CN107299099A - 可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学领域,涉及一种可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及应用,可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的基因名称是Krt17‑219、Krt17‑452或Krt17‑1472。本发明提供了一种能够可有效抑制角蛋白17表达、可为今后研发银屑病靶向治疗药物奠定基础的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及应用。
Description
技术领域
本发明属于医学领域,涉及一种SiRNA序列及应用,尤其涉及一种可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及外用治疗银屑病的应用。
背景技术
银屑病作为一种常见的慢性炎症性疾病,病情顽固病情容易反复发作的特点给患者及亲属造成了沉重的生活负担和精神困扰,而其以红斑、鳞屑为主要表现的外观也严重影响患者的生活质量和身心健康。但是,银屑病的具体发病机制目前尚不十分明确。研究表明,遗传因素、环境因素以及自身免疫因素共同导致了银屑病的发生和发展。以往研究认为,T细胞作为机体的主要免疫细胞,在银屑病的发病过程中起着主要的作用。近些年,随着研究的深入,广大学者对除T细胞之外的角质形成细胞、树突状细胞及中性粒细胞等多种细胞在银屑病中发挥的作用,也逐渐有了新的认识。然而这些细胞具体在疾病的不同阶段中以何种方式发挥何种作用,仍不是十分明确。
角蛋白17(K17)作为一种细胞骨架蛋白,是角蛋白家族中的一员,属于I型角蛋白,由432个氨基酸组成,分为头、体、尾三个结构域,主要的功能区在体区。K17具有高度保守性,其在不同种属间,如鼠和牛,体和尾两个结构域均可保持90%以上的保守性。在正常情况下,K17主要分布于毛囊、指甲、皮脂腺及汗腺等部位,在维持细胞的形态稳定发挥了重要作用。在临床上,K17基因的突变可以引起多发性脂囊瘤及2型先天性甲肥厚。这提示K17能够参与皮肤附属器的分化发育。当皮肤损伤后,K17的表达亦会有所升高。研究发现,干涉K17的原代角质形成细胞,其体积变小,蛋白合成效率降低。而在K17敲除的小鼠实验中发现,胚胎外胚层创口的愈合时间有所延长。另有研究发现,K17能够参与细胞内的激酶信号转导通路,发挥调节细胞凋亡、增殖和蛋白合成等功能。
早在上世纪90年代即有学者发现K17在银屑病患者头皮中高表达。而后亦有研究发现K17表达水平与疾病的严重程度呈正相关。由于在正常的表皮角质形成细胞中不表达,K17的这种表达模式提示与银屑病的发生发展密切相关。伴随着银屑病角质形成细胞的增殖活跃和分化障碍,角蛋白谱也随之发生了变化。在正常角质形成细胞分化过程中表达的K1和K10,在银屑病皮损中的表达下调,取而代之的则是代表着角质形成细胞高增殖状态的角蛋白,包括K6、K16和K17(见图1)。那么,K17如此异常高表达的机制是什么呢?Komine等对K17的表达调控机制进行了深入研究发现,凡是能介导STAT1磷酸化激活的细胞因子,如IL-6,均可上调K17的表达。而IL-3、IL-4、IL-10、IFN-α及IFN-β等不能激活STAT1的细胞因子,均不能上调K17的表达,这一结果提示STAT1是K17表达上调的关键转录因子。
中国人民解放军第四军医大学于2011年在细胞及动物模型中发现银屑病相关细胞因子IL-17A能够通过STAT1和STAT3上调角质形成细胞中K17的表达,同时也发现,IL-22能够通过STAT3和ERK1/2通路来上调角质形成细胞中K17的表达。可见,银屑病角质形成细胞中K17的表达受到多种细胞因子的调控,包括IL-17、IL-22和IFN-γ等,而这些细胞因子都是由银屑病发病过程中的辅助T细胞分泌的。另外,有研究发现,由于K17含有与链球菌M蛋白相类似的氨基酸序列“ALEEANxxL”,且含有这一序列的K17肽段能够刺激来自于银屑病患者的T细胞分泌IFN-γ,因此提示K17可能是银屑病自身反应性T细胞的靶抗原。不久后,K17与链球菌M蛋白相类似的另一抗原表位“GLRRxLD”也被发现。随后,中国人民解放军第四军医大学通过利用体外K17肽段及抗原提呈细胞同银屑病患者来源的T细胞共孵育,证实了含有“ALEEANxxL”表位的K17肽段确实能够激活自身反应性T细胞,同时还发现了3个新的能够刺激T细胞活化的K17抗原表位90。由此可见,K17可能作为一个重要的自身抗原,参与银屑病的免疫反应过程。
在此基础上,首次提出了银屑病发病过程中的一个由K17参与的环路:银屑病局部T细胞活化后,释放IL-17、IL-22和IFN-γ等细胞因子,这些细胞因子作用于角质形成细胞,使K17表达升高,此时高表达的K17被角质形成细胞或专职的抗原提呈细胞提呈给初始T细胞,使其活化,产生更多的细胞因子,促进银屑病的进一步恶化,以此形成循环。并且研究发现,通过反义核酸或siRNA等技术抑制K17的表达,在体外实验和动物实验中分别观察到角质形成细胞增生活性下降、表皮厚度变薄、炎症反应减轻、银屑病皮损改善等现象,首次明确了K17分子可以作为新的靶标用于银屑病的治疗。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题,本发明提供了一种能够可有效抑制角蛋白17表达、可为今后研发银屑病靶向治疗药物奠定基础的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列,其特征在于:所述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的基因名称是Krt17-219、Krt17-452或Krt17-1472;
所述Krt17-219的正义链5’-3’是GGGAGCAACAGUUAUUCCATT,所述Krt17-219的反义链3’-5’是UGGAAUAACUGUUGCUCCCTT;
所述Krt17-452的正义链5’-3’是CUACAGCGCUUAUUACCAUTT,所述Krt17-452的反义链3’-5’是AUGGUAAUAAGCGCUGUAGTT;
所述Krt17-1472的正义链5’-3’是GAGACCAUUAAAGCUUGCUTT,所述Krt17-1472的反义链3’-5’是AGCAAGCUUUAAUGGUCUCTT。
可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列在制备治疗银屑病药物的应用。
可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列在制备减轻银屑病病症药物的应用。
一种基于可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列制备而成的治疗银屑病的药物。
一种用于治疗银屑病的药物,其特征在于:所述用于治疗银屑病的药物是由可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列、1×磷酸缓冲盐溶液PBS以及医用凡士林混合而成;所述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是5-20μl;所述1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是20-50μl;所述凡士林的用量是80-300μl。
上述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是8-12μl;所述1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是25-40μl;所述凡士林的用量是90-150μl。
上述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是10μl;所述1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是30μl;所述凡士林的用量是100μl。
本发明的优点是:
本发明提供了一种可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及应用,该可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的基因名称是Krt17-219、Krt17-452或Krt17-1472;该可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列能够抑制角蛋白17表达、能减轻IMQ诱导银屑病、能降低皮损细胞因子的表达水平、能够减轻IMQ诱导的银屑病样小鼠模型中中性粒细胞的浸润程度。本发明在前期工作的基础上,进一步探讨在咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型中,K17与细胞因子和趋化因子以及中性粒细胞的关系,为今后研发银屑病靶向治疗药物奠定基础。
附图说明
图1是正常表皮与银屑病表皮角蛋白表达对比图;
图2是K17在SiRNA干涉IMQ诱导银屑病样小鼠模型中的表达;
图3A是Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠的外观;
图3B是Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠在低倍(10×)和高倍(40×)镜下的H&E染色切片;
图3C是Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠表皮厚度统计图;
图4A是Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠细胞因子的表达情况;
图4B是Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠趋化因子的表达情况;
图5A是流式细胞术检测Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠表皮中的中性粒细胞数量的分布;
图5B是流式细胞术检测Ctrl-V组、IMQ-V组以及IMQ-SiRNA组小鼠表皮中的中性粒细胞数量的统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列,可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的基因名称是Krt17-219、Krt17-452或Krt17-1472;
Krt17-219的正义链5’-3’是GGGAGCAACAGUUAUUCCATT,Krt17-219的反义链3’-5’是UGGAAUAACUGUUGCUCCCTT;
Krt17-452的正义链5’-3’是CUACAGCGCUUAUUACCAUTT,Krt17-452的反义链3’-5’是AUGGUAAUAAGCGCUGUAGTT;
Krt17-1472的正义链5’-3’是GAGACCAUUAAAGCUUGCUTT,Krt17-1472的反义链3’-5’是AGCAAGCUUUAAUGGUCUCTT。
本发明所提供的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列在制备治疗银屑病药物或减轻银屑病病症药物的应用。
基于本发明所提供的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列,还可以制备成的治疗银屑病或减轻银屑病的药物。
同时,本发明采用上述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列,提供了一种用于治疗银屑病的药物,该用于治疗银屑病的药物是由可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列、1×磷酸缓冲盐溶液PBS以及医用凡士林混合而成;可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是5-20μl;1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是20-50μl;凡士林的用量是80-300μl,作为优选,本发明采用的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是8-12μl;1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是25-40μl;凡士林的用量是90-150μl。
实施例1:
K17siRNA配置
配制K17-SiRNA乳膏:本发明所提供的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列中每种SiRNA序列各10μl,1x PBS 30μl,凡士林:100μl,充分混匀,制备成乳膏状。
实施例2:
本发明所提供的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列是:
表1K17-SiRNA序列
实施例3:
根据3种不同的SiRNA序列,分别制备软膏,在IMQ外用涂抹构建的银屑病样小鼠模型中进行如下试验,并得到试验结果:
1、K17siRNA干涉效果验证及验证
将配制好的K17-SiRNA乳膏涂抹于剃毛后的野生型C57BL/6小鼠背部,连续涂抹2天后,再继续涂抹K17-SiRNA乳膏的同时加用IMQ(咪喹莫特),检测对IMQ诱导银屑病样小鼠模型进行SiRNA干涉后其K17表达情况。脱颈处死小鼠后,取小鼠背部皮肤组织行Real-timePCR,检测K17表达。结果显示,IMQ-SiRNA组的K17表达量明显低于IMQ-V组(p<0.001)(图2),Ctrl-V组是只涂抹凡士林;IMQ-V组是交替涂抹凡士林和IMQ;IMQ-SiRNA组是交替涂抹K17-SiRNA和IMQ。
2、K17表达下调减轻IMQ诱导银屑病样小鼠表型
在IMQ-V组交替涂抹凡士林和IMQ(咪喹莫特)、IMQ-SiRNA组交替涂抹K17-SiRNA和IMQ(方法见2.1.3)后,可以观察到IMQ-SiRNA组和IMQ-V组在外观上差异不明显(图3A)。但是在H&E染色切片上可以看出,IMQ-SiRNA组的表皮较IMQ-V组薄,更接近Ctrl-V组(图3B),同时可以观察到,在IMQ-V组中,真皮浅层有较多的炎细胞浸润,表皮内也可见少量炎细胞,而在另外两组中此现象并不明显。测量表皮厚度,进行统计学分析发现(图3C),虽然IMQ-V组和IMQ-SiRNA组的表皮相较于Ctrl-V组均有增厚(p<0.001),但后者增厚的程度较前者轻,且具有统计学意义(p<0.01)。
3、角蛋白17下调对皮损细胞因子的影响
通过H&E染色切片观察到IMQ-SiRNA组表皮增厚较IMQ-V组有所减弱,那么K17表达降低造成的表皮增厚减弱、角质形成细胞增殖降低,是否会影响表皮内的细胞因子和趋化因子的表达?因此通过Real-time PCR来观察三组小鼠中细胞因子和趋化因子变化的情况。结果显示,IMQ-V组的IL-6、IL-8及IL-22的表达量明显高于Ctrl-V组(p<0.01,p<0.001,p<0.01),而在IMQ-SiRNA组中,三种细胞因子的表达量较IMQ-V组有明显降低(p<0.001,p<0.001,p<0.01)(图4A)。在CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCR-10、CCL-20、CCL-22等趋化因子的表达中,IMQ-V组的表达量均显著高于Ctrl-V组,但各趋化因子在IMQ-SiRNA组中的表达却较IMQ-V组有明显的降低(图4B)。说明K17的缺失可能造成细胞因子及趋化因子表达量的减少。
4、角蛋白17下调对皮损炎细胞浸润的影响
通过对H&E切片染色的观察,发现IMQ-V组中的真皮浅层有较多的炎细胞浸润,表皮内也可见少量炎细胞,而在另外两组中此现象并不明显。结合实时定量PCR的实验结果,推测在IMQ诱导的银屑病样小鼠模型中K17可能还发挥着对炎症细胞的趋化作用。因此,用流式细胞术检测此模型中炎细胞浸润情况。结果表明:IMQ-V组的中性粒细胞百分比明显高于Ctrl-V组(p<0.001),而K17表达降低的IMQ-SiRNA组,中性粒细胞数量则远低于IMQ-V组(p<0.001)(见图5A以及图5B)。证明K17表达量的降低,可以减轻IMQ诱导的银屑病样小鼠模型中中性粒细胞的浸润程度。
Claims (7)
1.一种可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列,其特征在于:所述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的基因名称是Krt17-219、Krt17-452或Krt17-1472;
所述Krt17-219的正义链5’-3’是GGGAGCAACAGUUAUUCCATT,所述Krt17-219的反义链3’-5’是UGGAAUAACUGUUGCUCCCTT;
所述Krt17-452的正义链5’-3’是CUACAGCGCUUAUUACCAUTT,所述Krt17-452的反义链3’-5’是AUGGUAAUAAGCGCUGUAGTT;
所述Krt17-1472的正义链5’-3’是GAGACCAUUAAAGCUUGCUTT,所述Krt17-1472的反义链3’-5’是AGCAAGCUUUAAUGGUCUCTT。
2.根据权利要求1所述的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列在制备治疗银屑病药物的应用。
3.根据权利要求1所述的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列在制备减轻银屑病病症药物的应用。
4.一种基于权利要求1所述的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列制备而成的治疗银屑病的药物。
5.一种用于治疗银屑病的药物,其特征在于:所述用于治疗银屑病的药物是由权利要求1所述的可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列、1×磷酸缓冲盐溶液PBS以及医用凡士林混合而成;所述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是5-20μl;所述1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是20-50μl;所述凡士林的用量是80-300μl。
6.根据权利要求5所述的用于治疗银屑病的药物,其特征在于:所述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是8-12μl;所述1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是25-40μl;所述凡士林的用量是90-150μl。
7.根据权利要求6所述的用于治疗银屑病的药物,其特征在于:所述可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列的用量是10μl;所述1×磷酸缓冲盐溶液PBS的用量是30μl;所述凡士林的用量是100μl。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171027 |
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