CN114225051A - 一种用于治疗银屑病的药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗银屑病的药物及其应用，涉及医药技术领域，药物的有效成分包括可抑制24p3R基因表达的siRNA序列。本发明的药物通过可抑制24p3R基因表达的siRNA序列抑制抗菌肽24p3受体(24p3R)表达，进而减轻银屑病，降低皮损细胞因子的表达水平，以及炎症小体NLRC4的表达水平，能够减轻中性粒细胞等炎症细胞的浸润程度；药物通过涂抹的方式涂抹于患处即可，治疗方法简单，疗效好，对人体无负面作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗银屑病的药物及其应用。
背景技术
银屑病是一种免疫介导的常见慢性炎症性皮肤病，伴有角化过度和多种炎症反应。全球发病率约3％，在欧美国家约有2500万患者，我国银屑病发病率为0.72％，约有1000万患者，且每年新增10万患者。本病初发时季节性明显，多为冬重夏缓。全身均可发病，但通常好发于头皮、指(趾)甲、四肢的伸侧(尤其小腿胫前)、腰骶部，一般呈对称分布，临床表现为红色斑块上覆较厚银白色鳞屑。银屑病主要的皮肤病理学特征为：表皮增生，角质形成细胞增殖明显，血管生成增加及扩张，炎症浸润明显。根据其临床表现及病理特征，主要分为寻常型银屑病、脓疱型银屑病、关节病型银屑病、红皮病型银屑病，其中寻常型银屑病最为常见，占全部患者的97％以上。
银屑病病情顽固且容易反复发作，给患者造成了沉重的生活负担和精神困扰。但是，银屑病的具体发病机制目前尚不十分明确。研究表明，遗传因素、环境因素以及自身免疫因素共同导致了银屑病的发生和发展。以往研究认为，T细胞作为机体的主要免疫细胞，在银屑病的发病过程中起着主要的作用。近些年，随着研究的深入，广大学者对除T细胞之外的角质形成细胞、树突状细胞及中性粒细胞等多种细胞在银屑病中发挥的作用，也逐渐有了新的认识。然而这些细胞具体在疾病的不同阶段中以何种方式发挥何种作用，仍不是十分明确。
银屑病治疗一般分为系统治疗、局部治疗以及物理疗法。系统治疗银屑病的药物有：维A酸、甲氨喋呤、延胡索乙酯等。研究表明，全身系统性治疗银屑病的疗效显著，使用方便，但会出现一定的肾毒性、高血压、肝毒性、高血脂等不良反应。局部疗法包括：卤米松等外用激素、焦油、地蒽酚、维A酸面霜、他莫克斯、维生素D3衍生物等。物理疗法：紫外线照射疗法目前为治疗银屑病患者的最佳疗效方法，但其治疗方式相对不变，且治疗过程中对正常皮肤有一定负作用。除此之外，由于银屑病治疗过程漫长，有些病人长期使用某种药物会带来抗药性，因此，寻找一种新的治疗药物是迫不及待的，可以为治疗银屑病带来新的思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于治疗银屑病的药物，通过抑制24p3R基因表达的siRNA序列抑制抗菌肽24p3受体(24p3R)表达，进而减轻银屑病，且对人体无负面作用。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种用于治疗银屑病的药物，所述药物的有效成分包括可抑制24p3R基因表达的siRNA序列。
进一步，siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUTT，序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCAG，序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述药物还可以是对上述可抑制24p3R基因表达的siRNA序列进行化学修饰后的RNA分子。
进一步，所述siRNA全链RNA碱基的核糖2位做2-OMe修饰。
进一步，所述siRNA正义链的3’端进行胆固醇修饰。
进一步，所述修饰后的siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT，序列如SEQ ID NO.3所示，所述修饰后的siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG，序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述siRNA的正义链和反义链进行分开合成、氨解、纯化、质检，然后以等摩尔量进行退火变成双链。
进一步，药物还包括医用凡士林；
进一步，所述药物各成分的用量为：可抑制24p3R表达的siRNA序列2-10nM/(单位面积cm2)，凡士林2mg/(单位面积cm2)。
进一步，为了便于24p3R siRNA粉末与凡士林混合，可以用无菌DEPC水与24p3RsiRNA混合分散后再与凡士林混合。无菌DEPC水用量根据配制的siRNA浓度的不同进行计算。
本发明还公开了可抑制24p3R基因表达的siRNA序列或对所述siRNA进行化学修饰后的RNA分子用于治疗银屑病。
进一步，所述siRNA序列的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUTT；所述siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCAG或对所述siRNA进行化学修饰后的RNA分子。
进一步，修饰后的siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT，所述修饰后的siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG。
本发明的有益效果：
本发明的药物通过可抑制24p3R基因表达的siRNA序列抑制24p3受体(24p3R)表达，降低皮损细胞因子以及炎症小体的表达水平，进而减轻银屑病，同时还能够减轻中性粒细胞等多种免疫细胞的浸润程度，下调减轻银屑病表型和表样，如发红、脱屑等，对治疗银屑病有积极作用。本发明的药物可以通过涂抹或注射的方式进行使用，治疗方法简单，疗效好，对人体治疗银屑病提供了新的思路。
附图说明
图1是小鼠用药5天后耳部皮肤24p3R在mRNA水平表达量统计图；
图2是小鼠用药5天后耳部表型图；
图3是小鼠耳部皮肤组织厚度变化统计图；
图4是小鼠耳部组织HE染色图；
图5是小鼠耳部皮肤细胞因子IL-1β、IL-23，趋化因子CXCL1、CXCL10在mRNA水平表达量统计图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明进行详细说明：
本发明设计了一种可抑制24p3R基因表达的siRNA序列，其siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUTT，siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCAG。该siRNA全链RNA碱基的核糖2位做2-OMe修饰，该siRNA的3’端带有胆固醇修饰，siRNA正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT，siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG。
上述任一一条可抑制24p3R基因表达的siRNA序列可用于抑制或治疗银屑病，并且可制成相关药物。
实施例1：鼠源24p3R siRNA的设计
通过美国国立生物技术信息中心的NCBI数据库，获得相关的鼠源24p3RmRNA的序列全长(NM_001360406.1)，通过固相亚磷酰胺法合成siRNA同时设计末端悬挂胆固醇，并合成一条阴性对照siRNA(siNC)，如表1所示。
表1
| 名称 | 正义链序列(5’-3’) | 反义链序列(3’-5’) |
| siRNA | GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT | AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG |
| siNC | UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT | ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT |
其中设计的siRNA和siNC由湖州河马生物科技有限公司合成。其合成步骤如下：
(1)为了提高siRNA的稳定性，因此对全链RNA碱基的核糖2位做2-OMe修饰(2'甲氧基修饰)，3’端两个DNA保护碱基不需要2-OMe修饰；
(2)同时为了促进siRNA在体内进入细胞，还对siRNA末端进行胆固醇修饰，胆固醇修饰在siRNA正义链的3’端。
具体的合成方法采用固相亚磷酰胺法：固相载体为控孔玻璃珠(CPG)，合成方向为3’-5’依次合成；正义链和反义链分开合成、氨解、纯化、质检，然后以等摩尔量进行退火变成双链。固相亚磷酰胺法从寡核苷酸3’往5’端方向合成，每轮循环增加一个碱基，分别合成正反义链，正义链采用已经耦连胆固醇的CPG作为固相载体，合成之后在其3’端就直接带有胆固醇修饰，即合成得到具有抑制24p3R基因表达的siRNA。
实施例2：药物的制备1
分别称取实施例1制备的可抑制24p3R基因表达的siRNA序列2nM(0.8OD)/(单位面积cm2)，无菌DEPC水1μl每nM siRNA粉末和医用级凡士林2mg/(单位面积cm2)；
将无菌DEPC水与24p3R siRNA混合均匀后，再与凡士林混合，分散均匀得到乳膏。
实施例3：药物的制备2
分别称取实施例1制备的可抑制24p3R基因表达的siRNA序列5nM(2.0OD)/(单位面积cm2)，无菌DEPC水0.4μl每nM siRNA粉末和医用凡士林2mg/(单位面积cm2)；
将无菌DEPC水与24p3R siRNA混合均匀后，再与凡士林混合，分散均匀得到乳膏。
实施例4：药物的制备3
分别称取实施例1制备的可抑制24p3R基因表达的siRNA序列10nM(4.0OD)/(单位面积cm2)，无菌DEPC水0.2μl每nM siRNA粉末和医用凡士林2mg/(单位面积cm2)；
将无菌DEPC水与24p3R siRNA混合均匀后，再与凡士林混合分散均匀得到乳膏。
实施例5：药物的制备4
分别称取实施例1制备的可抑制24p3R基因表达的siRNA序列2nM(0.8OD)/(单位面积cm2)和凡士林2mg/(单位面积cm2)；
将24p3R siRNA与凡士林混合加入超声分散仪中，超声分散均匀得到乳膏。
实验1：小鼠药物实验
1、采用雌性8-12周龄SPF级C57BL/6小鼠进行实验。均分成4组，每组3只，每日晨10时使用5％咪喹莫特(IMQ)或凡士林外涂小鼠耳部皮肤，连续使用5天，从第1日起，每隔一日于下午3时使用阴性药物或所述药物(24p3R的siRNA)涂抹小鼠耳部皮肤。其中：
组1用药为凡士林(每日晨10时)与带有阴性药物(si-NC)的凡士林(下午3时，浓度为：2nM(0.8OD)siRNA/cm2耳部皮肤/天)混合用药；
组2用药为凡士林(每日晨10时)与带有siRNA的凡士林(下午3时，2nM(0.8OD)siRNA/cm2耳部皮肤/天)混合用药；
组3用药为涂抹IMQ(5％，每日晨10时2mg/d/单侧耳朵)和带有阴性药物(si-NC)的凡士林(2nM(0.8OD)siRNA/cm2耳部皮肤/天)；
组4用药为为涂抹IMQ(5％，每日晨10时2mg/d/单侧耳朵)和带有siRNA的凡士林(2nM(0.8OD)siRNA/cm2耳部皮肤/天)；
得到的结果如图1-图3所示：与组3相比，组4采用siRNA作为有效物质表达下调减轻IMQ诱导银屑病样小鼠表型、小鼠耳部银屑病样表现(发红、脱屑)等；从耳部厚度来看，采用IMQ诱导后银屑病病样小鼠采用阴性药物后耳部厚度达到0.3mm以上，采用siRNA药物后，耳部厚度显著降低，约为0.1mm。
对上述小鼠耳部组织进行染色，评估炎症细胞的浸润情况，得到的数据如图4所示，IMQ组小鼠的表皮厚度明显增加，真皮浅层可见较多的炎症细胞浸润，采用阴性药物后耳部表皮厚度及炎症细胞浸润未见明显改善，采用siRNA药物后，耳部表皮厚度及真皮浅层炎症细胞浸润较IMQ组明显减少。
同时检测相对mRNA表达量，得到的数据如图5所示，IMQ组小鼠皮肤中炎症因子IL-1β、IL-23，趋化因子CXCL1、CXCL10的mRNA表达水平明显升高，采用阴性药物后耳部炎症因子及趋化因子的mRNA表达水平未见减低，采用siRNA药物后，耳部炎症因子及趋化因子的mRNA表达水平较IMQ组明显减少。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
序列表
<110> 中国人民解放军空军军医大学
<120> 一种用于治疗银屑病的药物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgauuucu acagcgaaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auucgcugua gaaaucgcca g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgauuucu acagcgaaud tdt 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
auucgcugua gaaaucgccd adg 23
Claims (10)
1.一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括可抑制24p3R基因表达的siRNA序列。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，所述siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUTT，所述siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCAG。
3.根据权利要求2所述的一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，对所述可抑制24p3R基因表达的siRNA序列进行化学修饰。
4.根据权利要求3所述的一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，所述siRNA全链RNA碱基的核糖2位做2-OMe修饰，对siRNA3’端进行胆固醇修饰。
5.根据权利要求4所述的一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，所述修饰后的siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT，所述修饰后的siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，所述药物还包括医用凡士林。
7.根据权利要求6所述的一种用于治疗银屑病的药物，其特征在于，所述药物各成分的每单位面积用量为：可抑制24p3R表达的siRNA序列2-10nM/cm2，凡士林2mg/cm2。
8.一种用于治疗银屑病的药物的应用，其特征在于，可抑制24p3R基因表达的siRNA序列或对所述siRNA进行化学修饰后的RNA分子用于治疗银屑病。
9.根据权利要求8所述的用于治疗银屑病的药物的应用，其特征在于，所述siRNA序列的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT，所述siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG。
10.根据权利要求8所述的用于治疗银屑病的药物的应用，其特征在于，所述修饰后的siRNA的正义链5’-3’是GGCGAUUUCUACAGCGAAUdTdT，所述修饰后的siRNA的反义链3’-5’是AUUCGCUGUAGAAAUCGCCdAdG。
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