基で置換した配列を生成させることによって、得ることができる(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)、Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.,260:2605−08(1985)、Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes,8:91−98(1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するため、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、自然発生するアミノ酸ポリマーおよび自然発生しないアミノ酸ポリマー、ならびに、1つ以上のアミノ酸残基が対応する自然発生するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
本明細書に記載される「転移ドメイン」、「リガンド結合ドメイン」、およびキメラ受容体組成物は、「類似体」または「保存的変異形」、および例示的な配列に実質的に対応する構造および活性を有する「模倣物」(「ペプチド模倣物」)をも含む。したがって、「保存的変異形」または「類似体」または「模倣物」という用語は、変更が本明細書で定義されるように、ポリペプチドの(保存的変異形の)構造および/または活性を実質的に変えることのないように、修飾したアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。これらは、アミノ酸配列の保存的に修飾された変異形、すなわち、タンパク質活性に重要でないアミノ酸残基の置換、付加または欠失、あるいは、重要なアミノ酸の置換であっても、構造および/または活性を実質的に変えないような類似の特性(例えば、酸性、塩基性、正または負の荷電、極性または非極性等)を有する残基によってアミノ酸を置換した変異形を含む。
さらに具体的には、「保存的に修飾された変異形」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関し、保存的に修飾された変異形は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、または、該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一の配列を意味する。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸がいずれの所定のタンパク質をコードする。
例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUのすべてがアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンが1つのコドンで特定されるどの位置においても、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、記載されている対応するコドンのいずれかと変えることができる。
そのような核酸変異形は「サイレントバリエーション」であり、それは、保存的に修飾された変異形の一種である。1つのポリペプチドをコードする本明細書に示すすべての核酸配列は、その核酸の可能なすべてのサイレントバリエーションも記載する。当業者には、核酸中の各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるATG、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)は、機能的に同一の分子をもたらすよう変更することができることを理解されよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載される各配列において、暗に意味されるものである。
機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換体の表は、当該技術分野において周知である。例えば、保存的置換を選ぶための1つの例示的なガイドラインは以下のとおり(本来の残基の後に例示的な置換体が示される)である。ala/glyまたはser、arg/lys;asn/glnまたはhis、asp/glu、cys/ser、gln/asn、gly/asp、gly/alaまたはpro、his/asnまたはgln、ile/leuまたはval、leu/ileまたはval、lys/argまたはglnまたはglu、met/leuまたはtyrまたはile、phe/metまたはleuまたはtyr、ser/thr、thr/ser、trp/tyr、tyr/trpまたはphe、val/ileまたはleu。他の例示的なガイドラインは、以下の6つのグループを使用する(それぞれは、互いに保存的置換体となるアミノ酸を含む)。1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、4)アルギニン(R)、リジン(K)、5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、および6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)(例えば、Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984);Schultz and Schimer,Principles of Protein Structure,Springer−Verlag(1979)も参照)。当業者には、上記の同定された置換のみが可能な保存的置換であるわけではないことを理解されよう。例えば、ある目的のため、すべての荷電アミノ酸を、正および負にかかわらず、互いに保存的置換として考えることができる。さらに、コード配列中の単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を変更、付加または削除する個別の置換、欠失または付加もまた、「保存的に修飾された変異形」とみなすことができる。
「模倣物」および「ペプチド模倣物」という用語は、ポリペプチド(例えば、本発明の転移ドメイン、リガンド結合領域、またはキメラの受容体)と実質的に同じ構造的、および/または機能的特性を有する合成の化合物を意味する。この模倣物は、全体が合成による非天然のアミノ酸類似体からなるものであってもよいし、あるいは、部分的に天然のペプチドアミノ酸からなり、かつ部分的に非天然のアミノ酸類似体からなるキメラの分子であってもよい。また、この模倣物は、このような置換が模倣物の構造、および/または活性を実質的に変えないものである限り、天然アミノ酸の保存的置換体を任意の量で組み込むこともできる。
保存的変異形である本発明のポリペプチドと同様に、慣用的な実験によって、模倣物が本発明の範囲内であるかどうか、すなわち、その構造および/または機能が実質的に変わっていないかを判定できる。ポリペプチド模倣物の組成物は、非天然の構造要素の任意の組み合わせを含むことができ、その構造要素は、典型的に次の3つの構造グループからのものである。a)天然のアミド結合(「ペプチド結合」)による連結以外の残基連結基、b)自然発生するアミノ酸残基に代わる非天然の残基、または、c)二次構造の模倣を生じる残基(すなわち、二次構造(例えば、ベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造等)を誘導または安定化するため)。その残基のすべてまたは一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段によって連結される場合、ポリペプチドは模倣物として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣物の残基は、ペプチド結合、他の化学結合または結合手段(例えば、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能マレイミド類、N,N´−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)もしくはN,N´−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)等)によって連結できる。従来のアミド結合(「ペプチド結合」)による連結の代わりとなりうる連結基には、例えば、ケトメチレン(例えば、−−C(=O)−−NH−−に対して−−C(=O)−−CH2)、アミノメチレン(CH2NH)、エチレン、オレフィン(CH.dbd.CH)、エーテル(CH2O)、チオエーテル(CH2−−S)、テトラゾール(CN4)、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルがある(例えば、Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,267−357,Marcell Dekker,Peptide Backbone Modifications,NY(1983)を参照)。また、ポリペプチドは、自然発生するアミノ酸残基の代わりにすべてまたは一部の非天然残基を含むことにより、模倣物として特徴付けることができ、非天然残基は、科学文献および特許文献にも十分に説明されている。
「標識」または「検出可能な部分」は、分光手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な構成である。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、電子稠密試薬、酵素(例えば、ELISAに通常使用されるようなもの)、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテン類、およびタンパク質(例えば、そのペプチド中に放射性標識を組み込むことにより検出可能にすることができ、あるいは、そのペプチドに特異的に反応する抗体を検出するよう使用することができる)を含む。
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、プローブに結合された標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出できるように、リンカーまたは化学結合を介して標識に共有結合されたもの、あるいは、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して非共有結合的に標識に結合されたものである。
本明細書において使用される、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、1種以上の化学結合による、通常は相補的塩基対による、通常は水素結合の形成による、相補的配列からなる標的核酸と結合することができる核酸として定義される。本明細書において使用される、プローブとは、天然の塩基(すなわち、A、G、C、またはT)または修飾塩基(7−デアザグアノシン、イノシン等)を含むことができる。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを阻害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されていてもよい。したがって、例えば、プローブは、ホスホジエステル結合以外のペプチド結合によって構成塩基が連結されたペプチド核酸であってもよい。当業者には、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブと完全な相補性を欠く標的配列とプローブが結合しうることを理解されよう。プローブは、任意で、例えば、同位体、発色団、発光団、色素原等で直接的に標識されるか、あるいは、例えば、ビオチン(それに対しストレプトアビジン複合体を後に結合できる)等により、間接的に標識される。該プローブの存在または非存在について検定することにより、選択配列または部分配列の存在または非存在を検出できる。
「異種(の)」という用語は、核酸の部分について使用される場合、該核酸が、自然において互いに同じ関係で存在しない2種以上の部分配列を含むことを意味する。例えば、該核酸は、典型的に遺伝子組換えによって生産されたものであり、新しい機能の核酸となるよう配列された関連のない遺伝子からの2つ以上の配列(例えば、ある起源からのプロモーターと、別の起源からのコード領域)を有するものである。同様に、異種のタンパク質は、該タンパク質が、自然において互いに同じ関係で存在しない2種以上の部分配列を含むことを意味する(例えば、融合タンパク質)。
「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する核酸配列のアレイとして定義される。本明細書において使用される、プロモーターとは、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターであるTATAエレメントの場合のように、転写の開始部位に近い必要な核酸配列を含む。また、プロモーターは、任意で、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素をも含み、それらは、転写の開始部位から数千塩基対も離れて配置することができる。「構成的」プロモーターは、多くの環境条件および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導的」プロモーターは、環境または発生の制御の下で活性であるプロモーターである。「作動可能に連結」という用語は、核酸発現制御配列(例えばプロモーター、または転写因子結合部位のアレイ)と第2の核酸配列との間での機能的な連結を意味し、該発現制御配列は、該第2の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
本明細書において使用される、「組換え」とは、合成されたポリヌクレオチドあるいは体外で操作されたポリヌクレオチド(例えば「組換えポリヌクレオチド」)、細胞中または他の生物学的系において遺伝子産物を生産するために組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド(「組換えタンパク質」)を意味する。また「組換え手段」は、発現(例えば、本発明の転移ドメインを含む融合タンパク質および本発明のプライマーを使用して増幅した核酸配列の誘導的または構成的な発現)のため、異なる起源からの種々のコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸を発現カセットまたはベクターに連結することを包含する。
「選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」とは、その配列が複合混合物(例えば、全細胞またはライブラリのDNAまたはRNA)に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ある分子が特定のヌクレオチド配列のみに対して結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを意味する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、典型的に核酸の複合混合物において、その標的部分配列にハイブリダイズする一方、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境では異なるであろう。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについて広範な指針を示しているものに、Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)がある。
一般的に、ストリンジェントな条件は、特定の配列について、所定のイオン強度pHにおいて、熱融解点(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が標的配列にハイブリダイズして平衡となる温度である(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度において)(標的配列が過剰に存在するため、Tmにおいて、プローブの50%が平衡において占められる)。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3において塩濃度が約1.0Mのナトリウムイオン濃度より低くなり、典型的に約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン濃度(または他の塩)となり、温度が、短いプローブ(例えば10〜50ヌクレオチド)に対して少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば50ヌクレオチドより大きいもの)に対して少なくとも約60℃であるような条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加して得ることもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、ポジティブなシグナルは、バックグランドの少なくとも2倍、任意でバックグランドハイブリダイゼーションの10倍である。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のものとなり得る。50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDS、42℃で培養、あるいは、5×SSC、1%SDS、65℃で培養、0.2×SSCおよび0.1%SDSにおいて65℃で洗浄。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば、1、2、5、10、15、30、60分間またはそれ以上の間行うことができる。
一般的に、ストリンジェントな条件は、特定の配列について、所定のイオン強度pHにおいて、熱融解点(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が標的配列にハイブリダイズして平衡となる温度である(所定のイオン強度、pH、および核酸濃度において)(標的配列が過剰に存在するため、Tmにおいて、プローブの50%が平衡において占められる)。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3において塩濃度が約1.0Mのナトリウムイオン濃度より低くなり、典型的に約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン濃度(または他の塩)となり、温度が、短いプローブ(例えば10〜50ヌクレオチド)に対して少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば50ヌクレオチドより大きいもの)に対して少なくとも約60℃であるような条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加して得ることもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、ポジティブなシグナルは、バックグランドの少なくとも2倍、任意でバックグランドハイブリダイゼーションの10倍である。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のものとなり得る。50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDS、42℃で培養、あるいは、5×SSC、1%SDS、65℃で培養、0.2×SSCおよび0.1%SDSにおいて65℃で洗浄。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば、1、2、5、10、15、30、60分間またはそれ以上の間行うことができる。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸同士でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に関連する場合には、やはり実質的に関連している。このことは、例えば、遺伝コードに許容される最大のコドン縮重を使用して核酸の複製物を作る場合に、生じる。そのような場合、典型的に、核酸は、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。典型的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、40%ホルムアミドの緩衝液中で、1MのNaCl、1%SDS、37℃でのハイブリダイゼーション、および1×SSCにおける45℃での洗浄を含む。そのようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップは、例えば、1、2、5、10、15、30、60分間またはそれ以上の間行うことができる。ポジティブなハイブリダイゼーションは、バックグランドの少なくとも2倍である。当業者には、類似するストリンジェンシーの条件を得るため、異なるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を使用することができることを容易に理解されよう。
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域またはそのフラグメントを含み、抗原を特異的に結合し、認識するポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリンの遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、およびミューの定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖(L鎖)は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖(H鎖)は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、それらは、免疫グロブリンのクラス、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをそれぞれ特定する。
典型的な免疫グロブリン(抗体)の構造単位は、四量体からなる。各四量体はポリペプチド鎖の2つの同じ対からなり、各対は、1つの「軽」鎖(約25kDa)と1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のN末端は、抗原の認識を主としてつかさどる約100〜110またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。「可変軽鎖」(VL)および「可変重鎖」(VH)という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を意味する。
「キメラの抗体」は、抗体分子であって、(a)定常領域またはその一部が変更、置換または交換されることにより、抗原結合部位(可変領域)が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および/または種の定常領域に連結されているか、あるいは、キメラの抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子(例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等)に連結されている抗体分子、または(b)可変領域またはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換または交換された抗体分子である。
「抗T2R」抗体は、T2Rの遺伝子、cDNA、またはそれらの部分配列によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。
「イムノアッセイ」という用語は、抗原に特異的に結合するために抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、および/または定量するため、特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。
抗体に「特異的(または選択的)に結合する」または「特異的(または選択的)に免疫反応する」とは、タンパク質またはペプチドに言及する場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団において、該タンパク質の存在を決定づける結合反応を意味する。したがって、所定のイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグランドの少なくとも2倍で特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合することはない。そのような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体が必要になり得る。
例えば、ラット、マウスもしくはヒト等の特定の種からT2Rファミリーメンバーに生じさせられるポリクローナル抗体は、T2Rポリペプチドのオルソログもしくは多型変異形および対立遺伝子を除く、他のタンパク質とではなく、T2Rポリペプチドもしくはその免疫部分と特異的に免疫反応するそれらのポリクローナル抗体のみを得るために選択され得る。本選択は、他種からのT2R分子または他のT2R分子と交差反応する抗体を取り去ることによって達成され得る。また、T2R GPCRファミリーメンバーのみを認識するが、他のファミリーからのGPCRを認識しない抗体を選択することができる。様々なイムノアッセイ法を、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用することができる。例えば、あるタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するため、固相ELISAイムノアッセイを常用することができる(例えば、特異的な免疫反応性を測定するため使用できるイムノアッセイの方法および条件の解説について、Harlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,(1988)を参照)。典型的に、特異的または選択的な反応は、バックグランドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍となり、より典型的には、バックグランドの10〜100倍より大きくなる。
「に選択的に関連する」とは、上に定義される、他のものに「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、または、上に定義されるようにタンパク質に「選択的(または特異的)に関連する」抗体の能力を意味する。
「発現ベクター」という用語は、原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む任意の細胞において、構成的または誘導的に、体外または生体内で、本発明の核酸配列を発現するための任意の組換え発現系を意味する。本用語は、線状または環状の発現系を含む。本用語は、エピソームのままであるか宿主細胞のゲノムに組み込まれる発現系を含む。発現系は、自己複製する能力を有するまたは有しない(すなわち、細胞において単に一過性の発現を駆動する)ものとすることができる。本用語は、組換え核酸の転写に必要な最小限の要素のみを含む組換え発現「カセット」を含む。
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、該発現ベクターの複製または発現を支える細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞(例えば大腸菌)または真核細胞(例えば、酵母細胞、昆虫細胞、両生動物細胞、または哺乳動物細胞(例えばCHO、Hela、HEK−293等)とすることができ、例えば、培養細胞、外植体、および生体内の細胞とすることができる。
上述に基づいて、本発明は、以前に同定されたヒト苦味受容体の、苦味化合物、例えば、図2および3に特定される苦味化合物、ならびに構造上関連するおよび他の苦味化合物による特異的活性化を調節する、好ましくは遮断する化合物を同定するためのアッセイを提供する。具体的には、本発明は、図2に同定される、下記の特異的味覚受容体を活性化することを示す苦味リガンドのうちの1つ、または別の構造上関連するもしくは別の苦味化合物によるhT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、hT2R76の活性化を調節する(例えば、遮断する)化合物を同定するための細胞ベースのアッセイを提供する。これらの化合物は、ヒト対象において、これらの味覚受容体と関連する苦味を調節し得る。これは、味覚テストで立証され得る。
図2に含まれる苦味リガンドのうちの少なくとも1つに特異的に応答する上記の苦味受容体は、他の刊行物、ならびに本譲受人によって出願された特許出願、例えば、米国特許第10/191,058号、および同第09/825,882号(いずれも、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる)に報告されるHEK293発現系およびカルシウム画像検査法を本質的に使用して決定された。さらに具体的には、本発明者は、カルボキシ−44アミノ酸残基とガストデューシンのカルボキシ−44アミノ酸残基との置換により修飾されたGα16Gタンパク質配列を含む、キメラGタンパク質(G16gust44)とともにロドプシン35アミノ酸タグ(配列番号1)で標識された特定のhT2Rを有するHEK293細胞をトランスフェクトし、カルシウム画像検査法によりこれらの細胞の特異的な苦味リガンドに対する応答を記録した。
具体的には、本発明者は、hT2R活性を監視するために哺乳類細胞ベースのアッセイを使用した。カルシウム画像アッセイでは、細胞を、48ウェル組織培養プレートに播種された。24時間後、細胞は、hT2R核酸配列を含む発現プラスミド(pEAK10)、およびキメラGタンパク質(G16gust44)を含むプラスミド(pEAK10)で過渡的にトランスフェクトされた。さらに24時間後、カルシウムに特異的な蛍光色素(Fluo−4、Molecular Probes)とともに、細胞をインキュベートされた。充填された細胞は、異なる苦味分子にさらされ、hT2Rの活性化は、G16gust44の活性化をもたらし、次いで、細胞内のカルシウム動員をもたらす。このカルシウム濃度の増加は、細胞内のカルシウム色素の蛍光特性を変化させる。これらの変化を、蛍光顕微鏡を使用して監視する。
本発明者はまた、若干異なるプロトコルを使用して自動蛍光照準システムFLIPRも使用した。G16gust44を安定的に発現するHEK−293細胞株は、hT2R発現プラスミドでトランスフェクトさせ、24時間後、細胞を充填し、FLIPR上で分析した。
リガンドが特定のhT2Rに対し同定された後、hT2RおよびG16gust44の双方を安定的に発現するHEK−293細胞株が、特定のhT2Rを活性化し、または図2に特定される化合物等の別の苦味リガンドによる本hT2Rの活性化を調節する(遮断するもしくは増強する)、他のリガンドを同定するための将来のスクリーニングアッセイを容易にするように生成される。これは、過渡的なトランスフェクトの必要性を避ける。
図示されるように、このような実験は、23の異なるhT2Rに対して、リガンド受容体対を同定した。ほとんどの検査された苦味分子は、1つ以上のhT2Rを活性化し、また、ほとんどのhT2Rは、概して、構造的に多様な苦味分子に応答するように「同調される」ことも認められた。上記のように、カルシウム画像化アッセイにおいて検査された、すべての同定された苦味リガンドおよび濃度は、図3に含まれる。さらに、図4および5は、異なるT2R対立遺伝子が、苦味リガンドに対して異なって応答し得、このような対立遺伝子変異形は、それが発現するT2R対立遺伝子に応じて、異なる個体において、苦味および/または他のT2R関連の活性に影響を与え得ることを示す。
これらの結果は、同定されたhT2R味覚受容体のいずれか1つを機能的に発現する細胞は、該特定のhT2Rのうちの少なくとも1つと関連する苦味を調節するリガンドを同定するためのアッセイに使用され得ることを示す。
好ましくは、これらのアッセイは、以下に特定されるアミノ酸配列のうちの1つを有するhT2RをコードするDNAを発現する被検細胞を利用する。しかしながら、苦味受容体の機能特性を保有する、すなわち、いくつかの苦味化合物に応答する、これらの受容体ポリペプチドのフラグメント、オルソログ、変異形、もしくはキメラは、これらのアッセイに有用であることも予測される。このような変異形の例としては、スプライス変異、単一ヌクレオチド多型、対立遺伝子変異形、および組換えもしくは化学的手段、または自然発生によって生成された変異形を含む。T2Rの単離および発現手段は、本発明のアッセイ、およびこれらの受容体の活性化を抑制する化合物を同定するための本発明の使用に検討されるアッセイに使用され、下に記載される。
T2Rの単離および発現
T2Rの単離および発現
本発明のT2Rもしくはそのフラグメントまたは変異形の単離および発現は、本出願に開示されるT2R核酸配列に基づいて構成されたプローブまたはプライマーを使用する安定したクローニング法によって達成され得る。関連T2R配列はまた、本明細書に開示された配列および既知のコンピュータベースの検索技術、例えば、BLAST配列検索を使用してヒトまたは他種のゲノムデータベースから同定され得る。特定の実施形態において、本明細書に開示された偽遺伝子を、機能的対立遺伝子または関連遺伝子を同定するために使用し得る。
発現ベクターは、その後、これらの配列の機能発現のために宿主細胞を感染させる、または導入するために使用され得る。これらの遺伝子およびベクターは、体外または生体内で生成および発現され得る。当業者は、核酸発現を変化および制御するための所望の表現型は、本発明のベクター内で遺伝子および核酸(例、プロモーター、エンハンサー等)の発現または活性を調節することにより得られ得ることは理解されよう。発現または活性を増大または低減するために説明されている既知の方法のいずれも使用することができる。本発明は、科学的および特許文献に十分に記載されている当技術分野において既知の任意の方法またはプロトコルと組み合わせて実施することができる。
あるいは、例えば、Carruthers,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−18(1982)、Adams,Am.Chem.Soc.,105:661(1983)、Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440−3444(1997)、Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373−380(1995)、Blommers,Biochemistry 33:7886−7896(1994)、Narang,Meth.Enzymol.68:90(1979)、Brown,Meth.Enzymol.68:109(1979)、Beaucage,Tetra.Lett.22:1859(1981)、米国特許第4,458,066号に記載されるような既知の化学合成技法によって、これらの核酸を体外で合成することができる。次いで二本鎖DNAフラグメントを、相補鎖を合成し、適切な条件下で一緒にそれらの鎖をアニーリングさせることによって、または適切なプライマー配列を有するDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を添加することによって得ることができる。
核酸の操作のための技法、例えば、配列における変異の生成、サブクローニング、ラベリングプローブ、シークエンシング、ハイブリダイゼーション等は、科学的文献および特許文献に十分説明されている。例えば、Sambrook,ed.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),Vols.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)、Ausubel,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1997)、Tijssen,ed.,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I,Theory and Nucleic Acid Preparation,Elsevier,N.Y.(1993)を参照。
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド等は、当業者に既知の多くの一般的手段のうちのいずれかによって分析および定量化され得る。これらとしては、例えば、NMR、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、および超拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィー等の生化学的分析方法、様々な免疫学的方法、例えば、液体もしくはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動(例えば、SDS−PAGE)、RT−PCR、定量PCR、他の核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射標識、シンチレーション計数法およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
オリゴヌクレオチドプライマーを、T2Rリガンド結合領域をコードする核酸を増幅するために使用し得る。本明細書に記載された核酸はまた、増幅技法を使用してクローンまたは定量的に測定され得る。増幅方法は、当技術分野で既知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Innis ed.,PCR Protocols,a Guide to Methods and Applications,Academic Press,N.Y.(1990)、Innis ed.,PCR Strategies,Academic Press,Inc.,N.Y.(1995))、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu,Genomics,4:560(1989)、Landegren,Science,241:1077(1988)、Barringer,Gene,89:117(1990))、転写増幅(Kwoh,PNAS,86:1173(1989))、自立配列複製(Guatelli,PNAS,87:1874(1990))、Qベータレプリカ−ゼ増幅(Smith,J.Clin.Microbiol.,35:1477−91(1997))、自動Qベータレプリカ−ゼ増幅アッセイ(Burg,Mol.Cell.Probes,10:257−71(1996))、および他のRNAポリメラーゼ介在技法(例えば、NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)が挙げられる。また、Berger,Methods Enzymol.,152:307−16(1987)、Sambrook、Ausubel、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号、Sooknanan,Biotechnology,13:563−64(1995)も参照。
一旦増幅されると、核酸(単独にまたはライブラリとして)は、当技術分野に既知の方法に従いクローニングすることができ、必要に応じて、通常の分子生物学的方法、例えば、米国特許第5,426,039号に記載される体外増幅核酸をクローニングするための方法等を使用して様々なベクターのいずれかに、クローニングすることができる。増幅配列のクローニングを促進するために、制限酵素部位を、PCRプライマー対に「組み込む」ことができる。例えば、Pst IおよびBsp E1部位は、本発明の典型的なプライマー対に設計された。これらの特定の制限部位は、連結される際、それらがスプライスされる、7回膜受容体「ドナー」をコードする配列に対して「枠内」である配列を有する(リガンド結合領域をコードする配列は、7回膜ポリペプチドの内部にある、したがって、構成物が制限酵素スプライス部位のダウンストリームに翻訳されることが望ましい場合、枠外の結果は避けられるべきであるが、挿入されたリガンド結合領域が膜貫通VII領域の実質的にほとんどを備える場合、必要ではない場合がある)。プライマーは、「ドナー」7回膜受容体の本来の配列を保持するよう設計することができる。あるいは、プライマーは、保存的置換(例えば、疎水性残基に対する疎水性、上述を参照)あるいは機能的に無害な置換(例えば、原形質膜挿入を阻止しないもの、ペプチダーゼによる開裂を引き起こすもの、受容体の異常な折りたたみを引き起こすもの等)であるアミノ酸残基をコードすることができる。
プライマー対は、T2Rタンパク質のリガンド結合領域を選択的に増幅するように設計し得る。それらの結合領域は、異なるリガンドに対し、異なり得る。したがって、1つのリガンドに対して最小限の結合領域となり得るものは、第2の潜在的リガンドについて限定しすぎたものとなり得る。したがって、異なるドメイン構造、例えば、7回膜貫通T2Rの膜貫通(TM)ドメインIIからVII、IIIからVII、IIIからVIもしくはIIから、VI、またはその変異形(例えば、特定のドメインの配列のみ、ドメインの順序の混合等)を有する異なるサイズの結合領域を増幅し得る。
多くの7回膜T2Rタンパク質のドメイン構造および配列は周知であるため、当業者は、縮重増幅プライマー対を設計するために、モデル配列としてドメイン側面および内部ドメイン配列を容易に選択することができる。例えば、ドメイン領域IIからVIIをコードする核酸配列を、プライマー対を使用してPCR増幅によって縮重することができる。膜貫通ドメインI(TM I)配列を含む核酸を増幅するために、縮重プライマーを、上に記載のT2Rファミリーコンセンサス配列1のアミノ酸配列をコードする核酸から設計することができる。このような縮重プライマーを、TM IからTM III、TM IからTM IV、TM IからTM V、TM IからTM VI、またはTM IからTM VIIを組み込む結合領域に生成するために使用することができる。他の縮重プライマーを、本明細書に提供される他のT2Rファミリーコンセンサス配列に基づいて設計することができる。このような縮重プライマーを、TM IIIからTM IV、TM IIIからTM V、TM IIIからTM VI、またはTM IIIからTM VIIを組み込む結合領域を生成するために使用することができる。
縮重プライマー対を設計するためのパラダイムは、当技術分野において周知である。例えば、COnsensus−DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)ストラテジーコンピュータプログラムは、http://blocks.fhcrc.org/codehop.htmlでアクセス可能であり、既知の味覚受容体リガンド結合領域として一連の関連タンパク質配列から始めるハイブリッドプライマー予測のためのBlockMaker多重配列整列サイトと直接リンクする(例えば、Rose,Nucleic Acids Res.26:1628−1635(1998)、Singh,Biotechniques 24:318−319(1998)を参照)。
オリゴヌクレオチドプライマー対を合成する手段は、当技術分野において周知である。「天然の」塩基対または合成した塩基対を使用できる。例えば、人工的な核酸塩基を使用することにより、プライマー配列を操作し、増幅産物のより複雑な混合物を生成させるため、汎用性のある方法が提供される。人工的な核酸塩基の様々なファミリーは、内部結合の回転を介して、複数の水素結合配向性を呈することができ、縮重分子認識のための手段を提供する。PCRプライマーの単一の位置にこれらの類似体を組み込むことにより、増幅産物の複雑なライブラリを生成させることができる。例えば、Hoops,Nucleic Acids Res.,25:4866−71(1997)を参照。天然のDNA塩基の形態を模倣するため、非極性分子も利用できる。アデニンに対する非水素結合性型の模倣物は、チミンに対する非極性型の模倣物に対して、効率よく選択的に複製し得る(例えば、Morales,Nat.Struct.Biol.5:950−954(1998)を参照)。例えば、2つの縮重塩基は、ピリミジン塩基である6H,8H−3,4−ジヒドロピリミド[4,5−c][1,2]オキサジン−7−オンまたはプリン塩基であるN6−メトキシ−2,6−ジアミノプリンとすることができる(例えば、Hill,PNAS,95:4258−4263(1998)を参照)。本発明の例示的な縮重プライマーは、核酸塩基類似体である5´−ジメトキシトリチル−N−ベンゾイル−2´−デオキシ−シチジン,3´−[(2−シアノエチル)−−(N,N−ジイソプロピル)]−アミド亜リン酸(配列において文字「P」で示す、上記参照のこと)を組み込む。このピリミジン類似体は、プリン類(AおよびGの残基を含む)と水素結合する。
本明細書に開示される味覚受容体と実質的に同一である多型変異形、対立遺伝子、および種間ホモログは、上に記載の核酸プローブを使用して単離できる。あるいは、T2Rポリペプチドならびにその多型変異形、対立遺伝子、および種間ホモログをクリーニングするため、発現ライブラリを使用することができる(それは、T2Rポリペプチドに対して作られた抗血清または精製抗体(T2Rホモログをやはり認識し、それに選択的に結合するもの)を免疫学的に用いて、発現されたホモログを検出することにより、行われる)。
味覚受容体のリガンド結合領域をコードする核酸は、適切な(完全または縮重)プライマー対を使用して適当な核酸配列の増幅(例えばPCR)により、生成させ得る。増幅核酸は、任意の細胞または組織からのゲノムDNA、あるいは、味覚受容体を発現する細胞から得られるmRNAまたはcDNAとすることができる。
一実施形態において、転移配列(トランスロケーション配列)に融合されるT2Rをコードする核酸を含むハイブリッドタンパク質コード配列を構築し得る。また、ハイブリッドのT2Rが提供され、それは、転移モチーフ(トランスロケーションモチーフ)と、化学感覚受容体(特に、味覚受容体)の他のファミリーの味覚を引き出す化合物結合領域とを含む。これらの核酸配列は、転写または翻訳の調節因子(例えば、転写および翻訳の開始配列、プロモーターおよびエンハンサー、転写および翻訳のターミネーター、ポリアデニル化配列、およびDNAをRNAに転写するのに有用な他の配列)に作動可能に連結することができる。組換え発現カセット、ベクターおよび遺伝子組換えの構成において、すべての所望の細胞または組織で所望の核酸の発現を誘導するため、プロモーターフラグメントを使用することができる。
別の実施形態において、融合タンパク質は、C末端またはN末端の転移配列を含み得る。さらに、融合タンパク質は、追加の要素(例えば、タンパク質検出、精製、または他の用途のための要素)を含むことができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば、金属キレートペプチド(例えば、ポリヒスチジン領域、ヒスチジン−トリプトファンモジュール、あるいは、固定化された金属上での精製を可能にする他のドメイン)、マルトース結合タンパク質、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Aドメイン、または、FLAG伸長/アフィニティ精製系で使用されるドメイン(ワシントン州、Seattle、Immunex Corp.)がある。
開裂可能なリンカー配列(例えば、第Xa因子(例えばOttavi,Biochimie 80:289−293(1998)を参照)、スブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ(例えばPolyak,Protein Eng.10:615−619(1997)を参照))、エンテロキナーゼ(Invitrogen,San Diego,Calif.)等)を、転移ドメイン(効率的な原形質膜発現用)と新しく翻訳されるポリペプチドの残りの部分との間に入れることは、精製の促進に有用であり得る。例えば、1つの構成物は、チオレドキシンが後に続く6つのヒスチジン残基に結合される核酸配列コードのポリペプチドと、エンテロキナーゼ開裂部位(例えばWilliams,Biochemistry,34:1787−97(1995)を参照)と、C末端転移ドメインとを含むことができる。該ヒスチジン残基は検出および精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ開裂部位は、所望のタンパク質(類)を融合タンパク質の残りの部分から精製するための手段となる。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の応用に関する技術は、科学文献および特許文献に詳細に記載されている(例えば、Kroll,DNA Cell.Biol,.12:441−53(1993)を参照)。
リガンド結合領域をコードする配列を含む発現ベクター(単独の発現ベクターとして、あるいは、発現ベクターのライブラリとして)は、ゲノムに、細胞質に、あるいは、細胞の核に導入することができ、種々の通常の技法によって発現させることができ、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Roberts,Nature,328:731(1987)、Berger supra;Schneider,Protein Exper.Purif.,6435:10(1995)、Sambrook;Tijssen;Ausubelを参照。生物学的試薬および実験装置の製造者からの製品情報も、既知の生物学的方法に関する情報を提供するものである。ベクターは、天然の起源から単離することができ、ATCCまたはGeneBankライブラリのような起源から入手することができ、あるいは、合成または組換えの方法により調製できる。
核酸は、細胞において安定的または一過的に発現する(例えば、エピソームの発現系)発現カセット、ベクターまたはウイルス中で発現させることができる。形質転換された細胞および配列において選択可能な表現型をもたらすため、発現カセットおよびベクター中に選択マーカーを組み込むことができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの統合が必要でないよう、エピソームでの維持および複製をコードすることができる。例えば、マーカーは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の選別が可能になるよう、抗生物質耐性(例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン)、あるいは、除草剤耐性(例えば、クロロスルフロン、またはバスタ(Basta))をコードしてもよい(例えば、Blondelet−Rouault,Gene,190:315−17(1997)、Aubrecht,J.Pharmacol.Exp.Ther.,281:992−97(1997)を参照)。ネオマイシンまたはハイグロマイシン等の基質に対する耐性を付与する選択可能なマーカーの遺伝子は、組織培養においてのみ利用できるため、さらに、化学耐性遺伝子を、体外および生体内での選択可能なマーカーとして使用される。
キメラの核酸配列は、任意の7回膜貫通型ポリペプチド内においてT2Rリガンド結合領域をコードし得る。7回膜貫通型受容体ポリペプチド類は、類似する一次配列ならびに二次構造および三次構造を有するため、構造的ドメイン(例えば、細胞外ドメイン、TMドメイン、細胞質ドメイン等)は、配列解析によって容易に同定できる。例えば、ホモロジーモデリング、フーリエ解析、およびらせん周期の検出によって、7回膜貫通型受容体配列を有する7つのドメインを同定し、特徴付けることができる。高速フーリエ変換(FFT)のアルゴリズムを使用して、分析配列の疎水性および変動性のプロファイルを特徴付ける支配的な周期を評価することができる。周期性検出の強化およびアルファらせん周期の指標もまた、例えば、Donnelly Protein Sci.2:55−70(1993)により行うことができる。他のアラインメントおよびモデル化のアルゴリズムも当該技術分野において周知である(例えば、Peitsch,Receptors Channels,4:161−64(1996)、Kyte & Doolittle,J.Md.Biol.,157:105−32(1982)、およびCronet,Protein Eng.,6:59−64(1993)を参照)。
また、本発明は、特定の核酸配列およびアミノ酸配列を有する核酸分子およびポリペプチドのみならず、そのフラグメント、特に、例えば40、60、80、100、150、200、もしくは250のヌクレオチドまたはそれ以上のフラグメント、さらには、例えば10、20、30、50、70、100、もしくは150のアミノ酸またはそれ以上のポリペプチドフラグメントも含む。任意で、該核酸のフラグメントは、T2Rファミリーのメンバーに対して生じる抗体に結合できる抗原性ポリペプチドをコードすることができる。さらに、本発明のタンパク質フラグメントは、任意に、T2Rファミリーのメンバーに対して生じる抗体に結合できる抗原性フラグメントとすることができる。
また、キメラタンパク質も想定され、別のGPCR(好ましくは7回膜貫通型スーパーファミリーのメンバー)の全体または一部に相当する付加的なアミノ酸に結合する、本明細書に記載のT2Rポリペプチドのうちの少なくとも1つの、少なくとも10、20、30、50、70、100、もしくは150のアミノ酸またはそれ以上を含む。これらのキメラは、本受容体と別のGPCRとから作ることができ、あるいは、本受容体類の2つ以上を組み合わせることにより作ることができる。一実施形態において、該キメラの一部分は、本発明のT2Rポリペプチドの膜貫通ドメインに相当するものまたはそれに由来するものである。別の実施形態において、該キメラの一部分は、本明細書に記載のT2Rポリペプチドの1つ以上の膜貫通領域に相当するものまたはそれらに由来するものであり、残りの部分は、別のGPCRに由来するものとすることが可能である。キメラの受容体は当該技術分野において周知であり、また、それらを調製する技法およびそこでの組み込みのためのGタンパク質共役受容体のドメインまたはフラグメントの選択および範囲も周知である。したがって、そのようなキメラの受容体を作るため、当業者のこの知識を容易に使用することができる。そのようなキメラ受容体の使用は、例えば、本明細書に具体的に開示される受容体の1つの味選択性の特性と、別の受容体(例えば、従来技術のアッセイ系に使用される周知の受容体)のシグナル伝達特性とが組み合わされる。
例えば、リガンド結合領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、N末端ドメイン、C末端ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせ等の領域は、異種タンパク質に共有結合することができる。例えば、T2Rの膜貫通領域を、異種GPCR膜貫通ドメインに結合することができ、あるいは、異種GPCR細胞外ドメインを、T2Rの膜貫通領域に結合することができる。最適な他の異種タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質、ベータガラクトシダーゼ、グルタミン酸受容体、およびロドプシンポリペプチド、例えば、ロドプシン(例えば、ウシロドプシン)N末端断片を含み得る。
また、本発明のT2R、フラグメント、または変異形を発現するための異なる宿主細胞を使用することは、本発明の範囲内である。クローニングした遺伝子または核酸(例えば、本発明のT2R、フラグメント、または変異形をコードするcDNA)の高レベルな発現を得るため、当業者は、典型的に、着目核酸配列を発現ベクターにサブクローニングする(該発現ベクターは、転写を誘導するための強いプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、タンパク質をコードする核酸の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む)。適当な細菌のプロモーターは、当該技術分野において周知であり、例えばSambrook et al.に記載されている。好ましくは、真核細胞の発現系は、対象hT2R受容体を発現するために使用される。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するために、いかなる既知の手順をも使用することができる。これには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、および、クローニングしたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、または他の外来遺伝材料を宿主細胞に導入するための他の既知の任意の方法の使用を含む(例えばSambrook et al.を参照)。単に必要なことは、使用する特定の遺伝子工学法が、着目T2R、フラグメント、または変異形を発現できる宿主細胞に少なくとも1つの核酸分子をうまく導入することができるということである。
発現ベクターを細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を、着目受容体、フラグメント、または変異形の発現に有利な条件下で培養し、次いで、標準的な手法を用いて培養物から回収する。そのような技法の具体例は、当該技術分野において周知である。このような技法の例は、当業者には既知である。例えば、WO第00/06593号(本開示に一致するように、参照することにより本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
本発明によるhT2Rの活性を調節する化合物の検出のためのアッセイ
本発明によるhT2Rの活性を調節する化合物の検出のためのアッセイ
検査化合物が、生体外および生体内の両方において、本発明のT2Rポリペプチドと特異的に結合するかどうかを判定するための方法および組成物を後述する。細胞生理機能の側面の多くを、自然発生またはキメラのT2Rとのリガンド結合の効果を評価するために監視することができる。これらのアッセイは、T2Rポリペプチドを発現する無傷細胞上、透過性化細胞上、または標準的な方法によって生成された膜画分上で行うことができる。
味覚受容体は、味覚を引き出す化合物に結合し、電気シグナルへの化学的刺激の伝達を開始する。活性化または抑制されたGタンパク質は、標的酵素、チャネル、および他のエフェクタータンパク質の特性を順に変化させる。一部の例は、視覚系のトランスデューシンによるcGMPホスホジエステラーゼの活性化、刺激性Gタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ、Gqおよび他の同族Gタンパク質によるホスホリパーゼC、ならびにGiおよび他のGタンパク質による多様なチャネルの調節である。ダウンストリーム結果分析もまた、ホスホリパーゼCによるジアシルグリセロールおよびIP3の産生、および、ひいては、IP3によるカルシウム動員に対して試験することができる。
アッセイの対象hT2Rタンパク質またはポリペプチドは、典型的に、本特許請求の範囲の前に記載される配列リストに含有される配列を有するポリペプチドまたはフラグメントもしくはその保存的に修飾された変異形から選択される。
あるいは、アッセイのT2Rタンパク質またはポリペプチドは、真核宿主細胞に由来することができ、これらのhT2Rポリペプチドとの、ある割合のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列またはその保存的に修飾された変異形を含むことができる。概して、アミノ酸配列同一性は、少なくとも30%、好ましくは30〜40%、さらに具体的には50〜60、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%である。任意で、アッセイのT2Rタンパク質またはポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等のT2Rポリペプチドの領域を含むことができる。任意で、本明細書に例示されるように、T2Rポリペプチド、またはその一部は、本明細書に記述したアッセイで使用されるキメラタンパク質を生成するために、共有結合的に異種タンパク質に連結することができる。
T2R活性のモジュレータは、組換えまたは自然発生の、いずれかの上記のようなT2Rタンパク質またはポリペプチドを使用して検査され得る。T2Rタンパク質またはポリペプチドは、単離、細胞に発現、細胞に由来する膜に発現、組織または動物に発現されることができ、組換えまたは自然発生のいずれか一方であることができる。例えば、舌切片、舌からの解離細胞、形質転換された細胞、膜を使用することができる。調節は、本明細書に記述される生体外または生体内アッセイの1つを使用して検査することができる。
モジュレータの検出
モジュレータの検出
検査化合物が、生体外および生体内の両方において、本発明のT2R受容体と特異的に結合するかどうかを判定するための組成物および方法を以下に記述する。細胞生理機能の側面の多くを、本発明のT2Rポリペプチドとのリガンド結合の効果を評価するために監視することができる。これらのアッセイは、化学感覚受容体を発現する無傷細胞上、透過性化細胞上、または標準的な方法によって、もしくは生体外で、デノボ合成タンパク質を使用して生成された膜画分上で行うことができる。
生体内で、味覚受容体は、味覚調節化合物に結合し、電気シグナルへの化学的刺激の伝達を開始する。活性化または抑制されたGタンパク質は、次いで、標的酵素、チャネル、および他のエフェクタータンパク質の特性を変化させる。一部の実施例は、視覚系のトランスデューシンによるcGMPホスホジエステラーゼ、刺激性Gタンパク質によるアデニル酸シクラーゼ、Gqおよび他の同族Gタンパク質によるホスホリパーゼCの活性化、ならびにGiおよび他のGタンパク質による多様なチャネルの調節である。ダウンストリーム結果分析もまた、ホスホリパーゼCによるジアシルグリセロールおよびIP3の産生、および、ひいては、IP3によるカルシウム動員に対して試験することができる。
あるいは、アッセイのT2Rタンパク質またはポリペプチドは、真核宿主細胞に由来することができ、本明細書に開示したT2Rポリペプチドとのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは保存的に修飾された変異形を含むことができる。概して、アミノ酸配列同一性は、少なくとも35から50%、または任意で75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%である。任意で、アッセイのT2Rタンパク質またはポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン等のT2Rタンパク質のドメインを含むことができる。さらに、上記のように、T2Rタンパク質またはそのドメインは、本明細書に記述したアッセイで使用されるキメラタンパク質を生成するために、共有結合的に異種タンパク質に連結することができる。
T2R受容体活性のモジュレータは、組換えまたは自然発生の、いずれかの上記のようなT2Rタンパク質またはポリペプチドを使用して検査される。T2Rタンパク質またはポリペプチドは、単離、細胞に発現、細胞に由来する膜に発現、組織または動物に発現されることができ、組換えまたは自然発生のいずれであることもできる。例えば、舌切片、舌からの解離細胞、形質転換された細胞、膜を使用することができる。調節は、本明細書に記述される生体外または生体内アッセイのうちの1つを使用して検査することができる。
1.生体外結合アッセイ
1.生体外結合アッセイ
味覚伝達は、本発明のT2Rポリペプチドを使用して、溶解または固体状態反応において生体外でも検査することができる。特定の実施形態において、T2Rリガンド結合ドメインは、リガンド結合をアッセイするために、溶解または固体状態反応において生体外で使用することができる。
リガンド結合ドメインは、膜貫通ドメインの細胞外ループ等の細胞外ドメインの付加的な部分とともに、N末端ドメインによって形成され得る。
生体外結合アッセイは、代謝型グルタミン酸受容体等の他のGPCRとともに使用されている(例えば、Han and Hampson,J.Biol.Chem.274:10008−10013(1999)を参照)。これらのアッセイは、放射活性または蛍光標識したリガンドを置換すること、内部蛍光の変化またはタンパク質分解感受性の変化を測定すること等を伴う可能性がある。
本発明によるT2Rポリペプチドへのリガンド結合は、溶液中、任意で固相に付着される2重膜中、脂質単分子層中、または小胞中で検査することができる。モジュレータの結合は、例えば、分光学的特性(例えば、蛍光、吸収度、屈折率)水力学的(例えば、形状)、クロマトグラフィー、または溶解特性の変化を使用して検査することができる。
本発明の好ましい実施形態において、[35S]GTPγS結合アッセイを使用する。上記のように、GPCRの活性化後、Gタンパク質複合体のGαサブユニットは、結合したGDPをGTPと交換するように刺激される。Gタンパク質交換活性のリガンド媒介の刺激は、推定リガンドの存在下で、Gタンパク質に追加された放射活性標識した[35S]GTPγSの結合を測定する生化学アッセイにおいて測定することができる。典型的に、対象となる化学感覚受容体を含む膜は、Gタンパク質と混合される。潜在的な抑制剤および/または活性化因子ならびに[35S]GTPγSがアッセイに追加され、Gタンパク質との[35S]GTPγSの結合が測定される。結合は、液体シンチレーション計数によって、またはシンチレーション近接アッセイ(scintillation proximity assay:SPA)を含む当技術分野において既知の任意の他の手段によって測定することができる。他のアッセイ形式において、蛍光標識したGTPγSを利用することができる。
2.蛍光偏光アッセイ
2.蛍光偏光アッセイ
別の実施形態において、蛍光偏光(Fluorescence Polarization:「FP」)ベースのアッセイは、リガンド結合を検出および監視するために使用してもよい。蛍光偏光は、平衡結合、核酸ハイブリダイゼーション、および酵素活性を測定するための用途の広い検査技術である。蛍光偏光アッセイは、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、沈殿、または電気泳動等の分離ステップを必要としない点で同種的である。これらのアッセイは、直接溶液中でリアルタイムに行われ、固定化段階を必要としない。偏向の測定は急速に行われ、試料を破壊しないため、偏光値は繰り返し測定することができ、試薬の添加後行なうことができる。概して、この技術は、低いピコモルからマイクロモルレベルへのフルオロフォアの偏光値を測定するために使用することができる。この項では、蛍光偏光を試料中でどのように使用するか、および本発明のT2Rポリペプチドとのリガンドの結合を測定する定量的方法に関して説明する。
蛍光標識した分子が平面偏光で励起される時、それは、その分子の回転に反比例する程度に偏光した光を放射する。蛍光標識した大分子は、励起された状態(フルオレセインの場合には4ナノ秒)の間、比較的定常のままであり、光の偏光は、励起と放射との間で比較的一定のままである。蛍光標識した小分子は、励起された状態の間、急速に回転し、偏光は、励起と放射との間で著しく変化する。したがって、小分子は低い偏光値を有し、大分子は、高い偏光値を有する。例えば、一本鎖フルオレセイン標識したオリゴヌクレオチドは、比較的低い偏光値を有するが、相補鎖とハイブリダイズされた時には、より高い偏光値を有する。本発明の化学感覚受容体を活性化または抑制し得る味覚を引き出す化合物結合を検出および監視するためにFPを使用する場合、蛍光標識した味覚を引き出す化合物または自動蛍光の味覚を引き出す化合物が使用され得る。
Intparが励起光面と平行な放射光の強度であり、Intperpが励起光面と垂直な放射光の強度である。光度の比率であるPは、無次元数である。例えば、BeaconTMおよびBeacon2000TMシステムを、これらのアッセイに関して使用し得る。そのようなシステムは、典型的に偏光をミリ偏光単位(1偏光単位=1000mP単位)で示している。
分子旋光度およびサイズ間の関係は、Perrin方程式により説明され、読者は、この方程式を詳細に説明する、参照することにより組み入れられる、Jolley,M.E.(1991)in Journal of Analytical Toxicology,pp.236−240を参照する。要するに、Perrin方程式は、偏光が、回転緩和時間に比例するということであり、その回転緩和時間とは、分子が約68.5°の角度で回転するのにかかる時間のことである。回転緩和時間は、方程式:2(回転緩和時間)=3VRTによって、粘性(eta)、絶対温度(T)、分子容(V)、および気体定数(R)に関連している。
回転緩和時間は、小分子(例えば、フルオレセイン)に対しては小さく(約1ナノ秒)、大分子(例えば、免疫グロブリン)に対しては大きい(約100ナノ秒)。粘性および温度が一定に保たれるならば、回転緩和時間、および、それ故偏光は、分子容積に直接関連する。分子容積の変化は、他の分子との相互作用、蛍光標識した分子の解離、重合、分解、ハイブリダイゼーション、または立体構造変化に起因し得る。例えば、蛍光偏光は、プロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、およびリボヌクレアーゼによる多数のフルオレセイン標識ポリマーの酵素的切断を測定するために使用されてきた。また、タンパク質/タンパク質相互作用、抗体/抗原結合、およびタンパク質/DNA結合に対する平衡結合を測定するためにも使用されてきた。
A.固体状態および可溶性ハイスループットアッセイ
A.固体状態および可溶性ハイスループットアッセイ
さらに別の実施形態において、本発明は、T2Rポリペプチド、またはT2Rポリペプチドを発現する細胞もしくは組織を使用する可溶性アッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、ハイスループット形式における固相ベースの生体外アッセイを提供し、該T2Rポリペプチド、またはT2Rポリペプチドを発現する細胞もしくは組織は、固相基質もしくは味覚刺激化合物に付着され、T2R受容体と接触され、結合は、適切なタグまたはT2R受容体に対して生じる抗体を使用して検出される。
本発明のハイスループットアッセイにおいて、最大数千の異なるモジュレータまたはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された潜在的なモジュレータに対して別々のアッセイを行うために使用することができ、または濃度もしくはインキュベーション時間効果が観察される場合には、5〜10ウェルごとに1つのモジュレータを検査することができる。したがって、単一の標準的マイクロタイタープレートは、約100(例えば、96)モジュレータをアッセイすることができる。1536ウェルプレートを使用する場合には、単一のプレートは、約1000から約1500の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。各プレートウェルにおいて多数の化合物をアッセイすることもまた可能である。1日当たりいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可能であり、アッセイは、最大約6,000〜20,000の異なる化合物に対するアッセイスクリーニングは、本発明の統合システムを使用して可能である。さらに最近、試薬操作のためのマイクロ流体法を開発されている。
着目分子は、共有結合性または非共有結合性連結、例えばタグを介して、直接または間接的に固体状態の構成要素に結合することができる。タグは、任意の種々の構成要素であることができる。概して、タグ(タグ結合剤)に結合する分子は、固体支持に固定され、着目タグ分子(例えば、着目味覚伝達分子)は、タグの相互作用およびタグ結合剤によって固体支持に付着される。
多くのタグおよびタグ結合剤は、文献で広く説明される既知の分子相互作用に基づいて使用することができる。例えば、タグが、天然結合剤、例えば、ビオチン、タンパク質A、またはタンパク質Gを有する場合、適切なタグ結合剤(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域等)と組み合わせて使用することができる。また、ビオチン等の天然結合剤を有する分子に対する抗体も、広く利用可能であり、適切なタグ結合剤である(SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA,St.Louis Mo.を参照)。
同様に、任意のハプテン性または抗原性化合物は、タグ/タグ結合剤対を形成するために、適切な抗体と組み合わせて使用することができる。数千の特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献で説明されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは、第1の抗体であり、タグ結合剤は、第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまた、タグおよびタグ−結合剤対として適切である。例えば、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト(例えば、トランスフェリン、c−kit、ウイルス性受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等の細胞受容体−リガンド相互作用。例えば、Pigott&Power,The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)を参照)。同様に、毒素および毒液、ウイルス性エピトープ、ホルモン(例えば、オピエート、ステロイド等)、細胞内受容体(例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンD、を含む種々の小リガンドの効果を媒介するもの、ペプチド)、薬物、レクチン、糖、核酸(線状および環状ポリマー構成の両方)、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質ならびに抗体はすべて、種々の細胞受容体と相互作用することができる。
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンサルファイド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート等の合成ポリマーもまた、適切なタグまたはタグ結合剤を形成することができる。多くの他のタグ/タグ結合剤対も、本開示の検討により当業者に明らかであるように、本明細書に記述したアッセイシステムにおいて有用である。
ペプチド、ポリエーテル等の一般的なリンカーは、タグとして機能することができ、約5から約200アミノ酸のポリgly配列等のポリペプチド配列を含むことができる。そのような柔軟なリンカーは、当業者には既知である。例えば、ポリ(エチレングリコール)リンカーは、Shearwater Polymers,Inc.(アラバマ州、Huntsville)から入手可能である。これらのリンカーは、任意でアミド連結、スルフヒドリル連結、または異種機能的連結を有する。
タグ結合剤は、現在利用可能な任意の種々の方法を使用して、固体基質に固定される。固体基質は、タグ結合剤の一部と反応する表面に化学基を固定する化学試薬に、基質のすべてまたは一部をさらすことによって、一般的に誘導体化または機能化される。例えば、より長い鎖部分への付着に好適な基は、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基を含むであろう。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、ガラス表面等の種々の表面を機能化するために使用することができる。そのような固相バイオポリマー配列の構成は、文献で広く説明されている。例えば、Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)(例えば、ペプチドの固相合成について記述)、Geysen et al.,J.Immun.Meth.,102:259−274(1987)(ピン上の固相構成要素の合成について記述)、Frank&Doring,Tetrahedron,44:60316040(1988)(セルロースディスク上の種々のペプチド配列の合成について記述)、Fodor et al.,Science,251:767−777(1991)、Sheldon et al.,Clinical Chemistry,39(4):718−719(1993)、およびKozal et al.,Nature Medicine,2(7):753759(1996)(すべて、固体基質に固定されたバイオポリマーの配列について記述)を参照。タグ結合剤を基質に固定するための非化学的方法には、熱、紫外線放射による架橋結合等の他の一般的な方法を含む。
3.細胞ベースのアッセイ
3.細胞ベースのアッセイ
好適な一実施形態において、T2Rタンパク質は、修飾されない形態において、あるいは異種の、分泌経路を介するその成熟化および標的化を促進するシャペロン配列を有する、もしくは好ましくは有しないキメラ、変異形または短縮された受容体として真核細胞内で発現する。そのようなT2Rポリペプチドは、HEK−293細胞等の任意の真核細胞内に発現することができる。好ましくは、細胞は、細胞内シグナル伝達経路と、またはホスホリパーゼC等のシグナル伝達タンパク質とキメラ受容体を共役することができる、機能的Gタンパク質、例えば、Gα15、もしくはキメラGα16、ガストデューシンもしくはトランスデューシンもしくはG16gust44等のキメラGタンパク質を含む。そのような細胞内におけるT2R受容体の活性化は、例えば、細胞内のFURA−2依存性蛍光を検出することによって、細胞内カルシウムの変化を検出すること等による任意の標準的な方法を使用して検出することができる。そのようなアッセイは、本出願に提示される実験的発見の根拠である。
活性化されたGPCR受容体は、受容体C末端尾部(および可能性として他の部位も)をリン酸化するキナーゼのための基質であることが多い。したがって、活性化因子は、放射標識したATPから受容体への32Pの移動を促進し、これはシンチレーションカウンターでアッセイすることができる。C末端尾部のリン酸化は、アレスチン様タンパク質の結合を促進し、Gタンパク質の結合を妨げる。GPCRシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法の一般的検討に関しては、例えば、Methods in Enzymology,vols.237 and 238(1994)and volume 96(1983)、Bourne et al.,Nature,10:349:117−27(1991)、Bourne et al.,Nature,348:125−32(1990)、Pitcher et al.,Ann.Rev.Biochem.,67:653−92(1998)を参照。
T2R調節は、推定T2Rモジュレータで処置されたT2Rポリペプチドの応答を、未処置対照試料または既知の「陽性」対照を含む試料と比較することによってアッセイされ得る。そのような推定T2Rモジュレータは、T2Rポリペプチド活性を抑制または活性化する分子を含むことができる。一実施形態において、T2Rを活性化する化合物で処置された対照試料に、100の相対T2R活性値を割り当てる。対照試料に対するT2R活性値が約90%、任意で50%、任意で25〜0%である場合、T2Rポリペプチドの阻害が達成されるとする。該対照に対するT2R活性値が110%、任意に150%、200〜500%、または1000〜2000%である場合、T2Rポリペプチドの活性が達成されるとする。
イオン流出の変化は、T2Rポリペプチドを発現する細胞または膜のイオン偏光(つまり、電位)の変化を測定することによって、評価され得る。細胞偏光の変化を測定するための一手段は、電圧クランプおよびパッチクランプ技術で電流の変化を測定すること(それによって、偏光の変化を測定すること)によるものである(例えば、「細胞付着」モード、「インサイドアウト」モード、および「全細胞」モード、例えば、Ackerman et al.,New Engl.J Med.,336:1575−1595(1997)を参照)。全細胞電流は、標準法を使用して都合よく測定される。他の既知のアッセイには、放射標識されたイオン流出アッセイおよび電圧感受性色素を使用する蛍光アッセイを含む(例えば、Vestergarrd−Bogind et al.,J.Membrane Biol.,88:67−75(1988)、Gonzales&Tsien,Chem.Biol.,4:269−277(1997)、Daniel et al.,J.Pharmacol.Meth.,25:185−193(1991)、Holevinsky et al.,J.Membrane Biology,137:59−70(1994)を参照)。
ポリペプチドの機能への検査化合物の効果は、上記のパラメータのいずれかを検討することによって測定することができる。GPCR活性に影響を及ぼす任意の好適な生理学的変化は、本発明のポリペプチドへの検査化合物の影響を評価するために使用することができる。機能的結果が無傷細胞または動物を使用して判定される場合、伝達物質放出、ホルモン放出、既知および未同定の遺伝子マーカーの両方に対する転写変化(例えば、ノーザンブロット)、細胞増殖またはpH変化等の細胞代謝の変化、およびCa2+、IP3、cGMP、またはcAMP等の細胞内2次メッセンジャーの変化等の種々の効果を測定することもできる。
GPCRのための好適なアッセイは、受容体活性を報告するために、イオンまたは電圧感受性色素を付与した細胞を含む。また、そのような受容体の活性を測定するためのアッセイは、検査された化合物の活性を評価するために、対照としての他のGタンパク質共役受容体に対する既知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用することもできる。調節化合物(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト)を同定するためのアッセイにおいて、細胞質または膜電圧におけるイオンレベルの変化は、イオン感受性または膜電圧蛍光指標をそれぞれ使用して監視される。使用され得るイオン感受性の指標および電圧プローブには、Molecular Probes 1997Catalogに開示されるものがある。Gタンパク質共役受容体では、Gα15およびGα16等の乱交雑Gタンパク質を選択したアッセイにおいて使用することができる(Wilkie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 88:10049−10053 (1991))。あるいは、ガストデューシン、トランスデューシン等の他のGタンパク質、およびGα16ガスト44またはGalpha16t25等のキメラGタンパク質が使用され得る。
受容体活性化は、その後の細胞内現象、例えば、2次メッセンジャーの増加を開始させる。一部のGタンパク質共役受容体の活性化は、ホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼC媒介の加水分解を介して、イノシトール3リン酸(IP3)の形成を刺激する(Berridge&Irvine,Nature,312:315−21(1984))。IP3は、次いで、細胞内カルシウムイオン貯蔵の放出を刺激する。したがって、細胞質カルシウムイオンレベルの変化、またはIP3等の2次メッセンジャーレベルの変化は、Gタンパク質共役受容体機能を評価するために使用することができる。そのようなGタンパク質共役受容体を発現する細胞は、細胞内貯蔵からのカルシウム放出および原形質膜イオンチャネルを経由する細胞外カルシウム流入の両方からの寄与の結果として、細胞質カルシウムレベルの増加を示し得る。
好適な実施形態において、T2Rポリペプチド活性は、受容体をホスホリパーゼCシグナル伝達経路に連結させる乱交雑Gタンパク質を有する異種細胞において、T2R遺伝子を発現することによって測定される(Offermanns&Simon,J.Biol.Chem.,270:15175−15180(1995)を参照)。好ましくは、細胞株はHEK−293(通常、T2R遺伝子を発現しない)であり、乱交雑Gタンパク質は、Gα15(Offermanns&Simon、上記参照)またはGα16ガスト44等のキメラGタンパク質である。味覚伝達の調節は、T2Rポリペプチドと関連する分子の投与を介したT2Rシグナル伝達経路の調節に対する応答の変化である、細胞内Ca2+レベルの変化を測定することによってアッセイされる。Ca2+レベルの変化は、任意で、蛍光Ca2+指標色素および蛍光定量イメージングを使用して測定される。
別の実施形態において、ホスファチジルイノシトール(phosphatidyl inositol:PI)加水分解は、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第5,436,128号に従って分析することができる。簡潔には、アッセイは、48時間以上3H−ミオイノシトールで細胞を標識することを含む。標識された細胞は、1時間検査化合物で処置する。処置された細胞を溶解し、クロロホルム−メタノール−水で抽出し、その後、イノシトールリン酸をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、シンチレーション測定で定量化した。刺激比は、アゴニストの存在下のcpmと緩衝液対照の存在下のcpmとの比率を計算することによって決定する。同様に、抑制比は、アンタゴニストの存在下のcpmと緩衝液対照(アゴニストを含有してもよく、またはしなくてもよい)の存在下のcpmとの比率を計算することによって決定する。
他の受容体アッセイは、細胞内環状ヌクレオチド、例えば、cAMPまたはcGMPのレベルを測定することを含み得る。受容体の活性化が環状ヌクレオチドレベルの減少に繋がる場合では、アッセイにおいて受容体活性化化合物を細胞に加える前に、細胞内環状ヌクレオチドレベル、例えば、フォルスコリンを増加させる薬剤に細胞をさらすことが好適であり得る。一実施形態において、細胞内cAMPまたはcGMPの変化は、イムノアッセイを使用して測定することができる。Offermanns&Simon,J.Bio.Chem.,270:15175−15180(1995)に記載される方法を、cAMPのレベルを測定するために使用することができる。また、Felley−Bosco et al.,Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.,11:159−164(1994)に記載される方法を、cGMPのレベルを測定するために使用することができる。さらに、cAMPおよび/またはcGMPを測定するためのアッセイキットは、米国特許第4,115,538号に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
別の実施形態において、転写レベルは、シグナル伝達への検査化合物の効果を評価するために測定することができる。着目T2Rポリペプチドを含有する宿主細胞を、任意の相互作用をもたらすのに十分な時間検査化合物と接触させ、次いで、遺伝子発現のレベルを測定する。そのような相互作用をもたらす時間は、時間的経過を追い、時間の関数としての転写レベルを測定すること等によって、経験的に判定され得る。転写量は、好適であるとして当業者には既知の任意の方法を使用して測定され得る。例えば、着目タンパク質のmRNA発現は、ノーザンブロットを使用して検出することができ、またはそれらのポリペプチド産物は、イムノアッセイを使用して同定することができる。あるいは、レポーター遺伝子を使用する転写ベースのアッセイを、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第5,436,128号に記載されるように使用することができる。レポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータラクタマーゼおよびアルカリホスファターゼであることができる。さらに、着目タンパク質は、緑色蛍光タンパク質等の第2のレポーターへの付着を介する間接的レポーターとして使用することができる(例えば、Mistili&Spector,Nature Biotechnology,15:961−964(1997)を参照)。
転写量は、次いで、検査化合物の非存在下における一方の同じ細胞内の転写量と比較されるか、あるいは着目T2Rポリペプチドを欠く実質的に同一の細胞内の転写量と比較され得る。実質的に同一の細胞は、組換え細胞が調製されたが、異種DNAの導入によって修飾されなかった同じ細胞に由来し得る。転写量におけるいかなる差異も、検査化合物が、着目T2Rポリペプチドの活性を何らかの方法で変化させたことを示す。
4.化学感覚受容体を発現する非ヒトトランスジェニック動物
4.化学感覚受容体を発現する非ヒトトランスジェニック動物
本発明の1つ以上の味覚受容体配列を発現する非ヒト動物も、受容体アッセイに使用することができる。そのような発現は、化学感覚受容体またはそのリガンド結合領域をコードする核酸で安定的または過渡的にトランスフェクトされた非ヒト動物を、検査化合物を接触させることによって、ならびに、受容体ポリペプチド複合体に特異的に結合させることにより検査化合物に動物が反応するかどうかを判定することによって、検査化合物が、生体内の哺乳類味覚膜貫通受容体複合体に特異的に結合するかどうかを測定するために使用することができる。
本発明のベクターでトランスフェクトされたまたはそれに感染した動物は、特異的または一連の受容体に結合することができる味覚刺激を同定および特徴付けるためのアッセイに特に有用である。そのようなヒト味覚受容体配列を発現するベクターに感染した動物は、味覚刺激および例えば、細胞生理機能(例えば、味覚ニューロン)への、CNS、または行動へのそれらの効果の生体内スクリーニングのために使用することができる。
単独にまたはライブラリとして、核酸およびベクターを感染/発現させる手段は、当技術分野において既知である。種々の個々の細胞、器官、または動物全体のパラメータは、種々の手段によって測定することができる。本発明のT2R配列は、感染性病原体、例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いた送達によって、例えば、動物味覚組織内に発現することができる。
内在性味覚受容体遺伝子は、機能的なままであることができ、野生型(天然)活性は、依然として存在することができる。他の状況において、すべての味覚受容体活性が、外来性ハイブリッド受容体によって導入されることが望ましい場合、ノックアウトラインの使用が好適である。非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの構成、ならびに形質転換した細胞を産生するための組換えコンストラクトの選択および調製のための方法は、当技術分野において既知である。
「ノックアウト」細胞および動物の構成は、哺乳類細胞内の特定の遺伝子の発現レベルは、抑制される遺伝子のDNA配列のいくらかの部分を妨害するように機能する新しいDNA配列内へゲノムを導入することによって、減少または完全に抑止され得るという前提に基づいている。また、「遺伝子トラップ挿入」は、宿主遺伝子を破壊するために使用することができ、マウス胚性幹(embryonic stem:ES)細胞を、ノックアウトトランスジェニック動物を作製するために使用することができる(例えば、Holzschu,Transgenic Res.6:97−106(1997)を参照)。外来性の挿入は、典型的に、相補的核酸配列間の相同組換えによるものである。外来性配列は、エクソン、イントロンもしくは転写制御配列、または標的遺伝子の発現レベルに影響を与えることができる任意のゲノム配列、あるいはそれらの組み合わせ等の、修飾される標的遺伝子のいくらかの部分である。多能性胚性幹細胞における相同組換えを介した遺伝子標的化は、着目ゲノム配列を正確に修飾することを可能にする。いずれの技術もノックアウト動物を生成、スクリーニング、繁殖するために使用することができる、例えば、Bijvoet,Hum.Mol.Genet.7:53−62(1998)、Moreadith,J.Mol.Med.75:208−216(1997)、Tojo,Cytotechnology 19:161−165(1995)、Mudgett,Methods Mol.Biol.48:167−184(1995)、Longo,Transgenic Res.6:321−328(1997)、米国特許第5,616,491号、同第5,464,764号、同第5,631,153号、同第5,487,992号、同第5,627,059号、同第5,272,071号、WO第91/09955号、WO第93/09222号、WO第96/29411号、WO第95/31560号、WO第91/12650号を参照。
本発明の核酸は、「ノックアウト」ヒト細胞およびそれらの子孫を生成するために、試薬としても使用することができる。同様に、本発明の核酸は、マウスにおいて「ノックイン」を生成するために、試薬として使用することもできる。ヒトまたはラットT2R遺伝子配列は、マウスゲノムにおいてオルソログT2Rを交換することができる。このようにして、ヒトまたはラットT2Rを発現するマウスを生成する。次いで、このマウスは、ヒトまたはラットT2Rの機能を分析するために、およびそのようなT2Rのためのリガンドを同定するために使用することができる。
モジュレータ
モジュレータ
T2Rファミリーメンバーのモジュレータとして検査される化合物は、任意の小さい化学化合物、またはタンパク質、糖、核酸もしくは脂質等の生物学的実体であることができる。あるいは、モジュレータは、T2Rファミリーメンバーの遺伝的に変化された型であり得る。典型的に、検査化合物は、小さい化学分子およびペプチドであり得る。ほとんどの場合、化合物は水溶液または有機(特に、DMSOベースの)溶液中に溶解されて使用されるが、基本的に、任意の化学化合物を、本発明のアッセイにおいて潜在的なモジュレータまたはリガンドとして使用することができる。アッセイは、アッセイステップを自動化し、典型的に平行して行われるアッセイ(例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形態で)に、便利な源から化合物を提供することによって、大きな化学ライブラリをスクリーニングするように設計され得る。Sigma(St.Louis,Mo.)、Aldrich(St.Louis,Mo.)、Sigma−Aldrich(St.Louis,Mo.)、Fluka Chemika−Biochemica Analytika(Buchs,Switzerland)等を含む多くの化学化合物供給業者が存在することを理解されたい。
一実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的な治療的化合物(潜在的なモジュレータまたはリガンド化合物)を含む組み合わせ化学またはペプチドライブラリを提供することを含む。次いで、そのような「組み合わせ化学ライブラリ」または「リガンドライブラリ」を、所望の特徴的活性を表示するそれらのライブラリメンバー(特定化学種またはサブクラス)を同定するために、本明細書に記載されるように、1つ以上のアッセイにおいてスクリーニングする。したがって、同定された化合物は、従来の「リード化合物」として機能することができ、またはそれら自体を潜在的なもしくは実際の消費者製品として使用することができる。
組み合わせ化学ライブラリは、試薬等の多くの化学的「ビルディングブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成によって産生された多様な化学化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリ等の線状組み合わせ化学ライブラリは、所与の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)に対して、可能な限りの方法で、一連の化学ビルディングブロック(アミノ酸)を組み合わせることによって形成される。数百万の化学化合物を、化学ビルディングブロックのそのような組み合わせ混合によって合成することができる。
組み合わせ化学ライブラリの調製およびスクリーニングは、当業者には既知である。そのような組み合わせ化学ライブラリは、ペプチドライブラリ(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.,37:487−93(1991)およびHoughton et al.,Nature,354:84−88(1991)を参照)を含むがこれらに限定されない。また、化学的に多様なライブラリを生成するための他の化学物質を使用することもできる。そのような化学物質としては、ペプトイド(例えば、WO第91/19735号)、コードされたペプチド(例えば、WO第93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、WO第92/00091号)、ベンゾジアゼピン類(例えば、米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン類、ベンゾジアゼピン類およびジペプチド等のダイバーソマー(Hobbs et al.,PNAS.,90:6909−13(1993))、ビニローグポリペプチド(Hagihara et al.,J.Amer.Chem.Soc.,114:6568(1992))、グルコーススカホールドを持つ非ペプチド性ペプチド類似体(Hirschmann et al.,J.Amer.Chem.Soc.,114:9217−18(1992))、小型化合物ライブラリの類似体有機合成(Chen et al.,J.Amer. Chem.Soc.,116:2661(1994))、オリゴカルバメート(Cho et al.,Science,261:1303(1993))、ペプチジルホスフォネート(Campbell et al.,J.Org.Chem.,59:658(1994))、核酸ライブラリ(Ausubel,Berger,and Sambrook,すべて前出)、ペプチド核酸ライブラリ(米国特許第5,539,083号)、抗体ライブラリ(Vaughn et al.,Nature Biotechnology,14(3):309−14(1996)およびPCT/US第96/10287号)、糖ライブラリ(Liang et al.,Science,274:1520−22(1996)および米国特許第5,593,853号)、小型有機分子ライブラリ(benzodiazepines,Baum,C&EN,Jan 18,page 33(1993)、チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号、ピロリジン、米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号、モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号、ベンゾジアゼピン、同第5,288,514号等)を含むが、これらに限定されない。
組み合わせライブラリの作製のための装置は、市販されている(例えば、357MPS,390MPS(Advanced Chem.Tech(ケンタッキー州、Louisville))、Symphony(Rainin(マサチューセッツ州、Woburn))、433A(Applied BioSystems(カリフォルニア州、Foster City))、9050 Plus(Millipore(マサチューセッツ州、Bedford))を参照)。さらに、数々の組み合わせライブラリは、それ自体が市販されている(例えば、ComGenex(Princeton、ニュージャージー州)、Tripos,Inc.(ミズーリー州、St.Louis)、3DPharmaceuticals(ペンシルバニア州、Exton)、Martek Biosciences(メリーランド州、Columbia)等を参照)。
本発明の一側面において、T2Rモジュレータは、それによって、生成物、組成物、または成分の味覚を所望の方法で調節するために、任意の食品、菓子類、医薬組成物、またはその原料中に使用することができる。例えば、苦味感覚を増強させるT2Rモジュレータは、生成物または組成物に苦味を提供するために添加することができ、一方、苦味感覚を遮断するT2Rモジュレータは、生成物または組成物の苦味を遮断するために添加することができる。また、本発明は、食物、飲料、および医薬品に認められる苦味化合物を同定する手段、およびそれを欠く、または減少した量を有する、味を改善した、食物、飲料、および医薬品を作製する手段を提供する。
本発明により同定された化合物の使用
本発明により同定された化合物の使用
本発明に従って同定された化合物は、図2に含まれる苦味化合物、または構造上関連する化合物もしくは他の苦味化合物、例えば、苦味知覚を引き出す食物および飲料または医薬品または化粧品に認められる化合物のうちの少なくとも1つによる、hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9A、hT2R9V、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R44、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75およびhT2R76、ならびにhT2R54のうちの少なくとも1つの活性化により誘発される、苦味を調節する、好ましくは遮断するために、食物、飲料、化粧品または医薬品に添加することができる。
前述のように、好ましくは、対象T2R細胞ベースのアッセイにおいて同定された化合物の味覚調節特性、好ましくは苦味遮断特性は、ヒトまたは動物味覚検査、好ましくはヒト味覚検査において確認される。
キット
キット
T2R遺伝子およびそれらのホモログは、味覚受容体細胞の同定のために、法医学的および父子確認のために、および味覚伝達を試験するために有用な道具である。T2Rプローブおよびプライマー等のT2R核酸と特異的にハイブリダイズするT2Rファミリーメンバーに特異的な試薬、ならびにT2Rタンパク質に特異的に結合するT2Rに特異的な試薬、例えば、T2R抗体は、味覚細胞発現および味覚伝達制御を試験するために使用される。
試料中のT2Rファミリーメンバーに対するDNAおよびRNAの存在を調べる核酸アッセイは、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット、リボヌクレアーゼプロテクション、S1解析、PCR等の増幅技術、およびインサイツハイブリダイゼーション等の当業者には既知である多数の技術を含む。in situハイブリダイゼーションにおいて、例えば、標的核酸を、細胞内のハイブリダイゼーションに利用可能となるように、細胞環境から遊離させる一方、その後の解釈および解析のための細胞の形態を保存する。以下の論文は、インサイツハイブリダイゼーション技術の概要を提供する。Singer et al.,Biotechniques,4:230250(1986)、Haase et al.,Methods in Virology,vol.VII,189−226(1984)、およびNames et al.,eds.,Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(1987)。さらに、T2Rタンパク質は、上記の種々のイノムアッセイ法で検出することができる。検査試料は、典型的に、陽性対照(例えば、組換えT2Rタンパク質を発現する試料)および陰性対照の両方と比較される。
また、本発明は、T2Rファミリーメンバーのモジュレータをスクリーニングするためのキットも提供する。そのようなキットは、容易に入手可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、そのようなキットは、以下の材料の任意の1つ以上を含むことができる。T2R核酸またはタンパク質、反応管、およびT2R活性を検査するための説明書。任意に、該キットは、機能的T2Rポリペプチドを含む。多種多様のキットおよび構成要素は、キットの対象となるユーザおよびユーザの特定の必要性に応じて、本発明に従って調製することができる。
本発明を概して説明してきたが、例証の目的で与えられるものであり、限定を意図するものではない、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において開示した例示的な実施形態に種々の修正および変更ができることを理解されたい。
実施例1
本実施例において、hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75およびhT2R76のうちの1つ、ならびにそれ(特許請求の範囲の前に記載の配列リストに含まれるこれらのhT2RおよびキメラGタンパク質に対する配列)と結合するキメラGタンパク質を安定的または過渡的に発現するHEK−293細胞を生成し、これらの細胞は、これらの苦味受容体のそれぞれを特異的に活性化する化合物を同定するために異なる苦味リガンドに対してスクリーニングされた。
本実施例において、hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75およびhT2R76のうちの1つ、ならびにそれ(特許請求の範囲の前に記載の配列リストに含まれるこれらのhT2RおよびキメラGタンパク質に対する配列)と結合するキメラGタンパク質を安定的または過渡的に発現するHEK−293細胞を生成し、これらの細胞は、これらの苦味受容体のそれぞれを特異的に活性化する化合物を同定するために異なる苦味リガンドに対してスクリーニングされた。
さらに具体的には、異なる苦味リガンドによるこれらの受容体の活性化は、細胞内カルシウム濃度の変化を検出する細胞ベースのアッセイにおいて測定される。簡潔に言うと、ヒト胎児由来腎臓細胞を、48ウェル組織培養プレートに播種する。24時間後、これらの播種されたHEK−293細胞は、キメラGタンパク質(G16gust44)(配列番号2)をコードする配列を含有する発現プラスミド(pEAK10)で過渡的にトランスフェクトされ、また、リン酸Ca2+あるいは脂質ベース系のいずれかにより特定のhT2R核酸配列を含むpEAK10発現プラスミドで過渡的にトランスフェクトされる。さらに、pEAK10プラスミドに含まれるhT2R配列は、それぞれ、hT2R配列の上流のRho−35タグまたはSSTR−3タグを含むように改変され、したがって、ロドプシンタンパク質(配列番号l)の35アミノ酸またはSSTR−3タンパク質の45アミノ酸のN末端タグを発現する。
さらに24時間後、過渡的にトランスフェクトされた細胞を、カルシウムに特異的な蛍光色素(Fluo−4;Molecular Probes)とともにインキュベートする。これらの充填された細胞は、その後、異なる苦味分子にさらされる。苦味リガンドによるhT2Rの活性化は、G16gust44の活性化をもたらし、それは、細胞内へのカルシウム動員をもたらす。その結果、細胞内カルシウムのこの変化は、蛍光色素に、蛍光顕微鏡を使用して監視される蛍光の検出可能な変化を生じさせる。具体的には、このカルシウム濃度の増加は、細胞内のカルシウム色素の蛍光特性を変化させ、これらの変化は、蛍光顕微鏡および特別に設計されたソフトウェア(Imaging Workbench,Axon)を使用して監視される。
また、アッセイを、若干異なるプロトコルを使用して自動蛍光イメージングシステム(FLIPR)で行うことができる。本プロトコルにおいて、G16gust44を安定して発現するHEK−293細胞株は、hT2R発現プラスミドでトランスフェクトさせ、24時間後、細胞を染料充填し、FLIPRで分析する。
さらに、本方法を使用してリガンドが特定のhT2Rに対し同定されると、それにより特定のhT2RおよびキメラGタンパク質(G16gust44)を安定的に発現するHEK−293細胞株を生成する。
多数の苦味リガンドは、記載される濃度で上記の同定されたhT2Rに対してアッセイされた。各hT2Rのこれらのアッセイの結果は、図2に要約される。検査された各hT2Rは、少なくとも1つの苦味リガンドにより特異的に活性化されることが認められ得る。表結果から見られるように、典型的に、特定のhT2Rは、異なる構造を有する多くの異なる苦味リガンドに応答する。また、図2の結果は、多くの苦味リガンドは、1つ以上のhT2Rを特異的に活性化することを示す。これらの苦味リガンドに使用される濃度を、図3に含む。
実施例2:hT2R9対立遺伝子変異形およびアッセイ
実施例2:hT2R9対立遺伝子変異形およびアッセイ
hT2R9および他のヒトT2Rの脱オーファン化は、前述の実施例において報告される。本実施例は、特に、本明細書の特許請求の範囲の前に記述される配列リストにおける配列に含まれるhT2R9配列に関する。それに関し、hT2R9の2つのハプロタイプがあることがKimら(Hum Mutat.2005 Sep;26:199−204)により報告されている。双方のT2R9ハプロタイプ(hT2R9AおよびhT2R9V)のタンパク質およびDNA配列は、配列リストの配列番号13〜16に含まれる。hT2R9Vと称するものは、検査された苦味リガンドについて、非機能的対立遺伝子の様相を呈し、その一方、他の対立遺伝子、hT2R9Aは、検査された苦味リガンドについて、機能的である。2つの対立遺伝子は、アミノ酸位置187で1つのアミノ酸残基により異なり、hT2R9Aは、Ala残基を含むが、hT2R9Vは、代わりにVal残基を含む。Kimら(Hum Mutat.2005 Sep;26:199−204)によると、それらの2つのハプロタイプは、ヒトハロタイプの集団の約91%(hT2R9V 55.5%、およびhT2R9A 35.5%)を占める。
上述の実施例に記載されるように、hT2R9を含む23の異なるヒト味覚受容体をうまく脱オーファン化した。hT2R9の2つの主要なハプロタイプは、hT2R9VおよびhT2R9Aとして本明細書で称される。それに対応する核酸およびアミノ酸配列は、特許請求の範囲の前に記述される配列リストに含まれる。
まず、hT2R9V配列を、クローン化した。その後、hT2R9A配列をクローン化し、双方を、T2R9リガンドを同定するためにRho標識された発現ベクターおよび同じHEK−293細胞ベースのアッセイを使用して発現した。これらのhT2R9配列の双方を、同じリガンドを使用して、これらのアッセイにおいて評価した。hT2R9Aは、オフロキサシンと接触させた場合、活性を示したが、同じアッセイ条件下で、hT2R9Vまたは偽トランスフェクトされたHEK−293細胞は活性を示さなかったことが観察された(図4を参照)。
さらに、同じT2R9配列は、SSTR−3タグを含む異なる発現構成を使用してアッセイされた(Bufe et al.,Nat.Genet.32:397−400(2002))。これらの結果は、過渡的にトランスフェクトされた細胞およびFLIPRを使用して図5に含まれる用量依存曲線を生じた。これらの結果は、前述の実験と一致し、hT2R9Aが機能的である、すなわち、特異的苦味リガンドに応答する一方、hT2R9Vは同一の苦味リガンドに応答しないことを示唆する。上記のように、T2RおよびT1Rはともに、胃腸細胞に発現することが知られており、消化および代謝機能および疾患に潜在的に役割を果たすと考えられている。したがって、これらのT2R9対立遺伝子の一方または双方は、治療的スクリーニングアッセイにおいて有用であり得る。また、hT2R9を含むhT2R配列におけるそのような対立遺伝子変異は、一部の個人、例えば、hT2R9Aを有する人々の群に対し、hT2R9V対立遺伝子に対して同型である群の間で苦味リガンドへの異種応答に関与し得る。
(a) キメラGタンパク質およびhT2R遺伝子およびポリペプチドの配列
(a) キメラGタンパク質およびhT2R遺伝子およびポリペプチドの配列
ロドプシンタグのタンパク質配列:(配列番号1)
MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPW
MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPW
G16gust44のタンパク質配列:(配列番号2)
MARSLTWRCCPWCLTEDEKAAARVDQEINRILLEQKKQDRGELKLLLLGPGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSEEERKGFRPLVYQNIFVSMRAMIEAMERLQIPFSRPESKHHASLVMSQDPYKVTTFEKRYAAAMQWLWRDAGlRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITEEGYVPTAQDVLRSRMPTTGINEYCFSVQKTNLRIVDVGGQKSERKKWIHCFENVIALIYLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALFGTILELPWFKSTSVILFLNKTDILEEKIPTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGSNLKKEDKEIYSHMTCATDTQNVKFVFDAVTDIIIKENLKDCGLF
MARSLTWRCCPWCLTEDEKAAARVDQEINRILLEQKKQDRGELKLLLLGPGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSEEERKGFRPLVYQNIFVSMRAMIEAMERLQIPFSRPESKHHASLVMSQDPYKVTTFEKRYAAAMQWLWRDAGlRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITEEGYVPTAQDVLRSRMPTTGINEYCFSVQKTNLRIVDVGGQKSERKKWIHCFENVIALIYLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALFGTILELPWFKSTSVILFLNKTDILEEKIPTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGSNLKKEDKEIYSHMTCATDTQNVKFVFDAVTDIIIKENLKDCGLF
hT2R1配列:
DNA−(配列番号3)
ATGCTAGAGTCTCACCTCATTATCTATTTTCTTCTTGCAGTGATACAATTTCTTCTTGGGATTTTCACAAATGGCATCATTGTGGTGGTGAATGGCATTGACTTGATCAAGCACAGAAAAATGGCTCCGCTGGATCTCCTTCTTTCTTGTCTGGCAGTTTCTAGAATTTTTCTGCAGTTGTTCATCTTCTACGTTAATGTGATTGTTATCTTCTTCATAGAATTCATCATGTGTTCTGCGAATTGTGCAATTCTCTTATTTATCAATGAATTGGAACTTTGGCTTGCCACATGGCTCGGCGTTTTCTATTGTGCCAAGGTTGCCAGCGTCCGTCACCCACTCTTCATCTGGTTGAAGATGAGGATATCCAAGCTGGTCCCATGGATGATCCTGGGGTCTCTGCTATATGTATCTATGATTTGTGTTTTCCATAGCAAATATGCAGGGTTTATGGTCCCATACTTCCTAAGGAAATTTTTCTCCCAAAATGCCACAATTCAAAAAGAAGATACACTGGCTATACAGATTTTCTCTTTTGTTGCTGAGTTCTCAGTGCCATTGCTTATCTTCCTTTTTGCTGTTTTGCTCTTGATTTTCTCTCTGGGGAGGCACACCCGGCAAATGAGAAACACAGTGGCCGGCAGCAGGGTTCCTGGCAGGGGTGCACCCATCAGCGCGTTGCTGTCTATCCTGTCCTTCCTGATCCTCTACTTCTCCCACTGCATGATAAAAGTTTTTCTCTCTTCTCTAAAGTTTCACATCAGAAGGTTCATCTTTCTGTTCTTCATCCTTGTGATTGGTATATACCCTTCTGGACACTCTCTCATCTTAATTTTAGGAAATCCTAAATTGAAACAAAATGCAAAAAAGTTCCTCCTCCACAGTAAGTGCTGTCAGTGA
タンパク質−(配列番号4)
MLESHLIIYFLLAVIQFLLGIFTNGIIVVVNGIDLIKHRKMAPLDLLLSCLAVSRIFLQLFIFYVNVIVIFFIEFIMCSANCAILLFINELELWLATWLGVFYCAKVASVRHPLFIWLKMRISKLVPWMILGSLLYVSMICVFHSKYAGFMVPYFLRKFFSQNATIQKEDTLAIQIFSFVAEFSVPLLIFLFAVLLLIFSLGRHTRQMRNTVAGSRVPGRGAPISALLSILSFLILYFSHCMIKVFLSSLKFHIRRFIFLFFILVIGIYPSGHSLILILGNPKLKQNAKKFLLHSKCCQ
DNA−(配列番号3)
ATGCTAGAGTCTCACCTCATTATCTATTTTCTTCTTGCAGTGATACAATTTCTTCTTGGGATTTTCACAAATGGCATCATTGTGGTGGTGAATGGCATTGACTTGATCAAGCACAGAAAAATGGCTCCGCTGGATCTCCTTCTTTCTTGTCTGGCAGTTTCTAGAATTTTTCTGCAGTTGTTCATCTTCTACGTTAATGTGATTGTTATCTTCTTCATAGAATTCATCATGTGTTCTGCGAATTGTGCAATTCTCTTATTTATCAATGAATTGGAACTTTGGCTTGCCACATGGCTCGGCGTTTTCTATTGTGCCAAGGTTGCCAGCGTCCGTCACCCACTCTTCATCTGGTTGAAGATGAGGATATCCAAGCTGGTCCCATGGATGATCCTGGGGTCTCTGCTATATGTATCTATGATTTGTGTTTTCCATAGCAAATATGCAGGGTTTATGGTCCCATACTTCCTAAGGAAATTTTTCTCCCAAAATGCCACAATTCAAAAAGAAGATACACTGGCTATACAGATTTTCTCTTTTGTTGCTGAGTTCTCAGTGCCATTGCTTATCTTCCTTTTTGCTGTTTTGCTCTTGATTTTCTCTCTGGGGAGGCACACCCGGCAAATGAGAAACACAGTGGCCGGCAGCAGGGTTCCTGGCAGGGGTGCACCCATCAGCGCGTTGCTGTCTATCCTGTCCTTCCTGATCCTCTACTTCTCCCACTGCATGATAAAAGTTTTTCTCTCTTCTCTAAAGTTTCACATCAGAAGGTTCATCTTTCTGTTCTTCATCCTTGTGATTGGTATATACCCTTCTGGACACTCTCTCATCTTAATTTTAGGAAATCCTAAATTGAAACAAAATGCAAAAAAGTTCCTCCTCCACAGTAAGTGCTGTCAGTGA
タンパク質−(配列番号4)
MLESHLIIYFLLAVIQFLLGIFTNGIIVVVNGIDLIKHRKMAPLDLLLSCLAVSRIFLQLFIFYVNVIVIFFIEFIMCSANCAILLFINELELWLATWLGVFYCAKVASVRHPLFIWLKMRISKLVPWMILGSLLYVSMICVFHSKYAGFMVPYFLRKFFSQNATIQKEDTLAIQIFSFVAEFSVPLLIFLFAVLLLIFSLGRHTRQMRNTVAGSRVPGRGAPISALLSILSFLILYFSHCMIKVFLSSLKFHIRRFIFLFFILVIGIYPSGHSLILILGNPKLKQNAKKFLLHSKCCQ
hT2R3配列:
DNA−(配列番号5)
ATGATGGGACTCACCGAGGGGGTGTTCCTGATTCTGTCTGGCACTCAGTTCACACTGGGAATTCTGGTCAATTGTTTCATTGAGTTGGTCAATGGTAGCAGCTGGTTCAAGACCAAGAGAATGTCTTTGTCTGACTTCATCATCACCACCCTGGCACTCTTGAGGATCATTCTGCTGTGTATTATCTTGACTGATAGTTTTTTAATAGAATTCTCTCCCAACACACATGATTCAGGGATAATAATGCAAATTATTGATGTTTCCTGGACATTTACAAACCATCTGAGCATTTGGCTTGCCACCTGTCTTGGTGTCCTCTACTGCCTGAAAATCGCCAGTTTCTCTCACCCCACATTCCTCTGGCTCAAGTGGAGAGTTTCTAGGGTGATGGTATGGATGCTGTTGGGTGCACTGCTCTTATCCTGTGGTAGTACCGCATCTCTGATCAATGAGTTTAAGCTCTATTCTGTCTTTAGGGGAATTGAGGCCACCAGGAATGTGACTGAACACTTCAGAAAGAAGAGGAGTGAGTATTATCTGATCCATGTTCTTGGGACTCTGTGGTACCTGCCTCCCTTAATTGTGTCCCTGGCCTCCTACTCTTTGCTCATCTTCTCCCTGGGGAGGCACACACGGCAGATGCTGCAAAATGGGACAAGCTCCAGAGATCCAACCACTGAGGCCCACAAGAGGGCCATCAGAATCATCCTTTCCTTCTTCTTTCTCTTCTTACTTTACTTTCTTGCTTTCTTAATTGCATCATTTGGTAATTTCCTACCAAAAACCAAGATGGCTAAGATGATTGGCGAAGTAATGACAATGTTTTATCCTGCTGGCCACTCATTTATTCTCATTCTGGGGAACAGTAAGCTGAAGCAGACATTTGTAGTGATGCTCCGGTGTGAGTCTGGTCATCTGAAGCCTGGATCCAAGGGACCCATTTTCTCTTAG
タンパク質−(配列番号6)
MMGLTEGVFLILSGTQFTLGILVNCFIELVNGSSWFKTKRMSLSDFIITTLALLRIILLCIILTDSFLIEFSPNTHDSGIIMQIIDVSWTFTNHLSIWLATCLGVLYCLKIASFSHPTFLWLKWRVSRVMVWMLLGALLLSCGSTASLINEFKLYSVFRGIEATRNVTEHFRKKRSEYYLIHVLGTLWYLPPLIVSLASYSLLIFSLGRHTRQMLQNGTSSRDPTTEAHKRAIRIILSFFFLFLLYFLAFLIASFGNFLPKTKMAKMIGEVMTMFYPAGHSFILILGNSKLKQTFVVMLRCESGHLKPGSKGPIFS
DNA−(配列番号5)
ATGATGGGACTCACCGAGGGGGTGTTCCTGATTCTGTCTGGCACTCAGTTCACACTGGGAATTCTGGTCAATTGTTTCATTGAGTTGGTCAATGGTAGCAGCTGGTTCAAGACCAAGAGAATGTCTTTGTCTGACTTCATCATCACCACCCTGGCACTCTTGAGGATCATTCTGCTGTGTATTATCTTGACTGATAGTTTTTTAATAGAATTCTCTCCCAACACACATGATTCAGGGATAATAATGCAAATTATTGATGTTTCCTGGACATTTACAAACCATCTGAGCATTTGGCTTGCCACCTGTCTTGGTGTCCTCTACTGCCTGAAAATCGCCAGTTTCTCTCACCCCACATTCCTCTGGCTCAAGTGGAGAGTTTCTAGGGTGATGGTATGGATGCTGTTGGGTGCACTGCTCTTATCCTGTGGTAGTACCGCATCTCTGATCAATGAGTTTAAGCTCTATTCTGTCTTTAGGGGAATTGAGGCCACCAGGAATGTGACTGAACACTTCAGAAAGAAGAGGAGTGAGTATTATCTGATCCATGTTCTTGGGACTCTGTGGTACCTGCCTCCCTTAATTGTGTCCCTGGCCTCCTACTCTTTGCTCATCTTCTCCCTGGGGAGGCACACACGGCAGATGCTGCAAAATGGGACAAGCTCCAGAGATCCAACCACTGAGGCCCACAAGAGGGCCATCAGAATCATCCTTTCCTTCTTCTTTCTCTTCTTACTTTACTTTCTTGCTTTCTTAATTGCATCATTTGGTAATTTCCTACCAAAAACCAAGATGGCTAAGATGATTGGCGAAGTAATGACAATGTTTTATCCTGCTGGCCACTCATTTATTCTCATTCTGGGGAACAGTAAGCTGAAGCAGACATTTGTAGTGATGCTCCGGTGTGAGTCTGGTCATCTGAAGCCTGGATCCAAGGGACCCATTTTCTCTTAG
タンパク質−(配列番号6)
MMGLTEGVFLILSGTQFTLGILVNCFIELVNGSSWFKTKRMSLSDFIITTLALLRIILLCIILTDSFLIEFSPNTHDSGIIMQIIDVSWTFTNHLSIWLATCLGVLYCLKIASFSHPTFLWLKWRVSRVMVWMLLGALLLSCGSTASLINEFKLYSVFRGIEATRNVTEHFRKKRSEYYLIHVLGTLWYLPPLIVSLASYSLLIFSLGRHTRQMLQNGTSSRDPTTEAHKRAIRIILSFFFLFLLYFLAFLIASFGNFLPKTKMAKMIGEVMTMFYPAGHSFILILGNSKLKQTFVVMLRCESGHLKPGSKGPIFS
hT2R4配列:
DNA−(配列番号49)
ATGCTTCGGTTATTCTATTTCTCTGCTATTATTGCCTCAGTTATTTTAAATTTTGTAGGAATCATTATGAATCTGTTTATTACAGTGGTCAATTGCAAAACTTGGGTCAAAAGCCATAGAATCTCCTCTTCTGATAGGATTCTGTTCAGCCTGGGCATCACCAGGTTTCTTATGCTGGGACTATTTCTGGTGAACACCATCTACTTCGTCTCTTCAAATACGGAAAGGTCAGTCTACCTGTCTGCTTTTTTTGTGTTGTGTTTCATGTTTTTGGACTCGAGCAGTGTCTGGTTTGTGACCcTGCTCAATATCTTGTACTGTGTGAAGATTACTAACTTCCAACACTCAGTGTTTCTCCTGCTGAAGCGGAATATCTCCCCAAAGATCCCCAGGCTGCTGCTGGCCTGTGTGCTGATTTCTGCTTTCACCACTTGCCTGTACATCACGCTTAGCCAGGCATCACCTTTTCCTGAACTTGTGACTACGAGAAATAACACATCATTTAATATCAGTGAGGGCATCTTGTCTTTAGTGGTTTCTTTGGTCTTGAGCTCATCTCTCCAGTTCATCATTAATGTGACTTCTGCTTCCTTGCTAATACACTCCTTGAGGAGACATATACAGAAGATGCAGAAAAATGCCACTGGTTTCTGGAATCCCCAGACGGAAGCTCATGTAGGTGCTATGAAGCTGATGGTCTATTTCCTCATCCTCTACATTCCATATTCAGTTGCTACCCTGGTCCAGTATCTCCCCTTTTATGCAGGGATGGATATGGGGACCAAATCCATTTGTCTGATTTTTGCCACCCTTTACTCTCCAGGACATTCTGTTCTCATTATTATCACACATCCTAAACTGAAAACAACAGCAAAGAAGATTCTTTGTTTCAAAAAATAG
タンパク質−(配列番号50)
MLRLFYFSAIIASVILNFVGIIMNLFITVVNCKTWVKSHRISSSDRILFSLGITRFLMLGLFLVNTIYFVSSNTERSVYLSAFFVLCFMFLDSSSVWFVTLLNILYCVKITNFQHSVFLLLKRNISPKIPRLLLACVLISAFTTCLYITLSQASPFPELVTTRNNTSFNISEGILSLVVSLVLSSSLQFIINVTSASLLIHSLRRHIQKMQKNATGFWNPQTEAHVGAMKLMVYFLILYIPYSVATLVQYLPFYAGMDMGTKSICLIFATLYSPGHSVLIIITHPKLKTTAKKILCFKK
DNA−(配列番号49)
ATGCTTCGGTTATTCTATTTCTCTGCTATTATTGCCTCAGTTATTTTAAATTTTGTAGGAATCATTATGAATCTGTTTATTACAGTGGTCAATTGCAAAACTTGGGTCAAAAGCCATAGAATCTCCTCTTCTGATAGGATTCTGTTCAGCCTGGGCATCACCAGGTTTCTTATGCTGGGACTATTTCTGGTGAACACCATCTACTTCGTCTCTTCAAATACGGAAAGGTCAGTCTACCTGTCTGCTTTTTTTGTGTTGTGTTTCATGTTTTTGGACTCGAGCAGTGTCTGGTTTGTGACCcTGCTCAATATCTTGTACTGTGTGAAGATTACTAACTTCCAACACTCAGTGTTTCTCCTGCTGAAGCGGAATATCTCCCCAAAGATCCCCAGGCTGCTGCTGGCCTGTGTGCTGATTTCTGCTTTCACCACTTGCCTGTACATCACGCTTAGCCAGGCATCACCTTTTCCTGAACTTGTGACTACGAGAAATAACACATCATTTAATATCAGTGAGGGCATCTTGTCTTTAGTGGTTTCTTTGGTCTTGAGCTCATCTCTCCAGTTCATCATTAATGTGACTTCTGCTTCCTTGCTAATACACTCCTTGAGGAGACATATACAGAAGATGCAGAAAAATGCCACTGGTTTCTGGAATCCCCAGACGGAAGCTCATGTAGGTGCTATGAAGCTGATGGTCTATTTCCTCATCCTCTACATTCCATATTCAGTTGCTACCCTGGTCCAGTATCTCCCCTTTTATGCAGGGATGGATATGGGGACCAAATCCATTTGTCTGATTTTTGCCACCCTTTACTCTCCAGGACATTCTGTTCTCATTATTATCACACATCCTAAACTGAAAACAACAGCAAAGAAGATTCTTTGTTTCAAAAAATAG
タンパク質−(配列番号50)
MLRLFYFSAIIASVILNFVGIIMNLFITVVNCKTWVKSHRISSSDRILFSLGITRFLMLGLFLVNTIYFVSSNTERSVYLSAFFVLCFMFLDSSSVWFVTLLNILYCVKITNFQHSVFLLLKRNISPKIPRLLLACVLISAFTTCLYITLSQASPFPELVTTRNNTSFNISEGILSLVVSLVLSSSLQFIINVTSASLLIHSLRRHIQKMQKNATGFWNPQTEAHVGAMKLMVYFLILYIPYSVATLVQYLPFYAGMDMGTKSICLIFATLYSPGHSVLIIITHPKLKTTAKKILCFKK
hT2R5配列:
DNA−(配列番号7)
ATGCTGAGCGCTGGCCTAGGACTGCTGATGCTGGTGGCAGTGGTTGAATTTCTCATCGGTTTAATTGGAAATGGAATCCTGGTGGTCTGGAGTTTTAGAGAATGGATCAGAAAATTCAACTGGTCCTCATATAACCTCATTATCCTGGGCCTGGCTGGCTGCCGATTTCTCCTGCAGTGGCTGATCATTTTGGACTTAAGCTTGTTTCCACTTTTCCAGAGCAGCCGTTGGCTTCGCTATCTTAGTATCTTCTGGGTCCTGGTAAGCCAGGCCAGCTTATGGTTTGCCACCTTCCTCAGTGTCTTCTATTGCAAGAAGATCACGACCTTCGATCGCCCGGCCTACTTGTGGCTGAAGCAGAGGGCCTATAACCTGAGTCTCTGGTGCCTTCTGGGCTACTTTATAATCAATTTGTTACTTACAGTCCAAATTGGCTTAACATTCTATCATCCTCCCCAAGGAAACAGCAGCATTCGGTATCCCTTTGAAAGCTGGCAGTACCTGTATGCATTTCAGCTCAATTCAGGAAGTTATTTGCCTTTAGTGGTGTTTCTTGTTTCCTCTGGGATGCTGATTGTCTCTTTGTATACACACCACAAGAAGATGAAGGTCCATTCAGCTGGTAGGAGGGATGTCCGGGCCAAGGCTCACATCACTGCGCTGAAGTCCTTGGGCTGCTTCCTCTTACTTCACCTGGTTTATATCATGGCCAGCCCCTTCTCCATCACCTCCAAGACTTATCCTCCTGATCTCACCAGTGTCTTCATCTGGGAGACACTCATGGCAGCCTATCCTTCTCTTCATTCTCTCATATTGATCATGGGGATTCCTAGGGTGAAGCAGACTTGTCAGAAGATCCTGTGGAAGACAGTGTGTGCTC
GGAGATGCTGGGGCCCATGA
タンパク質−(配列番号8)
MLSAGLGLLMLVAVVEFLIGLIGNGILVVWSFREWIRKFNWSSYNLIILGLAGCRFLLQWLIILDLSLFPLFQSSRWLRY LSIFWVLVSQASLWFATFLSVFYCKKITTFDRPAYLWLKQRAYNLSLWCLLGYFIINLLLTVQIGLTFYHPPQGNSSIRY PFESWQYLYAFQLNSGSYLPLVVFLVSSGMLIVSLYTHHKKMKVHSAGRRDVRAKAHITALKSLGCFLLLHLVYlMASPF SITSKTYPPDLTSVFIWETLMAAYPSLHSLILIMGIPRVKQTCQKILWKTVCARRCWGP
DNA−(配列番号7)
ATGCTGAGCGCTGGCCTAGGACTGCTGATGCTGGTGGCAGTGGTTGAATTTCTCATCGGTTTAATTGGAAATGGAATCCTGGTGGTCTGGAGTTTTAGAGAATGGATCAGAAAATTCAACTGGTCCTCATATAACCTCATTATCCTGGGCCTGGCTGGCTGCCGATTTCTCCTGCAGTGGCTGATCATTTTGGACTTAAGCTTGTTTCCACTTTTCCAGAGCAGCCGTTGGCTTCGCTATCTTAGTATCTTCTGGGTCCTGGTAAGCCAGGCCAGCTTATGGTTTGCCACCTTCCTCAGTGTCTTCTATTGCAAGAAGATCACGACCTTCGATCGCCCGGCCTACTTGTGGCTGAAGCAGAGGGCCTATAACCTGAGTCTCTGGTGCCTTCTGGGCTACTTTATAATCAATTTGTTACTTACAGTCCAAATTGGCTTAACATTCTATCATCCTCCCCAAGGAAACAGCAGCATTCGGTATCCCTTTGAAAGCTGGCAGTACCTGTATGCATTTCAGCTCAATTCAGGAAGTTATTTGCCTTTAGTGGTGTTTCTTGTTTCCTCTGGGATGCTGATTGTCTCTTTGTATACACACCACAAGAAGATGAAGGTCCATTCAGCTGGTAGGAGGGATGTCCGGGCCAAGGCTCACATCACTGCGCTGAAGTCCTTGGGCTGCTTCCTCTTACTTCACCTGGTTTATATCATGGCCAGCCCCTTCTCCATCACCTCCAAGACTTATCCTCCTGATCTCACCAGTGTCTTCATCTGGGAGACACTCATGGCAGCCTATCCTTCTCTTCATTCTCTCATATTGATCATGGGGATTCCTAGGGTGAAGCAGACTTGTCAGAAGATCCTGTGGAAGACAGTGTGTGCTC
GGAGATGCTGGGGCCCATGA
タンパク質−(配列番号8)
MLSAGLGLLMLVAVVEFLIGLIGNGILVVWSFREWIRKFNWSSYNLIILGLAGCRFLLQWLIILDLSLFPLFQSSRWLRY LSIFWVLVSQASLWFATFLSVFYCKKITTFDRPAYLWLKQRAYNLSLWCLLGYFIINLLLTVQIGLTFYHPPQGNSSIRY PFESWQYLYAFQLNSGSYLPLVVFLVSSGMLIVSLYTHHKKMKVHSAGRRDVRAKAHITALKSLGCFLLLHLVYlMASPF SITSKTYPPDLTSVFIWETLMAAYPSLHSLILIMGIPRVKQTCQKILWKTVCARRCWGP
hT2R7配列:
DNA−(配列番号9)
ATGGCAGATAAAGTGCAGACTACTTTATTGTTCTTAGCAGTTGGAGAGTTTTCAGTGGGGATCTTAGGGAATGCATTCATTGGATTGGTAAACTGCATGGACTGGGTCAAGAAGAGGAAAATTGCCTCCATTGATTTAATCCTCACAAGTCTGGCCATATCCAGAATTTGTCTATTGTGCGTAATACTATTAGATTGTTTTATATTGGTGCTATATCCAGATGTCTATGCCACTGGTAAAGAAATGAGAATCATTGACTTCTTCTGGACACTAACCAATCATTTAAGTATCTGGTTTGCAACCTGCCTCAGCATTTACTATTTCTTCAAGATAGGTAATTTCTTTCACCCACTTTTCCTCTGGATGAAGTGGAGAATTGACAGGGTGATTTCCTGGATTCTACTGGGGTGCGTGGTTCTCTCTGTGTTTATTAGCCTTCCAGCCACTGAGAATTTGAACGCTGATTTCAGGTTTTGTGTGAAGGCAAAGAGGAAAACAAACTTAACTTGGAGTTGCAGAGTAAATAAAACTCAACATGCTTCTACCAAGTTATTTCTCAACCTGGCAACGCTGCTCCCCTTTTGTGTGTGCCTAATGTCCTTTTTCCTCTTGATCCTCTCCCTGCGGAGACATATCAGGCGAATGCAGCTCAGTGCCACAGGGTGCAGAGACCCCAGCACAGAAGCCCATGTGAGAGCCCTGAAAGCTGTCATTTCCTTCCTTCTCCTCTTTATTGCCTACTATTTGTCCTTTCTCATTGCCACCTCCAGCTACTTTATGCCAGAGACGGAATTAGCTGTGATTTTTGGTGAGTCCATAGCTCTAATCTACCCCTCAAGTCATTCATTTATCCTAATACTGGGGAACAATAAATTAAGACATGCATCTCTAAAGGTGATTTGGAAAGTAATGTCTATTCTAAAAGGAAGAAAATTCCAACAACATAAACAAATCTGA
タンパク質−(配列番号10)
MADKVQTTLLFLAVGEFSVGILGNAFIGLVNCMDWVKKRKIASIDLILTSLAISRICLLCVILLDCFILVLYPDVYATGKEMRIIDFFWTLTNHLSIWFATCLSIYYFFKIGNFFHPLFLWMKWRIDRVISWILLGCVVLSVFISLPATENLNADFRFCVKAKRKTNLTWSCRVNKTQHASTKLFLNLATLLPFCVCLMSFFLLILSLRRHIRRMQLSATGCRDPSTEAHVRALKAVISFLLLFIAYYLSFLIATSSYFMPETELAVIFGESIALIYPSSHSFILILGNNKLRHASLKVIWKVMSILKGRKFQQHKQI
DNA−(配列番号9)
ATGGCAGATAAAGTGCAGACTACTTTATTGTTCTTAGCAGTTGGAGAGTTTTCAGTGGGGATCTTAGGGAATGCATTCATTGGATTGGTAAACTGCATGGACTGGGTCAAGAAGAGGAAAATTGCCTCCATTGATTTAATCCTCACAAGTCTGGCCATATCCAGAATTTGTCTATTGTGCGTAATACTATTAGATTGTTTTATATTGGTGCTATATCCAGATGTCTATGCCACTGGTAAAGAAATGAGAATCATTGACTTCTTCTGGACACTAACCAATCATTTAAGTATCTGGTTTGCAACCTGCCTCAGCATTTACTATTTCTTCAAGATAGGTAATTTCTTTCACCCACTTTTCCTCTGGATGAAGTGGAGAATTGACAGGGTGATTTCCTGGATTCTACTGGGGTGCGTGGTTCTCTCTGTGTTTATTAGCCTTCCAGCCACTGAGAATTTGAACGCTGATTTCAGGTTTTGTGTGAAGGCAAAGAGGAAAACAAACTTAACTTGGAGTTGCAGAGTAAATAAAACTCAACATGCTTCTACCAAGTTATTTCTCAACCTGGCAACGCTGCTCCCCTTTTGTGTGTGCCTAATGTCCTTTTTCCTCTTGATCCTCTCCCTGCGGAGACATATCAGGCGAATGCAGCTCAGTGCCACAGGGTGCAGAGACCCCAGCACAGAAGCCCATGTGAGAGCCCTGAAAGCTGTCATTTCCTTCCTTCTCCTCTTTATTGCCTACTATTTGTCCTTTCTCATTGCCACCTCCAGCTACTTTATGCCAGAGACGGAATTAGCTGTGATTTTTGGTGAGTCCATAGCTCTAATCTACCCCTCAAGTCATTCATTTATCCTAATACTGGGGAACAATAAATTAAGACATGCATCTCTAAAGGTGATTTGGAAAGTAATGTCTATTCTAAAAGGAAGAAAATTCCAACAACATAAACAAATCTGA
タンパク質−(配列番号10)
MADKVQTTLLFLAVGEFSVGILGNAFIGLVNCMDWVKKRKIASIDLILTSLAISRICLLCVILLDCFILVLYPDVYATGKEMRIIDFFWTLTNHLSIWFATCLSIYYFFKIGNFFHPLFLWMKWRIDRVISWILLGCVVLSVFISLPATENLNADFRFCVKAKRKTNLTWSCRVNKTQHASTKLFLNLATLLPFCVCLMSFFLLILSLRRHIRRMQLSATGCRDPSTEAHVRALKAVISFLLLFIAYYLSFLIATSSYFMPETELAVIFGESIALIYPSSHSFILILGNNKLRHASLKVIWKVMSILKGRKFQQHKQI
hT2R8配列:
DNA−(配列番号11)
ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGATACATTGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAATTTAGTTATCGCCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTTTATACAAAAAATAAACAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACCACCTGCCTTAATGTCTTCTATTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAAATTGATATGGTGGTGCACTGGATCCTGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATAGTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCAATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGTAAAATACCATACTTTGAACCCTTaACTCTCTTTAACCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCATTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGCAAATAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCCAGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTTATCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCTTCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGTGGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATTCTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGCAGACATTTGTCAGAATGCTGACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA
タンパク質−(配列番号12)
MFSPADNIFIILITGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYILTNLVIARICLISVMVVNGIVIVLNPDVYTKNKQQIVIFTFWTFANYLNMWITTCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMVVHWILLGCFAISLLVSLlAAIVLSCDYRFHAIAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPLTLFNLFAIVPFIVSLISFFLLVRSLWRHTKQIKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSFIFFFFLYYISSILMTFSYLMTKYKLAVEFGElAAILYPLGHSLILIVLNNKLRQTFVRMLTCRKIACMI
DNA−(配列番号11)
ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGATACATTGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAATTTAGTTATCGCCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTTTATACAAAAAATAAACAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACCACCTGCCTTAATGTCTTCTATTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAAATTGATATGGTGGTGCACTGGATCCTGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATAGTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCAATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGTAAAATACCATACTTTGAACCCTTaACTCTCTTTAACCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCATTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGCAAATAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCCAGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTTATCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCTTCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGTGGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATTCTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGCAGACATTTGTCAGAATGCTGACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA
タンパク質−(配列番号12)
MFSPADNIFIILITGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYILTNLVIARICLISVMVVNGIVIVLNPDVYTKNKQQIVIFTFWTFANYLNMWITTCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMVVHWILLGCFAISLLVSLlAAIVLSCDYRFHAIAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPLTLFNLFAIVPFIVSLISFFLLVRSLWRHTKQIKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSFIFFFFLYYISSILMTFSYLMTKYKLAVEFGElAAILYPLGHSLILIVLNNKLRQTFVRMLTCRKIACMI
hT2R9配列:
hT2R9V
cDNA−(配列番号13)
ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGATTCATTGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGCTTGGCCATCTCCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACATATGGCAATAGCGTGCTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACTTCTTGCCTCAGTATCTTCTATTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAGATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTCTTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGATGATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGTCATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCAGGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGTGATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTGTTACTTTTCTCCCTAGTTAGACACACCAAGCAGATTCGACTGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAGGCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTCCTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTTATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGGTGACATAGTAACTGTCATTTTCCCATCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTCTGAAGATGTTAAGATTTGTGAAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG
タンパク質(配列番号14)
MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILISLAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSVLVSIVNVVWTFANNSSLWFTSCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKNDDMWYHLFKVSHEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMVPFILCLISFFLLLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAIKAVIIFLLLLIVYYPVFLVMTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFVKCFLRRRKPFVP
hT2R9A
cDNA−(配列番号15)
ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGATTCATTGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGCTTGGCCATCTCCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACATATGGCAATAGCGTGCTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACTTCTTGCCTCAGTATCTTCTATTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAGATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTCTTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGATGATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGTCATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCAGGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGCGATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTGTTACTTTTCTCCCTAGTTAGACACACCAAGCAGATTCGACTGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAGGCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTCCTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTTATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGGTGACATAGTAACTGTCATTTTCCCATCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTCTGAAGATGTTAAGATTTGTGAAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG
タンパク質−(配列番号16)
MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILISLAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSVLVSIVNVVWTFANNSSLWFTSCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKNDDMWYHLFKVSHEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMAPFILCLISFFLLLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAlKAVIIFLLLLIVYYPVFLVMTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFVKCFLRRRKPFVP
hT2R9V
cDNA−(配列番号13)
ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGATTCATTGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGCTTGGCCATCTCCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACATATGGCAATAGCGTGCTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACTTCTTGCCTCAGTATCTTCTATTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAGATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTCTTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGATGATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGTCATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCAGGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGTGATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTGTTACTTTTCTCCCTAGTTAGACACACCAAGCAGATTCGACTGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAGGCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTCCTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTTATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGGTGACATAGTAACTGTCATTTTCCCATCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTCTGAAGATGTTAAGATTTGTGAAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG
タンパク質(配列番号14)
MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILISLAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSVLVSIVNVVWTFANNSSLWFTSCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKNDDMWYHLFKVSHEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMVPFILCLISFFLLLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAIKAVIIFLLLLIVYYPVFLVMTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFVKCFLRRRKPFVP
hT2R9A
cDNA−(配列番号15)
ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGATTCATTGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGCTTGGCCATCTCCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACATATGGCAATAGCGTGCTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACTTCTTGCCTCAGTATCTTCTATTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAGATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTCTTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGATGATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGTCATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCAGGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGCGATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTGTTACTTTTCTCCCTAGTTAGACACACCAAGCAGATTCGACTGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAGGCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTCCTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTTATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGGTGACATAGTAACTGTCATTTTCCCATCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTCTGAAGATGTTAAGATTTGTGAAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG
タンパク質−(配列番号16)
MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILISLAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSVLVSIVNVVWTFANNSSLWFTSCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKNDDMWYHLFKVSHEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMAPFILCLISFFLLLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAlKAVIIFLLLLIVYYPVFLVMTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFVKCFLRRRKPFVP
hT2R10配列:
DNA−(配列番号17)
ATGCTACGTGTAGTGGAAGGCATCTTCATTTTTGTTGTAGTTAGTGAGTCAGTGTTTGGGGTTTTGGGGAATGGATTTATTGGACTTGTAAACTGCATTGACTGTGCCAAGAATAAGTTATCTACGATTGGCTTTATTCTCACCGGCTTAGCTATTTCAAGAATTTTTCTGATATGGATAATAATTACAGATGGATTTATACAGATATTCTCTCCAAATATATATGCCTCCGGTAACCTAATTGAATATATTAGTTACTTTTGGGTAATTGGTAATCAATCAAGTATGTGGTTTGCCACCAGCCTCAGCATCTTCTATTTCCTGAAGATAGCAAATTTTTCCAACTACATATTTCTCTGGTTGAAGAGCAGAACAAATATGGTTCTTCCCTTCATGATAGTATTCTTACTTATTTCATCGTTACTTAATTTTGCATACATTGCGAAGATTCTTAATGATTATAAAACGAAGAATGACACAGTCTGGGATCTCAACATGTATAAAAGTGAATACTTTATCAAgCAGATTTTGCTAAATCTGGGAGTCATTTTCTTCTTTACACTATCCCTAATTACATGTATTTTTTTAATCATTTCCCTTTGGAGACACAACAGGCAGATGCAATCGAATGTGACAGGATTGAGAGACTCCAACACAGAAGCTCATGTGAAGGCAATGAAAGTTTTGATATCTTTCATCATCCTCTTTATCTTGTATTTTATAGGCATGGCCATAGAAATATCATGTTTTACTGTGCGAGAAAACAAACTGCTGCTTATGTTTGGAATGACAACCACAGCCATCTATCCCTGGGGTCACTCATTTATCTTAATTCTAGGAAACAGCAAGCTAAAGCAAGCCTCTTTGAGGGTACTGCAGCAATTGAAGTGCTGTGAGAAAAGGAAAAATCTCAGAGTCACATAG
タンパク質−(配列番号18)
MLRVVEGIFIFVVVSESVFGVLGNGFIGLVNCIDCAKNKLSTIGFILTGLAISRIFLIWIIITDGFIQIFSPNIYASGNLIEYISYFWVIGNQSSMWFATSLSIFYFLKIANFSNYIFLWLKSRTNMVLPFMIVFLLISSLLNFAYIAKILNDYKTKNDTVWDLNMYKSEYFIKQILLNLGVIFFFTLSLITCIFLIISLWRHNRQMQSNVTGLRDSNTEAHVKAMKVLISFIILFILYFIGMAIEISCFTVRENKLLLMFGMTTTAIYPWGHSFILILGNSKLKQASLRVLQQLKCCEKRKNLRVT
DNA−(配列番号17)
ATGCTACGTGTAGTGGAAGGCATCTTCATTTTTGTTGTAGTTAGTGAGTCAGTGTTTGGGGTTTTGGGGAATGGATTTATTGGACTTGTAAACTGCATTGACTGTGCCAAGAATAAGTTATCTACGATTGGCTTTATTCTCACCGGCTTAGCTATTTCAAGAATTTTTCTGATATGGATAATAATTACAGATGGATTTATACAGATATTCTCTCCAAATATATATGCCTCCGGTAACCTAATTGAATATATTAGTTACTTTTGGGTAATTGGTAATCAATCAAGTATGTGGTTTGCCACCAGCCTCAGCATCTTCTATTTCCTGAAGATAGCAAATTTTTCCAACTACATATTTCTCTGGTTGAAGAGCAGAACAAATATGGTTCTTCCCTTCATGATAGTATTCTTACTTATTTCATCGTTACTTAATTTTGCATACATTGCGAAGATTCTTAATGATTATAAAACGAAGAATGACACAGTCTGGGATCTCAACATGTATAAAAGTGAATACTTTATCAAgCAGATTTTGCTAAATCTGGGAGTCATTTTCTTCTTTACACTATCCCTAATTACATGTATTTTTTTAATCATTTCCCTTTGGAGACACAACAGGCAGATGCAATCGAATGTGACAGGATTGAGAGACTCCAACACAGAAGCTCATGTGAAGGCAATGAAAGTTTTGATATCTTTCATCATCCTCTTTATCTTGTATTTTATAGGCATGGCCATAGAAATATCATGTTTTACTGTGCGAGAAAACAAACTGCTGCTTATGTTTGGAATGACAACCACAGCCATCTATCCCTGGGGTCACTCATTTATCTTAATTCTAGGAAACAGCAAGCTAAAGCAAGCCTCTTTGAGGGTACTGCAGCAATTGAAGTGCTGTGAGAAAAGGAAAAATCTCAGAGTCACATAG
タンパク質−(配列番号18)
MLRVVEGIFIFVVVSESVFGVLGNGFIGLVNCIDCAKNKLSTIGFILTGLAISRIFLIWIIITDGFIQIFSPNIYASGNLIEYISYFWVIGNQSSMWFATSLSIFYFLKIANFSNYIFLWLKSRTNMVLPFMIVFLLISSLLNFAYIAKILNDYKTKNDTVWDLNMYKSEYFIKQILLNLGVIFFFTLSLITCIFLIISLWRHNRQMQSNVTGLRDSNTEAHVKAMKVLISFIILFILYFIGMAIEISCFTVRENKLLLMFGMTTTAIYPWGHSFILILGNSKLKQASLRVLQQLKCCEKRKNLRVT
hT2R13配列:
DNA−(配列番号19)
ATGGAAAGTGCCCTGCCGAGTATCTTCACTCTTGTAATAATTGCAGAATTCATAATTGGGAATTTGAGCAATGGATTTATAGTACTGATCAACTGCATTGACTGGGTCAGTAAAAGAGAGCTGTCCTCAGTCGATAAACTCCTCATTATCTTGGCAATCTCCAGAATTGGGCTGATCTGGGAAATATTAGTAAGTTGGTTTTTAGCTCTGCATTATCTAGCCATATTTGTGTCTGGAACAGGATTAAGAATTATGATTTTTAGCTGGATAGTTTCTAATCACTTCAATCTCTGGCTTGCTACAATCTTCAGCATCTTTTATTTGCTCAAAATAGCGAGTTTCTCTAGCCCTGCTTTTCTCTATTTGAAGTGGAGAGTAAACAAAGTGATTCTGATGATACTGCTAGGAACCTTGGTCTTCTTATTTTTAAATCTGATACAAATAAACATGCATATAAAAGACTGGCTGGACCGATATGAAAGAAACACAACTTGGAATTTCAGTATGAGTGACTTTGAAACATTTTCAGTGTCGGTCAAATTCACTATGACTATGTTCAGTCTAACACCATTTACTGTGGCCTTCATCTCTTTTCTCCTGTTAATTTTCTCCCTGCAaAAACATCTCCAGAAAATGCAACTCAATTACAAAGGACACAGAGACCCCAGGACCAAGGTCCATACAAATGCCTTGAAAATTGTGATCTCATTCCTTTTATTCTATGCTAGTTTCTTTCTATGTGTTCTCATATCATGGATTTCTGAGCTGTATCAGAGCACAGTGATCTACATGCTTTGTGAGACGATTGGAGTCTTCTCTCCTTCAAGCCACTCCTTTCTTCTGATTCTAGGAAACGCTAAGTTAAGACAGGCCTTTCTTTTGGTGGCAGCTAAGGTATGGGCTAAACGATGA
タンパク質−(配列番号20)
MESALPSIFTLVllAEFIIGNLSNGFIVLINCIDWVSKRELSSVDKLLIILAISRIGLIWEILVSWFLALHYLAIFVSGTGLRIMIFSWIVSNHFNLWLATIFSIFYLLKIASFSSPAFLYLKWRVNKVILMILLGTLVFLFLNLIQINMHIKDWLDRYERNTTWNFSMSDFETFSVSVKFTMTMFSLTPFTVAFISFLLLIFSLQKHLQKMQLNYKGHRDPRTKVHTNALKIVISFLLFYASFFLCVLISWISELYQSTVIYMLCETIGVFSPSSHSFLLILGNAKLRQAFLLVAAKVWAKR
DNA−(配列番号19)
ATGGAAAGTGCCCTGCCGAGTATCTTCACTCTTGTAATAATTGCAGAATTCATAATTGGGAATTTGAGCAATGGATTTATAGTACTGATCAACTGCATTGACTGGGTCAGTAAAAGAGAGCTGTCCTCAGTCGATAAACTCCTCATTATCTTGGCAATCTCCAGAATTGGGCTGATCTGGGAAATATTAGTAAGTTGGTTTTTAGCTCTGCATTATCTAGCCATATTTGTGTCTGGAACAGGATTAAGAATTATGATTTTTAGCTGGATAGTTTCTAATCACTTCAATCTCTGGCTTGCTACAATCTTCAGCATCTTTTATTTGCTCAAAATAGCGAGTTTCTCTAGCCCTGCTTTTCTCTATTTGAAGTGGAGAGTAAACAAAGTGATTCTGATGATACTGCTAGGAACCTTGGTCTTCTTATTTTTAAATCTGATACAAATAAACATGCATATAAAAGACTGGCTGGACCGATATGAAAGAAACACAACTTGGAATTTCAGTATGAGTGACTTTGAAACATTTTCAGTGTCGGTCAAATTCACTATGACTATGTTCAGTCTAACACCATTTACTGTGGCCTTCATCTCTTTTCTCCTGTTAATTTTCTCCCTGCAaAAACATCTCCAGAAAATGCAACTCAATTACAAAGGACACAGAGACCCCAGGACCAAGGTCCATACAAATGCCTTGAAAATTGTGATCTCATTCCTTTTATTCTATGCTAGTTTCTTTCTATGTGTTCTCATATCATGGATTTCTGAGCTGTATCAGAGCACAGTGATCTACATGCTTTGTGAGACGATTGGAGTCTTCTCTCCTTCAAGCCACTCCTTTCTTCTGATTCTAGGAAACGCTAAGTTAAGACAGGCCTTTCTTTTGGTGGCAGCTAAGGTATGGGCTAAACGATGA
タンパク質−(配列番号20)
MESALPSIFTLVllAEFIIGNLSNGFIVLINCIDWVSKRELSSVDKLLIILAISRIGLIWEILVSWFLALHYLAIFVSGTGLRIMIFSWIVSNHFNLWLATIFSIFYLLKIASFSSPAFLYLKWRVNKVILMILLGTLVFLFLNLIQINMHIKDWLDRYERNTTWNFSMSDFETFSVSVKFTMTMFSLTPFTVAFISFLLLIFSLQKHLQKMQLNYKGHRDPRTKVHTNALKIVISFLLFYASFFLCVLISWISELYQSTVIYMLCETIGVFSPSSHSFLLILGNAKLRQAFLLVAAKVWAKR
hT2R14配列:
DNA−(配列番号21)
ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCGTTTTAATTGTGGAATTTATAATTGGAAATTTAGGAAATAGTTTCATAGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGATCGGATCCTCACTGCTTTGGCAATCTCTCGAATTAGCCTGGTTTGGTTAATATTCGGAAGCTGGTGTGTGTCTGTGTTTTTCCCAGCTTTATTTGCCACTGAAAAAATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAGTGTCTGGTTAGCTACAGGCCTCGGTACTTTTTATTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAAGTGGAGaGTTAAAAAGGTGGTTTTGGTGCTGCTTCTTGTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATATTGCACTGATAAACATCCATATAAATGCCAGTATCAATGGATACAGAAGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTTTCCAGTCTTATTGTATTAACCAGCACTGTGTTCATTTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCTTCTCCTCATCTTCTCCATGTGGAAACATCGCAAGAAGATGCAGCACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAAGCCCACAGAGGAGTTAAAAGTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTATGCCATTTTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCAGTTTGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGAAAATCTAATTATTCTTTCCCAGGTGATGGGAATGGCTTATCCTTCATGTCACTCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGAAGCTGAGACAGGCCTCTCTGTCAGTGCTACTGTGGCTGAGGTACATGTTCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGAATTTAGAGAATCATCTTGA
タンパク質−(配列番号22)
MGGVIKSIFTFVLIVEFIIGNLGNSFIALVNCIDWVKGRKISSVDRILTALAISRISLVWLIFGSWCVSVFFPALFATEKMFRMLTNIWTVINHFSVWLATGLGTFYFLKIANFSNSIFLYLKWRVKKVVLVLLLVTSVFLFLNIALINIHINASINGYRRNKTCSSDSSNFTRFSSLIVLTSTVFIFIPFTLSLAMFLLLIFSMWKHRKKMQHTVKISGDASTKAHRGVKSVITFFLLYAIFSLSFFISVWTSERLEENLIILSQVMGMAYPSCHSCVLILGNKKLRQASLSVLLWLRYMFKDGEPSGHKEFRESS
DNA−(配列番号21)
ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCGTTTTAATTGTGGAATTTATAATTGGAAATTTAGGAAATAGTTTCATAGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGATCGGATCCTCACTGCTTTGGCAATCTCTCGAATTAGCCTGGTTTGGTTAATATTCGGAAGCTGGTGTGTGTCTGTGTTTTTCCCAGCTTTATTTGCCACTGAAAAAATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAGTGTCTGGTTAGCTACAGGCCTCGGTACTTTTTATTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAAGTGGAGaGTTAAAAAGGTGGTTTTGGTGCTGCTTCTTGTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATATTGCACTGATAAACATCCATATAAATGCCAGTATCAATGGATACAGAAGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTTTCCAGTCTTATTGTATTAACCAGCACTGTGTTCATTTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCTTCTCCTCATCTTCTCCATGTGGAAACATCGCAAGAAGATGCAGCACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAAGCCCACAGAGGAGTTAAAAGTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTATGCCATTTTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCAGTTTGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGAAAATCTAATTATTCTTTCCCAGGTGATGGGAATGGCTTATCCTTCATGTCACTCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGAAGCTGAGACAGGCCTCTCTGTCAGTGCTACTGTGGCTGAGGTACATGTTCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGAATTTAGAGAATCATCTTGA
タンパク質−(配列番号22)
MGGVIKSIFTFVLIVEFIIGNLGNSFIALVNCIDWVKGRKISSVDRILTALAISRISLVWLIFGSWCVSVFFPALFATEKMFRMLTNIWTVINHFSVWLATGLGTFYFLKIANFSNSIFLYLKWRVKKVVLVLLLVTSVFLFLNIALINIHINASINGYRRNKTCSSDSSNFTRFSSLIVLTSTVFIFIPFTLSLAMFLLLIFSMWKHRKKMQHTVKISGDASTKAHRGVKSVITFFLLYAIFSLSFFISVWTSERLEENLIILSQVMGMAYPSCHSCVLILGNKKLRQASLSVLLWLRYMFKDGEPSGHKEFRESS
hT2R16配列:
DNA−(配列番号23)
ATGATACCCATCCAACTCACTGTCTTCTTCATGATCATCTATGTGCTTGAGTCCTTGACAATTATTGTGCAGAGCAGCCTAATTGTTGCAGTGCTGGGCAGAGAATGGCTGCAAGTCAGAAGGCTGATGCCTGTGGACATGATTCTCATCAGCCTGGGCATCTCTCGCTTCTGTCTACAGTGGGCATCAATGCTGAACAATTTTTGCTCCTATTTTAATTTGAATTATGTACTTTGCAACTTAACAATCACCTGGGAATTTTTTAATATCCTTACATTCTGGTTAAACAGCTTGCTTACCGTGTTCTACTGCATCAAGGTCTCTTCTTTCACCCATCACATCTTTCTCTGGCTGAGGTGGAGAATTTTGAGGTTGTTTCCCTGGATATTACTGGGTTCTCTGATGATTACTTGTGTAACAATCATCCCTTCAGCTATTGGGAATTACATTCAAATTCAGTTACTCACCATGGAGCATCTACCAAGAAACAGCACTGTAACTGACAAACTTGAAAATTTTCATCAGTATCAGTTCCAGGCTCATACAGTTGCATTGGTTATTCCTTTCATCCTGTTCCTGGCCTCCACCATCTTTCTCATGGCATCACTGACCAAGCAGATACAACATCATAGCACTGGTCACTGCAATCCAAGCATGAAAGCGCaCTTCACTGCCCTGAGGTCCCTTGCCGTCTTATTTATTGTGTTTACCTCTTACTTTCTAACCATACTCATCACCATTATAGGTACTCTATTTGATAAGAGATGTTGGTTATGGGTCTGGGAAGCTTTTGTCTATGCTTTCATCTTAATGCATTCCACTTCACTGATGCTGAGCAGCCCTACGTTGAAAAGGATTCTAAAGGGAAAGTGCTAG
タンパク質−(配列番号24)
MIPIQLTVFFMIIYVLESLTIIVQSSLIVAVLGREWLQVRRLMPVDMILISLGISRFCLQWASMLNNFCSYFNLNYVLCNLTITWEFFNILTFWLNSLLTVFYCIKVSSFTHHIFLWLRWRILRLFPWILLGSLMITCVTIIPSAIGNYIQIQLLTMEHLPRNSTVTDKLENFHQYQFQAHTVALVIPFILFLASTIFLMASLTKQIQHHSTGHCNPSMKAHFTALRSLAVLFIVFTSYFLTILITIIGTLFDKRCWLWVWEAFVYAFILMHSTSLMLSSPTLKRILKGKC
DNA−(配列番号23)
ATGATACCCATCCAACTCACTGTCTTCTTCATGATCATCTATGTGCTTGAGTCCTTGACAATTATTGTGCAGAGCAGCCTAATTGTTGCAGTGCTGGGCAGAGAATGGCTGCAAGTCAGAAGGCTGATGCCTGTGGACATGATTCTCATCAGCCTGGGCATCTCTCGCTTCTGTCTACAGTGGGCATCAATGCTGAACAATTTTTGCTCCTATTTTAATTTGAATTATGTACTTTGCAACTTAACAATCACCTGGGAATTTTTTAATATCCTTACATTCTGGTTAAACAGCTTGCTTACCGTGTTCTACTGCATCAAGGTCTCTTCTTTCACCCATCACATCTTTCTCTGGCTGAGGTGGAGAATTTTGAGGTTGTTTCCCTGGATATTACTGGGTTCTCTGATGATTACTTGTGTAACAATCATCCCTTCAGCTATTGGGAATTACATTCAAATTCAGTTACTCACCATGGAGCATCTACCAAGAAACAGCACTGTAACTGACAAACTTGAAAATTTTCATCAGTATCAGTTCCAGGCTCATACAGTTGCATTGGTTATTCCTTTCATCCTGTTCCTGGCCTCCACCATCTTTCTCATGGCATCACTGACCAAGCAGATACAACATCATAGCACTGGTCACTGCAATCCAAGCATGAAAGCGCaCTTCACTGCCCTGAGGTCCCTTGCCGTCTTATTTATTGTGTTTACCTCTTACTTTCTAACCATACTCATCACCATTATAGGTACTCTATTTGATAAGAGATGTTGGTTATGGGTCTGGGAAGCTTTTGTCTATGCTTTCATCTTAATGCATTCCACTTCACTGATGCTGAGCAGCCCTACGTTGAAAAGGATTCTAAAGGGAAAGTGCTAG
タンパク質−(配列番号24)
MIPIQLTVFFMIIYVLESLTIIVQSSLIVAVLGREWLQVRRLMPVDMILISLGISRFCLQWASMLNNFCSYFNLNYVLCNLTITWEFFNILTFWLNSLLTVFYCIKVSSFTHHIFLWLRWRILRLFPWILLGSLMITCVTIIPSAIGNYIQIQLLTMEHLPRNSTVTDKLENFHQYQFQAHTVALVIPFILFLASTIFLMASLTKQIQHHSTGHCNPSMKAHFTALRSLAVLFIVFTSYFLTILITIIGTLFDKRCWLWVWEAFVYAFILMHSTSLMLSSPTLKRILKGKC
hT2R44配列:
DNA−(配列番号25)
ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTATATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGTTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTGTTATTACTACATTGGTATGCAACTCAGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTAAGAATTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCAACCATTTCAGCAGCTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATGTTTTATTTGCTCAGGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCGCATAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGGATGAGACTGTATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAATGTACCATTCAAATATGACTCTAACCATGCTAGCAAACTTTGTACCCCTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAaCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTTCTTCTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATGATCATATCAGTTTGTAATTTGGGGAGGCTGGAAAAGCAACCTGTCTTCATGTTCTGCCAAGCTATTATATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTTGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGATTTTTCTTTCAGTTTTGCGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGACAGAAGCCTTCGTCTCCATAGATTCACAAGAGGGGCATTGTGTGTCTTCTAG
タンパク質−(配列番号26)
MITFLPIIFSILIVVIFVIGNFANGFIALVNSIEWVKRQKISFVDQILTALAVSRVGLLWVLLLHWYATQLNPAFYSVEVRITAYNVWAVTNHFSSWLATSLSMFYLLRIANFSNLIFLRIKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMDETVWTKEYEGNVTWKIKLRSAMYHSNMTLTMLANFVPLTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHlKALQTVTSFLLLCAIYFLSMIISVCNLGRLEKQPVFMFCQAIIFSYPSTHPFILILGNKKLKQIFLSVLRHVRYWVKDRSLRLHRFTRGALCVF
DNA−(配列番号25)
ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTATATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGTTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTGTTATTACTACATTGGTATGCAACTCAGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTAAGAATTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCAACCATTTCAGCAGCTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATGTTTTATTTGCTCAGGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCGCATAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGGATGAGACTGTATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAATGTACCATTCAAATATGACTCTAACCATGCTAGCAAACTTTGTACCCCTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAaCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTTCTTCTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATGATCATATCAGTTTGTAATTTGGGGAGGCTGGAAAAGCAACCTGTCTTCATGTTCTGCCAAGCTATTATATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTTGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGATTTTTCTTTCAGTTTTGCGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGACAGAAGCCTTCGTCTCCATAGATTCACAAGAGGGGCATTGTGTGTCTTCTAG
タンパク質−(配列番号26)
MITFLPIIFSILIVVIFVIGNFANGFIALVNSIEWVKRQKISFVDQILTALAVSRVGLLWVLLLHWYATQLNPAFYSVEVRITAYNVWAVTNHFSSWLATSLSMFYLLRIANFSNLIFLRIKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMDETVWTKEYEGNVTWKIKLRSAMYHSNMTLTMLANFVPLTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHlKALQTVTSFLLLCAIYFLSMIISVCNLGRLEKQPVFMFCQAIIFSYPSTHPFILILGNKKLKQIFLSVLRHVRYWVKDRSLRLHRFTRGALCVF
hT2R5O配列:
DNA−(配列番号27)
ATGATAACTTTTCTGCCCATCATATTTTCCATTCTAGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCGTTGGTgAATTCCACCGAGTGGGTGAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTGTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTGTTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAgTTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCCTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCGCTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGGTGCTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGGTAAACATGAATCAGATTGTATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAGGCGTGCAATGTACCTTTCAGATACGACTGTAACCATGCTAGCAAACTTAGTACCCTTTACTGTAACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAGTCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGTACCAAGGTCCACATAAAAGTTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCTTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTGTGTCTGTAATAATATCAGTTTGGAGTTTTAAGAATCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCCAAGCTATTGGATTCAGCTGTTCTTCAGCCCACCCGTTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTATCTTTCAGTTTTGTGGCAAATGAGGTACTGA
タンパク質−(配列番号28)
MITFLPIIFSILVVVTFVIGNFANGFIALVNSTEWVKRQKISFADQIVTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFYSVELRTTAYNIWAVTGHFSNWPATSLSIFYLLKIANFSNLIFLRLKRRVKSVILVVLLGPLLFLACHLFVVNMNQIVWTKEYEGNMTWKIKLRRAMYLSDTTVTMLANLVPFTVTLISFLLLVCSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKVLQTVISFFLLCAIYFVSVIISVWSFKNLENKPVFMFCQAIGFSCSSAHPFILIWGNKKLKQTYLSVLWQMRY
DNA−(配列番号27)
ATGATAACTTTTCTGCCCATCATATTTTCCATTCTAGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCGTTGGTgAATTCCACCGAGTGGGTGAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTGTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTGTTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAgTTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCCTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCGCTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGGTGCTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGGTAAACATGAATCAGATTGTATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAGGCGTGCAATGTACCTTTCAGATACGACTGTAACCATGCTAGCAAACTTAGTACCCTTTACTGTAACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAGTCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGTACCAAGGTCCACATAAAAGTTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCTTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTGTGTCTGTAATAATATCAGTTTGGAGTTTTAAGAATCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCCAAGCTATTGGATTCAGCTGTTCTTCAGCCCACCCGTTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTATCTTTCAGTTTTGTGGCAAATGAGGTACTGA
タンパク質−(配列番号28)
MITFLPIIFSILVVVTFVIGNFANGFIALVNSTEWVKRQKISFADQIVTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFYSVELRTTAYNIWAVTGHFSNWPATSLSIFYLLKIANFSNLIFLRLKRRVKSVILVVLLGPLLFLACHLFVVNMNQIVWTKEYEGNMTWKIKLRRAMYLSDTTVTMLANLVPFTVTLISFLLLVCSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKVLQTVISFFLLCAIYFVSVIISVWSFKNLENKPVFMFCQAIGFSCSSAHPFILIWGNKKLKQTYLSVLWQMRY
hT2R51配列:
DNA−(配列番号29)
ATGTTGACTCTAACTCGCATCCGCACTGTGTCCTATGAAGTCAGGAGTACATTTCTGTTCATTTCAGTCCTGGAGTTTGCAGTGGGGTTTCTGACCAATGCCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGcCACTGAGCAACAGTGATTGTGTGCTGCTGTGTCTCAGCATCAGCCGGCTTTTCCTGCATGGACTGCTGTTCCTGAGTGCTATCCAGCTTACCCACTTCCAGAAGTTGAGTGAACCACTGAACCACAGCTACCAAGCCATCATCATGCTATGGATGATTGCAAACCAAGCCAACCTCTGGCTTGCTGCCTGCCTCAGCCTGCTTTACTGCTCCAAGCTCATCCGTTTCTCTCACACCTTCCTGATCTGCTTGGCAAGCTGGGTCTCCAGGAAGATCTCCCAGATGCTCCTGGGTATTATTCTTTGCTCCTGCATCTGCACTGTCCTCTGTGTTTGGTGCTTTTTTAGCAGACCTCACTTCACAGTCACAACTGTGCTATTCATGAATAACAATACAAGGCTCAACTGGCAGATTAAAGATCTCAATTTATTTTATTCCTTTCTCTTCTGCTATCTGTGGTCTGTGCCTCCTTTCCTATTGTTTCTGGTTTCTTCTGGGATGCTGACTGTCTCCCTGGGAAGGCACATGAGGACAATGAAGGTCTATACCAGAAACTCTCGTGACCCCAGCCTGGAGGCCCACATTAAAGCCCTCAAGTCTCTTGTCTCCTTTTTCTGCTTCTTTGTGATATCATCCTGTGcTGCCTTCATCTCTGTGCCCCTACTGATTCTGTGGCGCGACAAAATAGGGGTGATGGTTTGTGTTGGGATAATGGCAGCTTGTCCCTCTGGGCATGCAGCCgTCCTGATCTCAGGCAATGCCAAGTTGAGGAGAGCTGTGATGACCATTCTGCTCTGGGCTCAGAGCAGCCTGAAGGTAAGAGCCGACCACAAGGCAGATTCCCGGACACTGTGCTGA
タンパク質−(配列番号30)
MLTLTRIRTVSYEVRSTFLFISVLEFAVGFLTNAFVFLVNFWDVVKRQPLSNSDCVLLCLSISRLFLHGLLFLSAIQLTHFQKLSEPLNHSYQAIIMLWMIANQANLWLAACLSLLYCSKLIRFSHTFLICLASWVSRKISQMLLGIILCSCICTVLCVWCFFSRPHFTVTTVLFMNNNTRLNWQIKDLNLFYSFLFCYLWSVPPFLLFLVSSGMLTVSLGRHMRTMKVYTRNSRDPSLEAHlKALKSLVSFFCFFVISSCAAFISVPLLILWRDKIGVMVCVGlMAACPSGHAAVLISGNAKLRRAVMTILLWAQSSLKVRADHKADSRTLC
DNA−(配列番号29)
ATGTTGACTCTAACTCGCATCCGCACTGTGTCCTATGAAGTCAGGAGTACATTTCTGTTCATTTCAGTCCTGGAGTTTGCAGTGGGGTTTCTGACCAATGCCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGcCACTGAGCAACAGTGATTGTGTGCTGCTGTGTCTCAGCATCAGCCGGCTTTTCCTGCATGGACTGCTGTTCCTGAGTGCTATCCAGCTTACCCACTTCCAGAAGTTGAGTGAACCACTGAACCACAGCTACCAAGCCATCATCATGCTATGGATGATTGCAAACCAAGCCAACCTCTGGCTTGCTGCCTGCCTCAGCCTGCTTTACTGCTCCAAGCTCATCCGTTTCTCTCACACCTTCCTGATCTGCTTGGCAAGCTGGGTCTCCAGGAAGATCTCCCAGATGCTCCTGGGTATTATTCTTTGCTCCTGCATCTGCACTGTCCTCTGTGTTTGGTGCTTTTTTAGCAGACCTCACTTCACAGTCACAACTGTGCTATTCATGAATAACAATACAAGGCTCAACTGGCAGATTAAAGATCTCAATTTATTTTATTCCTTTCTCTTCTGCTATCTGTGGTCTGTGCCTCCTTTCCTATTGTTTCTGGTTTCTTCTGGGATGCTGACTGTCTCCCTGGGAAGGCACATGAGGACAATGAAGGTCTATACCAGAAACTCTCGTGACCCCAGCCTGGAGGCCCACATTAAAGCCCTCAAGTCTCTTGTCTCCTTTTTCTGCTTCTTTGTGATATCATCCTGTGcTGCCTTCATCTCTGTGCCCCTACTGATTCTGTGGCGCGACAAAATAGGGGTGATGGTTTGTGTTGGGATAATGGCAGCTTGTCCCTCTGGGCATGCAGCCgTCCTGATCTCAGGCAATGCCAAGTTGAGGAGAGCTGTGATGACCATTCTGCTCTGGGCTCAGAGCAGCCTGAAGGTAAGAGCCGACCACAAGGCAGATTCCCGGACACTGTGCTGA
タンパク質−(配列番号30)
MLTLTRIRTVSYEVRSTFLFISVLEFAVGFLTNAFVFLVNFWDVVKRQPLSNSDCVLLCLSISRLFLHGLLFLSAIQLTHFQKLSEPLNHSYQAIIMLWMIANQANLWLAACLSLLYCSKLIRFSHTFLICLASWVSRKISQMLLGIILCSCICTVLCVWCFFSRPHFTVTTVLFMNNNTRLNWQIKDLNLFYSFLFCYLWSVPPFLLFLVSSGMLTVSLGRHMRTMKVYTRNSRDPSLEAHlKALKSLVSFFCFFVISSCAAFISVPLLILWRDKIGVMVCVGlMAACPSGHAAVLISGNAKLRRAVMTILLWAQSSLKVRADHKADSRTLC
hT2R54配列:
DNA−(配列番号31)
ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTTGCTGAATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAGGCAGTTTCCACAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCATGATGTTAGAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTTATATTCTTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTCTCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTTATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCCTCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATTGTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCACATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTTCTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTGTGGAATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA
タンパク質−(配列番号32)
MTKLCDPAESELSPFLITLlLAVLLAEYLIGIIANGFlMAlHAAEWVQNKAVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKISFIFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVFISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGIVTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAlKAISYFLILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQllMAAYPASHSILLIQDNPGLRRAWKRLQLRLHLYPKEWTL
DNA−(配列番号31)
ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTTGCTGAATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAGGCAGTTTCCACAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCATGATGTTAGAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTTATATTCTTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTCTCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTTATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCCTCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATTGTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCACATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTTCTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTGTGGAATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA
タンパク質−(配列番号32)
MTKLCDPAESELSPFLITLlLAVLLAEYLIGIIANGFlMAlHAAEWVQNKAVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKISFIFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVFISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGIVTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAlKAISYFLILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQllMAAYPASHSILLIQDNPGLRRAWKRLQLRLHLYPKEWTL
hT2R55配列:
DNA−(配列番号33)
ATGGCAACGGTGAACACAGATGCCACAGATAAAGACATATCCAAGTTCAAGGTCACCTTCACTTTGGTGGTCTCCGGAATAGAGTGCATCACTGGCATCCTTGGGAGTGGCTTCATCACGGCCATCTATGGGGCTGAGTGGGCCAGGGGCAAAACACTCCCCACTGGTGACCGCATTATGTTGATGCTGAGCTTTTCCAGGCTCTTGCTACAGATTTGGATGATGCTGGAGAACATTTTCAGTCTGCTATTCCGAATTGTTTATAACCAAAACTCAGTGTATATCCTCTTCAAAGTCATCACTGTCTTTCTGAACCATTCCAATCTCTGGTTTGCTGCCTGGCTCAAAGTCTTCTATTGTCTTAGAATTGCAAACTTCAATCATCCTTTGTTCTTCCTGATGAAGAGGAAAATCATAGTGCTGATGCCTTGGCTTCTCAGGCTGTCAGTGTTGGTTTCCTTAAGCTTCAGCTTTCCTCTCTCGAGAGATGTCTTCAATGTGTATGTGAATAGCTCCATTCCTATCCCCTCCTCCAACTCCACGGAGAAGAAGTACTTCTCTGAGACCAATATGGTCAACCTGGTATTTTTCTATAACATGGGGATCTTCGTTCCTCTGATCATGTTCATCCTGGCAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAGGGACCCCAGCATGAAGGCTCACATAGGGGCCATCAAAGCCACCAGCTACTTTCTCATCCTCTACATTTTCAATGCAATTGCTCTATTTCTTTCCACGTCCAACATCTTTGACACTTACAGTTCCTGGAATATTTTGTGCAAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCGGCCACTCAGTACAACTGATCTTGGGCAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGTTTCAGCACCAAGTTCCTCTTTACCTAAAAGGGCAGACTCTGTGA
タンパク質−(配列番号34)
MATVNTDATDKDISKFKVTFTLVVSGIECITGILGSGFITAIYGAEWARGKTLPTGDRIMLMLSFSRLLLQIWMMLENIFSLLFRIVYNQNSVYILFKVITVFLNHSNLWFAAWLKVFYCLRIANFNHPLFFLMKRKIIVLMPWLLRLSVLVSLSFSFPLSRDVFNVYVNSSIPIPSSNSTEKKYFSETNMVNLVFFYNMGIFVPLIMFlLAATLLILSLKRHTLHMGSNATGSRDPSMKAHIGAlKATSYFLILYIFNAIALFLSTSNIFDTYSSWNILCKllMAAYPAGHSVQLILGNPGLRRAWKRFQHQVPLYLKGQTL
DNA−(配列番号33)
ATGGCAACGGTGAACACAGATGCCACAGATAAAGACATATCCAAGTTCAAGGTCACCTTCACTTTGGTGGTCTCCGGAATAGAGTGCATCACTGGCATCCTTGGGAGTGGCTTCATCACGGCCATCTATGGGGCTGAGTGGGCCAGGGGCAAAACACTCCCCACTGGTGACCGCATTATGTTGATGCTGAGCTTTTCCAGGCTCTTGCTACAGATTTGGATGATGCTGGAGAACATTTTCAGTCTGCTATTCCGAATTGTTTATAACCAAAACTCAGTGTATATCCTCTTCAAAGTCATCACTGTCTTTCTGAACCATTCCAATCTCTGGTTTGCTGCCTGGCTCAAAGTCTTCTATTGTCTTAGAATTGCAAACTTCAATCATCCTTTGTTCTTCCTGATGAAGAGGAAAATCATAGTGCTGATGCCTTGGCTTCTCAGGCTGTCAGTGTTGGTTTCCTTAAGCTTCAGCTTTCCTCTCTCGAGAGATGTCTTCAATGTGTATGTGAATAGCTCCATTCCTATCCCCTCCTCCAACTCCACGGAGAAGAAGTACTTCTCTGAGACCAATATGGTCAACCTGGTATTTTTCTATAACATGGGGATCTTCGTTCCTCTGATCATGTTCATCCTGGCAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAGGGACCCCAGCATGAAGGCTCACATAGGGGCCATCAAAGCCACCAGCTACTTTCTCATCCTCTACATTTTCAATGCAATTGCTCTATTTCTTTCCACGTCCAACATCTTTGACACTTACAGTTCCTGGAATATTTTGTGCAAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCGGCCACTCAGTACAACTGATCTTGGGCAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGTTTCAGCACCAAGTTCCTCTTTACCTAAAAGGGCAGACTCTGTGA
タンパク質−(配列番号34)
MATVNTDATDKDISKFKVTFTLVVSGIECITGILGSGFITAIYGAEWARGKTLPTGDRIMLMLSFSRLLLQIWMMLENIFSLLFRIVYNQNSVYILFKVITVFLNHSNLWFAAWLKVFYCLRIANFNHPLFFLMKRKIIVLMPWLLRLSVLVSLSFSFPLSRDVFNVYVNSSIPIPSSNSTEKKYFSETNMVNLVFFYNMGIFVPLIMFlLAATLLILSLKRHTLHMGSNATGSRDPSMKAHIGAlKATSYFLILYIFNAIALFLSTSNIFDTYSSWNILCKllMAAYPAGHSVQLILGNPGLRRAWKRFQHQVPLYLKGQTL
hT2R61配列:
DNA−(配列番号35)
ATGATAACTTTTCTACCCATCATTTTTTCCAGTCTGGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAACTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTAATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTGATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTACCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACTTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGTTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATGAGATTGTGCGGACAAAAGAATTTGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAAGAGTGCAATGTACTTTTCAAATATGACTGTAACCATGGTAGCAAACTTAGTACCCTTCACTCTGACCCTACTATCTTTTATGCTGTTAATCTGTTCTTTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGAAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTTTGGCAAATGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG
タンパク質−(配列番号36)
MITFLPIIFSSLVVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFNSVEV RTTAYNIWAVINHFSNWLATTLSIFYLLKIANFSNFIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACHLFVINMNEIVRTKEFEG NMTWKIKLKSAMYFSNMTVTMVANLVPFTLTLLSFMLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHlKALQTVISFLLLCAI YFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP
DNA−(配列番号35)
ATGATAACTTTTCTACCCATCATTTTTTCCAGTCTGGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAACTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTAATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTGATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTACCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACTTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGTTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATGAGATTGTGCGGACAAAAGAATTTGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAAGAGTGCAATGTACTTTTCAAATATGACTGTAACCATGGTAGCAAACTTAGTACCCTTCACTCTGACCCTACTATCTTTTATGCTGTTAATCTGTTCTTTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGAAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTTTGGCAAATGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG
タンパク質−(配列番号36)
MITFLPIIFSSLVVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFNSVEV RTTAYNIWAVINHFSNWLATTLSIFYLLKIANFSNFIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACHLFVINMNEIVRTKEFEG NMTWKIKLKSAMYFSNMTVTMVANLVPFTLTLLSFMLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHlKALQTVISFLLLCAI YFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP
hT2R64配列:
DNA−(配列番号37)
ATGACAACTTTTATACCCATCATTTTTTCCAGTGTGGTAGTGGTTCTATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGCGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAGATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTTAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGCTGTTGGGGCCTTTACTATTTTTGGCTTGTCAACTTTTTGTGATAAACATGAAAGAGATTGTACGGACAAAAGAATATGAAGGAAACTTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAGTGTACCTTTCAGATGCGACTGTAACCACGCTAGGAAACTTAGTGCCCTTCACTCTGACCCTGCTATGTTTTTTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTTTTTCCTCTTGTTATGTGCCGTTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGCGGCAAGTGAGGTACTGGGTGAAGGGAGAGAAGCCTTCATCTCCATAG
タンパク質−(配列番号38)
MTTFIPIIFSSVVVVLFVIGNFANGFIALVNSIEWVKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVFNPAFYSVEVRTTAYNVWAVTGHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACQLFVINMKEIVRTKEYEGNMTWKIKLRSAVYLSDATVTTLGNLVPFTLTLLCFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKVLQTVIFFLLLCAIYFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP
DNA−(配列番号37)
ATGACAACTTTTATACCCATCATTTTTTCCAGTGTGGTAGTGGTTCTATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGCGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAGATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTTAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGCTGTTGGGGCCTTTACTATTTTTGGCTTGTCAACTTTTTGTGATAAACATGAAAGAGATTGTACGGACAAAAGAATATGAAGGAAACTTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAGTGTACCTTTCAGATGCGACTGTAACCACGCTAGGAAACTTAGTGCCCTTCACTCTGACCCTGCTATGTTTTTTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTTTTTCCTCTTGTTATGTGCCGTTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGCGGCAAGTGAGGTACTGGGTGAAGGGAGAGAAGCCTTCATCTCCATAG
タンパク質−(配列番号38)
MTTFIPIIFSSVVVVLFVIGNFANGFIALVNSIEWVKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVFNPAFYSVEVRTTAYNVWAVTGHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACQLFVINMKEIVRTKEYEGNMTWKIKLRSAVYLSDATVTTLGNLVPFTLTLLCFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKVLQTVIFFLLLCAIYFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP
hT2R65配列:
DNA−(配列番号39)
ATGATGTGTTTTCTGCTCATCATTTCATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCATAGCCCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAACACACGAAAGATCTCCTCAGCTGAGCAAATTCTCACTGCTCTGGTGGTCTCCAGgATTGGTTTACTCTGGGTCATGTTATTCCTTTGGTATGCAACTGTGTTTAATTCTGCTTTATATGGTTTAGAAGTAAGAATTGTTGCTTCTAATGCCTGGGCTGTAACGAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTGTTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTCTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGGCCCTTGGTATTTCTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGAGAGAGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAGCTTGACTGTAACTACTCTAGCAAACCTCATACCCTTTACTCTGAGCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTTTGTAAACATCTCAAGAAGATGCGGCTCCATAGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCATATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATGTTATTTGCCATTTACTTTCTGTGTATAATCACATCAACTTGGAATCTTAGGACACAGCAGAGCAAACTTGTACTCCTGCTTTGCCAAACTGTTGCAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCATCCTGATTATGGGAAGTAGGAAGCTAAAACAGACCTTTCTTTCAGTTTTGTGGCAGATGACACGCTGA
タンパク質−(配列番号40)
MMCFLLIISSILVVFAFVLGNVANGFIALVNVIDWVNTRKISSAEQILTALVVSRIGLLWVMLFLWYATVFNSALYGLEVRIVASNAWAVTNHFSMWLAASLSIFCLLKIANFSNLISLHLKKRIKSVVLVILLGPLVFLICNLAVITMDERVWTKEYEGNVTWKIKLRNAIHLSSLTVTTLANLIPFTLSLICFLLLICSLCKHLKKMRLHSKGSQDPSTKVHlKALQTVTSFLMLFAIYFLCIITSTWNLRTQQSKLVLLLCQTVAIMYPSFHSFILIMGSRKLKQTFLSVLWQMTR
DNA−(配列番号39)
ATGATGTGTTTTCTGCTCATCATTTCATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCATAGCCCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAACACACGAAAGATCTCCTCAGCTGAGCAAATTCTCACTGCTCTGGTGGTCTCCAGgATTGGTTTACTCTGGGTCATGTTATTCCTTTGGTATGCAACTGTGTTTAATTCTGCTTTATATGGTTTAGAAGTAAGAATTGTTGCTTCTAATGCCTGGGCTGTAACGAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTGTTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTCTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGTTGGGGCCCTTGGTATTTCTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGAGAGAGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGAAATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAGCTTGACTGTAACTACTCTAGCAAACCTCATACCCTTTACTCTGAGCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTTTGTAAACATCTCAAGAAGATGCGGCTCCATAGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCATATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATGTTATTTGCCATTTACTTTCTGTGTATAATCACATCAACTTGGAATCTTAGGACACAGCAGAGCAAACTTGTACTCCTGCTTTGCCAAACTGTTGCAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCATCCTGATTATGGGAAGTAGGAAGCTAAAACAGACCTTTCTTTCAGTTTTGTGGCAGATGACACGCTGA
タンパク質−(配列番号40)
MMCFLLIISSILVVFAFVLGNVANGFIALVNVIDWVNTRKISSAEQILTALVVSRIGLLWVMLFLWYATVFNSALYGLEVRIVASNAWAVTNHFSMWLAASLSIFCLLKIANFSNLISLHLKKRIKSVVLVILLGPLVFLICNLAVITMDERVWTKEYEGNVTWKIKLRNAIHLSSLTVTTLANLIPFTLSLICFLLLICSLCKHLKKMRLHSKGSQDPSTKVHlKALQTVTSFLMLFAIYFLCIITSTWNLRTQQSKLVLLLCQTVAIMYPSFHSFILIMGSRKLKQTFLSVLWQMTR
hT2R67配列:
DNA−(配列番号41)
ATGATAACTTTTCTATACATTTTTTTTTCAATTCTAATAATGGTTTTATTTGTTCTCGGAAACTTTGCCAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTTCATTGACTGGGTGAAGAGAAAAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAATTGGTTTGCTCTGGGCATTATTATTAAATTGGTATTTAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAATTAAGAATTACTTCTTATAATGCCTGGGTTGTAACCAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAACCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTCTTTTTCTTCATTTAAAGAGGAGAGTTAGGAGTGTCATTCTGGTGATACTGTTGGGGACTTTGATATTTTTGGTTTGTCATCTTCTTGTGGCAAACATGGATGAGAGTATGTGGGCAGAAGAATATGAAGGAAACATGACTGGGAAGATGAAATTGAGGAATACAGTACATCTTTCATATTTGACTGTAACTACCCTATGGAGCTTCATACCCTTTACTCTGTCCCTGATATCTTTTCTGATGCTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGAGAAGGATCGCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTCTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTTCTTTCTATTCCTAATCGTTTCGGTTTGGAGTCCTAGGAGGCTGCGGAATGACCCGGTTGTCATGGTTAGCAAGGCTGTTGGAAACATATATCTTGCATTCGACTCATTCATCCTAATTTGGAGAACCAAGAAGCTAAAACACACCTTTCTTTTGATTTTGTGTCAGATTAGGTGCTGA
タンパク質−(配列番号42)
MITFLYIFFSILIMVLFVLGNFANGFIALVNFIDWVKRKKISSADQILTALAVSRIGLLWALLLNWYLTVLNPAFYSVELRITSYNAWVVTNHFSMWLAANLSIFYLLKIANFSNLLFLHLKRRVRSVILVILLGTLIFLVCHLLVANMDESMWAEEYEGNMTGKMKLRNTVHLSYLTVTTLWSFIPFTLSLISFLMLICSLCKHLKKMQLHGEGSQDLSTKVHlKALQTLISFLLLCAIFFLFLIVSVWSPRRLRNDPVVMVSKAVGNIYLAFDSFILIWRTKKLKHTFLLILCQIRC
DNA−(配列番号41)
ATGATAACTTTTCTATACATTTTTTTTTCAATTCTAATAATGGTTTTATTTGTTCTCGGAAACTTTGCCAATGGCTTCATAGCACTGGTAAATTTCATTGACTGGGTGAAGAGAAAAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCTCCAGAATTGGTTTGCTCTGGGCATTATTATTAAATTGGTATTTAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAATTAAGAATTACTTCTTATAATGCCTGGGTTGTAACCAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAACCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTCTTTTTCTTCATTTAAAGAGGAGAGTTAGGAGTGTCATTCTGGTGATACTGTTGGGGACTTTGATATTTTTGGTTTGTCATCTTCTTGTGGCAAACATGGATGAGAGTATGTGGGCAGAAGAATATGAAGGAAACATGACTGGGAAGATGAAATTGAGGAATACAGTACATCTTTCATATTTGACTGTAACTACCCTATGGAGCTTCATACCCTTTACTCTGTCCCTGATATCTTTTCTGATGCTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGAGAAGGATCGCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTCTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTTCTTTCTATTCCTAATCGTTTCGGTTTGGAGTCCTAGGAGGCTGCGGAATGACCCGGTTGTCATGGTTAGCAAGGCTGTTGGAAACATATATCTTGCATTCGACTCATTCATCCTAATTTGGAGAACCAAGAAGCTAAAACACACCTTTCTTTTGATTTTGTGTCAGATTAGGTGCTGA
タンパク質−(配列番号42)
MITFLYIFFSILIMVLFVLGNFANGFIALVNFIDWVKRKKISSADQILTALAVSRIGLLWALLLNWYLTVLNPAFYSVELRITSYNAWVVTNHFSMWLAANLSIFYLLKIANFSNLLFLHLKRRVRSVILVILLGTLIFLVCHLLVANMDESMWAEEYEGNMTGKMKLRNTVHLSYLTVTTLWSFIPFTLSLISFLMLICSLCKHLKKMQLHGEGSQDLSTKVHlKALQTLISFLLLCAIFFLFLIVSVWSPRRLRNDPVVMVSKAVGNIYLAFDSFILIWRTKKLKHTFLLILCQIRC
hT2R71配列:
DNA−(配列番号43)
ATGCAAGCAGCACTGACGGCCTTCTTCGTGTTGCTCTTTAGCCTGCTGAGTCTTCTGGGGATTGCAGCGAATGGCTTCATTGTGCTGGTGCTGGGCAGGGAGTGGCTGCGATATGGCAGGTTGCTGCCCTTGGATATGATCCTCATTAGCTTGGGTGCCTCCCGCTTCTGCCTGCAGTTGGTTGGGACGGTGCACAACTTCTACTACTCTGCCCAGAAGGTCGAGTACTCTGGGGGTCTCGGCCGACAGTTCTTCCATCTACACTGGCACTTCCTGAACTCAGCCACCTTCTGGTTTTGCAGCTGGCTCAGTGTCCTGTTCTGTGTGAAGATTGCTAACATCACACACTCCACCTTCCTGTGGCTGAAGTGGAGGTTCCCAGGGTGGGTGCCCTGGCTCCTGTTGGGCTCTGTCCTGATCTCCTTCATCATAACCCTGCTGTTTTTTTGGGTGAACTACCCTGTATATCAAGAATTTTTAATTAGAAAATTTTCTGGGAACATGACCTACAAGTGGAATACAAGGATAGAAACATACTATTTCCCATCCCTGAAACTGGTCATCTGGTCAATTCCTTTTTCTGTTTTTCTGGTCTCAATTATGCTGTTAATTAATTCTCTGAGGAGGCATACTCAGAGAATGCAGCACAACGGGCACAGCCTGCAGGACCCCAGCACCCAGGCTCACACCAGAGCTCTGAAGTCCCTCATCTCCTTCCTCATTCTTTATGCTCTGTCCTTTCTGTCCCTGATCATTGATGCCGCAAAATTTATCTCCATGCAGAACGACTTTTACTGGCCATGGCAAATTGCAGTCTACCTGTGCATATCTGTCCATCCCTTCATCCTCATCTTCAGCAACCTCAAGCTTCGAAGCGTGTTCTCGCAGCTCCTGTTGTTGGCAAGGGGCTTCTGGGTGGCCTAG
タンパク質−(配列番号44)
MQAALTAFFVLLFSLLSLLGlAANGFIVLVLGREWLRYGRLLPLDMILISLGASRFCLQLVGTVHNFYYSAQKVEYSGGLGRQFFHLHWHFLNSATFWFCSWLSVLFCVKIANITHSTFLWLKWRFPGWVPWLLLGSVLISFIITLLFFWVNYPVYQEFLIRKFSGNMTYKWNTRIETYYFPSLKLVIWSIPFSVFLVSIMLLINSLRRHTQRMQHNGHSLQDPSTQAHTRALKSLISFLILYALSFLSLIIDAAKFISMQNDFYWPWQIAVYLCISVHPFILIFSNLKLRSVFSQLLLLARGFWVA
DNA−(配列番号43)
ATGCAAGCAGCACTGACGGCCTTCTTCGTGTTGCTCTTTAGCCTGCTGAGTCTTCTGGGGATTGCAGCGAATGGCTTCATTGTGCTGGTGCTGGGCAGGGAGTGGCTGCGATATGGCAGGTTGCTGCCCTTGGATATGATCCTCATTAGCTTGGGTGCCTCCCGCTTCTGCCTGCAGTTGGTTGGGACGGTGCACAACTTCTACTACTCTGCCCAGAAGGTCGAGTACTCTGGGGGTCTCGGCCGACAGTTCTTCCATCTACACTGGCACTTCCTGAACTCAGCCACCTTCTGGTTTTGCAGCTGGCTCAGTGTCCTGTTCTGTGTGAAGATTGCTAACATCACACACTCCACCTTCCTGTGGCTGAAGTGGAGGTTCCCAGGGTGGGTGCCCTGGCTCCTGTTGGGCTCTGTCCTGATCTCCTTCATCATAACCCTGCTGTTTTTTTGGGTGAACTACCCTGTATATCAAGAATTTTTAATTAGAAAATTTTCTGGGAACATGACCTACAAGTGGAATACAAGGATAGAAACATACTATTTCCCATCCCTGAAACTGGTCATCTGGTCAATTCCTTTTTCTGTTTTTCTGGTCTCAATTATGCTGTTAATTAATTCTCTGAGGAGGCATACTCAGAGAATGCAGCACAACGGGCACAGCCTGCAGGACCCCAGCACCCAGGCTCACACCAGAGCTCTGAAGTCCCTCATCTCCTTCCTCATTCTTTATGCTCTGTCCTTTCTGTCCCTGATCATTGATGCCGCAAAATTTATCTCCATGCAGAACGACTTTTACTGGCCATGGCAAATTGCAGTCTACCTGTGCATATCTGTCCATCCCTTCATCCTCATCTTCAGCAACCTCAAGCTTCGAAGCGTGTTCTCGCAGCTCCTGTTGTTGGCAAGGGGCTTCTGGGTGGCCTAG
タンパク質−(配列番号44)
MQAALTAFFVLLFSLLSLLGlAANGFIVLVLGREWLRYGRLLPLDMILISLGASRFCLQLVGTVHNFYYSAQKVEYSGGLGRQFFHLHWHFLNSATFWFCSWLSVLFCVKIANITHSTFLWLKWRFPGWVPWLLLGSVLISFIITLLFFWVNYPVYQEFLIRKFSGNMTYKWNTRIETYYFPSLKLVIWSIPFSVFLVSIMLLINSLRRHTQRMQHNGHSLQDPSTQAHTRALKSLISFLILYALSFLSLIIDAAKFISMQNDFYWPWQIAVYLCISVHPFILIFSNLKLRSVFSQLLLLARGFWVA
hT2R75配列:
DNA−(配列番号45)
ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTACATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTATTAGTATTAAATTGGTATGCAACTGAGTTGAATCCAGCTTTTAACAGTATAGAAGTAAGAATTACTGCTTACAATGTCTGGGCAGTAATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTATTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATCAGATTATATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAACTGAGGAGTGCAATGTACCTTTCAAATACAACGGTAACCATCCTAGCAAACTTAGTTCCCTTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAAAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCATGAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATCATGTCAGTTTGGAGTTTTGAGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCGAAGCTATTGCATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGTGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG
タンパク質−(配列番号46)
MITFLPIIFSILIVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLVLNWYATELNPAFNSIEVRITAYNVWAVINHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMNQIIWTKEYEGNMTWKIKLRSAMYLSNTTVTILANLVPFTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHlKALQTVTSFLLLCAIYFLSIIMSVWSFESLENKPVFMFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS
DNA−(配列番号45)
ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTACATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTATTAGTATTAAATTGGTATGCAACTGAGTTGAATCCAGCTTTTAACAGTATAGAAGTAAGAATTACTGCTTACAATGTCTGGGCAGTAATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTATTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATCAGATTATATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAACTGAGGAGTGCAATGTACCTTTCAAATACAACGGTAACCATCCTAGCAAACTTAGTTCCCTTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAAAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCATGAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATCATGTCAGTTTGGAGTTTTGAGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCGAAGCTATTGCATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGTGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG
タンパク質−(配列番号46)
MITFLPIIFSILIVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLVLNWYATELNPAFNSIEVRITAYNVWAVINHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMNQIIWTKEYEGNMTWKIKLRSAMYLSNTTVTILANLVPFTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHlKALQTVTSFLLLCAIYFLSIIMSVWSFESLENKPVFMFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS
hT2R76配列:
DNA−(配列番号47)
ATGAATGGAGACCACATGGTTCTAGGATCTTCGGTGACTGACAAGAAGGCCATCATCTTGGTTACCATTTTACTCCTTTTACGCCTGGTAGCAATAGCAGGCAATGGCTTCATCACTGCTGCTCTGGGCGTGGAGTGGGTGCTACGGAGAATGTTGTTGCCTTGTGATAAGTTATTGGTTAGCCTAGGGGCCTCTCGCTTCTGTCTGCAGTCAGTGGTAATGGGTAAGACCATTTATGTTTTCTTGCATCCGATGGCCTTCCCATACAACCCTGTACTGCAGTTTCTAGCTTTCCAGTGGGACTTCCTGAATGCTGCCACCTTATGGTCCTCTACCTGGCTCAGTGTCTTCTATTGTGTGAAAATTGCTACCTTCACCCACCCTGTCTTCTTCTGGCTAAAGCACAAGTTGTCTGGGTGGCTACCATGGATGCTCTTCAGCTCTGTAGGGCTCTCCAGCTTCACCACCATTCTATTTTTCATAGGCAACCACAGAATGTATCAGAACTATTTAAGGAACCATCTACAACCTTGGAATGTCACTGGCGATAGCATACGGAGCTACTGTGAGAAATTCTATCTCTTCCCTCTAAAAATGATTACTTGGACAATGCCCACTGCTGTCTTTTTCATTTGCATGATTTTGCTCATCACATCTCTGGGAAGACACAGGAAGAAGGCTCTCCTTACAACCTCAGGATTCCGAGAGCCCAGTGTGCAGGCACACATAAAGGCTCTGCTGGCTCTCCTCTCTTTTGCCATGCTCTTCATCTCATATTTCCTGTCACTGGTGTTCAGTGCTGCAGGTATTTTTCCACCTCTGGACTTTAAATTCTGGGTGTGGGAGTCAGTGATTTATCTGTGTGCAGCAGTTCACCCCATCATTCTGCTCTTCAGCAACTGCAGGCTGAGAGCTGTGCTGAAGAGTCGcCGTTCCTCAAGGTGTGGGACACCTTGA
タンパク質−(配列番号48)
MNGDHMVLGSSVTDKKAIILVTILLLLRLVAIAGNGFITAALGVEWVLRRMLLPCDKLLVSLGASRFCLQSVVMGKTIYVFLHPMAFPYNPVLQFLAFQWDFLNAATLWSSTWLSVFYCVKIATFTHPVFFWLKHKLSGWLPWMLFSSVGLSSFTTILFFIGNHRMYQNYLRNHLQPWNVTGDSIRSYCEKFYLFPLKMITWTMPTAVFFICMILLITSLGRHRKKALLTTSGFREPSVQAHlKALLALLSFAMLFISYFLSLVFSAAGIFPPLDFKFWVWESVIYLCAAVHPIILLFSNCRLRAVLKSRRSSRCGTP
DNA−(配列番号47)
ATGAATGGAGACCACATGGTTCTAGGATCTTCGGTGACTGACAAGAAGGCCATCATCTTGGTTACCATTTTACTCCTTTTACGCCTGGTAGCAATAGCAGGCAATGGCTTCATCACTGCTGCTCTGGGCGTGGAGTGGGTGCTACGGAGAATGTTGTTGCCTTGTGATAAGTTATTGGTTAGCCTAGGGGCCTCTCGCTTCTGTCTGCAGTCAGTGGTAATGGGTAAGACCATTTATGTTTTCTTGCATCCGATGGCCTTCCCATACAACCCTGTACTGCAGTTTCTAGCTTTCCAGTGGGACTTCCTGAATGCTGCCACCTTATGGTCCTCTACCTGGCTCAGTGTCTTCTATTGTGTGAAAATTGCTACCTTCACCCACCCTGTCTTCTTCTGGCTAAAGCACAAGTTGTCTGGGTGGCTACCATGGATGCTCTTCAGCTCTGTAGGGCTCTCCAGCTTCACCACCATTCTATTTTTCATAGGCAACCACAGAATGTATCAGAACTATTTAAGGAACCATCTACAACCTTGGAATGTCACTGGCGATAGCATACGGAGCTACTGTGAGAAATTCTATCTCTTCCCTCTAAAAATGATTACTTGGACAATGCCCACTGCTGTCTTTTTCATTTGCATGATTTTGCTCATCACATCTCTGGGAAGACACAGGAAGAAGGCTCTCCTTACAACCTCAGGATTCCGAGAGCCCAGTGTGCAGGCACACATAAAGGCTCTGCTGGCTCTCCTCTCTTTTGCCATGCTCTTCATCTCATATTTCCTGTCACTGGTGTTCAGTGCTGCAGGTATTTTTCCACCTCTGGACTTTAAATTCTGGGTGTGGGAGTCAGTGATTTATCTGTGTGCAGCAGTTCACCCCATCATTCTGCTCTTCAGCAACTGCAGGCTGAGAGCTGTGCTGAAGAGTCGcCGTTCCTCAAGGTGTGGGACACCTTGA
タンパク質−(配列番号48)
MNGDHMVLGSSVTDKKAIILVTILLLLRLVAIAGNGFITAALGVEWVLRRMLLPCDKLLVSLGASRFCLQSVVMGKTIYVFLHPMAFPYNPVLQFLAFQWDFLNAATLWSSTWLSVFYCVKIATFTHPVFFWLKHKLSGWLPWMLFSSVGLSSFTTILFFIGNHRMYQNYLRNHLQPWNVTGDSIRSYCEKFYLFPLKMITWTMPTAVFFICMILLITSLGRHRKKALLTTSGFREPSVQAHlKALLALLSFAMLFISYFLSLVFSAAGIFPPLDFKFWVWESVIYLCAAVHPIILLFSNCRLRAVLKSRRSSRCGTP
上述の詳細な説明は、本発明のいくつかの実施形態に関して説明したが、上記の説明は例証目的のみであり、開示した本発明の限定を意図しないことを理解されたい。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (79)
- hT2Rl、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R44、hT2R50、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76から選択されるヒトT2R苦味受容体を調節する化合物を同定するアッセイであって、前記苦味受容体は、アセサルフェームK、アセトアミノフェン、2−アセチルピラジン、アロイン、アミノ−2−ノルボルナン−カルボン酸、アミグダリン、アンドログラフォリド、アルブチン、アリストロキン酸、アトロピン、ブルシン、4−ベンジルピペリジン、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、シンコニン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、シクロオクタノン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、ジイソブチルアミン、ジメチルビグアナイド、2,6−ジメチルピペリジン、ドキセピン、マレイン酸エナラプリル、エドロホニウム、エノキサシン、(−)エピカテキン、(−)エリスロマイシン、エチルピラジン、ファモチジン、ガバペンチン、ギンゴライドA、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、塩酸ラベタロール、リナマリン、ロメフロキサシン、(−)ルピニン、N−メチルチオ尿素、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、ニトロフタレン、ニトロサッカリン、オフロキサシン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ペプチド−LPFNQL(配列番号51)、ペプチド−LPFSQL(配列番号52)、ペプチド−YQEPVLGPVRGPFPIIV(配列番号57)、ペプチド−PVLGPVRGPFPIIV(配列番号58)、ペプチド−PVRGPFPIIV(配列番号55)、ペプチド−RGPFPIIV(配列番号56)、N−エチル−N´−フェニル尿素、2−ピコリン、ピクリン酸、ピレンゼピン二塩酸塩、フェニルチオカルバミド、プレドニゾン、プロカインアミド、6−n−プロピル−2−チオウラシル、クァシン、キナクリン、キニーネ、ラニチジン、サッカリン、D−(−)−サリシン、硫酸スパルテイン5水和物、オクタ酢酸スクロース、ストリキニーネ、スルファメトキサゾール、テオブロミン、チオアセトアニリド、チオカルバニリド、トラゾリン、トリル尿素、トラピジル(trapidil)、トリメトプリム、およびL−トリプトファンから選択される少なくとも1つの苦味リガンド、または構造上関連する化合物に特異的に応答し、
i.hT2R1、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、およびhT2R76ポリペプチドのうちの少なくとも1つであって、それぞれ、(1)配列番号4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、および48に含まれるポリペプチド配列を有する、および/または(2)それぞれ、配列番号3、5、7、9、11、13、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、および47に含まれる核酸配列でコードされる、および/または(3)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、(2)における配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる、および/または(4)(1)における配列への少なくとも90%の配列同一性を保有するポリペプチド配列を有するhT2Rポリペプチド、または前記苦味リガンドもしくは構造上関連する化合物のうちの少なくとも1つにより活性化される、(1)、(2)、(3)、もしくは(4)のうちのいずれかのフラグメントもしくはキメラの、活性化を誘発するために、前記苦味化合物のうちの少なくとも1つへのその効果のために化合物をスクリーニングするステップと、
ii. 前記苦味化合物または構造上関連する化合物のうちの少なくとも1つによる前記受容体の活性化へのその効果に基づいて、前記化合物が、苦味を調節するかどうかを判定するステップと、
iii. 前記苦味化合物のうちの少なくとも1つにより前記ヒト苦味受容体の活性化を調節する場合、潜在的な苦味モジュレータとして前記化合物を同定するステップと、を含む、アッセイ。 - 前記hT2Rは、hT2R1ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R4ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R5ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R7ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R8ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R9ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R10ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R13ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R14ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R16ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R44ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R50ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R51ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R54ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R55である、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R61である、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R64ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R65ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R67ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R71である、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R75ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R76ポリペプチドである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、細胞膜上に発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、単離細胞膜上に発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、無傷細胞上に発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、真核細胞上に発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、両生類、哺乳類または昆虫細胞によって発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、HEK293、BHK、C0S、HEK293T、CHO、およびアフリカツメガエル卵母細胞から選択される細胞上に発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 蛍光定量アッセイである、請求項1に記載のアッセイ。
- 結合アッセイである、請求項1に記載のアッセイ。
- 細胞内イオン濃度へのその効果をアッセイすることによって、前記化合物への効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 細胞内ナトリウムまたはカルシウムへの前記化合物の効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 細胞膜電位への前記化合物の効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体の転写への前記化合物の効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記化合物は、前記苦味リガンドのうちの1つと前記味覚受容体の相互作用を遮断するその能力に基づいて選択される、請求項1に記載のアッセイ。
- 細胞内cAMP、cGMPまたはIP3への前記化合物の効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、前記味覚受容体の細胞外ドメインまたは膜貫通領域を含む、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記アッセイは、カルシウムに特異的な蛍光色素を使用して、カルシウムの変化を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記アッセイは、Fluo−3、Fluo−4、およびFura−2から選択される色素を使用して、細胞内カルシウムの変化を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、溶液中にある、請求項1に記載のアッセイ。
- 分光学的特性、流力特性または溶解度の変化を検出する結合アッセイである、請求項1に記載のアッセイ。
- Gタンパク質との前記味覚受容体の複合への、前記化合物の効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- トランスデューシン、ガストデューシン、Gα15、Gα16、またはそれらのキメラから選択されるGタンパク質との前記味覚受容体の複合への前記化合物の効果を検出する、請求項1に記載のアッセイ。
- 蛍光偏光アッセイである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、固相基質に接着される、請求項1に記載のアッセイ。
- ハイスループットアッセイである、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、HEK−293細胞によって発現される、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体はhT2R1であり、前記アッセイは、クロラムフェニコール、クロロキン、シクロオクタノン、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、プレドニゾン、キニーネ、スルファメトキサゾール、チオアセトアニリド、チオカルバニリド、ギンゴライドA、ロメフロキサシン、N−メチルチオ尿素、メチルプレドニゾロン、ニトロサッカリン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ペプチド−LPFNQL(配列番号51)、ペプチド−LPFSQL(配列番号52)、ペプチド−YQEPVLGPVRGPFPIIV(配列番号57)、ペプチド−PVLGPVRGPFPIIV(配列番号54)、ペプチド−RGPFPIIV(配列番号56)、およびピクリン酸、ならびに構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとのhT2Rlの相互作用を抑制または遮断する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記味覚受容体は、hT2R4であり、前記アッセイは、4−ベンジルピペリジン、クロロキン、塩酸ジルチアゼム、ジイソブチルアミン、2,6−ジメチルピペリジン、ドキセピン、マレイン酸エナラプリル、ファモチジン、ガバペンチン、グアイアコールグリセリルエーテル、塩酸ラベタロール、(−)ルピニン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ピレンゼピン二塩酸塩、プロカインアミド、キニーネ、ラニチジン、ストリキニーネ、テオブロミン、トラゾリン、およびトリメトプリム、ならびに構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとのhT2R4の相互作用を抑制または遮断する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R5であり、前記アッセイは、ジメチルビグアナイド、1−メチル−2−キノリノン、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、および2−ピコリン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R5の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R7であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、クロロキン、エチルピラジン、1−メチル−2−キノリノン、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、2−ピコリン、ピレンゼピン二塩酸塩、キニーネ、ストリキニーネ、およびトリメトプリム、ならびに構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとのhT2R7の相互作用を抑制または遮断する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R8であり、前記アッセイは、アセサルフェームK、2−アセチルピラジン、アロイン、アンドログラフォリド、アトロピン、クロラムフェニコール、シクロヘキシミド、シクロオクタノン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、マレイン酸エナラプリル、(−)エリスロマイシン、エチルピラジン、ファモチジン、ガバペンチン、ギンゴライドA、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、ロメフロキサシン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、ニトロフタレン、ニトロサッカリン、オレウロペイン(oleuropein)、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、N´−エチル−N´−フェニル尿素、2−ピコリン、ピクリン酸、ピレンゼピン二塩酸塩、プロカインアミド、クァシン、ラニチジン、サッカリン、オクタ酢酸スクロース、ストリキニーネ、トラピジル(trapidil)、およびトリメトプリム、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R8の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R9であり、前記アッセイは、エチルピラジン、オフロキサシン、ならびに構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとの前記hT2R9の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R10であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、アンドログラフォリド、アトロピン、ブルシン、4−ベンジルピペリジン、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、シンコニン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、シクロオクタノン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、ジイソブチルアミン、2,6−ジメチルピペリジン、ドキセピン、エドロホニウム、エリスロマイシン、エチルピラジン、ファモチジン、ガバペンチン、ギンゴライドA.、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、ルピニン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、プレドニゾン、プロカインアミド、クァシン、キナクリン、キニーネ、ラニチジン、硫酸スパルテイン5水和物、オクタ酢酸スクロース、ストリキニーネ、トラゾリン、トリル尿素、トラピジル(trapidil)、およびトリメトプリム、ならびに構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとの前記hT2R10の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2RはhT2R13であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、アトロピン、クラリスロマイシン、安息香酸デナトニウム、ドキセピン、エチルピラジン、オレウロペイン(oleuropein)、オキシフェノニウムHBr、およびキナクリン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R13の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R14であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、アリストロキン酸、シクロオクタノン、デキサメタゾン、塩酸ジルチアゼム、2,6−ジメチルピペリジン、エリスロマイシン、エチルピラジン、ゴイトリン、グアイアコールグリセリルエーテル、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、ニトロフタレン、ニトロサッカリン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、N´−エチル−N´−フェニル尿素、2−ピコリン、ピクリン酸、キニーネ、ストリキニーネ、テオブロミン、トリル尿素、およびトラピジル(trapidil)、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとの前記hT2R14の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R16であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、アミグダリン、アルブチン、リナマリン、およびD−(−)−サリシン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとの前記hT2R16の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R44であり、前記アッセイは、エチルピラジンおよび2−アセチルピラジン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとの前記hT2R44の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R50であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、およびエチルピラジン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R50の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R51であり、前記アッセイは、クラリスロマイシン、エチルピラジン、ゴイトリン、n−メチルチオ尿素、塩化オキシブチニン、N´−エチル−N´−フェニル尿素、2−ピコリン、フェニルチオカルバミド、6−n−プロピル−2−チオウラシル、チオアセトアニリド、およびトリメトプリム、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとの前記hT2R51の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R54であり、前記アッセイは、アセトアミノフェン、クロロキン、クラリスロマイシン、安息香酸デナトニウム、エピカテキン、エリスロマイシン、塩酸ラベタロール、1−メチル−2−キノリノン、オレウロペイン(oleuropein)、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、ピレンゼピン二塩酸塩、プロカインアミド、ラニチジン、ストリキニーネ、トリメトプリム、およびL−トリプトファン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R54の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R55であり、前記アッセイは、ドキセピン、リナマリン、塩化オキシブチニン、キニーネ、およびストリキニーネ、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R55の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R61であり、前記アッセイは、アセサルフェームK、アロイン、アリストロキン酸、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、安息香酸デナトニウム、ニトロサッカリン、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウム臭化水素酸塩、ペプチド−LPFNQL(配列番号51)、ペプチド−LPFSQL(配列番号52)、ピクリン酸、サッカリン、およびストリキニーネ、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R61の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R64であり、前記アッセイは、アセサルフェームK、アミノ−2−ノルボルナン−カルボン酸、アリストロキン酸、ガバペンチン、リナマリン、ロメフロキサシン、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウムHBr、キニーネ、ラニチジン、サッカリン、ストリキニーネ、およびL−トリプトファン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R64の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R65であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、エチルピラジン、および1−メチル−2−キノリノン、ならびに構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとのhT2R65の相互作用を抑制または遮断する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R67であり、前記アッセイは、2−アセチルピラジン、アンドログラフォリド、エチルピラジン、および塩化オキシブチニン、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R67の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R71であり、前記アッセイは、ニトロサッカリンおよびピクリン酸、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R71の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R75であり、前記アッセイは、アンドログラフォリド、アトロピン、ブルシン、4−ベンジルピペリジン、カフェイン、クロラムフェニコール、クロロキン、シンコニン、シプロフロキサシン、安息香酸デナトニウム、デキサメタゾン、ドキセピン、マレイン酸エナラプリル、エノキサシン、エリスロマイシン、エチルピラジン、ギンゴライドA、ゴイトリン、塩酸ラベタロール、ロメフロキサシン、(−)ルピニン、1−メチル−2−キノリノン、メチルプレドニゾロン、オフロキサシン、オメプラゾール、塩化オキシブチニン、オキシフェノニウム臭化水素酸塩、ピレンゼピン二塩酸塩、プレドニゾン、プロカインアミド、クァシン、キニーネ、ラニチジン、硫酸スパルテイン5水和物、ストリキニーネ、スルファメトキサゾール、トラゾリン、トラピジル(trapidil)、およびトリメトプリム、ならびに構造上関連する化合物から選択される少なくとも1つの苦味リガンドとのhT2R75の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- 前記hT2Rは、hT2R76であり、前記アッセイは、ブルシン、および構造上関連する化合物から選択される苦味リガンドとのhT2R76の相互作用を遮断または抑制する化合物をスクリーニングする、請求項1に記載のアッセイ。
- ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47のいずれかに含まれるDNA配列、または配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、および48のいずれかに含まれるポリペプチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を有するT2Rポリペプチドを発現する、単離味覚または胃腸細胞。
- 前記細胞は、配列番号13または15に含まれる、hT2R9VまたはhT2R9AのDNA配列を含む、請求項71に記載の単離味覚または胃腸細胞。
- ヒトT2Rを調節する化合物を同定する方法であって、請求項71または72に記載の味覚または胃腸細胞を、潜在的T2R調節化合物と接触させるステップと、前記化合物がそこに発現したT2Rの活性と特異的に結合するおよび/または調節するかどうか、および/または別の化合物による前記ヒトT2Rの特異的結合または活性化に影響するかどうかを検出するステップと、を含む、方法。
- T2R9AまたはT2R9V表現型を有する個人をスクリーニングする方法であって、個人の遺伝子検査を行うステップと、前記個人が、配列番号15に含まれるhT2R9A配列、または配列番号13に含まれるhT2R9V配列を含むかどうかを判定するステップと、を含む方法。
- 配列番号15または13に記載のT2R9AまたはT2R9V配列を発現する細胞を、推定T2R9AまたはT2R9V調節化合物と接触させるステップと、前記T2R9AまたはT2R9Vの活性を調節する化合物を検出するステップと、を含む、スクリーニングアッセイ。
- T2R9ハプロタイプの発現と関連する差異を検出する方法であって、hT2R9Aと特異的に結合および/またはそれを活性化するが、hT2R9Vには特異的に結合および/またはそれを活性化しない、または、その逆の化合物を同定するステップを含む、方法。
- hT2R9AあるいはhT2R9Vのいずれかを発現する細胞を接触させるステップと、前記hT2R9配列のいずれかを特異的に活性化する化合物を同定するステップと、生体内でその効果を判定するステップと、を含む、T2Rリガンドスクリーニングアッセイ。
- 舌または胃腸系における細胞により現された、T2Rの効果を含む、味覚および/または胃腸もしくは消化機能への前記リガンドの効果を検査するステップをさらに含む、請求項77に記載のアッセイ。
- 前記細胞は、腸管内分泌細胞である、請求項78に記載のアッセイ。
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