BRPI0505035B1 - processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína g contendo a expressão de ric-8b e uso da proteína ric-8b - Google Patents

Abstract

processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína g. a presente invenção refere-se a um processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteínas g, em especial, para receptores protéicos presentes nos neurônios olfatórios do nariz, através da utilização de proteínas gef (fatores trocadores de nucleotídeos de guanina), preferentemente a proteína ric-8b, para permitir a seleção dos receptores olfatórios de acordo com as suas características intrísecas, quais sejam, receptores sensíveis a cheiros agradáveis, desagradáveis, doces azedos, suor, etc. mais especificamente, o processo compreende as etapas de: a) cultivo de células hek293 (linhagem imortalizada de células de rim de embrião humano) em placas de 96 poços, na densidade de 0,5 x 10^ 5^ células/poço; b) transfecção das células cerca de 24 h após o plaqueamento, com 10-30 ng de cada plasmídeo, de expressão contendo cdnas correspondentes às regiões codificadoras de g<244>olf, ric-8b e o receptor olfatório a ser testado, da seguinte maneira: - mistura do dna com 50 <109>l de dmem; - adição de <109>l de plus reagent, misturar, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente;- adição de 2 <109>l de lipofectamina, que foi diluída em 50 <109>l de dmem, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente; - aspiração do meio dos poços; - adição de 400 <109>l de dmem à mistura gentilmente, adicionar aos poços; - incubação por 3 horas a 37°c, 5% co~ 2~; - adição de 3 ml de dmem + 10% fbs; e - incubação de 24 a 48 h: c) adição a cada poço do ligante que será testado na concentração desejada, sendo as soluções estoque preparadas em dmso e as diluições finais peparadas em dmem sem soro, seguida de incubação por 10 minutos e adição de 200 <109>l de tampão de lise; d) medição das concentrações de camp em cada poço.

Description

“Processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína G contendo a expressão de RIC-8B e uso da proteína RIC-8B” A presente invenção refere-se a um processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína G, em especial, para receptores protéicos presentes nos neurônios olfatórios do nariz, através da utilização de proteínas GEF (fatores trocadores de nucleotídeos de guanina), preferentemente a proteína RIC-8B, para permitir a seleção dos receptores olfatórios de acordo com as suas características intrínsecas, quais sejam, receptores sensíveis a cheiros agradáveis, desagradáveis, doces, azedos, suor, etc. O homem é capaz de discriminar aproximadamente 10000 odorantes distintos. Esta discriminação é realizada graças à presença de receptores protéicos (receptores olfatórios) presentes nos neurônios olfatórios do nariz. Os receptores olfatórios pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Foram identificados aproximadamente 350 receptores olfatórios em humanos, que são codificados por 350 genes distintos. A ativação destes receptores por diversos odorantes resulta tanto na geração de uma percepção consciente do odor, como em respostas comportamentais inatas, como medo, ânsia de vômito, atração sexual ou bem estar. A determinação dos ligantes que ativam cada um destes receptores contribuirá tanto para a compreensão de como a percepção dos odores é gerada no nosso cérebro, como para compreendermos como comportamentos inatos são gerados.

Recentemente se desenvolveu um grande interesse pela aplicabilidade prática de aspectos relacionados às sensações químicas como paladar e olfato. Como estes sentidos são importantes para a saúde, nutrição e qualidade de vida em geral, aplicações nesta área podem apresentar um grande impacto no mercado de consumo de produtos comestíveis e de cosméticos. Além disto, outra possível aplicação é o controle de pestes, já que muitos dos comportamentos apresentados por insetos e pequenos mamíferos (que também apresentam receptores olfatórios) são determinados por odorantes presentes no meio ambiente. Foi identificado, por exemplo, um receptor olfatório no mosquito vetor para a malária, o Anopheles gambiae, que parece ser responsável pela detecção de suor humano (Hallem et al, 2004. Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant. Nature 427: 213-213). Este receptor representa um meio potencial de se controlar este inseto.

A percepção de odorantes está debilitada em pacientes que apresentam doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson. O desenvolvimento de testes que avaliam a capacidade olfativa será útil no diagnóstico de doenças assim como no acompanhamento de sua progressão. Os testes que existem atualmente são bastante rudimentares, e poderiam ser aprimorados com base nos novos conhecimentos sobre receptores olfatórios.

Para se determinar o código olfatório é necessário que se faça a correlação de cada um dos receptores olfatórios com os odorantes que os ativam. Para que isto seja possível é necessário que exista um sistema experimental onde se possa expressar estes receptores em larga escala (já que o número de receptores e de odorantes é grande) no laboratório e testá-los quanto à sua habilidade de serem ativados por diferentes ligantes. Para que um sistema deste tipo funcione é necessário expressar os receptores em células heterólogas (como células de mamíferos), e em seguida testar se estas células tomam-se capazes de detectar odorantes. No entanto, receptores olfatórios não são expressos de maneira eficiente em células heterólogas, porque ficam retidas no retículo endoplasmático das células e não são endereçadas corretamente para a membrana plasmática. Devido a este problema, desde 1991, quando os receptores foram clonados pela primeira vez, até 1999, nenhum receptor havia sido correlacionado ao seu ligante. A superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) é composta de várias famílias cujos membros estão envolvidos na detecção de uma grande variedade de ligantes tais como hormônios, neurotransmissores, luz, odorantes e íons. Estes receptores estão, portanto, envolvidos em uma série de processos fisiológicos. Todos os membros desta superfamília apresentam em comum as seguintes características: - Uma estrutura protéica que atravessa a membrana plasmática sete vezes, com a sua extremidade amino-terminal localizada no espaço extracelular, e a extremidade carboxi-terminal localizada no espaço intracelular, como indicado na Figura 1, que é uma representação esquemática de um GPCR. - Enquanto os sete domínios transmembrana apresentam tamanhos conservados entre os diferentes membros da superfamília, os tamanhos das extremidades amino e carboxi-terminal destes receptores podem variar bastante, dependendo da família à qual o receptor pertence. -Estes receptores acoplam-se à proteína G heterotrimérica, localizada na face interna da membrana plasmática, e responsável pela transdução do sinal do receptor. As proteínas G são constituídas por três subunidades (α, β e γ) e podem ser divididas em diferentes tipos (Gs, Gi, Gq ou Gt), dependendo do tipo de subunidade α que contém e de quais efetuadores intracelulares elas regulam. Em geral, a ativação das proteínas Gs resulta na estimulação da adenilil ciclase; a ativação da proteína Gi resulta na inibição da adenilil ciclase; a ativação da proteína Gq na estimulação da fosfolipase C e a ativação da proteína Gt na estimulação da cGMP fosfodiesterase.

Em 1999, um grupo desenvolveu um método que permitiu a expressão de pelo menos alguns dos receptores olfatórios (Krautwurst e colegas, 1998. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell 95: 917-926). O método consiste em adicionar à região amino-terminal dos receptores uma seqüência de 20 aminoácidos proveniente da região amino-terminal da rhodopsina (que também é um GPCR). A adição desta seqüência aos receptores olfatórios permite a sua expressão funcional em células heterólogas, provavelmente por que auxilia no endereçamento dos receptores para a membrana plasmática destas células. No entanto, o método não funciona para todos os receptores, e os resultados funcionais obtidos não são muito robustos. Recentemente outro método foi desenvolvido, que se baseia na utilização das proteínas “receptor transporter protein” (RTP) (Saito e colegas, 2004. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell 119: 679-691). Estas proteínas estão normalmente presentes nos neurônios olfatórios, e quando introduzidas juntamente com os receptores olfatórios em células heterólogas atuam como proteínas acessórias que auxiliam no endereçamento dos receptores para a membrana plasmática. Foi demonstrado que em sistemas heterólogos que utilizam as proteínas RTPmais a adição da seqüência de 20 aminoácidos da rhodopsina, mais a adição da proteína Gaolf ; específica de neurônios olfatórios), é possível expressar vários receptores olfatórios de maneira funcional. No entanto, este sistema também não é muito robusto, e também experimentos não publicados indicaram que não funciona para todos os receptores olfatórios.

Duas companhias de biotecnologia nos Estados Unidos estão atualmente procurando identificar ligantes para os receptores de paladar, que também pertencem à superfamília de GPCRs (matéria na revista Nature 2005 435: 559, intitulada “More flavour up front”). Estas companhias pretendem também desenvolver produtos relacionados aos receptores olfatórios, o que demonstra o potencial interesse destas pelo assunto que envolve este pedido de patente.

Atentando para as limitações atualmente existentes e no intuito de preencher uma lacuna existente no mercado, foi desenvolvida a presente invenção, cujo objetivo principal é utilizar a proteína RIC-8B em sistemas heterólogos de expressão de receptores olfatórios ou de outros GPCRs que se acoplem à proteínas tipo Gs (a proteína Golf é tipo Gs). A RIC-8B (SEQ. ID No. 1) poderá ser adicionada juntamente com outras proteínas (RTPs, por exemplo), ou sozinha, dependendo do receptor a ser analisado.

Mais especificamente, a presente invenção consiste na construção de um sistema heterólogo para expressão de receptores olfatórios (e possivelmente de outros tipos de GPCRs que se acoplem a proteínas G semelhantes a Gaolf ) para a identificação em larga escala de ligantes para estes receptores. As etapas do processo da presente invenção compreendem: a) Cultivo de células HEK293 (linhagem imortalizada de células de rim de embrião humano) em placas de 96 poços (na densidade de 0,5 X105 células/poço). b) Transfecção das células, 24 h após o plaqueamento, com 10-30 ng de cada plasmídeo, plasmídeos de expressão contendo cDNAs correspondentes às regiões codificadoras de Gaolf (SEQ. ID No. 2) ou RIC-8B (SEQ. ID No. 1) ou o receptor olfatório,da seguinte maneira: - mistura do DNA com 50 μΙ de meio “Dulbecco's Modified Eagle Médium” (DMEM); - adição de 5 μΙ de PLUS™REAGENT, misturar, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente; - adição de 2 μΙ de Lipofectamine®, que foi diluída em 50 μΙ de DMEM, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente; - aspiração do meio dos poços; - adição de 400 μΙ de DMEM à mistura, misturar gentilmente, adicionar aos poços; - incubação por 3 horas a 37°C, 5% C02; - adição de 3 ml de DMEM + 10% soro fetal bovino (FBS) - incubação de 24 a 48 h c) Adição a cada poço do ligante que será testado na concentração desejada. As soluções estoque são preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) e as diluições finais preparadas em DMEM (sem soro). Incubar por 10 minutos e adicionar 200 μΙ de tampão de lise. d) Medição das concentrações de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) em cada poço de duas maneiras: d.1) utilizando-se um sistema imunoenzimático para a detecção direta de cAMP; d.2) utilizando-se de um plasmídeo repórter que é co-transfectado nas células, juntamente com os outros plasmídeos, durante o item b descrito acima. O plasmídeo repórter poderá ser, por exemplo, o pCRE-SEAP. Este repórter será ativado por cAMP resultando na expressão de fosfatase alcalina que será secretada para o meio de cultura presente no poço. 100 μΙ deste meio de cultura será transferido para uma nova placa de 96 poços, e 100 μΙ da solução contendo o substrato para a fosfatase alcalina (20 mM para-nitrofenil fosfato, 1mM MgCI2, em 1 M dietanolamina, pH 9,8) serão adicionados a estes poços. A absorbância a 410 nm resultante é então medida utilizando-se um leitor de placas. Desta maneira é possível quantificar a concentração de cAMP. A proteína RIC-8B atua como uma GEF (fator trocador de GTP) sobre a Gaolf. A RIC-8B é capaz de amplificar a transdução de sinal através de receptores de dopamina (que também são GPCRs), que se acoplam a Gaolf (Von Dannecker e colegas, 2005. Ric-8B, an otfactory putative GTP Exchange factor, amplifies signal transduction through the olfactory specific G- protein Gaolf.(Joumal of Neuroscience 25: 3793-3800). Experimentos recentes indicam que RIC-8B também é capaz de amplificar o sinal de receptores olfatórios na presença de Gaolf, como mostrado nas Figuras 2 e 3. Estes resultados indicam que RIC-8B pode ser utilizada no melhoramento de sistemas heterólogos para receptores olfatórios. O OR-EG é o receptor olfatório mais bem caracterizado até hoje. Já foi demonstrado que este receptor reconhece o ligante eugenol. Vários trabalhos foram realizados onde este receptor foi expresso, em fusão com a seqüência da rodopsina, e na presença de Gaolf. Este receptor, portanto, diferentemente da grande maioria dos receptores olfatórios, pode ser funcionalmente expresso nestas condições (não necessita da adição das proteínas RTPs).

Na Figura 2 é demonstrado que não foi observada atividade do receptor OR-EG (SEQ. ID No. 4) que não tem a seqüência de rodopsina na presença da proteína RTP (SEQ. ID No. 3). Por outro lado, a proteína RIC-8B (SEQ. ID No. 1) é capaz de amplificar o sinal obtido em OR-EG sem a adição da seqüência da rodopsina. A vantagem disto é que é preferível que se tenha um sistema onde a seqüência de aminoácidos original do receptor a ser estudado é mantida, pois alterações, como a adição de uma seqüência de outro receptor (da rodopsina) na sua extremidade amino-terminal poderia interferir nas características ou especificidade do receptor.

Figura 2 - Respostas obtidas do receptor EG-OR (SEQ. ID No. 4). Células HEK293T foram transfectadas com os cDNAs indicados e ativadas com 300 μΜ do odorante eugenol (■) ou sem adição de odor (□). Os níveis de AMPc produzidos foram medidos para cada caso.

Na Figura 3 estão apresentados os resultados obtidos com o receptor S6 (SEQ. ID No. 5), que reconhece o ligante ácido azelaico (ou ácido nonadeóico). A especificidade deste receptor havia sido determinada através de um método “in vivo” (Malnic e colegas, 1999. Combinatorial receptor codes for odors. Cell 96: 713-723), e até há pouco tempo nunca havia sido expresso em sistemas heterólogos. Recentemente dois trabalhos mostraram que é possível realizar a expressão funcional deste receptor, na presença da seqüência da rodopsina. Em um destes trabalhos, demonstrou-se que é necessária a adição das proteínas RTP, para se obter respostas (Saito e colegas, 2004. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell 119: 679-691).

No sistema da presente invenção, também não foi possível obter resposta funcional do receptor S6 (SEQ. ID No. 5) sem a seqüência de rodopsina. Mas para o receptor com esta seqüência adicionada à sua extremidade amino-terminal, foi obtida uma resposta apenas quando se adicionou RIC-8B (SEQ. ID No. 1) juntamente com as proteínas RTP (SEQ. ID No. 3) (Figura 3). A resposta obtida com a adição de apenas RIC-8B, ou apenas as proteínas RTP, não produziu uma resposta satisfatória. Este experimento indica, portanto, que para obter-se expressão funcional de alguns dos receptores olfatórios é necessário que ambas as proteínas, RIC-8B e RTPs estejam presentes.

Figura 3 - Respostas obtidas do receptor RhoS6-OR (receptor S6 com a seqüência de rhodopsina adicionada à sua extremidade amino-terminal), SEQ. ID No. 5. Células HEK293T foram transfectadas com os cDNAs indicados e ativadas com 300 μΜ do odorante ácido azelaico (■) ou sem adição de odor (□). Os níveis de AMPc produzidos foram medidos para cada caso.

Dentre as muitas vantagens da presente invenção destacam-se: 1- a adição de RIC-8B a diversos sistemas heterólogos resulta na amplificação do sinal obtido, permitindo que receptores que normalmente apresentam sinais fracos, sejam analisados. Desta maneira o número total de receptores que tem seus ligantes determinados é significativamente ampliado. 2- para alguns ORs, será possível verificar a função na ausência da seqüência de rodopsina. Como descrito acima, é possível que a alteração da região amino-terminal do receptor a ser estudado possa alterar sua especificidade, ou até mesmo abolir sua capacidade de identificar o seu ligante. As respostas obtidas de receptores inalterados (sem a seqüência da rodopsina) apresentam a vantagem de ser mais fisiológicas, ou mais representativas das respostas obtidas destes receptores “in vivo”. 3- nos trabalhos descritos acima, onde diferentes sistemas foram desenvolvidos para se obter a expressão funcional dos ORs, como por exemplo com a utilização das proteínas RTP, os sinais obtidos não são muito robustos. Respostas são obtidas apenas quando se utiliza concentrações altas dos odorantes a serem testados (aproximadamente 300 μΜ). Com a amplificação do sinal, causada pela adição da RIC-8B, pode-se utilizar concentrações mais baixas dos ligantes, o que também se aproxima mais de uma situação fisiológica. O processo, objeto da presente invenção, traz as seguintes inovações em relação à situação anterior: - os sistemas para a identificação de ligantes para receptores olfatórios que utilizam a proteína RIC-8B se tornam mais robustos, de forma que receptores que com os métodos anteriores não podiam ser analisados, agora podem. Desta maneira, pode-se determinar as especificidades de um número maior de receptores do que era permitido anteriormente. - os sistemas para a identificação de ligantes para receptores olfatórios que utilizam a proteína RIC-8B permitem que pelo menos determinados receptores sejam analisados na ausência de modificações de sua seqüência primária (ausência de adição da seqüência de rodopsina), o que contribui para que as especificidades determinadas sejam mais equiparáveis às fisiológicas. - com a adição de RIC-8B, concentrações menores (mais fisiológicas) de odorantes podem ser utilizadas. Este fator também deve contribuir para que as especificidades determinadas sejam mais corretas. - o mesmo tipo de abordagem poderá ser utilizado para a identificação de ligantes para outros membros superfamília de receptores acoplados a proteína G (GPCRs), que acoplem à proteína tipo Gs. Um grande número destes receptores são órfãos, isto é, não apresentam ligantes conhecidos. Como vários destes receptores devem estar envolvidos em processos fisiológicos importantes, a identificação de seus ligantes poderá trazer informações importantes a respeito de suas funções e estes poderão se tornar importantes alvos para drogas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (7)

1. Processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína G, caracterizado por conter a expressão de RIC-SB e compreender as etapas de: a) Cultivo de células HEK293 em placas de 96 poços, na densidade de 0,5 X 105 eéluias/poço; b) Transfecção dessas células após 24 h do plaqueamento com 10-30 ng de plasmídeos de expressão contendo cDNAs correspondentes às regiões codificadoras de Gaolf, RIC-8B e o receptor olíatório, da seguinte maneira: - mistura do D NA com 50 pl de meio Dulbecco’s Modified Eagle Médium” (DMEM); - adição de 5 pl de PLUS™REAGENT, mistura e incubação por 15 minutos à temperatura ambiente; - adição de 2 μΙ de Upofectamine®, diluída em 50 μΙ de DMEM, incubação por 15 minutos à temperatura ambiente; - aspiração do meio dos poços; - adição de 400 μΙ de DMEM à mistura, mistura e adição aos poços; - incubação por 3 horas a 37 °C, 5% C02; - adição de 3 ml de DMEM + 10% de soro fetal bovino (FBS); e - incubação de 24 a 48 h; c) Adição a cada poço do ligante que será testado na concentração desejada, sendo as soluções estoque preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) e as diluições finais preparadas em DMEM sem soro, seguida de incubação por 10 minutos e adição de 200 μΙ de tampão de lise; d) Medição das concentrações de adenosina monofosfato cícIígo (AMPc) em cada poço.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da medição das concentrações de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) ser feita utilizando-se um sistema imunoenzimático para a detecção direta de AMPc.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da medição das concentrações de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) ser feita utilizando-se um plasmídeo repórter que é co-transfectado nas células, juntamente com os outros plasmídeos, durante a etapa inicial de transfecção das células,

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado peio fato do plasmídeo repórter ser, preferencial mente, o pCRE-SEAP sendo 100 μ I deste meio de cultura transferido para uma nova placa de 96 poços e 100 μΙ da solução contendo o seguinte substrato para a fosfatase alcalina, 20 mM para-nitrofenil fosfato, 1mM MgCI2, em 1 M dietanolamina, pH 9,8; adicionados a estes poços de modo que a absorbância a 410 nm resultante seja então medida utilizando-se um leitor de placas, quantificando a concentração de adenosina monofosfato cíclico (AMPc).

5. Uso da proteína RIC-8B caracterizado por ser na composição de sistemas heterólogos de expressão de receptores olfatórios ou de outros receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que se acoplem às proteínas tipo Gs.

6. Uso da proteína RIC-8B, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser na composição de sistemas heterólogos de expressão de receptores olfatórios ou de outros receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que se acoplem à proteína Gaolf.

7. Uso da proteína RIC-8B, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo sistema heterólogo também compreender a expressão de proteínas “receptor transporter protein” (RTPs).