CN108699123A - G蛋白 - Google Patents
G蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108699123A CN108699123A CN201780010155.5A CN201780010155A CN108699123A CN 108699123 A CN108699123 A CN 108699123A CN 201780010155 A CN201780010155 A CN 201780010155A CN 108699123 A CN108699123 A CN 108699123A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- subunits
- mutation
- gpcr
- parent
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 title claims description 119
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 title claims description 118
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 title claims description 118
- 102000034353 G alpha subunit Human genes 0.000 claims abstract description 741
- 108091006099 G alpha subunit Proteins 0.000 claims abstract description 741
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 613
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 521
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 521
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 64
- 102000034345 heterotrimeric G proteins Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108091006093 heterotrimeric G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 266
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 243
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 154
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 126
- 108091006065 Gs proteins Proteins 0.000 claims description 104
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 104
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 103
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 91
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 89
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 88
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 85
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 84
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 65
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 52
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 46
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 32
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 31
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 26
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 21
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 20
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 19
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 18
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 14
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 14
- -1 GDP or GTP Chemical compound 0.000 claims description 12
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 claims description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 11
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 10
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 claims description 9
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 8
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004226 guanylic acid Substances 0.000 claims description 8
- 101100338269 Caenorhabditis elegans his-41 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108010078315 G-protein Beta gamma Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 108060007624 small GTPase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 5'-xanthylic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 102000017922 Neurotensin receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 108060003370 Neurotensin receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 4
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000024188 Andala Species 0.000 claims description 2
- 241001614291 Anoplistes Species 0.000 claims description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014974 beta2-adrenergic receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108040006828 beta2-adrenergic receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 claims description 2
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 claims 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims 1
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 97
- XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N γS-GTP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 79
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 76
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 49
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 42
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 34
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 31
- 230000008859 change Effects 0.000 description 28
- 230000006870 function Effects 0.000 description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 28
- 239000002585 base Substances 0.000 description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 25
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 24
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 23
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 23
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 18
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- JADDQZYHOWSFJD-FLNNQWSLSA-N N-ethyl-5'-carboxamidoadenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(=O)NCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 JADDQZYHOWSFJD-FLNNQWSLSA-N 0.000 description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 13
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 13
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 13
- 238000011160 research Methods 0.000 description 13
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 12
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 11
- 229940125425 inverse agonist Drugs 0.000 description 11
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 8
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 7
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 7
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 7
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 6
- WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N decyl beta-D-maltopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N 0.000 description 6
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 108091006026 monomeric small GTPases Proteins 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012552 review Methods 0.000 description 6
- 101100491817 Caenorhabditis elegans evl-20 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 5
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 5
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 5
- 101000677856 Stenotrophomonas maltophilia (strain K279a) Actin-binding protein Smlt3054 Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 5
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 5
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 5
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 102220511417 Proteasome subunit beta type-10_G49D_mutation Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- ZUHVYHQVJYIHPN-KHXPSBENSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl 4-fluorosulfonylbenzoate;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OC(=O)C1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 ZUHVYHQVJYIHPN-KHXPSBENSA-N 0.000 description 4
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 4
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 4
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 3
- 102000007471 Adenosine A2A receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010085277 Adenosine A2A receptor Proteins 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000016285 Guanine Nucleotide Exchange Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010067218 Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 3
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 3
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 3
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 3
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N dodecyldimethylamine N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229940126662 negative allosteric modulator Drugs 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 3
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 3
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102100024959 5-hydroxytryptamine receptor 2C Human genes 0.000 description 2
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 2
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 2
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 2
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101150102561 GPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000008924 GPCR kinases Human genes 0.000 description 2
- 108050000878 GPCR kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108091006068 Gq proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000052606 Gq-G11 GTP-Binding Protein alpha Subunits Human genes 0.000 description 2
- 102000017911 HTR1A Human genes 0.000 description 2
- 101150015707 HTR1A gene Proteins 0.000 description 2
- 101000761348 Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 2C Proteins 0.000 description 2
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 2
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100034437 Neurabin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108091014434 Neurabin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000003840 Opioid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000137 Opioid Receptors Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 2
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 2
- 102220567788 Ras-related protein R-Ras_S43N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220577656 Ras-related protein Rap-2a_S17N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 2
- 102000006612 Transducin Human genes 0.000 description 2
- 108010087042 Transducin Proteins 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241001463139 Vitta Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229920002892 amber Polymers 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 108010007701 calcyon Proteins 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002022 differential scanning fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 2
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000001362 electron spin resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 2
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010005264 metarhodopsins Proteins 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000003725 proteoliposome Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 2
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 description 2
- 239000011604 retinal Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 102220314083 rs376703933 Human genes 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- KQKPFRSPSRPDEB-UHFFFAOYSA-N sumatriptan Chemical compound CNS(=O)(=O)CC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 KQKPFRSPSRPDEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003708 sumatriptan Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 2
- ZOTHAEBAWXWVID-HXEFRTELSA-N uk-432,097 Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C(=O)NCC)O[C@H]1N1C2=NC(C(=O)NCCNC(=O)NC3CCN(CC3)C=3N=CC=CC=3)=NC(NCC(C=3C=CC=CC=3)C=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 ZOTHAEBAWXWVID-HXEFRTELSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- ZZJYIKPMDIWRSN-TZBSWOFLSA-N (+)-butaclamol Chemical compound C12=CC=CC=C2CCC2=CC=CC3=C2[C@@H]1CN1CC[C@@](C(C)(C)C)(O)C[C@@H]13 ZZJYIKPMDIWRSN-TZBSWOFLSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CHBOSHOWERDCMH-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1C(CCl)C1=CC=C(Cl)C=C1 CHBOSHOWERDCMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 description 1
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 description 1
- 102000017920 ADRB1 Human genes 0.000 description 1
- 108091008803 APLNR Proteins 0.000 description 1
- 102100035990 Adenosine receptor A2a Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108091006334 Anaphylatoxin receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001156002 Anthonomus pomorum Species 0.000 description 1
- 102000016555 Apelin receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 description 1
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102100039705 Beta-2 adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710152983 Beta-2 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100038495 Bile acid receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010073466 Bombesin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000010183 Bradykinin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001736 Bradykinin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100505076 Caenorhabditis elegans gly-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 108010001789 Calcitonin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100038520 Calcitonin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- QCDFBFJGMNKBDO-UHFFFAOYSA-N Clioquinol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=C(I)C=C(Cl)C2=C1 QCDFBFJGMNKBDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- XXXSILNSXNPGKG-ZHACJKMWSA-N Crotoxyphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(C)=C\C(=O)OC(C)C1=CC=CC=C1 XXXSILNSXNPGKG-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- MMWCIQZXVOZEGG-XJTPDSDZSA-N D-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-XJTPDSDZSA-N 0.000 description 1
- 101150049660 DRD2 gene Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000011392 Galanin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001605 Galanin receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010063919 Glucagon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100040890 Glucagon receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000017357 Glycoprotein hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050005395 Glycoprotein hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000000543 Histamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002059 Histamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010029 Homer Scaffolding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077223 Homer Scaffolding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000783751 Homo sapiens Adenosine receptor A2a Proteins 0.000 description 1
- 101000892264 Homo sapiens Beta-1 adrenergic receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000603876 Homo sapiens Bile acid receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001060451 Homo sapiens Pyroglutamylated RF-amide peptide receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000584583 Homo sapiens Receptor activity-modifying protein 1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFIDUCMKNJIJTO-BBRMVZONSA-N ICI 118551 Chemical compound CC(C)N[C@@H](C)[C@@H](O)COC1=CC=C(C)C2=C1CCC2 VFIDUCMKNJIJTO-BBRMVZONSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- AMHAQOBUZCQMHN-UHFFFAOYSA-N Indo-1 dye Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C=2NC3=CC(=CC=C3C=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 AMHAQOBUZCQMHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 239000009147 Kangxin Substances 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000008238 LHRH Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010021290 LHRH Receptors Proteins 0.000 description 1
- HQVHOQAKMCMIIM-FQEVSTJZSA-N LSM-15495 Chemical compound C([C@H]1COC=2C=CC=C3C(C(=O)C=4C5=CC=CC=C5C=CC=4)=C(N1C3=2)C)N1CCOCC1 HQVHOQAKMCMIIM-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000016994 Lysolipids receptors Human genes 0.000 description 1
- 108070000013 Lysolipids receptors Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004378 Melanocortin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000950 Melanocortin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000001419 Melatonin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050009605 Melatonin receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100033818 Motilin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108700040483 Motilin receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021126 N-formyl peptide receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710091942 N-formyl peptide receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000028517 Neuropeptide receptor Human genes 0.000 description 1
- 108070000018 Neuropeptide receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100386053 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108050000742 Orexin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000008834 Orexin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100027184 Periplakin Human genes 0.000 description 1
- 101710202907 Periplakin Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007074 Phospholipase C beta Human genes 0.000 description 1
- 108010047834 Phospholipase C beta Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000014743 Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010064032 Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010046644 Polymeric Immunoglobulin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035187 Polymeric immunoglobulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000056271 Prolactin-releasing peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700024163 Prolactin-releasing peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015433 Prostaglandin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010050183 Prostaglandin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002020 Protease-activated receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050009310 Protease-activated receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002298 Purinergic P2Y Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010000818 Purinergic P2Y Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027888 Pyroglutamylated RF-amide peptide receptor Human genes 0.000 description 1
- 101100015376 Rattus norvegicus Gnaz gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100030697 Receptor activity-modifying protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000405414 Rehmannia Species 0.000 description 1
- 102000004215 Relaxin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000728 Relaxin receptors Proteins 0.000 description 1
- 108070000025 Releasing hormones receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016983 Releasing hormones receptors Human genes 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N Retinaldehyde Chemical compound O=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 241000271569 Rhea Species 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 102100028927 Secretin receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013380 Smoothened Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010090739 Smoothened Receptor Proteins 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007124 Tachykinin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010072901 Tachykinin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 102000003790 Thrombin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000166 Thrombin receptors Proteins 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 101710095160 Urotensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 102000012088 Vasoactive Intestinal Peptide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010075974 Vasoactive Intestinal Peptide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102220609880 Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1_L63K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N [C].O Chemical compound [C].O FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- PAZJSJFMUHDSTF-UHFFFAOYSA-N alprenolol Chemical compound CC(C)NCC(O)COC1=CC=CC=C1CC=C PAZJSJFMUHDSTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002213 alprenolol Drugs 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 206010006514 bruxism Diseases 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N cholesteryl hemisuccinate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)CCC(O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 WLNARFZDISHUGS-MIXBDBMTSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- SEGLCEQVOFDUPX-UHFFFAOYSA-N di-(2-ethylhexyl)phosphoric acid Chemical compound CCCCC(CC)COP(O)(=O)OCC(CC)CCCC SEGLCEQVOFDUPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- JVHCMYZFGCOCTD-UHFFFAOYSA-N dihydroalprenolol Chemical compound CCCC1=CC=CC=C1OCC(O)CNC(C)C JVHCMYZFGCOCTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 102000013035 dynein heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 108060002430 dynein heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- WVLHGCRWEHCIOT-UHFFFAOYSA-N eltoprazine Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=CC2=C1OCCO2 WVLHGCRWEHCIOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006047 eltoprazine Drugs 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005183 environmental health Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002082 fibula Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000011207 functional examination Methods 0.000 description 1
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 150000004001 inositols Chemical class 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001038 ionspray mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000003835 leukotriene receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000146 leukotriene receptors Proteins 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000013554 lipid monolayer Substances 0.000 description 1
- 210000001699 lower leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical group C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 208000004141 microcephaly Diseases 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- JLTCWSBVQSZVLT-UHFFFAOYSA-N n-[6-amino-1-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]-1-oxohexan-2-yl]-1-[19-amino-7-(2-amino-2-oxoethyl)-10-(3-amino-3-oxopropyl)-13-benzyl-16-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxa Chemical compound NCCCCC(C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C1NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(N)CSSC1.N1C(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 JLTCWSBVQSZVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOMMMLWIABWRKL-WUTDNEBXSA-N nazartinib Chemical compound C1N(C(=O)/C=C/CN(C)C)CCCC[C@H]1N1C2=C(Cl)C=CC=C2N=C1NC(=O)C1=CC=NC(C)=C1 IOMMMLWIABWRKL-WUTDNEBXSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 1
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- UWJJYHHHVWZFEP-UHFFFAOYSA-N pentane-1,1-diol Chemical compound CCCCC(O)O UWJJYHHHVWZFEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002469 receptor inverse agonist Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220129380 rs781535204 Human genes 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 108700027603 secretin receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000005364 simax Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- DKGZKTPJOSAWFA-UHFFFAOYSA-N spiperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCC2(C(NCN2C=2C=CC=CC=2)=O)CC1 DKGZKTPJOSAWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001675 spiperone Drugs 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4722—G-proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/05—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on GTP; involved in cellular and subcellular movement (3.6.5)
- C12Y306/05001—Heterotrimeric G-protein GTPase (3.6.5.1)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种亲本异源三聚体G蛋白α(Gα)亚基的突变体，所述突变体(i)缺乏所述亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋；(ii)能够在异源三聚体G蛋白β(Gβ)亚基和异源三聚体G蛋白γ(Gγ)亚基不存在的情况下与GPCR结合；并且(iii)具有与所述亲本异源三聚体Gα亚基的氨基酸序列相比包含一个或多个突变的氨基酸序列，所述突变选自缺失、取代和插入。
Description
本发明涉及突变G蛋白，并且具体地说，涉及异源三聚体G蛋白的突变α亚基。本发明还涉及包括这种突变体的产物、突变体的用途以及涉及这种突变体的方法。
G蛋白通过在GDP结合的非活性状态与GTP结合的活性状态之间相互转换来结合鸟嘌呤核苷酸并充当多条信号传导通路的分子开关。G蛋白由两个主要种类组成：单体小G蛋白和异源三聚体G蛋白。尽管小G蛋白以及异源三聚体G蛋白的α亚基(Gα)均包含GTP酶结构域(G结构域)，但是Gα包含附加的螺旋结构域(H结构域)并且还与Gβ(Gβ)亚基和Gγ(Gγ)亚基形成复合物。尽管小G蛋白以及异源三聚体G蛋白的α亚基经历类似的信号传导循环，但是其活化在一个重要方面有所不同。小G蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)大部分是胞质蛋白，而Gα亚基的GEF通常是膜结合的G蛋白偶联受体(GPCR)。尽管小G蛋白的GEFS与GDP结合区直接相互作用，但是GPCR在距GDP结合区几乎的位点处与Gα结合并且变构地触发GDP释放以活化小G蛋白。
GPCR构成控制许多生理过程的非常大的蛋白家族并且是许多有效药物的靶标。因此，GPCR具有相当大的药理学重要性。具体地说，参考Overington等人(2006年)《药物发现自然综述(Nature Rev.Drug Discovery)》第5卷第993到996页，其指出超过四分之一的现有药物将GPCR作为靶标。GPCR列表在通过引用结合的Foord等人(2005年)的《药理学综述(Pharmacol Rev.)》第57卷第279到288页中给出。
三十年来的生物化学和生物物理研究已经产生通GPCR进行G蛋白活化的模型。激动剂与GPCR结合诱导受体结构发生微小变化1-4，从而允许与G蛋白发生生产性相互作用。这个过程可能包括至少两个阶段：可能涉及G蛋白βγ亚基或脂质部分的初始对接相互作用诱导α亚基的极端C端发生构象变化5,6。然后，属于主要受体结合区7和受体特异性的决定簇8,9的C端能够完全接合受体。这个相互作用触发了G蛋白和受体两者的相互诱导的构象变化10。在G蛋白中，这些变化传播到核苷酸结合袋，从而导致GDP释放10,11。在受体中，构象变化反馈回到配体结合袋，从而降低配体的解离速率，这导致了显著增大的激动剂结合亲和力12,13。这个亲和力转变的机制很可能是由于配体结合袋的微小重组或复合物向较低能态的过渡造成的，所述过渡是由于G蛋白结合所赋予的构象稳定。在这个三元复合物中，受体充当伴侣，从而保护热不稳定的无核苷酸G蛋白免于变性14,15。在鸟嘌呤核苷酸不存在的情况下，这个复合物是稳定的；然而，在体内，GTP由于其高细胞浓度而迅速结合12,14。这触发了使G蛋白从受体解离16,17的构象变化以及Gα亚基和βγ亚基的分离14,16。然后，活化的α-GTP和βγ亚基能够刺激其对应的下游信号传导通路。
配体结合袋的原子分辨率映射对设计用于调节GPCR活性的药物而言具有重大意义。因此，用于使受体在其高亲和力激动剂结合构象下结晶化的方法是激动剂化合物的基于高效结构的设计的关键先决条件。至今，三种方法已经完成了这一点：首先，转导蛋白的C端肽在与视蛋白36和变视紫红质II37两者复合时结晶化；其次，诱导高亲和力激动剂结合状态的骆驼科动物抗体(Nb80)已经在与β2AR38复合时结晶化；再次，异源三聚体Gs已经在与β2AR10复合时结晶化。尽管这些结构所提供的GPCR活化是有价值的见解，但是对于基于较宽结构的药物设计应用而言，所述结构具有几个主要缺点。视蛋白和变视紫红质II复合物分别在和处解出，并且在这两种情况下，生色团(chromaphore)结合袋周围的电子密度较强36,37。然而，使用G蛋白C端肽来稳定其它GPCR的活性构象尚未成功10。此外，由转导蛋白肽诱导的构象变化远远小于在β2AR-Gs复合物10中观察到的那些构象变化，从而指示这些结构表示沿活化通路的中间构象。Nb80–β2AR复合物以的分辨率解出，并且还在配体结合袋周围展现出良好的电子密度38。然而，Nb80诱导的构象变化小于在β2AR-Gs复合物10中观察到的那些构象变化，从而表明这个结构也可以表示中间构象。此外，尽管Nb80被特异性地衍生成结合β2AR并且因此有可能与其它密切相关GPCR(例如，β1AR)高效地偶联，但是新的纳米抗体可能需要针对较远相关受体而产生。β2AR–Gs复合物以的分辨率解出，然而，在这个结构中，配体结合袋周围的电子密度非常差。此外，使G蛋白-GPCR复合物结晶化的复杂度意味着这个策略有限地用于基于较宽结构的药物设计应用。所有上述复合物以中到高分辨率解出，然而，所述复合物在配体结合袋周围提供的细节不足以准确地定义与高亲和力激动剂结合构象相关联的结构变化。因此，为了准确地定义这些变化并且为了允许基于最佳结构的药物设计，非常需要以大于的分辨率解出G蛋白-GPCR复合物的结构。
刺激性G蛋白(Gαs)的分离的GTP酶结构域和螺旋结构域之前已被转染到COS-7细胞41。然而，单独地，并无蛋白增加细胞cAMP的产生。而且，并未调查GTP酶结合GPCR的能力。
Gα亚基还被示出为以不依赖βγ的方式与GPCR相互作用，并且在存在大量过量受体的情况下经历核苷酸交换，但是动力学比全酶43,45,46慢得多。然而，所有构造都包含完整的螺旋结构域。
本说明书中对显然在前公开的文件的列举或讨论不应必然地被视为是承认所述文件是现有技术的一部分或者是公知常识。
在本文中，我们描述了最小工程化G蛋白α(MEGA)结构域的设计，所述MEGA结构域与GPCR偶联并且可以诱导与高亲和力激动剂结合状态相关联的核心药理学和构象变化。MEGA结构域可被视为Gα亚基的最小版本，缺乏螺旋结构域的一部分或全部，所述MEGA结构域即使在βγ二聚体不存在的情况下也可以与GPCR偶联。我们已经标识出提高MEGA结构域的表达和稳定性两者的突变，同时保留了蛋白的基本鸟嘌呤核苷酸结合特性和功能。我们已经发现的突变在异源三聚体G蛋白之中是充分保守的，并且据信被转移到所有四类α亚基的成员。因此，这个方法可以用于产生能够与不同GPCR偶联的GTP酶结构域库。MEGA结构域的替代性描述是mini G蛋白，并且这两个定义均可以用于描述本发明的突变G蛋白。
因此，本发明的第一方面提供一种亲本异源三聚体G蛋白α(Gα)亚基的突变体，所述突变体(i)缺乏所述亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋；(ii)能够在异源三聚体G蛋白β(Gβ)亚基和异源三聚体G蛋白γ(Gγ)亚基不存在的情况下与GPCR结合；并且(iii)具有与所述亲本异源三聚体Gα亚基的氨基酸序列相比包含一个或多个突变的氨基酸序列，所述突变选自缺失、取代和插入。
异源三聚体G蛋白包括由鸟嘌呤基-核苷酸结合α亚基(Gα)、β亚基(Gβ)和γ亚基(Gγ)这三个亚基组成的蛋白质的含义。如上所述，这种异源三聚体蛋白将信号从GPCR转导到下游效应器。任何异源三聚体G蛋白的Gα亚基可以用于实践本发明。典型地，Gα亚基的长度在350个氨基酸与400个氨基酸之间并且具有在40kDa到45kDa的范围内的分子量。存在基于序列相似性和功能分组的四个Gα亚基家族，总共包含十七个Gα亚基，其中的任何亚基均可以用于实践本发明：
Gαs ：Gαs、Gαolf(嗅觉的)
Gαi/o ：Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo1、Gαo2、Gαz、Gαt1、Gαt2、Gαt3(味蛋白)
Gαq/11 ：Gαq、Gα11、Gα14、Gα15(有时被称为16)
Gα12/13 ：Gα12、Gα13
Gs和Gi家族调控腺苷酸环化酶活性，而Gq使磷脂酶Cβ活化并且G12/13可以使小GTP酶家族活化。
还存在真菌和植物类α亚基。例如，已知酵母使用GPCR/G蛋白通路；酿酒酵母中的交配因子信号转导是由G蛋白α1亚基(GP-1)介导的。Urano等人还综述了在拟南芥和水稻(Oryza sativa)这两种模型生物体中主要研究的植物的G蛋白信号传导(Urano等人《开放生物学(Open Biol.)》2013年3月，第3卷(第3期)：120186)。所有这种Gα亚基均包括在本发明的范围内。适合的Gα亚基及其分类的进一步细节在本领域中是熟知的，并且可见于http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR001019以及Flock等人2015年(《自然(Nature)》第524卷：第173页)和Anantharanman等人2011年(《基因(Gene)》第475卷：第63到78页)。还可以通过查阅科学文献和如http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/ReceptorFamiliesForward？type＝GPCR等可用在线数据库来找到关于给定GPCR偶联的Gα亚基的信息(另外参见Alexander等人(2015年)，药理学简明指南2015/16：G蛋白偶联受体(The Concise Guide to PHARMACOLOGY 2015/16：G protein-coupled receptors)《英国药理学期刊(Br J Pharmacol.)》第172卷：第5744到5869页)。下文中关于本发明的第四方面提供了本发明的突变Gα亚基可以结合的GPCR的进一步详情，包括特定GPCR的实例。
许多Gα亚基的氨基酸序列(和对所述氨基酸序列进行编码的cDNA的核苷酸序列)是容易获得的，例如，通过参考GenBank或UniProt。具体地说，Flock等人2015年(《自然(Nature)》第524卷：第173页)给出了来自UniProt(http://www.uniprot.org/uniprot)的所有人Gα旁系同源物的人基因ID。还应注意，因为具有增大数量的基因组的序列是完整的，因此Gα亚基的氨基酸序列可以从其推导出来。
尽管Gα可以衍生自任何源，但特别优选的是Gα来自真核源。特别优选的是Gα衍生自动物(例如，脊椎动物)源如哺乳动物或鸟类。特别优选的是Gα亚基衍生自大鼠、小鼠、兔或狗或非人灵长类动物或人或者衍生自鸡或火鸡。为了避免引起怀疑，“衍生自”包括以下含义：cDNA或基因最初是使用来自源的遗传物质得到的，但是蛋白质随后可以表达在任何宿主细胞中。因此，很明显，真核Gα(如鸟类或哺乳动物的Gα)可以表达在原核宿主细胞如大肠杆菌中，但视情况而定可被视为是鸟类或哺乳动物衍生的。
Gα亚基包括两个结构域：GTP结合结构域和螺旋结构域。GTP结合结构域与类Ras小GTP酶是同源的并且包括开关区I和II，所述开关区I和II在活化期间改变构象。开关区是α-螺旋的环，构象对鸟嘌呤核苷酸敏感。
Gα亚基的螺旋结构域包括插入在开关区I之前的GTP结合结构域中并且对异源三聚体G蛋白而言唯一的螺旋插入结构域的含义。这个螺旋结构域用于在与GTP结合结构域的界面处螯合鸟嘌呤核苷酸并且必须被代替以实现核苷酸解离。Flock等人(2015年)已经执行了对来自不同生物体的Gα亚基的结构和序列比对并且已经证明Gα亚基的螺旋结构域包括被表示为螺旋A、螺旋B、螺旋C、螺旋D、螺旋E和螺旋F的六个α螺旋。因此，螺旋结构域可被视为在Gα亚基的氨基酸序列内的螺旋A的第一氨基酸残基与螺旋F的最后氨基酸残基之间的区域。然而，应理解，螺旋结构域还可以被视为延伸超过这些α螺旋以包围周围环区即螺旋A之前的环和螺旋F之后的环，从而使得螺旋结构域的边界不是绝对的。
在一个实施例中，突变Gα亚基缺乏亲本异源三聚体Gα亚基的α螺旋A、B、C、D、E或F中的至少一个α螺旋，比如α螺旋A、B、C、D、E或F中的至少两个、三个、四个、五个或所有的六个α螺旋。在突变Gα亚基缺乏α螺旋A、B、C、D、E或F中的超过一个α螺旋时，突变Gα亚基通常也缺乏干预环。因此，如果突变Gα亚基缺乏螺旋A和螺旋B，则突变Gα通常也会缺乏将螺旋A连接到螺旋B的环，等等。
在优选实施例中，突变Gα亚基缺乏亲本Gα亚基的螺旋结构域的α螺旋A、B、C、D和E以及干预环区。
在另一个优选实施例中，突变Gα亚基缺乏亲本Gα亚基的螺旋结构域的α螺旋A、B、C、D、E和F以及干预环区。
α螺旋A到F相对于十七个人Gα旁系同源物的氨基酸序列的定位展示在图25中(与Flock等人2015年的图1的延长日期(Extended Date)(《自然(Nature)》第524卷：第173页)相对应)，并且应了解，技术人员可以容易地确定所述α螺旋在其它Gα蛋白内的位置，例如通过蛋白比对和/或利用预测二级结构的计算机算法(参见例如Flock等人2015年)。例如，第二Gα蛋白中的螺旋A将会是与图25所列出的人Gα旁系同源物之一中的螺旋A同源的α螺旋。可以通过搜索定义人Gα亚基旁系同源物之一的序列中的螺旋A的类似氨基酸序列例如通过序列比对来标识第二Gα亚基中的同源螺旋。而且，可以用于基于氨基酸序列来预测蛋白质基元的存在的基于计算机的算法可在本领域中广泛使用。基于特定α螺旋在氨基酸序列内的相对位置及其相对于其它基元和α螺旋的位置，可以容易地标识同源螺旋。
为了实现不同Gα蛋白之间的任何氨基酸残基/位置的比较，Flock等人2015年(《自然(Nature》)第524卷：第173页)已经设想了常用Gα编号(CGN)系统。CGN以DSP格式为每个残基提供‘地址’，所述地址是指：(1)结构域(D)；(2)共有二级序列(S)；以及(3)在二级结构要素内的位置(P)。例如，苯丙氨酸336在Gαi1中被表示为Phe336G.H5.8，因为其是G结构域的共有螺旋H5内的第八个氨基酸残基。在Gαs2中的相应位置是Phe376G.H5.8。环用其旁侧的二级结构要素(SSE)的小写字母进行标记；例如，s6h5是指将串S6与螺旋H5连接的环(参见图25)。CGN映射web服务器可在http://mrc-lmb.cam.ac.uk/CGN处获得。
应了解，CGN可以用于标识任何Gα亚基中的螺旋A到F中的每个螺旋的边界。例如，Gαs中螺旋A(H.HA)的第一残基是Asp85H.HA.1并且Gαs中螺旋F(H.HF)的最后残基是Arg199H.HF.6。因此，突变Gα亚基可能缺乏亲本Gα亚基的与如图1和图25列出的长同种型人Gαs的氨基酸残基Asp85到氨基酸残基Arg199定义的区域相对应的螺旋结构域。
在第一和第二Gα亚基通过比对例如通过使用MacVector和Clustal W来进行比较时，“相应区域”包括第二Gα亚基的氨基酸序列中的与第一Gα亚基中的区域比对的区域(例如，由长同种型人Gαs的氨基酸残基Asp85到氨基酸残基Arg199定义的区域)的含义。例如，图25示出了所有人Gα亚基的比较，根据所述比对，可以标识出其它人Gα亚基中与长同种型人Gαs的氨基酸残基Asp85到氨基酸残基Arg199定义的区域相对应的区域。将了解，还可以标识出其它人Gα亚基中与长同种型人Gα亚基中的不同区域相对应的区域。
在具体实施例中，突变Gα亚基缺乏亲本异源三聚体Gα亚基的螺旋结构域的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基70到193、71到193、85到193或85到199相对应的区域。
应理解，在突变Gα亚基缺乏整个螺旋结构域时，本发明的突变Gα亚基可被视为分离GTP酶结构域或不具有其螺旋结构域的Gα亚基。
给定突变Gα亚基是否缺乏亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋可由技术人员例如通过以下项来确定：将突变Gα亚基的氨基酸序列与亲本Gα亚基的氨基酸序列进行比对以及评估与亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋相对应的氨基酸序列是否存在于突变Gα亚基的氨基酸序列中。可以以核苷酸序列水平执行类似分析。
能够在异源三聚体G蛋白β(Gβ)亚基和异源三聚体G蛋白γ(Gγ)亚基不存在的情况下与GPCR结合包括以下含义：Gα亚基不需要Gβ亚基和Gγ亚基存在以与GPCR结合。换句话说，本发明的突变Gα亚基能够以不依赖βγ的方式与GPCR结合。优选的是，本发明的突变Gα亚基应该以类似于在亲本Gα亚基和βγ亚基一起结合时亲本Gα亚基和GPCR结合的亲和力(也就是说，通常在1到3倍内)与同一GPCR结合。换句话说，突变Gα亚基应该以类似于亲本异源三聚体G蛋白与GPCR结合的亲和力与同一GPCR结合。与GPCR结合包括在通过其激动剂结合时与GPCR结合的含义。
各个方法可以用于确定GPCR与测试化合物之间的结合，包括例如尺寸排阻色谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离振子共振测定、基于芯片的测定、免疫细胞荧光(immunocytofluorescence)、酵母双杂交技术和噬菌体展示，上述方法是本领域的常见做法并且描述在例如以下项中：Plant等人(1995年)《分析生物化学(Analyt Biochem)》，第226卷(第2期)，第342到348页和Sambrook等人(2001年)《分子克隆实验手册第三版(Molecular Cloning A Laboratory Manual.Third Edition)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约。检测测试化合物与GPCR之间的结合的其它方法包括：用离子喷雾质谱法/HPLC法或其它物理和分析方法进行超滤。可以使用例如本领域技术人员所熟知的荧光共振能量转移(FRET)法，其中可以通过测量两个荧光标记实体在彼此非常接近时的相互作用来测量荧光标记的结合。WO 2009/081136中描述了又进一步方法。
在一个实施例中，突变Gα亚基能够在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR在功能上结合。“功能结合”包括以下含义：突变Gα亚基能够与表达在细胞表面上的GPCR结合，从而使得突变Gα亚基可以经由细胞的信号传导通路的组分将信号从GPCR(例如，已经与调节因子如受体的配体结合)转导到细胞中。这种功能结合的另一术语是偶联。如上文所解释的，异源三聚体G蛋白与GPCR偶联并且将信号从GPCR有效地传导到下游效应器。具体地说，配体如激素和神经传递素与GPCR的结合通过引起构象变化而使受体活化，这进而使在膜的细胞内侧的结合G蛋白活化。活化受体促进结合GDP与Gα亚基上的GTP的交换。GTP结合改变了Gα内的开关区的构象，这允许结合的三聚体G蛋白(非活性)从受体释放并且解离到(GTP结合的)活性Gα亚基和βγ二聚体中。Gα亚基和βγ二聚体继续活化如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、磷脂酶C等不同的下游效应器以及离子通道。这些效应器通常经由对基因转录的下游调控进而调控如cAMP、cGMP、二酰基甘油、钠或钙阳离子等二级信使的细胞内浓度，最终产生生理响应。循环通过将α亚基结合GTP水解成GDP来完成，从而使α和β/γ亚基重新关联并且使α和β/γ亚基与受体结合，这将信号封端。
可见，突变Gα亚基与GPCR之间的功能结合导致Gα亚基活化，从而使得Gα亚基可以在细胞中产生Gα蛋白信号。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基能够在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR结合，从而使得Gα亚基可以被GPCR活化，例如如通过Gα蛋白信号的生成或所述Gα蛋白信号的基础水平的增加证明的。Gα蛋白信号包括通常经由所讨论的特定Gα亚基与信号转导相关联并且因此可用作标志物以用于活化Gα亚基的任何下游信号的含义。信号可以是本文所描述的信号中的任何信号并且可以使用本领域中的任何适合技术来测定。
功能结合可以在细胞测定中进行评估，在所述细胞测定中，使能够将信号转导到细胞中的GPCR与突变Gα亚基接触，并且在(例如，用配体)刺激GPCR之后评估Gα蛋白信号。优选的是，细胞共同表达了突变Gα亚基和GPCR以增强信号，并且甚至更加优选的是，GPCR或突变Gα亚基的表达由可诱导启动子控制，所述可诱导启动子的许多实例已经在本领域中进行描述并且通常是可用的。然而，可以使用允许在将Gα与其GPCR结合之后测量Gα蛋白信号的任何测定格式，并且一旦已经刺激GPCR，就可以使用所述测定格式。优选的是，信号是可检测的。信号可以与(例如，GDP结合的或GTP结合的)Gα亚基的鸟嘌呤基-核苷酸结合状态相对应，所述鸟嘌呤基-核苷酸结合状态可以在纯化蛋白级分或丰富蛋白级分上进行生物化学评估，例如，在检测到放射性标记的GTPγS的量的情况下。信号可以与Gα亚基的GTP酶活性相对应，或者信号可以与二级信使的水平相对应，或者信号可以反映下游效应器的状态(例如，细胞蛋白的磷酸化状态或活性)。可替代地，使用报告基因可以提供读出，其中报告基因的表达由通过Gα亚基转导的信号控制。又另一种方法是测量GPCR针对其配体的亲和力。再另一种方法是测量已知通过Gα亚基进行信号传导来调控的细胞的表型(例如，细胞生长或形态)。下文中给出了进一步细节。
典型地，突变Gα亚基以不依赖βγ的方式、以类似于或大于其在βγ二聚体存在的情况下所具有的效力的效力与其GPCR在功能上结合。典型地，Gα亚基在βγ二聚体存在和不存在的情况下与GPCR结合时生成的Gα蛋白信号在彼此的5倍到10倍内，比如在2到3倍内。典型地，与Gα亚基在βγ二聚体存在的情况下与GPCR结合时生成的Gα蛋白信号相比，Gα亚基在βγ二聚体不存在的情况下与GPCR结合时生成的Gα蛋白信号会弱不超过5倍。
应了解，由Gα与GPCR之间的功能结合(例如，Gα的活化)生成的特定Gα蛋白信号会常常取决于所讨论的Gα亚基的类型。例如，Gαs型Gα亚基介导信号转导到刺激环AMP(cAMP)在细胞内产生的效应器。相反，Gαi型Gα亚基介导信号转导到抑制环AMP在细胞内产生的效应器。属于Gαq型的另一类Gα亚基使磷脂酶C(PLC)通路活化，从而导致磷酸肌醇水解以生成两类不同的二级信使，即二酰基甘油(DAG)和肌醇磷酸酯。二酰基甘油使某些蛋白激酶C(PKS)活化并且某些肌醇磷酸酯刺激钙从细胞内储存处移动。多种多样的细胞内效应器已被标识为受Gα亚基控制，包括cAMP、cGMP、磷酸二酯酶、磷脂酶C和磷脂酶A2。另外，Gα活化能够调节离子通道的范围并且能够抑制某些电压敏感钙瞬变以及刺激心脏钾通道。技术人员将能够选择适当的测定用于给定Gα亚基(例如，参见Neves等人(2002)《科学(Science)》第296卷：第1636到1639页；以及Cabrera-Vera等人(2013年)《内分泌学综述(EndocrineReviews)》第24卷：第765到781页)。
在测试调节cAMP的Gα亚基时，用于检测cAMP的标准技术可以用于评估功能结合，比如在未标记cAMP存在的情况下对[3H]cAMP定量的竞争性测定。
可以例如在质膜制备时通过使用本领域熟知的技术确定γ32P GTP的分解来测量Gα亚基的GTP酶活性(例如，参见《信号转导：实用方法(Signal Transduction:A PracticalApproach)》，G Milligan编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，牛津，英格兰)。
在测试调节磷脂酶C的Gα亚基时，可以使用标准脂质提取技术来提取和分析肌醇脂质。还可以使用薄层色谱法来测量DAG。还可以使用放射性标记技术或HPLC来定量所有这三种肌醇脂质(IP1、IP2、IP3)的可溶于水的衍生物。DAG还可以由磷脂酰胆碱产生。还可以使用放射性标记技术来测量这个磷脂响应于Gα活化而进行的分解。
可以使用标准技术来测量细胞内钙的移动或钙从细胞外部的流入。对适当的钙指示剂、荧光的、生物发光的、金属染色的或钙敏感的微电极的选择取决于细胞类型和研究事件的大小和时间常数(Borle(1990年)《环境健康展望(Environ Health Perspect)》第84卷：第45到56页)。作为示例性钙检测方法，细胞可以使用标准方法加载有钙敏感性荧光染料fura-2或indo-1，并且可以使用荧光计来测量钙的任何变化。
适合的测定的进一步实例包括：钙移动(Gonzalez JE、Maher MP.，用于离子通道和受体药物发现的细胞荧光指示剂和电压/离子探针读取器(VIPR)工具(Cellularfluorescent indicators and voltage/ion probe reader(VIPR)tools for ionchannel and receptor drug discovery)，《受体通道(Receptors Channels)》2002年，第8卷(第5到6期)：第283到295页；Dupriez VJ、Maes K、Le Poul E、Burgeon E、Detheux M.，“针对G蛋白偶联受体、离子通道和酪氨酸蛋白激酶受体的基于水母发光蛋白的功能测定”(Aequorin-based functional assays for G-protein-coupled receptors,ionchannels,and tyrosine kinase receptors)，《受体通道(Receptors Channels)》2002年，第8卷(第5到6期)：第319到330页)；cAMP水平的变化(Weber M、Ferrer M、Zheng W、IngleseJ、Strulovici B、Kunapuli P.，使用酶分段互补针对Gs和Gi偶联受体进行1536孔cAMP测定(A 1536-well cAMP assay for Gs-and Gi-coupled receptors using enzymefragmentation complementation)，《测定与药物开发技术(Assay Drug Dev Technol)》2004年2月，第2卷(第1期)：第39到49页)；激酶通路的活化(Leroy D、Missotten M、Waltzinger C、Martin T、Scheer A.，G蛋白偶联受体介导的ERK1/2磷酸化：针对GPCR活化通用传感器(G protein-coupled receptor-mediated ERK1/2 phosphorylation：towardsa generic sensor of GPCR activation)，《受体和信号转导研究期刊(J Recept SignalTransduct Res)》2007年，第27卷(第1期)：第83到97页)；例如经由使用报告基因来调控基因转录(Liu B、Wu D.，使用荧光素酶报告测定来分析G12/13与G蛋白偶联受体的偶联(Analysis of the coupling of G12/13 to G protein-coupled receptors using aluciferase reporter assay)，《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》2004年，第237卷：第145到149页；Kent TC、Thompson KS、Naylor LH.，开发用于筛选G蛋白偶联受体的通用双报告基因测定的(Development of a generic dual-reporter gene assay forscreening G-protein-coupled receptors)《生物分子筛选期刊(J Biomol Screen)》2005年8月，第10卷(第5期)：第437到446页)；β抑制蛋白的复原(Hudson CC、Oakley RH、Sjaastad MD、Loomis CR.，通过抑制蛋白转位对已知G蛋白偶联受体进行高含量筛选(High-content screening of known G protein-coupled receptors by arrestintranslocation)，《酶学方法(Methods Enzymol)》2006年，第414卷：第63到78页)；G蛋白的活化如测量GTP酶活性(Jameson EE、Roof RA、Whorton MR、Mosberg HI、Sunahara RK、Neubig RR、Kennedy RT.，使用荧光GTP类似物对基础和受刺激G蛋白GTP酶活性进行实时检测(Real-time detection of basal and stimulated G protein GTP酶activity usingfluorescent GTP analogues)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》2005年3月4日，第280卷(第9期)：第7712到7719页)或测量[35S]GTPγS结合(Rodgers G、Hubert C、McKinzie J、Suter T、Statnick M、Emmerson P、Stancato L.，开发用于标识微类阿片受体的拮抗剂的位移结合和GTPγS闪烁接近测定(Development of displacement binding andGTPgammaS scintillation proximity assays for the identification ofantagonists of the micro-opioid receptor)，《测定和药物开发技术(Assay Drug DevTechnol)》，2003年10月，第1卷(第5期)：第627到636页)。
通常，将G蛋白与GPCR结合已被示出为增大了GPCR针对其激动剂的亲和力(例如，参见Leff(1995年)TiPS，第16卷：第89页)，并且因此，除了例如通过评估Gα蛋白信号来评估突变Gα亚基的活化之外，评估突变Gα亚基与GPCR之间的功能结合的优选方法是通过测量GPCR针对其配体的亲和力。以此方式，功能结合可被表征为，相比于GPCR未与Gα亚基结合时GPCR针对其激动剂的亲和力，GPCR针对其激动剂的亲和力在GPCR与Gα亚基结合时增大。可以使用本领域中任何适合的技术来测量这种亲和力增大，包括竞争性结合测定，任选地其中竞争配体中的一者或两者被可检测地标记。在实例中描述了这种测定的实例，所述测定测量用于在Gαs存在和不存在时与β肾上腺素受体结合的拮抗剂3H-二氢阿普洛尔(3H-DHA)与激动剂异丙肾上腺素之间的竞争。为了增大这种测定的敏感性，可能期望还将GPCR和/或Gα亚基暴露于已知稳定Gα亚基或激动剂构象的试剂。这种试剂的实例包括抗体(例如，纳米抗体)或其功能模仿天然激动剂的功能的其它蛋白。具体实例为纳米抗体35(Ref 40)和纳米抗体80(Ref 38)，并且进一步实例提供在WO 2012007593、WO 2015121092和WO2014122183中。应了解，可以例如通过以下方式来选择其它这种抗体/纳米抗体：将纯化GPCR或过量表达在全细胞中的GPCR注入小鼠或美洲鸵中、选择与GPCR结合的抗体/纳米抗体、以及选择使全细胞中的GPCR活化的那些抗体/纳米抗体(例如，通过筛选GPCR活化信号传导通路的下游效应的增产)。
在已知G蛋白与GPCR的结合增大了GPCR针对其激动剂的亲和力时，典型地，突变Gα亚基在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR的结合使GPCR针对激动剂的亲和力增大至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。优选地，突变Gα亚基在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR的结合使GPCR针对激动剂的亲和力增大至少10倍、50倍或100倍。
应了解，一些G蛋白可以减小GPCR针对其拮抗剂的亲和力，在这种情况下，可以通过测量这个亲和力减小来评估突变Gα亚基与GPCR之间的功能结合。与用于测量针对激动剂的亲和力增大的上述那些测定类似的测定可以用于测量针对拮抗剂的亲和力减小。在已知G蛋白与GPCR的结合减小了GPCR针对其拮抗剂的亲和力时，典型地，突变Gα亚基在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR的结合使GPCR针对拮抗剂的亲和力减小至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。优选地，突变Gα亚基在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR的结合使GPCR针对拮抗剂的亲和力减小至少10倍、50倍、100倍或150倍。
如上文所概括的，GPCR与异源三聚体G蛋白之间的相互作用诱导了G蛋白和受体两者的构象变化。具体地说，GPCR的跨膜螺旋6的细胞质末端移动远离受体的核心 或更多。因此，突变Gα亚基在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下的功能结合预期将会诱导在亲本Gα亚基与Gβ和Gγ亚基一起与GPCR结合时显而易见的这些构象变化中的一个或多个构象变化。换句话说，突变Gα的结合预期使GPCR适配其G蛋白结合构象。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR的结合导致GPCR的跨膜螺旋6的细胞质端移动远离受体的核心或更多，比如距离受体的核心至少或因此，应了解，这提供了确定Gα亚基是否与GPCR在功能上结合或偶联的又另一种方法。用于探测蛋白质结构的各种方法在本领域中是已知的并且任何适合的方法均可使用。例如，可以使用任何结构生物学技术，比如x射线晶体学。其它方法包括电子显微镜法、NMR、通过电子顺磁共振波谱法进行直接测量、或FRET。
评估突变Gα亚基与GPCR之间的功能结合或偶联的又另一种方法是评估GPCR/激动剂/突变Gα亚基复合物在变性条件下的稳定性并且将所述稳定性与GPCR/激动剂复合物在变性条件下的稳定性进行比较。如果GPCR/激动剂/突变Gα亚基复合物的稳定性(热稳定性)大于GPCR/激动剂复合物的稳定性，这将会指示功能结合。应了解，在测量GPCR/G蛋白复合物的热稳定性时，应该在突变Gα亚基所耐受的温度范围内执行实验的温度(例如，以确保可能检测到配体结合)。典型地，这意味着在35℃以下执行实验，但是对于一些特别不稳定的Gα亚基，可能需要保持温度非常低(例如，10℃以下)。当然，还应了解到，可以在βγ亚基存在的情况下执行稳定性测量。可以使用测量稳定性的任何适合方法，例如如下文中和实例中所描述的(另外参见图10、图11和图17)。
可以用于评估突变Gα亚基是否与GPCR在功能上结合或偶联的测定的实例还描述在实例5中，并且包括(i)激动剂亲和力转变测定、(ii)热稳定性测定、(iii)荧光检测尺寸排阻色谱法(FSEC)、(iv)基于荧光的饱和结合分析和(v)尺寸排阻色谱法(SEC)。因此，应了解到，这些测定中的任何一个或多个可以单独地或与上述测定之一一起用于确定突变Gα亚基与GPCR之间的功能结合或偶联。
在优选实施例中，突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比在变性条件下具有增大稳定性和/或当表达在细胞中时以比其亲本Gα亚基更高的水平进行表达。因此，应了解到，在与其亲本Gα亚基进行比较时，突变Gα亚基包含一个或多个突变，在表达在细胞中时与其亲本Gα亚基相比，所述一个或多个突变增大了突变Gα亚基在变性条件下的稳定性和/或增大了突变Gα亚基的表达水平。
突变Gα亚基可以是针对任何变性剂或变性条件具有增大稳定性的突变Gα亚基，比如针对热、洗涤剂、离液剂或pH极值中的任何一种或多种。因此，应了解到，在去稳定条件下，突变Gα相对于其亲本可以具有延长寿命。
可以通过测量与已知结合配偶体(例如，GPCR)的结合或通过使用光谱法如特定温度下的荧光、CD或光散射来容易地确定针对热的增大稳定性(即，热稳定性)。典型地，在Gα亚基与结合配偶体(例如，GPCR)结合时，Gα亚基在特定温度下结合所述结合配偶体(例如，GPCR)的能力可以用于确定突变体的热稳定性。可能方便的是确定“准Tm”，即，Gα亚基的50％在孵育给定时间段(例如，30分钟)之后在所阐述的条件下灭活的温度。具有较高热稳定性的突变Gα亚基与其亲本相比具有增大的准Tm。可替代地，可以根据时间在特定温度下通过测量稳定性来评估热稳定性。例如，可以确定结合配偶体(例如，GPCR)结合的水平在时间零点处降到结合配偶体(例如，GPCR)结合的水平的50％的给定温度下的时间长度(Shibata等人，2009年，《分子生物学期刊(J Mol Biol)》)。然而，在任一情况下，应了解到，温度是变性剂。
关于针对洗涤剂或到离液剂的增大稳定性，典型地，Gα亚基在测试洗涤剂或测试离液剂存在的情况下孵育定义时间并且稳定性是使用例如结合配偶体结合或如上文所讨论的光谱法来确定的。
关于pH极值，将会选择典型的测试pH(例如，在4.5到5.5的范围内(低pH)或在8.5到9.5的范围内(高pH))。
因为在结晶化过程期间使用了相对粗糙的洗涤剂，因此优选的是突变Gα亚基在这种洗涤剂存在的情况下是稳定的。某些洗涤剂的“粗糙度”的顺序是DDM、C11→C10→C9→C8麦芽糖苷或葡萄糖苷、十二烷基二甲基氧化胺(LDAO)和SDS。特别优选的是突变Gα亚基在C9麦芽糖苷或葡萄糖苷、C8麦芽糖苷或葡萄糖苷、LDAO和SDS中的任何项的情况下更加稳定，并且因此优选的是这些洗涤剂用于稳定性测试。
由于其易于确定，一次你优选的是突变Gα相比于其亲本蛋白具有增大的热稳定性。应了解，热充当变性剂，并且这可以通过冷却样本例如通过放置在冰上来容易地移除。据信，热稳定性还可以是针对其它变性剂或变性条件的热稳定性指南。因此，增大的热稳定性有可能转译成变性洗涤剂的稳定性，尤其是比DDM变性更多的那些洗涤剂，例如，具有较小头基和较短烷基链和/或具有带电荷头基的那些洗涤剂。
在将pH极值用作变性条件时，应了解到，这可以通过添加中和剂来快速移除。类似地，在将离液剂用作变性剂时，变性效应可以通过将样本稀释到离液剂发挥其离液效应的浓度以下来移除。
突变Gα亚基可以是以比其亲本Gα亚基更高的水平表达在细胞中的突变Gα亚基。优选地，当在相同条件下表达在细胞中时，突变Gα亚基以比其亲本Gα亚基的水平大至少1倍的水平表达在细胞中，比如大至少2倍、3倍、4倍或5倍且更加优选地大至少10倍或50倍。适合的表达系统在下文中且在实例中进一步详细地描述，并且包括细菌或酵母中的组成型或诱导型表达系统、如杆状病毒、塞姆利基森林病毒和慢病毒等病毒表达系统、或者昆虫或哺乳动物细胞中的瞬时转染。用于评估蛋白表达的方法是本领域中熟知的并且包括如ELISA、SDS-PAGE分析、蛋白质印迹(western blotting)、凝胶过滤和HPLC等技术。
应了解到，本发明的第一方面的一些突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比可以更低的水平表达在细胞中和/或在变性条件下更不稳定，但是这种突变Gα亚基可以与GPCR形成复合物，所述复合物在变性条件下比在其亲本Gα亚基与GPCR之间形成的复合物更稳定。
GPCR被认为以与如激动剂和拮抗剂等不同药理类配体相关联的多个不同构象存在，并且在不同构象之间循环以便起作用(Kenakin T.(1997年)《纽约科学院年报(Ann N YAcad Sci)》第812卷，第116到125页)。构象之间的切换使得难以获得受体的晶体结构。因此，稳定特定构象的能力是结晶化研究所高度期望的。如实例所讨论的，发明人已经发现，本文所描述的突变Gα亚基增大了GPCR在其激动剂结合形式下的热稳定性。因此，在进一步实施例中，本发明的第一方面的突变Gα亚基能够在与GPCR结合时稳定GPCR的特定构象。稳定特定构象包括构象在变性条件下稳定的含义。换句话说，构象具有延长寿命，如通过在变性条件下保留配体结合能力证明的。优选地，特定构象是激动剂构象。用于评估变性条件下的稳定性的方法包括上文所概括的那些方法并且在本领域中是熟知的(参见例如WO 2008/114020)。简单地说，所述方法可以包括：使GPCR在配体不存在或存在的情况下经受变性条件以及然后测量对配体结合的保留。GPCR在配体不存在的情况下经受变性条件时，GPCR然后与配体接触以评估GPCR在何种程度下仍可以与配体结合。为了测量特定构象的稳定性，在稳定性实验中需要使用所述构象类配体(例如，激动剂构象的激动剂等等)。由于被稳定的构象典型地是激动剂构象，因此用于测量稳定性的配体典型地是激动剂，但是应了解，还可以使用部分激动剂。
典型地，本发明的第一方面的突变Gα亚基应该如其亲本Gα亚基那样保留与核苷酸(例如，GDP、GTP等鸟嘌呤核苷酸或如GTPγS或GppNp等核苷酸衍生物)结合的能力。类似地，突变Gα亚基应该如其亲本Gα亚基那样保留与Gβ亚基和/或Gγ亚基结合的能力。与核苷酸结合可以稳定突变Gα亚基，并且因此保留这些能力特别期望用于对G蛋白-GPCR复合物进行结构分析(例如，通过低温电子显微镜法)，如下文进一步描述的。
然而，为了避免引起怀疑，未保留这些活性中的一者或两者的突变Gα亚基仍由本发明的突变Gα亚基包含。
Gα亚基的开关I区由螺旋结构域与GTP酶结构域的β串2之间的环组成(CGN：G.hfs2)，但是还与来自螺旋结构域的螺旋F重叠。开关I可以通过将CGN系统用作位于螺旋F(H.HF)的第一氨基酸残基与β串2(G.S2)的第一氨基酸残基之间的区域来定义(例如，在人Gαs中，这将会是包括这两个指定氨基酸残基的D194H.HF.1到I207G.S2.1)。
在一个实施例中，突变Gα亚基保留其亲本Gα亚基的开关I区，例如，根据如图1列出的长同种型人Gαs的编号与氨基酸残基Asp 194到Ile 207相对应的区域。应理解，这个实施例可以对应于缺失与亲本Gα亚基的螺旋结构域的螺旋A到螺旋E相对应的区域的实施例。发明人已经发现，在与突变Gα亚基的亲本Gα亚基相比增大了所述突变Gα亚基的稳定性和/或表达水平的其它突变不存在的情况下，开关I区对于实现表达而言较为重要。然而，在与突变Gα亚基的亲本Gα亚基相比增大了所述突变Gα亚基的稳定性和/或表达水平的一个或多个突变存在的情况下，可以截短或完全缺失开关I区。因此，在另一个实施例中，突变Gα亚基是缺失亲本Gα亚基的开关I区(例如，根据如图1列出的长同种型人Gαs的编号与氨基酸残基Asp 194到Ile 207相对应的区域)或其部分的突变Gα亚基。其部分包括根据如图1列出的长同种型人Gαs的编号与氨基酸残基Asp 194到Ile 207相对应的区域的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个氨基酸残基的含义。优选地，开关I区的缺失部分包括已经缺失的一段连续氨基酸残基。
在又另一个实施例中，亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关I区被小GTP酶的开关I区代替。可以例如通过如本文所描述的结构和序列比对来容易地标识来自小GTP酶的开关I区。
在本发明的第一方面的突变Gα亚基的特别优选的实施例中，亲本Gα结构域的螺旋结构域、开关I区以及将GTP酶结构域联接到螺旋结构域的N端的连接子1区全部缺失。连接子1区(CGN：G.s1h1)在不同Gα亚基之间在长度上有所不同，但是可以通过将CGN系统用作螺旋1/螺旋A环(G.h1ha)的第一残基与最后残基之间的区域例如人Gαs V65G.h1ha.1到S84G.h1ha.20(包括这两个指定残基)来定义。可替代地，连接子1区可以被定义为位于螺旋1(G.H1)的最后残基与螺旋A(H.HA)的第一残基之间的区域，例如，人Gαs H64G.H1.12到D85H.HA.1(不包括这两个指定残基)。
因此，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基65到207相对应的区域的突变Gα亚基。
然而，应了解，可能期望保留这个区域的任一或两个末端处的一个或多个氨基酸残基(例如，2个、3个、4个或5个)。例如，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基66到207、67到207、68到207、69到207、70到207、65到206、65到205、65到204、65到203或65到202相对应的区域的突变Gα亚基。
在本发明的第一方面的突变Gα亚基的特别优选的实施例中，突变Gα亚基是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基65到203相对应的区域的突变Gα亚基。可替代地，这个区域可被定义为在螺旋1(G.H1)的最后残基与距离β折叠层(G.S2)的第一氨基酸残基三个N端残基氨基酸残基之间的区域，例如，人GαS H64G.H1.12到T204G.hfs2.5(包括这两个指定残基)。特别优选的是用如下文进一步描述的氨基酸连接子来代替这个区域。优选实例包括长度为八个氨基酸的连接子，比如GGSGGSGG或GGGGGGGG。
还应了解到，可能期望缺失这个区域的任一或两个末端处的一个或多个附加氨基酸残基(例如，2个、3个、4个或5个)。例如，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基60到207、61到207、62到207、63到207、64到207、65到208、65到209、65到210、65到211或65到212相对应的区域的突变Gα亚基。
在本发明的第一方面的突变Gα亚基的另一个实施例中，亲本Gα亚基的螺旋结构域以及将GTP酶结构域联接到螺旋结构域的N端的连接子1区缺失，但是亲本Gα亚基的开关I区缺失或用来自小GTP酶的开关I区代替。
为了促进突变Gα亚基的结晶化、表达和/或纯化，可能期望缺失来自亲本Gα亚基的N端的一个或多个氨基酸。因此，在一个实施例中，与亲本Gα亚基相比，本发明的第一方面的突变Gα亚基具有N端截短的氨基酸序列。例如，N端可以缺失多达10个氨基酸，比如N端可以缺失多达9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸或1个氨基酸。在另一个实例中，N端可以缺失多达15个、20个、25个、30个、35个或40个氨基酸。典型地，N端缺失的氨基酸在5个与20个之间。据信，N端的缺失特别有利于结晶化，并且因此，如果突变Gα亚基要被结晶化，则可能期望其亲本Gα亚基的N端缺失多达40个氨基酸。相比之下，在期望与βγ二聚体结合的情况下，N端不应该有缺失，或者仅应该缺失多达5个N端残基(例如，N端1个、2个、3个、4个或5个残基)。在特别优选的实施例中，缺失亲本Gα亚基的N端5个氨基酸、或缺失亲本Gα亚基的N端20个氨基酸、或缺失来自亲本Gα亚基的N端21个氨基酸、或缺失来自亲本Gα亚基的N端25个氨基酸。
在进一步优选实施例中，突变Gα亚基是缺失如图29所示出的氨基酸残基Ile/LeuHN43的所有N端氨基酸残基的突变Gα亚基。例如，在突变Gα亚基是突变Gαs亚基时，所述缺失对应于缺失根据如图29所示出的人Gαs的编号与人Gαs的前25个氨基酸相对应的前25个氨基酸。
应了解到，突变Gα亚基可以包括本文所定义的N端截短中的任何N端截短以及上文所提及的螺旋结构域、连接子1区和开关I区的缺失中的任何缺失。例如，突变Gα亚基可以包括本文所定义的N端截短中的任何N端截短并且可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基65到203相对应的区域的突变Gα亚基。
在本发明的第一方面的那些实施例中，在保持亲本Gα亚基的开关I区或其部分的情况下，发明人已经发现，亲本Gα亚基中的以下氨基酸残基的单独代替导致表达增大：如图1所示出的长同种型人Gαs的Leu 197和Cys 200。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基是在与亲本Gα亚基进行比较时包含开关I区的一个或多个突变的突变Gα亚基，并且在更具体的实施例中，突变Gα亚基是在与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的任何一个或多个位置相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基：Leu 197和Cys 200。使用CGN系统，这些氨基酸残基被标识为L197H.HF.4和C200G.hfs2.1。当位置L197H.HF.4处的氨基酸残基是亮氨酸时，其优选地取代丙氨酸残基，并且当位置C200G.hfs2.1处的氨基酸残基是半胱氨酸时，其优选地取代丝氨酸残基。
在另一个实施例中，突变Gα亚基是缺失亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关III区或其部分的突变Gα亚基。可以通过将CGN系统用作位于β折叠层4(G.S4)的最后残基与螺旋3(G.H3)的第一残基之间的区域例如人Gαs Ala249G.S4.7到Arg265G.H3.1(不包括这两个指定残基)来定义开关III区。因此，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基Ser 250到Asn 264相对应的区域或其部分的突变Gα亚基。其部分包括根据如图1列出的长同种型人Gαs的编号与氨基酸残基Ser 250到Asn 264相对应的区域的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸残基的含义。优选地，开关III区的缺失的部分包括已经缺失的一段连续氨基酸残基。例如，发明人已经发现，缺失与Asn254G.s4h3.5到Thr263G.s4h3.14相对应的氨基酸段为突变Gα亚基提供了特别好的特性(例如，在与GPCR偶联以及提高稳定性/表达水平方面)，并且因此，在具体实施例中，突变Gα亚基是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基254到263相对应的区域的突变Gα亚基。然而，应了解，可能期望保留这个区域的任一或两个末端处的一个或多个氨基酸残基(例如，2个、3个、4个或5个)。例如，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基255到263、256到263、257到263、258到263、259到263、254到262、254到261、254到260、254到259或254到258相对应的区域的突变Gα亚基。类似地，应了解，可能期望保留这个区域的任一或两个末端处的一个或多个附加氨基酸残基(例如，2个、3个、4个或5个)。例如，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基253到263、252到263、251到263、250到263、249到263、254到264、254到265、254到266、254到267或254到268相对应的区域的突变Gα亚基。
应了解，突变Gα亚基可以是其中如上文所定义的那样缺失亲本Gα亚基的开关III区或其部分的突变Gα亚基，并且可以包括本文所定义的N端截短中的任何N端截短以及上文所提及的螺旋结构域、连接子1区和开关I区的缺失中的任何缺失。例如，突变Gα亚基可以包括本文所定义的N端截短中的任何N端截短，并且可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基65到203和氨基酸254到263相对应的区域的突变Gα亚基。
在另一个实施例中，突变Gα亚基是缺失亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关II区或其部分的突变Gα亚基。可以通过将CGN系统用作在β折叠层3(G.S3)的最后氨基酸残基与β折叠层4(G.S4)的第一氨基酸残基之间的区域例如Gαs Val224G.S3.8到Ala243G.S4.1(不包括这两个指定残基)来定义开关II区。因此，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基Gly 225到Thr 242相对应的区域或其部分的突变Gα亚基。其部分包括根据如图1列出的长同种型人Gαs的编号与氨基酸残基Gly 225到Thr 242相对应的区域的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个氨基酸残基的含义。优选地，开关II区的缺失的部分包括已经缺失的一段连续氨基酸残基。在优选实施例中，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基227到230相对应的区域的突变Gα亚基。优选地，开关II区或其部分(例如，根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基227到230相对应的区域)被如下文进一步讨论的连接子序列代替；然而，这种连接子并非是必需的。
应了解，可能期望保留开关II区的任一或两个末端处的一个或多个氨基酸残基(例如，2个、3个、4个或5个)。例如，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基226到242、227到242、228到242、229到242、230到242、225到241、225到240、225到239、225到238或225到237相对应的区域的突变Gα亚基。类似地，应了解，可能期望保留这个区域的任一或两个末端处的一个或多个附加氨基酸残基(例如，2个、3个、4个或5个)。例如，突变Gα亚基可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基224到242、223到242、222到242、221到242、220到242、225到243、225到244、225到245、225到246或225到247相对应的区域的突变Gα亚基。
应理解，突变Gα亚基可以是如上文所定义的那样缺失亲本Gα亚基的开关II区或其部分的突变Gα亚基，并且可以包括本文所定义的N端截短中的任何N端截短以及上文所提及的螺旋结构域、连接子1区、开关I区和开关III区的缺失中的任何缺失。例如，突变Gα亚基可以包括本文所定义的N端截短中的任何N端截短，并且可以是缺失亲本Gα亚基的根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基65到203和氨基酸227到230相对应的区域的突变Gα亚基，任选地，其中还缺失亲本Gα亚基的与氨基酸残基254到263相对应的区域。
应了解，在亲本Gα亚基的任何部分(例如，螺旋结构域的至少一个螺旋或者开关I区、开关II区或开关III区中的任何区域或其部分)缺失时，Gα亚基的剩余部分(即，到缺失的N端的部分以及到缺失的C端的部分)可以通过连接子序列连结在一起。‘连接子序列’包括将通过缺失产生的两部分附连在一起的任何化学部分的含义。优选地，连接子是肽。适合的连接子肽是典型地采用无规卷曲构象的那些，例如，肽可以包含甘氨酸或丝氨酸或甘氨酸加丝氨酸残基的混合物。优选地，连接子包含2个与50个氨基酸残基之间、更优选地2个与30个之间且还更优选地3个与20个之间如3个与8个之间。下文表2中提供了适合连接子的实例。优选的是螺旋结构域、开关I区和开关II区中的任何项被连接子代替。对连接子的需要取决于缺失的尺寸。例如，小的缺失如区域中缺失十个氨基酸或更少可能不需要连接子，并且通过缺失产生的两部分可以直接连结在一起。然而，较大缺失如区域中缺失超过十个氨基酸将通常需要连接子。
如实例所证明的，发明人已经标识出当表达在细胞中时与突变Gα亚基的亲本Gα亚基相比增大突变Gα亚基在变性条件下的稳定性和/或增大突变Gα亚基的表达的各个突变，并且因此，优选的是本发明的第一方面的突变Gα亚基包括增大这种稳定性和/或表达的一个或多个突变。这种突变的实例列在下文的表2到表5中，并且因此，突变Gα亚基可以包括下文的表2到表5所列出的突变中的任何一个或多个突变。
在一个实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的任何一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个)位置相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基：Val 36、His 41、Ala 48、Gly 49、Glu 50、Met 60、Leu 63、Leu197、Lys 200、Arg 201、Phe 208、Asn 218、Gly 226、Glu 230、Ala 249、Ser 252、Leu 272、Ile 372、Val 375。优选地，氨基酸中的每个氨基酸被表2到表5所指示的特定氨基酸残基代替。例如，位置36处的缬氨酸被天冬氨酸代替，位置41处的组氨酸被异亮氨酸或缬氨酸代替，等等。然而，应了解，每个氨基酸可以被其它氨基酸代替，条件是突变Gα亚基能够在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR结合。
在本发明的任何方面，尽管用于代替特定位置处的给定氨基酸的氨基酸典型地是天然发生的氨基酸，典型地是“可编码”氨基酸，但是其可以是非天然氨基酸(在这种情况下，蛋白质典型地通过化学合成或通过使用非天然氨基-酰基tRNA形成)。“可编码”氨基酸是通过mRNA的转译而被合并到多肽中的氨基酸。还可能通过共价化学修饰例如通过蛋白质的转译后处理或半合成而在给定位置处产生非天然氨基酸或引入非肽键联。这些转译后修饰可以是如磷酸化、糖基化或棕榈酰化等天然的、或合成的或生物合成的。
在具体实施例中，突变Gα亚基是具有当与亲本Gα亚基的氨基酸序列进行比较时根据如图1列出的长同种型人Gα-s的编号具有以下突变中的一个或多个突变的氨基酸序列的突变Gα亚基：V36D、H41I或H41V、A48L、G49D、E50N、M60A或M60C、L63Y或L63R或L63K、L297A、C200S、R201A、F208N、N218K、G226A、E230A、A249D或A249E、S252D或S252E、L272D或L272E、I372A或I372C、以及V375I。
在具体实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时具有5个到20个或5个到25个氨基酸残基长度的N端截短、开关III区的缺失、并且在根据如图1列出的人Gα-s的长同种型的编号与以下位置中的一个或多个(例如，2个、3个、4个或5个)位置相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基：His 41、Leu 197、Cys 200、Ala 249和Leu 272。
在进一步实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时具有5个到20个或5个到25个氨基酸残基长度的N端截短、开关III区的缺失、并且在根据如图1列出的长同种型人Gα-s的编号与以下位置中的任何一个或多个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个)位置相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基：Gly 49、Glu 50、Leu 63、Ala 249、Ser 252、Leu 272、Ile 372和Val 375。
在还另一个具体实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的长同种型人Gα-s的编号与以下位置中的一个或多个位置相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基：Gly 49、Glu 50、Gly 226和Ser 252。
在又另一个具体实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时具有以下项的突变Gα亚基：(i)Ile/LeuHN43的所有N端氨基酸残基的缺失；(ii)在螺旋1(G.H1)的最后残基与距离β折叠层2(G.S2)的第一氨基酸残基三个N端残基的氨基酸残基之间的区域的缺失，任选地，其中所述区域被氨基酸连接子(例如，8氨基酸连接子如GGSGGSGG或GGGGGGGG)代替；(iii)TyrS4H3.4与Asn/SerS4H3.15之间的十个氨基酸残基的缺失；以及(iv)在与以下位置中的任何一个或多个(例如，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个)位置分别对应的位置处的不同氨基酸：Gly49SIH1.3、Glu50SIH1.4、Ala249S4.7、Ser252S4H3.3、Leu272H3.8、Ile372H5.4和Val375H5.7，任选地其中残基突变成D49SIH1.3、N50SIH1.4、D249S4.7、D252S4H3.3、D272H3.8、A372H5.4和I375H5.7。
典型地，本发明的第一方面的突变Gα亚基与如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的氨基酸序列(SEQ ID NO：91)具有至少20％的序列一致性，比如至少30％、40％、50％、60％或70％的序列一致性，且更典型地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
在进一步具体实施例中，突变Gα亚基是与图26中的对应于SEQ ID No:1-45的氨基酸序列中的任何氨基酸序列具有至少20％的序列一致性的突变Gα亚基，例如，至少30％、40％、50％、60％或70％的序列一致性，且更加优选地至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。优选地，突变Gα亚基是包括图26中的与SEQ ID No:1-45相对应的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的突变Gα亚基。
在进一步具体实施例中，突变Gα亚基是与图29、图35、图36、图37、图38和图40中的任何附图中的氨基酸序列中的任何氨基酸序列具有至少20％的序列一致性的突变Gα亚基，例如，至少30％、40％、50％、60％或70％的序列一致性，且更优选地至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。优选地，突变Gα亚基是包括图29、图35、图36、图37、图38和图40中的任何附图中的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的突变Gα亚基。
两个多肽之间的序列一致性百分比可以使用适合的计算机程序来确定，例如，威斯康辛大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序，并且应了解，一致性百分比是关于其序列已被最佳比对的多肽进行计算的。比对可以可替代地使用Clustal W程序来实施(Thompson等人，1994年，《核酸研究(NucleicAcids Res)》，第22卷(第22期)：第4673到4680页)。所使用的参数可以如下：快速成对的比对参数：K-元组(字)尺寸；1，窗口尺寸；5，空位罚分；3，顶部对角线数；5.计分方法：百分之x。多个比对参数：空位开放罚分；10，空位延伸罚分；0.05。计分矩阵：BLOSUM。
已经报道了异源三聚体G蛋白(由Barren和Artemyev49综述)和小G蛋白(由Feig50综述)的大量显性负向突变。显性负向突变可以通过螯合以下项来抑制G蛋白信号传导：βγ亚基、活化GPCR(例如，能够与G蛋白结合的GPCR)、或下游结合配偶体49，50。螯合GPCR的那些突变体是设计MEGA结构域所特别期望的，因为所述突变体可以帮助防止三元复合物(即，Gα亚基、GPCR和βγ亚基之间的复合物)解离。因此，在一个实施例中，本发明的第一方面的突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时包括一个或多个显性负向突变的突变Gα亚基。本领域中已知的任何这种显性负向突变可以合并到本发明的突变Gα亚基中，并且下文中包括了一些具体实例。
S17N是针对ras51所描述的第一显性负向突变之一并且相应突变已经表征在Gαs(S54N)52-54和Gαt(S43N)55,56中。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与Ser 54相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基。当突变Gα亚基是Gαs亚基时，突变体优选地包括突变S54N，并且当突变Gα亚基是Gαt亚基时，突变体优选地包括突变S43N。
位于NKXD基元内的N338D突变被标识为酵母G蛋白Gpa158中的显性负向突变体。类似于Ras S17N，Gpa1N338D突变体似乎与受体形成不可逆空结合袋复合物，所述不可逆空结合袋复合物对鸟嘌呤核苷酸58的解离具有抗性。作者注意到，突变蛋白是热不稳定的并且所述受体结合提供保护以免于变性58。Simon和同事报道称，也位于NKXD基元内的D273N突变产生了展现出受体螯合显性负向表型(不依赖βγ)62-64的核苷酸耗竭的Gαo、Gα11和Gα12亚基。因此，在另一个实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在NKXD基元内具有一个或多个不同氨基酸的突变Gα亚基，任选地其中NKXD基元的Asn用Asp代替和/或其中NKXD基元的Asp用Asn代替。NKXD基元属于在所有G蛋白中高度保守并且在科学文献中详细描述的G盒(G-box)基元群组。NKXD基元在Gαs中的CGN代码是N292G.S5.7、K293Gshg.1、Q294G.HG.1和D295G.HG.2。当突变Gα亚基是酵母Gpa1时，突变体优选地包括突变N338D，并且当突变Gα亚基是Gαo、Gα11或Gα12中的任何亚基时，突变体优选地包括突变D273N。
Simon和同事还发现，在Gαo中加入第二突变Q205L使Gα亚基的核苷酸特异性从鸟嘌呤核苷酸切换到黄嘌呤核苷酸62-64。这些双重突变Gα亚基(D273N/Q205L)还在生理条件下充当受体螯合显性负向突变体，其中黄嘌呤核苷酸基本上不存在。然而，当用黄嘌呤核苷酸补充时，双重突变Gα亚基重新获得其全部生物功能，从而使其成为用于研究体内G蛋白信号传导路径的有用工具。进一步地，D273N和D273N/Q205L突变体均保留其受体偶联敏感性。Gαo中的D273对应于Gαs中的Q227G.s3h2.3。因此，在进一步实施例中，本发明的第一方面的突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的Gαs的编号与Gln 227相对应的位置处具有不同氨基酸并且任选地在根据如图1列出的Gαs的编号与Asp 295相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基。当突变Gα亚基是Gαo时，突变体优选地包括突变Q205L并且任选地还包括突变D273N。
Bourne和同事设计了展现出显性负向表型65的三重突变体。G226A、E268A和A366S突变的组合产生了Gαs亚基，所述Gαs亚基将受体和βγ亚基两者高效地螯合在稳定的无核苷酸三元复合物中。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的一个或多个或所有位置相对应的位置处具有一个或多个不同氨基酸的突变Gα亚基：Gly 226、Glu 268和Ala 366。当突变Gα亚基是突变Gα亚基时，突变体优选地包括突变G226A、E268A和A366S中的一个或多个或所有突变。
Pereira和Cerione报道了开关III区的突变，所述突变产生受体螯合显性负向表型59。发现Gαt的R238E突变(嵌合体644)以核苷酸缺乏状态存在。还有报道称，突变体比其它核苷酸缺乏的Gα突变体更加热不稳定，可能是因为其采取部分活性构象59。然而，Gαs的同一突变也未能产生显性负向表型。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图27列出的Gαt亚基(嵌合体6)的编号与Arg 238相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gαt亚基(嵌合体6)。
像大多数无核苷酸Gα亚基24,25,66,67一样，这个三重突变体是热不稳定的65。因此，这些突变中的两个突变(G226A和A366S)与附加突变组合以产生更加稳定的显性负向突变体68。这里，Gαs的α3/β5环用Gαi2的相应区域代替48，如之前的章节所描述的。总共包含七个突变的这个构造据报道具有显著提高的热稳定性48。
除了显性负向突变之外，可能期望合并到本发明的第一方面的突变Gα亚基中的其它突变包括已知增大Gα针对GPCR的亲和力的突变。因此，应了解到，突变Gα亚基可以是当与亲本Gα亚基进行比较时包括已知增大Gα亚基针对GPCR的亲和力的一个或多个突变的突变Gα亚基。本领域中已知的任何这种亲和力增大的突变可以合并到本发明的突变Gα亚基中，并且下文中包括了一些具体实例。
Iverson和同事设计了两个Gαi1构造30，试图模仿α5螺旋的旋转和转位，预测所述旋转和转位是由受体结合29诱导的：首先，使二硫键在残基I56与Q333之间工程化(突变成半胱氨酸)，以诱导α5螺旋转变；其次，将正电荷引入α5螺旋的N端(D328R)，以扰乱核苷酸周围的局部静电分布。解出二硫工程化蛋白的晶体结构，从而确认二硫键的存在和α5螺旋的位置转变30。这两个突变体均展示了增大水平的核苷酸交换，并且二者均能够与视紫红质相互作用，然而，受体不能够进一步加快核苷酸交换速率30。D328R突变体还展示了与野生型Gαi1相比与视紫红质的增强的相互作用30。因此，在一个实施例中，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图25列出的Gαi1亚基的编号与Ile 56和Gln 333相对应的位置中的每个位置处具有半胱氨酸残基的突变Gα亚基。另外或可替代地，突变Gα亚基是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图25列出的Gαi1亚基的编号与Asp 328相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基。当突变Gα亚基是Gαi亚基时，优选地，突变体包括突变D328R。
Grishina和Berlot已经将Gαs的α3/β5环(即，在螺旋3与β串5之间的环)标识为可能的受体接触位点48。据报道，用来自Gαi2的相应环代替这个区域增大了β2AR的亲和力并且降低了受体催化核苷酸交换速率48。因此，在又另一个实施例中，突变Gα亚基可以是用Gαi2亚基的α3/β5环代替亲本Gα亚基的α3/β5环的突变Gαs亚基。α3/β5环包括由Gαs的氨基酸序列N271G.H3.8到I285G.h3s5.3定义的与Gαi2的K249G.H3.7到T263G.h3s5.3相对应的区域的含义。Gαs中的这个环的代替与以下突变相对应：N271K、K274D、R280K、T284D和I285T，并且因此，应了解到，突变Gα亚基可以是当与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的长同种型人Gαs亚基的编号与Asn 271、Lys 274、Arg 280、Thr 284和Ile 285中的任何一个或多个相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基。当突变Gα亚基是Gαs亚基时，优选地，突变体包括突变N271K、K274D、R280K、T284D和I285T中的一个或多个突变。
Moller和同事报道称，转导蛋白的C端区内的Cys-347的修饰防止视紫红质-转导蛋白复合物离散47。有趣的是，所使用的修饰试剂的类型似乎确定了复合物的核苷酸结合状态：Cys-347的碘乙酸(IAA)羧甲基化捕获了视紫红质-转导蛋白空袋复合物并且赋予了对鸟嘌呤核苷酸介导的解离的抗性47；2-硝基5-氰硫基甲苯酸(NTCBA)处理捕获了处于GDP结合状态的视紫红质-转导蛋白复合物47。这可能在设计MEGA结构域时是重要的，因为核苷酸结合的三元复合物可能比核苷酸耗竭的复合物更稳定。因此，在又另一个实施例中，突变Gα亚基可以是根据如图25列出的Gαt亚基的编号与Cys 347相对应的位置处的氨基酸残基被化学修饰的突变Gα亚基，任选地其中所述氨基酸残基被羧甲基化(例如，已经用IAA处理)或氰基化(例如，已经用NTCBA处理)。
亲本Gα亚基的突变体可以适合的方式产生并且以任何适合的形式提供。可以采用常规的定点诱变或者可以使用本领域中熟知的基于聚合酶链反应的过程。
亲本Gα亚基的突变体是与亲本Gα亚基的氨基酸序列相比其氨基酸序列包括缺失、氨基酸取代和/或插入中的一种或多种的突变体。虽然缺失可以是亲本Gα亚基的氨基酸序列内(即，并非是在序列的端)的缺失，但是应了解到，缺失可以是在亲本Gα亚基的氨基酸序列的N端和C端中的一者或两者处。类似地，虽然插入可以是在亲本Gα亚基的氨基酸序列内(即，并非是在序列的端)插入一个或多个(例如，2个、3个、4个或5个或更多个)氨基酸，但是在亲本Gα亚基的氨基酸序列的N端和C端中的一者或两者处的插入例如融合也包括在内。
为了避免引起怀疑，本发明的突变Gα亚基还可以是由第一Gα亚基的一个或多个部分以及第二Gα亚基的一个或多个部分组成的嵌合体。嵌合体可以用于转换一类Gα亚基(例如，Gαs)以表现得更像另一类(例如，Gq或Gi)。例如，用来自Gq的那些氨基酸代替GS的C端的最后18个氨基酸允许Gα亚基与仅与Gq偶联的受体结合。最近的体内FRET研究还表明，在α五螺旋内但在五个C端残基远端的残基强烈影响了特异性(另外参见实例5)。如实例5更加详细地解释的，发明人已经发现，在单独将Gs中标识出的突变转移到其它G蛋白类型并未成功地生成那些其它G蛋白类型的mini G蛋白的情况下，另一种方法是通过将mini-Gs的特异性转换成所期望G蛋白的特异性来形成嵌合体。因此，一旦能够在Gβ亚基和Gγ亚基不存在的情况下与GPCR结合的根据本发明的第一方面的突变Gα亚基已经产生，那么在所述突变Gα亚基是特定家族或类型的Gα亚基(例如，Gαs)的突变体的情况下，可能期望突变Gα亚基突变以进一步将突变Gα亚基的特异性转换成不同家族或类型的突变Gα亚基(例如，Gαq)的特异性。这种嵌合体的实例提供在实例5和附图中并且包括在本发明的范围内。应了解到，本文所描述的mini Gαs蛋白中的任何最小Gαs蛋白可以发生产生了实例5中标识的从Gs到Gq的特异性变化的突变中的任何突变。
通常，突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比具有至少一个突变(即，缺失、取代或插入)，比如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个突变。典型地，突变Gα亚基具有不超过25个突变，比如不超过24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个或15个突变。最典型地，突变Gα具有在5个与15个之间的突变，比如在5个与10个之间的突变(例如，在5个与9个之间的突变或在5个与8个之间的突变)。
在实施例中，突变Gα亚基包括1个或2个缺失以及至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代。典型地，突变Gα亚基不包括超过10个氨基酸取代。
优选地，突变Gα亚基包含3个缺失(例如，N端缺失、螺旋结构域中的缺失以及开关III区缺失)，但是应了解到，可以形成更少或更多缺失(例如，除了螺旋结构域中的至少一个螺旋的缺失之外，开关III区中的仅一个缺失)。
亲本Gα亚基不需要是天然发生的蛋白。方便地，亲本Gα亚基可以是能够表达在如大肠杆菌等适合的宿主生物体中的工程化版本。例如，亲本Gα亚基可以是天然发生的蛋白的截短形式(在任一或两个末端处被截短)，或者亲本Gα亚基可以是与天然发生的蛋白或到其片段的融合物。可替代地或另外，亲本Gα与天然发生的Gα相比可以被修饰以提高例如可溶性、蛋白水解稳定性(例如，通过截短、环的缺失、糖基化位点的突变或如半胱氨酸等反应氨基酸侧链的突变)。在任何情况下，亲本Gα是能够与一个或多个GPCR结合的蛋白质，所述一个或多个GPCR已知与天然发生的Gα结合。因此，突变Gα亚基和亲本Gα亚基均应与(多个)相同的GPCR结合。在已知亲本Gα亚基与超过一个GPCR结合的情况下，优选的是突变Gα亚基能够以与亲本Gα亚基可比的亲和力扩散和/或等级顺序与所述多个GPCR结合。优选地，突变Gα亚基还应与和亲本Gα亚基相同的(多个)β亚基和(多个)γ亚基结合。还优选的是突变Gα亚基与和亲本Gα亚基相同的(多个)下游效应器结合。然而，应了解，突变Gα亚基可以在如上文所讨论的嵌合体的情况下(例如，在亲本Gα亚基的特异性已经转换成所期望G蛋白的特异性的情况下)与不同于其亲本Gα亚基的GPCR结合。类似地，突变Gα亚基可以与不同于亲本Gα亚基的下游效应器结合。
方便地，突变Gα亚基被适合的核酸分子编码并且表达在适合的宿主细胞中。可以使用本领域中熟知的标准克隆技术、定点诱变和PCR来进行适合核酸分子对突变Gα亚基的编码。适合的表达系统包括细菌或酵母中的组成型或诱导型表达系统、如杆状病毒、塞姆利基森林病毒和慢病毒等病毒表达系统、或者昆虫或哺乳动物细胞中的瞬时转染。适合的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、乳酸乳球菌细胞、酿酒酵母细胞、粟酒裂殖酵母细胞、毕赤酵母细胞、草地贪夜蛾细胞和粉纹夜蛾细胞。适合的动物宿主细胞包括HEK293、COS、S2、CHO、NSO、DT40等等。已知的是，一些Gα亚基需要特异性脂质来起作用。在这一情况下，期望选择执行脂化反应的宿主细胞。另外或可替代地，可以使用分离和纯化突变Gα亚基期间的纯化组分来执行反应。因此，应了解，可以脂化本发明的第一方面的突变Gα亚基。例如，已知Gα共价联接到Gly2和Cys3上的棕榈酰基，并且因此，突变Gα亚基可被棕榈酰基脂化。这可能是液晶相结晶化所期望的或在Gα亚基待在全细胞测定中研究时所期望的。然而，在其它实施例中，本发明的第一方面的突变Gα亚基未脂化，这可能优选用于洗涤剂溶液、药物筛选、结合研究(例如，表面等离子共振)等中的结构研究。
用于克隆和工程化基因和cDNA、用于使DNA发生突变以及用于表达宿主细胞中的多核苷酸的多肽的分子生物学方法在本领域中是熟知的，如通过引用并入本文中的以下项所例证的：《分子克隆实验手册(Molecular cloning,a laboratory manual)》第三版，Sambrook，J.和Russell，D.W.(编)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。
方便地，本发明的突变Gα亚基包括：可检测部分，比如亲和标签(例如，组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白标签、GST标签、HA标签、FLAG标签)；或直接可检测标记(比如荧光团、放射性同位素、造影剂或发光标记)；或间接可检测标记(比如酶、酶底物、抗体、抗体片段、抗原、半抗原、配体、亲和分子、显色底物、蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和脂质)。可检测标记的实例包括绿色荧光蛋白(GFP)，并且因此应了解到，本发明包括GFP与本发明的突变Gα亚基之间的融合蛋白。实例5和图36中描述了这种融合蛋白的实例。应了解到，突变Gα亚基还可以包括切割位点例如以实现纯化期间可检测部分的移除。可以使用本领域中已知的任何适合的切割位点。实例是烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点。
本发明的第二方面提供一种亲本异源三聚体G蛋白α(Gα)亚基的突变体，所述突变体(i)能够在异源三聚体G蛋白β(Gβ)亚基和异源三聚体G蛋白γ(Gγ)亚基不存在的情况下与GPCR结合；并且(ii)在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的任何一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个)位置相对应的位置处具有不同氨基酸：Val 36、His 41、Ala 48、Gly 49、Glu 50、Met 60、Leu 63、Leu 197、Cys 200、Arg 201、Phe 208、Asn 218、Gly 226、Glu 230、Ala 249、Ser 252、Leu 272、Ile 372和Val 375。
对可能存在于本发明的第二方面的突变Gα亚基中的附加突变的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面所描述的那些。
因此，突变Gα亚基可以进一步包括如上文中关于本发明的第一方面所描述的螺旋结构域、开关I区、开关II区和开关III区的一个或多个缺失。
对突变(例如，缺失、插入和取代)的数目的优选选择也如上文中关于本发明的第一方面所定义的。突变Gα亚基可以包含仅一个缺失(例如，在开关III区中)。
例如，突变Gα亚基可以具有5个到20个或5个到25个氨基酸残基长度的N端截短、开关III区的缺失、以及在根据如图1列出的长同种型人Gα-s的编号与以下位置中的任何一个或多个(例如，至少2个、3个、4个或5个)位置相对应的位置处的不同氨基酸：His 41、Leu197、Cys 200、Ala 249和Leu 272，任选地其中亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋也是缺失的。
突变Gα亚基的特别优选的N端截短是缺失如图29所示的氨基酸残基Ile/LeuHN43的所有N端氨基酸残基的N端截短。例如，在突变Gα亚基是突变Gαs亚基时，所述缺失对应于缺失根据如图29所示出的人Gαs的编号与人Gαs的前25个氨基酸相对应的前25个氨基酸。
在另一个实例中，突变Gα亚基可以具有5个到20个或5个到25个氨基酸残基长度的N端截短、开关III区的缺失、以及在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的任何一个或多个(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个)位置相对应的位置处的不同氨基酸：Gly 49、Glu 50、Leu 63、Ala 249、Ser 252、Leu 272、Ile 372和Val 375，任选地其中亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋也是缺失的。例如，突变Gα亚基可以在根据如图1列出的长同种型人Gαs的编号的以下位置中的任何位置处具有不同氨基酸：Gly49、Glu 50、Ala 249、Ser 252、Leu 272、Ile 372和Val 375。
本发明的第二方面的突变Gα亚基还可以包括一个或多个显性负向突变和/或已知增大Gα蛋白与GPCR之间的亲和力的一个或多个突变，如上文中关于本发明的第一方面所描述的。
如实例所示，发明人已经标识出与其亲本Gα亚基相比在变性条件下具有增大稳定性的突变Gα亚基。因此，还应了解到，本发明考虑了包括本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基的组合物的产生，其特征在于，突变Gα暴露于去稳定条件。这种组合物具有各种应用，例如，用于结晶化、药物筛选、生物测定和生物传感器应用。因此，本发明还提供一种组合物，所述组合物包括本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基，其特征在于，所述突变Gα暴露于对于以比所述突变Gα亚基更大的程度去稳定所述亲本Gα有效的去稳定条件。
“去稳定条件”包括能够将Gα蛋白群的平衡从细胞中的折叠天然状态转变到展开状态的任何条件。以此方式，以展开状态存在的Gα蛋白的比例增大并且在细胞中以折叠天然状态存在的比例减小。从折叠状态到展开状态的这个结构变化导致了Gα蛋白群的结构的可检测变化。而且，这个结构变化会导致Gα蛋白群的生物活性的可检测减小。因此，在一个实施例中，去稳定条件是对于与在去稳定条件不存在的情况下的Gα蛋白群的结构相比引起所述群的结构的显著扰动有效的条件。
“Gα亚基群的结构的显著扰动”意指当相对于用于检测扰动的测量的统计变化进行评估时将会在10次测量中偶然出现少于1次的扰动，更加优选地20次测量中1次且甚至更加优选地50次测量中1次或100次测量中1次。
用于探测蛋白质结构的各种方法在本领域中是已知的并且任何适合的方法均可使用。例如，可以通过例如用共价附连的荧光标记或esr自旋标记来直接探测构象或通过测量蛋白质内天然的或有意引入的氨基酸侧链的可及性来测定结构扰动(Hubbell，W.L.等人，《蛋白质化学进展(Adv.Protein.Chem.)》第63卷，第243到290页(2003年)；Baneres，J.L.等人，《生物化学期刊(J.Biol.Chem.)》第280卷，第20253到20260页(2005年)；Kobilka，B.K.和Deupi，X.《药理科学趋势(Trends.Pharmacol.Sci.)》第28卷，第397到406页(2007年))。蛋白水解稳定性、通过质谱法或核磁共振波谱法测得的氘/氢交换、蓝色天然凝胶、毛细管区电泳法、圆二色(CD)或线性二色(LD)谱和光散射也可以用于测量二级和三级结构的构象变化。类似地，可以如上文中关于本发明的第一方面所描述的那样使用用于评估Gα活性的任何适合方法。
本发明的第三方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸对根据本发明的第一或第二方面的突变Gα亚基进行编码。多核苷酸可以是DNA或者多核苷酸可以是RNA。典型地，多核苷酸包括在载体中，比如可以用于表达所述突变Gα亚基的载体。适合的载体是在细菌或哺乳动物或昆虫细胞中传播和/或允许表达在所述细胞中的载体。本发明还包括包含对突变Gα亚基进行编码的多核苷酸的细胞，比如诸如细菌或真核细胞等宿主细胞。适合的细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
对本发明的突变Gα亚基进行编码的多核苷酸的实例提供在图26中并且具有SEQID No:46-90中列出的多核苷酸序列。因此，在一个实施例中，本发明的第三方面的多核苷酸与SEQ ID No:46-90中的任何项的多核苷酸序列具有至少20％的序列一致性，比如至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。优选地，多核苷酸包括SEQ ID No:46-90中的任何项的多核苷酸序列。
本发明的第四方面提供一种复合物，所述复合物包括：(i)根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或其能够与GPCR结合的部分；以及(ii)GPCR或其能够与本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基结合的部分。
对突变Gα亚基的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面和第二方面描述的那些。优选的是突变Gα亚基是与SEQ ID No:1-45中的任何项的氨基酸序列具有至少20％的序列一致性的突变Gα亚基，比如至少30％、40％、50％、60％或70％的序列一致性，且更加优选地至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。优选地，突变Gα亚基是包括图26中的与SEQ ID No:1-45相对应的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的突变Gα亚基。优选的是突变Gα亚基是与图29、图35、图36、图37、图38和图40中的任何附图中的氨基酸序列中的任何氨基酸序列具有至少20％的序列一致性的突变Gα亚基，例如，至少30％、40％、50％、60％或70％的序列一致性，且更优选地至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。优选地，突变Gα亚基是包括图29、图35、图36、图37、图38和图40中的任何附图中的氨基酸序列中的任何一个氨基酸序列的突变Gα亚基。
应了解到，复合物可以包括突变Gα亚基的能够与GPCR结合的部分，比如能够如上所述与GPCR在功能上结合的部分。对Gα亚基与GPCR之间的结合的评估是本领域中的标准实践并且包括上述那些方法。通常，所述部分的长度为至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸。
GPCR包括GPCR超家族内的所有7-TMR。用于实践本发明的适合的GPCR包括但不限于腺苷受体特别是腺苷A2A受体(基因名称：ADORA2A)、蕈毒硷受体、血清素受体(例如，5HT2C；基因名称：HTR2C)、β-肾上腺素受体(例如，βAR-1；基因名称：ADRB1)、神经降压素受体(NTS1；基因名称：NTSR1)和食欲素受体(例如，OX2；基因名称：HTR2C)。另外，国际药理学联合会(International Union of Pharmacology)制作了GPCR列表(通过引用并入本文中的Foord等人(2005年)《药理学综述(Pharmacol.Rev.)》第57卷，第279到288页，并且这个列表在http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward处定期更新)。应注意，人有超过800个GPCR，所述GPCR主要基于其氨基酸序列相似性而被分成不同的类别，例如，A类、B类、C类、D类、E类和F类，例如，类视紫红质受体(A类)、分泌素受体(B类)、代谢型谷氨酸/信息素受体(C类)和卷曲/平滑受体(F类)(Fredriksson等人(2003年)《分子药理学(MolPharmacol)》第63卷：第1256到1272页)。GPCR还通过引用其结合的天然配体而被分成各个家族。所有GPCR和特别是已知与G蛋白偶联的GPCR包括在本发明的范围内。因此，GPCR可以是以下受体中的任何受体：腺苷受体、β-肾上腺素受体、神经降压素受体、蕈毒硷酸受体、5-羟色胺受体、肾上腺素受体、过敏毒素受体、血管紧张素受体、apelin受体、蛙皮素受体、血管舒缓激肽受体、大麻素受体、趋化因子受体、缩胆囊素受体、多巴胺受体、内皮素受体、游离脂肪酸受体、胆汁酸受体、甘丙肽受体、胃动素受体、胃饥饿素受体、糖蛋白激素受体、GnRH受体、组胺受体、KiSS1衍生肽受体、白三烯和脂氧素受体、溶血磷脂受体、黑色素浓缩激素受体、黑皮质素受体、褪黑素受体、神经介素U受体、神经肽受体、N-甲酰肽家族受体、烟酸受体、阿片受体、类视蛋白受体、食欲素受体、P2Y受体、肽P518受体、血小板活化因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽受体、前列腺素受体、蛋白酶活化受体、松弛素受体、生长抑素受体、SPC/LPC受体、速激肽受体、跟踪氨基受体(trace amino receptor)、促甲状腺素释放激素受体、尿紧张素受体、后叶加压素/催产素受体、孤独GPCR、降血钙素受体、促肾上腺皮质激素释放因子受体、胰高血糖素受体(例如，类胰高血糖素肽1受体；GLP1R)、甲状旁腺受体、VIP/PACAP受体、LNB7TM受体、GABA受体、代谢型谷氨酸受体、钙传感器受体(参见通过引用并入本文中的Foord等人(2005年)《药理学综述(Pharmacol.Rev.)》第57卷，第279到288页，表1)。
应了解到，复合物可以包括GPCR的能够与突变Gα亚基结合的部分，比如如上所述能够与Gα亚基在功能上结合的部分。所述部分可以包括GPCR的仅跨膜部分。通常，所述部分的长度为至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸。
许多GPCR的氨基酸序列(和对所述氨基酸序列进行编码的cDNA的核苷酸序列)是容易获得的，例如，通过参考GenBank。具体地说，Foord等人同上给出了来自Entrez基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)的人基因符号以及人、小鼠和大鼠基因ID。还应注意，因为人基因组的序列是基本上完整的，因此人GPCR的氨基酸序列可以从其推导出来。
虽然GPCR可以衍生自任何源，但特别优选的是Gα来自真核源。特别优选的是GPCR衍生自如哺乳动物或鸟类等脊椎动物源。特别优选的是GPCR衍生自大鼠、小鼠、兔或狗或非人灵长类动物或人或者衍生自鸡或火鸡。为了避免引起怀疑，“衍生自”包括以下含义：cDNA或基因最初是使用来自源的遗传物质得到的，但是蛋白质随后可以表达在任何宿主细胞中。因此，很明显，真核GPCR(如鸟类或哺乳动物GPCR)可以表达在原核宿主细胞如大肠杆菌中，但视情况而定可被视为是鸟类或哺乳动物衍生的。
在一些情况下，GPCR可由超过一个不同的亚基组成。例如，降血钙素相关受体需要单个跨膜螺旋蛋白(RAMP1)的结合来获取其生理配体结合特性。与GPCR组合以形成或调节功能复合物的效应器、辅助物、助剂或GPCR相互作用蛋白是本领域中熟知的并且包括例如受体激酶、G蛋白和抑制蛋白(Bockaert等人(2004年)《药物发现与开发时论(Curr OpinionDrug Discov and Dev)》第7卷，第649到657页)。
如上文所概括的，认为GPCR以与如激动剂和拮抗剂等不同药理学类配体相关联的多个不同构象存在，并且在不同构象之间循环以便起作用(Kenakin T.(1997年)《纽约科学院年报(Ann N Y Acad Sci)》第812卷，第116到125页)。因此，在一个实施例中，GPCR是以特定构象状态如激动剂构象或拮抗剂构象驻留的GPCR。例如，GPCR可以是在变性条件下、在特定构象(例如，激动剂或拮抗剂构象)下与其亲本GPCR在变性条件下在同一特定构象下的稳定性相比具有增大稳定性的突变GPCR。这种稳定突变GPCR的实例以及用于形成其的方法在本领域中是熟知的，并且参考WO 2008/114020、WO 2009/071914、WO 2009/081136和WO2010/149964。另外或可替代地，为了促进突变Gα亚基与特定构象的GPCR之间的复合物的形成，GPCR可以暴露于已知稳定所述构象的试剂。稳定激动剂构象的这种试剂的实例包括上文中关于本发明的第一方面所描述的那些，比如纳米抗体。
应了解到，一旦本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基与GPCR形成复合物，GPCR将会采取其G蛋白结合状态，即，GPCR的跨膜螺旋6的细胞质末端移动远离受体的核心或更多的状态，比如至少或
应了解到，可能方便的是可检测地标记突变Gα亚基或GPCR中的一个或其它或其部分以促进对其结合的检测。适合标记的实例包括肽标记、核酸标记(Kerr等人(1993年)，JACS，第115卷，第2529到2531页；以及Brenner和Lerner(1992)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第89卷，第5381到5383页)、化学标记(Ohlmeyer等人(1993年)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第90卷，第109222到10926页；以及Maclean等人(1997)《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，第94卷，第2805到2810页)；荧光标记(Yamashita和Weinstock(SmithKline Beecham公司)，WO 95/32425(1995年)；以及Sebestyen等人(1993年)《肽学报1992年第22届欧洲肽研讨会会议纪要(Pept.Proc.Eur.Pept.Symp.22nd 1992)》，第63到64页)、或射频标签(Nicolaou等人(1995)《应用化学(英文国际版)(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》，第34卷，第2289到2291页；以及Moran等人(1995年)，JACS，第117卷，第10787到10788页)。还可以使用上文中关于本发明的第一方面所描述的可检测部分中的任何可检测部分。
考虑到配体结合袋的映射对于设计用于调节GPCR活性的药物而言非常重要，可能期望复合物进一步包括GPCR配体。包括配体还会有助于稳定GPCR的特定构象如激动剂构象或拮抗剂构象。
典型地，配体是完全激动剂并且能够与GPCR结合并且能够引起例如通过G蛋白偶联、下游信号传导事件或如血管舒张等生理输出测得的完全(100％)生物响应。配体还可以是部分激动剂并且能够与GPCR结合并且能够引起部分(＜100％)生物响应。
配体还可以是反向激动剂，所述反向激动剂是与受体结合并且降低其基础(即，未受到激动剂刺激的)活性有时甚至降到零的分子。
配体还可以是拮抗剂，所述拮抗剂是与受体结合并且阻断激动剂的结合因此防止生物响应的分子。反向激动剂和部分激动剂在某些测定条件下可以是拮抗剂。
以上配体可以是正构的，正构包括配体和与内源性激动剂相同的位点组合的含义；或者配体可以是变构的或异位的，变构或异位包括配体和与正构位点不同的位点组合的含义。以上配体可以是邻位的(syntopic)，邻位包括配体与相同或重叠位点处的(多个)其它配体相互作用的含义。配体可以是可逆的或不可逆的。
用于本发明的配体还可以是变构调节剂如正变构调节剂、增效剂、负变构调节剂和抑制剂。配体可以凭借自身的能力具有如激动剂或反向激动剂的活性，或者配体可以在激动剂或反向激动剂存在的情况下具有活性，在这一情况下，配体与这种分子组合使用以与GPCR结合。
通过引用并入本文中的Neubig等人(2003年)《药理学综述(Pharmacol.Rev.)》55，第597到606页描述了各类配体。
配体可以是小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体中的任何项。
优选地，虽然配体是小有机或无机部分，但是其可以是肽或多肽。典型地，当配体是小有机或有机部分时，其具有从50到2000的Mr，比如从100到1000，例如，从100到500。
典型地，配体以mM到pM的Kd与GPCR结合，比如在从μM(微摩尔)到nM的范围内。通常，优选具有最低Kd的配体。
小有机分子配体在本领域中是熟知的，例如参见下文中的实例。其它小分子配体包括：在5HT1A受体处是完全激动剂的5HT；在5HT1A受体处是部分激动剂的依托拉嗪(参见Newman-Tancredi等人(1997年)《神经病学(Neurophamacology)》，第36卷，第451到459页)；(+)-布他拉莫和螺旋哌丁苯是多巴胺D2受体反向激动剂(参见Roberts和Strange(2005年)《英国药理学期刊(Br.J.Pharmacol.)》，第145卷，第34到42页)；并且WIN55212-3是CB2的中性拮抗剂(Savinainen等人(2005年)《英国药理学期刊(Br.J.Pharmacol.)》，第145卷，第636到645页)。
配体可以是拟肽、核酸、肽核酸(PNA)或适体。配体可以是如Na+或Zn2+等离子、如油酰胺等脂质、或如肝素等碳水化合物。
配体可以是与GPCR结合的多肽。虽然这种多肽(包括寡肽)典型地是从Mr 500到Mr50,000，但是可以更大。多肽可以是天然发生的GPCR相互作用蛋白或与GPCR相互作用的其它蛋白或其衍生物或片段，条件是其以特定构象与GPCR选择性地结合。GPCR相互作用蛋白包括与信号传导相关联的那些蛋白以及与运输相关联的那些蛋白，所述蛋白常常经由GPCR的C端部分中的PDZ结构域起作用。
已知结合某些GPCR的多肽包括以下项中的任何项：G蛋白、抑制蛋白、RGS蛋白、G蛋白受体激酶、RAMP、14-3-3蛋白、NSF、旁血小板溶蛋白(periplakin)、树突棘素(spinophilin)、GPCR激酶、受体酪氨酸激酶、离子通道或其亚基、锚蛋白和Shanks或Homer蛋白。其它多肽包括NMDA受体亚基NR1或NR2a、calcyon或纤连蛋白结构域框架。多肽可以是与GPCR的胞外结构域结合的多肽如腓骨蛋白-1。多肽可以是与异源寡聚体中的所选GPCR结合的另一个GPCR。GPCR处的蛋白-蛋白相互作用的综述见于通过引用并入本文中的Milligan和White(2001年)《药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.)》，第22卷，第513到518页或Bockaert等人(2004年)《药物发现开发时论(Curr.Opinion Drug Discov.Dev.)》，第7卷，第649到657页。
多肽配体可以方便地是与GPCR结合的抗体。术语“抗体”包括天然发生的抗体、单克隆抗体或其片段。我们还包括在其结合特性方面类抗体的工程化抗体和分子，包括单链Fv(scFv)分子和结构域抗体(dAb)。还应注意骆驼科动物抗体和工程化骆驼科动物抗体。结合GPCR的这种分子在本领域中是已知的并且在任何情况下可以使用熟知技术形成。适合的抗体包括目前用于GPCR的放射免疫测定(RIA)的抗体，因为其倾向于识别出构象表位。
多肽还可以是基于分子框架的结合蛋白，比如锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、富含亮氨酸蛋白、四三肽(tetratriopeptide)重复蛋白或者设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)或者基于质钙蛋白或纤连蛋白结构域的蛋白或者基于人γ结晶或人泛素的Affilin支架。
在本发明的一个实施例中，配体共价连结到GPCR，比如G蛋白或抑制蛋白融合蛋白。一些GPCR(例如，凝血酶受体)被蛋白酶在N端切割并且新的N端与激动剂位点结合。因此，这种GPCR是天然GPCR-配体融合物。
应了解到，使用抗体或其它“通用”结合多肽(比如已知与许多不同GPCR偶联的G蛋白)可能对其天然配体和小分子配体未知的“孤独”GPCR特别有利。
在本发明的第四方面的实施例中，复合物进一步包括G蛋白β亚基或G蛋白γ亚基或G蛋白βγ亚基。存在五个β亚基(Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4、Gβ5)和12个γ亚基(Gγ1、Gγ2、Gγ3、Gγ4、Gγ5、Gγ7、Gγ8、Gγ9、Gγ10、Gγ11、Gγ12、Gγ13)，所述亚基可能会以一个Gβ亚基和一个Gγ亚基的任何组合成为二聚体，并且这些二聚体中的任何二聚体可能会结合任何Gα亚基。文献中有许多关于有利组合的报道，特别是关于结合不同GPCR(例如，Gαsβ1γ2有利地结合β2AR，Gαsβ2γ7或Gαsβ4γ5有利地结合A2A)，并且因此，对于给定的Gα或GPCR，技术人员将能够标识出优选的β和/或γ亚基结合配偶体。G蛋白α、β和γ亚基之间的结合常常通过其它因子来调控，比如组织特异性表达或膜定位。在体内，任何组合都是可能的。许多Gβ亚基和Gγ亚基的氨基酸序列(和对其进行编码的cDNA的核苷酸序列)是容易获得的，例如通过参考GenBank。
在实施例中，复合物进一步包括核苷酸。例如，复合物可以包括如GDP或GTP等鸟嘌呤核苷酸或黄嘌呤核苷酸。核苷酸可以是天然发生的或合成的核苷酸的衍生物，比如GTPγS或GppNp。因此，应了解到，复合物可以包括核苷酸和配体。熟知的是，镁离子对于核苷酸结合可能较为重要，并且因此在进一步实施例中，复合物进一步包括镁离子。例如，复合物可以包括镁离子或核苷酸。
方便地，复合物通过以下方式产生：分别表达突变Gα亚基或其部分和GPCR或其部分以及在适合于复合物形成的条件下、在表达之后一起添加这两种蛋白质。可替代地，可以使用标准分子生物技术使细胞工程化以表达或过量表达突变Gα亚基和GPCR，从而使得GPCR/突变Gα亚基可以从细胞中恢复。因此，应了解到，本发明还提供一种能够对以下项进行编码的多核苷酸或表达载体：(i)根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或其能够与GPCR结合的部分；以及(ii)GPCR或其能够与根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基结合的部分。多核苷酸或表达载体可以将(i)和(ii)表达为不同的多肽，或者(i)和(ii)可以是同一多肽链的一部分，即，(i)和(ii)可以表达为融合多肽。
优选地，GPCR/突变Gα亚基复合物是可溶的。典型地，蛋白质在大肠杆菌中或在昆虫细胞中制造并且通过对其加标签来纯化，例如，用6x His标签以及使用镍珠来分离重组蛋白。例如，典型地，使用杆状病毒表达系统，突变Gα亚基表达在大肠杆菌中并且GPCR表达在昆虫细胞中。类似地，蛋白质的不同表位标签版本可以表达在细胞中或从所述细胞纯化。典型地，将核苷酸、配体和/或镁离子中的任何项添加到分离或纯化的复合物中并且在允许核苷酸、配体和/或镁离子与复合物结合的条件下孵育。
如根据实例显而易见的，本发明的第四方面的复合物适于晶体化，并且因此，应了解到，本发明还以结晶形式提供本发明的第四方面的复合物。具体地说，实例4描述了G蛋白(miniG 414)结合的腺苷A2a受体在其激动剂(NECA)结合形式下的结构，并且因此，在优选实施例中，复合物是包括腺苷A2a和突变Gα亚基miniG 414的结晶复合物。
本文所公开的突变Gα亚基和组合物可用于结晶化研究并且可用于药物发现项目。突变Gα亚基和组合物可以用于例如通过基于表面等离子共振或荧光的技术来对受体/配体动力学和热力学参数进行生物物理测量。突变Gα亚基和组合物可以用于配体结合筛选并且可以与固体表面偶联以用于高通量筛选或用作生物传感器芯片。包含突变Gα亚基或复合物的生物传感器芯片可以用于检测分子，尤其是生物分子。下文中提供了这种方法和用途的进一步细节。
本发明提供本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物，所述突变Gα亚基或所述复合物呈溶解形式(例如，在用洗涤剂进行水性溶解之后)和/或所述突变Gα亚基或所述复合物基本上没有其它蛋白质。优选地，突变Gα亚基或复合物在溶解时仍处于其天然折叠状态，或者以天然折叠状态存在的突变Gα亚基或包含所述突变Gα亚基的复合物的群的比例大于亲本Gα亚基或包含所述亲本Gα亚基的复合物的群的比例。优选地，突变Gα亚基或包括突变Gα亚基/GPCR的复合物保持其结构完整性并且呈功能形式(例如，所述突变Gα亚基或所述复合物能够结合配体或其天然结合配偶体(例如，G蛋白或GPCR))。
本发明提供本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物，所述突变Gα亚基或所述复合物被固定到固体支持物。类似地，本发明提供一种固体支持物，根据本发明的第一方面或第二方面的一个或多个突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物被固定到所述固体支持物。例如，固体支持物可以包括具有(例如，2个或更多个，比如5个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、96个或更多个或者100个或更多个)突变Gα亚基或突变Gα亚基/GPCR复合物的阵列。阵列内的突变Gα亚基和/或GPCR的一致性相同或不同。这种固体支持物可用于结合筛选并且可用作生物传感器。
本发明提供一种本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物用于结晶化的用途。
本发明提供一种本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物用于药物发现的用途。
本发明提供一种本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物用于配体结合筛选或用于测定开发的用途。
本发明提供一种本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物用作生物传感器的用途。在优选实施例中，生物传感器是可以用于测量体内配体水平的生物传感器。
本发明的第五方面提供一种产生GPCR-Gα亚基复合物的晶体的方法，所述方法包括：
(i)提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基、GPCR和任选地GPCR配体；
(ii)形成所述突变Gα亚基、所述GPCR和任选地所述GPCR配体的复合物；以及(iii)使所述复合物结晶化以形成晶体。
对突变Gα亚基和GPCR的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面、第二方面和第四方面所描述的。应了解到，步骤(i)和(ii)可以包括：提供根据本发明的第四方面的复合物。
任何适合的结晶化方法可以用于使融合蛋白晶体化，比如通过引用并入本文中的“生物大分子晶体化(Crystallisation of Biological Macromolecules)”(AlexanderMcPherson；ISBN：0-87969-617-6)中综述的那些结晶化方法中的任何结晶化方法。优选地，使用如实例中概括的蒸汽扩散法来实施晶体化。
方便地，GPCR在与突变Gα亚基复合时以特定构象(例如，激动剂构象)结晶化，并且因此，应了解到，方法可以进一步包括：使GPCR与已知稳定期望构象的试剂相接触，如适当配体(激动剂或拮抗剂)或如上所述其它试剂(例如，纳米抗体)。如下文所描述的，晶体可以用于例如使用X射线晶体学来解出复合物的结构。
本发明的第六方面提供一种确定特定构象(例如，激动剂构象)下的GPCR的结构的方法，所述方法包括：提供本发明的第四方面的复合物以及确定所述复合物的结构。
蛋白质的结构包括蛋白质的一级、二级、三级和适用时四级结构。确定如本文所使用的结构包括确定蛋白质的原子布置或原子坐标的含义，并且常常通过如X射线晶体学等生物物理学方法进行。
在实施例中，GPCR-Gα亚基以结晶形式提供并且复合物的晶体结构是例如通过如X射线晶体学等生物物理学方法确定的。X射线晶体学在本领域中是熟知的。简要描述的X射线衍射图案可以通过从晶体衍射出X射线来获得。衍射数据用于计算包括晶体的晶胞(unitcell)的电子密度图；图用于建立原子在晶胞内的位置(即，原子坐标)。因此，方法可以进一步包括：从晶体获得原子坐标。在替代性实施例中，确定复合物的NMR结构。在又替代性实施例中，通过低温电子显微镜法来确定结构。
本发明的第七方面提供一种选择亲本异源三聚体Gα亚基的突变体的方法，所述突变体能够在所述亲本异源三聚体G蛋白的β和γ亚基不存在的情况下与GPCR偶联，所述方法包括：
(a)在所述亲本异源三聚体G蛋白的β和γ亚基不存在的情况下提供亲本异源三聚体Gα亚基的一个或多个突变体；
(b)提供GPCR；以及
(c)确定所述或每个突变Gα亚基是否能够与所述GPCR结合，并且选择能够与所述GPCR结合的那些突变体。
对突变Gα亚基、如何形成突变Gα亚基以及GPCRs的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面所描述的那些。因此，突变体是包括选自缺失、插入和取代的一个或多个突变的突变体。典型地，突变Gα亚基缺少螺旋结构域的至少一个螺旋。方便地，GPCR是在变性条件下、在特定构象下与其亲本GPCR在变性条件下、在同一特定构象下的稳定性相比具有增大稳定性的GPCR。
上文中关于本发明的第一方面还描述了用于评估突变Gα亚基与GPCR的结合的方法。
优选的是步骤(c)包括：确定所述或每个Gα亚基是否能够与GPCR在功能上结合(或‘偶联’)以及选择能够与GPCR结合的那些突变体。
方便地，步骤(c)包括：确定所述或每个突变Gα亚基是否在与GPCR结合时增大GPCR针对激动剂的亲和力，或者确定所述或每个Gα亚基是否在与GPCR结合时活化。可替代地，步骤(c)可以包括：确定所述或每个突变Gα亚基是否在与GPCR结合时减小GPCR针对拮抗剂的亲和力，或者确定所述或每个Gα亚基是否在与GPCR结合时活化。
应了解到，步骤(c)可以包括上文中关于本发明的第一方面所描述的用于评估突变Gα亚基是否与GPCR在功能上结合或偶联的测定中的任何一个或多个测定，即(i)激动剂亲和力转变测定、(ii)热稳定性测定、(iii)荧光检测尺寸排阻色谱法(FSEC)、(iv)基于荧光的饱和结合分析和(v)尺寸排阻色谱法(SEC)。
发明人已经发现，本发明的一些突变Gα亚基使GPCR以特定构象稳定，并且应了解到，可能期望选择这种突变体。因此，本发明的第五方面的方法可以进一步包括：确定所述或每个突变Gα亚基是否能够在与GPCR结合时稳定GPCR的特定构象(例如，激动剂构象)；以及选择能够这样做的这种突变体。用于测试特定构象的稳定性的适合方法在本领域中是熟知的并且包括上文中和WO 2008/114020中描述的那些方法。简要地，突变Gα亚基和GPCR的复合物可以经受变性条件(在配体存在或不存在的情况下)，并且评估了复合物中的GPCR能够在经受变性条件之后与配体结合的程度。
在实施例中，在步骤(c)之前，GPCR暴露于能够稳定特定构象的试剂。适合的试剂在本领域中是已知的并且包括配体(例如，激动剂)或如上所述其它试剂(例如，抗体、纳米抗体或其功能模仿天然激动剂的功能的其它试剂)。
突变Gα亚基和/或GPCR以溶解形式方便地提供，其中突变Gα亚基和/或GPCR保持结构完整性并且呈功能形式(例如，能够结合其对应的结合配偶体，比如Gα的GPCR或者GPCR的配体或G蛋白)。使用适当的溶解系统如适合的洗涤剂(或其它两亲试剂)和缓冲剂系统，所述溶解系统可被本领域技术人员选择成对特定蛋白质有效。可以使用的典型洗涤剂包括例如十二烷基麦芽糖苷(DDM)或CHAPS或辛基葡糖苷(OG)或许多其它洗涤剂。可能方便的是包括其它组分如胆固醇半琥珀酸酯或胆固醇本身或庚烷-1,2,3,-三醇。丙三醇、脯氨酸或甜菜碱的存在可能有用。
典型地，突变Gα亚基和/或GPCR以粗提取物(例如，具有来自如大肠杆菌或哺乳动物细胞等宿主细胞的膜级分，突变Gα亚基和/或GPCR表达在所述宿主细胞中)提供。突变Gα亚基和/或GPCR以典型地包括存在于样本中的蛋白质的至少75％更典型地至少80％或85％或90％或95％或98％或99％的形式提供。当然，突变Gα亚基和/或GPCR如上文所讨论的典型地溶解，并且因此突变Gα亚基和/或GPCR通常与洗涤剂分子和/或脂质分子相关联。
在一个实施例中，本发明的第七方面的方法进一步包括：确定突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比在变性条件下是否具有增大稳定性和/或确定当表达在细胞中时突变Gα亚基是否以比其亲本Gα亚基高的水平进行表达。这种突变Gα亚基更易于以实验方式控制并且因此优选的是方法选择这种突变体。上文和实例中描述了用于评估稳定性和表达水平的适合方法。应注意，一些突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比可以更低的水平表达和/或在变性条件下更不稳定；然而，当突变Gα亚基与GPCR复合时，复合物在变性条件下比包括亲本Gα亚基的相应复合物更稳定。因此，应了解到，确定突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比在变性条件下是否具有增大稳定性的步骤可以包括：在突变Gα亚基与GPCR复合时确定所述稳定性。
本发明的第八方面提供一种用于产生亲本异源三聚体Gα亚基的突变体的方法，所述突变体能够在所述亲本异源三聚体G蛋白的β和γ亚基不存在的情况下与GPCR偶联，所述方法包括：
(a)实施本发明的第七方面所述的方法，
(b)标识所述一个或多个突变Gα亚基中的所述突变(例如，缺失、插入和/或取代)的所述一个或多个位置，所述一个或多个突变Gα亚基是针对增大稳定性选择的，以及(c)合成突变Gα亚基，所述突变Gα亚基包含所标识的所述位置中的一个或多个位置处的突变(例如，缺失、插入和/或取代)。
本发明提供一种突变Gα亚基，所述突变Gα亚基可通过本发明的第八方面所述的方法获得。
如实例所示出，发明人已经发现，本发明的突变Gα亚基可以在Gα亚基与GPCR结合时稳定GPCR的特定构象。因此，本发明的第九方面提供一种将稳定特定构象下的GPCR的方法，所述方法包括：
(a)提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基和靶GPCR，以及
(b)形成所述突变Gα亚基和所述GPCR的复合物，其中所述GPCR以特定构象稳定。
对突变Gα亚基的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面或第二方面所描述的那些。靶GPCR可以是任何适合的GPCR，并且优选地是属于与已知和Gα亚基结合的GPCR相同的GPCR种类或家族的GPCR，并且更加优选地是已知与Gα亚基结合的GPCR。适当的GPCR的实例如上文所提及的。
方便地，突变Gα亚基被固定到固体支持物上。
典型地，靶GPCR被提供为包含处于多个构象状态的GPCR的溶液。因此，方法可以包括以下步骤：
(i)向包括一个或多个固定突变Gα亚基的固体支持物施加包含处于多个构象状态的GPCR的溶液，
(ii)形成所述一个或多个突变Gα亚基和所述GPCR的复合物，以及
(iii)移除弱结合或未结合的分子，其中GPCR以特定构象捕获。以此方式，应了解到，本发明的第九方面的方法可被视为捕获处于特定构象状态的GPCR的方法。
在实施例中，方法进一步包括：纯化复合物。
本发明的第十方面提供一种选择具有增大稳定性的GPCR的方法，所述方法包括：
(a)提供亲本GPCR的一个或多个突变体和根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基，
(b)选择配体，所述配体是在所述GPCR以特定构象驻留时与所述亲本GPCR结合的配体，
(c)确定与所述亲本GPCR关于结合所选配体或关于结合所述突变Gα亚基的稳定性相比，所述或每个突变GPCR是否关于结合所述配体或关于结合所述突变Gα亚基具有增大稳定性，以及
(d)选择与所述亲本GPCR相比关于结合所选配体或关于结合所述突变Gα亚基具有增大稳定性的那些突变体，其中步骤(c)中所述GPCR驻留的所述特定构象与步骤(b)中选择的配体的种类相对应。
亲本GPCR的突变体可以任何适合的方式产生并且可以任何适合的形式提供。因此，例如，可以形成亲本蛋白质的一系列特异性突变体，其中亲本蛋白质的所有或一部分中的每个氨基酸残基非依赖性地改变成另一个氨基酸残基。例如，可能方便的是蛋白质的预测膜自旋的那些部分发生突变。因此，方便地，GPCR的待突变部分可以是基于建模。类似地，基于疏水性对GPCR的跨膜区进行建模的计算机程序是可获得的(Kyle和Dolittle(1982年)《分子生物学期刊(J.Mol.Biol.)》，第157卷，第105到132页)，并且在选择蛋白质的待突变部分时可以使用这种模型。可以采用常规的定点诱变或者可以使用本领域中熟知的基于聚合酶链反应的过程。可能但不期望使用核糖体展示法来选择突变蛋白。
虽然每个所选氨基酸典型地被Ala代替(即，Ala扫描诱变)，但是所述氨基酸可被任何其它氨基酸代替。如果所选氨基酸是Ala，则其可方便地被Leu代替。可替代地，氨基酸可被Gly代替(即，Gly扫描诱变)，这可以允许相邻螺旋更紧密填装，所述更紧密填装可以将蛋白质锁定在特定构象。如果所选氨基酸是Gly，则其可方便地被Ala代替。
可替代地，突变体可以通过无规诱变过程产生，所述无规诱变过程可能属于整个蛋白质或其所选部分。无规诱变过程在本领域中是熟知的。
方便地，突变GPCR与亲本蛋白相比具有一个代替氨基酸(即，突变GPCR在一个氨基酸位置处突变)。以此方式，可以评估对单个氨基酸代替的稳定性的贡献。然而，与亲本蛋白质相比，测定了稳定性的突变GCPR可以具有超过一个代替氨基酸，比如至少2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或9个或10个或11个或12个代替。
亲本GPCR不需要是天然发生的蛋白。方便地，亲本GPCR可以是能够表达在如大肠杆菌等适合的宿主生物体中的工程化版本。亲本GPCR可以是天然发生的蛋白的截短形式(在任一或两个末端处被截短)，或者亲本GPCR可以是与天然发生的蛋白或其片段的融合物。可替代地或另外，亲本GPCR与天然发生的GPCR相比可以被修饰以提高例如可溶性、蛋白水解稳定性(例如，通过截短、环的缺失、糖基化位点的突变或如半胱氨酸等反应氨基酸侧链的突变)。在任何情况下，亲本GPCR是能够与所选配体结合的蛋白质，所述配体是已知与天然发生的GPCR结合的配体。方便地，亲本GPCR是在添加适当配体时可以影响通常已知受G蛋白活化影响的下游活性中的任何一种或多种活性的亲本GPCR。然而，应了解到，突变体的稳定性应与亲本进行比较以便能够评估稳定性的增大。
典型地，特定构象是激动剂构象并且因此所选配体是激动剂。给定GPCR的激动剂配体的实例在本领域中是已知的并且包括上文和实例中所描述的那些。
考虑到GPCR在与突变Gα亚基结合时是稳定的，应了解到，特定构象(例如，激动剂构象)将会是具有G蛋白结合构象特性的特定构象(例如，激动剂构象)。例如，构象可以是GPCR的跨膜螺旋6的细胞质末端移动远离受体的核心或更多的构象，比如至少或
突变Gα亚基和/或突变GPCR以溶解形式方便地提供，其中突变Gα亚基和/或突变GPCR保持结构完整性并且呈功能形式，如上文中例如关于本发明的第七方面所描述的。然而，应了解到，突变GPCR可以提供在含膜组合物中(即，驻留在脂质膜中)、与所选配体和突变Gα亚基接触，并且然后膜例如用洗涤剂溶解。
一旦配体已经选择，则确定所述或每个突变GPCR关于结合所选配体或关于结合突变Gα亚基与亲本GPCR关于结合所述配体或突变Gα亚基相比是否具有增大稳定性。应了解到，这个步骤(c)是确定所述或每个突变GPCR针对由所选配体确定的特定构象是否具有增大稳定性(与其亲本相比)的步骤。因此，突变GPCR如通过配体结合测得的关于结合所选配体或在结合所选配体的同时具有增大稳定性，或如通过突变Gα亚基结合测得的关于结合突变Gα亚基或在结合突变Gα亚基的同时具有增大稳定性。如下文所讨论的，特别优选的是增大稳定性是在结合所选配体的同时评估的。
增大稳定性是在强制条件下通过突变体的延长寿命测得的，所述强制条件可能导致不稳定(比如热、粗糙的洗涤剂条件、离液剂等等)。强制条件下的去稳定性典型地是通过测量结构的变性或损失来确定的。如下文所讨论的，这个去稳定性可以表现为配体结合能力的损失或Gα亚基结合能力的损失或者二级或三级结构指示剂的损失。
当使用与所选配体的结合来确定增大稳定性时，存在可以用于确定突变GPCR的稳定性的不同测定格式。
在一个实施例中，突变GPCR可以在经受确定突变体的稳定性的过程之前与配体接触(突变GPCR和配体在测试期间保持接触)。因此，例如，当方法用于选择以一个构象与配体结合并且具有提高的热稳定性的突变GPCR时，受体在加热之前与配体接触，并且然后与亲本受体相比，在加热之后与受体结合的配体的量可以用于表达热稳定性。这提供了对在暴露于变性条件(例如，热)之后保留配体结合能力的GPCR的量的测量，所述测量进而是对稳定性的指示。
在替代性(但不太优选的)实施例中，突变GPCR经受突变体的稳定性在与配体接触之前确定的过程。因此，例如，当方法用于选择以一个构象与配体结合并且具有提高的热稳定性的突变膜受体时，受体在与配体接触之前先加热，并且然后与受体结合的配体的量可以用于表达热稳定性。再次，这提供对在暴露于变性条件之后保留配体结合能力的GPCR的量的测量。
当使用与突变Gα亚基结合来确定增大稳定性时，应了解到，突变GPCR和突变Gα亚基可以在经受确定突变体的稳定性的过程之前与配体相接触(突变GPCR和配体在测试期间保持接触)。
在所有实施例中，应了解到，突变体的稳定性的比较是参考亲本分子在相同条件下进行的。
应了解到，在这些实施例中的所有实施例中，所选突变体是在以特定构象驻留时与亲本蛋白相比具有增大稳定性的突变体。实例4中给出了本发明的第十方面的实例。
优选地，选择在如以下项等变性条件下具有增大稳定性的突变GPCR：热、洗涤剂、离液剂或pH极值中的任何一种或多种。
用于评估变性条件下的稳定性的方法包括上文中关于本发明的第一方面所描述的那些并且还描述在WO 2008/114020中。
方便地，当使用配体或突变Gα亚基结合来测定GPCR时(即，用于确定GPCR是否处于非变性状态)，配体或突变Gα亚基被可检测地标记，例如，被放射性标记或荧光标记。
从上文应了解到，本发明包括一种用于选择具有增大稳定性的突变GPCR的方法，所述方法包括：(a)提供亲本GPCR的一个或多个突变体，其中所述一个或多个突变体驻留在含膜组合物中；(b)使所述一个或多个突变体与接合所述亲本GPCR的所选配体(例如，激动剂)以及与根据本发明的第一方面或第二方面的亲本Gα亚基接触；(c)溶解所述含膜组合物；(d)通过在特定温度下且在特定时间之后测量所述突变GPCR结合所选所述配体(例如，激动剂)的能力或与所述突变Gα亚基结合的能力来确定与所述亲本GPCR相比在所述配体(例如，激动剂)存在时亲本GPCR的所述或每个突变体是否具有增大热稳定性；以及(d)选择与所述亲本GPCR相比在相同条件下、在所述特定温度下且在所述特定时间之后结合所选所述配体(例如，激动剂)更多的那些突变GPCR。在步骤(d)中，典型地使用特定温度下的固定时间段来测量突变GPCR结合所选所述配体(例如，激动剂)或突变Gα亚基的能力。在步骤(d)中，典型地选择温度和时间，亲本GPCR对所选配体(例如，激动剂)或突变Gα亚基的结合在所述温度下、在固定时间段期间减少50％(这指示，受体的50％灭活；“准”Tm)。
应了解到，可能期望标识出稳定根据本发明的第四方面的GPCR/Gα亚基组合物的进一步试剂。因此，方法还提供一种标识增大根据本发明的第四方面的复合物在变性条件下的稳定性的一个或多个试剂的方法，所述方法包括：提供根据本发明的第四方面的复合物；使所述复合物与候选试剂接触；以及在变性条件下确定所述候选试剂对根据本发明的第四方面的所述复合物的稳定性的影响。候选试剂可以包括核苷酸、磷酸类似物或镁离子。
本发明的第十一方面提供一种用于制备突变GPCR的方法，所述方法包括：
(a)实施本发明的第十方面所述的方法；
(b)标识所述一个或多个突变GPCR中的所述一个或多个突变氨基酸残基的所述一个或多个位置，所述一个或多个突变GPCR是针对增大稳定性选择的，以及
(c)合成突变GPCR，所述突变GPCR包含所标识的所述位置中的一个或多个位置处的代替氨基酸。
本发明提供一种突变GPCR，所述突变GPCR可通过本发明的第十一方面所述的方法获得。
MEGA结构域也可以是使用结构法和非结构法两者进行片段文库筛选的有价值工具。因此，本发明的第十二方面提供一种标识GPCR的结合配偶体的方法，所述方法包括：
a)提供根据本发明的第四方面的复合物；
b)提供一种或多种测试化合物；
c)确定所述或每种测试化合物是否与所述复合物结合；以及
d)分离与所述复合物结合的一种或多种测试化合物。
对根据本发明的第四方面的复合物的优选选择包括如上所述那些。
存在有力证据表明，一旦三元G蛋白-GPCR复合物形成，配体就可以在不使复合物解离的情况下从结合袋中移除：对无核苷酸视紫红质-转导蛋白复合物的羟胺处理使视紫红质与视黄醛之间的Schiff基键发生水解，从而导致视黄醛肟释放14。因此，在实施例中，步骤(a)所提供的复合物不包含GPCR配体。然而，应了解到，在其它实施例中，使配体结合例如以用于标识其它结合配偶体而非调节配体结合可以是有用的。
在一个实施例中，复合物可以提供在全细胞制品、细胞膜片段中、在洗涤剂中溶解，或者复合物可以合并到脂单层、脂双层、珠联脂颗粒、另一个固体支持脂层或脂蛋白体中。
发明人认识到，通过将膜固定到可以排列或以其它方式多路传输的珠或表面上来促进高通量膜-复合物筛选。典型地，膜复合物与脂质以脂蛋白体形式一起安置在表面上。复合物的洗涤剂溶解形式可以是部分纯或高纯制品。通过提高的稳定性以及溶解条件的优化实现的纯化赋予了移除外部“粘性”抗原和脂质以及如例如噬菌体可以粘附的碳水化合物等其它细胞表面物质的优势。
应了解到，如本领域中熟知的，复合物的GPCR和/或突变Gα亚基可以工程化成包括C端或N端处的分子标签。标签可以是FLAG标签、His标签、c-Myc标签、DDDDK标签、HSV标签、Halo标签或生物素标签中的任何标签。这种标签可以用于在解出时促进基于噬菌体的选择方案并且还可以用于赋予与固体支持物的结合。
突变Gα亚基和/或突变GPCR在洗涤剂和溶解缓冲剂以及添加剂范围内的增大稳定性使其特别好地固定到固体表面上。因此，在一个实施例中，复合物被固定到固体支持物上。各个支持物在本领域中是已知的并且包括例如珠、柱、载玻片、芯片或板。固定可以是经由共价或非共价相互作用。
通过引用并入本文中的WO 2009/081136中提供了用于筛选GPCR的结合配偶体的各种格式，并且可以使用任何这种格式。
测试化合物可以提供为生物样本。具体地说，样本可以是从个体得到的任何适合样本。例如，样本可以是液体样本如血液、血清、等离子体或脊髓液。可替代地，样本可以是组织或细胞提取物。
在一个实施例中，所述一种或多种测试化合物是多肽。例如，测试化合物可以是已知与某些GPCR或Gα亚基结合的特定类型的多肽，但是是在期望识别出构象特异性多肽的情况下。可替代地，多肽可以是候选治疗性分子，例如，anticalin(Skerra《生物技术期刊(JBiotechnol)》(2001年)第74卷(第4期)：第257到275页)。
在一个实施例中，所述一种或多种测试化合物是肽。
在一个实施例中，所述一种或多种测试化合物是亲合体、拟肽、核酸、肽核酸(PNA)或适体或者脂质或碳水化合物。
在一个实施例中，所述一种或多种测试化合物是基于分子框架的结合蛋白，比如锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、富含亮氨酸蛋白、四三肽重复蛋白、或设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、或基于脂钙蛋白或纤连蛋白结构域的蛋白、或基于人γ结晶或人泛素的Affilin支架。
在一个实施例中，所述一种或多种测试化合物是小分子，例如，小于5000道尔顿的分子，或者所述一种或多种测试化合物是天然产物。
在一个实施例中，所述一种或多种测试化合物是抗体。例如，测试化合物可以是针对突变Gα亚基、GPCR或突变Gα亚基/GPCR复合物产生的抗体。
如本文所使用的，术语“抗体”包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。这种片段包括保留其针对以下项的结合活性的完整抗体的片段：靶物质、Fv片段、F(ab')片段和F(ab')2片段以及抗体的基因工程化衍生物如单链抗体(scFv)、融合抗体、结构域抗体(dAb)和二抗体。例如，应了解到，重组DNA技术可以用于产生保留原抗体的结合特异性的进一步抗体或嵌合分子。这种技术可能涉及将对抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDR)进行编码的DNA融合到不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，如例如在EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400中所描述的。而且，产生抗体的杂交瘤或其它细胞可以经受可以或可以不改变所产生抗体的结合特异性的基因突变或其它变化。因此，由于抗体可以多种方式修饰，因此术语“抗体”应解释为涵盖具有带所需特异性的结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，术语包括抗体片段、衍生物、功能等价物和抗体的同系物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是全部或部分合成的。因此包括包含免疫球蛋白结合结构域的嵌合分子或融合到另一种多肽的等价物。此外，如本领域所熟知的，抗体和其片段可以是人或人源化抗体。
本领域中已知的各个过程可以用于针对突变Gα亚基、GPCR或突变Gα亚基/GPCR复合物或者针对其片段或融合物产生抗体。例如，体内和体外免疫均包括在内。
应了解到，在一些情况下，优选测试化合物的高通量筛选并且方法可以用作本领域技术人员熟知的术语“文库筛选”法。因此，测试化合物可以是测试化合物文库。例如，文库可以是例如通过核糖体展示产生的肽或蛋白文库或在体内、离体或体外制备的抗体文库。用于制备和筛选这种文库的方法在本领域中是已知的。方便地，方法用于片段文库筛选，例如使用生物物理学方法或晶体浸渍技术。
本发明包括用于标识用于治疗疾病或病状的药物或先导化合物的筛选法。应了解到，特别优选的是能够进行高通量操作的筛选测定。
应了解到，在本文所描述的可以是本领域技术人员熟知的术语药物筛选法的方法中，测试化合物可以是类药化合物或用于开发类药化合物的先导化合物。因此，在一个实施例中，方法进一步包括：修饰已被示出为与复合物结合的测试化合物；以及确定所修饰测试化合物是否与复合物结合。
各种方法可以用于确定突变Gα亚基/GPCR复合物与测试化合物之间的结合，包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子共振测定、基于芯片的测定、免疫细胞荧光、酵母双杂交技术和噬菌体展示。检测测试化合物与复合物之间的结合的其它方法包括：用离子喷雾质谱法/HPLC法或其它物理或分析方法进行超滤。可以使用例如本领域技术人员所熟知的荧光共振能量转移(FRET)法，其中可以通过测量两个荧光标记实体在彼此非常接近时的相互作用来测量荧光标记的结合。通过引用并入本文中的WO 2009/081136中描述了进一步方法。
生成针对突变Gα亚基/GPCR复合物具有高亲和力特异性的结合配偶体的能力将会促进治疗性结合配偶体产生。因此，应了解到，除了建立与复合物的结合之外，还将期望确定结合配偶体对复合物的功能影响。因此，在方法的实施例中，方法进一步包括：确定结合配偶体是否影响其结合的复合物的功能以及分离影响复合物的功能的测试化合物。
例如，在一个实施例中，确定结合配偶体是否改变复合物中的GPCR与其配体的结合。例如，结合配偶体可以是正或负变构调节剂。
在另一个实施例中，确定结合配偶体是否调节GPCR或突变Gα亚基的活化。例如，结合配偶体可以是属于正或负变构调节剂的GPCR配体。在这个测定中，复合物表达在全细胞中，例如，在哺乳动物或昆虫细胞中，其中允许复合物与熟知的GPCR信号转导通路偶联(Eglen R.M.，用于一级和二级筛选的功能G蛋白偶联受体测定(Functional G protein-coupled receptor assays for primary and secondary screening)，《组合化学及高通量筛选(Comb Chem High Throughput Screen)》2005年6月，第8卷(第4期)：第311到318页)，并且对通过这种通路进行的信号传导进行评估。上文中关于本发明的第一方面提供了这种测定的进一步细节。
在一个实施例中，所述方法进一步包括：
(i)确定所述或每个测试化合物是否与根据本发明的第四方面的不同复合物结合；以及
(ii)分离未与根据本发明的第四方面的所述不同复合物结合的所述或每个测试化合物。
以此方式，应了解到，方法可以用于标识调节特异性GPCR-Gα亚基对的活性但不调节其它信号传导级联中的受体和Gα亚基两者的结合配偶体。不同复合物包括以下含义：含有与方法的步骤(a)所提供的复合物内所包含的Gα亚基和/或GPCR不同的Gα亚基(例如，属于不同种类或同种型)和/或GPCR的复合物。例如，不同复合物可以包括与本发明的第十二方面的方法的步骤(a)的复合物中的Gα亚基的种类不同的种类的Gα亚基和/或与本发明的第十二方面的方法的步骤(a)的复合物中的GPCR不同的GPCR。
结合配偶体可以结合的特异性界面的实例包括：人腺苷A2a受体的Arg 102(3.50)、Ala 105(3.53)、Ile 106(3.54)、Arg 107(3.55)、Pro 109、Leu 110、Arg 111、Tyr112、Ile 200(5.61)、Ala 203(5.64)、Q 207(5.67)、Leu 208(5.68)、Q 210(5.70)、Lys 227(6.29)、Ala 231(6.33)、Leu 235(6.37)、Arg 291(7.56)、Ile 292(H7与H8之间的环)、Arg293(H8)和Arg 296(H8)(括号中为Ballesteros-Weinstein编号)以及人Gs的His41(s1.2)、Asp 215(s2s3.1)、Val 217(s3.1)、Phe 376(h5.8)、Cys 379(h5.11)、Arg 380(h5.12)、Asp381(h513)、Ile 383(h5.15)、Gln 384(h5.16)、Arg 385(h5.17)、His 387(h5.19)、Leu 388(h5.20)、Gln 390(h5.22)、Tyr 391(h5.23)、Glu 392(h5.24)、Leu 393(h5.25)、Leu 394(h5.26)。使用B-W和CGN系统，可以确定其它GPCR和Gα亚基中的相应残基。
本发明的第十三方面提供一种标识Gα亚基的结合配偶体的方法，所述方法包括：
a)提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基；
b)提供一种或多种测试化合物；
c)确定所述或每种测试化合物是否与所述突变Gα亚基结合；以及
d)分离与所述突变Gα亚基结合的一种或多种测试化合物。
对突变Gα亚基的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面所提及的那些，并且对方法的测试化合物和测定格式/步骤的优选选择包括上文中关于本发明的第十二方面所描述的那些。
本发明的第十四方面提供一种抗体，所述抗体与本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物选择性地结合。还包括对这种抗体进行编码的多核苷酸。
抗体的实例包括上文中关于本发明的第十二方面描述的那些。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是抗体片段如ScFv或上述那些抗体片段中的任何抗体片段。形成抗体的方法在本领域中是熟知的。例如，为了产生多克隆抗体，可以通过用免疫原进行一次或多次注射来免疫各种适合的宿主动物(例如，兔、山羊、鸡、小鼠或其它哺乳动物)。针对免疫原蛋白的多克隆抗体分子可以从哺乳动物(例如，从血清或蛋黄)分离并且通过主要提供免疫血清的IgG级分的熟知技术进一步纯化，比如使用蛋白A或蛋白G的亲和力色谱法。单克隆抗体可以使用杂交瘤法来制备，比如Kohler和Milstein，《自然(Nature)》，第256卷：第495页(1975年)所描述的那些。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物典型地用免疫剂免疫以引发产生或能够产生将会与免疫剂特异性地结合的抗体的淋巴细胞。
应了解到，针对复合物的抗体可以有助于在变性条件下稳定复合物。而且，针对复合物的抗体可以具有治疗价值，因为所述抗体比针对GPCR/配体复合物单独产生的抗体更有可能使受体活化。
本发明的第十五方面提供一种评估G蛋白与GPCR之间的结合的方法，所述方法包括：提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基以及GPCR；以及评估所述突变Gα亚基与所述GPCR之间的结合。
对突变Gα亚基的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面或第二方面所描述的那些。如上所述，可以使用任何适合的GPCR。
用于评估突变Gα亚基与GPCR之间的结合的方法在本领域中是熟知的并且包括上述那些方法，例如，用于评估如本发明的第一方面和第十二方面所描述的蛋白结合的方法。
在实施例中，方法包括：评估突变Gα亚基与GPCR之间的功能结合或偶联。再次，用于这样做的适合方法描述在上文中。
方便地，突变Gα亚基和GPCR中的一者或两者被可检测地标记，比如被荧光标记。可以使用FRET。
在一个实施例中，突变Gα亚基和GPCR提供在细胞内，任选地其中在体内或体外实施方法。
本发明的第十六方面提供一种评估试剂对G蛋白与GPCR之间的偶联的影响的方法，所述方法包括：提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基；以及评估所述试剂对所述突变Gα亚基与所述GPCR之间的偶联的影响。
对测定的优选选择包括上文中关于本发明的第五方面所提及的那些。正如本发明的第十五方面，被评估的结合可以是功能结合或偶联。应了解到，这个方法可以用于标识对Gα亚基与GPCR之间的相互作用或偶联有正面或负面影响的试剂。例如，根据测定生成的信号的减小将会指示抑制复合物形成的试剂。通常，将会在试剂存在和不存在的情况下实施方法，使得可以评估试剂对相互作用的影响。
本发明的第十七方面提供一种用于选择或设计GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物的一个或多个结合配偶体的方法，所述方法包括：
(a)提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物的三维结构表示，
(b)使用分子建模法来选择或设计所述GPCR、所述G蛋白或所述GPCR-G蛋白复合物的一个或多个结合配偶体，其中将所述突变Gα亚基或所述复合物的至少一部分的所述三维结构表示与一个或多个候选结合配偶体的三维结构表示进行比较，并且选择预测与所述GPCR、所述G蛋白或所述GPCR-G蛋白复合物相互作用的一个或多个结合配偶体。
‘三维结构表示’包括计算机生成的表示或物理表示。典型地，表示是计算机生成的。计算机表示可以通过可商购软件程序来生成或展示。软件程序的实例包括但不限于通过引用并入本文中的QUANTA(Accelrys公司，《2001和2002年版权(COPYRIGHT.2001,2002)》)，O(Jones等人，《晶体学学报(Acta Crystallogr.)》，A47，第110到119页(1991年))和RIBBONS(Carson，《应用晶体学期刊(J.Appl.Crystallogr.)》，第24卷，第9589到9961页(1991年))。
“结合配偶体”意指与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物结合的任何分子。优选地，分子与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物选择性地结合。例如，优选的是结合配偶体具有比至少一个其它GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物低至少五倍或十倍的Kd值(解离常数)，且优选地低超过100倍或500倍。
结合配偶体可以是以下项中的任何项：小分子(例如，具有小于5000道尔顿的分子量，例如，小于4000道尔顿、3000道尔顿、2000道尔顿、1000道尔顿或500道尔顿)；多肽；anticalin；肽；抗体；嵌合抗体；单链抗体；适体；darpin；Fab、F(ab')2、Fv、ScFv或dAb抗体片段；小分子；天然产物；亲合体；拟肽；核酸；肽核酸分子；脂质；碳水化合物；基于分子框架的蛋白，包括锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、富含亮氨酸蛋白、四三肽重复蛋白或设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)；基于脂钙蛋白或纤连蛋白结构域的蛋白、或基于人γ结晶或人泛素的Affilin支架；G蛋白；RGS蛋白；抑制蛋白；GPCR激酶；受体酪氨酸激酶；RAMP；NSF；GPCR；NMDA受体亚基NR1或NR2a；calcyon；或者与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物结合的片段或其衍生物。
用于选择或设计结合配偶体以及用于使用分子建模的方法在本领域中是熟知的并且描述在例如WO 2008/068534中。例如，根据本发明可以采用的分子建模技术包括例如N.C.Cohen等人，“药物化学分子建模软件及方法(Molecular Modeling Software andMethods for Medicinal Chemistry)”，《药物化学期刊(J.Med.Chem.)》，第33卷，第883到894页(1990年)；另外参见M.A.Navia和M.A.Murcko，“关于药物设计的结构信息的使用(TheUse of Structural Information in Drug Design)”，《结构生物学时论(CurrentOpinions in Structural Biology)》，第2卷，第202到210页(1992年)；L.M.Balbes等人，“计算机辅助药物设计的现代方法视角(A Perspective of Modern Methods inComputer-Aided Drug Design)”，《计算化学综述(Reviews in ComputationalChemistry)》，第5卷，K.B.Lipkowitz和D.B.Boyd编，VCH，纽约，第337到380页(1994年)；另外参见W.C.Guida，“基于结构的药物设计软件(Software For Structure-Based DrugDesign)”，《结构生物学时论(Curr.Opin.Struct.Biology)》，第4卷，第777到781页(1994年)。
通常可以通过两种方式来实现对结合配偶体的设计：通过结合配偶体的逐步组装或通过结合配偶体的重新合成。另外，其它基于计算机的方法可用于选择结合配偶体。因此，应了解到，方法可以用于片段筛选、生物物理筛选方法和对DNA编码文库进行筛选。
本发明的第十八方面提供一种用于分析一个或多个结合配偶体与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物的相互作用的方法，所述方法包括：
(a)提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物的三维结构表示，
(b)提供欲与所述突变Gα亚基或所述复合物的结构或所述结构的一部分拟合的一个或多个结合配偶体的的三维结构表示；以及
(c)将所述一个或多个结合配偶体与所述结构拟合。
“拟合”意指通过自动或半自动方法来确定候选结合配偶体的一个或多个原子与本发明的GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物结构的至少一个原子之间的相互作用并且计算这种相互作用稳定的程度。相互作用包括由电荷、空间、亲脂性考虑等等引起的吸引和排斥。这种类型的电荷和空间相互作用可以计算方式建模。这种计算的实例将会是经由如Amber等力场(Cornell等人，“模拟蛋白、核酸和有机分子的第二代力场(A SecondGeneration Force Field for the Simulation of Proteins,Nucleic Acids,andOrganic Molecules)”，《美国化学学会期刊(Journal of the American ChemicalSociety)》，(1995年)，第117卷(第19期)，第5179到5197页)，所述力场将会为蛋白和结合配偶体上的原子分配部分电荷并且使用库伦势来估计蛋白质与结合配偶体原子之间的静电相互作用能量。Amber力场将会分配范德华力(van der Waals)能量术语来评估两个原子之间的吸引和排斥相互作用。可以使用各种方法来对亲脂性相互作用进行建模。评估对配体结合的疏水性贡献的其它方法是可用的并且这些对本领域技术人员而言将会是已知的。评估相互作用的其它方法是可用的并且对如上所述设计分子领域的技术人员而言将会是已知的。用于拟合的各种基于计算机的方法在本领域中是已知的并且在WO2008/068534中进行描述。
在本发明的第十七方面或第十八方面的实施例中，根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物的三维结构表示是如下获得的：提供根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基或根据本发明的第四方面的复合物；以及确定突变Gα亚基或复合物的三维结构表示。
在本发明的第十七方面或第十八方面的实施例中，方法可以进一步包括：改进所述一个或多个结合配偶体的结构表示以增大或减小其与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物的相互作用。
本发明的第十九方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基、根据本发明的第四方面的复合物或根据本发明的第十四方面的抗体。
本发明还提供用于药物的根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基、根据本发明的第四方面的复合物或根据本发明的第十四方面的抗体。
应了解到，根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基、根据本发明的第四方面的复合物或根据本发明的第十四方面的抗体中的任何项可以具有对抗与异常G蛋白信号传导(例如，上调的G蛋白信号传导)相关联的疾病或病状的治疗价值。与异常G蛋白信号传导(例如，上调的G蛋白信号传导)相关联的疾病或病状包括以下含义：通过异常G蛋白信号传导(例如，上调的G蛋白信号传导)来介导病理的至少一部分的任何生物或医学病状或病症。病状可能是由不想要的细胞的存在引起的，或者不想要的细胞的存在可能是病状的效应。这种疾病在本领域中是熟知的并且可以通过查阅科学文献来标识。这种病状的实例是癌症。对抗疾病或病状包括以下含义：减少或减轻患者的症状(即，姑息使用)、防止症状恶化或发展、治疗病症(例如，通过抑制或消除致病物)、或预防没有病状或病症的受试者产生所述病状或病症。
因此，本发明还提供用于对抗与异常G蛋白信号传导(例如，上调的G蛋白信号传导)相关联的疾病或病状的根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基、根据本发明的第四方面的复合物、或根据本发明的第十四方面的抗体。优选地，疾病或病状是癌症。
关于本发明的第四方面的复合物，应了解到，这可能可以用作高亲和力诱饵受体来肃清过量配体，并且因此，下调不适当的高G蛋白响应可能是有用的。
尽管本发明的突变Gα亚基、复合物或抗体可能单独给药，但是优选的是其与一种或多种可接受的载体一起作为药物配制品呈现。(多种)载体必须在与治疗剂相容且对于其接受者无害的意义上是“可接受的”。典型地，载体将会是将无菌且无热原的水或盐水。
在适当的情况下，配制品可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过配药学领域所熟知的任何方法来制备。这种方法包括使活性成分(用于治疗或预防用不想要的细胞表征的病状的试剂)与构成一种或多种辅助成分的载体相关联的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地关联以及然后在必要时使产品成形来制备配制品。
适合于口服给药的根据本发明的配制品可以离散单位呈现，如各自含有预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂；以粉剂或颗粒剂呈现；以水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液呈现；或以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂呈现。活性成分还可以大丸剂、药糖剂或糊剂呈现。
优选的单位剂量配制品是含有活性成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的那些。
应理解，关于正在讨论的配制品的类型，除上文特别提及的成分之外，本发明的配制品可以包括在本领域中常规的其它试剂，例如，适合于口服给药的那些可以包括调味剂。
给予个体的本发明的突变Gα亚基、复合物或抗体的量是在对于对抗特定个体的病状有效的量。量可以由医师确定。
优选地，在本文所描述的任何医学用途的上下文中，有待治疗的受试者是人。可替代地，受试者可以是动物，例如，家养动物(例如，狗或猫)、实验室动物(例如，实验室啮齿动物如小鼠、大鼠或兔)或在农业上重要的动物(即，家畜)例如马、牛、绵羊或山羊。
本发明的第二十方面提供一种多部分试剂盒，所述多部分试剂盒包括：(i)根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基；以及(ii)GPCR或其能够与根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基结合的部分。应了解到，本发明还包括一种多部分试剂盒，所述多部分试剂盒包括：(i)对根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基进行编码的多核苷酸；以及(ii)对GPCR或其能够与根据本发明的第一方面或第二方面的突变Gα亚基结合的部分进行编码的多核苷酸。
对突变Gα亚基、GPCR和对其进行编码的多核苷酸的优选选择包括上文中关于本发明的第一方面、第二方面、第三方面和第四方面所概括的那些。
方便地，所述多部分试剂盒中的(i)和(ii)中的一者或两者被可检测地标记。
在实施例中，所述试剂盒进一步包括GPCR配体，所述GPCR配体的适合实例包括上文所提及的那些配体中的任何配体。例如，所述GPCR配体可以是小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体中的任何项。
在进一步实施例中，所述多部分试剂盒进一步包括G蛋白β亚基和/或G蛋白γ亚基。再次，G蛋白βγ亚基的适合实例描述在上文中。例如，试剂盒可以包括五个β亚基中的任何β亚基和/或12个γ亚基中的任何γ亚基。在具体实例中，试剂盒可以包括β1和/或γ2。
在又进一步实施例中，所述多部分试剂盒进一步包括核苷酸，任选地其中所述核苷酸是如GDP或GTP等鸟嘌呤核苷酸，或任选地其中所述核苷酸是黄嘌呤核苷酸。其它可能核苷酸包括上文中关于本发明的其它方面所提及的那些(例如，GTPγS或GppNp)。
现在，将参考以下附图和实例来描述本发明。
图1.mini-Gs氨基酸序列与人Gα序列的比对。用灰色突出显示的氨基酸缺失和取代对于可以在β和γ亚基不存在的情况下起作用的最小GTP酶结构域的产生至关重要。正如螺旋结构域的缺失一样，结晶化需要N端缺失。为清楚起见，所有编号使用完整人GNASL序列(1-394)的编号，但是mini-Gs仅包含229个氨基酸残基。
图2.β1AR构造的饱和结合数据。(a)3H-二氢阿普洛尔(3H-DHA)与β1AR-WT结合的解离常数(Kd)为5.0nM±0.6nM。(b)3H-DHA与β1AR-84结合的Kd为20nM±3nM。数据表示三个独立试验的平均值±SEM。所示曲线来自一式两份地执行的代表性实验。
图3.使用竞争性结合测定来测量G蛋白与膜嵌入式β1AR的偶联。
(a)为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT+Nb80(Ki为5.8nM±0.8nM，n＝2)；(ii)β1AR-WT+Gs-Nb35(Ki为6.8nM±0.6nM，n＝2)；(iii)β1AR-WT+Gs(Ki为17nM±2nM，n＝2)；(iv)β1AR-WT(40nM±0nM，n＝2)。
(b)为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+Gs-Nb35(Ki为16nM±4nM，n＝3)；(i)β1AR-84+Nb80(Ki为28nM±1nM，n＝2)；(iii)β1AR-84+Gs(Ki为271nM±54nM，n＝2)；(iv)β1AR-84(2.6μM±0.3μM，n＝2)。
(c)在20℃下执行的实验。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+Mini Gs77–βγ–Nb35(Ki为3.6nM±0.8nM，n＝2)；(ii)β1AR-84+Mini Gs77(Ki为1.9μM±0.2μM，n＝3)；(iii)β1AR-84(Ki为2.6μM±0.3μM，n＝15)。
(d)在4℃下执行的实验。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+Mini Gs77–βγ–Nb35(Ki为10nM，n＝2)；(ii)β1AR-84+Mini Gs77(Ki为117nM，n＝2)；(iii)β1AR-84(Ki为2.1μM±0.2μM，n＝12)。
图4.β2AR-WT–Gs复合物10的晶体结构。(a)异源三聚体Gs由α亚基、β亚基和γ亚基组成并且通过Nb35以GPCR结合构象稳定。(b)仅来自Gs的25KDa GαGTP酶结构域与β1AR-WT形成显著的相互作用。
图5.对mini Gs77纯化的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。(1)分子量标志物；(2)mini Gs77；(3)25ng BSA；(4)50ng BSA；(5)100ng BSA；(6)250ngBSA；(7)500ng BSA；(8)1μg BSA；(9)2.5μg BSA。Mini Gs77(用箭头指示)以大约200μg每升大肠杆菌培养物的产率以及大约百分之10到百分之20的纯度被部分纯化。
图6.用于稳定mini Gs的突变设计。(a)Gαs81(深灰色)和Arl-298(浅灰色)的结构比对。Gαs GTP酶结构域以的RMSD与Arl-2比对，但是共享仅百分之25的序列一致性(使用Dali服务器19确定)。(b)Gαs(深灰色)和Arl-2(浅灰色)的核苷酸结合袋之间的比对。突变成与Arl-2中的相应残基(G49D、E50N、A249D和S252D)相匹配的Mini Gs残基被示出为棒状物并加下划线。突变可能相互作用的残基被示出为棒状物。(c)位于α3螺旋内的Leu-272突变成天冬氨酸的允许与N端开关II区中的带电荷和极性残基簇(227到233)进行可能的相互作用。(d)Gαs在其GTP结合(深灰色)和GPCR结合(浅灰色)构象下的比对。在GPCR结合构象下，Ile-372(α5螺旋)与Met-60和His-64(α1螺旋)在空间上位阻，从而阻止α1螺旋针对GαGTP酶结构域的核心紧密填装。(e)V375I突变(使用PyMol的突变功能来建模)被设计成增大GαGTP酶结构域的核心与其GPCR结合构象下的α5螺旋之间的疏水接触。与Val-375相互作用的残基被示出为棒状物，预测由异亮氨酸突变的δ-碳(*)形成的附加接触(小于)被展示为虚线。附图是使用PyMOL(PyMOL分子制图系统，7.4版，LLC)制备的。
图7.使用激动剂去甲肾上腺素进行的β1AR-WT竞争性结合测定。测定是在用于热稳定性测定的相同缓冲剂条件下执行的。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT+Gs-Nb35(Ki为0.36nM±0.02nM，n＝2)；(ii)β1AR-WT+Nb80(Ki为0.70nM±0.11nM，n＝2)；(iii)β1AR-WT(Ki为158nM±6nM，n＝2)。
图8.mini Gs393的序列。组氨酸标签(由CACCACCATCATCACCAT编码的HHHHHH)用深灰色来突出显示，TEV蛋白酶切割位点用浅灰色来突出显示(由GAAAATCTTTATTTCCAGGGT编码的ENLYFQG)，并且用于代替GαAH结构域的连接子用灰色来突出显示(由GGTGGGAGTGGCGGGAGCGGAGGT编码的GGSGGSGG)。突变以粗体示出并且加下划线。使用NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)限制位点将这个构造克隆到pET15b载体以用于大肠杆菌表达。终止密码子也被突出显示(TAATAG)。
图9.对mini Gs的验证：β1AR药理学和mini Gs复合物。(a-c)使用竞争性结合测定来测量到β1AR的G蛋白结合。(a)膜中的受体。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT+mini Gs393(Ki为4.1nM±1.1nM，n＝2)；(ii)β1AR-WT+Gs–Nb35(Ki为6.8nM±0.6nM，n＝2)；(iii)β1AR-WT(Ki为40nM±0nM，n＝2)。
(b)膜中的受体。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+mini Gs393(Ki为3.6nM±0.0nM，n＝2)；(ii)β1AR-84+Gs–Nb35(Ki为16nM±4nM，n＝2)；(iii)β1AR-84(Ki为2.6μM±0.3μM，n＝15)。
(c)在DDM中溶解的受体。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+mini Gs393(Ki为4.7nM±0.4nM，n＝2)；(ii)β1AR-84+Gs–Nb35(Ki为23nM±7nM，n＝2)；(iii)β1AR-84(Ki为2.8μM±0.2μM，n＝2)。
(d到f)对mini Gs复合物的分析性凝胶过滤分析。(d)Mini Gs393以100mg每升大肠杆菌培养物的产率纯化(插图)，并且通过凝胶过滤解析成保留体积为17.2ml的单峰。(e)Mini Gs399，N端残基6到25被代替并且所逆转的L272D突变保留其与Gβ1γ2结合的能力的构造。与保留体积分别为15.8ml或16.4ml的Gβ1γ2或mini Gs399相比，mini Gs399和Gβ1γ2的等摩尔混合物解析成保留体积为14.6ml的单峰。(f)Mini Gs393能够结合LMNG洗涤剂中的纯化β1AR-WT。与保留体积分别为13.6ml或17.1ml的β1AR-WT或mini Gs393相比，β1AR-WT和miniGs393的等摩尔混合物解析成保留体积为13.2ml的主峰。
图10.对mini Gs的验证：热稳定性和GPT响应性(a-b)β1AR-WT复合物的热稳定性。(a)十二烷基麦芽糖苷的热稳定性。为清楚起见，热稳定性曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(表观Tm示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT(Tm为25.9℃±0.0℃，n＝3)；(ii)β1AR-WT+Nb80(Tm为32.0℃±0.0℃，n＝3)；(iii)β1AR-WT+mini Gs393(Tm为34.1℃±0.5℃，n＝3)；(iv)β1AR-WT+Gs–Nb35(Tm为35.8℃±0.1℃，n＝3)。
(b)辛基葡糖苷的热稳定性；未偶联β1AR-WT并未在OG洗涤剂中溶解时存活。为清楚起见，热稳定性曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(表观Tm示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT+Gs–Nb35(Tm为13.6℃±0.2℃，n＝3)；(ii)β1AR-WT+Nb80(Tm为14.3℃±0.2℃，n＝3)；(iii)β1AR-WT+mini Gs393(Tm为19.7℃±0.5℃，n＝3)。
(c-d)通过竞争性结合测定测得的β1AR-84复合物在膜中的GTP介导解离。除了I372A突变和V375I突变被逆转之外，Mini Gs404是与mini Gs393相同的构造。
(c)并无GTPγS存在于测定中。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+mini Gs393(Ki为3.6nM±0.0nM，n＝3)；(ii)β1AR-84+miniGs404(Ki为18nM±2nM，n＝2)；(iii)β1AR-84+Gs(Ki为271nM±54nM，n＝2)；(iv)β1AR-84(Ki为2.6μM±0.3μM；n＝15)。
(d)在测定时、在0.25mM GTPγS存在的情况下。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+mini Gs393(Ki为5.2nM±0.7nM，n＝2)；(ii)β1AR-84+mini Gs404(Ki为700nM±60nM，n＝2)；(iii)β1AR-84+Gs(Ki为2.7μM±0.1μM，n＝2)；(iv)β1AR-84(Ki为3.0μM±0.1μM；n＝2)。
在GTPγS存在或不存在的情况下，β1AR-WT-mini Gs393的异丙肾上腺素亲和力并无统计差异。所示曲线来自一式两份地执行的代表性实验。
图11.DM或NG洗涤剂中的β1AR-WT复合物的热稳定性(表观Tm)。(a)癸基麦芽糖苷的热稳定性。为清楚起见，热稳定性曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(表观Tm示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT(Tm为20.4℃±0.4℃，n＝3)；(ii)β1AR-WT+Nb80(Tm为28.6℃±0.3℃，n＝3)；(iii)β1AR-WT+mini Gs393(Tm为30.5℃±0.4℃，n＝3)；(iv)β1AR-WT+Gs–Nb35(Tm为31.1℃±0.4℃，n＝3)。
(b)壬基葡糖苷的热稳定性；未偶联β1AR-WT并未在NG洗涤剂中溶解时存活。为清楚起见，热稳定性曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(表观Tm示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-WT+Nb80(Tm为16.7℃±0.7℃，n＝2)；(ii)β1AR-WT+Gs–Nb35(Tm为19.0±0.2℃，n＝2)；(iii)β1AR-WT+mini Gs393(Tm为24.7℃±0.4℃，n＝2)。数据表示图例中指示的独立实验数(n)的平均值±SEM。所示曲线来自一式两份地执行的代表性实验。
图12.通过竞争性结合测定测得的膜中的β1AR-84-mini Gs391复合物的GTP介导解离。除了V375I突变被逆转之外，mini Gs391是与mini Gs393相同的构造。
(a)GTPγS不存在。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+mini Gs391(Ki为3.0nM±0.4nM，n＝2)；(ii)β1AR-84(Ki为2.6μM±0.3μM，n＝15)。
(b)在GTPγS存在的情况下(0.25mM)。为清楚起见，表示结合反应的曲线按照从图的左手侧到图的右手侧的顺序进行描述(代表异丙肾上腺素结合的Ki示出在括号中，其中还指示了独立实验数(n))：(i)β1AR-84+mini Gs391(Ki为4.7nM±0.1nM，n＝2)；(ii)β1AR-84(Ki为3.0μM±0.1μM，n＝2)。
在GTPγS存在或不存在的情况下，β1AR-WT-mini Gs391的异丙肾上腺素亲和力并无统计差异。所示曲线来自一式两份地执行的代表性实验。
图13.在Nb80或Gs存在的情况下的β1AR竞争性结合曲线。异丙肾上腺素与不同β1AR构造结合的亲和力(IC50)是在Nb80和Gs存在的情况下测得的。(A)接近野生型的β1AR构造(β6)在细胞内结合配偶体不存在的情况下展示出高异丙肾上腺素亲和力(180nM)(右侧曲线)。在Nb80存在的情况下(左侧曲线)，异丙肾上腺素亲和力仅增大到51nM。(B)最小热稳定受体构造(β84)在细胞内结合配偶体不存在的情况下展示出较低的异丙肾上腺素亲和力(7.1μM)(右侧曲线)。在Nb80存在的情况下(左侧曲线)，异丙肾上腺素亲和力明显转变到16nM。(C)在非脂化Gs存在的情况下，β84的异丙肾上腺素亲和力仅从6.9μM(右侧曲线)增大到1.4μM(左侧曲线)。(D)在非脂化Gs和Nb35存在的情况下，β84的异丙肾上腺素亲和力从6.9μM(右侧曲线)明显转变到68nM(左侧曲线)。所示数据来自单个代表性实验，并且误差条表示两次测量结果之间的标准误差。
图14.在GTP酶结构域存在的情况下的β1AR竞争性结合曲线。异丙肾上腺素与β1AR结合的亲和力(IC50)是Gαs GTP酶结构域存在的情况下测得的。(A)，在20℃下，β84的异丙肾上腺素亲和力(中间曲线)为3.3μM，并且在GTP酶结构域存在的情况下未增大(3.4μM)(右上侧曲线)。然而，GTP酶结构域、βγ二聚体和Nb35的组合诱导异丙肾上腺素亲和力转变到206nM(左侧曲线)。(B)，在4°℃下，β84的异丙肾上腺素亲和力(右侧曲线)为3.9μM，在GTP酶结构域(绿色)存在的情况下，亲和力增大到253nM(左侧曲线)。所示数据来自单个代表性实验，并且误差条表示两次测量结果之间的标准误差。
图15.mini-Gs结合的A2AR的配体结合和总体结构。a，Mini-Gs增大了激动剂与A2AR结合的亲和力，类似于通过异源三聚体G蛋白观察到的。通过以增大浓度的激动剂NECA测量反向激动剂3H-ZM241385的位移来一式三份地执行竞争结合曲线(括号中为Ki值，全部数据参见图16)。为清楚起见，曲线从图的左手侧到图的右手侧进行描述：(i)A2AR和异源三聚体G蛋白与纳米抗体Nb35(Ki为340nM±70nM)；(ii)A2AR和mini-Gs(Ki为430nM±80nM)；(iii)A2AR(Ki为4.6μM±0.3μM)。将G蛋白全部添加到包含A2AR的膜中以给出25μM的最终浓度，并且NaCl的最终浓度为100mM。b，A2AR的结构被描绘成浅灰色动画，其中mini-Gs呈深灰色。与A2AR结合的激动剂NECA和与mini-Gs结合的激动剂GDP被描绘成空间填充模型。对相关二级结构特征进行标记。
图16.对表达在HEK293细胞膜中的A2AR执行竞争测定，其中激动剂NECA竞争放射标记的反向激动剂3H-ZM241385的结合。实验是在100mM KCl(a，b)、100mM NaCl(c，d)或500mMNaCl(e，f)存在的情况下执行的以确认mini-Gs与异源三聚体Gs与纳米抗体Nb35的类似行为以用于复合物的稳定。结果总结在表(g)中。用针对统计显著性的非配对t检验对来自至少3个独立实验的数据进行分析。
图17.洗涤剂溶解的、3H-NECA结合的A2AR在mini-Gs414存在或不存在的情况下的热稳定性。未纯化A2AR以以下浓度在洗涤剂中溶解：(a)DDM，0.1％；(b)DM，0.13％；(c)OG，0.8％。将样本加热30分钟、在冰上淬灭，并且确定所结合的3H-NECA的量。在每个图中，A2AR单独是左侧曲线，而与mini Gs414结合的A2AR是右侧曲线。通过非线性方式来分析数据，并且根据对拟合的S形剂量-响应曲线的分析来确定表观Tm(d)。
图18.A2AR链A中的NECA(a和b)、A2AR链B中的NECA(c和d)以及mini-Gs链C中的GDP(e和f)的省略图差异密度的正交视图。等高线水平在图a到图d中为2.5Σ并且在图e和图f中为3.0Σ。
图19.参考CGN系统，mini-Gs(链C和链D)与β2AR-Gs结构中使用的牛GNAS2(P04896)的比对。在Gs-β2AR复合物中β2AR的或mini-Gs-A2AR复合物中的A2AR的内的残基用灰色突出显示。
图20.A2AR与mini-Gs之间的填装相互作用。a，描绘其在A2AR-mini-Gs结构中的二级结构的A2AR的图。浅灰色阴影的残基在链A和/或链B中是无序的。二硫键被描绘成黑色虚线。b，mini-Gs拓扑的动画。c，mini-Gs与A2AR之间的接触的图，其中线厚度表示氨基酸残基之间的相互作用的相对数目。
图21.人β2-肾上腺素受体(adrb2_人)、人腺苷A2A受体(AA2AR_人)以及结晶化A2AR-mini-Gs结构的链A和链B的比对。关键Ballesteros-Weinstein编号示出在序列上方，并且结晶化A2AR中用于促进纯化和结晶化的突变被加下划线。浅灰色条指示β2AR-Gs结构中α螺旋的位置，而深灰色条表示A2AR-miniGs结构中的这些区。
图22.mini-Gs结合的A2AR与异源三聚体Gs结合的β2AR的比较。a，通过比对以下各项来执行β2AR-Gs(PDB ID：3SN6)10与A2AR-mini-Gs的结构比对：单独地，受体；A2AR，深灰色；β2AR，浅灰色。描绘与β2AR结合的Gαs(浅灰色)和与A2AR结合的mini-Gs(深灰色)的所得相对部署。NECA和GDP被描绘成空间填充模型。为清楚起见，已经省略了Gαs的α螺旋结构域以及Gαs结合的Nb35和Gβγ。b到e，对应G蛋白与受体之间的氢键(虚线)的详细比较；受体在图的上部，其中螺旋用H3、H5、H6、H7和H8进行标记，mini-Gs和Gαs在图的下部，其中残基使用CGN系统进行标记。对氨基酸残基的标记示出了受体的Ballesteros-Weinstein(B-W)编号和G蛋白的CGN符号。f和g，分别是作为空间填充模型的A2AR和β2AR的细胞质表面的视图，其中深灰色原子与其对应G蛋白接触。h，与mini-Gs-A2AR复合物和Gs-β2AR复合物中的G蛋白接触的残基的比较。受体中相接触的氨基酸残基呈深灰色。白色残基是不与对应G蛋白接触的那些残基，但是其它受体中的等效残基与对应G蛋白接触。给予跨膜α螺旋中的残基B-W编号，其中破折号表示环或H8中的残基。氨基酸残基5.71到5.77在mini-Gs-A2AR结构中是无序的。
图23.和A2AR结合的mini-Gs(链c，深灰色)与和β2AR结合的Gαs(浅灰色)的GTP酶结构域的比对。与mini-Gs结合的GDP被描绘成空间填充模型。对与受体相互作用的α5螺旋进行标记。
图24.A2AR在G蛋白结合时的构象变化。将和mini-Gs结合的A2AR(深灰色)与以活性-中间构象和NECA(PDB编码2YDV)1或UK432097(PDB编码3QAK)4结合的A2AR(浅灰色)进行比对以突出显示G蛋白结合时的结构变化。结构均不用于这两个比较，因为与NECA相比，配体UK432097的大的延伸使细胞外表面相比于NECA结合的结构扭曲，并且NECA结合的结构包含受体在细胞内的一半的热稳定突变。a，平行于膜平面来观察2YDV与受体在细胞外的一半的比对。b，从细胞质表面观察到的与3QAK的比对，其中为清楚起见，移除mini-Gs。c，平行于膜来观察与3QAK的比对。将A2AR中的跨膜α螺旋标记为H3、H5、H6、H7，并且对mini-Gs进行标记。残基用其Ballesteros-Weinstein编号进行标记，并且箭头描绘了在mini-Gs结合时的移动方向。将B-W和CGN编号分别转换成A2AR和mini-Gs中的氨基酸残基如下：R3.50，Arg 102；Y5.58，Tyr 197；K6.29，Lys 227；A3.33，Ala 231羰基；L6.37，Leu 235；Y7.53，Tyr 288；YH5.23，Tyr 391；LH5.25，Leu 393；C端H5.24，mini-Gs的C端(Leu 394)。
图25.常用Gα编号系统103的人旁系同源物参考比对。a，所有规范人Gα旁系同源物的参考比对。结构域(D)、共有二级结构(S)和在人参考比对的SSE中的位置(P)示出在比对的顶部。b，CGN命名中使用的SSE的定义的参考表。
图26.mini Gs氨基酸和核苷酸序列。氨基酸序列被列为SEQ ID No:1-45，并且核苷酸序列被列为SEQ ID No:46-90。
图27.Galphat亚基(嵌合体6)的氨基酸序列。这是嵌合蛋白，其中牛Gαt1的残基216到294已经用大鼠Gαi1的残基220到298代替。其已经在与βγ亚基(1GOT)复合时结晶化。
图28.人Gα亚基的系统发育关系。试图将已经用家族特异性颜色突出显示的所有Gα亚基转换成mini-G蛋白。使用TreeDyn来确定系统发育关系。
图29.GαGTP酶结构域蛋白质序列的比对。所比对的氨基酸序列属于本研究中用于产生初始mini-G蛋白的Gα亚基的野生型GTP酶结构域。GαAH结构域(未示出)是缺失的并且被连接子(斜体的GGGGGGGG或GGSGGSGG)代替。为了构造mini-G蛋白，用灰色突出显示的残基是缺失的，并且粗体残基突变成以下项(Gαs残基编号和CGN上标)：D49S1H1.3、N50S1H1.4、D249S4.7、D252S4H3.3、D272H3.8、A372H5.4、I375H5.7。甘氨酸突变(G217D；加下划线)仅合并到Gi1中以提高表达(参见结果和讨论)。序列上方的编号是用于Gαs，并且序列下方的CGN系统是用于参考的。
图30.β1AR-mini-Gs复合物和A2AR-mini-Gs复合物。(a)GFP-mini-Gs与β1AR的FSEC迹线(括号中给出了保留体积)：GFP-mini-Gs(15.1ml)；GFP-mini-Gs与和反向激动剂ICI118551结合的β1AR(15.1ml)；GFP-mini-Gs与和激动剂异丙肾上腺素结合的β1AR(8ml、12.1ml和15.1ml)。示出了来自至少两个独立实验的代表性色谱图。(b)使用荧光饱和结合测定(FSBA)对GFP-mini-Gs到DDM溶解的β1AR的亲和力的测量；圆形，与激动剂异丙肾上腺素结合的β1AR(总结合)；方形，与反向激动剂ICI118551结合的β1AR(非特异性结合)；三角形，特异性结合，表观KD为201±1nM(平均值±SEM，n＝2)。所示曲线来自代表性实验。(c)GFP-mini-Gs与DDM溶解的A2AR的FSEC迹线(括号中给出了保留体积)：GFP-mini-Gs(15.1ml)；GFP-mini-Gs与和反向激动剂ZM241385结合的A2AR(15.1ml)；GFP-mini-Gs与和激动剂NECA结合的A2AR(12.5ml和15.1ml)。示出了来自至少两个独立实验的代表性色谱图。(d)使用FSBA对mini-Gs到DDM溶解的A2AR的亲和力进行的测量：圆形，与激动剂NECA结合的A2AR(总结合)；方形，与反向激动剂ZM241385结合的A2AR(非特异性结合)；三角形，特异性结合，表观KD为428nM±24nM(平均值±SEM，n＝2)。(e)与纯化A2AR结合的mini-Gs的分析性尺寸排阻色谱法(SEC)(括号中给出了保留体积)：A2AR-mini-Gs复合物，153kDa(13ml)；A2AR，133kDa(13.3ml)；mini-Gs，22kDa(17.2ml)。在SEC迹线右边的三个图是来自3个单独的SEC实验的级分的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶：顶部图，mini-Gs；中间图，A2AR；底部图，与NECA结合的A2AR混合(1.2:1摩尔比)的mini-Gs。
图31.A2AR-mini-Golf复合物。(a)与纯化A2AR结合的mini-Golf的分析性SEC(括号中给出了保留体积)：A2AR-mini-Golf复合物，153kDa(13ml)；A2AR，133kDa(13.3ml)；mini-Golf，23kDa(17.1ml)。在SEC迹线右边的三个图是来自3个单独的SEC实验的级分的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶：顶部图，mini-Golf；中间图，A2AR；底部图，与NECA结合的A2AR混合(1.2:1摩尔比)的mini-Golf。(b)未纯化DM溶解的、3H-NECA结合的A2AR的热稳定性。通过非线性回归来分析数据，并且根据对拟合的S形剂量-响应曲线的分析来确定表观Tm值。Tm值表示各自一式两份地执行的两个独立实验的平均值±SEM：圆形，无mini-Golf(26.9℃±0.3℃)；方形，mini-Golf(32.5℃±1℃)。所示曲线来自代表性实验。
图32.mini-Gs/q嵌合体与GPCR之间的各种复合物的热稳定性测定。(a)纯化的、洋地黄皂苷溶解的、125I-AngII结合的AT1R的热稳定性(括号中为Tm值)：圆形，无mini-Gs/q(22.6℃±0.4℃)；方形，方形Gs/q57；倒三角形，mini-Gs/q70(30.7℃±1℃)；三角形，Gs/q71(30.2℃±0.8℃)。(b)未纯化DDM溶解的、3H-NTS结合的NTSR1的热稳定性：圆形，无mini-Gs/q(24.9℃±0.4℃)；方形，mini-Gs/q57(26.7℃±0.7℃)；六边形，mini-Gs/q58(25.1℃±0.4℃)；倒三角形，mini-Gs/q70(32.5℃±0.3℃)；菱形，mini-Gs/q71(28.6℃±1.1℃)。(c)未纯化DM溶解的、3H-NECA结合的A2AR的热稳定性：圆形，无mini-Gs/q(26.9℃±0.3℃)；方形，mini-Gs/q57(30.6℃±0.3℃)；六边形，mini-Gs/q58(26.9℃±0.5℃)；倒三角形，mini-Gs/q70(27.5℃±0.2℃).在所有图中，通过非线性回归来分析数据(n＝3)，并且根据对拟合的S形剂量-响应曲线的分析来确定表观Tm值，其中值被示出为平均值±SEM。所示曲线来自代表性实验。
图33.5HT1BR-mini-Gi1复合物。(a)mini-Gi1偶联增大了针对5HT1BR的激动剂亲和力。通过以增大浓度的激动剂舒马曲坦测量拮抗剂3H-GR125743的位移来一式两份地执行竞争结合曲线(n＝2)(括号中的Ki值表示平均值±SEM)：圆形，5HT1BR(Ki为276nM±10nM)；六边形，5HT1BR和mini-Gi1(Ki为80nM±13nM)；方形，5HT1BR和mini-Gs/i1(Ki为36nM±2nM)；三角形，5HT1BR和mini-Gi1β1γ2(Ki为15nM±1nM)；菱形，5HT1BR和mini-Gs/i1β1γ2(Ki为7.2nM±0.8nM)。误差条表示SEM。(b)使用FSBA对mini-Gs/i1嵌合体针对DDM溶解的、多尼曲坦结合的5HT1BR的亲和力进行的测量：圆形，5HT1BR和GFP-mini-Gs/i1(总结合)；方形，5HT1BR和GFP-mini-Gs(非特异性结合)；三角形，特异性结合。386nM±47nM的表观KD表示两个独立实验的平均值±SEM。所示曲线来自代表性实验。(c)GFP-mini-Gi1与5HT1BR在DDM中的FSEC迹线：在DDM中纯化的GFP-mini-Gi1和多尼曲坦结合的5HT1BR(13.5ml)；GFP-mini-Gi1(13.5ml)。(d)GFP-mini-Gi1与5HT1BR在LMNG中的FSEC迹线：在LMNG中纯化的GFP-mini-Gi1和多尼曲坦结合的5HT1BR(12.2ml和14.3ml)；GFP-mini-Gi1(14.3ml)。(e)GFP-mini-Gs/i1与5HT1BR的FSEC迹线：在DDM中纯化的GFP-mini-Gs/i1和多尼曲坦结合的5HT1BR(13.2ml)；GFP-mini-Gs/i1(15.1ml)。(f)GFP-mini-Gi1β1γ2与5HT1BR的FSEC迹线：在LMNG中纯化的GFP-mini-Gi1β1γ2和多尼曲坦结合的5HT1BR(11.8ml)；GFP-mini-Gi1β1γ2(14.3ml)。在图c到f中，保留体积在括号中给出。
图34.5HT1BR-mini-Go1复合物。(a)通过以增大浓度的激动剂舒马曲坦测量拮抗剂3H-GR125743的位移来对膜一式两份地执行竞争结合曲线(n＝2)(表示平均值±SEM的表观Ki值在括号中)：圆形，5HT1BR(Ki为276nM±10nM)；方形，5HT1BR和mini-Go1(Ki为32nM±3nM)。误差棒表示SEM。(b)使用FSBA对GFP-mini-Go1针对DDM溶解的、多尼曲坦结合的5HT1BR的亲和力进行的测量：圆形，5HT1BR和GFP-mini-Go1(总结合)；方形，5HT1BR和GFP-mini-Gs(非特异性结合)；三角形，特异性结合。表观KD值(184nM±24nM)表示两个独立实验的平均值±SEM。所示曲线来自代表性实验。(c)GFP-mini-Go1与和以下各项结合的、DDM溶解的未纯化5HT1BR的FSEC迹线(保留体积示出在括号中)：拮抗剂SB224289(14.9ml)；激动剂多尼曲坦(11.3ml和14.9ml)。被解析成保留体积为14.9ml的主峰的游离GFP-mini-Go1。(d)mini-Go1与纯化5HT1BR形成复合物。这三个图是来自3个单独的SEC实验的级分的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶：顶部图，mini-Go1；中间图，5HT1BR；底部图，与多尼曲坦结合的5HT1BR混合(1:1摩尔比)的mini-Go1。(e)GFP-mini-Go1与纯化5HT1BR的FSEC迹线：在DDM中纯化的GFP-mini-Go1与5HT1BR(13ml)；GFP-mini-Go1(14.8ml)。(f)GFP-mini-Gs与纯化5HT1BR的FSEC迹线：在DDM中纯化的GFP-mini-Gs与5HT1BR(阴性对照；15.1ml)；GFP-mini-Gs(15.1ml)。保留体积示出在括号中。
图35.本研究中使用的mini-G蛋白序列。多组氨酸标签用虚线加下划线，TEV蛋白酶切割位点用灰色突出显示，并且用于代替GαAH结构域的连接子是斜体的。突变以粗体示出并且加下划线。
图36.未成功表达在大肠杆菌中的mini-G蛋白序列。多组氨酸标签用虚线加下划线，TEV位点用灰色突出显示，并且用于代替GαAH结构域的连接子是斜体的。突变以粗体示出并且加下划线。使用NcoI和XhoI限制位点将构造克隆到质粒pET15b中以用于大肠杆菌表达。
图37.本研究中使用的GFP-mini-G蛋白序列：GFP(加双下划线)用GGGGS连接子(斜体)融合到mini-G蛋白的N端。多组氨酸标签用虚线加下划线，TEV切割位点用灰色突出显示，并且用于代替GαAH结构域的连接子是斜体的(GGSGGSGG或GGGGGGGG)。
图38.本研究中使用的所选mini-Gs/q嵌合体的序列比对。粗体的残基是mini-G蛋白的签名突变。灰色的残基是在Gq中发现的那些。序列上方的菱形标识Gαs中的氨基酸残基，其中与β2AR(β2con)或A2AR(2A con)中的残基原子接触的侧链。序列上方的椭圆形标识Gαs中的氨基酸残基，其中仅主链原子与受体接触。
图39.对纯化A2AR与mini-Gs/q嵌合体的分析性SEC和SDS-PAGE分析。与纯化A2AR结合的mini-Gs/q57(a)、mini-Gs/q58(b)和mini-Gs/q70(c)的分析性SEC：A2AR-mini-Gs/q复合物；A2AR；mini-Gs/q。在SEC迹线下方的三个图是来自3个单独的SEC实验的级分的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶：顶部图，mini-Gs/q；中间图，A2AR；底部图，与mini-Gs/q混合(1:1.2摩尔比)的NECA结合的A2AR。
图40.本研究中使用的不同mini-Gi1和mini-Go1蛋白的序列比对。粗体的残基是mini-G蛋白的签名突变。注意mini-Gi1中的用于提高表达的附加G217D突变(粗体；mini-G蛋白中的残基114)。mini-Gs中的残基突变成其在mini-Gi1或mini-Go1(分别为单下划线或双下划线)中的等效物以制成mini-Gs/i1或mini-Gs/o1嵌合体。注意用于与β1γ2形成异源三聚体的构造中的N端(用灰色突出显示)的重新插入(即，mini-Gi1_46；mini-Gs/i1_43和mini-Gs/o1_16)。
图41.激动剂构象的GLP1R在mini-Gs存在的情况下的稳定性。mini-Gs增大了GLP1R在mini-Gs存在的情况下的稳定性。GLP1R Tm为14.7℃，GLP1R加mini-Gs Tm为19.3℃。
实例1：工程化最小G蛋白以促进G蛋白偶联受体以其活性构象结晶化
引言
G蛋白偶联受体(GPCR)响应于如激素和神经递质等刺激子来调节细胞质信号传导通路。处于所有活化状态的GPCR的结构确定对于阐明信号转导的精确机制至关重要。然而，由于其固有的不稳定性，已经证明GPCR-G蛋白复合物的结晶化特别具有挑战性。这里，我们描述了最小G蛋白的设计，所述最小G蛋白仅由来自腺苷酸环化酶刺激G蛋白(Gs)的GTP酶结构域组成。mini Gs是在Gβγ亚基不存在的情况下高效地偶联GPCR的小的可溶蛋白。我们工程化mini Gs以与β1肾上腺素受体(β1AR)形成即便是在短链洗涤剂中溶解时也稳定的复合物。mini G蛋白诱导与异源三聚体G蛋白类似的GPCR药理学和结构变化。其因此是将会促进GPCR以其活性构象的高通量结构确定的新型工具。
结果
开发敏感性测定来检测Gs与β1AR的偶联
我们开发了可以通过测量激动剂结合亲和力的响应来检测不同结合配偶体与β1AR的相互作用的敏感性竞争性结合测定。在这项工作期间使用的结合配偶体是：Nb8038，结合β2AR并诱导向脂化Gs的激动剂亲和力的可比转变的纳米抗体；Nb3540，将Gs以其GPCR结合构象稳定的纳米抗体；非脂化Gs(Gαsβ1γ2)；以及非脂化Gβγ(Gβ1γ2)。测定中使用的结合蛋白的浓度被标准化为25μM、高于用于Nb80与β1AR96结合的平衡解离常数(KD)大约30倍。并无亲和力数据可用于Gs，然而，我们预期这个浓度高于KD至少10倍。
异源竞争性结合测定用于测量拮抗剂3H-二氢阿普洛尔(3H-DHA)与激动剂异丙肾上腺素之间的竞争。使用衍生自饱和结合实验的3H-DHA的解离常数(Kd)来计算抑制常数(Ki)值。首先，测定类野生型火鸡β1AR构造97(β1AR-WT)(参见表1)。这个构造在结合配偶体不存在的情况下具有40nM±0nM的异丙肾上腺素Ki。Ki响应于Nb80、Gs或Gs–Nb35而分别转变为：5.8nM±0.8nM(6.9倍)、17nM±2nM(2.4倍)或6.8nM±0.6nM(5.9倍)(图3a)。针对β1AR-WT的激动剂亲和力转变相对较小，因此，我们接下来测试最小热稳定性构造(β1AR-84)，所述最小热稳定性构造包含上述突变中的一些突变3,96(参见表1)。这个构造在其未偶联状态下具有显著低于β1AR-WT的异丙肾上腺素Ki(2.6μM±0.3μM)但是响应于结合配偶体产生了更大转变。到Nb80、Gs或Gs–Nb35的偶联分别将Ki转变为28nM±1nM(93倍)、271nM±54nM(9.6倍)或16nM±4nM(163倍)(图3b)。竞争性结合曲线最佳地拟合单位点结合参数。因此，针对一些结合配偶体(比如Gs)观察到的激动剂亲和力的部分转变最有可能反映高亲和力激动剂结合状态的不完整稳定性，而非表示部分偶联或混合受体群。这些结果证明，非脂化Gs能够偶联β1AR，但是需要Nb35来稳定复合物并阐明与Nb80相等的激动剂结合亲和力响应。使用β1AR-84的竞争性结合测定比β1AR-WT更敏感，并且因此用于区分不同结合配偶体稳定高亲和力激动剂结合状态的能力的小差异。
Gαs GαGTP酶结构域的分离以及测量与β1AR-84的结合
β2AR–Gs复合物10的结构揭示，仅来自Gs的GαGTP酶结构域与受体形成显著相互作用(参见图4)。我们通过用短甘氨酸连接子代替与GαAH相对应的序列来在遗传水平下分离GTP酶结构域(参见表2)。我们称为mini Gs77的这个构造较差地表达在大肠杆菌中并且可能无法纯化成同质性，从而指示其非常不稳定。但是，小量蛋白质(大约200μg/L培养物)可以大约百分之10到20的纯度来制备(参见图5)。来自Gαs的GαGTP酶结构域和GαAH结构域之前已被表达为独立蛋白以确定其在鸟嘌呤核苷酸结合和水解41中的作用，但是未曾调查过其结合GPCR的能力。我们在Gβγ-Nb35存在或不存在的情况下、在20℃下、在竞争性结合测定中测试了mini Gs77偶联β1AR-84的能力。在mini Gs77存在的情况下(1.9μM±0.2μM)并未观察到β1AR-84(2.6μM±0.3μM)的激动剂结合亲和力的显著转变，但是mini Gs77–Gβγ–Nb35诱导转变到3.6nM±0.8nM(718倍)(图3c)。这证明，部分纯化的GαGTP酶结构域是功能性的，但是也表明，其不能够在Gβγ亚基不存在的情况下偶联β1AR-84。然而，当我们在4℃下重复测定时，我们观察到未偶联受体的激动剂Ki响应于mini Gs77而从2.1μM±0.2μM(在4℃下)显著转变到99nM±12nM(21倍)(图3d)。这是临界结果，因为这证明分离GαGTP酶结构域可以在Gβγ亚基不存在的情况下结合β1AR-84。还表明，热稳定性是其稳定受体的高亲和力激动剂结合状态的能力的限制因子。
β1AR–mini Gs复合物的热稳定
我们使mini Gs在与β1AR复合时热稳定。使用我们的竞争性结合测定在4℃和20℃下筛选突变体。由于突变体的低可变表达水平，不可能标准化测定中使用的浓度。相反，每个竞争曲线使用从1L大肠杆菌培养物纯化的总mini Gs(表3)。在初始筛选期间测试了大约100个突变体。与亲本mini Gs构造(mini Gs77)相比在任一温度下将β1AR-84的激动剂亲和力转变超过2倍的突变被分类为正的。总共标识了涵盖11个唯一位置的14个正突变(表3)。
包含修饰N端和连接子区(参见表2)的新亲本构造(mini Gs161)用于组合突变。正突变与来自第一轮筛选的最佳突变之一(A249D)组合，并且正突变在与β1AR-WT复合时的稳定性使用热稳定性测定在n-十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DDM)洗涤剂中进行测试。激动剂3H-去甲肾上腺素(3H-NE)用于Tm测定，然而，由于与这个配体相关联的高背景信号，最大浓度200nM可用于测定。这大约等于未偶联β1AR-WT的Ki，但是高于与Nb80或Gs–Nb35复合的β1AR-WT的Ki大约250倍(参见图7)。因此，针对未偶联β1AR-WT引用的Tm值是在非饱和激动剂条件下，但是具有较高激动剂亲和力的β1AR-WT复合物是在激动剂饱和条件下。
A249D突变体(mini Gs162)具有25.1℃的表观Tm(表4)、低于未偶联β1AR-WT的表观Tm(25.9℃)。包含A249D突变和开关III缺失的双重突变体(mini Gs164)将复合物的表观Tm增大到28.6℃。添加G49D突变、E50N突变、S252D突变和L272D突变产生了类似的表观Tm值(在双重突变体的0.2℃内)。这六个突变由于其对膜嵌入式β1AR-84的激动剂亲和力的正面单独影响而用于最终构造(表3)。来自第一轮筛选的其它正突变均未进一步增大复合物的Tm并且因此被拒绝。除L272D之外的所有突变也增大了基础GDP结合状态的Tm(表4)，如通过差示扫描荧光测定法(DSF)评估的。
六个突变中成功组合的五个突变聚合在核苷酸结合袋和磷酸酯结合环(P环)周围(图6b)。A249D突变被设计成与Lys-293和S251相互作用，以稳定核苷酸结合袋的基础。以GPCR结合构象无序的开关III的缺失旨在通过用在Arl-298中发现的定义二级机构要素(α螺旋、310螺旋和β转角)代替这个柔性环来稳定mini Gs。通过与Arg-265的可能相互作用，S252D突变也被设计成稳定开关III周围的区域。通过可能与Arg-265和Lys-293的相互作用，位于P环中的G49D突变和E50N突变分别被设计成降低柔性并且在构象上限制这个区。通过与其N端区内的带电荷和极性残基簇(227到233)的可能相互作用，第六个突变(L272D)被设计成在构象上限制开关II(图6c)。
筛选稳定洗涤剂中的β1AR-WT–mini Gs复合物的突变
包含来自第一轮筛选的六个稳定突变的mini Gs183不能够完全稳定洗涤剂溶解的β1AR-WT。Nb80或Gs-Nb35的复合物分别具有高于Gs183 3.3℃或7.1℃的表观Tm值(表4)。因此，大约150个突变体的第二图是基于Gs在其受体结合构象10下的结构使用诱变设计的。这些突变在亲本构造中进行筛选，所述亲本构造具有修饰连接子区(参见表2)。我们标识出增大复合物在洗涤剂中的稳定性的四个附加突变(表4)。最佳突变体(I372A)将复合物的表观Tm从29.2℃增大到34.0℃并且与V375I加性地组合，从而给出35.0℃的最终表观Tm。这比Nb80高3.0℃并且仅比Gs–Nb35低0.8℃。所有洗涤剂稳定突变减小了GDP结合构象下的miniGs的稳定性(表4)。
洗涤剂稳定突变位于α1–α5螺旋界面周围。GPCR结合构象的Gαs10与GTP结合结构81的比对揭示了Ile-372(在α5螺旋中)与残基Met-60和His-64(在α1螺旋中)的空间位阻(图6d)。这个位阻似乎阻止α1螺旋的C端区针对GαGTP酶结构域的核心紧密填装，从而将蛋白质的核心暴露于溶剂。I372A突变被设计成消除这个位阻并且促进在这个区域中更好的填装。V375I被设计成提高GPCR结合构象下α5螺旋与蛋白质的核心之间的填装(图6e)。在这项工作过程中，I372A突变还被独立报道成稳定视紫红质-Gi1复合物92。
对mini Gs的验证
通过改变连接子以及缩短N端来修饰洗涤剂稳定的构造(mini Gs345)以用于晶体学应用(参见表2)。最终稳定的构造被称为mini Gs393(参见图8)。这个构造能够阐明针对以下项的等于或大于Nb80或Gs–Nb35的激动剂亲和力转变(图9a到图9c)：膜嵌入式β1AR-WT(与5.8nM±0.8nM相比，分别为4.1nM±1.1nM或6.8nM±0.6nM)；膜嵌入式β1AR-84(与28nM±1nM相比，分别为3.6nM±0.0nM或16nM±4nM)；以及DDM溶解的β1AR-84(与83nM±2nM相比，分别为4.7nM±0.4nM或23nM±7nM)。这些数据证明，mini Gs能够与Nb80或Gs–Nb35一样良好地或比其更好地稳定β1AR的高亲和力激动剂结合状态。此外，与mini Gs393偶联的膜嵌入式或洗涤剂溶解的β1AR-84的激动剂结合亲和力之间并无显著差异。这证明，受体的药理学响应在脂质或洗涤剂环境中是相同的。
mini Gs393高度表达在大肠杆菌中：其可以用100mg每升培养物的产率进行纯化，并且浓缩到超过100mg/ml(图9d)。分析性凝胶过滤用于证明mini Gs393可以结合十二烷基麦芽糖乙戊二醇(LMNG)洗涤剂中的纯化β1AR-WT。相比于β1AR-WT或mini Gs393分别为13.6ml或17.1ml，mini Gs393和β1AR-WT的1:1化学计量混合物解析成保留体积为13.2ml的主峰(图9e)。这个结果清楚地证明，结合测定与洗涤剂中的纯化蛋白质之间稳定复合物的形成相关。此外，其中N端残基6到25被代替并且L272D突变被逆转(参见表2)的构造mini Gs399保留其与Gβγ形成异源三聚体的能力。相比于Gβγ或mini Gs399分别为15.8ml或16.4ml，miniGs399和Gβ1γ2的1:1化学计量混合物解析成保留体积为14.6ml的单峰(图9f)。这个特性可以用于较大mini Gs异源三聚体有利的应用(低温电子显微镜法)或用于研究Gβγ在G蛋白活化时的作用。
在多个不同的试剂中测试β1AR-WT-mini Gs393复合物的稳定性。在如DDM等较长链洗涤剂中，β1AR-WT-mini Gs393复合物具有34.1℃的表观Tm，比未偶联β1AR-WT高8.2℃。在DDM中，mini Gs393比Gs-Nb35稍微更不稳定(1.7℃)，但是比Nb80稍微更加稳定(2.1℃)(参见图10a)。类似图案在正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DM)中观察到，其中β1AR-WT-mini Gs393复合物具有30.5℃的表观Tm，比未偶联β1AR-WT高10.1℃。在Dm中，mini Gs393比Gs-Nb35稍微更不稳定(0.6℃)，但是比Nb80稍微更加稳定(1.9℃)(参见图11a)。在如n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)等短链洗涤剂中，β1AR-WT-mini Gs393复合物具有19.7℃的表观Tm，比Gs–Nb35(6.1℃)或Nb80(5.4℃)更加稳定(图10b)。类似图案在正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷(NG)中观察到，其中β1AR-WT-mini Gs393复合物具有24.7℃的表观Tm，比Gs–Nb35(5.7℃)或Nb80(8.0℃)更加稳定(参见图11b)。未偶联β1AR-WT在NG或OG中溶解之后完全灭活，从而证明通过mini Gs393偶联赋予受体相当大的热稳定度。NG和OG均为用于蒸汽扩散结晶化的适合洗涤剂，从而突出显示这是用于GPCR-mini Gs复合物的结构确定的可行方法。
突变体的核苷酸结合特性并未在这项工作中广泛研究，但是进行了一项有趣的观察：涉及mini Gs393的β1AR-84复合物对GTP介导的解离具有完全抗性(图10c和图10d)。将GTPγS以0.25mM的浓度添加竞争性结合测定中(在复合物形成之后)，所述浓度在正常人细胞99中的GTP的生理范围内。未偶联β1AR-84在GTPγS存在的情况下具有3.0μM±0.1μM的异丙肾上腺素Ki。用GTPγS来处理复合物将Gs诱导的激动剂结合亲和力转变从271nM±54nM完全逆转到2.7μM±0.1μM(图10c)。mini Gs404(除了I372A突变和V375I突变被逆转之外，与mini Gs393相同的构造)诱导的激动剂结合亲和力转变(参见表2)几乎被GTPγS完全逆转(从18nM±2nM到700nM±60nM)。然而，β1AR-WT-mini Gs393复合物的激动剂结合亲和力在GTPγS存在或不存在的情况下并无显著差异(3.6nM±0.0nM，相比于5.2nM±0.7nM)。对GTPγS的这一无响应性追溯到I372A突变，其中mini Gs389(除了V375I突变被逆转之外，与miniGs393相同的构造)(参见表2)以与mini Gs393几乎相同的方式表现(参见图12)。因此，I372A突变似乎使核苷酸结合袋的占据与GPCR结合解偶联(参见讨论)。这是有趣的发现，因为其允许稳定的GPCR-mini Gs复合物形成在活细胞中。结合mini Gs393偶联对GPCR的热稳定效应，这可以允许溶解和纯化太不稳定以至于无法使用传统技术纯化的GPCR。
讨论
已经开发了若干个新型方法来稳定和结晶化类活性构象的GPCR，这些方法包括与以下各项的复合：G蛋白衍生肽36,37、G蛋白模仿纳米抗体38,100,101以及纳米抗体稳定异源三聚体G蛋白10。然而，这些方法并不是理想的：G蛋白衍生肽似乎不诱导与异源三聚体G蛋白相同的受体构象变化；G蛋白模仿纳米抗体无法重新产生天然GPCR-G蛋白界面；并且异源三聚体G蛋白复合物是大的、动态的并且在洗涤剂中不稳定，从而使其成为针对结晶化特别具有挑战性的靶。因此，我们设计了最小G蛋白，所述最小G蛋白适于类天然GPCR-G蛋白复合物的高通量结晶化。最近，我们以的分辨率解出mini Gs在与野生型人腺苷A2a受体复合时的结构(参见实例4)。A2a复合物的分子组构非常类似于β2AR-Gs复合物10的分子组构，从而强烈表明，其是天然信号传导复合物的准确反映。
G蛋白工程化工作也已经为G蛋白活化机制提供了独特的见解。我们标识出在受体结合构象下α1与α5螺旋之间的空间位阻，所述空间位阻似乎阻止α1螺旋针对GαGTP酶结构域的核心紧密填装(图6d)。之前已经表明，GPCR对α1螺旋的变构去稳定可以是打开GαGTP酶-GαAH结构域界面并且去稳定核苷酸结合袋89,90,92时的关键事件。我们证明，预测消除α1螺旋与α5螺旋之间的空间位阻的Ile-372到丙氨酸的突变几乎完全抑制了复合物的GTP介导解离。这些数据指示，Ile-372充当GPCR结合位点与核苷酸结合袋之间的关键接替，并且其突变使GPCR结合与核苷酸占据有效地解偶联。将Ile-372标识为信号转导时的关键残基还证明了最小G蛋白特别是最小稳定变体用于研究G蛋白活化机制的多样性。
最小G蛋白是新型工具，具有许多可能应用，包括：受体药理学的表征、结合动力学研究、GPCR在其活性构象下的热稳定、药物发现、以及类天然GPCR-G蛋白复合物的结晶化。此外，这里报道的所有突变位于Gα亚基的保守区内。因此，概念据信可转移到所有种类的异源三聚体G蛋白，这将会允许产生能够偶联任何GPCR的最小G蛋白图。
物质与方法
克隆本工作中使用的所有构造的细节提供在表1和表2中。使用快速变化方案(Quick Change protocol)(Stratagene)来执行定点诱变。使用之前描述的方法102的修改版来执行插入和缺失。
G蛋白的杆状病毒表达G蛋白基因克隆到转移载体pBacPAK8(Clontech)中，并且使用flashBAC ULTRA系统(Oxford Expression Technologies)来制备杆状病毒。粉纹夜蛾细胞((Expression Systems))在5L最佳生长烧瓶(Thompson Instrument)中、在ESF921无血清培养基(Expression Systems)中生长。在感染之前，立刻添加热灭活胎牛血清(Sigma)到最终浓度为5％。以3％的最终浓度用第三传代病毒来感染细胞。在与多种病毒共感染的情况下(针对异源三聚体Gs或Gβγ)，添加每种病毒到最终浓度为3％。培养物的最终体积为每烧瓶3L并且最终细胞密度为3×106个细胞/ml。细胞在感染后48h通过在5000g下离心5mins而收获、在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。
非脂化Gαs的纯化将来自6L昆虫细胞培养物的细胞沉淀物(cell pellet)在缓冲液A(30mM TRIS、pH 8.0、100mM NaCl、5mM MgCl2、5mM咪唑、50μM GDP)中重悬到400ml。添加PMSF(1mM)、胃酶抑素A(2.5μM)、亮抑酶肽(10μM)、完全蛋白酶片剂(罗氏(Roche))、DNase I(50μg/ml)和DTT(100μM)。将细胞通过声处理(在70％的振幅下10分钟)进行破碎并且通过离心(在38,000g下1h)进行澄清。在5ml/min下将上清液加载到5ml镍琼脂糖凝胶FF柱(NiSepharose FF column)(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上。在5ml/min下用25ml缓冲液A、50ml缓冲液B(20mM TRIS、pH 8.0、300mM NaCl、10mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μMGDP)和25ml缓冲液C(20mM TRIS、pH 8.0、300mM NaCl、30mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP)来顺序地洗涤柱。用25ml缓冲液D(20mM TRIS、pH 9.0、50mM NaCl、500mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP)来洗脱柱。将洗脱物在缓冲液E(20mM TRIS、pH 9.0、50mMNaCl、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP、1mM DTT)中稀释到250ml并且在5ml/min下加载到5ml Q琼脂糖凝胶HP柱(Q Sepharose HP column)(通用电气医疗集团)上。将柱用50ml缓冲液E洗涤并且用50mM到300mM NaCl的线性梯度(在缓冲液E中)洗脱。将峰级分合并并且添加TEV蛋白酶以给出1:20w/w的最终比(TEV:Gαs)。将样本针对1L缓冲液F(20mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、10μM GDP)透析过夜。将咪唑(20mM)和Ni-NTA树脂(4ml)添加到样本并且混合1h。将混合物倾倒到包含1m Ni-NTA树脂的一次性柱上，并且收集流通物。用10ml缓冲液F洗涤柱并且将这个洗涤物与流通物合并。使用10KDa MWCO AmiconUltra离心过滤器(密理博(Millipore))将合并样本浓缩到1.5ml。将样本加载到用缓冲液G(10mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、1μM GDP、0.1mM TCEP)平衡的Superdex-200 26/600凝胶过滤柱(通用电气医疗集团)上。将峰级分合并并且浓缩到50mg/ml。将纯蛋白质等分、在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。典型产率为每升培养物6.5mg纯Gαs。
非脂化Gs异源三聚体的纯化非脂化异源三聚体Gs的纯化基本上如针对非脂化Gαs所描述的那样执行，以下除外：用50ml而非25ml缓冲液C来来洗涤镍琼脂糖凝胶柱；洗涤液D包含300mM而非500mM咪唑；缓冲液D和E的pH为8.5而非9.0；用50mM到200mM而非50mM到300mM NaCl的线性梯度来洗脱Q琼脂糖凝胶柱；并且不执行TEV切割步骤，而非将Q琼脂糖凝胶柱的级分浓缩并加载到Superdex-200柱上。典型产率为每升培养物7mg纯Gs。
非脂化Gβγ二聚体的纯化非脂化Gβγ二聚体的纯化基本上如针对非脂化Gαs所描述的那样执行，以下除外：将GDP从所有缓冲液中省略；将MgCl2在从缓冲液B到缓冲液G中省略；洗涤液B和C包含250mM而非300mM NaCl；缓冲液D包含25mM而非50mM NaCl；洗涤液D包含300mM而非500mM咪唑；用1mM EDTA来补充缓冲液E和F；用25mM到200mM而非50mM到300mMNaCl的线性梯度来洗脱Q琼脂糖凝胶柱；并且不执行TEV切割步骤，而非将Q琼脂糖凝胶柱的级分浓缩并加载到Superdex-200柱上。典型产率为每升培养物7.5mg纯Gβγ。
纳米抗体的表达和纯化Nb80和Nb35的合成基因((集成DNA技术公司(IntegratedDNA Technologies))克隆到pET26b(Novagen)中以周质表达在大肠杆菌菌株BL21(DE3)RIL(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))中。将细胞通过声处理(在70％的振幅下10mins)进行裂解。将Nb80通过IMAC和凝胶过滤进行纯化，典型产率为每升培养物12mg纯蛋白质。将Nb35通过IMAC、阳离子交换色谱法和凝胶过滤进行纯化，典型产率为每升培养物26mg纯蛋白质。
最小G蛋白的表达和纯化(用于筛选)将最小G蛋白突变体克隆到pET15b(Novagen公司)中。在大肠杆菌菌株BL21(DE3)RIL中执行表达。细胞在补充有葡萄糖(0.1％)的2TY培养基中生长。在15℃下、用IPTG(100μM)来诱导培养物20h。将细胞通过声处理(在70％的振幅下2mins)进行裂解。将突变体通过IMAC进行部分纯化。将咪唑从PD10柱(通用电气医疗集团)上移除，并且将样本浓缩到20mg/ml。将部分纯蛋白质等分、在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。
最小G蛋白的表达和纯化(最终方案)用最小G蛋白构造转化的BL21(DE3)RIL细胞在补充有葡萄糖(0.2％)和MgSO4(5mM)以及止泡剂(0.01％)的TB培养基中生长。将细胞培养在2L带挡板的烧瓶(Simax)中，在140rpm下振荡。使培养物在30℃下生长，直至达到0.8的OD600。用IPTG(50μM)来诱导表达并且温度降到25℃。细胞在诱导后20h通过在5000g下离心10mins而收获、在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。
将来自1L培养物的细胞沉淀物在缓冲液A(40mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑、5mM MgCl2、50μM GDP)中重悬到200ml。添加PMSF(1mM)、胃酶抑素A(2.5μM)、亮抑酶酞(10μM)、完全蛋白酶片剂、DNase I(50μg/ml)和DTT(100μM)。将细胞通过声处理(在70％的振幅下10分钟)进行破碎并且通过离心(在38,000g下45mins)进行澄清。在5ml/min下将上清液加载到10ml镍琼脂糖凝胶FF柱上。在5ml/min下用100ml缓冲液H(20mMHEPES、pH 7.5、500mM NaCl、40mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP)来洗涤柱。用30ml缓冲液I(20mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、500mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP)来洗脱柱。添加TEV蛋白酶以给出1:20w/w的最终比(TEV:Gαs)。添加DTT(1mM)并且将样本针对2L缓冲液J(20mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、10μM GDP)透析过夜。将咪唑(20mM)和Ni-NTA树脂(4ml)添加到样本并且混合1h。将混合物倾倒到包含1m Ni-NTA树脂的一次性柱上，并且收集流通物。用10ml缓冲液F洗涤柱并且将这个洗涤物与流通物合并。将合并样本浓缩到1.5ml并加载到用缓冲液K(10mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、1μM GDP、0.1mM TCEP)平衡的Superdex-200 26/600凝胶过滤柱上。将峰级分合并并且浓缩到100mg/ml。将纯蛋白质等分、在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。典型产率为每升培养物100mg纯蛋白质。
饱和结合测定将表达β1AR的细胞重悬在1ml的补充有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂(罗氏)的测定缓冲液(20mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl)中。将细胞通过经由弯曲的26G针进行的10次传代进行破碎。将细胞碎片通过离心(在4℃下、在3000g下5mins)移除。将上清液稀释并且针对每个样本采取2×0.96ml等分试样。添加阿普洛尔(120μl)到阴性样本(最终浓度为1mM)并且添加测定缓冲液(120μl)到阳性样本。将样本等分(12×108μl)到PCR板中。添加[3H]-二氢阿普洛尔(12μl)到每个孔(以给出在以下范围内的最终浓度：2.5nM到2.56μM)。将样本混合并在20℃下孵育2h。将样本(2×50μl一式两份)通过用PEI(0.1％)预浸渍的96孔玻璃纤维滤板(默克密理博(Merck Millipore))真空过滤。将每个孔用测定缓冲液(3×200μl)洗涤。将过滤器干燥、冲压成闪烁管并且添加4ml Ultima Gold闪烁液(珀金埃尔默(Perkin Elmer))。通过使用Tri-Carb计数器(珀金埃尔默)进行闪烁计数(每个样本1min)来对放射性定量。从阳性样本中减去阴性样本的数据。用图形绘制数据(Prism)并且从单位点饱和测定分析导出Kd值。
竞争性结合测定将表达β1AR的昆虫细胞重悬在1ml的补充有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂(罗氏)的测定缓冲液(25mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mM抗坏血酸)中。将细胞通过经由弯曲的26G针进行的10次传代进行破碎。将细胞碎片通过离心(在4℃下、在3000g下5mins)移除。将上清液稀释并且针对每个样本采取单个1.68ml等分试样。添加结合配偶体(240μl)(最终浓度为25μM)。在20℃下，将混合物等分(17×96μl)到0.2mlPCR板中。将在含有1U/ml腺苷三磷酸双磷酸酶(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))的缓冲液中制备的异丙肾上腺素(12μl)添加到每个孔中(最终浓度在以下范围内：1pM到10mM)。将阿普洛尔(12μl)添加到阴性样本中(最终浓度为100μM)。将样本混合并在20℃下孵育1.5h。将[3H]-二氢阿普洛尔(12μl)添加到每个孔(β1AR-WT或β1AR-84的最终浓度分别为5nM或20nM)。将样本混合并在20℃下孵育1.5h。正如饱和结合测定方案所描述的，将样本(2×50μl，一式两份)真空过滤。用图形绘制数据并且从单位点拟合Ki分析导出Ki值。
使用类似的方案来执行使用洗涤剂溶解的β1AR-84的竞争性结合测定，以下除外：在4℃下执行所有步骤；在添加结合配偶体之前，用DDM(最终浓度为0.1％)将膜溶解30分钟；正如热稳定性测定方案所描述的，执行结合配体与游离配体的分离(通过凝胶过滤)。
β1AR-WT-mini Gs复合物的热稳定性测量将表达野生型β1AR-WT的昆虫细胞重悬在1ml的补充有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂(罗氏)的测定缓冲液(25mM HEPES、pH 7.5、400mM NaCl、1mM MgCl2、1mM抗坏血酸、0.1％BSA、0.004％杆菌肽)中。将细胞通过经由弯曲的26G针进行的10次传代进行破碎。将细胞碎片通过离心(在4℃下、在3000g下5mins)移除。将上清液稀释并且针对每个样本采取2×0.78ml等分试样。添加阿普洛尔(120μl)到阴性样本(最终浓度为200mM)并且添加测定缓冲液(120μl)到阳性样本。添加结合配偶体(120μl)到这两个样本(最终浓度为25μM)。将在含有1U/ml腺苷三磷酸双磷酸酶(西格玛奥德里奇)的缓冲液中制备的3H-去甲肾上腺素(120μl)添加到这两个样本中(最终浓度为200nM)。将样本混合并在4℃下孵育1h。添加洗涤剂(60μl)到这两个样本(最终浓度:DDM＝0.1％；DM＝0.13％；OG＝0.8％)。将样本混合并在冰上孵育1h。通过离心(在4℃下、在17000g下5mins)移除不可溶物质。将上清液等分(9×120μl)到0.2ml PCR管中。将每个样本加热到期望温度(在4℃与50℃之间)恰好30分钟，随后在冰上淬火30分钟。将样本(2×50μl，一式两份)应用于预先平衡(25mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2,、0.025％DDM)并填装(床体积为225μl)在96孔滤板(默克密理博)中的Toyopearl HW-40F树脂。将板离心(在4℃下、在1800rpm下5mins)。将滤液转移到Isoplates(珀金埃尔默)，并且将200μl的OptiphaseSupermix闪烁液(珀金埃尔默)添加到每个孔。使用MicroBeta计数器(珀金埃尔默)通过闪烁计数(每孔1min)来对放射性定量。从阳性样本中减去阴性样本的数据。用图形绘制数据并且从S形剂量-响应(可变斜率)分析导出表观解链温度(Tm)值。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)对GDP结合的mini Gs突变体进行热稳定性测量用测定缓冲液(10mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mM GDP、2mM DTT)将mini Gs突变体(30μg)稀释到135μl。从20倍储存溶液中添加宝石橙(SYPRO-orange)(15μl)以给出2倍的最终浓度。将样本混合并且将2×50μl等分试样(一式两份)转移到0.2ml PCR管(Qiagen)中。使用Rotor-Gene Q(Qiagen)来执行热稳定性测量。在以4s/℃从25℃斜变到99℃之前，在25℃下将样本平衡90s。使用Rotor-Gene Q软件从分析中导出与曲线的拐点相对应的解链温度(Tm)。将Tm值计算为三个独立实验的平均值±SEM。
最小G蛋白复合物的凝胶过滤分析使用mini Gs399来制备mini Gs-βγ复合物：N端残基6到25被代替并且L272D突变被逆转的构造(参见表2)。将纯化mini Gs399与非脂化Gβ1γ2亚基以等摩尔比(各自为6.7nmol)混合、用缓冲液L(10mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、1μM GDP、0.1mM TCEP)稀释到200μl并且在冰上孵育4小时。将整个样本(200μl)加载到用缓冲液L平衡的Superdex-20010/300凝胶过滤柱上。
使用在LMNG洗涤剂中纯化的野生型β1AR-WT来制备β1AR-mini Gs复合物。将纯化β1AR-WT和mini Gs以等摩尔比(各自为3.3nmol)混合、用缓冲液M(10mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、1μM抗坏血酸、1μM异丙肾上腺素、0.002％LMNG)稀释到200μl并且在冰上孵育4小时。将整个样本(200μl)加载到用缓冲液M平衡的Superdex-20010/300凝胶过滤柱上。
实例2：用于检测非脂化Gs到β1AR的偶联的测定的开发
引言
大量结构和生物物理数据提供了关于获得高分辨率结构的G蛋白-GPCR复合物为何被证明是困难的的线索：无核苷酸G蛋白内的柔性似乎是主要问题7，24，42，61。我们已经工程化了仍与GPCR偶联但移除了已经使复合物的结晶化如此困难的多数柔性的最小GPCR结合蛋白。首先，我们开发能够检测非脂化Gs与β1AR的偶联的测定。接下来，我们表达与Gαs分离的GTP酶结构域并且证明其即使在βγ二聚体不存在的情况下也能够偶联β1AR。然而，由于较差的表达和严重的热不稳定性，因此GTP酶结构域的产生是困难的。因此，我们执行诱变筛选并且标识出提高了分离GTP酶结构域的表达和稳定性两者的突变，同时保留蛋白质的基础鸟嘌呤核苷酸结合特性和功能。我们发现的突变在异源三聚体G蛋白之中是充分保守的，并且预期转移到所有四类α亚基的成员。因此，这个方法可以用于产生能够偶联几乎所有GPCR的GTP酶结构域库。在本文中，我们描述了最小工程化G蛋白α(MEGA)结构域的设计，所述MEGA结构域偶联活化GPCR并且诱导与高亲和力激动剂结合状态相关联的核心药理学和构象变化。
结果
开发用于检测非脂化Gs与β1AR的偶联的测定
我们已经开发了能够检测纯化非脂化Gs(参见实验过程)到包含β1AR受体的细胞膜的偶联的竞争性结合测定。最初，我们对不同β1AR构造进行筛选，以标识响应于Nb80结合而显示出较大激动剂亲和力增大的受体。接近野生型β1AR构造(β6)针对异丙肾上腺素具有相对较高的亲和力(大约180nM)，所述亲和力响应于Nb80结合仅增大了3.5倍(图13a)。然而，一系列最小热稳定受体响应于Nb80结合而显示出大得多的转变。选择这些构造中的包含四个热稳定突变的一个构造(β84)来进一步表征Nb80和Gs的偶联。β84针对异丙肾上腺素具有低得多的亲和力(大约7.1μM)，但是在Nb80结合时显示出更加显著的转变，从而导致亲和力为大约16nM(图13b)。然而，Gs偶联仅导致小的激动剂亲和力转变，从大约6.9μM到1.4μM(图13c)。因此，我们假设，添加用于促进β2AR–Gs复合物7的结晶化的Nb35可以稳定复合物并且产生较大的激动剂亲和力转变。这里，我们观察到从大约6.9μM到68nM的异丙肾上腺素亲和力转变(图13d)，类似于用Nb80获得的转变。
Gαs的分离GTP酶结构域的表达和表征
对大量构造进行测试以找到将GTP酶结构域与Gαs分离的最佳方法。这个过程基本上涉及螺旋结构域从其在开关I区内的位置的缺失。所估计的策略为：(1)缺失螺旋结构域和在β2AR-Gs复合物7的晶体结构中无序的任何关联区域(残基57到207)；(2)缺失螺旋结构域(残基70到193)，并且将所得端与短甘氨酸连接子联接以保留接近天然的开关I区；(3)缺失螺旋结构域和开关I(残基65到203)，并且将所得端与较长的甘氨酸连接子联接；(4)缺失螺旋结构域和开关I(残基67到205)，并且从结构上相关的小GTP酶对开关I区进行插入。对每个策略的许多变化进行测试，因此所引用的残基范围是近似值。我们发现，策略(1)移除了GTP酶结构域的在受体不存在的情况下对其稳定性至关重要的区域并且因此是不适合的。策略2到4全部成功，并且导致小量分离GTP酶结构域表达在大肠杆菌中(大约100μg/L培养物)。不同构造之间的表达水平是可变的，但是难以定量。通常，螺旋结构域和开关I的完全移除(策略3)导致最高表达水平。
分离GTP酶结构域从大肠杆菌部分纯化并且其偶联β1AR的能力是使用上述激动剂转变测定来确定的。首先，我们测试GTP酶结构域的偶联，但是并未观察到亲和力增大(图14a)。其次，我们在βγ亚基和Nb35(图14a)存在的情况下测试GTP酶结构域，这里观察到亲和力转变(从大约3.3μM到206nM)。最终，我们在4℃下测试GTP酶结构域的偶联(图14b)，这里观察到亲和力转变(从大约3.9μM到253nM)。这证明，分离GTP酶结构域是活性的并且能够在βγ亚基不存在的情况下偶联受体。然而，其指示，GTP酶结构域是热不稳定的并且需要工程化来产生适合于结晶化应用的稳定蛋白质。
通过诱变对GTP酶结构域的稳定
执行对大约50种修饰(突变、缺失和嵌合体)的初始筛选。修饰被设计成：移除多余序列(与小GTP酶相比)、稳定核苷酸结合位点、限制构象上动态的开关区、稳定G蛋白的非活性状态或稳定G蛋白的活性构象。并未在与受体直接相互作用的区域进行修饰。用于诱变的亲本构造由以下项组成：N端20个氨基酸缺失、螺旋结构域的完全缺失、以及稍微修饰的开关I区的保留(参见实验过程)。
突变体表达在大肠杆菌中并且通过IMAC部分纯化。为了估计每种修饰的稳定效应，在4℃和20℃下执行激动剂转变测定；测定数据的总结呈现于表5中。突变体的表达水平广泛地有所不同，因此测定中使用的每个突变体的浓度无法标准化。相反，从一升培养物纯化的全部量的蛋白质包括在每个测定中。重要的是，测定中使用的蛋白质的浓度不影响激动剂亲和力转变的大小。因此，数据必须被解释为表达水平和稳定作用的组合。标识出明显提高了分离GTP酶结构域的表达和/或稳定性的四种关键修饰(Δ开关III、A249D、L272D和H41I)(表5)。A249D突变和开关III缺失均导致了显著提高的表达水平(大约1-2mg/L培养物)；L272D和H41I突变并未显著提高表达水平。在4℃下测定时，所有突变诱导大的激动剂亲和力转变(最终异丙肾上腺素亲和力为10nM到60nM)(表5)。此外，在20℃下测定时，A249D和Δ开关III突变体诱导大的激动剂亲和力转变(最终异丙肾上腺素亲和力分别为53nM和30nM)(表5)。在20℃下测定时，L272D和H41I突变体也诱导激动剂亲和力转变(最终异丙肾上腺素亲和力分别为464nM和589nM)(表5)，但是不如A249D和Δ开关III突变体那样大。然而，必须注意，测定中使用的A249D和Δ开关III突变体的浓度高大约5倍。还标识出提高了GTP酶结构域的稳定性的四种附加突变(G49D、E50N、G226A和S252D(表5)。然而，这些突变接近上述位点指示，其作用机制可能类似，因此，其加性特性必须凭经验来确定。
讨论
GPCR在其完全活性构象下的高分辨率结构的解决方案对于设计新型激动剂化合物具有主要重要性。我们已经开发了独特的策略来工程化G蛋白α亚基的分离GTP酶结构域以便耦合和在构象上活化GPCR。
异源三聚体G蛋白可以高效地耦合处于其脂化的膜关联状态的GPCR。MEGA结构域包括非脂化突变Gα亚基，所述非脂化突变Gα亚基的受体结合机制预期类似于全酶的受体结合机制。因此，设计MEGA结构域的前提是开发能够检测非脂化G蛋白与GPCR的偶联的测定。最初，我们发现，非脂化Gs针对最小热稳定β1AR仅诱发小的激动剂亲和力转变。然而，用于促进β2AR-Gs复合物7的结晶化的Nb35的添加产生了大得多的响应。Nb35似乎通过在构象上限制开关II区以及稳定α/β亚基界面来抑制G蛋白异源三聚体的解离。Nb35因此有可能降低GPCR-G蛋白三元复合物的构象动态，从而可能模仿膜锚定的稳定效应，但是通过不同机制进行。
我们评估了用于将GTP酶结构域与Gs分离的若干个不同策略。我们发现，螺旋结构域和开关I的完全移除产生了稍微更好的表达和稳定性。最初，我们发现，GTP酶结构域仅在βγ二聚体和Nb35存在的情况下诱发显著的激动剂亲和力转变，从而表明，仍需要βγ亚基来用于高效偶联。然而，我们假设，βγ二聚体和Nb35可以仅用于稳定热不稳定GTP酶结构域28。因此，我们在4℃下重复测定，并且发现GTP酶结构域能够以不依赖βγ的方式高效偶联受体。GPCR可以催化Gα亚基上的低水平核苷酸交换4，然而，需要βγ二聚体来促进快速交换以及因此信号放大56，57。螺旋结构域的缺失允许GTP酶结构域与受体以不依赖βγ的方式高效偶联。这可能是由于与GTP酶结构域更加快速的GDP解离，所述解离导致更加高效地偶联受体。同时，这些数据表明，受体与分离GTP酶结构域之间的相互作用机制类似于全酶的相互作用机制。因此，MEGA结构域有可能诱导受体发生类天然构象变化，并且因此表示对G蛋白偶联的真实模仿。
我们使用诱变来提高GTP酶结构域的稳定性和表达。识别出明显提高GTP酶结构域的表达水平和/或稳定性的许多关键突变，所述关键突变的机制在下文进行讨论。A249D突变提高了GTP酶结构域的表达和稳定性两者。在小GTP酶中，天冬氨酸常常发现于这个位置，在所述位置，天冬氨酸通过盐桥相互作用来稳定NKXD基元的赖氨酸。这个赖氨酸残基形成核苷酸结合袋的基础并且参与与鸟嘌呤环的π阳离子堆叠相互作用92。这个位置并未被小GTP酶中的天冬氨酸排他地占据，然而，在各个种类中，所述位置通常是保守的或非保守的，从而指示所述位置可以是某些GTP酶家族的稳定性所固有的。除了其中存在谷氨酸残基的Gαz之外，在异源三聚体G蛋白中，这个位置被丙氨酸或丝氨酸残基占据。然而，来自NKXD基元的赖氨酸是通过与来自螺旋结构域的天冬氨酸或谷氨酸(Gαs中的Asp-173)的盐桥相互作用来稳定的。这个相互作用在结构域界面在活化期间分离时破碎7。认为A249D突变稳定了核苷酸结合袋并增大了GDP结合亲和力，但是尚未对此进行测试。
开关III的缺失提高了GTP酶结构域的表达和稳定性两者。在异源三聚体G蛋白中，开关III参与介导通过GTP摄取产生的构象变化，并且效应器结合93所需要的。在小GTP酶中，开关III是不存在的并且相应区域由不同的二级结构要素组成：β4串在I型转角中封端，所述I型转角直接连接到在α3螺旋之前的310螺旋线段(使用STRIDE web服务器来执行二级结构指定94，95)。通过缺失开关III实现的稳定性的提高有可能是用更加有序的二级结构要素代替高度柔性环的结果。表达水平的增大有可能是由于提高稳定性与能量学上更有利的折叠通路的组合造成的。
H41I突变显著提高了分离GTP酶结构域的稳定性。据报道，组氨酸41大大地有助于在Gαs中观察到的基础核苷酸交换与Gt相比升高的水平96。之前有报道称，在Gt中的这个位置处发现的组氨酸41到缬氨酸的突变使Gαs的基础核苷酸交换水平减半96。我们示出了，H41V突变提高了MEGA结构域的稳定性(参见表5)，然而，在这个位置，H41I突变是最佳的。这一突变提高了GTP酶结构域的稳定性，因为所述突变增强了α5螺旋与αN/β1环之间的相互作用。这个区域中的紧密填装稳定了α5螺旋，由此降低了GDP解离速率96。
位于α2螺旋(邻近开关II)中的L272D突变显著提高了分离GTP酶结构域的稳定性。开关II在GDP结合状态与GTP结合状态之间明显改变了结构97：在GDP结合状态下，开关II更加动态，并且在晶体结构中常常是无序的98；在GTP结合状态下，开关II变得高度有序30，99，并且在Gs中，这个区域形成主要的效应器结合位点100。L272D突变有可能与开关II直接相互作用，并且在构象上限制整个区域。有趣的是，L272D突变可以与开关II中高度保守的精氨酸残基(Arg-231)形成盐桥相互作用，所述精氨酸残基针对GTP结合状态下的这种相互作用理想地定位30。这有可能通过限制将开关II下面的疏水残基暴露于水性环境来提高GTP酶结构域的稳定性。
总之，我们已经证明，尽管不稳定且较差地表达，但是来自Gαs的分离GTP酶结构域可以不依赖βγ的方式高效地偶联β1AR。我们已经执行了广泛的诱变筛选并且标识出明显增大结构域的表达和/或稳定性的四个关键突变。
方法和物质
β1AR构造用于G蛋白结合测定的β84构造包含多种修饰：N端MBP融合蛋白；N端截短(残基1到32)；细胞内环3缺失(残基244到271)；在残基367处的C端截短；C端六组氨酸标签；C116L突变；工程化二硫键(M40C到L103C)；以及四个热稳定突变(M90V、D322K、F327A和F338M)。受体是使用BaculoGold杆状病毒表达系统(BD Bioscience)表达在粉纹夜蛾(HighFive)细胞系(Life Technologies)中的。
Gαs GTP酶结构域构造下文中描述了用于初始诱变筛选的亲本GTP酶结构域(所有编号是指G长同种型αs)。构造由以下项组成：N端六组氨酸标签；N端缺失(残基1到20)；螺旋结构域缺失(残基71到193)，从而保持接近天然的开关I是完好的并且将端与连接子联接；以及开关I区中的两种突变(L197A和C200S)，以便移除通过移除螺旋结构域而暴露的不利的表面残基。
异源三聚体Gs的表达和纯化本研究中使用的非脂化异源三聚体Gs由以下项组成：人Gαs(长形式：包括连接子1中的可变剪接区)，所述人Gαs包含N端的用于移除所有可能的棕榈酰化位点的四个氨基酸缺失101；人Gβ1(包含N端六组氨酸标签)；以及包含用于移除异戊二烯化位点的C68S突变的人Gγ2102。对每个个体亚基进行编码的杆状病毒构造是使用flashBAC ULTRA系统(Oxford Expression Technologies)构造的。将Gs异源三聚体表达在草地贪夜蛾(SF9)细胞中，所述草地贪夜蛾(SF9)细胞是在含有10％胎牛血清(Gibco)和1％脂质(BD Bioscience)的TNM-FH培养基(Sigma)中生长的。以1:1:1的比例、以每个亚基2％的浓度、使用P3病毒来感染细胞。将细胞在27℃下孵育48小时。将细胞通过在4000g下离心10分钟收获并且用PBS(培养物体积的15％)洗涤。将细胞沉淀物在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。
将来自三升培养物的细胞沉淀物重悬在150ml的含有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(30mM Tris、100mM NaCl、10％甘油、5mM MgCl2、100μM GDP、0.5mM PMSF、2.5μM胃酶抑素A、10μM亮抑酶肽、50μg/ml DNase I、50μg/ml RNase A、pH 8.0)中，并且添加DTT到最终浓度为0.1mM。将细胞通过声处理进行破碎，并且通过在38000g下离心40分钟来移除不可溶物质。将上清液过滤(0.45μM)并且在5ml/min下加载到5ml镍琼脂糖凝胶快速流动HisTrap柱(通用电气医疗集团)上。用十个柱体积的裂解缓冲液、随后用十个柱体积的洗涤缓冲液(20mM Tris、250mM NaCl、5mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP、pH 8.0)在5ml/min下洗涤柱。在2ml/min下，用25ml洗脱缓冲液(20mM TRIS、50mM NaCl、200mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP、pH 8.3)来洗脱柱。用225ml的缓冲液(20mM Tris、50mMNaCl、10％甘油、0.5mM MgCl2、50μM GDP、1mM DTT、pH 8.3)来稀释洗脱液。在5ml/min下，将混合物直接加载到5ml Q琼脂糖凝胶HP HiTrap柱(通用电气医疗集团)上。在5ml/min下，用十个柱体积的Q缓冲液来洗涤柱。在2ml/min下，用从50mM到250mM的线性NaCl梯度(含有250mM NaCl的Q缓冲液)经40个柱体积来洗脱Gs。将含有Gs的级分合并并用10KDa截留Amicon Ultra浓缩管(密理博)浓缩至5mg/ml到10mg/ml。在1ml/min下，将浓缩Gs加载到用GF缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、10％甘油、0.2mM MgCl2、2μM GDP、0.1mM TCEP、pH 8.0)平衡的Superdex-200(16/60)凝胶过滤柱(通用电气医疗集团)上。将含有纯Gs的级分合并、浓缩到10mg/ml、在液氮下快速冷冻并且储存在-80℃下。典型产率为每升培养物1mg到2mg纯Gs。
Nb35的表达和纯化将Nb3510基因合成(集成DNA技术公司)并克隆到pET26b载体(默克(Merck))中。将Nb35表达在BL21(DE3)-RIL细胞(默克)中。使培养物在37℃下、在补充有葡萄糖(0.1％)和MgSO4(2mM)的极品肉汤(terrific broth)培养基中生长到OD600nm为0.8。用IPTG(50μM)在28℃下诱导表达大约18小时。将细胞通过在4000g下离心来收获并储存在-80℃下。
将来自六升培养物的细胞沉淀物重悬在200ml的含有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(40mM Hepes、100mM NaCl、5mM咪唑、5mM MgCl2、1mM PMSF、100μg/ml溶菌酶、50μg/ml DNase A、pH 7.5)中。将细胞在冰上孵育30分钟、然后通过声处理进行破碎，并且通过在38000g下离心30分钟来移除不可溶物质。将上清液过滤(0.45μM)并且在5ml/min下加载到5ml镍琼脂糖凝胶快速流动HisTrap柱(通用电气医疗集团)上。在5ml/min下，用15个柱体积的洗涤缓冲液(20mM Hepes、300mM NaCl、40mM咪唑、pH 7.5)来洗涤柱。在2ml/min下，用25ml洗脱缓冲液(20mM Hepes、500mM咪唑、pH 7.0)来洗脱柱。将洗脱液用225ml的SP缓冲液(20mM Hepes、pH 7.0)稀释，并且在5ml/min下直接加载到5ml SP琼脂糖凝胶HPHiTrap柱(通用电气医疗集团)上。在5ml/min下，用十个柱体积的SP缓冲液来洗涤柱。在2ml/min下，用从0mM到250mM的线性NaCl梯度(含有250mM NaCl的SP缓冲液)经40个柱体积来洗脱Nb35。将含有Nb35的级分合并并且针对500ml的GF缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、10％甘油、pH 7.5)透析过夜，具有两个外部缓冲液变化。将Nb35用3KDa截留Amicon Ultra浓缩管(密理博)浓缩到20mg/ml。在1ml/min下，将浓缩Nb35加载到用GF缓冲液平衡的Superdex-200(16/60)凝胶过滤柱(通用电气医疗集团)上。将含有纯Nb35的级分合并、浓缩到20mg/ml、在液氮下快速冷冻并且储存在-80℃下。典型产率为每升培养物5mg纯Nb35。
用于激动剂转变测定的Gαs GTP酶结构域的部分纯化将GTP酶结构域表达在BL21(DE3)-RIL细胞中。使细胞在25℃下、在补充有葡萄糖(0.1％)的2TY培养基中生长到OD600nm为0.5到0.8。用IPTG(100μM)在15℃下诱导表达大约16小时。将细胞通过在4000g下离心来收获并储存在-80℃下。
将来自两升培养物的细胞沉淀物重悬在22ml的含有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(30mM Tris、100mM NaCl、10mM咪唑、20％甘油、5mM MgCl2、3mM ATP、100μMGDP、0.5mM PMSF、2.5μM胃酶抑素A、10μM亮抑酶肽、50μg/ml溶菌酶、20μg/ml DNase I、pH7.5)中。添加DTT(0.1mM)并且将细胞在冰上孵育30分钟。将细胞通过声处理进行破碎，并且通过在50000g下离心40分钟来移除不可溶物质。将上清液过滤(0.45μM)，添加1ml镍琼脂糖凝胶快速流动树脂(通用电气医疗集团)并且将悬浮液在4℃下混合1.5小时。将混合物倾倒在空PD10柱(通用电气医疗集团)中并且用20ml的洗涤缓冲液(20mM Tris、300mM NaCl、40mM咪唑、20％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP、pH 7.5)洗涤。将柱用2.5ml洗脱缓冲液(20mMTRIS、100mM NaCl、400mM咪唑、20％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP、pH 7.5)洗脱。使用PD10柱(通用电气医疗集团)将部分纯化的蛋白质脱盐到GF缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP、0.1mM DTT、pH 7.5)中。使用10KDa截留Amicon Ultra浓缩管(密理博)将脱盐蛋白质浓缩到最终浓度为400μL。将浓缩蛋白质在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。
激动剂转变测定将来自大约2ml的表达β84受体构造的High Five培养物的细胞沉淀物重悬在1ml的含有Complete无EDTA蛋白酶抑制剂(罗氏)的裂解缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mM抗坏血酸、pH 7.5)中。将细胞通过经由弯曲的26G针进行的10次传代来裂解，并且将不可溶物质通过离心(在3000g下5mins)移除。将包含粗膜级分的上清液在裂解缓冲液(需要每竞争曲线0.8ml)中稀释到8ml。将G蛋白、MEGA结构域、Nb80或缓冲液(200μl)添加到粗膜(0.8ml)，并且通过经由弯曲的26G针进行的3次传代来均质化。测定中使用的G蛋白或Nb80的最终浓度为大约1mg/ml；所使用的MEGA结构域的最终浓度取决于其表达水平。将九等分试样(每等分88μl)转移到96孔PCR板(在冰上)。将异丙肾上腺素(11μl)添加到七个样本中以给出1×10-3M到1×10-9M的最终竞争性配体浓度曲线；在含有1U/ml腺苷三磷酸双磷酸酶(Sigma)的裂解缓冲液中制备异丙肾上腺素稀释液。将缓冲液(11μl)添加到剩余样本之一中以确定总信号，并且将阿普洛尔(11μl)添加到最终样本中以确定背景信号(最终浓度为100μM)。将样本在4℃下孵育2小时(或在20℃下孵育1小时)。将3H-二氢阿普洛尔(珀金埃尔默)添加到每个孔中(11μl)以给出最终浓度10nM(≤β84的Kd)。将样本在4℃下孵育2小时(或在20℃下孵育1小时)。将样本在被预浸渍在含有0.1％PEI的裂解缓冲液中的96孔GF/B滤板(密理博)上过滤。将板用冰冷的洗涤缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、1mM MgCl2、pH 7.5)洗涤三次(200μl)。将板干燥并且将过滤器冲压成闪烁管。添加闪烁液(4ml)，件样本孵育过夜并且然后将氚在液体闪烁计数器(Beckmann Coulter)中计数。使用Prism(GraphPad)的‘单位点-拟合logIC50’功能来分析数据。
实例3：应用
MEGA结构域具有广泛应用于设计用于调节GPCR和G蛋白活性的疗法。
GPCR在纯化期间的稳定
GCR在构象上是动态的，这导致了其较差的洗涤剂热稳定性69。MEGA结构域有可能在构象上且热稳定GPCR，并且因此将会提高纯化过程的效率。
GPCR在其完全活性构象下的热稳定
MEGA结构域有可能显著提高其结合的GPCR的热稳定性。然而，稳定性的进一步明显提高可以同受体在与MEGA结构域复合时的诱变热稳定88来实现。所得MEGA-StaR复合物将会是高度稳定的，并且适合于甚至要求最多的应用。此外，以此方式热稳定的GPCR可以甚至是在MEGA结构域不存在的情况下采用完全活性构象，从而为药物设计提供难得的机会。
GPCR在其完全活性构象下的结构确定
使用x射线晶体学和NMR，MEGA结构域的稳定特性将会允许进行GPCR的高亲和力激动剂结合状态的高分辨率结构确定。
针对活化GPCR的片段文库筛选
MEGA结构域也可以是使用结构法和非结构法进行片段文库筛选的有价值工具。存在有力证据表明，一旦三元G蛋白-GPCR复合物形成，配体就可以在不使复合物解离的情况下从结合袋中移除：对无核苷酸视紫红质-转导蛋白复合物的羟胺处理使视紫红质与视黄醛之间的Schiff基键发生水解，从而导致视黄醛肟释放14。然而，这既不使复合物解离也不使Meta-II光化学状态衰变成非活性视蛋白，此外，生色团位点似乎仍处于其开放构象14。因此，可能可以产生无配体MEGA-GPCR复合物，其中空配体结合袋保持高亲和力激动剂结合构象。无配体复合物表示使用生物物理方法或晶体浸渍技术进行片段文库筛选的理想底物。这些复合物也将会对设计用于靶向孤独受体的激动剂具有显著重要性。
筛选阻断特异性G蛋白-GPCR界面的混合物
GPCR的配体结合袋和细胞外表面是药物设计所运用的主要靶标，然而，下游信号传导蛋白也具有显著的治疗潜力。已经报道了调节G蛋白α亚基的若干个肽和小分子70-72。尽管这些分子通常靶向单个种类的G蛋白，但是G蛋白喜欢传导的混杂性质意味着其不可能适合于治疗应用。MEGA-GPCR复合物的结构将会允许设计靶向特异性G蛋白-受体界面的小分子。因此，可以抑制通过特异性G蛋白-受体对进行的信号传导，同时保留受体和G蛋白两者在其信号传导级联中的活性。
基于细胞的测定的开发
由于其单体性质，MEGA结构域将会可用于开发用于研究体内受体/G蛋白偶联的荧光测定。
理解受体特异性的分子机制
MEGA结构域还可以允许我们确定超过Gα-GPCR界面的受体特异性分子机制。MEGA结构域可以用βγ亚基的不同组合重新构造，这些GPCR-MEGA-βγ复合物可能比完全G蛋白-GPCR复合物更适于结晶化。因此，可以研究受体的C端与βγ亚基之间的相互作用。这可以允许基于G蛋白异源三聚体的βγ组分来设计可以靶向特异性GPCR-G蛋白复合物的变构调节剂。
作为治疗剂的MEGA结构域
MEGA结构域可被工程化以螯合GPCR、βγ亚基或下游效应器。这些显性负向突变体本身可以是有价值的治疗剂，例如在癌症治疗中。
实例4：与工程化G蛋白结合的腺苷A2A受体的结构
引言
G蛋白偶联受体(GPCR)是贯穿身体的化学细胞内信号传导网络的基本组分。为了理解信号传导的分子机制，在非活性构象下和在活性构象下与异源三聚体G蛋白偶联的受体的结构是必需的。这里，我们报道了以的分辨率与高度工程化G蛋白mini Gs结合的腺苷A2A受体(A2AR)的第一结构。mini Gs通过类似于但不同于β2-肾上腺素受体与Gs之间的界面的广泛界面与A2AR结合。与mini Gs结合的A2AR的结构标识出将受体从激动剂结合活性-中间状态过渡到完全活性G蛋白结合状态所涉及的关键氨基酸残基。结构突出显示了GPCR-G蛋白偶联的多样性和相似性并且以分子基础的可能复杂性暗示了G蛋白特异性。
腺苷是活化人的四个不同腺苷受体A1、A2A、A2B和A3的信号传导分子，并且已经牵涉在包括(104，105中综述的)血管生成、免疫功能和睡眠调控的宽范围的生理过程中。另外，存在有力证据证明高浓度细胞外腺苷对细胞健康有害并且促成了在(106中综述的)神经变性疾病、炎性病症、癌症和局部缺血再灌注损伤中观察到的病理学作用。因此有相当大的兴趣开发针对腺苷受体的亚型特异性激动剂和拮抗剂。在过去的40年间，已经通过传统药物化学105,107开发了宽范围的混合物，并且最近，已经实施了基于结构的药物设计来开发腺苷A2A受体(A2AR)的新型拮抗剂以用于帕金森病108的可能治疗。激动剂靶向A2AR(瑞加德松)经FDA批准用于心肌灌注显像107并且针对A3R具有特异性的激动剂就其抗癌和抗炎特性109正在开发中。
对与反向激动剂110-112或激动剂1,4,113结合的A2AR的结构的比较阐明了亚型特异性和效率114的分子决定簇。然而，并未完全理解活化受体以允许与G蛋白偶联的机制以及G蛋白选择性的基础。处于非活性状态的A2AR的结构已被确定为与拮抗剂ZM241385110-112、XAC110、咖啡因110或1,2,4-三嗪108结合，并且所有结构非常类似。在最高分辨率结构中标识出可以充当变构拮抗剂的膜内Na+离子，并且随后在GPCR的其它高分辨率结构96,116,117中标识出同源Na+离子。在与腺苷1、NECA1、CGS21680113或UK4320974共同结晶化后，A2AR的四种激动剂结合结构也已经确定。所有结构非常类似并且被认为表示受体的活性-中间构象，但不表示结合G蛋白1的完全活性构象。支持这一结论的观察包括，存在保守氨基酸残基的与其它GPCR的活化相关联的关键旋转异构体变化，而不存在跨膜螺旋6(H6)的细胞质末端远离受体核心114显著移动。A2AR的G蛋白偶联状态与未偶联状态118相比展现出更高亲和力的激动剂结合，但是不清楚到目前为止确定的激动剂结合结构以高亲和力构象还是低亲和力构象来描绘结合袋。相比于A2AR，与激动剂结合的β1AR或β2AR的结晶化产生了与和拮抗剂2,3结合的结构仅有细微不同的非活性构象的结构。现在显而易见的是，β2AR以构象的总体存在，无论是与拮抗剂、激动剂还是根本无配体结合，并且激动剂的存在增大了形成活性状态119的可能性。然后通过G蛋白10的结合或通过模仿的G蛋白(纳米抗体)38来稳定活化状态。因此，为了阐明A2AR的活化状态的结构，我们已经确定了其与工程化G蛋白结合的结构。
结果
G蛋白结合A2AR的结构。
存在与异源三聚体G蛋白结合的GPCR的单一报道结构，即，Gs结合β2AR10。结晶化是真实壮举，需要开发特异性抗体Nb35以通过以下项来稳定Gαβγ三聚体：在Gα与Gβ之间的界面处结合，将T4-溶菌酶与β2AR的N端融合，使用用于内消旋结晶化的新型单油精衍生物MAG7:7，以及用于纯化和结晶化的复合物过程。β2AR-Gs结构10示出了，针对Gα亚基进行了受体与G蛋白之间的几乎所有接触，并且因此，在理论上，Gβγ不需要用于复合物形成。因此我们采取了替代性方法，从而工程化Gαs亚基以使其适于形成良序晶体，这原则上应该允许活化状态120下的任何Gs偶联受体结晶化。我们开发了包括Gαs的GTP酶结构域的截短形式的最小G蛋白，mini Gs，包括用于在Gβγ不存在的情况下和在洗涤剂120存在的情况下稳定蛋白质的8点突变。截短包括开关III区、来自N端的23个氨基酸以及α螺旋结构域，所有截短将会有益于通过降低复合物的结构异质性来形成晶体。mini Gs再现了在异源三聚体G蛋白Gs存在的情况下孵育受体时发生的激动剂亲和力增大并且mini Gs还示出了与变构拮抗剂Na+存在的情况下相同的敏感性(图15和图16)。另外，mini Gs在激动剂NECA存在的情况下与A2AR容易形成复合物并且复合物比NECA结合A2AR更加热稳定得多，特别是在短链洗涤剂中(图17)。这个复合物通过蒸汽扩散在洗涤剂辛基硫葡糖苷中结晶化并且数据集从两个晶体中收集(参见进一步方法)。A2AR-mini Gs结构是使用NECA结合A2AR(PDB ID：2YDV)1的结构以及来自β2AR-Gs复合物(PDB ID:3SN6)10的Gαs GTP酶结构域作为搜索模型通过分子代替来确定的并且结构精化到(表6)。
存在每晶体学非对称单元由链A和C(复合物AC)或链B和D(复合物BD)组成的两种mini Gs-A2AR复合物。最佳电子密度是针对复合物AC(链A，A2AR；链C，mini Gs)观察到的，并且包括与A2AR结合的激动剂NECA的密度和与mini Gs结合的GDP的分子的密度(图18)。复合物BD中的链B(A2AR)也含有NECA的密度，但是链D(mini Gs)不含有与GDP相对应的密度。结构中不清楚的是mini Gs的两个分子为何在GDP占据方面有所不同，因为结构几乎相同(1127原子内的rmsd为)并且尽管链D中的GDP位点在对称相关受体(链A)的细胞外环2附近，但是这个环是无序的并且并未表明其将会阻止核苷酸结合。GDP存在于mini Gs结构中反映了工程化G蛋白的特性，所述工程化G蛋白在复合物形成之后对GTPγS介导的解离120并不敏感。因此，这个结构可被认为是GDP解离之前GPCR与GDP结合G蛋白之间的复合物。不对称单元中的这两个A2AR分子也几乎相同(1665个原子内的rmsd为)，但是由于跨膜螺旋6(H6；下文讨论的)的细胞质末端的向外移动而显著不同于之前确定的A2AR结构。复合物AC与复合物BD的结构比对示出了，mini Gs略有不同地定向在受体之间，GTP酶结构域相对于受体旋转3°，并且导致了mini Gs与A2AR之间的填装略有不同(图19)。尽管这可能是由于一个复合物中存在GDP而另一个复合物中不存在，但是看似更可能的是这是由于晶格接触的不同引起的。即便如此，这可以表示mini Gs与A2AR之间的界面由于活化G蛋白和受体的柔性性质而发生的天然变化。所有随后的分析将在复合物AC的上下文中进行讨论，因为这个复合物的电子密度被更好地定义，尤其是针对mini Gs与A2AR之间相互作用所涉及的残基中的一些。
复合物AC中的mini Gs与A2AR之间的界面形成在来自受体的20个氨基酸残基与mini Gs中的17个残基之间(图19、图20和图21)，包括受体上的总埋藏表面面积。惊人的是，在与mini Gs接触的20个氨基酸残基中，存在6个Arg残基、10个疏水残基和2个Gln残基。受体中接触mini Gs的主要区域发现于H3的细胞质末端、细胞质环2(CL2)、H5的细胞质末端、H6中的三个残基以及H7与H8之间的转角处的带正电荷区处(图20)。在mini Gs中，接触主要由涉及针对A2AR的H3、CL2、H5、H6、H7和H8中的残基填装的14个氨基酸残基α5螺旋进行。附加相互作用包括在A2AR中与CL2中的残基接触的以下项：β折叠层S1中的His41S1.2、S3中的Val217S3.1和S2与S3之间的环中的Asp215S2S3.1(图22；上标是指G蛋白CGN系统103)。A2AR和mini Gs中的氨基酸残基形成主要经由范德华力相互作用(～90％的接触)填装在一起的互补表面，其中跨界面有6个极性相互作用。这个互补性在A2AR的CL2中的序列PLRY针对S1、S3、S2-S3环和α5中的残基填装时特别明显，其中Leu110位于由His41S1.2、Val217S3.1、Phe376H5.8、Cys379H5.11和Arg380H5.12形成的袋中。螺旋α5突出到在A2AR的细胞质面内通过H6的细胞质末端的向外移动产生的裂隙中，α5螺旋的顶点Tyr391H5.23与形成裂隙的整个上表面的Arg1023.50(上标是指GPCR Ballesteros-Weinstein编号系统121)进行广泛的范德华力相互作用(图22)。α5螺旋的整体取向还可以通过受体的H8与α5之间的有利螺旋偶极来促成，所述有利螺旋偶极形成几乎连续的扭结螺旋。
β2AR-Gs结构和A2AR-mini Gs结构中的受体-G蛋白界面的比较
A2AR-mini Gs复合物和β2AR-Gs复合物10中的受体的叠加示出了，受体具有非常类似的架构(1239个原子内的rmsd为)，其中大多数差异发生在氨基酸序列最分散的细胞外区域(图22)。相比之下，受体的细胞内面很好地进行比对，包括H6的细胞质末端的大的向外转变。然而，mini Gs并未恰好叠加在与β2AR结合异源三聚体G蛋白的Gα亚基上(图22)，在取向方面有～15°的差异，但是α5螺旋的差异较小(～10°)。这是A2AR中与β2AR相比不同的氨基酸残基的结果(图18和图22)，导致了G蛋白与受体略有不同的填装。然而，mini Gs与和β2AR结合的Gαs的比对示出了，mini Gs和Gαs基本上相同(1158个原子内的rmsd为)，最显著的差异是对应α5螺旋之间的8°倾斜，从而导致mini Gs中的Tyr391的Cα远离G蛋白的核心有的位移(图23)。令人惊讶的是，mini Gs-A2AR界面与Gs-β2AR界面相比最显著的差异由于H7-H8边界处的不同氨基酸序列因此也发生在这个区。在A2AR中，H7以Arg2917.56封端并且与其中残基都不与Gαs接触的β2AR的等效位置中的序列S7.56PDFRI相比形成序列R7.56IREFR(未接触mini Gs的斜体氨基酸残基)。在A2AR中，Arg2917.56与Tyr 391H5.23的羰基形成氢键，其中还由Arg2917.56、Ile292和Arg293进行与mini Gs中的螺旋α5的范德华力接触。受体在与其对应G蛋白的接触存在/不存在的情况下有所不同的另一个区域在H5的末端处。在β2AR中，H5与A2AR相比延伸了附加转角，其中这个区域在结构中是无序的，也许是因为A2AR中的CL3环比β2AR短18个氨基酸残基。因此，在β2AR中，受体(Ile2335.72、Lys2355.74、Ser2365.75和Arg2395.78)与不存在于A2AR-mini Gs结构中的Gαs(Asp323H4.3、Asp343H4.23、Leu346H4.26、Arg347H4.27、T350H4S6.3和Y358H4S6.11)之间进行附加接触(图17和图18)。
尽管受体-G蛋白接触存在显著差异，但还存在许多相似性(图3)。例如，在H3的细胞质末端处，A2AR和β2AR两者中的Ile3.54和Arg3.55(β2AR中的Thr3.55)羰基形成氢键Ile3.54-GlnH5.16和Arg3.55-ArgH5.12，但是在β2AR-Gs复合物中，GlnH5.16与Glu5.64的侧链形成附加氢键，所述附加氢键是A2AR中的Ala。在这两个受体中，Gln5.68与G蛋白形成两个氢键，但是在β2AR中，这些氢键是与GlnH5.16和ArgH5.17形成的，而在A2AR中，与GlnH5.16的相互作用是相同的，但是第二氢键是与AspH5.13的骨架羰基形成的。在另一个实例中，AspH5.13与这两个受体形成氢键，但是这与和A2AR中的Gln5.71形成的单个氢键相比是由到β2AR中的Lys5.71的盐桥组成的。根据这些实例，清楚的是，尽管很少有接触相同，但是大多数是类似的，在所涉及的氨基酸侧链的特异性、界面处的构象以及相互作用的性质方面有所不同。
mini Gs结合时A2AR的构象变化
与激动剂结合的A2AR的之前报道的结构呈活性-中间构象1,4,113。这个分配是基于受体核心的旋转异构体变化和跨膜螺旋的移动的相似性，所述相似性还在与活性状态36,122的纳米抗体38和视紫红质结合的β2AR的活性状态的结构中观察到。然而，因为在激动剂结合A2AR中H6的移动程度小于在其它受体中观察到的程度的一半，因此细胞质裂隙中将会没有足够的空间来容置G蛋白的C端肽1。UK432097结合的A2AR12的活性-中间状态与和mini Gs结合的A2AR的结构的比较标识出了用于容置G蛋白结合的受体核心的细胞质半部的主要重新布置(图24)并且将会就从活性-中间状态过渡到G蛋白结合构象所需的重新布置方面进行描述。首先，H6的细胞质末端移动远离受体核心 如在Thr2246.26的Cα原子之间测得的。这个移动是通过H6绕螺旋轴进行小的可辨旋转而向外弯曲来实现的。H6移动的程度由A2AR和Leu393H5.25中的Lys2276.29、Ala2316.33和Leu2356.37与mini Gs的羧基端之间的范德华力相互作用来决定。H6的移动需要H6的细胞质末端与螺旋H5和H7填装的显著变化。具体地说，高度保守的Tyr1975.58和Tyr2887.53的侧链均采取新旋转异构体来填充之前被Leu2356.37(其Cα移动)和Ile2386.40(Cα移动)的侧链分别占据的空间。Tyr2887.53的转变允许保守DRY基元的Arg1023.50采取完全延伸构象，从而在mini Gs的α5螺旋中针对Tyr391H5.23的侧链填装。
相比于受体的细胞质半部的允许mini Gs结合的相当大的重新布置，受体的细胞外半部在NECA结合A2AR-mini Gs结构与NECA结合A2AR进行比较时不存在显著变化(图24)。因此，被描述成处于活性-中间状态的配体结合袋的安置确实描述了与A2AR结合的NECA的高亲和力状态。然而，清楚的是，结构并未带来关于也可以促进配体亲和力变化的在受体内在动力学方面的任何可能变化的信息。
结论
A2AR是已经在结构上定义了活性-中间构象和完全活性构象的第一GPCR。然而，与激动剂肽神经降压素1,4,110-114结合的神经降压素受体的结构示出了与腺苷结合的A2AR非常类似的特性并且因此也可能表示活性-中间构象123,124。最近，已经基于广泛EPR数据提出了β2AR在活性构象下还以两个不同状态存在，但是尚未阐明第二状态的结构119。然而，根据这项工作清楚的是，在结合或不结合G蛋白的情况下可以存在位于激动剂结合受体的活化通路上的不同构象。考虑到GPCR活化机制的高度保守性，A2AR的活性-中间体可能可以表示许多A类GPCR的共同中间体，但是其可以取决于受体的能量图景而仅瞬时存在。
β2AR和A2AR的G蛋白界面之间的相似性和差异是受体的不同氨基酸序列的结果并且导致G蛋白关于受体的位置和取向略有不同。因此，应期望Gs还将与其它Gs偶联受体略有不同地相互作用并且如Gi和Gq等其它G蛋白还将由于不同氨基酸序列以及受体和G蛋白两者的柔性性质而示出所述G蛋白与受体相互作用的细节的差异。因此，G蛋白结合界面的‘松散(loose)’性质可以允许G蛋白取向有显著变化。然而，提供了由GPCR进行的G蛋白活化的保守机制的妙处之一103：远离核苷酸结合袋代替螺旋α5，从而使α1从有序过渡到无序并且使核苷酸释放，与受体相互作用的确切模式在很大程度上是多余的。
方法和物质
表达和纯化。将mini Gs(构造414)表达在大肠杆菌中并且通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)和凝胶过滤色谱法进行纯化(参见进一步方法)。利用杆状病毒表达系统将包含用于移除可能的N联糖基化位点的N154A突变的野生型人A2AR(残基1到308)表达在昆虫细胞中。通过IMAC和凝胶过滤色谱法在激动剂NECA存在的情况下在正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DM)洗涤剂中纯化A2AR(参见进一步方法)。
复合和结晶化。将激动剂结合的纯化A2AR(DM中)与1.2倍摩尔过量的mini Gs混合，添加腺苷三磷酸双磷酸酶并且将样本在冰上孵育过夜。将复合物交换到在正辛基-β-D-硫吡喃葡糖苷(OTG)洗涤剂中，通过凝胶过滤进行纯化并且通过蒸汽扩散进行结晶化(参见进一步方法)。
数据收集、结构解出和精化。在光束线ID23-2(欧洲同步辐射光源(EuropeanSynchrotron Radiation Facility))处使用标准或螺旋收集模式从两个低温冷却晶体(100K)收集衍射数据。使用热稳定A2AR(PDB编码2YDV)和来自β2AR-Gs复合物(3SN6)的GαsGTP酶结构域作为搜索模型通过分子代替来解出结构(参见进一步方法)。
进一步方法
mini Gs的表达和纯化将合并N端组氨酸标签(His10)和TEV蛋白酶切割位点的的mini Gs414表达在大肠杆菌串BL21(DE3)RIL中。在25℃下用IPTG(50μM)诱导表达20h。将细胞通过离心收获并且通过声处理在补充有CompleteTM蛋白酶抑制剂(罗氏)的裂解缓冲液(40mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、10mM咪唑、5mM MgCl2、50μM GDP、1mM PMSF、2.5μM胃酶抑素A、10μM亮抑酶肽、50μg/ml DNase I、100μg/ml溶菌酶、100μM DTT)中裂解。将裂解液通过离心澄清并且加载到10ml Ni2+琼脂糖凝胶FF柱上。将柱用洗涤缓冲液(20mMHEPES pH 7.5、500mM NaCl、40mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP)洗涤并且用洗脱缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、500mM咪唑、10％甘油、1mM MgCl2、50μM GDP)洗脱。添加TEV蛋白酶并且将样本针对透析缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、10μM GDP)透析过夜。将TEV蛋白酶通过阴性纯化在Ni2+-NTA树脂(Qiagen)上移除。将样本浓缩到1.5ml并且加载到用凝胶过滤缓冲液(10mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM MgCl2、1μM GDP、0.1mM TCEP)平衡的Superdex-200 26/600凝胶过滤柱上。将峰级分合并并且浓缩到100mg/ml。将纯蛋白质等分，在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下。典型产率为每升培养物100mg纯mini Gs414。
腺苷A2AR的表达和纯化将野生型人腺苷A2AR(残基1到308)修饰成包含C端组氨酸标签(His10)和TEV蛋白酶切割位点。引入N154A突变以移除可能的N联糖基化位点。使用flashBAC ULTRA系统(Oxford Expression Technologies)来制备杆状病毒。将粉纹夜蛾细胞在ESF921培养基(Expression Systems)中生长到密度为3×106个细胞/ml，用A2AR杆状病毒进行感染并且孵育72h。收获细胞并且通过两个超速离心步骤在膜缓冲液(20mM HEPESpH 7.5、1mM EDTA、1mM PMSF)中制备膜。
将NECA(100μM)、NaCl(300mM)、PMSF(1mM)和CompleteTM蛋白酶抑制剂(罗氏)添加到膜，并且将样本在室温下混合30min。将膜用2％正癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷(DM)在冰上溶解1h。将样本通过超速离心进行澄清并且加载到5ml Ni-NTA柱(Qiagen)上。将柱用洗涤缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、500mM NaCl、10％甘油80mM咪唑、100μM NECA、0.15％DM)洗涤并且用洗脱缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、300mM咪唑、100μM NECA、0.15％DM)洗脱。将洗脱液用50kDa截留Amicon单元(密理博)浓缩，并且用PD10柱(通用电气医疗集团)交换到脱盐缓冲液(10mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、100μM NECA、0.15％DM)中。添加TEV蛋白酶，并且将样本在冰上孵育过夜。将样本浓缩到0.2ml并且加载到Superdex 200柱(通用电气医疗集团)上。将峰级分合并并且浓缩到大约20mg/ml。典型产率为每升培养物2mg纯A2AR。
复合和结晶化将纯化A2AR与1.2倍摩尔过量的mini Gs414混合。添加MgCl2(1mM)和腺苷三磷酸双磷酸酶(0.1U)，并且将混合物在冰上孵育过夜。将样本在凝胶过滤缓冲液(10mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、100μM NECA、0.35％正辛基-β-D-硫吡喃葡糖苷(OTG))中稀释10倍，浓缩到0.2ml并且加载到(在同一缓冲液中预先平衡的)Superdex 200柱上。将包含A2AR-mini Gs复合物的峰级分合并并且浓缩到20mg/ml。在胆固醇半琥珀酸酯(CHS)存在或不存在的情况下在OTG中通过蒸汽扩散来结晶化A2AR-mini Gs复合物。使用120nl沉滴在4℃下建造结晶化板。用于结构解出的晶体在以下两种条件下生长：0.1M NaOAc pH 5.5、10％PEG 2000(在CHS存在的情况下)；或0.1M NaOAc pH 5.7、9.5％PEG 2000MME(在CHS不存在的情况下)。将晶体低温保护在填充有30％PEG 400的母液中并且在液氮下快速冷冻。
数据收集、处理和精化使用10μm微焦光束(波长)用Pilatus 2M探测器在光束线ID23-2上在欧洲同步辐射光源处收集衍射数据。使用标准或螺旋收集模式来收集数据。将来自两个晶体的数据用于结构解出。使用MOSFLM104和AIMLESS105来处理数据。使用热稳定A2AR(PDB编码2YDV)107的结构和来自β2AR-Gs复合物(PDB编码3SN6)108的Gαs GTP酶结构域(残基40到59和205到394)作为搜索模型通过用PHASER106进行的分子代替来解出结构。使用REFMAC109和COOT110来执行模式精化和重建。
竞争结合测定将瞬时表达野生型A2AR的FreeStyle HEK293-F细胞重悬在测定缓冲液A(25mM HEPES、pH 7.5、100mM KCl、1mM MgCl2)、测定缓冲液B(25mM HEPES、pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2)或测定缓冲液C(25mM HEPES、pH 7.5、500mM NaCl、1mM MgCl2)中，并且通过经由26G针进行的10次传代进行裂解。在以25μM的最终浓度添加到膜之前，将纯化的结合配偶体交换缓冲液到对应缓冲液。将混合物等分并且添加NECA(最终浓度为0mM到1mM，在含有1u/mL腺苷三磷酸双磷酸酶的测定缓冲液中制备)。将样本在22℃下孵育90min，在其表观Kd(2.5nM)下添加3H-ZM241385，并且将样本在22℃下孵育另外的90min。在100μM的ZM241385存在的情况下确定非特异性结合。将受体结合放射性配体和游离放射性配体通过(用0.1％聚乙烯亚胺预浸渍的)96孔GF/B滤板过滤进行分离，并且用适当缓冲液洗涤3次。将板干燥并且使用Tri-Carb 2910TR(珀金埃尔默)通过液体闪烁计数对放射活性定量。使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来分析数据。从单位点拟合Ki分析导出NECA结合的Ki。使用针对统计显著性的非配对双尾t检验对来自各自一式两份地执行的至少三个独立实验的数据进行分析。
热稳定性测定将表达野生型人A2AR的粉纹夜蛾细胞的膜重悬在Tm缓冲液(25mMHEPES pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2)中并且通过经由26号针进行的10次传代进行均质化。以25μM的最终浓度添加结合配偶体。将3H-NECA和无标记NECA以1:5比例混合并且添加到膜中以给出1μM(高于表观Kd大约10倍)的最终浓度。将样本在室温下孵育1h，然后在冰上冷却30min。将DDM、DM或OG添加至最终浓度分别为0.1％、0.13％或0.8％，并且将样本在冰上孵育1h。将细胞碎片通过在20,000xg下离心5min进行移除，并且将上清液等分到PCR条带中。将样本加热到期望温度恰好30min，然后在冰上淬火30min。将样本(50μl)加载到填装到96孔滤板(密理博)中的凝胶过滤树脂上，所述96孔滤板被离心以将受体结合放射性配体与游离放射性配体分离。在200μM无标记NECA的存在下确定非特异性结合。使用MicroBetaTriLux闪烁计数器(珀金埃尔默)通过液体闪烁计数对放射活性进行定量。使用GraphPadPrism软件通过非线性回归来分析数据。从S形剂量-响应分析导出表观Tm值。结果表示一式两份地执行的两个独立实验的平均值±SEM。
表1这项工作期间使用的火鸡β1AR构造。β1AR-WT构造包含N和C端截短以及C116L突变。这些修饰被设计成防止糖基化或提高表达15。β1AR-84构造包含细胞质环三的附加缺失。热稳定突变(M90V、D322K、F327A和F388M)2,3。由M40C突变和L103C突变促进的跨膜螺旋1与2之间的二硫联。被设计成防止棕榈酰化的C358A突变。被设计成促进结晶化的N端MBP融合。
表2这项工作期间使用的亲本mini Gs构造。
表3响应于不同结合配偶体而示出β1AR-84的异丙肾上腺素Ki的竞争性结合测定。数据是来自除非表中另有说明否则一式两份地执行的单个实验，在这些情况下，数据表示所指示的独立实验数(n)的平均值±SEM。根据SDS-PAGE凝胶来估计突变对mini Gs的表达水平的影响。造成与亲本构造相比超过2倍的表达变化的突变体被简单示出为增大(+)或减小(-)。a常用Gα编号(CGN)系统。b不适用。c不确定。d用两个甘氨酸残基取代开关II残基227到230。e缺失开关III残基254到263。
表4处于基础GDP结合状态的β1AR-WT复合物或mini Gs突变体的热稳定性(Tm)测量结果。Tm值表示表中指示的独立实验数(n)的平均值±SEM。一些Tm值是根据一式两份地执行的单个实验确定的，假设误差为±0.5℃。处于GDP结合状态的mini Gs的Tm值是通过差示扫描荧光测定法确定的。a常用Gα编号(CGN)系统。b不适用。c不确定。d缺失的开关III残基254到263被称为SIII。e mini Gs199包含与mini Gs183相同的突变，但是具有重新设计的连接子区(参见表2)，并且被用作用于筛选洗涤剂稳定突变的亲本构造。
表5 GTP酶结构域突变体的激动剂转变测定数据。使用包含用部分纯化的GTP酶结构域突变体(总数是从1升的大肠杆菌培养物纯化的)重构的β1AR的膜来执行测定。针对每个突变体在4℃和20℃下执行测定。所述表示出了受体在每个条件下的最终异丙肾上腺素亲和力。受体的起始异丙肾上腺素亲和力为3.03μM±0.81μM(n＝16)，值的范围为1.5μM到4.4μM。因此，小于三倍的激动剂亲和力转变无法被视为显著。由于使用了部分纯化的物质，因此表达水平的定量是不可能的。因此，简化标度用于指示相比于亲本构造的相对表达水平。注意：在4℃下并未诱导激动剂亲和力转变的一些突变体并未在20℃下进行测试(在表中用n.d.来表示)。
表6数据收集和精化统计
参考文献
1.Lebon，G.等人(2011年)，激动剂结合的腺苷受体揭示GPCR活化的常见特征(Agonist-bound adenosine A2A receptor structures reveal common features ofGPCR activation)，《自然(Nature)》，第474卷(第7352期)：第521到525页。
2.Rosenbaum，D.M.等人、Lyons等人(2011年)，不可逆激动剂-β(2)肾上腺素受体复合物的结构和功能(Structure and function of an irreversible agonist-β(2)adrenoceptor complex)，《自然(Nature)》，第469卷(第7329期)：第236到240页。
3.Warne，T.等人(2011年)，对β(1)-肾上腺素受体的激动剂和部分激动剂作用的结构基础(The structural basis for agonist and partial agonist action on aβ(1)-adrenergic receptor)，《自然(Nature)》，第469卷(第7329期)：第241到244页。
4.Xu，F.等人(2011年)，激动剂结合人A2A腺苷受体的结构(Structure of anagonist-bound human A2A adenosine receptor)，《科学(Science)》，第332卷(第6027期)：第322到327页。
5.Herrmann，R.等人(2004年)，受体-G蛋白偶联时的相互作用顺序(Sequence ofinteractions in receptor-G protein coupling)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第279卷(第23期)：第24283到24290页。
6.Herrmann，R.等人(2006年)，视紫红质-转导蛋白偶联：GαC端在核苷酸交换催化中的作用(Rhodopsin-transducin coupling:role of the Galpha C-terminus innucleotide exchange catalysis)，《视觉研究(Vision Res)》，第46卷(第27期)：第4582到4593页。
7.Hamm，H.E.等人(1988年)，用来自α亚基的合成肽映射的与视紫红质结合的G蛋白的位点(Site of G protein binding to rhodopsin mapped with syntheticpeptides from the alpha subunit)，《科学(Science)》，第241卷(第4867期)：第832到835页。
8.Conklin，B.R.等人(1993年)，取代三个氨基酸将Gqα的受体特异性切换到Giα的受体特异性(Substitution of three amino acids switches receptor specificity ofGq alpha to that of Gi alpha)，《自然(Nature)》，第363卷(第6426期)：第274到276页。
9.Conklin，B.R.等人(1996年)，改变受体活化保真度的Gqα和Gsα的羧基端突变(Carboxyl-terminal mutations of Gq alpha and Gs alpha that alter the fidelityof receptor activation)，《分子药理学(Mol Pharmacol)》，第50卷(第4期)：第885到890页。
10.Rasmussen，S.G.等人(2011年)，β2肾上腺素受体-Gs蛋白复合物的晶体结构(Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex)，《自然(Nature)》，第477卷(第7366期)：第549到555页。
11.Chung，K.Y.等人(2011年)，由β2肾上腺素受体诱导的G蛋白Gs构象变化(Conformational changes in the G protein Gs induced by the beta2 adrenergicreceptor)，《自然(Nature)》，第477卷(第7366期)：第611到615页。
12.Chabre，M.等人(1989年)，视觉转导分子机制(Molecular mechanism ofvisual transduction)，《欧洲生物化学期刊(Eur J Biochem)》，第179卷(第2期)：第255到266页。
13.Delean，A.等人(1980年)，三元复合物模型解释了腺苷酸环化酶偶联β-肾上腺素受体的激动剂特异性结合特性(A Ternary Complex Model Explains the Agonist-Specific Binding-Properties of the Adenylate Cyclase-Coupled Beta-Adrenergic-Receptor)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第255卷(第15期)：第7108到7117页。
14.Bornancin，F.等人(1989年)，光激发的视紫红质与转导蛋白之间的瞬时复合物、视紫红质中的视黄醛位点与转导蛋白中的核苷酸位点之间的相互作用(Thetransitory complex between photoexcited rhodopsin and transducin.Reciprocalinteraction between the retinal site in rhodopsin and the nucleotide site intransducin)，《欧洲生物化学期刊(Eur J Biochem)》，第184卷(第3期)：第687到698页。
15.Sprang，S.R.(1997年)，G蛋白机制：从结构分析方面的见解(G proteinmechanisms:insights from structural analysis)，《生物化学年鉴(Annu RevBiochem)》，66：第639到678页。
16.Fung，B.K.(1983年)，牛视杆外节的转导蛋白的表征I.亚基的分离和重构(Characterization of transducin from bovine retinal rod outersegments.I.Separation and reconstitution of the subunits)，《生物化学期刊(JBiol Chem.)》，第258卷(第17期)：第10495到10502页。
17.Fung，B.K.等人(1983年)，牛视杆外节的转导蛋白的表征II.通过用胰蛋白酶进行的有限蛋白酶解揭示的不同结合位点和构象变化的证据(Characterization oftransducin from bovine retinal rod outer segments.II.Evidence for distinctbinding sites and conformational changes revealed by limited proteolysis withtrypsin)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第258卷(第17期)：第10503到10510页。
18.Wittinghofer，A.等人(2011年)，G结构域的结构-功能关系：规范开关基元(Structure-function relationships of the G domain，a canonical switch motif)，《生物化学年鉴(Annu Rev Biochem)》，第80卷：第943到971页。
19.Holm L.等人(2010年)，Dali服务器：3D保守映射(Dali server:conservationmapping in 3D)，《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，第38卷(Web服务器问题(Web Serverissue))：第W545到W549页。
20.Hall，A.等人(1986年)，Mg2+对p21N-ras的鸟嘌呤核苷酸交换速率的影响(Theeffect of Mg2+ on the guanine nucleotide exchange rate of p21N-ras)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第261卷(第24期)：第10963到10965页。
21.Higashijima，T.等人(1987年)，Mg2+和β-γ亚基复合物对鸟嘌呤核苷酸与G蛋白的相互作用的影响(Effects of Mg2+ and the beta gamma-subunit complex on theinteractions of guanine nucleotides with G proteins)，《生物化学期刊(J BiolChem.)》，第262卷(第2期)：第762到766页。
22.Jones，J.C.等人(2011年)，自活化G蛋白α亚基的晶体结构揭示了其不同的信号启动机制(The crystal structure of a self-activating G protein alpha subunitreveals its distinct mechanism of Signal initiation)，《科学信号传导(SciSignal)》，第4卷(第159期)：第ra8页。
23.Majumdar，S.等人(2004年)，扰乱转导蛋白的α亚基的连接子区：新类别组成型活性GTP结合蛋白(Perturbing the linker regions of the alpha-subunit oftransducin:a new class of constitutively active GTP-binding proteins)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第279卷(第38期)：第40137到40145页。
24.Ferguson，K.M.等人(1986年)，结合GDP对鸟嘌呤核苷酸与G蛋白结合的动力学的影响(The influence of bound GDP on the kinetics of guanine nucleotidebinding to G proteins)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第261卷(第16期)：第7393到7399页。
25.Posner，B.A.等人(1998年)，作为受体结合状态的近似值的Giα1的A326S突变体(The A326S mutant of Gialpha1 as an approximation of the receptor-boundstate)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第273卷(第34期)：第21752到21758页。
26.Vetter，I.R.等人(2001年)，三维的鸟嘌呤核苷酸结合开关(The guaninenucleotide-binding switch in three dimensions)，《科学(Science)》，第294卷(第5545期)：第1299到1304页。
27.Kapoor，N.等人(2009年)，用于活化异源三聚体G蛋白的顺序释放机制的结构证据(Structural evidence for a sequential release mechanism for activation ofheterotrimeric G proteins)，《分子生物学期刊(J Mol Biol)》，第393卷(第4期)：第882到897页。
28.Natochin，M.等人(2001年)，探索视紫红质催化转导蛋白活化机制(Probingthe mechanism of rhodopsin-catalyzed transducin activation)，《神经化学期刊(JNeurochem)》，第77卷(第1期)：第202到210页。
29.Oldham，W.M.等人(2006年)，异源三聚体G蛋白的受体催化活化机制(Mechanism of the receptor-catalyzed activation of heterotrimeric Gproteins)，《自然结构与分子生物学(Nat Struct Mol Biol)》，第13卷(第9期)：第772到777页。
30.Preininger，A.M.等人(2009年)，螺旋偶极移动和构象可变性促进了Gαi亚基的变构GDP释放(Helix dipole movement and conformational variability contributeto allosteric GDP release in Galphai subunits)，《生物化学(Biochemistry)》，第48卷(第12期)：第2630到2642页。
31.Abdulaev，N.G.等人(2005年)，异源三聚体G蛋白α亚基在与βγ亚基相关联时采取“预先活化”构象(Heterotrimeric G-protein alpha-subunit adopts a"preactivated"conformation when associated with betagamma-subunits)，《生物化学期刊(J Biol Chem)》，第280卷(第45期)：第38071到38080页。
32.Weiss，E.R.等人(1988年)，G蛋白受体活化(Receptor activation of Gproteins)，《FASEB期刊(FASEB J)》，第2卷(第13期)：第2841到2848页。
33.Hou，Y.等人(2000年)，G蛋白γ亚基在受体相互作用中的选择性作用(Selective role of G protein gamma subunits in receptor interaction)，《生物化学期刊(J Biol Chem)》，第275卷(第50期)：第38961到38964页。
34.McIntire，W.E.等人(2001年)，G蛋白β亚基是Gs与β1-肾上腺素受体和A2a腺苷受体结合的决定簇(The G protein beta subunit is a determinant in the couplingof Gs to the beta 1-adrenergic and A2a adenosine receptors)，《生物化学期刊(JBiol Chem.)》，第276卷(第19期)：第15801到15809页。
35.Richardson，M.等人(1999年)，α2A-肾上腺素受体在Sf9昆虫细胞膜中的不同βγ亚基组合物的Gi异源三聚体之间进行区分(The alpha2A-adrenergic receptordiscriminates between Gi heterotrimers of different betagamma subunitcomposition in Sf9insect cell membranes)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第274卷(第19期)：第13525到13533页。
36.Scheerer，P.等人、Hildebrand等人(2008年)，视蛋白在其G蛋白相互作用构象下的晶体结构(Crystal structure of opsin in its G-protein-interactingconformation)，《自然(Nature)》，第455卷(第7212期)：第497到502页。
37.Choe，H.W.等人(2011年)，变视紫红质II的晶体结构(Crystal structure ofmetarhodopsin II)，《自然(Nature)》，第471卷(第7340期)：第651到655页。
38.Rasmussen S.G.等人(2011年)，β(2)肾上腺素受体的纳米抗体稳定活性状态的结构(Structure of a nanobody-stabilized active state of theβ(2)adrenoceptor)，《自然(Nature)》，第469卷(第7329期)：第175到180页。
39.Abdulaev，N.G.等人(2006年)，异源三聚体G蛋白α亚基的受体结合“空袋”状态在构象上的动态的(The receptor-bound"empty pocket"state of the heterotrimericG-protein alpha-subunit is conformationally dynamic)，《生物化学(Biochemistry)》，第45卷(第43期)：第12986到12997页。
40.Westfield，G.H.等人(2011年)，β2-肾上腺素受体Gs复合物中的Gαsα-螺旋结构域的结构柔性(Structural flexibility of the G alpha s alpha-helical domainin the beta2-adrenoceptor Gs complex)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad SciU S A)，第108卷(第38期)：第16086到16091页。
41.Markby D.W.等人(1993年)，Gα亚基的分离的GTP结合和GTP酶活化结构域(Separate GTP binding and GTPase activating domains of a G alpha subunit)，《科学(Science)》，第262卷(第5141期)：第1895到1901页。
42.Dohlman，H.G.等人(2012年)，Gα螺旋结构域的信号活化和失活(Signalactivation and inactivation by the Galpha helical domain:a long-neglectedpartner in G protein signaling)，《科学信号传导(Sci Signal)》，第5卷(第226期)：第re2页。
43.Phillips，W.J.等人(1992年)，视紫红质转导蛋白交互作用II.转导蛋白-βγ亚基复合物对转导蛋白-α亚基与视紫红质偶联的影响(Rhodopsin/transducininteractions.II.Influence of the transducin-beta gamma subunit complex on thecoupling of the transducin-alpha subunit to rhodopsin)，《生物化学期刊(J BiolChem.)》，第267卷(第24期)：第17040到17046页。
44.Skiba，N.等人(1996年)，使用Gαt/Gαi1嵌合体对转导蛋白α亚基的效应器结合位点进行映射(Mapping of effector binding sites of transducin alpha-subunitusing G alpha t/G alpha i1chimeras)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第271卷(第1期)：第413到424页。
45.Singh，G.等人(2012年)，组成型活性Gα亚基提供了对G蛋白活化机制的见解(Aconstitutively active Galpha subunit provides insights into the mechanism ofG protein activation)，《生物化学(Biochemistry)》，第51卷(第15期)：第3232到3240页。
46.Herrmann，R.等人(2006年)，从GPCR到G蛋白的信号转移：GαN端区在视紫红质-转导蛋白偶联中的作用(Signal transfer from GPCRs to G proteins:role of the Galpha N-terminal region in rhodopsin-transducin coupling)，《生物化学期刊(JBiol Chem.)》，第281卷(第40期)：第30234到30241页。
47.Bubis，J.等人(2001年)，用碘乙酸对转导蛋白进行化学修饰：在Cys(347)处羧甲基化的转导蛋白-α允许转导蛋白与光活化的视紫红质结合但是防止其在GTP存在的情况下释放(Chemical modification of transducin with iodoacetic acid:transducin-alpha carboxymethylated at Cys(347)allows transducin binding to Light-activated rhodopsin but prevents its release in the presence of GTP)，《生物化学和生物物理学文献(Arch Biochem；Biophys)》，第395卷(第2期)：第146到157页。
48.Grishina，G.等人(2000年)，取代减小了受体介导的活化并且增大了受体亲和力的G(sα)表面暴露区(A surface-exposed region of G(salpha)in whichsubstitutions decrease receptor-mediated activation and increase receptoraffinity)，《分子药理学(Mol Pharmacol)》，第57卷(第6期)：第1081到1092页。
49.Barren，B.等人(2007年)，显性负向G蛋白α亚基的机制(Mechanisms ofdominant negative G-protein alpha subunits)，《神经科学研究期刊(J NeurosciRes)》，第85卷(第16期)：第3505到3514页。
50.Feig，L.A.等人(1999年)，贸易工具：使用Ras家族GTP酶的显性抑制突变体(Tools of the trade:use of dominant-inhibitory mutants of Ras-familyGTPases)，《自然细胞生物学(Nat Cell Biol)》，第1卷(第2期)：第E25到E27页。
51.Feig，L.A.等人(1988年)，抑制由突变体ras蛋白以GDP的优选亲和力进行的NIH 3T3细胞增殖(Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant rasprotein with preferential affinity for GDP，《分子和细胞生物学(Mol Cell Biol)》，第8卷(第8期)：第3235到3243页。
52.Cleator，J.H.等人(1999年)，Gαs的N54突变体具有抑制激素刺激的但并非基础cAMP水平的条件显性负向表型(The N54 mutant of Galphas has a conditionaldominant negative phenotype which suppresses hormone-stimulated but not basalcAMP levels)，《FEBS快报(FEBS Lett)》，第443卷(第2期)：第205到208页。
53.Cleator，J.H.等人(2004年)，防止cAMP产生的促甲状腺激素受体活化和肌醇1,4,5-三磷酸转换：不同G蛋白竞争由共同受体进行的活化(A dominant negativeGalphas mutant that prevents thyroid-stimulating hormone receptor activationof cAMP production and inositol 1,4,5-trisphosphate turnover:competition bydifferent G proteins for activation by a common receptor)，《生物化学期刊(JBiol Chem.)》，第279卷(第35期)：第36601到36607页。
54.Hildebrandt，J.D.等人(1991年)，Gsα的假定的Mg(2+)结合位点的突变防止其活化由受体进行(A mutation in the putative Mg(2+)-binding site of Gs alphaprevents its activation by receptors)，《分子和细胞生物学(Mol Cell Biol)》，第11卷(第10期)：第4830到4838页。
55.Natochin，M.等人(2006年)，阻断活化受体的转导蛋白-α的显性负向突变体(Dominant negative mutants of transducin-alpha that block activatedreceptor)，《生物化学(Biochemistry)》，第45卷(第20期)：第6488到6494页。
56.Ramachandran，S.等人(2011年)，捕获稳定的视紫红质-Gα-GTP-βγ复合物的显性负向Gα突变体(A dominant-negative Galpha mutant that traps a stablerhodopsin-Galpha-GTP-betagamma complex)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第286卷(第14期)：第12702到12711页。
57.Slepak，V.Z.等人(1995年)，Gαi2的显性负向突变体的功能分析(Functionalanalysis of a dominant negative mutant of G alpha i2)，《生物化学期刊(J BiolChem.)》，第270卷(第8期)：第4037到4041页。
58.Wu，Y.L.等人(2004年)，通过G蛋白α亚基的单点突变对信息素受体信号传导进行显性负向抑制(Dominant-negative inhibition of pheromone receptor signalingby a single point mutation in the G protein alpha subunit)，《生物化学期刊(JBiol Chem.)》，第279卷(第34期)：第35287到35297页。
59.Pereira，R.等人(2005年)，转导蛋白的α亚基的开关3点突变产生了独特的显性负向抑制剂(A switch 3 point mutation in the alpha subunit of transducinyields a unique dominant-negative inhibitor)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第280卷(第42期)：第35696到35703页。
60.Barren，B.等人(2006年)，转达蛋白-α的突变R238E产生了缺乏GTP酶和效应器但并非显性负向的G蛋白α亚基(Mutation R238E in transducin-alpha yields a GTPaseand effector-deficient,but not dominant-negative,G-protein alpha-subunit)，《分子视觉(Mol Vis)》，第12卷：第492到498页。
61.Zurita，A.R.等人(2008年)，Gsα和转导蛋白α的相同突变揭示了这些高度同源G蛋白α亚基之间的行为差异(The same mutation in Gsalpha and transducin alphareveals behavioral differences between these highly homologous G proteinalpha-subunits)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，第105卷(第7期)：第2363到2368页。
62.Yu，B.等人(2000年)，Go、G11和G16中的G蛋白α亚基的空突变体对G蛋白偶联受体的子集的抑制(Inhibition of subsets of G protein-coupled receptors by emptymutants of G protein alpha subunits in Go,G11,and G16)，《生物化学期刊(J BiolChem)》，第275卷(第1期)：第71到76页。
63.Yu，B.等人(1998年)，黄嘌呤核苷酸结合Goα突变体与G蛋白偶联受体的相互作用(Interaction of the xanthine nucleotide binding Goalpha mutant with Gprotein-coupled receptors)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第273卷(第46期)：第30183到30188页。
64.Yu，B.等人(1997年)，结合黄嘌呤核苷酸的Goα突变体的表征(Characterization of a Goalpha mutant that binds xanthine nucleotides)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第272卷(第29期)：第18015到18019页。
65.Iiri，T.等人(1999年)，被设计成通过Gs来抑制受体信号传导的Gsα突变体(Gsalpha mutant designed to inhibit receptor signaling through Gs)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，第96卷(第2期)：第499到504页。
66.Iiri，T.等人(1994年)，从具有内分泌功能获得和丧失的患者的Gsα进行快速GDP释放(Rapid GDP release from Gs alpha in patients with gain and loss ofendocrine function)，《自然(Nature)》，第371卷(第6493期)：第164到168页。
67.Warner，D.R.等人(1998年)，具有遗传性骨营养不良症的患者的Gsα的开关3区的新型突变(A novel mutation in the switch 3 region of Gsalpha in a patientwith Albright hereditary osteodystrophy impairs GDP binding and receptoractivation，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第273卷(第37期)：第23976到23983页。
68.Berlot，C.H.等人(2002年)，包含影响不同功能的突变的高度有效显性负向αs构造抑制了多个Gs偶联受体信号传导通路(A highly effective dominant negativealpha s construct containing mutations that affect distinct functionsinhibits multiple Gs-coupled receptor signaling pathways，《生物化学期刊(J BiolChem.)》，第277卷(第23期)：第21080到21085页。
69.Serrano-Vega，M.J.等人(2008年)，抗洗涤剂形式的β1-肾上腺素受体的构象热稳定(Conformational thermostabilization of the beta1-adrenergic receptor ina detergent-resistant form)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，第105卷(第3期)：第877到882页。
70.Johnston，C.A.等人(2005年)，与GDP选择性肽结合的Gα(i1)的结构提供了对鸟嘌呤核苷酸交换的见解(Structure of Galpha(i1)bound to a GDP-selectivepeptide provides insight into guanine nucleotide exchange)，《结构(Structure)》，第13卷(第7期)：第1069到1080页。
71.Kimple，R.J.等人(2002年)，用于对Gα亚基进行的核苷酸释放进行GoLoco诱导抑制的结构决定簇(Structural determinants for GoLoco-induced inhibition ofnucleotide release by Galpha subunits)，《自然(Nature)》，第416卷(第6883期)：第878到881页。
72.Nishimura，A.等人(2010年)，由小分子对异源三聚体Gq蛋白进行特异性抑制的结构基础(Structural basis for the specific inhibition of heterotrimeric Gqprotein by a small molecule)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，第107卷(第31期)：第13666到13671页。
73.Umezawa，Y.等人(1998年)，以鸟嘌呤核苷酸结合蛋白、Src同源-2结构域以及人类生长激素在与其特异性配体复合时的晶体结构证明的CH/pi相互作用(CH/piinteractions as demonstrated in the crystal structure of guanine-nucleotidebinding proteins，Src homology-2 domains and human growth hormone in complexwith their specific ligands)，《生物有机和药物化学(Bioorg Med Chem)》，第6卷(第4期)：第493到504页。
74.Li，Q.等人(1997年)，转导蛋白α亚基的开关II与开关III之间的连通是靶向活化所必需的(Communication between switch II and switch III of the transducinalpha subunit is essential for target activation)，《生物化学期刊(J BiolChem.)》，第272卷(第35期)：第21673到21676页。
75.Frishman，D.等人，基于知识的蛋白质二级结构指定(Knowledge-basedprotein secondary structure assignment)，《蛋白质(Proteins)》，第23卷(第4期)：第566到579页。
76.Heinig，M.等人(2004年)，STRIDE：用于从蛋白质的原子坐标进行二级结构分配的web服务器(STRIDE:a web server for secondary structure assignment fromknown atomic coordinates of proteins)，《核酸研究(Nucleic Acids Res)》，第32卷(Web服务器问题(Web Server issue))：第W500到W502页。
77.Muradov，K.G.等人(2000年)，N端结构域与C端结构域之间的偶联影响了转导蛋白-α内在的GDP/GTP交换(Coupling between the N- and C-terminal domainsinfluences transducin-alpha intrinsic GDP/GTP exchange)，《生物化学(Biochemistry)》，第39卷(第14期)：第3937到3942页。
78.Lambright，D.G.等人(1994年)，用于活化异源三聚体G蛋白的α亚基的结构决定簇(Structural determinants for activation of the alpha-subunit of aheterotrimeric G protein)，《自然(Nature)》，第369卷(第6482期)：第621到628页。
79.Coleman，D.E等人(1998年)，与GDP和Mg2+复合的G蛋白Giα1的晶体结构：晶体学滴定实验(Crystal structures；of the G protein Gi alpha 1 complexed with GDPand Mg2+:a crystallographic titration experiment)，《生物化学(Biochemistry)》，第37卷(第41期)：第14376到14385页。
80.Noel，J.P.等人(1993年)，与GTPγS复合的转导蛋白-α的2.2A晶体结构(The2.2A crystal structure of transducin-alpha complexed with GTP gamma S)，《自然(Nature)》，第366卷(第6456期)：第654到663页。
81.Sunahara，R.K.等人(1997年)，腺苷酸环化酶活化剂Gsα的晶体结构(Crystalstructure of the adenylyl cyclase activator Gsalpha)，《科学(Science)》，第278卷(第5345期)：第1943到1947页。
82.Tesmer，J.J.等人(1997年)，与GsαGTPγS的复合物中的腺苷酸环化酶的催化结构域的晶体结构(Crystal structure of the catalytic domains of adenylylcyclase in a complex with Gsalpha.GTPgammaS)，《科学(Science)》，第278卷(第5345期)：第1907到1916页。
83.Kleuss，C.等人(2003年)，Gα(s)在N端甘氨酸处棕榈酰化(Galpha(s)ispalmitoylated at the N-terminal glycine)，《EMBO期刊(EMBO J)》，第22卷(第4期)：第826到832页。
84.Simonds，W.F.等人(1991年)，G蛋白βγ二聚体：膜靶向需要亚基共同表达和完好的γC-A-A-X结构域(G-protein beta gamma dimers.Membrane targeting requiressubunit coexpression and intact gamma C-A-A-X domain)，《生物化学期刊(J BiolChem.)》，第266卷(第9期)：第5363到5366页。
85.Spiegel，A.M.等人(1991年)，G蛋白连接：膜关联的分子基础(The G proteinconnection:molecular basis of membrane association)，《生物化学科学趋势(TrendsBiochem Sci)》，第16卷(第9期)：第338到341页。
86.Herrmann，R.等人(2006年)，从GPCR到G蛋白的信号转移：GαN端区在视紫红质-转导蛋白偶联中的作用(Signal transfer from GPCRs to G proteins:role of the Galpha N-terminal region in rhodopsin-transducin coupling)，《生物化学期刊(JBiol Chem.)》，第281卷(第40期)：第30234到30241页。
87.Alexander，N.S.等人(2014年)，视紫红质-G蛋白复合物的能量分析将α5螺旋联接到GDP释放(Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links theα5 helix to GDP release)，《自然结构和分子生物学(Nat Struct Mol Biol)》，第21卷(第1期)：第56到63页。
88.Dror，R.O.等人(2015年)，信号转导：异源三聚体G蛋白核苷酸交换的结构基础(SIGNAL TRANSDUCTION.Structural basis for nucleotide exchange inheterotrimeric G proteins)，《科学(Science)》，第348卷(第6241期)：第1361到1365页。
89.Flock，T.等人(2015年)，用于由GPCR进行Gα活化的通用变构机制(Universalallosteric mechanism for Gα activation by GPCRs)，《自然(Nature)》，第524卷(第7564期)：第173到179页。
90.Kaya，A.I.等人(2014年)，作为异源三聚体Gi蛋白α亚基的α5螺旋与GDP结合区之间的接替的保守苯丙氨酸(A conserved phenylalanine as a relay between the α5helix and the GDP binding region of heterotrimeric Gi proteinαsubunit)，《生物化学期刊(J Biol Chem.)》，第289卷(第35期)：第24475到24487页。
91.Van Eps，N.等人(2011年)，G蛋白与活化受体的相互作用打开了α亚基中的结构域间界面(Interaction of a G protein with an activated receptor opens theinterdomain interface in the alpha subunit)，《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci U S A)》，第108卷(第23期)：第9420到9424页。
92.Sun，D.等人(2015年)，探索单氨基酸分辨率下的Gαi1蛋白活化(Probing Gαi1protein activation at single-amino acid resolution)，《自然结构和分子生物学(NatStruct Mol Biol)》，第22卷(第9期)：第686到694页。
93.Vuong T.M.等人(1984年)，视觉环核苷酸级联中的转导蛋白的毫秒活化(Millisecond activation of transducin in the cyclic nucleotide cascade ofvision)，《自然(Nature)》，第311卷(第5987期)：第659到661页。
94.Kuhn，H.，1981年，杆细胞蛋白质与圆盘膜的相互作用：光、离子强度和核苷酸的影响(Interactions of rod cell proteins with the disc membrane:influence oflight，ionic strength，and nucleotides)，Curr Top Membr Transp，第15卷：第171到201页。
95.Fung，B.K.等人(1981年)，光触发的视觉环核苷酸级联的信息流(Flow ofinformation in the light-triggered cyclic nucleotide cascade of vision)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，第78卷(第1期)：第152到156页。
96.Miller-Gallacher，R.等人(2014年)，氰基吲哚洛尔结合的β1-肾上腺素受体的分辨率结构标识出稳定无配体受体的膜内Na+离子(TheResolutionStructure of Cyanopindolol-Bound β1-Adrenoceptor Identifies an IntramembraneNa+ Ion that Stabilises the Ligand-Free Receptor)，PLoS On，第9卷(第3期)：第e92727页。
97.Warne，T.，et al，(2003年)，表达和纯化截短的非糖基化火鸡β-肾上腺素受体以进行结晶化(Expression and purification of truncated，non-glycosylated turkeybeta-adrenergic receptors for crystallization)，《生物化学和生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)》，第1610卷(第1期)：第133到140页。
98.Hanzal-Bayer，M.等人(2002年)，Arl2-GTP和PDEδ的复合物：从结构到功能(The complex of Arl2-GTP and PDE delta:from structure to function)，《EMBO期刊(EMBO J)》，第21卷(第9期)：第2095到106页。
99.Traut，T.W.(1994年)，嘌呤和嘧啶的生理浓度(Physiologicalconcentrations of purines and pyrimidines)，《分子和细胞生物学(Mol CellBiochem)》，第140卷(第1期)：第1到22页。
100.Ring A.M.等人(2013年)，通过工程化纳米抗体稳定的β2-肾上腺素受体的肾上腺素活化结构(Adrenaline-activated structure of β2-adrenoceptor stabilizedby an engineered nanobody)，《自然(Nature)》，第502卷(第7472期)：第575到579页。
101.Weichert D.等人(2014年)，用于研究G蛋白偶联受体活化的共价激动剂(Covalent agonists for studying G protein-coupled receptor activation)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，第111卷(第29期)：第10744到10748页。
102.Hansson K，M.D.等人(2008年)，PCR介导的质粒DNA缺失(PCR-mediateddeletion of plasmid DNA)，《生物化学年鉴(Anal Biochem)》，第375卷(第2期)：第373到375页。
103.Flock，T.等人(2015年)，用于由GPCR进行Gα活化的通用变构机制(Universalallosteric mechanism for Gα activation by GPCRs)，《自然(Nature)》，第524卷(第7564期)：第173到179页。
104.Fredholm，B.B.等人(2001年)，国际药理学联合会XXV.腺苷受体术语和分类(International Union of Pharmacology.XXV.Nomenclature and classification ofadenosine receptors)，《药理学综述(Pharmacol Rev)》，第53卷(第4期)：第527到552页。
105.Fredholm，B.B.等人(2011年)，国际基础药理学与临床药理学联合会LXXXI.腺苷受体术语和分类—更新版(International Union of Basic and ClinicalPharmacology.LXXXI.Nomenclature and classification of adenosine receptors--anupdate)，《药理学综述(Pharmacol Rev)》，第63卷(第1期)：第1到34页。
106.Chen，J.F.等人(2013年)，腺苷受体作为药物靶标—挑战何在？(Adenosinereceptors as drug targets-what are the challenges？)，《药物发现自然综述(Nat RevDrug Discov)》，第12卷(第4期)：第265到286页。
107.Muller，C.E.等人(2011年)，腺苷受体配体的最新发展及其作为新药的潜力(Recent developments in adenosine receptor ligands and their potential asnovel drugs)，《生物化学和生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)》，第1808卷(第5期)：第1290到1308页。
108.Congreve，M.等人(2012年)，关于作为使用基于结构的药物设计的腺苷A(2A)拮抗剂的1,2,4-三嗪衍生物的发现(Discovery of 1,2,4-triazine derivatives asadenosine A(2A)antagonists using structure based drug design)，《药物化学期刊(Journal of medicinal chemistry)》，第55卷(第5期)：第1898到1903页。
109.Fishman，P.等人(2012年)，A3腺苷受体激动剂的药理效果和治疗效果(Pharmacological and therapeutic effects of A3 adenosine receptor agonists)，《今日药物发现(Drug Discov Today)》，第17卷(第7到8期)：第359到366页。
110.Dore，A.S.等人(2011年)，腺苷A(2A)受体在与ZM241385以及黄嘌呤XAC和咖啡因复合时的结构(Structure of the adenosine A(2A)receptor in complex withZM241385 and the xanthines XAC and caffeine)，《结构(Structure)》，第19卷(第9期)：第1283到1293页。
111.Hino，T.等人(2012年)，通过变构反向激动剂抗体进行的G蛋白偶联受体失活(G-protein-coupled receptor inactivation by an allosteric inverse-agonistantibody)，《自然(Nature)》，第482卷(第7384期)：第237到240页。
112.Jaakola，V.P.等人(2008年)，与拮抗剂结合的人A2A腺苷受体的2.6埃晶体结构(The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor boundto an antagonist)，《科学(Science)》，第322卷(第5905期)：第1211到1217页。
113.Lebon，G.等人(2015年)，CGS21680与人腺苷A2A受体结合的分子决定簇(Molecular Determinants of CGS21680 Binding to the Human Adenosine A2AReceptor)，《分子药理学(Mol Pharmacol)》，第87卷(第6期)：第907到915页。
114.Lebon，G.等人(2012年)，G蛋白偶联受体的激动剂结合结构(Agonist-boundstructures of G protein-coupled receptors)，《结构生物学时论(Current opinion instructural biology)》，第22卷(第4期)：第482到490页。
115.Liu，W.等人(2012年)，钠离子对GPCR进行变构调控的结构基础(Structuralbasis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions)，《科学(Science)》，第337卷(第6091期)：第232到236页。
116.Fenalti，G.等人(2014年)，对δ-阿片受体信号传导的分子控制(Molecularcontrol of delta-opioid receptor signalling)，《自然(Nature)》，第506卷(第7487期)：第191到196页。
117.Zhang，C.等人(2012年)，人蛋白酶活化受体1的高分辨率晶体结构(High-resolution crystal structure of human protease-activated receptor 1)，《自然(Nature)》，第492卷(第7429期)：第387到392页。
118.Murphree，L.J.等人(2002年)，人A(2A)腺苷受体：高亲和力激动剂与包含Gβ(4)的受体-G蛋白复合物的结合(Human A(2A)adenosine receptors:high-affinityagonist binding to receptor-G protein complexes containing Gbeta(4))，《分子药理学(Mol Pharmacol)》，第61卷(第2期)：第455到462页。
119.Manglik，A.等人(2015年)，关于β2-肾上腺素受体信号传导的冬天过程的结构见解(Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-AdrenergicReceptor Signaling)，《细胞(Cell)》，第161卷(第5期)：第1101到1111页。
120.Carpenter，B.等人(2016年)提交的工程化最小G蛋白以促进G蛋白偶联受体在其活性构象下的结晶化(Engineering a minimal G Protein to facilitatecrystallisation of G protein coupled receptors in their active conformation)。
121.Ballesteros，J.A.等人(1995年)，用于对G蛋白偶联受体中的结构功能关系构造三维模型并进行计算探索的整合方法(Integrated methods for the constructionof three dimensional models and computational probing of structure functionrelations in G protein-coupled receptors)，《神经科学方法(Methods inNeurosciences)》，第25卷：第366到428页。
122.Park，J.H.等人(2008年)，无配体G蛋白偶联受体视蛋白的晶体结构(Crystalstructure of the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin)，《自然(Nature)》，第454卷(第7201期)：第183到187页。
123.Krumm，B.E.等人(2015年)，由神经降压素受体进行G蛋白活化的结构前提(Structural prerequisites for G-protein activation by the neurotensinreceptor)，《自然通讯(Nat Commun)》，第6卷：第7895页。
124.White，J.F.等人(2012年)，激动剂结合是神经降压素受体的结构(Structureof the agonist-bound neurotensin receptor)，《自然(Nature)》，第490卷(第7421期)：第508到513页。
125.Leslie，A.G.(2006年)，大分子衍射数据整合(The integration ofmacromolecular diffraction data)，《晶体学学报D区—生物晶体学(Acta CrystallogrD Biol Crystallogr)》，第62卷(第1部分)：第48到57页。
126.Evans，P.R.等人(2013年)，我的数据好在哪里？分辨率是多少？(How goodare my data and what is the resolution？)，《晶体学学报D区—生物晶体学(ActaCrystallogr D Biol Crystallogr)》，第69卷(第7部分)：第1204到1214页。
127.McCoy，A.J.等人(2007年)，Phaser晶体学软件(Phaser crystallographicsoftware)，《应用晶体学期刊(J Appl Crystallogr)》，第40卷(第4部分)：第658到674页。
128.Murshudov，G.N等人(2011年)，用于精化大分子晶体结构的REFMAC5(REFMAC5for the refinement of macromolecular crystal structures)，《晶体学学报D区—生物晶体学(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)》，第67卷(第4部分)：第355到367页。
129.Emsley，P.等人(2010年)，Coot的特征和发展(Features and developmentof Coot)，《晶体学学报D区—生物晶体学(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)》，第66卷(第4部分)：第486到501页。
实例5：进一步最小G蛋白
概述
所开发的第一最小G蛋白是mini Gs。这里，我们扩展最小G蛋白家族至包括最小Golf、最小Gi1、最小Go1以及嵌合体mini Gs/q和mini Gs/i。最小G蛋白被示出为与GPCR偶联并且与可以通过尺寸排阻色谱法纯化的纯化受体形成稳定复合物。与最小G蛋白偶联的激动剂结合GPCR与激动剂结合受体单独相比示出了更高的热稳定性。GFP在最小G蛋白的N端处的融合允许通过荧光检测尺寸排阻色谱法(FSEC)来监测受体偶联，并且在单独测定中，与洗涤剂溶解受体结合的最小G蛋白的亲和力被确定。这项工作为任何最小G蛋白的产生并且最终为完全活性状态下的任何GPCR的结构确定提供了基础。
引言
最小G蛋白的概念在加快GPCR在其活性状态下的结构确定速率方面示出了很大希望。然而，存在针对各种GPCR示出不同特异性的四个Gα亚基家族(图28；Gαs、Gαi、Gαq和Gα12)[24]。因此，为了真正可用作结构生物学中的工具，来自每个家族的至少一个成员需要转换成最小G蛋白。这里，我们报道了所有主要Gα家族的最小G蛋白的产生。我们还描述了可以用于表征最小G蛋白与GPCR的结合的五种不同测定并且在三种情况下示出了复合物可以通过尺寸排阻色谱法进行纯化。用于生成最小G蛋白的两种不同的方法可以容易地应用于任何其它Gα亚基，从而开启研究任何物种的可能任何GPCR之路。
物质与方法
配体
β1-肾上腺素受体(β1AR)激动剂盐酸异丙肾上腺素和反向激动剂盐酸ICI118551是来自西格玛奥德里奇。腺苷A2A受体(A2AR)激动剂NECA和拮抗剂ZM241385也是来自西格玛奥德里奇。血清素5HT1B受体(5HT1BR)激动剂盐酸多尼曲坦和选择性拮抗剂盐酸SB224289是来自圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)；激动剂琥珀酸舒马曲坦是来自CaymanChemical。血管紧张素II受体(AT1R)激动剂血管紧张素II是来自Tocris。所有放射活性配体均来自珀金埃尔默。
GPCR构造、表达和纯化
人腺苷A2A受体(A2aR)
在这项工作期间使用了两个不同的A2AR构造。对于使用纯化受体的SEC实验，使用含有N端硫氧还蛋白融合蛋白的A2AR构造来增大受体的分子量。在没有这个融合蛋白的情况下，A2AR和最小G蛋白在SDS-PAGE上具有相同的移动性，由此使在分析复合物时可视化各个组分变得困难。硫氧还蛋白-A2AR融合蛋白由以下项组成：N端可切割前导序列(gp67)、His10标签和TEV蛋白酶切割位点，随后是通过连接子连接到野生型人A2AR(残基6到316)的硫氧还蛋白。A2AR包含用于移除可能的N联糖基化位点的N154A突变。对于所有其它实验，使用包含C端His10标签和TEV蛋白酶切割位点以及用于移除可能的N联糖基化位点的N154A突变的C端截短的人A2AR构造(残基1到317)。如前所述，这两个构造使用杆状病毒表达系统进行表达[19](参见实例4)。细胞在感染后72小时通过离心收获，重悬在低渗缓冲液(20mM HEPES pH7.5、1mM EDTA、1mM PMSF)中，在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下直至使用。基本上如前所述，使用Ni2+-亲和力色谱法、随后使用SEC在DDM中执行受体的纯化[19]。
火鸡β1-肾上腺素受体(β1AR)
截短版野生型火鸡β1AR(构造：βAR6；[25])包含N端和C端处的截短以及用于纯化的C端His6标签[25]，并且如前所述在27℃下使用杆状病毒表达系统进行表达[26]。细胞在感染后48小时通过离心收获，重悬在低渗缓冲液(20mM Tris HCl pH 8、1mM EDTA、1mMPMSF)中，在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下直至使用。
人血管紧张素II型受体1(AT1R)
野生型AT1R(残基1到359)具有C端因子X切割位点、随后是GFP和用于纯化的His10标签，并且使用四环素可诱导哺乳动物表达系统作为稳定细胞系表达在HEK293细胞中[27]。将细胞在含有5％无四环素FBS的DMEM中生长，直到其80％汇合，并且然后，添加四环素至最终浓度为1μg/ml。将细胞生长24小时并且然后收获，并且重悬在PBS中，在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下直至使用。
大鼠神经降压素受体(NTSR1)
NTSR1如前所述进行表达[13]。杆状病毒构造NTSR1由以下项组成：血球凝集素信号肽和Flag标签，随后是野生型大鼠NTSR1(残基43到396)和C端His10标签。使用修饰pFastBac1转移质粒(英杰(Invitrogen))生成重组杆状病毒。用重组病毒感染粉纹夜蛾细胞，并且将温度从27℃降到21℃。细胞在感染后48小时通过离心收获，重悬在低渗缓冲液(10mM HEPES pH 7.5、10mM MgCl2、20mM PMSF)中，在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃下直至使用。
人血清素5HT1B受体(5HT1BR)
将野生型5HT1BR(残基34到390)修饰成包含C端TEV切割位点和His10标签、克隆到质粒pBacPAK8中并且使用FlashBAC ULTRA系统(Oxford Expression Technologies)来制备重组杆状病毒。将粉纹夜蛾细胞在ESF921培养基(Expression Systems)中生长到密度为3×106个细胞/ml，用5HT1BR杆状病毒进行感染并且在27℃下孵育48h以进行表达。使用Ni2+-亲和力色谱法、随后使用SEC在DDM或LMNG中执行受体的纯化。
G蛋白亚基的表达、纯化和稳定性
关于构造参见图29和图35到图37。根据实例1所描述的方案通过差示扫描荧光测定法(DSF)对最小G蛋白以及非脂化Gβ1γ2二聚体执行表达、纯化和稳定性测量。还使用天然DSF(NanoTemper Prometheus)在洗涤剂中确定最小G蛋白的稳定性。将50mM HEPES pH 7.5(KOH)、20mM MgCl2、50mM NaCl、1μM GDP中的最小G蛋白(2mg/ml)与无洗涤剂(对照)、0.1％LMNG或0.1％DDM混合。在加热之前将样本在Prometheus(20％激发、15℃到85℃、速率2.0℃/min)上、在冰上孵育(最少30min)并且确定散射开始。
A2AR-mini Gs复合物的SEC
将A2AR的硫氧还蛋白融合构造在DDM中纯化，最小G蛋白以1:1.2摩尔比过量添加，在冰上孵育过夜并且然后加载到Superdex S200 10/300尺寸排阻柱(10mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、100μM NECA,0.02％DDM；4℃、0.5ml/min)上。通过SDS-PAGE来分析峰级分。
FSEC测定
(1)A2AR
将总共包含20μg(560pmol)野生型A2aR的昆虫细胞膜(20×106个细胞)以2ml的最终体积在40mM HEPES pH 7.5、500mM NaCl、2mM MgCl2、2U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶(西格玛奥德里奇)和0.5％(v/v)DDM中在冰上溶解30min。通过超速离心(30min、4℃、135,000xg)移除不可溶物质。将上清液划分为等分试样以进行后续测定。向500μl的上清液中添加最终浓度均为60μM的激动剂NECA或反向激动剂ZM241385(阴性对照)。然后添加并且允许GFP-mini-Gs(6μg；110pmol)在加载200μl到Superdex S200 10/300尺寸排阻柱(缓冲液20mMHEPES pH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2、1μM NECA或ZM241385、0.03％DDM、4℃、流速0.45ml/min)上之前在冰上结合90min。在500μl测定缓冲液中，对照样本仅包含6μg GFP-mini-Gs。通过被设定成在488nm处激发并在525nm处发射的Hitachi荧光计(mV)来检测GRP荧光。
(2)β1AR
将总共包含8μg(178pmol)野生型β1AR的昆虫细胞膜(30×106个细胞)在20mMTris-HCl pH 8、500mM NaCl、5mM MgCl5、2U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶和0.5％(v/v)DDM中、在冰上溶解30min。通过超速离心(30min、4℃、135,000xg)移除不可溶物质。将上清液划分为等分试样以进行后续测定。将异丙肾上腺素(最终浓度为100μM)或ICI118551(最终浓度为10μM)添加到500μl的上清液中。然后添加并且允许GFP-mini-Gs(6μg)在加载200μl到Superdex S200 10/300尺寸排阻柱(缓冲液20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2、1μM异丙肾上腺素或ICI118551、0.03％DDM、4℃、流速0.45ml/min)上之前在冰上结合90min。在500μl测定缓冲液中，对照样本仅包含6μg GFP-mini-Gs。
(3)5HT1BR
在使用洗涤剂溶解的未纯化受体时，将表达610pmol 5HT1BR的昆虫细胞(40×106个细胞)重悬在20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2中至最终细胞密度为20×106个细胞/ml并且用0.5％DDM溶解(45min、4℃)。通过超速离心(30min、4℃、135,000xg)移除不可溶物质。将上清液划分为900μl等分试样以进行后续测定。为GFP-mini-Go1(5μg)添加多尼曲坦或SB224289各自到最终浓度为100μM，并且允许在加载500μl到Superdex S200 10/300尺寸排阻柱上之前在冰上结合90min。在500μl测定缓冲液中，对照样本仅包含5μg GFP-mini-Go1。
在一些FSEC实验中，使用纯化5HT1BR。将LMNG或DDM中多尼曲坦结合的纯化受体(120μg；3nmol)以450μl的最终体积用4μg(60pmol到80pmol)的GFP-mini-Gi1、GFP-mini-Go1或GFP-mini-Gs(阴性对照)在冰上孵育90min。然后将样本(200μl)加载到Superdex S20010/300尺寸排阻柱(缓冲液20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、10mM MgCl2、1μM 0.03％DDM或0.001％LMNG缓冲液、4℃、流速为0.45ml/min)上。
荧光饱和结合测定(FSBA)
(1)β1AR
将由表达β1AR的昆虫细胞制备的膜(50×106个细胞)溶解在20mM Tris-HCl pH 8、500mM NaCl、3mM咪唑、0.5％DDM中(1小时、4℃、最终体积为8ml)。通过超速离心(30min、4℃、135,000xg)移除不可溶物质并且将上清液划分为两个等分试样。将激动剂异丙肾上腺素添加到一个样本(最终浓度为10μM)并且将反向激动剂ICI118551添加到另一个样本(最终浓度为1μM)。然后将样本以每孔200μl等分到黑色Ni2+涂覆的96孔板(Pierce；赛默飞世尔(Thermo Fisher))中。允许受体经由其His标签在冰上结合1h。然后抽吸上清液，并且添加不同浓度(0μM到2.8μM)的200μl GFP-mini-Gs且在冰上孵育另外的90min。然后将上清液通过抽吸移除并且用缓冲液A(10μM异丙肾上腺素(激动剂)、20mM Tris-HCl pH 8、100mMNaCl、1mM MgCl2、1mg/mL BSA、30mM咪唑、0.03％DDM)或缓冲液B(1μM ICI118551(反向激动剂)、20mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mg/mL BSA、30mM咪唑、0.03％DDM)每个孔洗涤4次。用包含300mM咪唑的200μl的对应洗涤缓冲液来执行将受体-GFP-mini-Gs复合物从孔的两侧洗脱以制成均质溶液。然后使用在485nm处激发并在520nm处发射的Pherastar酶标仪(plate reader)(BMG Labtech有限公司)来测量荧光。使用GraphPadPrism5.0版(加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Software公司)通过非线性回归来分析与特异性结合相对应的ΔF数据(荧光激动剂条件减去荧光拮抗剂条件)并且从单位点特异性结合分析导出表观KD值。
(2)A2aR
基本上如上文中针对β1AR所描述的那样执行测定，但是缓冲液条件是不同的。在10ml的20mM Tris-HCl pH8、500mM NaCl、10mM咪唑和0.5％DDM中执行昆虫细胞膜(40×106个细胞)的溶解。在超速离心之后，将激动剂NECA(最终浓度为10μM)添加到上清液样本中并且将反向激动剂ZM241385(最终浓度为10μM)添加到另一个样本中。A2aR的洗涤缓冲液是缓冲液C(10NECA、20mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mg/mL BSA、50mM咪唑、0.03％DDM)或缓冲液D(10μM ZM241385、20mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mg/mL BSA、50mM咪唑、0.03％DDM)。
(3)5HT1BR
将表达5HT1BR的昆虫细胞(50×106个细胞)用包含10μM多尼曲坦、20mM Tris-HClpH 8、500mM NaCl、10mM咪唑、0.5％DDM的缓冲液溶解(1h、4℃、最终体积为6ml)。通过超速离心(30min、4℃、135,000xg)移除不可溶物质并且然后将每个孔200μl的上清液等分到黑色Ni2+涂覆的96孔板中。允许受体经由其His标签在冰上结合1h。然后抽吸上清液，并且添加不同浓度(从0μM到5μM)的200μl的GFP-mini-Go1、GFP-mini-Gs/i1或GFP-mini-Gs(阴性对照)且在冰上孵育另外的90min。然后将上清液通过抽吸移除并且用缓冲液E(1μM多尼曲坦、20mM Tris-HCl pH 8、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mg/mL BSA、50mM咪唑、0.03％DDM)每个孔洗涤4次。用包含300mM咪唑的200μL的缓冲液E来实施洗脱。使用GraphPad Prism5.0版(加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Software公司)通过非线性回归来分析与特异性结合相对应的ΔF数据(荧光Go1条件减去荧光Gs条件)并且从单位点特异性结合分析导出表观KD值。
竞争结合测定
将表达5HT1BR的昆虫细胞以2×106个细胞/ml的最终浓度重悬在1ml的测定缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、1mM抗坏血酸、20μM帕吉林)中。将细胞通过经由弯曲的26G针进行的10次传代进行剪切。将上清液在测定缓冲液中稀释10倍并且针对每个样本进行等分(900μl)。添加最小G蛋白(100μl，最终浓度为25μM)或缓冲液(阴性对照)。将混合物等分到0.2ml PCR板中，每个孔96μl。将在还含有2U/ml腺苷三磷酸双磷酸酶的测定缓冲液中制备的舒马曲坦(12μl)添加到每个孔(最终浓度的范围为100pM到1mM)。在100μM多尼曲坦存在的情况下确定非特异性结合。将样本混合并在4℃下孵育2h。将[3H]-GR125743(12μl)以其表观KD(10nM)浓度添加。将样本混合并且在通过96孔玻璃纤维GF/B滤板(默克密理博)过滤以及用冰冷的测定缓冲液洗涤之前在4℃下孵育2h。将过滤器干燥、冲压成闪烁管并且添加4ml Ultima Gold闪烁液(珀金埃尔默)。使用Tri-Carb计数器(珀金埃尔默)通过闪烁计数(每个样本1min)来对放射性进行定量，并且使用GraphPad Prism5.0版(加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Software公司)来确定Ki值。
热稳定性测定
(1)A2AR
将表达野生型人A2AR的粉纹夜蛾细胞的膜重悬在Tm缓冲液(25mM HEPES pH 7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2)中并且通过经由26G针进行的十次传代进行均质化。以25μM的最终浓度添加最小G蛋白。将3H-NECA和无标记NECA以1:5的摩尔比混合并且添加到膜中以给出1μM(高于表观KD大约十倍)的最终浓度。将样本在室温下孵育1h，然后在冰上冷却30min。添加癸基麦芽糖苷(DM)至最终浓度为0.13％，并且将样本在冰上孵育1h。通过离心(5min、20,000xg、4℃)移除细胞碎片和不可溶物质并且将上清液等分(120μl)到PCR条带中。将样本加热到期望温度恰好30min，然后在冰上淬火30min。将样本(50μl)加载到填装到96孔滤板(密理博)中的凝胶过滤树脂(Toyopearl HW-40F)上，所述96孔滤板被离心以将受体结合放射性配体与游离放射性配体分离[28]。在200μM无标记NECA存在的情况下确定非特异性结合。使用MicroBeta TriLux闪烁计数器(珀金埃尔默)通过液体闪烁计数对放射活性进行定量。使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来分析数据。从通过非线性回归执行的S形剂量-响应分析导出表观Tm值。结果表示一式两份地执行的两个独立实验的平均值±SEM。
(2)NTSR1
将来自10ml昆虫细胞培养物的细胞沉淀物重悬在包含DDM的1.8ml缓冲液中以给出50mM TrisHCl pH 7.4、100mM NaCl、1mM MgCl2、1％(w/v)DDM的最终缓冲液组合物。将样品在4℃下放置在旋转混合器上1小时。细胞碎片和非溶解物质通过超速离心(152,800xg、4℃、30min)移除，并且包含洗涤剂溶解的NTSR1的上清液用于在NTS和最小G蛋白存在的情况下针对热稳定性进行测试。对于热变性曲线，将上清液稀释6.67倍到包含22.5μM最小G蛋白和10nM 3H-NTS的测定缓冲液(50mM TrisHCl pH 7.4,100mM NaCl,1mM MgCl2)中并且在冰上孵育1h。在添加腺苷三磷酸双磷酸酶(0.25单位/ml，NEB)之后，将样本放置在冰上额外的30min。将样本(120μl等分试样)暴露于在0℃与60℃之间的不同温度30min并且放置在冰上。基本上如前所述，将受体-配体-最小G蛋白复合物与游离3H-NTS(100μl)分离是使用利用RDB缓冲液[50mM TrisHCl pH 7.4、1mM EDTA、0.1％(w/v)DDM、0.2％(w/v)CHAPS、0.04％(w/v)CHS]平衡的Bio-Spin 30Tris柱(伯乐生命医学产品有限公司(BioRad))通过离心辅助凝胶过滤(自旋测定)实现的[29].在每个变性实验开始和结束时记录在冰上的对照反应。确定关于未加热对照的在热暴露之后维持的活性百分比。使用Prism软件(GraphPad)中的玻尔兹曼(Boltzmann)S形方程通过非线性回归来分析数据。
(3)AT1R
将表达野生型AT1R的HEK 293细胞重悬在放射性配体结合测定缓冲液(50mMHEPES pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％BSA、40μg/ml杆菌肽)中并且通过声处理(4sec脉冲)进行均质化。分别以25μM和0.1单位/ml的最终浓度添加最小G蛋白和腺苷三磷酸双磷酸酶。分别以0.5nM和25nM的浓度(是表观KD值的大约50倍)添加125I-Ang II和无标记AngII。将样本在室温(20℃)下孵育一小时、在冰上冷却10分钟，并且然后添加洋地黄皂苷至最终浓度为1％且在冰上孵育一小时。通过离心(2min、20,000xg、4℃)移除不可溶物质。将反应混合物分成许多115μl等分试样并且各自在各个温度下孵育恰好30分钟。然后将反应物在冰上淬火5分钟。基本上如前所述，使用离心辅助凝胶过滤柱将和AT1R结合的125I-Ang II与未结合125I-Ang II分离[27].使用过量500倍的冷配体来确定非特异性结合。使用液体闪烁计数来测量放射活性。使用GraphPad prism软件通过非线性回归来分析数据并通过S形剂量-响应曲线的非线性回归来导出表观Tm值。
结果和讨论
新最小G蛋白的初始产生
最近设计的最小G蛋白,mini Gs[23]，仅包括Gs的GαGTP酶结构域以及用于使其热稳定的3个缺失和7个突变(图29)。mini Gs与β1-肾上腺素受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)两者偶联，并且产生与针对异源三聚体偶联观察到的激动剂亲和力增大[19、23以及实例1和实例4]相同的激动剂亲和力增大。然而，存在4个Gα亚基家族(图28)并且GPCR根据不同G蛋白的生理功能与所述G蛋白偶联[24].因此，为了提供用于任何GPCR在其完全活性状态下的结构确定的工具，开发来自每个其它家族的至少一个成员的最小G蛋白的各个版本是必要的。用于产生mini Gs的所有突变和缺失均位于Gα亚基的保守区内(图29)。因此，在理论上，这些突变可能可转移到其它Gα家族，从而允许产生能够与任何GPCR偶联的最小G蛋白图。
选择来自每个Gα家族的原型成员并且其包括以下项：来自Gs家族的Golf；来自Gi家族的Gi1、Go1、Gz和Gt；来自Gq/11家族的Gq和G16；以及来自G12/13家族的G12。将Gαs转换成Gs所需的突变被全体转移到所选Gα蛋白以产生各自的最小G蛋白版本(图29)。这些突变是以下项：(i)Ile/LeuHN43的所有N端氨基酸残基的缺失；(ii)残基HH1S2.12与距离IleS2.1三个N端残基的Thr之间的α螺旋结构域的缺失以及用8氨基酸残基连接子进行的代替；(iii)TyrS4H3.4与Asn/SerS4H3.15之间开关II的10个氨基酸残基的缺失；(iv)使7个残基突变成D49S1H1.3、N50S1H1.4、D249S4.7、D252S4H3.3、D272H3.8、A372H5.4、I375H5.7。残基数是针对Gαs的并且上标是指用于对G蛋白中的残基进行比较的CGN系统[6]。通过评估在大肠杆菌中的表达来执行每个最小G蛋白的初始表征并且通Ni2+-亲和力色谱法和尺寸排阻色谱法(SEC)来执行纯化。八个工程化最小G蛋白中的四个(最小Golf、最小Gi1、最小Go1和最小G12)满足了这些初始标准，即，这四个工程化最小G蛋白在其基础构象均稳定得足以允许高产率表达和纯化。每升培养物纯化最小G蛋白的产率和其如通过差示扫描荧光测定法测得的稳定性(括号中)如下：miniGs，100mg/L(65℃)；最小Golf，80mg/L(65℃)；最小Go1，100mg/L(64℃)；最小G12，25mg/L(73℃)。这四个新最小G蛋白中表达最差的是最小Gi1，因此合并附加突变G217D并且缩短N端处的截短，这将纯蛋白质的产率增大到12mg/L，但是稳定性仅为48℃。因此，最小Golf、最小Gi1、最小Go1和最小G12均具有充分得足以用于测试其与相关GPCR结合的能力的稳定性。最小G蛋白的氨基酸序列在图35中给出。
四个最小G蛋白未表达在大肠杆菌中，即，最小Gz、最小Gt、最小G16和最小Gq(氨基酸序列在图36中给出)。尽管G蛋白结构是高度保守的，但是缺失和突变从mini Gs的全体转移仍然失败，所述失败突出显示了我们缺乏对这些蛋白质的期刊的理解。确实，熟知需要辅助因子Ric8来对哺乳动物细胞中的Gq进行高效折叠[30]，并且还可能需要其它未知因子。出于本研究的目的，考虑到Gi家族的两个其它成员最小Gi1和最小Go1已经给出了稳定的最小G蛋白，因此我们未执行关于最小Gt1和最小Gz的任何进一步开发。相比之下，因为所测试的Gq家族的成员均未产生稳定的最小G蛋白，我们决定开发替代性策略来制成可用版本的最小Gq，同时封端关于最小G16的进一步工作。稍后将讨论最小Gq嵌合体的版本的成功工程化。
使用mini Gs系统进行的测定开发和验证
产生最小G蛋白的最终目的是对与激动剂和最小G蛋白结合的处于完全活性状态下的GPCR进行结构确定。在最简单格式中，这需要在洗涤剂中纯化GPCR并且由体内纯化组分形成G蛋白-GPCR复合物。因此有必要设计可以评估最小G蛋白是否已经在洗涤剂溶液中与GPCR偶联的一些简单测定。这证明并不如起初预期的那样直接，因为GPCR和/或最小G蛋白在其非活性和/或活性构象下可能不稳定。这些问题在执行产生mini Gs的最初工作时并不明显，因为mini Gs是所产生的最稳定的最小G蛋白之一并且热稳定β1-肾上腺素受体(β1AR)和野生型腺苷A2A受体(A2AR)均比其它GPCR稳定得多。因此，我们开发了五种不同的测定用于评估最小G蛋白是否与GPCR偶联和/或在洗涤剂中形成稳定复合物。这些测定均先使用mini Gs与β1AR和A2AR的偶联进行测试。各个测定具有其自己的限制，所述限制在随后的章节中常常是显而易见的，其中所述限制被用于不那么稳定的受体和新产生的最小G蛋白，并且这些将在下文中进行讨论。所使用的五种不同测定如下：(i)激动剂亲和力转变测定；(ii)热稳定性测定(TSA)；(iii)对GFP-mini-G蛋白结合的基于荧光的饱和结合分析(FSBA)；(iv)荧光检测尺寸排阻色谱法(FSEC)；(v)纯化复合物的尺寸排阻色谱法(SEC)。下文给出了使用各个测定的简要基本原理以及其优点和缺点。
(i)激动剂亲和力转变测定
mini Gs的产生依赖于激动剂亲和力转变测定来标识出与β1AR偶联的那些突变体[23]。通常认为，G蛋白偶联的定义特征是，与GPCR单独相比，激动剂针对G蛋白-GPCR复合物的亲和力增大。例如，野生型β2AR在与G蛋白偶联时结合激动剂比受体单独更紧密100倍。然而，其它受体的激动剂亲和力转变常常比针对β2AR所观察到的小得多如在β1AR中观察到的10倍激动剂亲和力转变[31]并且可以完全不存在，例如NTSR1。然而，这个测定的优点是，所述测定可以使用膜制剂中的受体或在洗涤剂中溶解的受体用标准药理学过程以高通量执行。测定可以使用饱和结合实验中的放射标记激动剂或更通常情况下使用竞争结合实验中的放射标记拮抗剂[19、23以及实例1和4](并且参见下文中关于血清素5HT1B受体的实验)。这个测定的优点是，所述测定非常敏感并且可以对膜结合受体执行，即，以在所有构象中受体最稳定的格式。这个测定的缺点是，一些受体在与G蛋白偶联时可能不示出激动剂亲和力转变。
(ii)热稳定性测定
洗涤剂溶解GPCR的热稳定性取决于所使用的洗涤剂的类型以及受体是无配体的、激动剂结合的还是拮抗剂结合的[32,33]。另外，受体稳定性倾向于通过配体的亲和力的增大和/或解离速率的减小而增大[34]。激动剂结合状态常常是受体的最不稳定构象之一，推测是因为激动剂增大了向完全活性状态过渡的可能性。在非活性状态下，存在跨膜α-螺旋的细胞内表面的紧密填装。在活化时，螺旋5和6的向外移动打断了这个紧密填装结构并且产生了G蛋白的C端结合的裂隙，由此允许G蛋白偶联[35]。完全活性状态下的非视紫红质GPCR的结构仅在其通过异源三聚体G蛋白[2]、构象特异性纳米抗体[14,17,18]或最小G蛋白[19]的结合稳定时确定。GPCR与G蛋白之间的界面超过 [2,19]，并且因此预测与激动剂结合GPCR相比增大了激动剂结合GPCR-G蛋白复合物的热稳定性。这是针对β1AR和A2AR两者观察到的，与mini Gs不存在时相比，在与mini Gs在各种不同的洗涤剂中偶联时，β1AR和A2AR在激动剂结合状态下一致更加稳定[19、23以及实例1和4]。
典型的热稳定性测定测量了在不同温度下加热30分钟之后放射标记激动剂中有多少仍与洗涤剂溶解受体结合[33]。这个测定的优点是，所述测定较快且是高通量的并且可以在所选的任何洗涤剂中执行。另一个优点是，激动剂-GPCR-最小G蛋白复合物可以在膜中执行，这在洗涤剂溶解时可以稳定受体，从而允许执行测定。如果在最小G蛋白存在的情况下存在热稳定性转变，则这强烈表明结合或偶联。
(iii)荧光检测尺寸排阻色谱法(FSEC)
FSEC是用于通过对未纯化洗涤剂溶解物执行SEC以及监测洗脱液中的GFP荧光来评估与GFP融合的膜蛋白在洗涤剂中是否稳定的快速方法[36]。在洗涤剂中稳定的膜蛋白以与膜蛋白的分子量加上特异性结合洗涤剂和脂质的质量一致的尺寸给出了对称的峰。通过将GFP与最小G蛋白的N端融合(图37)，可能使用FSEC来检测最小G蛋白与GPCR之间是否形成稳定复合物。GFP-mini-Gs融合蛋白具有54kDa的分子量并且以15.1ml的保留体积在FSEC上迁移。当这个GFP-mini-Gs融合蛋白在激动剂存在的情况下与DDM溶解的β1AR或A2AR混合时，则在12.1ml到12.5ml处观察到附加的峰(图30a、图30c)，所述附加峰与和GFP-mini-Gs结合的洗涤剂溶解受体的分子量(～180kDa)一致。如果受体与反向激动剂结合，则未观察到这个附加峰。附加峰有时在8ml的保留体积处观察到，所述保留体积与SEC柱的空隙体积相对应并且预测是由于GFP-mini-Gs的聚集。
这个测定的优点是，所述测定是对GPCR是否与最小G蛋白形成复合物的快速评估，因为受体不需要纯化并且SEC实验花费一小时以内。然而，主要的限制是，每个实验仅可以使用小量的GFP-mini-Gs来避免探测器饱和以及产生将会模糊GPCR与GFP-mini-G蛋白之间的复合物的存在的很宽的峰。因此，最小G蛋白的浓度低于其用于KD以用于与受体相关联并且因此测定不是定量的。另外，受体-最小G蛋白复合物必须是洗涤剂稳定的以便观察到峰。许多GPCR-G蛋白复合物太不稳定以至于无法在DDM中观察到并且因此有必要评估更温和的洗涤剂如LMNG(参见关于血清素5HT1B受体的章节)。
(iv)对最小G蛋白结合的基于荧光的饱和结合分析
为了确定最小G蛋白与受体结合的亲和力，开发了基于荧光的饱和结合测定(FSBA)。在这个测定中，与固定化受体特异性结合的GFP-mini-G蛋白的量是使用荧光酶标仪确定的。作为原理论据，在激动剂或反向激动剂存在的情况下，将DDM溶解的β1AR或A2AR经由其C端多组氨酸标签固定到96孔板的Ni2+涂覆的孔上。然后，以增大的浓度添加GFP-mini-Gs。在洗脱从而移除任何非特异性结合GFP-mini-Gs之后，测量GFP-mini-Gs荧光的量(图30b、图30d)。GFP-mini-Gs示出了与受体的特异性饱和结合，其中GFP-mini-Gs与β1AR和A2AR结合的表观KD值分别为201nM±1nM(n＝2)和428nM±24nM(n＝2)。
FSBA是用于确定最小G蛋白与体内受体结合的亲和力的简单测定。然而，必须了解到，所确定的表观亲和力可以仅对测定中的条件具有特异性。具体地说，所使用的洗涤剂类型可以对亲和力有深远影响，尤其是在其稍微去稳定受体的活性状态时。根据激动剂在稳定受体的活性状态方面如何有效，激动剂还可以影响最小G蛋白的表观亲和力。然而，FSBA仍是用于对最小G蛋白与受体的结合进行生物物理分析的有用工具。
(v)尺寸排阻色谱法(SEC)
用于观察最小G蛋白与受体偶联的最终生物化学测定是组合体内纯化组分并且然后观察通过SEC对相关蛋白进行的共同洗脱[23和实例4]。在激动剂NECA存在的情况下以1:1.2的摩尔比混合纯化A2AR和纯化mini Gs，允许形成复合物并且然后通过SEC来执行分离。与受体单独为133kDa并且mini Gs单独为22kDa相比，A2AR-mini Gs复合物解析成具有表观分子量153kDa的主峰。SDS-PAGE分析确认A2AR和mini Gs均存在于153kDa复合物的级分中(图30e)。
使用纯化组分和SEC来分析复合物形成的优点是，明确地观察到复合物形成。复合物形成的条件可以精化并且复合物的稳定性可以在一段日子之后通过重复SEC来容易地评估。这些数据是成功确定GPCR-最小G蛋白复合物的结构所必需的。这个测定的缺点是，需要足量的纯化受体并且这在项目的初始阶段是限制性的。
最小G蛋白的表征
最小Golf偶联并稳定A2AR
Golf和Gs的GTP酶结构域共享87％的序列一致性(全长α亚基为80％)并且这两种G蛋白均与A2AR偶联[37]。在mini Gs中的与A2AR-mini Gs复合物的晶体结构中的A2AR中的残基直接接触的17个氨基酸残基中[19和实例4]，除了Gs中的两个Arg残基用Golf中的两个Lys残基代替之外，所有这些残基是相同的。尽管这两个同种型之间具有高度序列同源性，但是Gαolf实际上比Gαs更加难以过量表达，报道用于产生功能性Gαolf的唯一方法是与昆虫细胞中的分子伴侣RIC8B共同表达[38]。因此，我们构造了最小Golf以调差最小G蛋白版本是否将会比天然α亚基更好地表达。最小Golf通过从mini Gs转移7点突变和3个缺失来构造(图29)并且最小Golf高度表达在大肠杆菌中且与mini Gs一样稳定。通过对由纯化蛋白质在体内组装的复合物进行的SEC以及热稳定性测定来评估最小Golf与A2AR的偶联[19、23以及实例1和4]纯化的NECA结合的A2AR与最小混合并且通过SEC和SDS-PAGE进行分析(图31a)。最小Golf的表观分子量为23kDa(17.1ml；理论分子量为26kDa)并且DM中的纯化A2AR的表观分子量为133kDa(13.3ml)。复合物A2AR-最小Golf解析成分子量为153kDa(13ml)的主峰并且包含A2AR和最小Golf。最小Golf还稳定了激动剂结合的DM溶解的A2AR，其中与受体单独的26.9℃±0.3℃相比，最小Golf偶联A2AR示出了32.5℃±1℃的表观Tm(图31b)。这个稳定性类似于在相同条件下用mini Gs获得的稳定性(32.9℃)[19和实例4]。
就突变的可转移性、最小Golf的表达和稳定性以及A2AR-最小Golf复合物的稳定性而言，最小Golf的结果非常鼓舞人心。因此，在G蛋白之间存在高度同源性的情况下，突变存在好的可转移性，如之前针对GPCR之间的热稳定突变的转移所观察到的[39]。这些数据还表明，即使天然α亚基被较差地表达，最小G蛋白也可以高度表达并且非常稳定。
产生嵌合Gs/q以研究Gq偶联受体
最小Gq在大肠杆菌中的表达并不成功。解释这一情况的一种可能性是，Gq在体内的高效折叠取决于分子伴侣Ric8[30]并且最小Gq具有类似要求。确实，Ric8与最小Gq在杆状病毒表达系统中的共同表达导致最小Gq过量产生。然而，在纯化最小Gq时，不可能解离Ric8(结果未示出)，从而表明最小Gq也许未正确折叠和/或非常不稳定。考虑到将最小G蛋白突变从Gs转移到Gq缺乏成功，开发了另一种策略。
用于尝试开发最小Gq的第二策略是将Gq的特异性决定簇转移到mini Gs上。很确定的是，Gα亚基的C端区形成了主要受体结合位点[40]并且是偶联特异性的主要决定簇[41,42]。突变Gα亚基的C端处少至3个到5个氨基酸已被示出为切换与一些GPCR偶联的特异性[41,42]。然而，至今出版的两个GPCR-G蛋白结构[2,19]揭示了受体与Gα之间的广泛界面，从而表明G蛋白的其它区也可以在特异性中起作用。最近的体内FRET研究还表明，在α5螺旋内但在五个C端残基远端的残基强烈影响了特异性[43]。
mini Gs未与测试的任何Gq偶联受体偶联(结果未示出)。然后，我们主要使用热稳定性测定(图32c)和SEC(图39)针对与Gq偶联受体结合的增益(图32a、图32b)以及与同源的Gs偶联受体A2AR结合的损失来估计mini Gs/q嵌合体的数量(图38)。首先，构造嵌合体miniGs/q57，其中mini Gs的五个C端氨基酸(QH5.22YELLH5.26)改变成在Gαq中发现的那些，这需要三个突变(Q390EH5.22、E392NH5.24和L394VH5.26)。我们未在这个构造与所测试的任何受体之间观察到任何可检测交互作用(图32a、图32b)。此外，仍观察到mini Gs/q57与A2AR之间的复合物(图32c和图39)，从而表明突变不足以将Gs的特异性改变到Gq。接下来，构造嵌合体miniGs/q58，其中mini Gs的α5螺旋的最后19个氨基酸残基*Phe376H5.8到Leu394H5.26)被改变成Gαq中的那些；这需要13个突变(N377AH5.9、D378AH5.10、C379VH5.11、R380KH5.12、I382TH5.14、Q384LH5.16、R385QH5.17、M386LH5.18、H387NH5.19、R389KH5.21、Q390EH5.22、E392NH5.24和L394VH5.26)。mini Gs/q58未与A2AR偶联(图32c和图39)，从而证明α5螺旋中超过C端5个氨基酸的残基在G蛋白特异性中较为重要。然而，在mini Gs/q58存在的情况下，Gq偶联受体NTSR1的热稳定性并无显著转变(图32b)。推论这可能是因为mini Gs/q58的稳定性受损，因为使mini Gs中的最后19个氨基酸残基突变也会改变埋藏在G蛋白的核心中的残基，从而影响mini Gs骨架的稳定性。因此，构造这个嵌合体的精化版本mini Gs/q70，其中α5螺旋中的侧链与β2AR[2]或A2AR[19]在G蛋白结合结构下形成直接接触(截留)的残基发生突变以匹配Gαq中的那些(R380KH5.12、Q384LH5.16、R385QH5.17、H387NH5.19、E392NH5.24和L394VH5.26；图38)。另外，突变Q390EH5.22尽管仅经由其骨架与A2AR接触但也包括在内，因为所述突变埋藏在受体-G蛋白界面中并且可能对于与Gq偶联受体的结合而言较为重要。mini Gs/q70给出了与所测试的Gq偶联受体NTSR1和AT1R两者更好的结合，并且与A2AR未示出结合(图32和图39)。
还构造了两个其它嵌合体来尝试提高mini Gs/q70。mini Gs/q72与mini Gs/q70相比包含附加突变C379VH5.11，并且尽管C379VH5.11侧链未与A2AR或β2AR形成直接接触，但是预测其到Val的突变从A2AR引入了Valγ2碳与Leu110之间的直接相互作用。然而，AT1R-miniGs/q72复合物并不具有比AT1R-mini Gs/q70更高的热稳定性(结果未示出)。最后，构造嵌合体mini Gs/q71，其中来自Gα的其它区的与β2AR[2]或A2AR[19]形成直接接触的残基发生突变以匹配Gαq中的那些。这包括mini Gs/q70中的七个突变(R380KH5.12、Q384LH5.16、R385QH5.17、H387NH5.19、Q390EH5.22、E392NH5.24和L394VH5.26)和六个附加突变(A39RHNS1.3、H41LS1.2、D343KH4.23、L346VH4.26、R347DH4.27和Y358I H4S6.11)。D343H4.23是侧链未与A2AR或β2AR相互作用的唯一氨基酸残基，但是到Lys的突变包括在内，因为较长侧链可能可以与受体相互作用并且电荷逆转可能对特异性较为重要。相反，Thr350H4S6.3未突变成最新Gs/q71中的Pro，虽然其侧链与β2AR形成直接接触。Gαs与Gαq的两个独立解出结构比对[44,45]示出了，G蛋白的这个区显著不同，并且因此，在Gαq中，这个残基不可能与受体相互作用。然而，在所有这些考虑之后，为了形成mini Gs/q70的提高版本，mini Gs/q71与mini Gs/q70相比未提高激动剂结合的Gq偶联受体的热稳定性(图32a、图32b)。
最小Gi1：解决稳定性问题
将7点突变和3个缺失从mini Gs转移到Gαi1以形成最小Gi1未成功，因为所得蛋白质被较差地表达并且具有低稳定性(结果未示出)。在产生mini Gs/q的嵌合体的工作正在进行的同时，我们决定首先研究最小Gi1看似如此不稳定的原因。因此，为了提高表达、稳定性并且为了允许最小Gi1与βγ亚基结合，重新插入N端(残基4到18)，将Asp249H3.8突变回Leu，并且基于(较差地表达的)Gi1与(高度表达的)Gs/Go之间的序列比较来引入G217DH2S4.3突变(图29和图35)。所得最小Gi1(构造46)仅产生了每升培养物12mg的纯化蛋白质并且比miniGs不稳定17℃，但是适合于GPCR偶联的初始研究。
将血清素5-HT1B受体(5HT1BR)用作模型Gi偶联受体以用于产生最小Gi1，因为其可以使用杆状病毒表达系统和在非活性状态下确定的其结构来表达并在DDM中纯化[10].最初，GFP-mini-Gi1针对与纯化5HT1BR(DDM中)的结合使用FSEC进行测试并且与激动剂多尼曲坦结合。然而，GFP-mini-Gi1(图37)在受体不存在的情况下或在多尼曲坦结合的5HT1BR存在的情况下以13.5ml迁移，从而指示无偶联发生(图33c)。然而，在使用LMNG纯化的5HT1BR时，FSEC示出了两个峰，一个对应于保留体积为14.3ml的游离GFP-mini-Gi1并且另一个对应于保留体积为12.2ml的与多尼曲坦活化5HT1BR结合的GFP-mini-Gi1(图33d)。因为多尼曲坦活化5HT1BR已经结晶化，这表明，受体在洗涤剂中相当稳定，这进而表明，GFP-mini-Gi1-5HT1BR-多尼曲坦复合物的不稳定可能是由于最小G蛋白而非受体。这通过在GFP-mini-Gi146(图37)与β1γ2之间形成异源三聚体进行测试，从而与LMNG中的多尼曲坦结合5HT1BR制成最小三聚体复合物并且形成FSEC。与游离GFP-mini-Gi1β1γ2三聚体的14.3ml相比，GFP-最小三聚体在与LMNG纯化5HT1BR形成复合物时解析成保留体积为11.8ml的单峰(图33f)。因此，β1γ2亚基恢复了最小Gi1的稳定。
尽管最小Gi1β1γ2三聚体与LMNG溶解的5HT1BR成功偶联，但由于异源三聚体G蛋白的大尺寸，因此这对晶体学而言并不如G蛋白偶联受体那样令人期望。因此，根据通过制成mini Gs/q嵌合体来将mini Gs的偶联改变为Gq的偶联的成功策略，应用同一策略来工程化Gs/i1嵌合体(图35和图40)。因此，将9个突变(C379VH5.11、R380TH5.12、Q384IH5.16、R385KH5.17、H387NH5.19、Q390DH5.22、Y391CH5.23、E392GH5.24和L394FH5.26)引入Gs的α5螺旋中以将其偶联特异性改变成Gi1的偶联特异性。与游离GFP-mini-Gs/i1的15.1ml相比，GFP-mini-Gs/i143(图37)与多尼曲坦结合的、DDM纯化的5HT1BR之间的复合物解析成保留体积为13.2ml的单峰(图33e)。因此，mini Gs/i1确实比最小Gi1更稳定。与mini Gs/i1相比，mini Gs针对多尼曲坦结的、DDM溶解的5HT1BR的特异性是使用FSBA确认的(图33)。未观察到GFP-mini-Gs与5HT1BR的特异性偶联，但是确认了与GFP-mini-Gs/i1的特异性偶联(表观KD为386nM；图33b)。
为了比较所有最小Gi1构造以及β1γ2的作用，对5HT1BR执行激动剂亲和力转变测定。未偶联受体针对这个测定中的激动剂舒马曲坦示出了276nM±10nM的Ki，所述Ki被最小Gi146和mini Gs/i143分别转变为80nM±13nM和36nM±2nM(图33a)。然而，将β1γ2添加到最小G蛋白导致最小Gi146-β1γ2和mini Gs/i143-β1γ2的激动剂亲和力分别进一步增大到15nM±1nM和7.2nM±0.8nM。因此，尽管成功生成最小Gi1和mini Gs/i1两者，但是其稳定性仍不完美，因为β1γ2的结合稳定了最小G蛋白并且在最小三聚体偶联时引发了更大的激动剂亲和力增大。
最小Go1与5HT1BR的偶联
Go1和Gi1的GTP酶结构域是高度保守的(一致性为80％)，但是从其衍生的最小G蛋白表现得大不相同。不像不稳定的最小Gi1，最小Go1表达得很好(100mg/L)、具有可比得上mini Gs的高稳定性并且其对温和洗涤剂的存在很不敏感。由于5HT1BR与Go和Gi家族成员均偶联[46]，我们测试了最小Go1与5HT1BR的偶联并且将结果与和最小Gi1的偶联进行比较(参见上文)。通过FSEC，GFP-mini-Go112(图37)与多尼曲坦结合的、DDM溶解的5HT1BR(未纯化)部分偶联，其中在受体与拮抗剂结合时较高分子量物种(保留体积为13ml)减少(图34c)。这是在未观察到结合的相同条件下与最小Gi1的结果相比而言的(图33c)。部分偶联可能是由测定中使用的低浓度的5HT1BR和GFP-mini-Go1造成的，因为在使用纯化5HT1BR和GFP-mini-Go1重复实验时，所有GFP-mini-Go1与受体结合(图34e)。另外，复合物通过SEC纯化并且SDS-PAGE指示了5HT1BR和最小Go1以1:1.2的摩尔比共同洗脱(图34d)。GFP-mini-Go1与DDM溶解的5HT1BR在多尼曲坦存在的情况下结合，表观KD为184nM±24nM(图34b)。在膜中，最小Go112将针对5HT1BR的激动剂亲和力从276nM±10nM转变到32nM±3nM(图34a)。
最小Go1的特性使这成为对Go/Gi偶联受体进行结构研究的理想选择而非使用miniGs/i，因为其更加高度表达并且对洗涤剂更耐受。
结论
这里呈现的工作的目的是生成可以用作GPCR在其完全活性状态下进行结构确定的基础的最小G蛋白范围。对Gs执行产生最小G蛋白的最初工作[23]，这证明是最佳表达且最稳定的最小G蛋白之一。将相关突变转移到其它G蛋白成功衍生出最小Golf、最小Go1和最小G12。最小Golf和最小Go1均仅在激动剂存在的情况下与相关受体偶联并且形成可以通过SEC纯化的稳定复合物。目前，我们不能证明最小G12与任何受体结合(结果未示出)，但是最小G12高度表达在大肠杆菌中并且具有热稳定性，从而表明蛋白质处于折叠状态。相比之下，用于生成最小Gt1、最小Gz、最小Gq和最小G16的初始尝试由于在大肠杆菌中无表达而未成功。最小Gi1表达得非常差，但在进一步诱变时提高，但是仍不如mini Gs那样稳定并且需要βγ亚基的结合来实现5HT1BR的完全激动剂亲和力转变。
用于生成最初不工作的那些最小G蛋白的最小G蛋白的第二种方法是通过将miniGs的特异性转换成所期望G蛋白的特异性来制成嵌合体。这最初是通过以下方式为Gq产生的：在mini Gs中，仅使α5螺旋中的侧链与β2AR或A2AR接触在相关复合物的晶体结构下的那些残基发生突变[2,19]，以匹配Gq中的等效残基。最终的mini Gs/q嵌合体是稳定的，过量表达在大肠杆菌中并且与Gq偶偶联受体偶联但不与Gs偶联受体偶联。过程还成功生成了miniGs/i1和mini Gs/o嵌合体。α5螺旋在至今结晶化的两种G蛋白-GPCR复合物中的GTP酶结构域与受体之间提供了～70％的埋藏表面面积。这里，工作示出了改变这些接触足以改变偶联特异性。然而，这并不是说界面的剩余30％不重要，只是一定范围的氨基酸残基可以容置在这个界面中并且因此其在定义G蛋白结合的特异性和亲和力两者时起到的作用不那么重要。
最小G蛋白及其特性在表7中示出。总体而言，在大肠杆菌中的表达水平是令人满意的并且最小G蛋白在洗涤剂不存在的情况下的稳定性也很好。然而，其稳定性在洗涤剂中降低，特别是在高浓度时，其中最大的稳定性减小在高洗涤剂浓度(大于0.5％w/v)处且利用如用于膜蛋白纯化那样粗糙的洗涤剂观察到[47]。因此，必须格外小心对用于形成受体-最小G蛋白复合物的洗涤剂的初始选择。
总之，这里产生的最小G蛋白范围将会涉及关于受体的活性结构直到受体-最小G蛋白复合物结晶化的进一步知识。这将会扩展我们对GPCR的信号传导的理解以及对药物发现的有用应用。
表7：最小G蛋白的突变体及其特性。
实例5的参考文献
1.Rosenbaum DM、Rasmussen SG、Kobilka BK.，G蛋白偶联受体的结构和功能(Thestructure and function of G-protein-coupled receptors)，《自然(Nature)》，2009年，第459卷(第7245期)：第356到363页，doi：10.1038/nature08144，PubMed PMID：19458711，PubMed Central PMCID：PMCPMC3967846。
2.Rasmussen SG、DeVree BT、Zou Y、Kruse AC、Chung KY、Kobilka TS等人，β2肾上腺素受体-Gs蛋白复合物的晶体结构(Crystal structure of the beta2 adrenergicreceptor-Gs protein complex)，《自然(Nature)》，2011年，第477卷(第7366期)：第549到555页，Epub 2011/07/21，doi：10.1038/nature10361，PubMed PMID：21772288，PubMedCentral PMCID：PMC3184188。
3.Tate CG、Schertler GF，工程化G蛋白偶联受体以促进其结构确定(Engineering G protein-coupled receptors to facilitate their structuredetermination)，《结构生物学时论(Curr Opin Struct Biol)》，2009年，第19卷(第4期)：第386到395页，Epub 2009/08/18，doi：10.1016/j.sbi.2009.07.004，PubMed PMID：19682887。
4.Venkatakrishnan AJ、Deupi X、Lebon G、Tate CG、Schertler GF、Babu MM，G蛋白偶联受体的分子签名(Molecular signatures of G-protein-coupled receptors)，《自然(Nature)》，2013年，第494卷(第7436期)：第185到194页，Epub 2013/02/15，doi：10.1038/nature11896，PubMed PMID：23407534。
5.Venkatakrishnan AJ、Deupi X、Lebon G、Heydenreich FM、Flock T、Miljus T等人，A类GPCR的不同活化通路在G蛋白偶联受体附近汇聚(Diverse activation pathwaysin class A GPCRs converge near the G-protein-coupling region)，《自然(Nature)》，2016年，第536卷(第7617期)：第484到487页，doi：10.1038/nature19107，PubMed PMID：27525504。
6.Flock T、Ravarani CN、Sun D、Venkatakrishnan AJ、Kayikci M、Tate CG等人，由GPCR进行Gα活化的通用变构机制(Universal allosteric mechanism for Galphaactivation by GPCRs)，《自然(Nature)》，2015年，524(7564)：第173到179页，Epub 2015/07/07，doi：10.1038/nature14663，PubMed PMID：26147082，PubMed Central PMCID：PMC4866443。
7.Warne T、Moukhametzianov R、Baker JG、Nehme R、Edwards PC、Leslie AG等人，激动剂和不封激动剂作用于β(1)-肾上腺素受体的结构基础(The structural basisfor agonist and partial agonist action on a beta(1)-adrenergic receptor)，《自然(Nature)》，2011年，第469卷(第7329期)：第241到244页，Epub 2011/01/14，doi：10.1038/nature09746，PubMed PMID：21228877，PubMed Central PMCID：PMC3023143。
8.Rosenbaum DM、Zhang C、Lyons JA、Holl R、Aragao D、Arlow DH等人，不可逆激动剂-β(2)肾上腺素受体复合物的结构和功能(Structure and function of anirreversible agonist-beta(2)adrenoceptor complex)，《自然(Nature)》，2011年，第69卷(第7329期)：第236到240页，Epub 2011/01/14，doi：10.1038/nature09665，PubMedPMID：21228876，PubMed Central PMCID：PMC3074335。
9.Zhang J、Zhang K、Gao ZG、Paoletta S、Zhang D、Han GW等人，人P2Y12受体的激动剂结合结构(Agonist-bound structure of the human P2Y12 receptor)，《自然(Nature)》，2014年，第509卷(第7498期)：第119到122页，doi：10.1038/nature13288，PubMed PMID：24784220，PubMed Central PMCID：PMCPMC4128917。
10.Wang C、Jiang Y、Ma J、Wu H、Wacker D、Katritch V等人，在血清素受体处进行分子识别的结构基础(Structural basis for molecular recognition at serotoninreceptors)，《科学(Science)》，2013年，第340卷(第6132期)：第610到614页，doi：10.1126/science.1232807，PubMed PMID：23519210，PubMed Central PMCID：PMCPMC3644373。
11.Lebon G、Warne T、Edwards PC、Bennett K、Langmead CJ、Leslie AG等人，激动剂结合腺苷A2A受体结构揭示了GPCR活化的常见特征(Agonist-bound adenosine A2Areceptor structures reveal common features of GPCR activation)，《自然(Nature)》，2011年，第474卷(第7352期)：第521到525页，Epub 2011/05/20，doi：10.1038/nature10136，PubMed PMID：21593763，PubMed Central PMCID：PMC3146096。
12.Xu F、Wu H、Katritch V、Han GW、Jacobson KA、Gao ZG等人，激动剂结合的人A2A腺苷受体的结构(Structure of an agonist-bound human A2A adenosinereceptor)，《科学(Science)》，2011年，第332卷(第6027期)：第322到327页，Epub 2011/03/12，doi：10.1126/science.1202793，PubMed PMID：21393508，PubMed Central PMCID：PMC3086811。
13.White JF、Noinaj N、Shibata Y、Love J、Kloss B、Xu F等人，激动剂结合的神经降压素受体的结构(Structure of the agonist-bound neurotensin receptor)，《自然(Nature)》，2012年，第490卷(第7421期)：第508到513页，Epub 2012/10/12，doi：10.1038/nature11558，PubMed PMID：23051748，PubMed Central PMCID：PMC3482300。
14.Rasmussen SG、Choi HJ、Fung JJ、Pardon E、Casarosa P、Chae PS等人，β(2)肾上腺素受体的纳米抗体稳定活性状态的结构(Structure of a nanobody-stabilizedactive state of the beta(2)adrenoceptor)，《自然(Nature)》，2011年，第69卷(第7329期)：第175到180页，Epub 2011/01/14，doi：10.1038/nature09648，PubMed PMID：21228869，PubMed Central PMCID：PMC3058308。
15.Choe HW、Kim YJ、Park JH、Morizumi T、Pai EF、Krauss N、等人，变视紫红质II的晶体结构(Crystal structure of metarhodopsin II)，《自然(Nature)》，2011年，第471卷(第7340期)：第651到655页，doi：nature09789[pii]
10.1038/nature09789，PubMed PMID：21389988。
16.Standfuss J、Edwards PC、D'Antona A、Fransen M、Xie G、Oprian DD等人，激动剂诱导的活化组成型活性视紫红质的结构基础(The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin)，《自然(Nature)》，2011年，第71卷(第7340期)：第656到660页，doi：nature09795[pii]
10.1038/nature09795，PubMed PMID：21389983。
17.Kruse AC、Ring AM、Manglik A、Hu J、Hu K、Eitel K等人，毒蕈硷乙酰胆碱受体的活化和变构调节(Activation and allosteric modulation of a muscarinicacetylcholine receptor)，《自然(Nature)》，2013年，第504卷(第7478期)：第101到106页，doi：10.1038/nature12735，PubMed PMID：24256733，PubMed Central PMCID：PMCPMC4020789。
18.Sounier R、Mas C、Steyaert J、Laeremans T、Manglik A、Huang W等人，传播μ阿片受体活化期间的构象变化(Propagation of conformational changes during mu-opioid receptor activation)，《自然(Nature)》，2015年，第524卷(第7565期)：第375到378页，doi：10.1038/nature14680，PubMed PMID：26245377，PubMed Central PMCID：PMCPMC4820006。
19.Carpenter B、Nehme R、Warne T、Leslie AG、Tate CG.，与工程化G蛋白结合的腺苷A(2A)受体的结构(Structure of the adenosine A(2A)receptor bound to anengineered G protein)，《自然(Nature)》，2016年，第536卷(第7614期)：第104到107页，Epub 2016/07/28，doi：10.1038/nature18966，PubMed PMID：27462812，PubMed CentralPMCID：PMC4979997。
20.Park JH、Scheerer P、Hofmann KP、Choe HW、Ernst OP.，无配体G蛋白偶联受体视蛋白的晶体结构(Crystal structure of the ligand-free G-protein-coupledreceptor opsin)，《自然(Nature)》，2008年，第454卷(第7201期)：第183到187页，Epub2008/06/20，doi：nature07063[pii]
10.1038/nature07063，PubMed PMID：18563085。
21.Scheerer P、Park JH、Hildebrand PW、Kim YJ、Krauss N、Choe HW等人，视蛋白在其G蛋白相互作用构象下的晶体结构(Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting conformation)，《自然(Nature)》，2008年，第455卷(第7212期)：第497到502页，Epub 2008/09/27，doi：nature07330[pii]
10.1038/nature07330，PubMed PMID：18818650。
22.Pardon E、Laeremans T、Triest S、Rasmussen SG、Wohlkonig A、Ruf A等人，用于生成结构生物学纳米抗体的通用协议(A general protocol for the generation ofNanobodies for structural biology)，《自然协议(Nat Protoc.)》，2014年，第9卷(第3期)：第674到693页，doi：10.1038/nprot.2014.039，PubMed PMID：24577359，PubMedCentral PMCID：PMCPMC4297639。
23.Carpenter B、Tate CG.，工程化最小G蛋白以促进G蛋白偶联受体在其活性构象下晶体化(Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of Gprotein-coupled receptors in their active conformation)，《蛋白质工程化、设计和选择：PEDS(Protein engineering,design&selection:PEDS.)》，2016年，第29卷(第12期)：第583到594页，Epub 2016/09/28，doi：10.1093/protein/gzw049，PubMed PMID：27672048。
24.Syrovatkina V、Alegre KO、Dey R、Huang XY.，G蛋白的调控、信号传导和生理功能(Regulation,Signaling,and Physiological Functions of G-Proteins)，《(Journal of molecular biology)》，2016年，第428卷(第19期)：第3850到3868页，Epub2016/08/16，doi：10.1016/j.jmb.2016.08.002，PubMed PMID：27515397，PubMed CentralPMCID：PMC5023507。
25.Warne T、Chirnside J、Schertler GF.，用于结晶化的截短非糖基化火鸡β-肾上腺素受体的表达和纯化(Expression and purification of truncated,non-glycosylated turkey beta-adrenergic receptors for crystallization)，《生物化学和生物物理学学报(Biochim Biophys Acta)》，2003年，第1610卷(第1期)：第133到140页，PubMed PMID：12586387。
26.Warne T、Serrano-Vega MJ、Baker JG、Moukhametzianov R、Edwards PC、Henderson R等人，β1-肾上腺素G蛋白偶联受体的结构(Structure of a beta1-adrenergic G-protein-coupled receptor)，《自然(Nature)》，2008年，第454卷(第7203期)：第486到491页，Epub 2008/07/03，doi：nature07101[pii]
10.1038/nature07101，PubMed PMID：18594507。
27.Thomas J、Tate CG.，对真核膜蛋白过量生产的质量控制(Quality controlin eukaryotic membrane protein overproduction)，《分子生物学期刊(J Mol Biol.)》，2014年，第426卷(第24期)：第4139到4154页，doi：10.1016/j.jmb.2014.10.012，PubMedPMID：25454020，PubMed Central PMCID：PMCPMC4271737。
28.Lebon G、Bennett K、Jazayeri A、Tate CG.，人腺苷A(2A)受体的激动剂结合构象的热稳定(Thermostabilisation of an agonist-bound conformation of thehuman adenosine A(2A)receptor)，《分子生物学期刊(J Mol Biol.)》，2011年，第409卷(第3期)：第298到310页，doi：S0022-2836(11)00378-0[pii]
10.1016/j.jmb.2011.03.075，PubMed PMID：21501622。
29.Shibata Y、White JF、Serrano-Vega MJ、Magnani F、Aloia AL,GrisshammerR等人，神经降压素受体NTS1的热稳定(Thermostabilization of the neurotensinreceptor NTS1)，《分子生物学期刊(J Mol Biol.)》，2009年，第390卷(第2期)：第262到277页，Epub 2009/05/09，doi：S0022-2836(09)00535-X[pii]
10.1016/j.jmb.2009.04.068，PubMed PMID：19422831。
30.Chan P、Thomas CJ、Sprang SR、Tall GG.，Ric-8的分子陪伴功能是折叠初生异源三聚体G蛋白α亚基(Molecular chaperoning function of Ric-8 is to foldnascent heterotrimeric G protein alpha subunits)，《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U S A)》，2013年，第110卷(第10期)：第3794到3799页，doi：10.1073/pnas.1220943110，PubMed PMID：23431197，PubMed Central PMCID：PMCPMC3593926。
31.Green SA、Holt BD、Liggett SB.，β1-和β2-肾上腺素受体展示与Gs的亚型选择性偶联(Beta 1-and beta 2-adrenergic receptors display subtype-selectivecoupling to Gs)，《分子药理学(Mol Pharmacol)》，1992年，第41卷(第5期)：第889到893页，PubMed PMID：1350321。
32.Tate CG.，用于确定G蛋白偶联受体结构的晶体澄清溶液(A crystal clearsolution for determining G-protein-coupled receptor structures)，《生物化学科学趋势(Trends in biochemical sciences)》，2012年，第37卷(第9期)：第343到352页，doi：10.1016/j.tibs.2012.06.003，PubMed PMID：22784935。
33.Magnani F、Serrano-Vega MJ、Shibata Y、Abdul-Hussein S、Lebon G、Miller-Gallacher J等人，用于生成最佳热稳定膜蛋白以供结构研究的诱变和筛选策略(Amutagenesis and screening strategy to generate optimally thermostabilizedmembrane proteins for structural studies)，《自然学报(Nat Protoc)》，2016年，第11卷(第8期)：第1554到1571页，doi：10.1038/nprot.2016.088，PubMed PMID：27466713。
34.Zhang X、Stevens RC、Xu F.，配体对于G蛋白偶联受体稳定性的重要性(Theimportance of ligands for G protein-coupled receptor stability)，《生物化学科学趋势(Trends in biochemical sciences)》，2015年，第40卷(第2期)：第79到87页，doi：10.1016/j.tibs.2014.12.005，PubMed PMID：25601764。
35.Lebon G、Warne T、Tate CG.，G蛋白偶联受体的激动剂结合结构(Agonist-bound structures of G protein-coupled receptors)，《结构生物学时论(Curr OpinStruct Biol)》，2012年，Epub 2012/04/07，doi：10.1016/j.sbi.2012.03.007，PubMedPMID：22480933。
36.Kawate T、Gouaux E.，用于对整合膜蛋白进行预结晶化筛选的荧光检测尺寸排阻色谱法(Fluorescence-detection size-exclusion chromatography forprecrystallization screening of integral membrane proteins)，《结构(Structure)》，2006年，第14卷(第4期)：第673到681页，doi：10.1016/j.str.2006.01.013，PubMed PMID：16615909。
37.Kull B、Svenningsson P、Fredholm BB.，腺苷A(2A)受体与大鼠纹状体中的g(olf)共定位并活化所述g(olf)(Adenosine A(2A)receptors are colocalized with andactivate g(olf)in rat striatum)，《分子药理学(Molecular pharmacology)》，2000年，第58卷(第4期)：第771到777页，Epub 2000/09/22，PubMed PMID：10999947。
38.Chan P、Gabay M、Wright FA、Kan W、Oner SS、Lanier SM、等人，通过GST-Ric-8解离进行异源三聚体G蛋白α亚基的纯化：纯化Gα(olf)的初步表征(Purification ofheterotrimeric G protein alpha subunits by GST-Ric-8 association:primarycharacterization of purified G alpha(olf))，《生物化学期刊(J Biol Chem)》，2011年，第286卷(第4期)：第2625到2635页，doi：10.1074/jbc.M110.178897，PubMed PMID：21115479，PubMed Central PMCID：PMCPMC3024758。
39.Serrano-Vega MJ、Tate CG.，稳定β-肾上腺素受体之间的突变的可转移性(Transferability of thermostabilizing mutations between beta-adrenergicreceptors)，《分子膜生物学(Mol Membr Biol)》，2009年，第26卷(第8期)：第385到396页，Epub 2009/11/04，doi：10.3109/09687680903208239，PubMed PMID：19883298。
40.Hamm HE、Deretic D、Arendt A、Hargrave PA、Koenig B、Hofmann KP.，用α亚基的合成肽映射的G蛋白与视紫红质结合的位点(Site of G protein binding torhodopsin mapped with synthetic peptides from the alpha subunit)，《科学(Science)》，1988年，第241卷(第4867期)：第832到835页Epub 1988/08/12，PubMed PMID：3136547。
41.Conklin BR、Farfel Z、Lustig KD、Julius D、Bourne HR.，三个氨基酸的取代将Gqα的受体特异性切换到Giα的受体特异性(Substitution of three amino acidsswitches receptor specificity of Gq alpha to that of Gi alpha)，《自然(Nature)》，1993年，第363卷(第6426期)：第274到276页，Epub 1993/05/20，doi：10.1038/363274a0.PubMed PMID：8387644。
42.Conklin BR、Herzmark P、Ishida S、Voyno-Yasenetskaya TA、Sun Y、FarfelZ等人，Gqα和Gsα的改变受体活化保真度的羧基端突变(Carboxyl-terminal mutations ofGq alpha and Gs alpha that alter the fidelity of receptor activation)，《分子药理学(Mol Pharmacol)》，1996年，第50卷(第4期)：第885到890页，Epub 1996/10/01，PubMedPMID：8863834。
43.Semack A、Sandhu M、Malik RU、Vaidehi N、Sivaramakrishnan S.，介导选择性G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导的Gαs和Gαq C端的结构要素(Structural Elements inthe Galphas and Galphaq C Termini That Mediate Selective G Protein-coupledReceptor(GPCR)Signaling)，《生物化学期刊(J Biol Chem)》，2016年，第291卷(第34期)：第17929到17940页，doi：10.1074/jbc.M116.735720，PubMed PMID：27330078，PubMedCentral PMCID：PMCPMC5016181。
44.Nishimura A、Kitano K、Takasaki J、Taniguchi M、Mizuno N、Tago K等人，由小分子对异源三聚体Gq蛋白进行特异性抑制的结构基础(Structural basis for thespecific inhibition of heterotrimeric Gq protein by a small molecule)，《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》，2010年，第107卷(第31期)：第13666到13671页，doi：10.1073/pnas.1003553107，PubMed PMID：20639466，PubMed Central PMCID：PMCPMC2922266。
45.Tesmer VM、Kawano T、Shankaranarayanan A、Kozasa T、Tesmer JJ.，膜处的活化G蛋白简况：Gαq-GRK2-Gβγ复合物(Snapshot of activated G proteins at themembrane:the Galphaq-GRK2-Gbetagamma complex)，《科学(Science)》2005年，第310卷(第5754期)：第1686到1690页，doi：10.1126/science.1118890，PubMed PMID：16339447。
46.Clawges HM、Depree KM、Parker EM、Graber SG.，人5-H1受体亚型在膜中展现出不同于Sf9细胞的G蛋白偶联表现(Human 5-HT1 receptor subtypes exhibit distinctG protein coupling behaviors in membranes from Sf9 cells)，《生物化学(Biochemistry)》，1997年，第36卷(第42期)：第12930到12938页，Epub 1997/10/23，doi：10.1021/bi970112b，PubMed PMID：9335552。
47.Tate CG.，关于纯化和结晶化期间膜蛋白不稳定的实际考虑(Practicalconsiderations of membrane protein instability during purification andcrystallisation)，《分子生物学方法(Methods Mol Biol)》，2010年，第601卷：第187到203页，doi：10.1007/978-1-60761-344-2_12，PubMed PMID：20099147。
实例6：mini Gs对GLP1R的作用
为了评估mini Gs对受体稳定性的影响，我们在洗涤剂溶解之后测量了GLP1R稳定性。为此目的，在溶解之前，用氚化的肽激动剂和mini Gs来孵育表达人GLP1R受体的细胞。允许混合物在4℃下溶解1小时之前在室温下达到平衡1小时。在不同温度下将受体/配体/mini Gs的等分试样孵育30分钟。在将过量未结合配体与受体结合分子分离之后，在各个温度下测量所保留的放射活性的水平，所述水平是相对于温度点绘制的。将结果与实验的相同但缺乏mini Gs的对照分支进行比较。mini Gs的存在显著增大了激动剂结合构象的稳定性(图41)。
Claims (117)
1.一种亲本异源三聚体G蛋白α(Gα)亚基的突变体，所述突变体(i)缺乏所述亲本Gα亚基的螺旋结构域的至少一个螺旋；(ii)能够在异源三聚体G蛋白β(Gβ)亚基和异源三聚体G蛋白γ(Gγ)亚基不存在的情况下与GPCR结合；并且(iii)具有与所述亲本异源三聚体Gα亚基的氨基酸序列相比包含一个或多个突变的氨基酸序列，所述突变选自缺失、取代和插入。
2.根据权利要求1所述的突变Gα亚基，其中所述突变体缺乏所述亲本Gα亚基的螺旋结构域的螺旋A、B、C、D、E或F中的任何一个或多个螺旋，任选地其中所述突变体缺乏螺旋A到E或缺乏所述亲本Gα亚基的螺旋结构域的螺旋A到F。
3.根据权利要求1或2所述的突变Gα亚基，其中所述突变体缺乏所述亲本异源三聚体Gα亚基的螺旋结构域的根据如图1中列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基70到193、71到193、85到193或85到199相对应的区域。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的突变Gα亚基，其中将所述突变Gα亚基与GPCR结合增大了所述GPCR针对激动剂的亲和力。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的突变Gα亚基，其中将所述突变Gα亚基与GPCR结合活化了所述Gα亚基。
6.根据权利要求5所述的突变Gα亚基，其中所述Gα亚基的活化在细胞中生成Gα蛋白信号，任选地其中所述G蛋白信号是环AMP(cAMP)的增加、cAMP的减少或钙的细胞内移动。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比在变性条件下具有增大稳定性和/或在表达在细胞中时以比其亲本Gα亚基更高的水平进行表达。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基能够在与所述GPCR结合时稳定所述GPCR的特定构象，任选地其中所述特定构象是激动剂构象。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基能够与核苷酸如鸟嘌呤核苷酸结合，和/或其中所述突变Gα单元能够与异源三聚体G蛋白的Gβ和/或Gγ亚基结合。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述Gα亚基是Gαs亚基、Gαi/o亚基、Gαq/11亚基或Gα12/13亚基中的任何亚基。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关I区未缺失。
12.根据权利要求1到10中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关I区缺失。
13.根据权利要求12所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关I区被小GTP酶的开关I区代替。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关I区根据如图1中列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基194到207相对应。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体G蛋白α亚基的螺旋结构域或其部分和/或开关I区或其部分被连接子序列代替。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体Gα亚基的根据如图1中列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基65到203相对应的区域缺失，任选地其中所述区域被连接子序列代替。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基具有N端截短氨基酸序列，任选地其中所述N端截短的长度为5个到20个或5个到25个氨基酸残基。
18.根据权利要求1到11和13到16中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基包含开关I区的一个或多个突变。
19.根据权利要求18所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的任何一个或多个位置相对应的位置处具有不同氨基酸：Leu 197和Cys 200。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体G蛋白α亚基的开关III区缺失，任选地其中所述亲本异源三聚体Gα亚基的开关III区根据如图1中列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基254到263相对应。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体Gα亚基的开关II区或其部分被连接子序列代替。
22.根据权利要求21所述的突变Gα亚基，其中所述亲本异源三聚体Gα亚基的开关II区根据如图1中列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与氨基酸残基227到230相对应。
23.根据权利要求15、16、21和22中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述连接子序列包括一个或多个甘氨酸残基和/或一个或多个丝氨酸残基。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的任何一个或多个位置相对应的位置处具有不同氨基酸：Val 36、His 41、Ala 48、Gly 49、Glu50、Met 60、Leu 63、Leu 197、Cys 200、Arg 201、Phe 208、Asn 218、Gly 226、Glu 230、Ala249、Ser 252、Leu 272、Ile 372、Val 375；任选地其中所述突变Gα亚基是在与亲本Gα亚基进行比较时在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置相对应的位置处具有不同氨基酸的突变Gα亚基：Gly 49、Glu 50、Ala 249、Ser 252、Leu 272、Ile 372和Val375。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基具有长度为20个氨基酸残基的N端截短、开关III区的缺失并且在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的一个或多个位置相对应的位置处具有不同氨基酸：His 41、Leu 197、Cys 200、Ala 249和Leu 272。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的一个或多个位置相对应的位置处具有不同氨基酸：Gly 49、Glu 50、Gly 226和Ser 252。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基与如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的氨基酸序列(SEQ ID NO:91)具有至少20％的序列一致性。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基与如图26、图29、图35、图36、图37、图38和图40中的任何图列出的氨基酸序列中的任何氨基酸序列具有至少20％的序列一致性。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基包括一个或多个显性负向突变。
30.根据权利要求29所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基任选地通过螯合G蛋白βγ亚基、螯合活化受体和/或通过螯合下游结合配偶体来抑制G蛋白信号传导。
31.根据权利要求29或30所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与Ser 54相对应的位置处具有不同氨基酸。
32.根据权利要求29到31中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基相比较时，所述突变Gα亚基在NKXD基元内具有一个或多个不同氨基酸，任选地其中所述NKXD基元的Asn用Asp代替和/或其中所述NKXD基元的Asp用Asn代替。
33.根据权利要求29到32中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图1列出的Gαs的编号与Gln 227相对应的位置处具有不同氨基酸。
34.根据权利要求29到33中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图1列出的人Gα-s亚基长同种型的编号与以下位置中的一个或多个位置相对应的位置处具有一个或多个不同氨基酸：Gly 226、Glu 268和Ala 366。
35.根据权利要求29到34中任一项所述的突变Gα亚基，所述突变Gα亚基是突变Gαt亚基(嵌合体6)并且在与所述亲本Gα亚基进行比较时所述突变Gα亚基在根据如图27列出的Gαt亚基(嵌合体6)的编号与Arg 238相对应的位置处具有不同氨基酸。
36.根据权利要求29到35中任一项所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基包括已知增大了Gα亚基针对GPCR的亲和力的一个或多个突变。
37.根据权利要求36所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图25列出的Gαi1亚基的编号与Ile 56和Gln 333相对应的位置中的每个位置处具有半胱氨酸残基。
38.根据权利要求36或37所述的突变Gα亚基，在与所述亲本Gα亚基进行比较时，所述突变Gα亚基在根据如图25列出的Gαi1亚基的编号与Asp 328相对应的位置处具有不同氨基酸。
39.根据权利要求36到38中任一项所述的突变Gα亚基，所述突变Gα亚基是突变Gαs亚基，其中所述亲本Gαs亚基的α3/β5环用Gαi2亚基的α3/β5环代替。
40.根据权利要求1到39中任一项所述的突变Gα亚基，所述突变Gα亚基是突变Gαt亚基，其中根据如图25列出的Gαt亚基的编号与Cys 347相对应的位置处的氨基酸残基被化学修饰，任选地其中所述氨基酸残基被羧甲基化或氰基化。
41.根据权利要求1到40中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变Gα亚基包括可检测部分如组氨酸标签或麦芽糖结合蛋白标签或绿色荧光蛋白标签和/或包括蛋白酶切割位点如烟草蚀纹病毒(TEV)切割位点。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的突变Gα亚基，其中所述突变体与其亲本体相比针对热、洗涤剂、离液剂和pH极值中的任何一种具有增大稳定性。
43.一种组合物，其包括根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基，其特征在于，所述突变Gα暴露于对于以比所述突变Gα亚基更大的程度去稳定所述亲本Gα有效的去稳定条件。
44.一种多核苷酸，所述多核苷酸对根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基进行编码。
45.根据权利要求44所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:46-90中的任何项的多核苷酸序列具有至少20％的序列一致性。
46.一种宿主细胞，其包括根据权利要求44或45所述的多核苷酸。
47.一种复合物，其包括：(i)根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或其能够与GPCR结合的部分，以及(ii)GPCR或其能够与根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基结合的部分。
48.根据权利要求47所述的复合物，其中所述GPCR是1类GPCR或2类GPCR或3类GPCR，任选地其中所述GPCR是β肾上腺素受体、腺苷受体、毒蕈碱受体或神经降压素受体中的任何受体。
49.根据权利要求47或48所述的复合物，其中所述GPCR以特定构象状态如激动剂结合构象驻留。
50.根据权利要求47到49中任一项所述的复合物，其中所述GPCR是在变性条件下、在特定构象下与其亲本GPCR在变性条件下、在相同特定构象下的稳定性相比具有增大稳定性的突变GPCR。
51.根据权利要求47到50中任一项所述的复合物，其中(i)和(ii)中的一者或两者被可检测地标记。
52.根据权利要求47到51中任一项所述的复合物，所述复合物进一步包括GPCR配体。
53.根据利要求52所述的复合物，其中所述GPCR配体是小分子、蛋白质、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体中的任何项。
54.根据权利要求47到53中任一项所述的复合物，所述复合物进一步包括G蛋白βγ亚基。
55.根据权利要求47到54中任一项所述的复合物，所述复合物进一步包括核苷酸，任选地其中所述核苷酸是鸟嘌呤核苷酸如GDP或GTP，或者任选地其中所述核苷酸是黄嘌呤核苷酸。
56.根据权利要求47到55中任一项所述的复合物，其中所述复合物呈结晶形式。
57.一种能够对以下项进行编码的多核苷酸或表达载体：(i)根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或其能够与GPCR结合的部分以及(ii)GPCR或其能够与根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基结合的部分。
58.根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物，所述突变Gα亚基或所述复合物呈溶解形式。
59.根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物，所述突变Gα亚基或所述复合物基本上没有其它蛋白质。
60.根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物，所述突变Gα亚基或所述复合物被固定到固体支持物。
61.一种固体支持物，根据权利要求1到42中任一项所述的一个或多个突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物被固定到所述固体支持物。
62.一种根据权利要求1到42和58到60中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55和58到60中任一项所述的复合物用于结晶化的用途。
63.一种根据权利要求1到42和58到60中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55和58到60中任一项所述的复合物用于药物发现的用途。
64.根据权利要求63所述的用途，其中所述突变Gα亚基或所述复合物用于配体结合筛选或测定开发。
65.一种根据权利要求1到42和58到60中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55和58到60中任一项所述的复合物用作生物传感器的用途，任选地其中所述生物传感器能够测量体内配体水平。
66.一种产生GPCR-Gα亚基复合物的晶体的方法，所述方法包括：
(i)提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基、GPCR和任选地GPCR配体；
(ii)形成所述突变Gα亚基、所述GPCR和任选地所述GPCR配体的复合物；以及
(iii)使所述复合物结晶化以形成晶体。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述GPCR以特定构象结晶化。
68.一种确定特定构象的GPCR的结构的方法，所述方法包括：提供根据权利要求47到55中任一项所述的GPCR-Gα亚基复合物以及确定所述复合物的结构。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述GPCR-Gα亚基复合物以结晶形式提供并且所述复合物的晶体结构被确定。
70.根据权利要求68或69所述的方法，所述方法进一步包括从所述晶体获得原子坐标。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述复合物的NMR结构被确定。
72.根据权利要求67到71中任一项所述的方法，其中所述特定构象是激动剂构象或拮抗剂构象。
73.一种用于选择亲本异源三聚体Gα亚基的突变体的方法，所述突变体能够在所述亲本异源三聚体G蛋白的β和γ亚基不存在的情况下与GPCR偶联，所述方法包括：
(a)在所述亲本异源三聚体G蛋白的β和γ亚基不存在的情况下提供亲本异源三聚体Gα亚基的一个或多个突变体；
(b)提供GPCR；以及
(c)确定所述或每个突变Gα亚基是否能够与所述GPCR结合，并且选择能够与所述GPCR结合的那些突变体。
74.根据权利要求73所述的方法，其中步骤(c)包括确定所述或每个突变Gα亚基是否在与所述GPCR结合时增大了所述GPCR针对激动剂的亲和力。
75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述或每个突变Gα亚基是否能够在与所述GPCR结合时稳定所述GPCR的特定构象，任选地其中所述特定构象是激动剂构象。
76.根据权利要求73到75中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之前，所述GPCR暴露于能够稳定特定构象的试剂，任选地其中所述试剂是纳米抗体。
77.根据权利要求73到76中任一项所述的方法，其中将所述GPCR提供在含膜组合物中。
78.根据权利要求73到77中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：确定所述突变Gα亚基与其亲本Gα亚基相比在变性条件下是否具有增大稳定性和/或确定所述突变Gα亚基在表达在细胞中时是否以比其亲本Gα亚基更高的水平进行表达。
79.根据权利要求73到78中任一项所述的方法，其中所述GPCR是在变性条件下、在特定构象下与其亲本GPCR在变性条件下、在相同特定构象下的稳定性相比具有增大稳定性的突变GPCR。
80.一种用于制备亲本异源三聚体Gα亚基的突变体的方法，所述突变体能够在所述亲本异源三聚体G蛋白的β和γ亚基不存在的情况下与GPCR偶联，所述方法包括：
(a)实施根据权利要求73到79中任一项所述的方法，
(b)标识所述一个或多个突变Gα亚基中的所述一个或多个突变氨基酸残基的所述一个或多个位置，所述一个或多个突变Gα亚基是针对增大稳定性选择的，以及
(c)合成突变Gα亚基，所述突变Gα亚基包含所标识的所述位置中的一个或多个位置处的代替氨基酸。
81.一种能够通过权利要求80所述的方法获得的突变Gα亚基。
82.一种稳定特定构象的GPCR的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基以及靶GPCR，以及
(b)形成所述突变Gα亚基和所述GPCR的复合物，其中所述GPCR以特定构象稳定。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述突变Gα亚基被固定到固体支持物上。
84.根据权利要求82或83所述的方法，其中所述靶GPCR以包含处于多个构象状态的所述GPCR的溶液形式提供。
85.根据权利要求82到84中任一项所述的方法，所述方法进一步包括纯化所述复合物。
86.一种用于选择具有增大稳定性的GPCR的方法，所述方法包括；
(a)提供亲本GPCR的一个或多个突变体和根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基，
(b)选择配体，所述配体是在所述GPCR以特定构象驻留时与所述亲本GPCR结合的配体，
(c)确定与所述亲本GPCR关于结合所选配体或关于结合所述突变Gα亚基的稳定性相比，所述或每个突变GPCR是否关于结合所述配体或关于结合所述突变Gα亚基具有增大稳定性，以及
(d)选择与所述亲本GPCR相比关于结合所选配体或关于结合所述突变Gα亚基具有增大稳定性的那些突变体，其中步骤(c)中所述GPCR驻留的所述特定构象与步骤(b)中选择的配体的种类相对应。
87.根据权利要求86所述的方法，其中在步骤(c)之前，亲本GPCR的所述一个或多个突变体与所选配体接触。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中所述所选配体来自激动剂类配体并且所述特定构象是激动剂构象。
89.根据权利要求86到88中任一项所述的方法，其中选择在如以下项的变性条件下具有增大稳定性的突变GPCR：热、洗涤剂、离液剂和pH极值中的任何一种或多种。
90.一种用于制备突变GPCR的方法，所述方法包括：
(a)实施根据权利要求86到89中任一项所述的方法，
(b)标识所述一个或多个突变GPCR中的所述一个或多个突变氨基酸残基的所述一个或多个位置，所述一个或多个突变GPCR是针对增大稳定性选择的，以及
(c)合成突变GPCR，所述突变GPCR包含所标识的所述位置中的一个或多个位置处的代替氨基酸。
91.一种能够通过权利要求90所述的方法获得的突变GPCR。
92.一种标识GPCR的结合配偶体的方法，所述方法包括：
e)提供根据权利要求47到55中任一项所述的复合物；
f)提供一种或多种测试化合物；
g)确定所述或每种测试化合物是否与所述复合物结合；以及
h)分离与所述复合物结合的一种或多种测试化合物。
93.根据权利要求92所述的方法，其中步骤(a)所提供的复合物不包含GPCR配体。
94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述方法用于片段文库筛选。
95.根据权利要求92到94中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
(iii)确定所述或每种测试化合物是否与根据权利要求47到55中任一项所述的不同复合物结合；以及
(iv)分离未与根据权利要求47到55中任一项所述的不同复合物结合的所述或每种测试化合物。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述不同复合物包括：与权利要求92所述的步骤(a)的所述复合物中的所述Gα亚基的种类不同的种类的Gα亚基和/或与权利要求92所述的步骤(a)的所述复合物中的所述GPCR不同的GPCR。
97.一种标识Gα亚基的结合配偶体的方法，所述方法包括：
e)提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基；
f)提供一种或多种测试化合物；
g)确定所述或每种测试化合物是否与所述突变Gα亚基结合；以及
h)分离与所述突变Gα亚基结合的一种或多种测试化合物。
98.一种与根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物选择性地结合的抗体。
99.一种评估G蛋白与GPCR之间的结合的方法，所述方法包括：提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基和GPCR，以及评估所述突变Gα亚基与所述GPCR之间的结合。
100.一种评估试剂对G蛋白与GPCR之间的偶联的影响的方法，所述方法包括：提供根据权利要求1到31中任一项所述的突变Gα亚基和GPCR，以及评估所述试剂对所述突变Gα亚基与所述GPCR之间的偶联的影响。
101.根据权利要求99或100所述的方法，其中所述突变Gα亚基被荧光标记。
102.根据权利要求99到101中任一项所述的方法，其中所述突变Gα亚基和所述GPCR提供在细胞内，任选地其中所述方法在体内或体外实施。
103.一种用于选择或设计GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物的一个或多个结合配偶体的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物的三维结构表示，以及
(b)使用分子建模法来选择或设计所述GPCR、所述G蛋白或所述GPCR-G蛋白复合物的一个或多个结合配偶体，其中将所述突变Gα亚基或所述复合物的至少一部分的所述三维结构表示与一个或多个候选结合配偶体的三维结构表示进行比较，并且选择预测与所述GPCR、所述G蛋白或所述GPCR-G蛋白复合物相互作用的一个或多个结合配偶体。
104.一种用于分析一个或多个结合配偶体与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物的相互作用的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物的三维结构表示，以及
(b)提供欲与所述突变Gα亚基或所述复合物的结构或所述结构的一部分拟合的一个或多个结合配偶体的三维结构表示；以及
(c)将所述一个或多个结合配偶体与所述结构拟合。
105.根据权利要求103或104所述的方法，其中根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物的所述三维结构表示是如下获得的：提供根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物，以及确定所述突变Gα亚基或所述复合物的三维结构。
106.根据权利要求104中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：改进所述一个或多个结合配偶体的所述结构表示以增大或减小所述一个或多个结合配偶体与GPCR、G蛋白或GPCR-G蛋白复合物的相互作用。
107.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物或根据权利要求98所述的抗体。
108.根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物或根据权利要求98所述的抗体，所述突变Gα亚基或所述复合物或所述抗体用于医学。
109.根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或根据权利要求47到55中任一项所述的复合物或根据权利要求98所述的抗体，所述突变Gα亚基或所述复合物或所述抗体用于对抗癌症。
110.一种多部分试剂盒，其包括：(i)根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基或其能够与GPCR结合的部分，或对所述突变Gα亚基或其部分进行编码的多核苷酸；以及(ii)GPCR或其能够与根据权利要求1到42中任一项所述的突变Gα亚基结合的部分，或对所述GPCR或其部分进行编码的多核苷酸。
111.根据权利要求110所述的多部分试剂盒，其中所述GPCR如权利要求48到50中任一项所定义的。
112.根据权利要求110或111所述的多部分试剂盒，其中(i)和(ii)中的一者或两者被可检测地标记。
113.根据权利要求110到112中任一项所述的多部分试剂盒，所述多部分试剂盒进一步包括GPCR配体。
114.根据权利要求113所述的多部分试剂盒，其中所述GPCR配体是小分子、蛋白质、肽、蛋白支架、核酸、离子、碳水化合物或抗体中的任何项。
115.根据权利要求111到114中任一项所述的多部分试剂盒，所述多部分试剂盒进一步包括G蛋白βγ亚基。
116.根据权利要求110到115中任一项所述的多部分试剂盒，所述多部分试剂盒进一步包括核苷酸，任选地其中所述核苷酸是鸟嘌呤核苷酸如GDP或GTP，或任选地其中所述核苷酸是黄嘌呤核苷酸。
117.基本上如本文所公开的任何新型突变Gα亚基、复合物、多核苷酸、抗体、组合物或方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1601690.9 | 2016-01-29 | ||
| GBGB1601690.9A GB201601690D0 (en) | 2016-01-29 | 2016-01-29 | G proteins |
| PCT/GB2017/050221 WO2017129998A1 (en) | 2016-01-29 | 2017-01-27 | G proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108699123A true CN108699123A (zh) | 2018-10-23 |
| CN108699123B CN108699123B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=55590425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780010155.5A Active CN108699123B (zh) | 2016-01-29 | 2017-01-27 | G蛋白 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10738287B2 (zh) |
| EP (1) | EP3408286A1 (zh) |
| JP (2) | JP2019507590A (zh) |
| CN (1) | CN108699123B (zh) |
| AU (1) | AU2017212788B2 (zh) |
| CA (1) | CA3012797A1 (zh) |
| GB (2) | GB201601690D0 (zh) |
| WO (1) | WO2017129998A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111003A (zh) * | 2019-06-20 | 2020-12-22 | 中国农业大学 | 含有me序列的一类新型抑制血小板聚集和抗血栓形成寡肽 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201601690D0 (en) * | 2016-01-29 | 2016-03-16 | Heptares Therapeutics Ltd | G proteins |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998016557A1 (en) * | 1996-10-11 | 1998-04-23 | The General Hospital Corporation | Assays for g-protein-linked receptors |
| CN1287169A (zh) * | 1999-09-02 | 2001-03-14 | 复旦大学 | 新的人g蛋白亚基及其编码序列 |
| WO2004092199A2 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Cue Biotech, Inc. | Method for identifying modulators of g protein coupled receptor signaling |
| US20050136512A1 (en) * | 2000-10-30 | 2005-06-23 | Senomyx, Inc. | Galphaq protein variants and their use in the analysis and discovery of agonists and antagonists of chemosensory receptors |
| US8546536B2 (en) * | 2008-08-29 | 2013-10-01 | Bellbrook Labs, Llc | Genetically engineered G-alpha proteins and uses thereof |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US209218A (en) * | 1878-10-22 | Improvement in steam-boiler furnaces | ||
| JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| EP0763202A4 (en) | 1994-05-23 | 1998-12-09 | Smithkline Beecham Corp | ENCODED COMBINATORIAL LIBRARIES |
| US6034071A (en) * | 1994-09-16 | 2000-03-07 | Iyengar; Srinivas Ravi V. | Mutant activated GS α and adenylyl cyclase 2 for use as therapeutic agents |
| WO1999005177A1 (en) | 1997-07-28 | 1999-02-04 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for identifying modulators of g-protein-coupled receptors |
| US7081360B2 (en) | 1998-07-28 | 2006-07-25 | Cadus Technologies, Inc. | Expression of G protein-coupled receptors with altered ligand binding and/or coupling properties |
| JP2004526441A (ja) | 2001-02-26 | 2004-09-02 | アリーナ・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド | 内因性および非内因性型ヒトｇタンパク質共役受容体 |
| EP3926045A1 (en) | 2007-03-22 | 2021-12-22 | Heptares Therapeutics Limited | Mutant proteins and methods for selecting them |
| GB0724051D0 (en) | 2007-12-08 | 2008-01-16 | Medical Res Council | Mutant proteins and methods for producing them |
| GB0724860D0 (en) | 2007-12-20 | 2008-01-30 | Heptares Therapeutics Ltd | Screening |
| US20110112037A1 (en) | 2008-03-05 | 2011-05-12 | Heptares Therapeutics Limited BioPark | Crystal structure |
| GB0910725D0 (en) | 2009-06-22 | 2009-08-05 | Heptares Therapeutics Ltd | Mutant proteins and methods for producing them |
| GB201014715D0 (en) | 2010-09-06 | 2010-10-20 | Vib Vzw | Nanobodies stabilizing functional conformational states of GPCRS |
| AU2014214054B2 (en) | 2013-02-05 | 2018-10-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Muscarinic acetylcholine receptor binding agents and uses thereof |
| CA2936728C (en) | 2014-01-30 | 2023-06-20 | Vib Vzw | Opioid receptor binding agents and uses thereof |
| GB201601690D0 (en) * | 2016-01-29 | 2016-03-16 | Heptares Therapeutics Ltd | G proteins |
-
2016
- 2016-01-29 GB GBGB1601690.9A patent/GB201601690D0/en not_active Ceased
-
2017
- 2017-01-27 EP EP17707651.0A patent/EP3408286A1/en active Pending
- 2017-01-27 GB GB1710663.4A patent/GB2558968B/en active Active
- 2017-01-27 CN CN201780010155.5A patent/CN108699123B/zh active Active
- 2017-01-27 AU AU2017212788A patent/AU2017212788B2/en active Active
- 2017-01-27 WO PCT/GB2017/050221 patent/WO2017129998A1/en active Application Filing
- 2017-01-27 US US15/549,246 patent/US10738287B2/en active Active
- 2017-01-27 JP JP2018539155A patent/JP2019507590A/ja active Pending
- 2017-01-27 CA CA3012797A patent/CA3012797A1/en active Pending
-
2020
- 2020-03-31 US US16/835,431 patent/US11339383B2/en active Active
-
2022
- 2022-01-21 JP JP2022007787A patent/JP2022084574A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998016557A1 (en) * | 1996-10-11 | 1998-04-23 | The General Hospital Corporation | Assays for g-protein-linked receptors |
| CN1287169A (zh) * | 1999-09-02 | 2001-03-14 | 复旦大学 | 新的人g蛋白亚基及其编码序列 |
| US20050136512A1 (en) * | 2000-10-30 | 2005-06-23 | Senomyx, Inc. | Galphaq protein variants and their use in the analysis and discovery of agonists and antagonists of chemosensory receptors |
| WO2004092199A2 (en) * | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Cue Biotech, Inc. | Method for identifying modulators of g protein coupled receptor signaling |
| US8546536B2 (en) * | 2008-08-29 | 2013-10-01 | Bellbrook Labs, Llc | Genetically engineered G-alpha proteins and uses thereof |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CARPENTER 等: "Engineering a minimal G protein to facilitate crystallisation of G protein-coupled receptors in their active conformation", 《PROTEIN ENGINEERING, DESIGN & SELECTION》 * |
| CARPENTER 等: "Structure of the adenosine A2A receptor bound to an engineered G protein", 《NATURE》 * |
| FLOCK 等: "Universal allosteric mechanism for Ga activation by GPCRs", 《NATURE》 * |
| HSU 等: "Molecular Cloning of a Novel Splice Variant of the a! Subunit of the Mammalian G0 Protein", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| RUSINOVA 等: "Specificity of Gβγ Signaling to Kir3 Channels Depends on the Helical Domain of Pertussis Toxin-sensitive Gα Subunits", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| WENG 等: "Structural Basis for the Function of the Heterotrimeric G-Proteins", 《SEMINARS IN NEUROSCIENCE》 * |
| 姜云璐 等: "G蛋白偶联受体与G蛋白相互作用的最新研究进展", 《生命科学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111003A (zh) * | 2019-06-20 | 2020-12-22 | 中国农业大学 | 含有me序列的一类新型抑制血小板聚集和抗血栓形成寡肽 |
| CN112111003B (zh) * | 2019-06-20 | 2022-02-11 | 中国农业大学 | 含有me序列的一类新型抑制血小板聚集和抗血栓形成寡肽 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB201710663D0 (en) | 2017-08-16 |
| JP2019507590A (ja) | 2019-03-22 |
| US20200231949A1 (en) | 2020-07-23 |
| US11339383B2 (en) | 2022-05-24 |
| US20190032033A1 (en) | 2019-01-31 |
| AU2017212788B2 (en) | 2021-07-29 |
| JP2022084574A (ja) | 2022-06-07 |
| WO2017129998A1 (en) | 2017-08-03 |
| AU2017212788A1 (en) | 2018-07-19 |
| US10738287B2 (en) | 2020-08-11 |
| GB2558968A (en) | 2018-07-25 |
| CN108699123B (zh) | 2023-12-08 |
| CA3012797A1 (en) | 2017-08-03 |
| EP3408286A1 (en) | 2018-12-05 |
| GB201601690D0 (en) | 2016-03-16 |
| GB2558968B (en) | 2021-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Erlandson et al. | Structural basis for G protein–coupled receptor signaling | |
| Yang et al. | G protein-coupled receptors: structure-and function-based drug discovery | |
| Eddy et al. | Allosteric coupling of drug binding and intracellular signaling in the A2A adenosine receptor | |
| Hilger et al. | Structure and dynamics of GPCR signaling complexes | |
| Shibata et al. | Thermostabilization of the neurotensin receptor NTS1 | |
| Culhane et al. | Transmembrane signal transduction by peptide hormones via family BG protein-coupled receptors | |
| Latek et al. | G protein-coupled receptors—recent advances | |
| Milligan et al. | Heterotrimeric G‐proteins: a short history | |
| JP6567291B2 (ja) | 変異体タンパク質とその製造方法 | |
| Görlich et al. | Two different subunits of importin cooperate to recognize nuclear localization signals and bind them to the nuclear envelope | |
| Yasui et al. | Structure of a receptor-binding fragment of reelin and mutational analysis reveal a recognition mechanism similar to endocytic receptors | |
| Deupi | Relevance of rhodopsin studies for GPCR activation | |
| Yamashita et al. | Distinct roles of the second and third cytoplasmic loops of bovine rhodopsin in G protein activation | |
| GB2447786A (en) | Mutant GPCR proteins and methods for selecting them | |
| KR20110117695A (ko) | 신규한 세포주와 방법 | |
| Valentin-Hansen et al. | The arginine of the DRY motif in transmembrane segment III functions as a balancing micro-switch in the activation of the β2-adrenergic receptor | |
| Orry et al. | Modeling and docking the endothelin G-protein-coupled receptor | |
| JP2022084574A (ja) | Ｇタンパク質 | |
| Sun et al. | Optimization of a peptide ligand for the adhesion GPCR ADGRG2 provides a potent tool to explore receptor biology | |
| Chen et al. | QR code model: a new possibility for GPCR phosphorylation recognition | |
| Park et al. | Unique N-terminal extension domain of human asparaginyl-tRNA synthetase elicits CCR3-mediated chemokine activity | |
| Iwasiow et al. | Delineation of the structural basis for the activation properties of the dopamine D1 receptor subtypes | |
| Lättig et al. | Structural determinants for selective recognition of peptide ligands for endothelin receptor subtypes ETA and ETB | |
| Naider et al. | A paradigm for peptide hormone-GPCR analyses | |
| JP2024069247A (ja) | Ｇタンパク質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: England Applicant after: Heptares Therapeutics Ltd. Address before: UK fictitious Applicant before: Heptares Therapeutics Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |