JP6567291B2 - 変異体タンパク質とその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）変異体及び増大した安定性を有するものを選択する方法に関する。特に、本発明は、それらの各々の親タンパク質と比較して、特定の条件下において増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択及び調製に関する。その様なタンパク質は結晶化可能である可能性がより高く、そのため、親タンパク質よりも構造決定に適している。それらは、薬剤探索及び開発のための研究にも有用である。
過去２０年間に亘って、膜タンパク質の構造決定の速度は次第に向上されてきたが、大半の成功は、真核生物よりもむしろ細菌由来の膜タンパク質の結晶化におけるものであった（非特許文献１）。細菌の膜タンパク質は、大腸菌における標準的な技術を用いて、真核生物の膜タンパク質よりも容易に過剰発現することができ（非特許文献２及び３）、細菌タンパク質は場合によっては界面活性剤により安定であり、界面活性剤に対する安定性は、精製及び結晶化に本質的に必要な条件である。ゲノム配列決定プロジェクトは、特定のトランスポーター又はイオンチャンネルの多数のホモログのクローニング及び発現を可能にし、結晶化の成功率も非常に大きく改善した。しかしながら、現在までに解析されている１２０の異なる膜タンパク質構造のうち、７種のみの哺乳動物の内在性膜タンパク質の構造が存在し（http://blanco.biomol.uci.edu/)、これらの膜タンパク質の５種が天然の起源から精製されて、界面活性剤の溶液中で安定である。真核生物の膜タンパク質の過剰発現における困難性とは別に、真核生物の膜タンパク質は、多くの場合に、界面活性剤の溶液中において乏しい安定性を示し、それらが即時に変性又は沈殿せずに試験することが可能な結晶化条件の範囲が非常に制限される。理想的には、膜タンパク質は、任意の所定の界面活性剤溶液中において数日間に亘って安定であるべきであるが、回折に利用可能な品質の結晶を成長させるために最も適切な界面活性剤は、最も不安定化する界面活性剤、すなわち、短い脂肪族鎖と小さい若しくは荷電した頭部基と有するものである傾向がある。ヒトの膜タンパク質は医薬産業による治療剤開発に利用するために必要とされており、多くの場合において各種の異なる哺乳動物由来の受容体、チャンネル、及びトランスポーターには実質的に薬理学的な差異が存在する一方で、任意のホモログタンパク質が酵母及び細菌のゲノムには含まれていない可能性があることから、我々が解析したいものもヒトの膜タンパク質の構造である。かくして、結晶化及び構造決定並びに薬剤スクリーニング、バイオアッセイ、及びバイオセンサーにおける用途などの他の目的のために、界面活性剤に安定な真核生物の内在性膜タンパク質の生産を可能にする一般的な戦略の開発が非常に必要とされている。
膜タンパク質は、細胞の生存能を保障するために膜において十分に安定であるように進化したが、界面活性剤溶液中で安定であるようには進化せず、このことは、膜タンパク質を人工的に進化させ、界面活性剤に安定な変異体を単離し得ることを示唆している（非特許文献４）。これが、その後、２種の細菌タンパク質、すなわち、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）（非特許文献５及び６）並びにバクテリオロドプシン（非特許文献７）について実証された。ＤＧＫのランダム変異誘発によって、熱安定性を増大する特定の点変異が同定され、組み合わせた際に、天然のタンパク質が５５℃で６分の半減期を有するのと比較して、最適な安定変異体が８０℃で３５分の半減期を有したため、その効果は相加的であった（非特許文献６）。界面活性剤耐性ＤＧＫ変異体の三量体がＳＤＳ中で安定になり、かくして、オリゴマー状態の安定性が熱安定性において重要な役割を担っているようであることが示された。変異誘発の目的は結晶化に適切な膜タンパク質を生産することであるが、ＤＧＫの構造は未だ決定されておらず、成功裡に結晶化したという報告は存在しない。へリックスＢに沿ったシステインスキャニング変異誘発によるバクテリアオロドプシンに対する更なる試験は、変異によって熱安定性を誘導するアミノ酸残基を予測することは不可能であり、構造における試験の際に、なぜ熱安定性が生じるのか明らかでないことを示した（非特許文献７）。
ＧＰＣＲは、多数の生理プロセスを調節する非常に大きなタンパク質ファミリーを構成し、多数の効果的な薬剤の標的である。かくして、それらは、非常に薬理学的に重要なものである。ＧＰＣＲの一覧は、参照によって本明細書に取り込むFoord et al (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288に挙げられている。ＧＰＣＲは一般的には単離した際に不安定であり、数多くの努力が為されたにもかかわらず、例外的に天然に安定であるウシロドプシン以外のものを結晶化することができなかった。
ＧＰＣＲは新薬の開発につながるような標的であり、現在の薬剤の四分の一超がＧＰＣＲを標的とすることを示すOverington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996が特に参照される。
ＧＰＣＲは、アゴニスト及びアンタゴニストなどの各種の薬理学的な種類のリガンドと結合する多数の異なる立体構造で存在し、機能するためにこれらの立体構造の間で循環すると解されている（Kenakin T. (1997) Ann N Y Acad Sci 812, 116-125）。
本発明の方法は、２１０位のＴｈｒ残基はＡｌａ残基で置換された構成的不活性型変異体ヒトカンナビノイド受容体１（Ｔ２１０Ａ）に対する［３Ｈ］ＣＰ５５９４０の結合を含むＤ’Ａｎｔｏｎａらによって公開された方法を含まないことが理解されるであろう。
本明細書に記載の明らかに過去に公開された文献の記載又は議論は、必ずしも、その文献が従来技術の一部であるか又は一般的な技術常識であると認めるものと解されるべきではない。
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本発明者は、界面活性剤中におけるＧＰＣＲの安定性の欠如及びＧＰＣＲが多数の立体構造で存在する事実という、ＧＰＣＲを結晶化する試みに関連する２つの重要な課題が存在することを見出した。機能するために、ＧＰＣＲは少なくとも２種の立体構造、すなわち、アゴニスト結合形態とアンタゴニスト結合形態とで循環するように進化しており、これらの２種の立体構造の間の変化がリガンドの非存在下では頻繁に生じ得る。かくして、任意の精製受容体は、複数の立体構造の混合物を構成するであろう。結晶化を試みている間にＧＰＣＲにリガンドを単純に添加することでは、それらの構造決定には至らない。したがって、結晶化の可能性を改善するために、本発明者は、ＧＰＣＲの安定性を改善した変異体を選択し、加えて、好ましくは、その受容体を特定の生物学的に有意義な立体構造に固定した。
本発明者は、特に生物学的に有意義な立体構造における、ＧＰＣＲの安定化が可能であるか否か、及び回折に利用可能な品質の結晶を得る可能性を有意に改善し得るその効果が十分に大きいものであるか否かを調べることとした。実施例１では、シチメンチョウの赤血球由来のβ１アドレナリン受容体（βＡＲ）（非特許文献８）を、多数の理由から本試験の試験対象として選択した。βＡＲは、放射標識された形態における市販の多数のリガンドを用いて十分に開発された薬理作用を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。加えて、βＡＲの過剰発現は、特に、バキュロウイルス発現系を用いて成功し、機能的な形態においてミリグラム量で精製し得た（非特許文献９）。実施例２では、ヒトアデノシン受容体を使用し、実施例３では、ラットニューロテンシン受容体を使用した。
熱安定化変異はシチメンチョウβ１アドレナリン受容体、ヒトアデノシン受容体、ラットニューロテンシン受容体及びヒトムスカリン受容体の配列に亘って広く散在していることが見出された。図１７は、ヒトβ−２ＡＲの配列とのアラインメントを示しており、such that when the 熱安定化変異がその配列上に位置せしめられている場合、合計７０の内、１１の例において、二配列が同じ位置に（図１７では星印で示す）変異を含んでいる。これは統計的に非常に有意である（ρ＜０．００００２）と決定された。よって、ひとたび一又は複数の安定化変異が一のＧＰＣＲにおいて同定されれば、安定性の増加した更なるＧＰＣＲを、ＧＰＣＲのアミノ酸配列を整列させ、対応する一又は複数の位置に同じ一又は複数の変異を作ることによって生産することができることは理解されよう。この概念は図２６において明確に実証されており、シチメンチョウβ１−ｍ２３における６の熱安定化変異がヒトβ２受容体に直ぐに移されている。得られた変異体β２−ｍ２３はヒトβ２受容体のものよりも高いＴｍ１２℃を有していた。
加えて、我々は、熱安定化変異を同定する際に予測性のある更なるＧＰＣＲの整列配列の対応位置ばかりでなく、整列配列からの同定された熱安定化変異の周りのアミノ酸のウインドウがまた無作為の場合と比較した場合に更なる熱安定化変異を含んでいる蓋然性が統計的に高いことを見出した。これは図３３において明確に実証されており、Ｂ１、ＮＴＲ、Ａ２Ａの整列配列が、熱安定化変異がマーキングされた状態で示されている。６２の変異のうち、その１８が対応する位置に正確に整列され、更に３１が、他の熱安定化変異がｉ番の位置にあるｉプラス又はマイナス４残基のウインドウ内に整列されている。これは統計的に非常に有意である（ρ＜０．００００１）。
よって、ひとたび一又は複数の安定化変異が一のＧＰＣＲにおいて同定されれば、安定性の増加した更なるＧＰＣＲを、ＧＰＣＲのアミノ酸配列を整列させ、熱安定化変異に対応する位置の何れかの側のアミノ酸のウインドウ内に一又は複数の変異を作ることによって生産することができる。
従って、本発明の第一の態様は、その親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを製造するための方法であって、
（ａ）第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列を同定し、その（一又は複数の）位置に、該一又は複数の変異体は第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を有し、
（ｂ）対応する（一又は複数の）位置に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供する
ことを含む方法を提供する。
（ａ）第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列を同定し、その（一又は複数の）位置に、該一又は複数の変異体は第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を有し、
（ｂ）対応する（一又は複数の）位置に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供する
ことを含む方法を提供する。
第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供する方法
そのアミノ酸配列を解析できるように、第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供するために任意の方法を使用することができる。例えば、安定化された変異体は以下及び実施例に記載のようにして選択し調製することができる。
そのアミノ酸配列を解析できるように、第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供するために任意の方法を使用することができる。例えば、安定化された変異体は以下及び実施例に記載のようにして選択し調製することができる。
特に、増大した安定性を有する変異体Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を選択するための好ましい方法は、
（ｉ）親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている際に該親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択すること、
（ｉｉｉ）選択したリガンドの結合に関して特定の立体構造にあるときの前記又は各変異体ＧＰＣＲが、そのリガンドの結合に関して同じ特定の立体構造にあるときの親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した安定性を有するか否かを測定すること、並びに
（ｉｖ）選択したリガンドの結合に関して、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択すること
を含む。
（ｉ）親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている際に該親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択すること、
（ｉｉｉ）選択したリガンドの結合に関して特定の立体構造にあるときの前記又は各変異体ＧＰＣＲが、そのリガンドの結合に関して同じ特定の立体構造にあるときの親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した安定性を有するか否かを測定すること、並びに
（ｉｖ）選択したリガンドの結合に関して、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択すること
を含む。
本発明者は、生物学的に有意義な形態（すなわち、薬理学的に有用な形態）におけるＧＰＣＲの結晶化可能性を改善するために、前記タンパク質の安定性を増大するだけではなく、前記タンパク質が特定の立体構造にある際に増大した安定性を有することが望ましいと解している。前記立体構造は、選択したリガンドによって決定され、生物学的に有意義な立体構造、特に薬理学的に有意義な立体構造である。而して、増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの変異体は好ましくは特定の立体構造の増大した安定性を有する変異体であり、例えばそれらは増大した立体構造的熱安定性を有しうる。よって、本発明の第一の態様の方法は、安定な立体構造が固定されたＧＰＣＲを変異誘発によって作製するために使用されうる。例えば、特定の立体構造で増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲの選択後に、アミノ酸配列中の安定化変異の位置を同定することができる。ついで、対応する一又は複数の位置に別のＧＰＣＲ中のアミノ酸配列において一又は複数の変異を作製する方法を用いて、その親ＧＰＣＲに対して特定の立体構造で増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを生産することができる。変異体ＧＰＣＲは、より高い割合のものが特定の立体構造の状態である点で、親分子よりも効率的により純粋な形態である。この立体構造に優先的に結合する一又は複数のリガンドを使用することによって他の立体構造から分離される選択された立体構造の慎重な選択は、上述の選択方法の重要な特徴である。本発明の第一の態様の方法はよって結晶化により供しやすい変異体ＧＰＣＲを製造するための方法であると解されてもよい。
Hopkins & Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730による新薬の開発につながるようなゲノムのレヴューにおいて、表１には、その多数がＧＰＣＲであるタンパク質ファミリーの一覧が含まれている。Overington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996は、薬剤標的のより詳細な記載を提供しており、図１は、四分の一超の現在の薬剤がＧＰＣＲを標的とすることを示している。経口薬の１８６種の全標的のうち、５２種のＧＰＣＲ標的が存在する。
本発明において使用するのに適切なＧＰＣＲは、β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体、特に、アデノシンＡ２ａ受容体、及びニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）を含むが、それらに限らない。他の適切なＧＰＣＲは当該技術分野においてよく知られており、上述のHopkins & Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730に挙げられているものを含む。加えて、International Union of Pharmacologyは、ＧＰＣＲの一覧を作成しており（参照によって本明細書に取り込むFoord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288、当該一覧は、http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardにおいて定期的に更新されている）。ＧＰＣＲは、それらのアミノ酸配列の類似性に基づいて、各種の異なる種類に分類されることに注意されるであろう。それらは、それらが結合する天然のリガンドによるファミリーにも分類される。全てのＧＰＣＲが本発明の範囲に含まれる。
多数のＧＰＣＲのアミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えばＧｅｎＢａｎｋを参照することによって、容易に利用可能である。特に、Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288は、Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)に由来するヒトの遺伝子記号並びにヒト、マウス、及びラットの遺伝子ＩＤを挙げている。ヒトゲノムの配列は実質的に完全であるため、ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列は、そこから推定し得ることに注意すべきである。
ＧＰＣＲは任意の起源に由来してよいが、真核生物起源に由来することが特に好ましい。哺乳類又は鳥類などの脊椎動物に由来することは特に好ましい。ＧＰＣＲがラット、マス、ウサギ、若しくはイヌ、又はヒトを除く霊長類若しくはヒト、又はニワトリ若しくはシチメンチョウに由来することが特に好ましい。誤解を避けるために、「由来する」の意味には、ｃＤＮＡ又は遺伝子がその起源に由来する遺伝子材料を用いて元々得られたが、タンパク質がその後に任意の宿主細胞において発現されてよいことを含める。かくして、真核生物のＧＰＣＲ（鳥類又は哺乳類のＧＰＣＲ）が、大腸菌などの原核生物の宿主細胞で発現されてよいが、場合によって、鳥類又は哺乳類由来であると解されることは明らかである。
ある場合においては、ＧＰＣＲは、２以上の異なるサブユニットからなってよい。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体は、その生理学的なリガンド結合特性を獲得するために、一回膜貫通へリックスタンパク質（ＲＡＭＰ１）の結合を必要とする。ＧＰＣＲと結合して機能的な複合体を形成又は調節するエフェクタータンパク質、付属タンパク質、補助タンパク質、又はＧＰＣＲ相互作用タンパク質は当該技術分野においてよく知られており、例えば、受容体キナーゼ、Ｇタンパク質、及びアレスチンを含む（Bockaert et al (2004) Curr Opinion Drug Discov and Dev 7, 649-657）。
上述の選択方法で増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを選択する場合、親ＧＰＣＲの変異体は、任意の適切な方法で生産されてよく、任意の適切な形態で提供されてよい。かくして、例えば、親タンパク質の全て又は一部における各アミノ酸残基が独立に他のアミノ酸残基に変換された、親タンパク質の一連の特定の変異体が作製されてよい。例えば、膜を貫通していると予測されるタンパク質の部分に変異を作製することが好都合であってよい。β2アドレナリン受容体の構造の場合のように（Rasmussen et al (2007) Nature 450, 383-387; Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）、ロドプシンの三次元構造は既知であり（Li et al (2004) J Mol Biol 343, 1409-1438; Palczewski et al (2000) Science 289, 739-745）、当該構造を使用してあるＧＰＣＲのモデルを作製することが可能である。かくして、簡便には、ＧＰＣＲの変異させる部分は、モデルに基づくものであってよい。同様に、疎水性に基づいてＧＰＣＲの膜貫通領域のモデルを作製するコンピュータープログラムを利用することも可能であり（Kyle & Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132）、タンパク質の変異させる部分を選択する際にその様なモデルを使用してよい。従来の部位指向性変異導入を使用してよく、又は当該技術分野においてよく知られたポリメラーゼ連鎖反応に基づく手法を使用してよい。望ましいものではないが、タンパク質変異体の選択にリボソームディスプレイ法が使用されてもよい。
典型的には、選択された各アミノ酸をＡｌａに置き換える（すなわち、Ａｌａスキャニング変異誘発）が、任意の他のアミノ酸に置き換えてもよい。選択したアミノ酸がＡｌａである場合は、好都合には、Ｌｅｕによって置き換えてもよい。代替的には、前記アミノ酸はＧｌｙに置き換えてもよく（すなわち、Ｇｌｙスキャニング変異誘発）、これは、特定の立体構造にあるタンパク質を固定化してよい隣接するヘリックスのより近接したパッキングを可能にする。選択されたアミノ酸がＧｌｙである場合は、好都合には、Ａｌａによって置き換えてよい。
特定の位置における所定のアミノ酸を置き換えるのに使用されるアミノ酸は、典型的には天然のアミノ酸、特に「コード可能な」アミノ酸であるが、非天然アミノ酸（この場合、典型的には、タンパク質は、化学合成又は非天然アミノ酸アシルｔＲＮＡを使用して作製される）であってよい。「コード可能な」アミノ酸は、ｍＲＮＡの翻訳によってポリペプチドに取り込まれるものである。非天然アミノ酸を作製し、又は、例えば、タンパク質の翻訳後修飾若しくは半合成によって共有結合性の化学修飾によって所定の位置に非ペプチド結合を導入することが可能である。これらの翻訳後修飾は、リン酸化、糖鎖付加、又はパルミトイル化などの天然のものであるか又は合成若しくは生合成によるものであってよい。
代替的には、前記変異体は、タンパク質全体又はその選択した一部に対するものであってよいランダム変異誘発法によって生産されてよい。ランダム変異誘発法は当該技術分野でよく知られている。
簡便には、増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを選択する場合、ＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して、１つの置き換わったアミノ酸を有する（すなわち、１つのアミノ酸部位において変異を有する）。このように、単独のアミノ酸を置き換えることによる安定性に対する寄与が評価されてよい。しかしながら、安定性について評価されるＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して２以上、例えば、２、３、４、５、又は６つの置き換わったアミノ酸を有してもよい。
以下により詳細に議論しているように、変異の組み合わせが、本発明の選択方法の結果に基づいて為されてよい。幾つかの特定の態様では、１つの変異を有するタンパク質における変異の組み合わせが、安定性における更なる向上を誘導することが認められた。かくして、本選択方法は、当該方法を実施して安定性を増大する変異を同定し、当該方法の工程（ｉ）において提供される１つの変異を有するＧＰＣＲにおいて同定した変異を組み合わせることによって、繰返し使用されてよいと解されるであろう。かくして、多数の変異を有するタンパク質変異体が、本選択方法を使用して選択されてよい。
増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを選択する場合、親ＧＰＣＲは、天然のタンパク質である必要はない。好都合には、大腸菌などの適切な宿主生物中で発現することが可能な遺伝子操作を受けたものであってよい。例えば、実施例１に記載の、好都合に操作したシチメンチョウβ−アドレナリン受容体は、切断されており、アミノ酸配列の１〜３３残基を欠失している（すなわち、βＡＲ３４−４２４）。親ＧＰＣＲは、天然のタンパク質の切断型であるか（一方又は両方の末端が切断されている）、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよい。代替的又は付加的に、親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲと比較して、例えば、可溶性、タンパク質分解安定性を改善するために修飾されてよい（例えば、切断、ループの欠失、グリコシル化部位の変異、又はシステインなどの反応性アミノ酸側鎖の変異）。いずれにしても、親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲに結合することが既知のものである、選択したリガンドに結合することが可能なタンパク質である。好都合には、親ＧＰＣＲは、適当なリガンドを加えて、Ｇタンパク質活性化によって影響を受けることが一般的に知られている一又は複数の下流の活性の任意のものに作用してよい。
しかしながら、増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを選択する場合、変異体の安定性は、安定性における増大を評価できるため、親と比較されると解されるであろう。
選択方法では、特定の立体構造を備えている親ＧＰＣＲに結合するリガンドが選択される。典型的には、前記リガンドは、親ＧＰＣＲの１つの立体構造に結合する（そして、前記ＧＰＣＲに当該立体構造をとらせる）が、ＧＰＣＲが採用し得ない他の立体構造に強力に結合することはない。かくして、前記リガンドの存在は、ＧＰＣＲが特定の立体構造をとらせることを促進すると解されてよい。かくして、本選択方法は、生物学的に有意義な立体構造（例えば、リガンド結合状態）に捕らわれ、当該立体構造でより安定であるＧＰＣＲ変異体を選択する方法であると解されてよい。
好ましくは、ＧＰＣＲが工程（ｉｉｉ）で備える特定の立体構造が、工程（ｉｉ）で選択されるリガンドの種類と対応する。
好ましくは、前記選択されるリガンドはアゴニストに分類されるリガンド由来のものであり、前記特定の立体構造はアゴニスト立体構造であるか、又は前記選択されるリガンドはアンタゴニストに分類されるリガンド由来のものであり、前記特定の立体構造はアンタゴニスト立体構造である。
好ましくは、前記選択されるリガンドはアゴニストに分類されるリガンドに由来し、ＧＰＣＲが工程（ｉｉｉ）で備える特定の立体構造がアゴニスト立体構造である。好ましくは、受容体変異体に対する前記選択されるリガンドの結合親和性は、野生型の受容体に対するもの以上であり、選択されるリガンドに対して顕著に低減した結合を示す変異体は、典型的には、除外される。
「リガンド」によって、本願では、ＧＰＣＲに結合し、且つ、ＧＰＣＲに特定の立体構造をとらせる任意の分子が含まれる。好ましくは、前記リガンドは、ＧＰＣＲ分子全体の半分超に特定の立体構造をとらせるものである。
多数の適切なリガンドが既知である。
典型的には、前記リガンドは完全なアゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することが可能であり、例えば、Ｇ−タンパク質結合、下流のシグナル伝達現象、又は血管拡張などの生理学的なアウトプットによって測定される、完全な（１００％の）生物学的応答を誘導することが可能である。かくして、典型的には、前記生物学的応答は、関連するエフェクター経路の刺激後のＧ−タンパク質におけるＧＤＰ／ＧＴＰ交換である。前記測定は、典型的には、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換又はその経路の最終産物（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、又はリン酸イノシトール）のレベルにおける変化である。前記リガンドは、部分的アゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することが可能であり、部分的（＜１００％）な生物学的応答を誘導することが可能である。
前記リガンドは、受容体に結合する分子であり、その基礎的な（すなわち、アゴニストによって刺激されていない）活性を場合によっては０にまでも低減する逆アゴニストであってもよい。
前記リガンドは、受容体に結合し、アゴニストの結合を阻害して、生物学的応答を妨げるアンタゴニストであってもよい。逆アゴニスト及び部分的アゴニストは、あるアッセイ条件下では、アンタゴニストとなり得る。
上記リガンドは、オルトステリック（orthosteric）であってよく、これは、それらが内在性アゴニストと同じ部位に結合するという意味を含む。または、それらはアロステリック（allosteric）又はアロトピック（allotopic）であってよく、これは、それらがオルトステリック部位と異なる部位に結合するという意味を含む。上記リガンドはシントピック（syntopic）であってよく、これは、それらが同じ又は重複する部位で他のリガンドと相互作用するという意味を含む。それらは、可逆的又は非可逆的であってよい。
アンタゴニストに関しては、サーマウンタブル（surmountable）であってよく、これは、アゴニストの最大の効果が、アンタゴニストを用いた事前処理又は同時処理によって低減されないという意味を含み；或いは、それらはインサーマウンタブル（insurmountable）であってよく、これは、アゴニストの最大の効果が、アンタゴニストの事前処理又は同時処理のいずれかによって低減されるという意味をふくみ；或いは、それらはニュートラル（neutral）であってよく、これは、アンタゴニストが逆アゴニスト又は部分的アゴニスト活性を有しないものであるという意味を含む。典型的には、アンタゴニストは、逆アゴニストでもある。
本選択方法に使用するリガンドは、ポジティブアロステリックモジュレータ、ポテンシエーター、ネガティブアロステリックモジュレータ、及びインヒビターなどのアロステリックモジュレータであってもよい。それらは、それら自体でアゴニスト又は逆アゴニストとしての活性を有してよく、又はそれらはアゴニスト又は逆アゴニストの存在下でのみ活性を有してよく、その場合には、ＧＰＣＲと結合するためにその様な分子と組み合わせて使用される。
参照によって本明細書に取り込むNeubig et al (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606は、各種のリガンドを開示している。
好ましくは、上述のリガンドは、低分子の有機又は無機成分であるが、ペプチド又はポリペプチドであってよい。典型的には、前記リガンドが低分子の有機又は無機成分である際は、５０から２０００、１００から１０００など、例えば、１００から５００のＭｒを有する。
典型的には、前記リガンドは、ｍＭからｐＭ、例えばμＭ（マイクロモーラー）からｎＭの範囲のＫｄでＧＰＣＲに結合する。一般的には、最も低いＫｄを有するリガンドが好ましい。
有機低分子のリガンドは、当該技術分野においてよく知られており、例えば、以下の実施例を参照のこと。他の低分子のリガンドは、５ＨＴ１Ａ受容体において完全なアゴニストである５ＨＴ；５ＨＴ１Ａ受容体に部分的なアゴニストであるエルトプラジン（Newman-Tancredi et al (1997) Neurophamacology 36, 451-459参照）；ドーパミンＤ２受容体アゴニストである（＋）−ブタクラモール及びスピペロン（Roberts & Strange (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 34-42参照）；並びにＣＢ２のニュートラルアゴニストであるＷＩＮ５５２１２−３（Savinainen et al (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 636-645）を含む。
前記リガンドは、ペプチドミメティック、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はアプタマーであってよい。Ｎａ＋又はＺｎ＋などのイオン、オレアミドなどの脂質、又はヘパリンなどの炭水化物であってもよい。
前記リガンドは、ＧＰＣＲに結合するポリペプチドであってよい。そのようなポリペプチド（オリゴペプチド含む）は、典型的には、５００から５０，０００の分子量であるが、それより大きいものであってもよい。前記ポリペプチドは、天然のＧＰＣＲ相互作用タンパク質又はＧＰＣＲと相互作用する他のタンパク質又はその誘導体若しくは断片であってよいが、特定の立体構造にあるＧＰＣＲに選択的に結合するものである。ＧＰＣＲ相互作用タンパク質は、シグナル伝達と関連するもの及び輸送に関連するものを含み、多くの場合においては、ＧＰＣＲのＣ末端部分のＰＤＺドメインを介して作用する。
あるＧＰＣＲに結合することが既知のポリペプチドは、Ｇタンパク質、アレスチン、ＲＧＳタンパク質、Ｇタンパク質受容体キナーゼ、ＲＡＭＰ、１４−３−３タンパク質、ＮＳＦ、ペリプラキン、スピノフィリン、ＧＰＣＲキナーゼ、レセプターチロシンキナーゼ、イオンチャンネル又はそのサブユニット、アンキリン、並びにＳｈａｎｋｓ又はＨｏｍｅｒタンパク質の任意のものを含む。他のポリペプチドは、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１又はＮＲ２ａカルシオン、又はフィブロネクチンドメインフレームワークを含む。前記ポリペプチドは、フィブリンー１などのＧＰＣＲの細胞外ドメインに結合するものであってよい。前記ポリペプチドは、ヘテロオリゴマーにおいて選択したＧＰＣＲを結合する他のＧＰＣＲであってよい。ＧＰＣＲにおけるタンパク質−タンパク質相互作用のレヴューは、参照によって本明細書に取り込むMilligan & White (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 513-518又はBockaert et al (2004) Curr. Opinion Drug Discov. Dev. 7, 649-657において認められる。
ポリペプチドリガンドは、好都合には、ＧＰＣＲに結合する抗体であってよい。用語「抗体」によって、本願では、天然の抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片が含まれる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子及びドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、遺伝子操作した抗体及びその結合特性において抗体様である分子も含む。ラクダ科の動物の抗体及びラクダ科の抗体であって遺伝子操作したものも挙げられてよい。ＧＰＣＲに結合するその様な分子は当該技術分野において既知であり、任意に、既知の技術を使用して作製されてよい。適切な抗体は、立体構造エピトープを認識する傾向があるため、ＧＰＣＲに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で現在使用されているものである。
前記ポリペプチドは、アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラトリオペプチドリピートタンパク質、又は設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）などのモジュール構成に基づく結合タンパク質、或いはリポカリン若しくはフィブロネクチンドメイン又はヒトγクリスタリン若しくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリンスカフォールド（affilin scaffold）に基づくタンパク質であってもよい。
本発明の１つの実施態様では、前記リガンドはＧＰＣＲに共有結合し、例えば、Ｇ−タンパク質又はアレスチン融合タンパク質などである。幾つかのＧＰＣＲ（例えば、トロンビン受容体）は、プロテアーゼによってＮ末端で切断され、新しいＮ末端はアゴニスト部位と結合する。かくして、その様なＧＰＣＲは天然のＧＰＣＲ−リガンド融合体である。
抗体又は他の「ユニバーサルな」結合ポリペプチド（例えば、多数の異なるＧＰＣＲに結合することが既知のＧタンパク質）の使用は、天然のリガンド及び低分子リガンドが未知の「オーファン」ＧＰＣＲに対する本発明の方法の使用において特に有利であり得ると解されるであろう。
本選択方法において一度リガンドが選択されると、当該選択したリガンドの結合に関して親ＧＰＣＲと比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が、前記リガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かが測定される。当該工程（ｉｉｉ）は、選択したリガンドによって決定される特定の立体構造について、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が（親と比較して）増大した安定性を有するか否かを測定するものである。かくして、前記ＧＰＣＲ変異体は、選択したリガンド結合の間に測定されるか又はリガンド結合によって測定される、選択したリガンドの結合の結合に関して増大した安定性を有する。以下に記載するように、増大した安定性が、選択したリガンドの結合の間に評価されることが好ましい。
増大した安定性は、好都合には、不安定にする可能性がある曝露条件下（例えば、熱、強力な界面活性剤条件、及びカオトロピック剤など）における、前記変異体の寿命の延長によって測定される。前記曝露条件下における不安定化は、典型的には、変性又は構造の損失の測定によって測定される。以下に記載するように、これは、リガンド結合能の損失又は二次若しくは三次構造の指標の損失によって現れる。
以下の図１２（特に好ましい実施態様を記載する）に関して記載するように、ＧＰＣＲ変異体の安定性を測定するために使用してよい各種のアッセイ形式が存在する。
１つの実施態様では、前記ＧＰＣＲ変異体を、当該変異体の安定性を測定する方法に供する前にリガンドと接触させる（前記ＧＰＣＲ変異体及びリガンドは、試験の間に接触した状態のままである）。かくして、例えば、本発明の方法が、１つの立体構造においてリガンドと結合し、且つ、改善された熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するために使用される際は、前記受容体を、加熱される前に前記リガンドと接触させ、次いで、加熱後に前記受容体に結合しているリガンドの量を使用して、親受容体との比較における熱安定性を表わしてよい。これによって、変性条件（例えば、熱）に曝露した後にリガンド結合能を保持しているＧＰＣＲの量の測定が提供され、これが安定性の指標である。
代替的（であるが上記のものよりは好ましいものではない）実施態様では、前記ＧＰＣＲ変異体を、前記リガンドと接触させる前に、前記変異体の安定性を測定する手法に供する。かくして、例えば、本発明の方法が、１つの立体構造においてリガンドと結合し、且つ、改善された熱安定性を有する膜受容体変異体を選択するために使用される際は、前記リガンドと接触させる前に、まず前記受容体を加熱し、次いで、前記受容体に結合したリガンドの量を使用して熱安定性を表わしてよい。そして、これによって、変性条件に曝露した後にリガンド結合能を保持しているＧＰＣＲの量の測定が提供される。
双方の実施態様において、前記変異体の安定性の比較が、同一の条件下における親分子を参照することによって為されると解されるであろう。
これらの実施態様の双方において、選択された変異体は、同じ特定の立体構造にある親タンパク質と比較して、特定の立体構造を備える際に増大した安定性を有するものである。
好ましい経路は、特定のＧＰＣＲに依存し、リガンドの非存在下におけるタンパク質のとり得る立体構造の数に依存するであろう。図１２に記載の実施態様では、所望の立体構造が選択される可能性を増大するため、リガンドが加熱工程の間に存在することが好ましい。
したがって、本選択方法は、増大した熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するための方法であって、（ｉ）親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供する工程、（ｉｉ）前記親ＧＰＣＲに結合するアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程、（ｉｉｉ）前記アンタゴニスト又はアゴニストの存在下において、特定の温度で特定の時間の後に前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストに結合するＧＰＣＲ変異体の能力を測定することによって、前記変異体又はその各々が親ＧＰＣＲと比較して増大した熱安定性を有するか否かを測定する工程、及び（ｉｖ）同一の条件下における親ＧＰＣＲよりも、特定の温度で特定の時間の後に多くの前記選択したアゴニスト又はアンタゴニストと結合するＧＰＣＲ変異体を選択する工程を含む方法を含むと解されるであろう。工程（ｉｉｉ）では、特定の温度における一定の期間が、典型的には、前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストと結合するＧＰＣＲ変異体の能力の測定において使用される。工程（ｉｉｉ）では、典型的には、選択した前記アンタゴニスト又はアゴニストの結合が当該温度で一定期間の間に５０％低減する（５０％の受容体が不活化されていることを示す：「見かけ上の」Ｔｍ）温度及び時間が選択される。
好都合には、前記リガンドを使用してＧＰＣＲをアッセイする（すなわち、前記アッセイを使用して非変性状態であるか否かを測定する）際は、前記リガンドは可視的に標識、例えば、放射標識又は蛍光標識される。他の実施態様では、リガンド結合は、二次検出系、例えば、抗体又は検出部位に共有結合する他の高親和性結合パートナー、例えば、比色分析において使用されてよい酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用して、未結合のリガンドの量を測定することによって評価されてよい。ＦＲＥＴ法が使用されてもよい。その安定性の測定においてＧＰＣＲ変異体をアッセイするために使用するリガンドは、前記方法の工程（ｉｉ）において選択されるものと同じリガンドである必要はないが、同じ受容体立体構造クラスが測定されることになるように同じリガンドクラスのメンバー、例えばアゴニスト又はアンタゴニストでなければならないと解されるであろう。
リガンド結合能を非変性タンパク質の存在の指標として使用して、親ＧＰＣＲ及びＧＰＣＲ変異体の安定性を測定することが好都合であるが、他の方法が当該技術分野で知られている。例えば、内在するトリプトファン蛍光の使用又は１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）などの外来性の蛍光プローブの使用のいずれかによる、蛍光スペクトルにおける変化が、アンフォールディングの感度の良好な指標であってよく、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（商標）法（Mezzasalma et al, J Biomol Screening, 2007, Apr;12(3):418-428）において説明されている。タンパク質分解に対する安定性、質量分析器によって測定される重水素／水素交換、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｇｅｌ、キャピラリーゾーン電気泳動、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、及び光散乱を使用して、二次又は三次構造と関連するシグナルの損失によってアンフォールディングを測定してよい。しかしながら、これらの方法の全てが、それらを使用する前に、適度な量（例えば、高いｐｍｏｌ／ｎｍｏｌ量）で精製されたタンパク質を必要とするが、実施例に記載の方法は、ｐｍｏｌ量の本質的に未精製のＧＰＣＲを使用する。
好ましい実施態様では、工程（ｉｉ）において、各々の存在がＧＰＣＲに同一の特定の立体構造を備えさせる、２又はそれ以上の同じ種類のリガンドを選択する。かくして、当該実施態様において、同じ種類の一又は複数の（天然又は非天然）リガンド（例えば、完全なアゴニスト又は部分的アゴニスト又はアンタゴニスト又は逆アゴニスト）が使用されてよい。平行して又は連続的に当該方法に同じ種類の多数のリガンドを含めることによって、例えば結合部位において親と実質的に異なるが、代償的変化によって依然としてリガンドに結合することが可能な多数の変性を有する受容体の立体構造を、思わず遺伝子操作及び選択する理論的なリスクが最小化される。以下を使用して当該リスクを軽減してもよい：
１．例えば結合分析、機能分析、又は分光分析によって根拠付けられる共通の薬理学的分類を有する、化学的に異なるリガンドのセット（例えば、ｎ＝２から５）を選択する工程（これらのリガンドは、例えば野生型受容体及び／又は変異型受容体を使用する競争結合試験並びに／或いはそれらが共通のファーマコフォアを表わす必要は無いが分子モデリングによって根拠付けられるように、受容体の共通の空間的領域に結合すると解されるべきである）；
２．安定性を増大することが意図される一又は複数の受容体変異体を作製し、リガンドセットの全てを使用してタイト結合についてアッセイする工程（前記アッセイは、平行、多重、又は連続的に為されてよい）；
３．例えば、各リガンドについての結合等温線の測定によって、及びリガンドを用いた安定性のシフトの測定によって（典型的には、野生型と比較してウィンドウが狭い）、安定化された受容体変異体の確実性を確認する工程。
１．例えば結合分析、機能分析、又は分光分析によって根拠付けられる共通の薬理学的分類を有する、化学的に異なるリガンドのセット（例えば、ｎ＝２から５）を選択する工程（これらのリガンドは、例えば野生型受容体及び／又は変異型受容体を使用する競争結合試験並びに／或いはそれらが共通のファーマコフォアを表わす必要は無いが分子モデリングによって根拠付けられるように、受容体の共通の空間的領域に結合すると解されるべきである）；
２．安定性を増大することが意図される一又は複数の受容体変異体を作製し、リガンドセットの全てを使用してタイト結合についてアッセイする工程（前記アッセイは、平行、多重、又は連続的に為されてよい）；
３．例えば、各リガンドについての結合等温線の測定によって、及びリガンドを用いた安定性のシフトの測定によって（典型的には、野生型と比較してウィンドウが狭い）、安定化された受容体変異体の確実性を確認する工程。
変異による結合部位に対する影響によって生じる見掛けの親和性における変化に対する監視のために、好ましくは、同じ薬理学的分類を有するが、異なる化学的分類を有するリガンドを使用して、受容体をプロファイルするべきである。典型的には、これらによって、異なる分子認識特性を有するが、同様の親和性におけるシフト（変異体対親、例えば野生型）が示されるべきである。結合実験は、好ましくは、同じ薬理学的分類内の標識リガンドを使用して実施するべきである。
それにもかかわらず、同じ薬理学的分類内のリガンドの複数の化学的分類に特異的な立体構造基質が存在する可能性があり、これらは、その手法において、選択したリガンドの化学的分類に依存して特異的に安定化される可能性があることが認識されるべきである。
典型的には、前記選択したリガンドは、親ＧＰＣＲに対する結合と同様の作用強度でＧＰＣＲ変異体に結合する。典型的には、ＧＰＣＲ変異体及び親ＧＰＣＲに対する特定のリガンド結合についてのＫｄ値は、互いに５から１０倍、例えば、２から３倍の範囲である。典型的には、親ＧＰＣＲと比較してＧＰＣＲ変異体に対するリガンドの結合は、最大で５倍弱く、最大で１０倍強いであろう。
典型的には、選択された立体構造で安定化された受容体変異体は、親受容体と同程度（典型的には、２から３倍以内）又はそれ以上の親和性で選択したリガンドに結合するはずである。アゴニスト−立体構造変異体について、前記変異体は、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以上の親和性で前記アゴニストと結合し、典型的には、親ＧＰＣＲと同定又はそれ以下の親和性でアンタゴニストと結合する。同様に、アンタゴニスト−立体構造変異体について、前記変異体は、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以上の親和性でアンタゴニストと結合し、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以下の親和性でアゴニストと結合する。
選択するリガンドについての親和性における顕著な低減（典型的には２から３倍超）を示す変異体は、典型的には除外する。
典型的には、同じ分類を有する一連のリガンドの結合の序列は同程度であるが、当該序列において１つ又は２つの逆転が存在する可能性があり、あるいは一連のリガンドに異常値が存在する可能性がある。
更なる実施態様では、同じ立体構造の受容体に結合する２つ又はそれ以上のリガンド、例えば、アロステリックモジュレータ及びオルトステリックアゴニストを使用してよい。
誤解を避けるために、また、実施例から明らかなように、効果的な方法に多数のリガンドを使用することが必要なわけではない。
選択方法の更なる実施態様では、選択したリガンドに結合することが可能であるが、第一のリガンドとは異なる分類のものである第二の選択したリガンドには結合できないか又は親ＧＰＣＲより弱く結合するＧＰＣＲ変異体を選択することも有利であってよい。かくして、例えば、ＧＰＣＲ変異体は、選択したアンタゴニストの結合に関して増大した安定性を有するものであることに基づいて選択されるものであってよいが、その様に選択されたＧＰＣＲ変異体を更に試験して、完全なアゴニストに結合するか（又は親ＧＰＣＲよりも弱く完全なアゴニストに結合するか）否かを測定する。完全なアゴニストに結合しない（又は結合が低減する）変異体が選択される。このように、１つの特定の立体構造に固定化されているＧＰＣＲを更に選択する。
選択されたリガンド（本発明の方法の工程（ｉｉ）で選択したもの）及び上述の更なる（第二の）リガンドが、リガンドの種類の任意のペア、例えば、完全なアゴニストとアンタゴニスト；アンタゴニストと逆アゴニスト；逆アゴニストとアンタゴニスト；逆アゴニストと完全なアゴニスト；及び完全なアゴニストと逆アゴニストなどであってよい。
前記受容体変異体が、更なる（第二の）リガンドに対する親受容体の親和性の５０％未満の親和性、より好ましくは１０％未満、更に好ましくは１％未満又は０．１％未満又は０．０１％未満の親和性で更なる（第二の）リガンドに結合することが好ましい。かくして、前記受容体変異体と第二のリガンドとの相互作用のＫｄは、親受容体よりも高い。実施例１に示すように、β−アドレナリン受容体変異体であるβＡＲ−ｍ２３（アンタゴニストを使用して本発明の方法によって選択される）は、親よりも３桁弱く（すなわち、Ｋｄが１０００倍以上）アゴニストに結合する。同様に、実施例２では、アデノシンＡ２ａ受容体変異体であるＲａｎｔ２１が、親よりも２から４桁弱くアゴニストに結合する。
このタイプの対抗選択を使用して、より特異的（及び、そのため、より迅速且つより効率的）に変異誘発法を、リガンドによって決まる純粋な立体構造に対する経路に沿って管理することが可能であるため有用である。
好ましくは、選択方法における変異体ＧＰＣＲは、構造の完全性を維持している適切な可溶化形態で提供され、機能的形態である（例えば、リガンドに結合することが可能である）。特定のタンパク質について有効な当業者に選択されてよい適当な可溶化系、例えば、適切な界面活性剤（又は他の両親媒性剤）及び緩衝液系を使用する。典型的には、使用してよい界面活性剤は、例えば、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）又はＣＨＡＰＳ又はオクチルグルコシド（ＯＧ）又は他の多数の界面活性剤を含む。コレステロールヘミスクシネート若しくはコレステロール自体又はヘプタン−１，２，３−トリオールなどの他の化合物を含めることも好都合であってよい。グリセロール又はプロリン又はベタインの存在は有用であってよい。ＧＰＣＲは、一度膜から可溶化されると、アッセイするために十分に安定である必要があることは重要である。幾つかのＧＰＣＲについては、ＤＤＭは十分であるが、望ましい場合には、グリセロール又は他のポリオールを添加して、アッセイのための安定性を増大させてよい。さらなるアッセイのための安定性は、任意にグリセロールの存在下において、例えば、ＤＤＭ、ＣＨＡＰＳ、及びコレステロールヘミスクシネートの混合物に可溶化することによって達成されてよい。特に不安定なＧＰＣＲについては、ジギトニン又はアンフィポール（amphipol）或いは従来の界面活性剤の非存在下において膜から直接ＧＰＣＲを可溶化することが可能であり、顕著な数の脂質をＧＰＣＲに結合させた状態のままとすることによって典型的に安定性を維持する他のポリマーを使用して可溶することが望ましい。機能的な形態の非常に不安定な膜タンパク質を可溶化するために、ナノディスク（nanodisc）を使用してもよい。
典型的には、選択方法における変異体ＧＰＣＲは、（例えば、大腸菌などの前記変異体を発現させた宿主細胞由来の膜画分の）粗抽出物で提供される。タンパク質変異体が、典型的には少なくとも７５％、より典型的には少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％のサンプル中に存在するタンパク質を占める形態で提供されてよい。言うまでもなく、典型的には、上述のように可溶化され、多くの場合にＧＰＣＲ変異体は界面活性剤及び／又は脂質分子と相互作用する。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、任意の変性又は変性条件に対して、例えば、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、又は極端なｐＨのいずれか一又は複数に対して増大した安定性を有するものでありうる。
熱に対する安定性（すなわち、熱安定性）に関して、これは、リガンド結合を測定することによって、或いは特定の温度における蛍光、ＣＤ、又は光散乱などの分光学的方法によって容易に測定することが可能である。典型的には、ＧＰＣＲがリガンドに結合する際は、特定の温度においてリガンドに結合するＧＰＣＲの能力を使用して、前記変異体の熱安定性を測定してよい。「見かけのＴｍ」、すなわち、５０％の受容体が所定の条件下で所定の時間（例えば、３０分）に亘ってインキュベートした後に、不活化される温度を測定することも好都合であり得る。より高い熱安定性のＧＰＣＲ変異体は、それらの親と比較してより大きな見かけのＴｍを有する。
界面活性剤又はカオトロピックに対する増大した安定性に関しては、典型的には、前記ＧＰＣＲを、試験界面活性剤又は試験カオトロピック剤の存在下において所定の時間に亘ってインキュベートして、例えば、リガンド結合又は上述の分光学的方法を使用して安定性を測定する。
極端なｐＨに関しては、典型的な試験ｐＨは、例えば、４．５から５．５（低ｐＨ）の範囲又は８．５から９．５（高ｐＨ）の範囲で選択されるであろう。
比較的強力な界面活性剤を結晶化の段階で使用するため、ＧＰＣＲ変異体がその様な界面活性剤の存在下において安定であることが好ましい。ある界面活性剤の「強力」さは、ＤＤＭ、Ｃ１１→Ｃ１０→Ｃ９→Ｃ８マルトシド又はグルコシド、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）及びＳＤＳの順である。ＧＰＣＲ変異体がＣ９マルトシド又はグルコシド、Ｃ８マルトシド又はグルコシド、ＬＤＡＯ、及びＳＤＳのいずれかに対して良い安定であることが特に好ましく、そのため、これらの界面活性剤を安定性試験に使用することが好ましい。
測定の容易性のため、熱安定性を測定することが好ましく、第一の親ＧＰＣＲの変異体は、所定の条件に関して親タンパク質と比較して増大した熱安定性を有するものである。熱は変性剤としての作用を有し、サンプルを冷却すること、例えば、氷上に置くことで容易に取り除くことが可能であると解されるであろう。熱安定性は、他の変性剤又は変性条件に対する安定性の指針でもある可能性がある。かくして、増大した熱安定性は、変性界面活性剤、特にＤＤＭよりも変成作用が強いもの、例えば、より小さな頭部基及びより短いアルキル鎖並びに／又は荷電した頭部基を有する界面活性剤中の安定性に置き換えられる可能性がある。本発明者は、熱安定性を有するＧＰＣＲが強力な界面活性剤に対してもより安定であることを発見した。
変性条件として極端なｐＨを使用する際は、中和剤を添加することによって迅速にこれを取り除くことができると解されるであろう。同様に、カオトロピック剤を変性剤として使用する際は、カオトロピック剤がカオトロピック効果を奏する濃度未満にサンプルを希釈することによって、変性効果を除去し得る。
選択方法の更なる実施態様では、選択された変異体ＧＰＣＲがＧタンパク質に共役できるかどうかが決定される。選択された変異体ＧＰＣＲが、親ＧＰＣＲに匹敵する伝播及び／又は親和性順位序列で、選択するリガンドと同じクラスの複数のリガンドに結合できるかどうかが決定されるならばまた好ましい。
本選択方法の特定の実施態様では、ＧＰＣＲは、βアドレナリン受容体（例えば、シチメンチョウ由来）であり、リガンドはアンタゴニストであるジヒドロアルプレノロール（ＤＨＡ）である。
本選択方法の更に好ましい実施態様では、ＧＰＣＲがアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）（例えば、ヒト由来）であり、リガンドがアンタゴニストであるＺＭ ２４１３８５（４−［２−［［７−アミノ−２−（２−フリル）［１，２，４−］−トリアゾロ［２，３−α］［１，３，５］トリアジン−５−イル］アミノ］エチル］フェノール）又はアゴニストであるＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）である。
選択方法の更に好ましい実施態様では、ＧＰＣＲがニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）（例えば、ラット由来）であり、リガンドがアゴニストであるニューロテンシンである。
本発明の第二の態様は、増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを調製する方法であって、
（ｉ）上述の選択方法を実施すること、
（ｉｉ）増大した安定性について選択された一又は複数のＧＰＣＲ変異体中の一又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定すること、及び
（ｉｉｉ）同定した位置の一又は複数に変異を含むＧＰＣＲ変異体を合成すること
本発明の第二の態様は、増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを調製する方法であって、
（ｉ）上述の選択方法を実施すること、
（ｉｉ）増大した安定性について選択された一又は複数のＧＰＣＲ変異体中の一又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定すること、及び
（ｉｉｉ）同定した位置の一又は複数に変異を含むＧＰＣＲ変異体を合成すること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
（ｉ）上述の選択方法を実施すること、
（ｉｉ）増大した安定性について選択された一又は複数のＧＰＣＲ変異体中の一又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定すること、及び
（ｉｉｉ）同定した位置の一又は複数に変異を含むＧＰＣＲ変異体を合成すること
本発明の第二の態様は、増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを調製する方法であって、
（ｉ）上述の選択方法を実施すること、
（ｉｉ）増大した安定性について選択された一又は複数のＧＰＣＲ変異体中の一又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定すること、及び
（ｉｉｉ）同定した位置の一又は複数に変異を含むＧＰＣＲ変異体を合成すること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
実施例に見られるように、驚くべきことに、ＧＰＣＲの内部の単独のアミノ酸に対する変化が、前記タンパク質が特定の立体構造を備える条件下おいて、親タンパク質と比較して前記タンパク質の安定性を増大させる。かくして、増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを調製する方法の第一の実施態様では、親タンパク質の１つのアミノ酸残基がタンパク質変異体では変化している。典型的には、前記アミノ酸残基は、選択において試験した変異体において認められるアミノ酸残基に変化される。しかしながら、任意の他のアミノ酸残基、例えば、任意の天然アミノ酸残基（特に、「コード可能な」アミノ酸残基）又は非天然アミノ酸に置き換えられてよい。一般的には、簡便にするために、アミノ酸残基は、１９の他のコード可能なアミノ酸の１つに置き換えられる。好ましくは、本選択方法において選択した変異体に存在する置き換えられたアミノ酸残基である。
実施例で認められるように、安定性における更なる増大が、親タンパク質のアミノ酸の２つ以上を置き換えることによって得られてよい。典型的には、置き換えられたアミノ酸の各々が、本選択方法を使用して同定されたものである。典型的には、同定された各アミノ酸は、タンパク質変異体に存在するアミノ酸に置き換えられてよいが、上述のように、それは任意の他のアミノ酸で置き換えられてもよい。
典型的には、増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを調製する場合、変異体ＧＰＣＲは、親タンパク質と比較して、１から１０の置き換えられたアミノ酸、好ましくは１から８、典型的には２から６、例えば、２、３、４、５、又は６の置き換えられたアミノ酸を含む。
多数の変異体が、本選択方法に供されてよいと解されるであろう。換言すると、多数の変異体が、本選択方法の工程（ｉ）で提供されてよい。上述の選択及び調製方法によって、その構造が非常に安定な多数の点変異タンパク質を作製するために選択された多数の変異誘発されたＧＰＣＲが作製されてよいと解されるであろう。
よって、工程（ａ）における第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体は、第一の親ＧＰＣＲと比較して複数の変異を含んでいてもよい。
工程（ａ）における第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体は任意の適切な方法によって調製されうる。好都合には、前記タンパク質変異体は、適切な核酸分子にコードされ、適切な宿主細胞において発現される。前記ＧＰＣＲ変異体をコードする適切な核酸分子は、当該技術分野でよく知られている標準的なクローニング技術、部位特異的突然変異誘発法、及びＰＣＲを用いて作製されてよい。適切な発現系は、細菌又は酵母における構成的又は誘導性の発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、及びレンチウイルスなどのウイルス発現系、又は昆虫若しくは哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションを含む。適切な宿主細胞は、大腸菌、乳酸連鎖球菌、サッカロミセスセレビシアエ、スキゾサッカロミセスポンベ、ピチアパストリス、スポドプテラフルギペルダ、及びトリコプルシアニ細胞を含む。適切な動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、及びＤＴ４０などを含む。幾つかのＧＰＣＲは、機能するために特定の脂質（例えば、コレステロール）を必要とする。その場合には、脂質を含む宿主細胞を選択することが望ましい。加えて又は代替的に、前記脂質は、前記タンパク質変異体の単離及び精製の間に添加してもよい。これらの発現系及び宿主細胞は、本発明の第一の態様に係る方法の工程（ａ）におけるＧＰＣＲ変異体について使用してもよいと解されるであろう。
遺伝子及びｃＤＮＡのクローニング及び操作のため、ＤＮＡを変異させるため、及び宿主細胞においてポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための分子生物学的方法が、参照によって本明細書に取り込む「Molecular cloning, a laboratory manual”, third edition, Sambrook, J. & Russell, D.W. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY」に例示されているように、当該技術分野においてよく知られている。
β−アドレナリン受容体変異体
β−アドレナリン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アドレナリンに結合する。
β−アドレナリン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アドレナリンに結合する。
一実施態様では、親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、対応する野生型のβ−アドレナリン受容体と比較した際に、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号による以下の位置：Ｉｌｅ５５、Ｇｌｙ６７、Ａｒｇ６８、Ｖａｌ８９、Ｍｅｔ９０、Ｇｌｙ９８、Ｉｌｅ１２９、Ｓｅｒ１５１、Ｖａｌ１６０、Ｇｌｎ１９４、Ｇｌｙ１９７、Ｌｅｕ２２１、Ｔｙｒ２２７、Ａｒｇ２２９、Ｖａｌ２３０、Ａｌａ２３４、Ａｌａ２８２、Ａｓｐ３２２、Ｐｈｅ３２７、Ａｌａ３３４、Ｐｈｅ３３８の任意の一又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有する、β−アドレナリン受容体変異体である。
β−アドレナリン受容体変異体は、任意のβ−アドレナリン受容体変異体であってよいが、所定のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体アミノ酸配列に参照されるアミノ酸の位置の一又は複数において変異されている。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲが、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson et al (1994) Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680）を使用して測定すると、前記所定のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体配列と比較した際に少なくとも２０％アミノ酸配列同一性を有する者であることが特に好ましい。より好ましくは、第一の親ＧＰＣＲの変異体受容体は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的に、より高い程度のアミノ酸同一性が、天然のリガンドが結合するオルトステリック（「活性」）部位の付近では保存されている。
以下の実施例１及び図１に記載のように、親シチメンチョウβ−アドレナリン配列（図９に示す）における以下のアミノ酸残基：Ｉｌｅ５５、Ｇｌｙ６７、Ａｒｇ６８、Ｖａｌ８９、Ｍｅｔ９０、Ｇｌｙ９８、Ｉｌｅ１２９、Ｓｅｒ１５１、Ｖａｌ１６０、Ｇｌｎ１９４、Ｇｌｙ１９７、Ｌｅｕ２２１、Ｔｙｒ２２７、Ａｒｇ２２９、Ｖａｌ２３０、Ａｌａ２３４、Ａｌａ２８２、Ａｓｐ３２２、Ｐｈｅ３２７、Ａｌａ３３４、Ｐｈｅ３３８の個々の置換は、熱安定性の増大を引き起こす。
かくして、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、その親と比較した際に、これらのアミノ酸残基の一又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているシチメンチョウβ−アドレナリン受容体変異体を含む。第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親受容体における一又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するβ−アドレナリン受容体変異体でありうる。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するβ−アドレナリン受容体であってよく、又はその切断型であってよく、又は天然のタンパク質又はその断片との融合体であってよく、又はリガンド結合能を保持している天然配列と比較して変異を含有してよい。
「対応するアミノ酸残基」によって、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体と他のβ−アドレナリン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較する際に、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体中の所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のβ−アドレナリン受容体のアミノ酸残基が含まれる。
図９は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体とヒトβ１、β２、及びβ３−アドレアなリン受容体との間のアラインメントを示す。
ヒトβ１のＩｌｅ７２はシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応し；ヒトβ２のＩｌｅ４７はシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応し；ヒトβ３のＴｈｒ５１がシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応していることが認められる。ヒトβ１、β２、及びβ３における他の対応するアミノ酸残基は図９を参照して容易に同定することが可能である。
特定のアミノ酸がＡｌａに置き換えられることが好ましい。しかしながら、特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置きかえられることが好ましい（例えば、図１におけるシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＡｌａ２３４、Ａｌａ２８２、及びＡｌａ３３４）。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、さらに大きい安定性が与えられる可能性があるため、２以上のアミノ酸の位置において、親と比較して異なるアミノ酸を有するβ−アドレナリン受容体であれば好ましい。特に好ましいヒトβ１受容体変異体は、以下のアミノ酸残基：Ｋ８５、Ｍ１０７、Ｙ２４４、Ａ３１６、Ｆ３６１及びＦ３７２の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸が、Ａｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する残基である場合を除く）。
上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ１受容体変異体を使用することができる。
特に好ましいヒトβ２受容体変異体は、以下のアミノ酸：Ｋ６０、Ｍ８２、Ｙ２１９、Ｃ２６５、Ｌ３１０及びＦ３２１の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ａｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。
上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ２受容体変異体を使用することができる。
図２６は、β１−ｍ２３における６の熱安定化変異（Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、Ｆ３２７Ａ、Ｆ３３８Ｍ）は、ヒトβ２受容体に転用して（対応する変異Ｋ６０Ｓ、Ｍ８２Ｖ、Ｙ２１９Ａ、Ｃ２６５Ｌ、Ｌ３１０Ａ、Ｆ３２１Ｍ）、ヒトβ２−ｍ２３を作製した際の熱安定性に対する効果を示す。ヒトβ２及びβ２−ｍ２３のＴｍは、２９℃及び４１℃の各々であり、かくして、熱安定化変異を１つの受容体から他の受容体に転用可能であることが例示される。よって、特に好ましいヒトβ２受容体変異体は、Ｋ６０Ｓ、Ｍ８２Ｖ、Ｙ２１９Ａ、Ｃ２６５Ｌ、Ｌ３１０Ａ、Ｆ３２１Ｍの変異を含むものである。
特に好ましいヒトβ３受容体変異体は、以下のアミノ酸：Ｗ６４、Ｍ８６、Ｙ２２４、Ｐ２８４、Ａ３３０ 及びＦ３４１の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられたものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ａｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）
上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ３受容体変異体を使用することができる。
特に好ましい変異の組み合わせは、実施例１の表１及び２に詳細に記載しており、第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体ＧＰＣＲは、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体変異体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例１の表１及び２に示すものと同じアミノ酸に置き換えられているβ−アドレナリン受容体変異体も含む。
特に好ましい変異体は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸に変異を含有するものである（Ｒ６８Ｓ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、Ａ３３４Ｌ）（下記の表２のｍ６−１０参照）；（Ｍ９０Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ｆ３３８Ｍ）（下記の表２のｍ７−７参照）；（Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｖ２３０Ａ、Ｆ３２７Ａ、Ａ３３４Ｌ）（下記の表２のｍ１０−８参照）；及び（Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、Ｆ３２７Ａ、Ｆ３３８Ｍ）（下記の表２のｍ２３参照）。
変異体アデノシン受容体
アデノシン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アデノシンに結合する。
アデノシン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アデノシンに結合する。
一実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、対応する野生型アデノシンと比較した際に、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした以下の位置：Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｌｅｕ１６７、Ａｌａ１８４、Ａｒｇ１９９、Ａｌａ２０３、Ｌｅｕ２０８、Ｇｌｎ２１０、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｕ２１９、Ａｒｇ２２０、Ｓｅｒ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ｇｌｎ２２６、Ｌｙｓ２２７、Ｈｉｓ２３０、Ｌｅｕ２４１、Ｐｒｏ２６０、Ｓｅｒ２６３、Ｌｅｕ２６７、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２７９、Ａｓｎ２８４、Ｇｌｎ３１１、Ｐｒｏ３１３、Ｌｙｓ３１５、Ａｌａ５４、Ｖａｌ５７、Ｈｉｓ７５、Ｔｈｒ８８、Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｔｈｒ１１９、Ｌｙｓ１２２、Ｇｌｙ１２３、Ｐｒｏ１４９、Ｇｌｕ１５１、Ｇｌｙ１５２、Ａｌａ２０３、Ａｌａ２０４、Ａｌａ２３１、Ｌｅｕ２３５、Ｖａｌ２３９の任意の一又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体である。
変異体アデノシン受容体は任意のアデノシン受容体の変異体であってよいが、所定のヒトアデノシンＡ２ａ受容体アミノ酸配列を参照して記載されるアミノ酸位置の一又は複数において変異されている。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、所定のヒトアデノシンＡ２ａ受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％の配列同一性を有する。典型的には、より高い程度の配列保存がアデノシン結合部位に存在する。
以下の実施例２に記載するように、（図１０に示す）ヒトアデノシンＡ２ａ受容体配列の以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｌｅｕ１６７、Ａｌａ１８４、Ａｒｇ１９９、Ａｌａ２０３、Ｌｅｕ２０８、Ｇｌｎ２１０、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｕ２１９、Ａｒｇ２２０、Ｓｅｒ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ｇｌｎ２２６、Ｌｙｓ２２７、Ｈｉｓ２３０、Ｌｅｕ２４１、Ｐｒｏ２６０、Ｓｅｒ２６３、Ｌｅｕ２６７、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２７９、Ａｓｎ２８４、Ｇｌｎ３１１、Ｐｒｏ３１３、Ｌｙｓ３１５の個々の置き換えは、アゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）を使用して測定した際の熱安定性における増大を引き起こす。
（図１０に示す）ヒトＡ２ａ受容体配列における以下のアミノ酸残基：Ａｌａ５４、Ｖａｌ５７、Ｈｉｓ７５、Ｔｈｒ８８、Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｔｈｒ１１９、Ｌｙｓ１２２、Ｇｌｙ１２３、Ｐｒｏ１４９、Ｇｌｕ１５１、Ｇｌｙ１５２、Ａｌａ２０３、Ａｌａ２０４、Ａｌａ２３１、Ｌｅｕ２３５、Ｖａｌ２３９の置き換えは、アンタゴニストであるＺＭ２４１３８５（４−［２−［［７−アミノ−２−（２−フリル）［１，２，４］−トリアゾロ［２，３−α］［１，３，５］トリアジン−５−イル］アミノ］エチル］フェノール）を使用して測定した際の熱安定性の増大を引き起こす。
かくして、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の一又は複数が他のアミノ酸残基に置き換えられている変異体ヒトアデノシンＡ２ａ受容体でありうる。第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親受容体の一又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている他の起源に由来する変異体アデノシン受容体でもありうる。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するアデノシン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。
「対応するアミノ酸残基」によって、ヒトアデノシン受容体Ａ２ａ受容体及び他のアデノシン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較する際に、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体における所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のアデノシン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。
図１０は、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体及び３種の他のヒトアデノシン受容体（Ａ２ｂ、Ａ３、及びＡ１）の間のアラインメントを示す。
例えば、Ａ２ｂ受容体（ＡＡ２ＢＲと示されている）におけるＳｅｒ１１５がＡ２ａ受容体のＧｌｙ１１４と対応することが認められる。同様に、Ａ３受容体（ＡＡ３Ｒと示されている）におけるＡｌａ６０がＡ２ａ受容体におけるＡｌａ５４に対応することなどが認められる。ヒトアデノシン受容体Ａ２ｂ、Ａ３、及びＡ１における他の対応するアミノ酸残基は、図１０を参照して容易に同定することが可能である。
親の特定のアミノ酸がＡｌａに置き換わることが好ましい。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えることが好ましい。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲが、２以上のアミノ酸の位置において親と比較して異なるアミノ酸を有する変異体アデノシン受容体であるのが好ましい。特に好ましいヒトアデノシンＡ２ｂ受容体は、以下のアミノ酸残基：Ａ５５、Ｔ８９、Ｒ１２３、Ｌ２３６及びＶ２４０の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換わっているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ａｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。
３又は４又は５の上述の変異を有する変異体ヒトアデノシンＡ２ｂ受容体を使用することができる。
特に好ましいヒトアデノシンＡ３受容体は、以下のアミノ酸残基：Ａ６０、Ｔ９４、Ｗ１２８、Ｌ２３２ 及びＬ２３６の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ａｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。
３又は４又は５の上述の変異を有するヒトアデノシンＡ３受容体変異体を使用することができる。
特に好ましいヒトアデノシンＡ１受容体は、以下のアミノ酸残基：Ａ５７、Ｔ９１、Ａ１２５、Ｌ２３６、及びＬ２４０の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ａｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。
変異の特に好ましい組み合わせは実施例２に詳細に記載している。第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体ＧＰＣＲは、これらのヒトアデノシンＡ２ａ受容体を含み、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例２に示すものと同じアミノ酸によって置き換えられている他の変異体アデノシン受容体も含む。
特に好ましいアデノシン受容体変異体は、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸に変異を含有するものである（Ａ５４Ｌ，Ｋ１２２Ａ，Ｌ２３５Ａ）（Ｒａｎｔ１７）；（Ａ５４Ｌ，Ｔ８８Ａ，Ｖ２３９Ａ，Ａ２０４Ｌ）（Ｒａｎｔ１９）；及び（Ａ５４Ｌ，Ｔ８８Ａ，Ｖ２３９Ａ，Ｋ１２２Ａ）（Ｒａｎｔ２１）。
変異体ニューロテンシン受容体
ニューロテンシン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ニューロテンシンに結合する。
ニューロテンシン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ニューロテンシンに結合する。
一実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、対応する野生型のニューロテンシン受容体と比較した際に、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けして記載した以下の位置：Ａｌａ６９、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ａｌａ８６、Ａｌａ９０、Ｓｅｒ１００、Ｈｉｓ１０３、Ｓｅｒ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｌｅｕ１１１、Ａｓｐ１１３、Ｉｌｅ１１６、Ａｌａ１２０、Ａｓｐ１３９、Ｐｈｅ１４７、Ａｌａ１５５、Ｖａｌ１６５、Ｇｌｕ１６６、Ｌｙｓ１７６、Ａｌａ１７７、Ｔｈｒ１７９、Ｍｅｔ１８１、Ｓｅｒ１８２、Ａｒｇ１８３、Ｐｈｅ１８９、Ｌｅｕ２０５、Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｙ２０９、Ｇｌｙ２１５、Ｖａｌ２２９、Ｍｅｔ２５０、Ｉｌｅ２５３、Ｌｅｕ２５６、Ｉｌｅ２６０、Ａｓｎ２６２、Ｖａｌ２６８、Ａｓｎ２７０、Ｔｈｒ２７９、Ｍｅｔ２９３、Ｔｈｒ２９４、Ｇｌｙ３０６、Ｌｅｕ３０８、Ｖａｌ３０９、Ｌｅｕ３１０、Ｖａｌ３１３、Ｐｈｅ３４２、Ａｓｐ３４５、Ｔｙｒ３４９、Ｔｙｒ３５１、Ａｌａ３５６、Ｐｈｅ３５８、Ｖａｌ３６０、Ｓｅｒ３６２、Ａｓｎ３７０、Ｓｅｒ３７３、Ｐｈｅ３８０、Ａｌａ３８５、Ｃｙｓ３８６、Ｐｒｏ３８９、Ｇｌｙ３９０、Ｔｒｐ３９１、Ａｒｇ３９２、Ｈｉｓ３９３、Ａｒｇ３９５、Ｌｙｓ３９７、Ｐｒｏ３９９の任意の一又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体ニューロテンシン受容体である。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、所定のラットニューロテンシン受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％の配列同一性を有する。
変異体ニューロテンシン受容体は任意のニューロテンシン受容体の変異体であってよいが、所定のラットニューロテンシン受容体アミノ酸配列を参照して言及されるアミノ酸位置の一又は複数で変異している。
以下の実施例３に記載しているように、（図１１及び２８に示す）ラットニューロテンシン受容体配列の以下のアミノ酸残基：Ｌｅｕ７２、Ａｌａ８６、Ａｌａ９０、Ｓｅｒ１００、Ｈｉｓ１０３、Ｓｅｒ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｌｅｕ１１１、Ａｓｐ１１３、Ｉｌｅ１１６、Ａｌａ１２０、Ａｓｐ１３９、Ｐｈｅ１４７、Ａｌａ１５５、Ｌｙｓ１７６、Ｔｈｒ１７９、Ｍｅｔ１８１、Ｓｅｒ１８２、Ｐｈｅ１８９、Ｌｅｕ２０５、Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｙ２０９、Ｇｌｙ２１５、Ｌｅｕ２５６、Ａｓｎ２６２、Ｖａｌ２６８、Ｍｅｔ２９３、Ａｓｐ３４５、Ｔｙｒ３４９、Ｔｙｒ３５１、Ａｌａ３５６、Ｐｈｅ３５８、Ｓｅｒ３６２、Ａｌａ３８５、Ｃｙｓ３８６、Ｔｒｐ３９１、Ａｒｇ３９２、Ｈｉｓ３９３、Ｌｙｓ３９７、Ｐｒｏ３９９の個々の置き換えは、ニューロテンシンの不在下について考えた際に熱安定性における増大を引き起こす。
以下の実施例３に記載のように、（図１１及び２８に記載の）ラットニューロテンシン受容体配列における以下のアミノ酸残基：Ａｌａ６９、Ａｌａ７３、Ａｌａ８６、Ａｌａ９０、Ｈｉｓ１０３、Ｖａｌ１６５、Ｇｌｕ１６６、Ａｌａ１７７、Ａｒｇ１８３、Ｇｌｙ２１５、Ｖａｌ２２９、Ｍｅｔ２５０、Ｉｌｅ２５３、Ｉｌｅ２６０、Ｔｈｒ２７９、Ｔｈｒ２９４、Ｇｌｙ３０６、Ｌｅｕ３０８、Ｖａｌ３０９、Ｌｅｕ３１０、Ｖａｌ３１３、Ｐｈｅ３４２、Ｐｈｅ３５８、Ｖａｌ３６０、Ｓｅｒ３６２、Ａｓｎ３７０、Ｓｅｒ３７３、Ｐｈｅ３８０、Ａｌａ３８５、Ｐｒｏ３８９、Ｇｌｙ３９０、Ａｒｇ３９５の個々の置き換えは、ニューロテンシンの存在下について考えると、熱安定性における増大を引き起こす。
かくして、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の一又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられている変異体ラットニューロテンシン受容体でありうる。第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親受容体の一又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基によって置き換えられている他の起源に由来する変異体ニューロテンシン受容体でもありうる。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するニューロテンシン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してもよいが、リガンド結合能を保持する。
「対応するアミノ酸残基」によって、ラットニューロテンシン受容体と他のニューロテンシン受容体とをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷとを使用して比較する際に、ラットニューロテンシン受容体における所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のニューロテンシン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。
図１１は、ラットニューロテンシン受容体と２つのヒトニューロテンシン受容体１及び２との間のアラインメントを示す。例えば、ヒトニューロテンシン受容体１のＡｌａ８５がラットニューロテンシン受容体のＡｌａ８６が対応し；ヒトニューロテンシン受容体１のＰｈｅ３５３がラットニューロテンシン受容体のＰｈｅ３５８に対応することなどが認められる。ヒトニューロテンシン受容体１及び２における他の対応するアミノ酸残基は、図１１を参照して容易に同定可能である。
親の特定のアミノ酸残基がＡｌａに置き換えられることが好ましい。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えられることが好ましい。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、２以上のアミノ酸の位置において、親と比較すると異なるアミノ酸を有する変異体ニューロテンシン受容体であることが好ましい。特に好ましいヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）は、以下のアミノ酸残基：Ａｌａ８５、Ｈｉｓ１０２、Ｉｌｅ２５９、Ｐｈｅ３３７及びＰｈｅ３５３の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基がＡｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。
３又は４又は５の上述の変異を有するヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）を使用することができる。
特に好ましいヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ２）は、以下のアミノ酸残基：Ｖ５４、Ｒ６９、Ｔ２２９、Ｐ３３１及びＦ３４７の一又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基がＡｌａ又はＶａｌ又はＭｅｔ又はＬｅｕ又はＩｌｅで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。３又は４又は５の上述の変異を有するヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ２）が好ましい。
特に好ましい変異の組み合わせは、実施例３に詳細に記載している。第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体ＧＰＣＲは、これらの変異体ラットニューロテンシン受容体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例３に示すものと同じアミノ酸によって置き換えられている他の変異体ニューロテンシン受容体も含む。
特に好ましいニューロテンシン受容体変異得体は、ラットニューロテンシン受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基における変異を含有するものである（Ｆ３５８Ａ，Ａ８６Ｌ，Ｉ２６０Ａ，Ｆ３４２Ａ）（Ｎａｇ７ｍ）；（Ｆ３５８Ａ，Ｈ１０３Ａ，Ｉ２６０Ａ，Ｆ３４２Ａ）（Ｎａｇ７ｎ）。
変異体ムスカリン受容体
ムスカリン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ムスカリンに結合する。
ムスカリン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ムスカリンに結合する。
一実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、対応する野生型のムスカリン受容体と比較した際に、図１７に記載のヒトムスカリン受容体Ｍ１の番号付けした以下の位置：Ｌｅｕ６５、Ｍｅｔ１４５、Ｌｅｕ３９９、Ｉｌｅ３８３及びＭｅｔ３８４の任意の一又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有する変異体ムスカリン受容体を提供する。
変異体ＧＰＣＲは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、所定のヒトムスカリン受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％の配列同一性を有する。
変異体ムスカリン受容体は、任意のムスカリン受容体の変異体であってよいが、所定のムスカリン受容体アミノ酸配列を参照して挙げられているアミノ酸の位置の一又は複数で変異されている。
かくして、第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の一又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられた変異体ヒトムスカリン受容体を含む。第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、親受容体における一又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸によって置き換えられている他の起源由来の変異体ムスカリン受容体も含む。誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するムスカリン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質又はその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。
「対応するアミノ酸残基」によって、ヒトムスカリン受容体と他のムスカリン受容体とをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した際に、ヒトムスカリン受容体における所定のアミノ酸に対して整列（アライン）する他のムスカリン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。
特定のアミノ酸残基がＡｌａで置き換えられることが好ましい。しかしながら、特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えられることが好ましい。
変異体βアドレナリン、アデノシン及びニューロテンシン受容体を含む第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、それに対するリガンドの存在下又は不存在下でその親と比較して増大した熱安定性を有しているのが好ましい。典型的には、リガンドは、アンタゴニスト、フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト又はインバースアゴニストであり、オルソステリックでもアロステリックでもよい。上で検討したように、リガンドは抗体のようなポリペプチドでありうる。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲ、例えば変異体βアドレナリン受容体又は変異体アデノシン受容体又は変異体ニューロテンシン受容体は、その親より少なくとも２℃安定であり、好ましくはその親より少なくとも５℃安定であり、より好ましくはその親より少なくとも８℃安定であり、更により好ましくはその親より少なくとも１０℃又は１５℃又は２０℃安定であることが好ましい。典型的には、親及び変異体受容体の熱安定性は同じ条件下で測定される。典型的には、熱安定性はＧＰＣＲが特定のコンフォメーションにある条件下でアッセイされる。典型的には、この選択された条件はＧＰＣＲに結合するリガンドの存在下である。
第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、適切な界面活性剤に溶解され精製される場合、ドデシルマルトシドで溶解されたウシロドプシンと同様な熱安定性を有していることが好ましい。第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、４０℃での３０分間の加熱後にそのリガンド結合活性の少なくとも５０％を保持していることが特に好ましい。第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、５５℃での３０分間の加熱後にそのリガンド結合活性の少なくとも５０％を保持していることが更に好ましい。
誤解を避けるために言及すると、第一の親ＧＰＣＲの親は、天然の配列を有するＧＰＣＲであってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。
典型的には、一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、一又は複数の位置を同定することは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Thompson et al.,1994）を使用して、それらのアミノ酸配列を親ＧＰＣＲの配列とアラインメントすることを伴う。
「対応する一又は複数の位置」によって、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して、第一の及び第二のＧＰＣＲがアラインメントによって比較される際に、第一のＧＰＣＲのアミノ酸配列における位置に整列（アライン）する第二のＧＰＣＲのアミノ酸配列における位置を含む。例えば、図１７におけるアラインメントで示すように、シチメンチョウβ１−ｍ２３における６つの安定化変異であるＲ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、Ｆ３２７Ａ、及びＦ３３８Ｍが、ヒトβ２受容体における残基であるＫ６０、Ｍ８２、Ｙ２１９、Ｃ２６５、Ｌ３１０、及びＦ３２１の各々に対応する位置である。
第二のＧＰＣＲのアミノ酸配列における対応する一又は複数の位置を同定して、それらの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換える。典型的には、前記アミノ酸は、第一の親ＧＰＣＲの変異体における対応する位置のアミノ酸を置き換えたものと同じアミノ酸で置き換えられる（但し、それらのアミノ酸が既にその残基に存在する場合を除く）。例えば、シチメンチョウβ１−ｍ２３の６８位では（Ｒ６８Ｓ）、アルギニン残基がセリン残基で置き換えられている。したがって、ヒトβ２受容体の対応する位置である６０位（Ｋ６０）において、リジン残基が好ましくはセリン残基で置き換えられる。
変異は、例えば、上述のように、且つ、当該技術分野においてよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されてよい。
第二のＧＰＣＲは任意の他のＧＰＣＲであってよいと解されるであろう。例えば、１つの種に由来するＧＰＣＲにおける安定化変異は、他の種に由来する第二のＧＰＣＲに転用してよい。同様に、１つの特定のＧＰＣＲアイソフォームにおける安定化変異は、異なるアイソフォームである第二のＧＰＣＲに転用してよい。好ましくは、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類又はファミリーのものである。系統発生解析は、タンパク質配列の類似性に基づいて、ＧＰＣＲを３つの主な分類、すなわち、クラス１、２、及び３に分けており、それらのフェノタイプはロドプシン、セレクチンレセプター、及びメタボトロピックグルタメート受容体の各々である（Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288）。かくして、第二のＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類のＧＰＣＲであってよい。同様に、ＧＰＣＲは、グルタメート及びＧＡＢＡなどの天然のリガンドによってファミリーに分類されている。かくして、第二のＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲファミリーのものであってよい。ＧＰＣＲの分類及びファミリーの一覧は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288）によって作成されており、その一覧はhttp://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。
第二の親ＧＰＣＲは、第一のＧＰＣＲにおける変異の対応する位置を第二のＧＰＣＲにおいて決定し得るように、第一の親ＧＰＣＲと整列（アライン）することが可能でなくてはならないと解されるであろう。かくして、典型的には、第二の親ＧＰＣＲは、前記第一の親ＧＰＣＲに対して少なくとも２０％の配列同一性を有し、より好ましくは第一の親ＧＰＣＲに対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する。しかしながら、幾つかのＧＰＣＲは、低い配列同一性を有しており（例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲ）、同時に構造においては非常に似ている。かくして、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではない。
実施例６に記載されているように、変異体ＧＰＣＲのアラインメントにいて実施された統計的解析は、熱安定化変異を同定する際に予測性のある更なるＧＰＣＲの整列配列の対応位置ばかりでなく、整列配列からの同定された安定化変異の周りのアミノ酸のウインドウが無作為分布と比較した場合に更なる安定化変異を含んでいる蓋然性が統計的に高いことを示している。
これは、β１アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体及びアデノシンＡ２Ａ受容体の整列配列がマーキングされた熱安定化変異と共に示されている図３３に明確に実証されている。６２の変異のうち、その１８は対応する位置に正確に整列され、更なる３１は、他の熱安定化変異がｉ番目の位置にあるｉプラス又はマイナス４残基のウィンドウ内に整列されている。これは統計的に非常に有意である（ρ＜０．０００４）。更に、ＧＰＣＲ配列のアラインメント内の任意の他の与えられた熱安定化位置からｉプラス又はマイナス３（ρ＜０．００１５）、ｉプラス又はマイナス２（ρ＜０．００５３）及びｉプラス又はマイナス１（ρ＜０．００８）のサイズの残基ウィンドウ内に熱安定化変異の同定に対する統計的有意性が観察される。
従って、発明者等は、ひとたび第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲが同定されれば、ｉが親ＧＰＣＲ中の安定化変異に対応する位置であるｉプラス又はマイナス５残基のウィンドウ内において更なるＧＰＣＲのアミノ酸配列に一又は複数の安定化変異を作製することによって更なるＧＰＣＲを作製することができるという理由付けをした。
よって、本発明の第二の態様は、親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを生産する方法を提供し、該方法は、
（ａ）第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を同定すること、
（ｂ）ｉが対応する位置であるｉプラス又はマイナス５残基のウィンドウ内において第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む。
（ａ）第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を同定すること、
（ｂ）ｉが対応する位置であるｉプラス又はマイナス５残基のウィンドウ内において第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む。
上述のように、典型的には、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置の同定は、例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Thompson et al., 1994）を使用してそのアミノ酸配列を親ＧＰＣＲのものと整列させることを含む。
「ｉプラス又はマイナス５残基のウィンドウ」には、第一の親ＧＰＣＲの変異体中の一又は複数の安定化変異の対応する位置のアミノ酸残基と、かかる各残基の前の５個のアミノ酸残基と後の５個のアミノ酸残基が含まれる。よって、第一の親ＧＰＣＲの変異体が二つの安定化変異を有している場合、ｉプラス又はマイナス５残基の二つのウィンドウが存在し、第一のものはｉが第一安定化変異に相当する位置であるｉプラス又はマイナス５残基に対応し、第二のものはｉが第二安定化変異に相当する位置であるｉプラス又はマイナス５残基に対応する等である。同じことが以下に述べるｉプラス又はマイナス４、ｉプラス又はマイナス３、ｉプラス又はマイナス２及びｉプラス又はマイナス１のウィンドウのそれぞれについて言える。
一を越えるウィンドウが存在する場合、一又は複数の変異がウィンドウの一又は複数に作製されうることが理解される。例えば、各ｉプラス又はマイナス４のウィンドウ内には、ｉ−５、ｉ−４、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、ｉ＋３、ｉ＋４及びｉ＋５のアミノ酸残基の一又は複数が変異されうる。あるいは、一つのウィンドウ内のアミノ酸残基の一又は複数のみが変異されうる。
特に好ましい実施態様では、工程（ｂ）において、ｉが対応する位置であるｉプラス又はマイナス４残基のウィンドウ内において第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異が作製されて、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が提供される。「ｉプラス又はマイナス４残基のウィンドウ」には、第一の親ＧＰＣＲの変異体中の一又は複数の安定化変異の対応する位置のアミノ酸残基と、かかる各残基の前の３個のアミノ酸残基と後の３個のアミノ酸残基が含まれる。よって、ｉプラス又はマイナス４の各ウィンドウ内には、ｉ−４、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２、ｉ＋３及びｉ＋４のアミノ酸残基の一又は複数が変異されうる。
他の実施態様では、工程（ｂ）において、ｉが対応する位置であるｉプラス又はマイナス３残基のウィンドウ内において第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異が作製されて、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が提供される。「ｉプラス又はマイナス３残基のウィンドウ」には、第一の親ＧＰＣＲの変異体中の一又は複数の安定化変異の対応する位置のアミノ酸残基と、かかる各残基の前の３個のアミノ酸残基と後の３個のアミノ酸残基が含まれる。よって、ｉプラス又はマイナス３の各ウィンドウ内には、ｉ−３、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２及びｉ＋３のアミノ酸残基の一又は複数が変異されうる。
他の実施態様では、工程（ｂ）において、ｉが対応する位置であるｉプラス又はマイナス２残基のウィンドウ内において第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異が作製されて、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が提供される。「ｉプラス又はマイナス２残基のウィンドウ」には、第一の親ＧＰＣＲの変異体中の一又は複数の安定化変異の対応する位置のアミノ酸残基と、かかる各残基の前の２個のアミノ酸残基と後の２個のアミノ酸残基が含まれる。よって、ｉプラス又はマイナス２の各ウィンドウ内には、ｉ−２、ｉ−１、ｉ、ｉ＋１及びｉ＋２のアミノ酸残基の一又は複数が変異されうる。
他の実施態様では、工程（ｂ）において、ｉが対応する位置であるｉプラス又はマイナス１残基のウィンドウ内において第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異が作製されて、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が提供される。「ｉプラス又はマイナス１残基のウィンドウ」には、第一の親ＧＰＣＲの変異体中の一又は複数の安定化変異の対応する位置のアミノ酸残基と、かかる各残基の前のアミノ酸残基と後のアミノ酸残基が含まれる。よって、ｉプラス又はマイナス１の各ウィンドウ内には、ｉ−１、ｉ及びｉ＋１のアミノ酸残基の一又は複数が変異されうる。
変異は、例えば上述のようにアミノ酸配列において、当該分野でよく確立された技術を使用して、作製することができる。
第一及び第二のＧＰＣＲの優先度は本発明の第一の態様について上で定義している。
実施例７に記載されているように、変異体ＧＰＣＲで実施された統計的解析は、安定化変異が一次配列中で互いに近接するばかりでなくそれらは三次元空間でも空間的に近接していることを明らかにした。
従って、発明者等は、ひとたび第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲが同定されれば、親ＧＰＣＲ中の安定化変異に対応する位置に三次元で空間的に近接している更なるＧＰＣＲのアミノ酸配列に一又は複数の安定化変異を作製することによって更なるＧＰＣＲを作製することができるという理由付けをした。
よって、本発明の第三の態様は、親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを生産する方法を提供し、該方法は、
（ａ）第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を同定すること、
（ｂ）ｉが対応する位置であるアミノ酸残基ｉのＣα原子から１２Åの距離内、又はその任意の原子から８Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む。
（ａ）第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を同定すること、
（ｂ）ｉが対応する位置であるアミノ酸残基ｉのＣα原子から１２Åの距離内、又はその任意の原子から８Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む。
「の距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列」とは、ｉが第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する対応する一又は複数の位置のアミノ酸残基であるアミノ酸残基ｉからＣα原子又は任意の原子のその距離内にあるアミノ酸残基の全てを意味する。例えば、残基ｉのＣα原子から１２Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列には、残基ｉのＣα原子から１２Åの距離内、例えば残基ｉのＣα残基から１１Å、１０Å、９Å、８Å、７Å、６Å、５Å、４Å又は３Åにあるアミノ酸残基の全てが含まれる。残基ｉの任意の原子の８Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列には、残基ｉの任意の原子から８Åの距離内、例えば残基ｉの任意の原子から７Å、６Å、５Å、４Å又は３Åにあるアミノ酸残基の全てが含まれる。
アミノ酸残基は、そのアミノ酸残基のＣα原子が残基ｉのＣα原子から特定の距離内にあるならば、残基ｉのＣα原子の特定の距離内にあると言われる。例えば、アミノ酸残基は、そのアミノ酸残基のＣα原子が残基ｉのＣα原子から１２Åの距離内にあるならば、残基ｉのＣα原子の１２Åの距離内にあると見なされる等である。同様に、アミノ酸残基は、そのアミノ酸残基の任意の原子が残基ｉの任意の原子から特定の距離内にあるならば、残基ｉの任意の原子の特定の距離内にあると言われる。例えば、アミノ酸残基は、そのアミノ酸残基の任意の原子が残基ｉの任意の原子から８Åの距離内にあるならば、残基ｉの任意の原子の８Åの距離内にあると見なされる。よって、第一が両残基のＣα原子間であり第二が両残基の任意の原子間である二つの距離基準が存在し、何れかの方法を使用することができることが理解される。
距離は三次元座標に基づいて測定されるものである。例えば、距離は、典型的には２つの原子のＸ、Ｙ及びＺ座標の標準的な幾何によって測定される（例えば((x1-x2)2 + (y1-y2)2 + (z1-z2)2)の平方根)。
「任意の原子」にはアミノ酸残基ｉの任意の原子が含まれる。例えば、水素原子又は非水素原子でありうる。原子はアミノ酸鎖の原子であり得、又はそれは主鎖の原子でありうる。
第二のＧＰＣＲの構造が知られている場合、距離は、タンパク質がその天然状態に折り畳まれているときに測定されることが理解される。さもないと、距離は、第二のＧＰＣＲの構造モデル内で測定されうる。構造モデルは、本発明の第四の態様に関して以下に記載するものを含む当該分野で知られている任意の適した方法を使用して作製することができる。例えば、構造モデルはホモロジーに基づいて又は新規構造予測方法を使用してコンピュータで作成されるモデルでありうる（Qian et al Nature (2007) 450: 259-64）。
上記距離内の第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中の任意のアミノ酸残基を変異させることができることが理解される。変異は、例えば、上述のように、かつ当該分野でよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されうる。
第一及び第二ＧＰＣＲに対する優先度は、本発明の第一の態様について上述した通りである。
本発明者は、増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲにおける一又は複数の変異が存在する構造モチーフの同定が、増大した安定性を有する更なる変異体ＧＰＣＲを製造するのに有用であろうとの理由付けを行った。
従って、本発明の第四の態様は、親Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲを製造するための方法であって、
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の構造モチーフを構造膜タンパク質モデル中で同定すること、及び
（ｉｉｉ）第二の親ＧＰＣＲにおける一又は複数の対応する構造モチーフを定めるアミノ酸配列における一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異を提供すること
を含む方法を提供する。
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の構造モチーフを構造膜タンパク質モデル中で同定すること、及び
（ｉｉｉ）第二の親ＧＰＣＲにおける一又は複数の対応する構造モチーフを定めるアミノ酸配列における一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異を提供すること
を含む方法を提供する。
一又は複数の既知の構造モデルにおいて安定化変異をマッピングすることを使用して、その様な安定化変異を有する特定の構造モチーフを同定してよい。本発明者は、その様なモチーフを同定するために、β２−アドレナリン受容体の構造モデルに対してβ１アドレナリン受容体の安定化変異をマッピングした（Rasmussen et al (2007) Nature 450, 383-387; Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）。例えば、表（ｖｉ）は、本発明者がヒトβ２−アドレナリン受容体に対してマッピングしたシチメンチョウβ１−アドレナリン受容体変異体を挙げており、それらが存在する対応する構造モチーフを記載している。実施例４に記載のように、Ｙ２２７Ａ変異（ヒトβ２受容体のＹ２１９に対応する）のヒトβ２アドレナリン受容体に対するマッピングは、変異がヘリックス界面におけるパッキングを改善し得るように、ヘリックス間の界面に位置することを明らかにする（実施例１５、１６、及び２３参照）。同様に、Ｍ９０Ｖ変異（ヒトβ２受容体におけるＭ８２に対応する）のヒトβ２−受容体に対するマッピングは、ヘリックスがねじれる部分でヘリックス２に変異が存在することを明らかにする（図１５、１６、及び２０参照）。他の変異は、脂質二重膜、疎水性−親水性境界領域、タンパク質結合ポケット、及びループ領域に向いている膜貫通ヘリックス表面を含む更なる構造モチーフに存在することが認められた（表（ｖｉ）及び図１８−１９、２１−２２、及び２４−２５）。
その様な構造モチーフは、安定化変異を含有することによって、タンパク質の安定性の決定に重要である。したがって、これらのモチーフを変異の標的とすることは、安定化ＧＰＣＲ変異体の産生を容易にするであろう。事実、同じ構造モチーフに２以上の変異がマップされた複数の例が存在する。例えば、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体Y２２７Ａ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌ変異は、同じヘリックス界面にマップされ、Ｖ８９Ｌ及びＭ９０Ｖ変異は同じヘリックスのねじれにマップされ、Ｆ３２７Ａ及びＡ３３４Ｌ変異は脂質二重膜に向いた同じヘリックス表面にマッピングされた（表（ｖｉ））。かくして、１つの安定化変異が同定された際は、変異が存在する構造モチーフの決定は、更なる安定化変異の同定を可能にするであろう。
本発明の第二態様における第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体は、上述のようにして選択され又は調製されうる。従って、第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体は、上述した特定の変異体、例えば変異体βアドレナリン受容体、アデノシン受容体、ニューロテンシン受容体又はムスカリン受容体の任意のものでありうる。よって、本発明の第二態様の方法は、安定な立体構造が固定されたＧＰＣＲを変異誘発によって作製するために使用されてもよい。例えば、特定の立体構造における増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択の後に、その様な安定化変異が存在する構造モチーフを同定してよい。他のＧＰＣＲにおいて、対応する構造モチーフを規定するアミノ酸配列における一又は複数の変異を作製することが、次いで、親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造において増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造するために使用されてよい。
本発明者は、ヒトβー２ＡＲ、ラットＮＴＲ１、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ｈｉｔｏアデノシンＡ２ａＲ、及びヒトムスカリンＭ１受容体のアミノ酸配列（図１７）の多重配列アラインメントを実施し、同定された熱安定化変異（実施例１から３）が前記配列に存在する際は、全部で７０のうち１１例において、２つの配列が同じ位置で変異を有していることが示されている（図１７において星印で示す）。いずれかの理論につなげることを意図しないが、本発明者は、これらの位置の熱安定化変異は、構造膜タンパク質モデルにマッピングするための促進された転用可能性を有するものであるはずである。かくして、１つの実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの変異体は、対応する親受容体と比較した際に、図１７に記載のヒトβ２ＡＲの番号付けした以下の位置：Ａｌａ５９、Ｖａｌ８１、Ｓｅｒ１４３、Ｌｙｓ１４７、Ｖａｌ１５２、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２２２、Ａｌａ２２６、Ａｌａ２７１、Ｌｅｕ２７５及びＶａｌ３１７の任意の一又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有する、ヒトβ−２ＡＲ、ラットＮＴＲ１、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、又はヒトムスカリンＭ１受容体である。
一又は複数の構造モチーフを同定するために、安定化変異を膜タンパク質の既知の構造にマッピングする。
「膜タンパク質」によって、細胞又はオルガネラの膜に結合又は接合するタンパク質を意味する。好ましくは、前記膜タンパク質は、膜に持続的に組み込まれ、脂質二重層を物理的に破壊する界面活性剤、非極性溶媒、又は変性剤を用いてのみ除去され得る内在性膜タンパク質である。
膜タンパク質の構造モデルは任意の適切な構造モデルであってよい。例えば、前記モデルは、既知の結晶構造であってよい。ＧＰＣＲ結晶構造の例は、ウシロドプシン（Palczewski, K. et al., Science 289, 739-745. (2000)）及びヒトβ２アドレナリン受容体（Rasmussen et al, Nature 450, 383-7 (2007); Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）を含む。ヒトβ２アドレナリン受容体構造の座標は、RCSB Protein Data Bankにおいて２ｒｈ１、２ｒ４ｒ及び２ｒ４ｓの登録番号で見出されうる。ＧＰＣＲ結晶構造の他の例は、座標が登録番号２ｖｔ４でRCSB Protein Data Bank (PDB)に見出されうるシチメンチョウβアドレナリン受容体（Warne et al (2008) Nature 454: 486-91）と、座標が登録番号３ｅｍｌでＲＣＳＢ ＰＤＢに見出されうるヒトＡ２Ａアデノシン受容体を含む。あるいは、構造モデルは、ホモロジーに基づくか又はｄｅ ｎｏｖｏ構造予測法を使用して、コンピューターによって生成されるモデルであってよい（Qian et al Nature (2007) 450: 259-64）。
所定のＧＰＣＲ変異体の安定化変異は、ＧＰＣＲに対して十分な構造類似性を有する任意の膜タンパク質の構造モデルにマッピングされてよい。特に、膜タンパク質のドメインは、転用可能な所定の変異について、安定化変異が存在するＧＰＣＲドメインに対して十分な構造類似性を有する。
タンパク質ドメインは、典型的には、単独のタンパク質として単独で存在するか又は他のドメインとの組み合わせにおける大きなタンパク質の一部であってよい二次構造要素の個別的に折りたたまれた集合として規定される。一般的には、機能的な進化単位である。
ＧＰＣＲは本質的には大きなＮ末端ドメインを有するものを除く単独のドメインタンパク質である。したがって、典型的には、その構造モデルは、ＧＰＣＲに対して十分な類似性を有する少なくとも１つのドメインを含む膜タンパク質のものである。
構造類似性は、配列同一性の分析によって間接的に又は構造の比較によって直接的に決定されてよい。
配列同一性に関しては、変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するＧＰＣＲドメインをコードするアミノ酸配列を、構造モデルが利用可能な膜タンパク質のドメインをコードするアミノ酸配列と整列（アライン）する。これらの配列の一又は複数は、主要保存ドメインに加えて、挿入配列又はＮ末端若しくはＣ末端伸長を含有してよい。最適なアラインメントのために、その様な配列は、分析を歪めないように除外する。問題のドメインに亘る十分な配列同一性を有する膜タンパク質を、次いで、変異をマッピングするための構造モデルとして使用してよい。可溶性タンパク質ドメインについては、それらの３Ｄ構造は、配列同一性が増大すると１００％まで増大する構造保存のレベルとともに、約２０％の配列同一性で広範に保存されており、良好には３０％超の同一性で保存されていることが示されている（Ginalski,K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177）。かくして、構造膜タンパク質モデルが、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を含有するＧＰＣＲドメイン変異体と少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有するドメインを含有する膜タンパク質のモデルである。
配列同一性は、ＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul et al, NAR (1997), 25, 3389-3402）などのアルゴリズム又はHidden Markov Models (Eddy S et al, J Comput Biol (1995) Spring 2 (1) 9-23)に基づく方法を使用して測定してよい。典型的には、２つのポリペプチドの間の配列同一性の％は、任意の適切なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを使用して測定してよく、配列が最適に整列（アライン）されたポリペプチドに関して同一性の％を計算すると解されるであろう。そのアラインメントは、代替的には、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して実施されてよい（Thompson et al.,1994）。使用するパラメータは、以下の通りでありうる：Fast pairwise alignment parameters: K-tuple(word) size; 1, window size; 5, gap penalty; 3, number of top diagonals; 5. Scoring method: x percent. Multiple alignment parameters: gap open penalty; 10, gap extension penalty; 0.05. Scoring matrix: BLOSUM。
配列同一性に加えて、構造類似性が、構造モデルの比較によって直接的に決定されてよい。構造モデルを使用して、配列中で連続的であるか又はそうでなくてよい、配列分析のみからは明らかでない構造類似領域を検出してよい。例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲは類似した構造を共有すると解されているが、それらの配列同一性は非常に低い。同様に、水輸送アクアポリンであるホウレンソウＳｏＰｉｐ２、大腸菌ＡｑｐＺ、メタノコッカスＡｑｐＭ、ラットＡｑｐ４、ヒトＡｑｐ１、及びヒツジＡｑｐ０は、低い配列同一性を共有しているが、それら全ては類似した構造を有する。
高い忠実性の構造モデルが、構造が相同的なタンパク質の既知の構造に基づいてモデルを作製するＭＯＤＥＬＬＥＲ（Sali A and Blundell T, J Mol Biol (1993) 234(3) 779-815）などの標準的なソフトウェアパッケージを使用して未知の構造のタンパク質について作製されてよい。その様なモデリングは、配列同一性の増大とともに改善する。典型的には、未知の構造の配列と既知の３Ｄ構造の配列との間の配列同一性は、３０％超である（Ginalski,K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177）。加えて、配列のみに基づくｄｅ ｎｏｖｏ構造予測法を使用して、未知の構造のタンパク質のモデルを作製してよい（Qian et al, (2007) Nature 450:259-64）。構造を実験的に測定又はモデリングによって導き出すと、構造類似領域が、２以上の３Ｄ構造の直接的な比較によって検出されてよい。それらは、例えば、ＤＡＬＩ（Holm, L and Sander, C (1996) Science 273, 595-603）などのソフトウェアを使用して検出可能な特定の構造及びトポロジーといった二次的な構造要素を含んでよい。それらは、アミノ酸側鎖及びポリペプチド主鎖の局所的な配列、特定の空間配置における原子の特定のセット若しくは原子のグループを含んでよく、例えば、グラフ理論的表現を使用して検出されてもよい(Artymiuk,P et al, (2005) J Amer Soc Info Sci Tech 56 (5) 518-528)。この手法において、比較するタンパク質又はタンパク質の領域内の原子又は原子のグループが、典型的には、ノードの間の角度及び間隔を表示するグラフのエッジとともにグラフのノードとして表わされる。これらのグラフにおける共通のパターンは、共通の構造モチーフを示す。この手法が拡張されて、水素結合ドナー若しくはアクセプター、疎水性、形状、電荷、又は芳香性などの原子又は原子のグループの任意の記述子を含んでよく、例えば、ＧＲＩＤ及び類似性調査のための基礎として使用される当該表示を使用して、その様な記述子にしたがってタンパク質が空間的にマッピングされてよい。前記方法、ソフトウェアの利用可能性、及び使用者の規定するパラメータ、しきい値、及び許容値の選択のためのガイドラインの説明は上述の参考文献に記載している。
好ましい実施態様では、構造膜タンパク質モデルは構造ＧＰＣＲモデルである。ＧＰＣＲの構造モデルは、第一の親ＧＰＣＲのモデルであってよいと解されるであろう。例えば、増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体内の安定化変異は、第一の親ＧＰＣＲ構造及びその様な変異が存在する構造モチーフに直接マッピングされてよい。第一の親ＧＰＣＲの構造が未知である場合は、他のＧＰＣＲの構造モデルを使用してよい。例えば、１つの種に由来するＧＰＣＲの安定化変異は、他の種に由来する同じＧＰＣＲの既知の構造モデルにマッピングされてよい。同様に、１つの特定のＧＰＣＲアイソフォームにおける安定化変異は、他のＧＰＣＲアイソフォームの既知の構造モデルにマッピングされてよい。さらに、１つのＧＰＣＲに由来する安定化変異は、同じ分類又はファミリーの他のＧＰＣＲにマッピングしてよい。ＧＰＣＲの分類及びファミリーの一覧は、International Union of Pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288)によって作成されており、当該一覧は、http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。
上述のように、構造モデルが、ＧＰＣＲ変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸を有するドメインに亘って十分な構造類似性を有する任意のＧＰＣＲのものであってよいと解されるであろう。かくして、ＧＰＣＲが、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を含有するタンパク質ドメインに亘って、第一の親ＧＰＣＲの変異体と少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有することが好ましい。しかしながら、発明者は、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではないと認識している。第一の親ＧＰＣＲに対して２０％未満の配列同一性を有するＧＰＣＲは、低い配列同一性が他の類似性、例えば、第一の親ＧＰＣＲと比較して同じ配列モチーフの存在、同じG−タンパク質に対する結合、又は同じ機能を有すること、或いは同じ疎水性親水性指標のプロットを有することによって相殺される場合に、安定化変異が転用される構造モデルとしても役に立ち得る。
構造モデルに対する安定化変異のマッピングは、当該技術分野において既知の適切な任意の方法を使用して実施されてよい。例えば、典型的には、構造モデルが利用可能なＧＰＣＲのアミノ酸配列を、第一の親ＧＰＣＲの変異体のアミノ酸配列と整列（アライン）する。第一の親ＧＰＣＲと関係する、ＧＰＣＲ変異体の少なくとも１つの異なるアミノ酸残基の一又は複数の位置は、構造モデルが利用可能なＧＰＣＲのアミノ酸配列に存在してよい。
「構造モチーフ」によって、熱安定化変異のＧＰＣＲ構造モデルにおける位置の三次元的記載を含める。例えば、構造モチーフは、ＧＰＣＲの内部の任意の二次又は三次構造モチーフであってよい。「三次構造モチーフ」によって、水素結合ドナー若しくはアクセプター、疎水性、形状、電荷、又は芳香性などの原子又は原子のグループの任意の記述子を含める。例えば、タンパク質は、ＧＲＩＤ及び構造モチーフを規定するための基礎として使用される当該表示を使用してその様な記述子にしたがって空間的にマッピングされてよい（Baroni et al (2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294）。
表（ｖｉ）は、安定化変異が存在することが認められるシチメンチョウβ１アドレナリン受容体の構造モチーフを挙げている。表から認められるように、変異は多数の異なる位置に存在している。３つの変異が、水性溶媒に接近可能であることが予測されるループ領域に存在する。８つの変異が、膜貫通α−ヘリックスに存在し、脂質二重層に向いており；これらの変異のうち３つが、ヘリックスの末端近辺であり、疎水性−親水性境界層にあると解されてよい。８つの変異は、膜貫通α−ヘリックスの間にあり、そのうち３つはヘリックスのねじれた又は歪められた領域のいずれかに存在し、他の２つの変異は１つのヘリックスに存在するが、変異残基に対する空間に近接したねじれを含む一又は複数の他のヘリックスと近接していると認められる。これらの後者の変異は、ねじれ領域内のアミノ酸のパッキングに作用し、熱安定性を生じさせ得る。他の変異は基質結合ポケットに存在する。
したがって、１つの実施態様では、構造モチーフは、ヘリックス界面、ヘリックスねじれ、ヘリックスねじれの逆のヘリックス、脂質二重層に向いたヘリックス表面、疎水性−親水性境界層における脂質二重層に向いたヘリックス表面、ループ領域、又はタンパク質結合ポケットのいずれかである。
安定化変異が存在する構造モチーフの同定は、タンパク質安定性におけるモチーフの重要性を示唆する。したがって、対応する一又は複数の構造モチーフを規定するアミノ酸配列における一又は複数の変異の作製は、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供するはずである。
構造モチーフを規定するアミノ酸配列は、タンパク質の二次又は三次構造において結合して構造モチーフを形成する、アミノ酸残基の一次アミノ酸配列である。その様な一次アミノ酸配列が連続的又は非連続的なアミノ酸残基を含んでよいと解されるであろう。かくして、構造モチーフを規定するアミノ酸配列の同定は、関与する残基を決定し、配列を実質的に規定することを伴うであろう。変異は、例えば、上述のように、当該技術分野においてよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されてよい。
「対応する一又は複数の構造モチーフ」によって、第二の親ＧＰＣＲに存在する構造モデルにおいて同定される一つ又は複数の類似構造モチーフを意味する。例えば、ヘリックス界面を同定する場合には、第二の親ＧＰＣＲにおける対応するヘリックス界面は、構造モデルに存在するヘリックスに類似するヘリックスの間の界面であろう。ヘリックスのねじれを同定した場合には、対応するヘリックスのねじれは、構造モデルに存在するねじれたヘリックスに類似するヘリックスにおけるねじれであろう。第二の親ＧＰＣＲにおける一又は複数の類似する構造モチーフは、例えば配列アラインメントによって、構造モデルにおける一又は複数のモチーフを規定する第二の親ＧＰＣＲの配列中の類似のアミノ酸配列を検索することによって同定されてよい。さらに、コンピューターに基づくアルゴリズムは、当該技術分野において広く利用可能であり、アミノ酸配列に基づくタンパク質モチーフの存在の予測に使用されてよい。かくして、アミノ酸配列内の特定のモチーフの相対的な位置及び他のモチーフに関連する位置に基づいて、類似する構造モチーフが容易に同定されてよい。第二の親ＧＰＣＲの構造モデルが利用可能である場合に、類似する一又は複数の構造モチーフがタンパク質の構造に対して直接マッピングされてよいと解されるであろう。典型的には、類似する構造モチーフを規定するアミノ酸配列は、構造モデルにおいてモチーフを規定する配列と少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、及び９０％、並びにさらに好ましくは９５％及び９９％の配列同一性を有する。
１つの実施態様では、第二の親ＧＰＣＲは第一の親ＧＰＣＲである。誤解を避けるために言及すると、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲの天然の配列を有してよく、又は切断型であってよく、又は天然タンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。
代替的な態様において、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲではない。例えば、増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの変異体が同定されてよいが、増大した安定性を有する異なるＧＰＣＲの変異体を産生することが望ましい。好ましくは、第二の親ＧＰＣＲは、上述の第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類又はファミリーのものである。しかしながら、第二の親ＧＰＣＲが任意の既知のＧＰＣＲであってよいが、第一の親ＧＰＣＲの変異体の安定化変異が存在する対応する構造モチーフを含有するように、第一の親ＧＰＣＲと顕著な構造類似性を共有すると解されるであろう。かくして、典型的には、第二の親ＧＰＣＲが、第一の親ＧＰＣＲと少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する。しかしながら、上述のように、幾つかのＧＰＣＲは、低い配列同一性を有するが（例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲ）、構造において類似する。かくして、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではない。
実施例８において検討されているように、本発明者は、アデノシンＡ２Ａアデノシン、ムスカリン１及びニューロテンシン受容体のホモロジーモデルをシチメンチョウβ１アドレナリン受容体と重ねることによって、変異体間の空間的関係を決定することができるばかりでなく、変異体の「ホットスポット」の統計的有意性を評価することができることを発見した。「ホットスポット」とは、変異されると、親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を生じるアミノ酸残基のクラスターを意味する。高度に統計的に有意であるかかるホットスポットは他のＧＰＣＲ構造中に存在する可能性が高く、よってその決定は、親ＧＰＣＲに対して増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを同定するために使用することができる。ホットスポットは本発明の第三態様において概説した構造モチーフに対応してもよいし対応しなくともよいことが理解される。例えば、ホットスポットを定める残基は、例えばヘリックス又はβストランドのような同じ構造モチーフに必ずしも属している必要はない。
よって、本発明の第四の態様は、その親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを製造するための方法であって、
（ａ）親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有するＧＰＣＲの一又は複数の変異体の一の三次元モデルを提供するか一を越える三次元モデルを整列させること、
（ｂ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に同定すること、
（ｃ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離ｄÅ内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する任意の整列されたモデルからの他の位置の数を決定すること、
（ｄ）他の位置の数が統計的に有意なクラスターを表すかどうかを決定し、もしそうなら、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の位置のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む方法を提供する。
（ａ）親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有するＧＰＣＲの一又は複数の変異体の一の三次元モデルを提供するか一を越える三次元モデルを整列させること、
（ｂ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に同定すること、
（ｃ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離ｄÅ内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する任意の整列されたモデルからの他の位置の数を決定すること、
（ｄ）他の位置の数が統計的に有意なクラスターを表すかどうかを決定し、もしそうなら、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の位置のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む方法を提供する。
「三次元モデル」には、親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲの三次元構造の既知の構造及び予想モデル、例えば上述のように当該分野で知られた（Quian et al, Nature (2007) 450:259-64）ホモロジーに基づき又は新規構造予測方法を使用して作製されたモデルの双方が含まれる。一を越えるモデルが存在する場合、モデルは異なった親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲでありうることが理解される。簡便には、一を越えるモデルが存在する場合、モデルは同じファミリー又はクラスに属する変異体ＧＰＣＲでありうる。ＧＰＣＲクラス及びファミリーのリストはInternational Union of pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288)によって製作されており、このリストはhttp://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。任意の変異体ＧＰＣＲの三次元モデルはそれらが十分な構造類似性を共有している前提でアラインされうることが更に理解される。よって、変異体ＧＰＣＲの一を越えるモデルが存在する場合、変異体ＧＰＣＲは互いに少なくとも２０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、８０％又は９０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有しているのが好ましい。しかしながら、互いに２０％未満の配列同一性のＧＰＣＲは、低い配列性が、同じＧタンパク質に結合し又は同じ機能を有し、又は実質的に同じヒドロパシープロットを有する同じ配列モチーフの存在を例えば含む他の類似性によって均衡される場合、尚アラインされうる。
特に好ましい実施態様では、三次元モデルは、例えばシチメンチョウβ１−ＡＲとのホモロジーに基づき、アデノシンＡ２Ａ受容体、ムスカリン１受容体又はニューロテンシン受容体のような、シチメンチョウβ１−ＡＲ結晶構造(Warne et al (2008) Nature 454: 486-91; PDB登録番号2vt4)、ヒトＡ２Ａアデノシン受容体結晶構造(Jaakola et al (2008) Science 322: 1211-1217; PDB登録番号3eml)の任意の一又は複数、あるいは親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲの作製モデルでありうる。上述のβアドレナリン受容体、アデノシン受容体、ニューロテンシン受容体及びムスカリン受容体のようなここに開示された変異体ＧＰＣＲの一又は複数のモデルを使用することができることが理解される。
典型的には、モデルはコンピュータによって作製される。コンピュータモデルは、市販のソフトウェアプログラムによって作成でき又は表示されうる。ソフトウェアプログラムの例には、限定されないが、ＱＵＡＮＴＡ (Accelrys. COPYRIGHT.2001, 2002), Ｏ(Jones et al., Acta Crystallogr. A47, pp. 110-119 (1991))及びＲＩＢＢＯＮＳ(Carson, J. Appl. Crystallogr., 24, pp. 9589-961 (1991))が含まれる。
好ましくは、一を越える三次元モデル、すなわち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のモデルが提供される。提供されるモデルが多くなると、増大した安定性を有するＧＰＣＲを生産するために他のＧＰＣＲ上にマッピングされうる統計的に有意なクラスターを定める機会が多くなることが理解される。しかしながら、有意なクラスターは、モデルが如何なる他のモデルともアラインされない場合である一つのみのモデルを使用しても尚、定めることができる。
「アライン（整列）する」とは、親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有するＧＰＣＲの一又は複数の変異体の三次元モデルが、各モデルからの均等な原子間の平均（又は二乗平均平方根）距離を最小にするように重ね合わされることを意味する。例えば、モデルは平均（又は二乗平均平方根）距離を最小にするように回転され、平行移動させられうる。三次元モデルは、当該分野で知られている任意の適切な方法、例えばＬＳＱＭＡＮ (Kleywegt & Jones (1994) A super position, CCP4/ESF-EAC BM, Newsletter on Protein Crystallography, 31: 9-14)のようなアルゴリズム又はＭＯＥ(Chemical Computing Group Inc)のSuperposeアルゴリズムを使用してアラインすることができ、又はＱＵＡＮＴＡ(Accelrys Inc)のSuperpose Folding Motifプログラムを使用することができる。
ひとたびモデルがアラインされたら、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離ｄÅ内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する任意の整列されたモデルからの他の位置の数が決定される。例えば、その変異体がその親ＧＰＣＲと比較して一個の異なったアミノ酸残基を有している変異体ＧＰＣＲの三次元モデルの与えられた位置に対して、その位置のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅの設定距離内の（一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を有している）任意のアラインされたモデルからの他の位置の数が決定される。
一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なったアミノ酸残基を有する位置は、その位置のアミノ酸のＣα原子又は任意の原子（「Ｃα原子」又は「任意の原子」が使用されているかどうかに応じて）が特定のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅ内であるならば、特定のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅの設定距離内であると言われる。例えば、「Ｃα原子」を用いる場合、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なったアミノ酸残基を有している位置は、その位置のアミノ酸のＣα原子が特定のアミノ酸残基のＣα原子からｄÅ内にあるならば、特定のアミノ酸残基のＣα原子からｄÅの設定距離内にあると言われる。同様に、「任意の原子」を用いる場合、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なったアミノ酸残基を有している位置は、その位置のアミノ酸の任意の原子が特定のアミノ酸残基の任意の原子からｄÅ内にあるならば、特定のアミノ酸残基の任意の原子からｄÅの設定距離内にあると言われる。一つのモデルだけの場合には、変異体がその親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一つの異なったアミノ酸残基を有しているその変異体内の位置の数だけが、特定のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅの設定距離内に決定されることが理解される。一を越えるモデルが存在する場合は、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一つの異なったアミノ酸残基を有している一又は複数の変異体ＧＰＣＲの任意のアラインされたモデル内の位置の数が、特定のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子からｄÅの設定距離内に決定される。
設定距離ｄÅは、特定のアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から上述の三次元座標に基づいて測定されるものであり、一つのモデル（一つのモデルだけが使用されている場合）又は全てのアラインされたモデル（一を越えるモデルが使用されている場合）をカバーする。
好ましくは、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有している一又は複数の位置のアミノ酸残基のＣα原子からの設定距離ｄÅは少なくとも２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å又は１２Åである。好ましくは、Ｃα原子からの設定距離ｄÅは少なくとの４Åである。特に好ましい実施態様では、Ｃα原子からの設定距離ｄÅは６Å又は８Å又は１０Å又は１２Åの何れかであり、最も好ましくは１０Å又は１２Åである。典型的には、設定距離ｄÅは１２Å以下である。
好ましくは、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有している一又は複数の位置のアミノ酸残基の任意の原子からの設定距離ｄÅは少なくとも２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å又は１２Åである。特に好ましい実施態様では、任意の原子からの設定距離ｄÅは４Å、６Å、８Å又は１０Åの何れかであり、最も好ましくは８Å又は１０Åである。典型的には、設定距離ｄÅは１２Å以下である。
好ましい距離は以下に記載されるように統計的に有意なクラスターを生じるものであることが理解される。
「任意の原子」には、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有している一又は複数の位置のアミノ酸残基の任意の原子が含まれる。例えば、それは水素原子又は非水素原子でありうる。原子はアミノ酸側鎖の原子であり得、又はそれは主鎖の原子でありうる。
一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも一個の異なったアミノ酸残基を有している任意のアラインされたモデルからの他の位置の数がひとたび決定されれば、これが統計的に有意なクラスターを表すかどうかを評価することが必要である。
「統計的に有意なクラスター」とは、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離ｄ内に同定された他の位置の数が、偶然予想されうる数より大きいことを意味する。典型的には、同定された他の位置の数が９５％のレベルで有意である（つまりρ＜０．００５）ならば統計的に有意であると言われる。クラスターがρ＜０．００１であるように統計的に有意であれば特に好ましい。
クラスターの有意性は当該分野の任意の適切な方法を使用して決定することができる。例えば、実施例８に記載しているように、無作為な分布が、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なったアミノ酸残基を有する位置のベースライン数を表すように作製された。このような無作為な分布は、変異体ＧＰＣＲの全体にＮの位置を無作為にあてがうことによって作製され、ここでＮは真の安定化変異の数（つまり、変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なったアミノ酸残基を有する位置の数）である。これは、一を越えるモデルが使用されている任意のアラインされたモデルに対して繰り返される。これらの無作為にあてがわれたマッピングがひとたび完了すれば、異なった距離のクラスターサイズの分布（平均及び標準偏差）が決定され得る。典型的には、このような無作為分布は、少なくとも５０００、１００００又は２００００のかかる無作為の割当から作製され、平均の回りに正規に分布していると仮定される。例えば６Åに対する無作為分布及び８Åに対する無作為分布のように、このような無作為分布は与えられた設定距離に対して計算される必要があることが理解される。与えられた距離における無作為分布からクラスターサイズの平均サイズと標準偏差を決定し、与えられたサイズのクラスターの存在の有意性を標準的な統計原理を使用して計算することができる。例えば、正規分布を使用して、サイズｎのクラスターの有意性は、式：Ｚ＝（ｘ−μ／σ）に従って計算することができ、ここで、ｘはクラスターのサイズ、ｍは平均クラスターサイズ、ｓはクラスター分布の標準偏差、Ｚは有意値である。同定された位置の数は偶然期待される数に標準偏差の面から近接し、９５％のレベルで尚も有意であることが理解される。
一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置における、アミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から上述からの設定距離内に同定された位置の数が有意であることが見出されると、タンパク質の安定性を決定するのに重要である可能性が高いアミノ酸を含む統計的に有意なクラスターが同定され、つまり一又は複数のホットスポットが定まった。クラスターの中心、つまり変異体がその親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置のアミノ酸残基が、ついで第二ＧＰＣＲ上にマッピングされ、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が得られうる。例えば、一又は複数の変異が、又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する対応位置にアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から同じ設定距離内に第二ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に作製されうる。例えば、クラスターが特定の変異体ＧＰＣＲの残基ＸのＣαから１０Å内にクラスターが同定されると、第二ＧＰＣＲ内の残基Ｘに対応するアミノ酸残基のＣαから１０Å内に第二ＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異が作製されうる。よって、一つの変異体ＧＰＣＲに統計的に有意なクラスターがひとたび同定されると、それらを使用して他のＧＰＣＲにおける安定化変異を同定することができる。
一を越えるクラスターが同定された実施例８に記載されているように、多くのクラスターの中心を定め、これを半径として使用して他の配列における変異の位置を同定するために使用することができるスーパークラスターの中心を定めることは有用でありうる。
よって、本発明は、その親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを製造するための方法を含み、該方法は、
（ａ）親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有するＧＰＣＲの一又は複数の変異体の一の三次元モデルを提供するか一を越える三次元モデルを整列させること、
（ｂ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に同定すること、
（ｃ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離ｄÅ内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する任意の整列されたモデルからの他の位置の数を決定すること、
（ｄ）他の位置の数が統計的に有意なクラスターを表すかどうかを決定すること、
（ｅ）（ｄ）で同定された二以上の統計的に有意なクラスターの中心を決定すること、及び
（ｆ）二以上の統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置からｘÅの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む。
（ａ）親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有するＧＰＣＲの一又は複数の変異体の一の三次元モデルを提供するか一を越える三次元モデルを整列させること、
（ｂ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を一又は複数の変異体が有する一又は複数の位置を一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に同定すること、
（ｃ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は任意の原子から設定距離ｄÅ内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する任意の整列されたモデルからの他の位置の数を決定すること、
（ｄ）他の位置の数が統計的に有意なクラスターを表すかどうかを決定すること、
（ｅ）（ｄ）で同定された二以上の統計的に有意なクラスターの中心を決定すること、及び
（ｆ）二以上の統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置からｘÅの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること
を含む。
「二以上の統計的に有意なクラスターの中心」は、二以上のクラスターの中心に対応する三次元空間中の点を意味する。これは、各クラスターの中心点の全（ｘ、ｙ及びｚ）座標の範囲によって決定される幾何中心、又は二以上のクラスターの重心でありうる。典型的には、各場合の中心は、当該分野でよく知られているようなコンピュータソフトウェアパッケージを使用して決定される。あるいは、「二以上の統計的に有意なクラスターの中心」は、上で定義された二以上のクラスターの中心（幾何中心又は重心）に最も近いアミノ酸残基を意味する。「最も近いアミノ酸残基」とは、そのアミノ酸の任意の原子が、タンパク質中の全ての原子から中心に最も近い原子であることを意味する。
中心は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０のクラスターの中心に対応しうることが理解される。
ついで、統計的に有意なクラスターの中心を第二のＧＰＣＲ上にマッピングし、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を得るために使用できる。例えば、一又は複数の変異を、統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置からｘÅの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に作製して、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を得ることができる。
中心が特定の変異体ＧＰＣＲにおける三次元空間中の点として定義される場合、中心に対応する位置は、第二のＧＰＣＲの三次元モデルを変異体ＧＰＣＲのモデルと比較した場合に中心点にアラインする第二のＧＰＣＲ中の点である。中心が特定の変異体ＧＰＣＲにおける上記点に最も近いアミノ酸残基として定義される場合、中心に対応する位置は、二つのＧＰＣＲをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した場合に変異体ＧＰＣＲ中の上記アミノ酸残基にアラインする第二ＧＰＣＲ中のアミノ酸残基のＣＩ原子である。
距離ｘÅは、一緒にスーパークラスターを構成する個々のクラスターの全てを捕捉するのに十分な半径をもたらす統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置からの距離である。上で検討したように、距離ｘÅはＣＩ原子から又は三次元空間中の点からでありうることが理解される。
上記距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中の任意のアミノ酸残基を変異させることができることが理解される。変異は、例えば上述のように、当該分野でよく確立された技術を使用してアミノ酸配列中に作製されうる。
第二ＧＰＣＲに対する優先度は本発明の第一の態様に関して上で定義した通りで、第一ＧＰＣＲに対する言及が、統計的に有意なクラスターが工程（ｄ）で同定された変異体ＧＰＣＲに対応する。
増大された安定性についてＧＰＣＲにおいてスクリーニングされ得る数千の変異体が潜在的に存在するため、安定性に対する寄与において重要であることが既知の特定の変異を標的とすることが有利である。したがって、本発明の第一、第二、第三及び第四の態様の方法を、増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択する方法において使用してもよいことは理解されるであろう。特に、本発明の第一、第二、第三及び第四の態様の方法の実施を用いて、特定のアミノ酸残基（つまり、特定の位置のもの、一次配列の近接性の点で特定の位置に近いもの、及び三次元の近接性の点で特定の位置に近いもの）に対して、又は安定性の決定に重要な構造モチーフを定めるアミノ酸配列に対して、又は安定性の決定に重要なアミノ酸を有している可能性が有意に高いことが決定されたクラスターの一部であるアミノ酸残基に対して、変異を標的とすることができる。
したがって、１つの実施態様では、本発明の第一、第二、第三及び第四の態様の方法は、
（Ｉ）特定の立体構造を備えた第二の親ＧＰＣＲに結合するものであるリガンドを選択すること、
（ＩＩ）第二の親ＧＰＣＲの変異体又はその各々が、特定の立体構造を備える際に、同じ特定の立体構造を備えている第二の親ＧＰＣＲのリガンド結合についての安定性と比較して、選択したリガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定すること、及び
（ＩＩＩ）選択したリガンドの結合に関して第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択すること
をさらに含む。
（Ｉ）特定の立体構造を備えた第二の親ＧＰＣＲに結合するものであるリガンドを選択すること、
（ＩＩ）第二の親ＧＰＣＲの変異体又はその各々が、特定の立体構造を備える際に、同じ特定の立体構造を備えている第二の親ＧＰＣＲのリガンド結合についての安定性と比較して、選択したリガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定すること、及び
（ＩＩＩ）選択したリガンドの結合に関して第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択すること
をさらに含む。
工程（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）は、上述の本発明の第一の態様の選択方法の工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）に対応することに気付くであろう。したがって、安定性を評価するリガンド及び方法の優先度は、選択方法に関して上述しているものである。
簡便には、本発明の第一、第二、第三及び第四の態様の方法は上述のように実施され、得られた変異体の安定性が評価される。ついで、本発明の第一、第二及び第三の態様の方法を繰り返すことができ、第一目の実施で生成された一又は複数の変異体が次の回における各方法の第一工程における第一の親ＧＰＣＲになる。よって、例えば増大した安定性を有する単一の変異を同定する方法を実施し、ついで各方法の第一工程で提供される親ＧＰＣＲである、単一変異体ＧＰＣＲ中においてその変異を組合せることによって方法を繰り返しの形で使用できることが理解される。該方法は、十分な安定化変異が同定されるまで、繰り返すことができる。
例えば、本発明の第二態様の特に好ましい実施態様では、漸次的に増大するウィンドウサイズ内で第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中の一又は複数の変異が作製される。典型的には、小さいウィンドウサイズが最初に使用され、その配列サブセットから安定化変異が同定され、所望の数の変異が見出されるまで増大したウィンドウサイズで更なる残基のスキャンを続ける。よって、最初の試行では、ｉが一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する対応の一又は複数の位置であるｉプラス又はマイナス一残基のウィンドウ内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製することができる。得られた変異体の安定性を評価し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択することができる。ついで、該方法は、ｉプラス又はマイナス２残基のウィンドウ内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製する等によって、繰り返すことができる。あるいは、分析される第一のウィンドウサイズはｉプラス又はマイナス２、３又は４残基でありうる。ひとたび十分な変異が同定されるとウィンドウを更に拡張する必要はないことが理解される。
同様に、本発明の第三の態様の特に好ましい実施態様では、第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中の一又は複数の変異が、アミノ酸残基ｉのＣα原子又は任意の原子からの漸次増加する距離内に作製される。典型的には、短い距離が最初に使用され、その配列サブセットから安定化変異が同定され、所望の数の変異が見出されるまで増大した距離で更なる残基のスキャンを続ける。よって、最初の試行では、ｉが一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する対応の一又は複数の位置であるアミノ酸残基ｉのＣα原子から６Åの距離内に、又はその任意の原子から４Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製することができる。得られた変異体の安定性を評価し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択することができる。ついで、該方法は、アミノ酸残基ｉのＣα原子から８Åの距離内に、又はその任意の原子から６Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製する等によって、繰り返すことができる。ひとたび十分な変異が同定されると距離を更に増大させる必要はないことが理解される。
本発明の第五の態様は、本発明の第一、第二、第三又は第四の態様の方法によって生産されるその親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する変異体ＧＰＣＲを提供する。
本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨの何れか一に対して増大した安定性を有するのが好ましい。
本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、増大した熱安定性を有するのが好ましい。
本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、それに対するリガンドの存在下又は不在下でその親と比較して増大した熱安定性を有することが好ましい。典型的には、リガンドは、アンタゴニスト、フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト又はインバースアゴニストであり、オルソステリックでもアロステリックでもよい。上で検討したように、リガンドは抗体のようなポリペプチドでありうる。
本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、その親より少なくとも２℃安定であり、好ましくはその親より少なくとも５℃安定であり、より好ましくはその親より少なくとも８℃安定であり、更により好ましくはその親より少なくとも１０℃又は１５℃又は２０℃安定であることが好ましい。典型的には、親及び変異体受容体の熱安定性は同じ条件下で測定される。典型的には、熱安定性はＧＰＣＲが特定の立体構造にある条件下でアッセイされる。典型的には、この選択された条件はＧＰＣＲに結合するリガンドの存在下である。
本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、適切な界面活性剤に溶解され精製される場合、ドデシルマルトシドで精製されたウシロドプシンと同様な熱安定性を有していることが好ましい。変異体ＧＰＣＲは、４０℃での３０分間の加熱後にそのリガンド結合活性の少なくとも５０％を保持していることが特に好ましい。変異体ＧＰＣＲは、５５℃での３０分間の加熱後にそのリガンド結合活性の少なくとも５０％を保持していることが更に好ましい。
一実施態様では、本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、その親受容体と比較して、（ｉ）図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした以下の位置：Ｉｌｅ５５、Ｇｌｙ６７、Ａｒｇ６８、Ｖａｌ８９、Ｍｅｔ９０、Ｇｌｙ９８、Ｉｌｅ１２９、Ｓｅｒ１５１、Ｖａｌ１６０、Ｇｌｎ１９４、Ｇｌｙ１９７、Ｌｅｕ２２１、Ｔｙｒ２２７、Ａｒｇ２２９、Ｖａｌ２３０、Ａｌａ２３４、Ａｌａ２８２、Ａｓｐ３２２、Ｐｈｅ３２７、Ａｌａ３３４、Ｐｈｅ３３８、（ｉｉ）図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした以下の位置：Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｌｅｕ１６７、Ａｌａ１８４、Ａｒｇ１９９、Ａｌａ２０３、Ｌｅｕ２０８、Ｇｌｎ２１０、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｕ２１９、Ａｒｇ２２０、Ｓｅｒ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ｇｌｎ２２６、Ｌｙｓ２２７、Ｈｉｓ２３０、Ｌｅｕ２４１、Ｐｒｏ２６０、Ｓｅｒ２６３、Ｌｅｕ２６７、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２７９、Ａｓｎ２８４、Ｇｌｎ３１１、Ｐｒｏ３１３、Ｌｙｓ３１５、（ｉｉｉ）図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けした以下の位置：Ａｌａ６９、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ａｌａ８６、Ａｌａ９０、Ｓｅｒ１００、Ｈｉｓ１０３、Ｓｅｒ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｌｅｕ１１１、Ａｓｐ１１３、Ｉｌｅ１１６、Ａｌａ１２０、Ａｓｐ１３９、Ｐｈｅ１４７、Ａｌａ１５５、Ｖａｌ１６５、Ｇｌｕ１６６、Ｌｙｓ１７６、Ａｌａ１７７、Ｔｈｒ１７９、Ｍｅｔ１８１、Ｓｅｒ１８２、Ａｒｇ１８３、Ｐｈｅ１８９、Ｌｅｕ２０５、Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｙ２０９、Ｇｌｙ２１５、Ｖａｌ２２９、Ｍｅｔ２５０、Ｉｌｅ２５３、Ｌｅｕ２５６、Ｉｌｅ２６０、Ａｓｎ２６２、Ｖａｌ２６８、Ａｓｎ２７０、Ｔｈｒ２７９、Ｍｅｔ２９３、Ｔｈｒ２９４、Ｇｌｙ３０６、Ｌｅｕ３０８、Ｖａｌ３０９、Ｌｅｕ３１０、Ｖａｌ３１３、Ｐｈｅ３４２、Ａｓｐ３４５、Ｔｙｒ３４９、Ｔｙｒ３５１、Ａｌａ３５６、Ｐｈｅ３５８、Ｖａｌ３６０、Ｓｅｒ３６２、Ａｓｎ３７０、Ｓｅｒ３７３、Ｐｈｅ３８０、Ａｌａ３８５、Ｃｙｓ３８６、Ｐｒｏ３８９、Ｇｌｙ３９０、Ｔｒｐ３９１、Ａｒｇ３９２、Ｈｉｓ３９３、Ａｒｇ３９５、Ｌｙｓ３９７、Ｐｒｏ３９９、並びに（ｉｖ）図１７に記載のムスカリン受容体の番号付けした以下の位置：Ｌｅｕ６５、Ｍｅｔ１４５、Ｌｅｕ３９９、Ｉｌｅ３８３及びＭｅｔ３８４の何れか一又は複数に対応する位置に少なくとも１個の異なるアミノ酸を有する変異体ＧＰＣＲである。
図１７に示すシチメンチョウβ１ＡＲ、ヒトアデノシン受容体、ラットニューロテンシン受容体、及びヒトムスカリン受容体アミノ酸配列のアラインメントは、７０のうちの１１例において、２つの配列が同じ位置、すなわち、図１７に記載のヒトβ２ＡＲの番号付けした以下の位置：Ａｌａ５９、Ｖａｌ８１、Ｓｅｒ１４３、Ｌｙｓ１４７、Ｖａｌ１５２、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２２２、Ａｌａ２２６、Ａｌａ２７１、Ｌｅｕ２７５及びＶａｌ３１７に変異を含有することを示す。したがって、好ましい実施態様では、本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、親受容体と比較して、これらの位置の何れか一又は複数に異なるアミノ酸を有するものである。
一実施態様では、本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、変異体βアドレナリン受容体である。例えば、変異体β−アドレナリン受容体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有していてもよく、前記変異体受容体は、親受容体と比較して、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした以下の位置：Ｉｌｅ５５、Ｇｌｙ６７、Ａｒｇ６８、Ｖａｌ８９、Ｍｅｔ９０、Ｇｌｙ９８、Ｉｌｅ１２９、Ｓｅｒ１５１、Ｖａｌ１６０、Ｇｌｎ１９４、Ｇｌｙ１９７、Ｌｅｕ２２１、Ｔｙｒ２２７、Ａｒｇ２２９、Ｖａｌ２３０、Ａｌａ２３４、Ａｌａ２８２、Ａｓｐ３２２、Ｐｈｅ３２７、Ａｌａ３３４、Ｐｈｅ３３８のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。
一実施態様では、本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは、変異体アデノシン受容体である。例えば、変異体アデノシン受容体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有していてもよく、前記変異体受容体は、親受容体と比較して、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした以下の位置：Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｌｅｕ１６７、Ａｌａ１８４、Ａｒｇ１９９、Ａｌａ２０３、Ｌｅｕ２０８、Ｇｌｎ２１０、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｕ２１９、Ａｒｇ２２０、Ｓｅｒ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ｇｌｎ２２６、Ｌｙｓ２２７、Ｈｉｓ２３０、Ｌｅｕ２４１、Ｐｒｏ２６０、Ｓｅｒ２６３、Ｌｅｕ２６７、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２７９、Ａｓｎ２８４、Ｇｌｎ３１１、Ｐｒｏ３１３、Ｌｙｓ３１５のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。
一実施態様では、本発明の第五態様の変異体ＧＰＣＲは変異体ニューロテンシン受容体である。例えば、変異体ニューロテンシン受容体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記変異体受容体は、親受容体と比較して、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けした以下の位置：Ａｌａ６９、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ａｌａ８６、Ａｌａ９０、Ｓｅｒ１００、Ｈｉｓ１０３、Ｓｅｒ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｌｅｕ１１１、Ａｓｐ１１３、Ｉｌｅ１１６、Ａｌａ１２０、Ａｓｐ１３９、Ｐｈｅ１４７、Ａｌａ１５５、Ｖａｌ１６５、Ｇｌｕ１６６、Ｌｙｓ１７６、Ａｌａ１７７、Ｔｈｒ１７９、Ｍｅｔ１８１、Ｓｅｒ１８２、Ａｒｇ１８３、Ｐｈｅ１８９、Ｌｅｕ２０５、Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｙ２０９、Ｇｌｙ２１５、Ｖａｌ２２９、Ｍｅｔ２５０、Ｉｌｅ２５３、Ｌｅｕ２５６、Ｉｌｅ２６０、Ａｓｎ２６２、Ｖａｌ２６８、Ａｓｎ２７０、Ｔｈｒ２７９、Ｍｅｔ２９３、Ｔｈｒ２９４、Ｇｌｙ３０６、Ｌｅｕ３０８、Ｖａｌ３０９、Ｌｅｕ３１０、Ｖａｌ３１３、Ｐｈｅ ３４２、Ａｓｐ３４５、Ｔｙｒ３４９、Ｔｙｒ３５１、Ａｌａ３５６、Ｐｈｅ３５８、Ｖａｌ３６０、Ｓｅｒ３６２、Ａｓｎ３７０、Ｓｅｒ３７３、Ｐｈｅ３８０、Ａｌａ３８５、Ｃｙｓ３８６、Ｐｒｏ３８９、Ｇｌｙ３９０、Ｔｒｐ３９１、Ａｒｇ３９２、Ｈｉｓ３９３、Ａｒｇ３９５、Ｌｙｓ３９７、Ｐｒｏ３９９のいずれかに対応する位置で異なるアミノ酸を有する。
一実施態様では、本発明の第十態様の変異体ＧＰＣＲは、変異体ムスカリン受容体である。例えば、変異体ムスカリン受容体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記変異体受容体は、図１７に記載のヒトムスカリン受容体の番号付けした以下の位置：Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 及びMet 384のいずれかに対応する位置において異なるアミノ酸を有する。
本発明のＧＰＣＲ変異体は、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、及び極端なｐＨのいずれか１つに対する増大した安定性を有することが好ましい。
本発明のＧＰＣＲ変異体が増大した熱安定性を有することが好ましい。
β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体、及びニューロテンシン受容体を含む本発明のＧＰＣＲ変異体が、それらのリガンドの存在下又は不在下に、親と比較して増大した熱安定性を有することが好ましい。典型的には、リガンドは、アンタゴニスト、完全なアゴニスト、部分的アゴニスト、又は逆アゴニストであり、オルトステリック又はアロステリックのいずれかである。上述のように、リガンドは、抗体などのポリペプチドであってよい。
本発明のＧＰＣＲ変異体、例えば、β−アドレナリン受容体変異体又は変異体アデノシン受容体又はニューロテンシン受容体変異体が、親よりも少なくとも２℃、好ましくは少なくとも５℃、より好ましくは少なくとも８℃、さらに好ましくは少なくとも１０℃又は１５℃又は２０℃安定であることが好ましい。典型的には、親受容体及び受容体変異体の熱安定性は、同じ条件下で測定される。典型的には、熱安定性は、ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている条件下でアッセイされる。典型的には、当該選択される条件は、ＧＰＣＲに結合するリガンドの存在下である。
本発明のＧＰＣＲ変異体が、可溶化され、且つ、適切な界面活性剤中で精製される際に、ドデシルマルトシド中で精製されたウシロドプシンと類似の熱安定性を有することが好ましい。ＧＰＣＲ変異体が、３０分間に亘る４０℃の加熱後に少なくとも５０％のリガンド結合活性を保持することが、特に好ましい。ＧＰＣＲ変異体が、３０分間に亘る５５℃の加熱後に少なくとも５０％のリガンド結合活性を保持することが、さらに好ましい。
本明細書に開示するＧＰＣＲ変異体は、結晶化試験に関して有用であり、且つ、薬剤探索プログラムにおいて有用である。それらは、例えば表面プラズモン共鳴又は蛍光に基づく技術による、受容体／リガンド動態及び熱動力学的パラメータの生物物理学的測定において使用されてよい。それらは、リガンド結合スクリーニングに使用してもよく、ハイスループットスクリーニングにおいて又はバイオセンサーチップとして使用するための固体表面に結合させてよい。ＧＰＣＲ変異体を含有するバイオセンサーチップを使用して、分子、特に生体分子を検出してよい。
本発明は、本発明の第一又は第二態様の変異体ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドも含む。特に、ポリヌクレオチドは、本発明のβ−アドレナリン受容体変異体又は変異体アデノシン受容体又はニューロテンシン受容体変異体をコードするものを含む。前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。典型的には、前記ＧＰＣＲ変異体を発現するために使用しうるベクターなどのベクターに含まれる。適切なベクターは、細菌又は哺乳動物又は昆虫細胞において発現を可能にする及び／又は増殖するものである。
本発明は、変異体ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む細菌又は真核生物細胞などの宿主細胞も含む。適切な細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞及び昆虫細胞を含む。
本発明を、以下の図面及び実施例を参照してより詳細に記載する。
実施例１：界面活性剤耐性形態におけるβ−アドレナリン受容体の立体構造安定化
要約
ヒトゲノムによってコードされる５００超の非嗅覚Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が存在し、その多くが潜在的な治療標的であると予測されているが、ファミリーの全てを代表するものとしてウシロドプシンのみの構造が利用可能である。ＧＰＣＲ構造決定における進歩の欠落には多数の理由が存在するが、本発明者は、これらの受容体の界面活性剤安定性を改善すること、及び同時にそれらを１つの好ましい立体構造に固定化することが、結晶化の可能性を大幅に改善するであろうと仮説を立てた。ＧＰＣＲ、すなわちβ−アドレアンリン受容体の界面活性剤可溶化熱安定化変異体の単離のための一般的な戦略は、アラニンスキャニング変異誘発、それに続く受容体安定性のアッセイに基づいて開発した。試験した３１８の変異体のうち、１５が安定性における測定可能な増大を示した。最初の変異部位の各々におけるアミノ酸の最適化の後に、最適に安定化した受容体を特定の変異を組み合わせることによって構築した。最も安定な受容体変異体であるβＡＲ−ｍ２３は、６つの点変異を有し、天然のタンパク質よりも結合したアンタゴニストの存在下で２１℃高いＴｍを生じさせ、βＡＲｍ２３はウシロドプシンと同程度に安定であった。加えて、βＡＲ−ｍ２３は広範な界面活性剤において顕著により安定で、結晶化に理想的であり、リガンドの不在下においてアンタゴニスト立体構造で好適に存在した。
要約
ヒトゲノムによってコードされる５００超の非嗅覚Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が存在し、その多くが潜在的な治療標的であると予測されているが、ファミリーの全てを代表するものとしてウシロドプシンのみの構造が利用可能である。ＧＰＣＲ構造決定における進歩の欠落には多数の理由が存在するが、本発明者は、これらの受容体の界面活性剤安定性を改善すること、及び同時にそれらを１つの好ましい立体構造に固定化することが、結晶化の可能性を大幅に改善するであろうと仮説を立てた。ＧＰＣＲ、すなわちβ−アドレアンリン受容体の界面活性剤可溶化熱安定化変異体の単離のための一般的な戦略は、アラニンスキャニング変異誘発、それに続く受容体安定性のアッセイに基づいて開発した。試験した３１８の変異体のうち、１５が安定性における測定可能な増大を示した。最初の変異部位の各々におけるアミノ酸の最適化の後に、最適に安定化した受容体を特定の変異を組み合わせることによって構築した。最も安定な受容体変異体であるβＡＲ−ｍ２３は、６つの点変異を有し、天然のタンパク質よりも結合したアンタゴニストの存在下で２１℃高いＴｍを生じさせ、βＡＲｍ２３はウシロドプシンと同程度に安定であった。加えて、βＡＲ−ｍ２３は広範な界面活性剤において顕著により安定で、結晶化に理想的であり、リガンドの不在下においてアンタゴニスト立体構造で好適に存在した。
結果
β１アドレナリン受容体の熱安定性を増大する単一変異の選択
シチメンチョウ赤血球由来のβＡＲはよく特性決定されており、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞において高レベルで発現されるため、構造研究に理想的な対象である（非特許文献１０、１１）。βＡＲの最も良好な過剰発現は、残基３４−４２４を含有する受容体の切断型を使用して得られ（βＡＲ３４−４２４）（非特許文献９）、これが本研究の出発点として使用された。アラニンスキャニング変異誘発を使用して、変異した際に、受容体の熱安定性を変化させるβＡＲ３４−４２４におけるアミノ酸を規定した；アラニンが配列中に存在する場合には、ロイシン残基に変異させた。全部で３１８の変異をアミノ酸残基３７−３６９、７つの膜貫通ドメインを含む領域、及びＣ末端の２３アミノ酸残基に作製した；１５アミノ酸残基における変異は、ＤＮＡ鋳型における強力な二次構造によって得られなかった。各変異体の配列決定をして所望の変異のみが存在することを確認した後に、受容体を大腸菌において機能的に発現させ、安定性についてアッセイした。
β１アドレナリン受容体の熱安定性を増大する単一変異の選択
シチメンチョウ赤血球由来のβＡＲはよく特性決定されており、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞において高レベルで発現されるため、構造研究に理想的な対象である（非特許文献１０、１１）。βＡＲの最も良好な過剰発現は、残基３４−４２４を含有する受容体の切断型を使用して得られ（βＡＲ３４−４２４）（非特許文献９）、これが本研究の出発点として使用された。アラニンスキャニング変異誘発を使用して、変異した際に、受容体の熱安定性を変化させるβＡＲ３４−４２４におけるアミノ酸を規定した；アラニンが配列中に存在する場合には、ロイシン残基に変異させた。全部で３１８の変異をアミノ酸残基３７−３６９、７つの膜貫通ドメインを含む領域、及びＣ末端の２３アミノ酸残基に作製した；１５アミノ酸残基における変異は、ＤＮＡ鋳型における強力な二次構造によって得られなかった。各変異体の配列決定をして所望の変異のみが存在することを確認した後に、受容体を大腸菌において機能的に発現させ、安定性についてアッセイした。
熱安定性についてのアッセイは、受容体を３０分間に亘って３２℃で加熱し、氷上で反応を停止させ、次いで、アンタゴニストである［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロールを使用して放射リガンド結合アッセイを実施して未処理の対象と比較して残存する機能的なβＡＲ３４−４２４分子の数を測定することによって、未精製界面活性剤可溶化受容体に対して実施した。非変異βＡＲ３４−４２４をアッセイ前に３０分間に亘って３２℃で加熱することで、未加熱の対照の約５０％まで結合が低減した（図７）；変異体についての全てのデータは、実施した全てのアッセイにおいて非変異βＡＲ３４−４２４を対照として含めることによって標準化した。一巡目のスクリーニングにおいて、１８の変異が安定性における明らかな増大を示し、加熱後に７５％超のアゴニスト結合を保持し、天然のβＡＲ３４−４２４の少なくとも５０％のレベルで大腸菌において発現した。これらの変異の更なる安定性の増大の可能性の観点から、１８残基の各々を２−５の異なるサイズ又は電荷の代替的なアミノ酸残基に変異させた（図１）。これら１８の変異体のうち、１２が更なる変化によって改善し、５が他のアミノ酸が存在する場合に更に良好な熱安定性を有し、第一のスクリーニングに由来する１つの変異が擬陽性であったことが明らかになった。加えて、アラニンへの変異では安定化されなかった３つの残基（Ｖ８９、Ｓ１５１、Ｌ２２１）を広範な他のアミノ酸残基に変異させた；アラニンに変異させた際に熱安定性に影響しなかった２つの位置は、他の変化によっても影響を受けなかった。対照的に、Ｖ８９はアラニンに変異させた際により低い熱安定性を示したが、Ｌｅｕに変異させた際は熱安定性が増大した。かくして、最初のアラニンスキャニングは、任意の所定の位置について試験したもののうち最も良好なアミノ酸残基の三分の二を示した。
変異された際に熱安定性の最も良好な増大を示した１６のアミノ酸残基の各々について予測される位置及び環境を、構造が既知のロドプシンの配列とβＡＲ配列とのアラインメントによって決定した（図２）。これらの残基の１４は、膜貫通α−ヘリックスに存在すると予測され、そのうち５つの残基は脂質に向いていると予測され、４つは深く埋め込まれており、残部の残基はヘリックスの間の界面に存在すると予測された。連続的なアミノ酸であるG６７及びＲ６８（ロドプシンにおけるＶ６３及びＱ６４）またはヘリックス５におけるクラスターＹ２２７、Ｒ２２９、Ｖ２３０、及びＡ２３４（ロドプシンにおけるＹ２２３、Ｑ２２５、Ｌ２２６、及びＶ２３０）などの、これらの残基の幾つかは、βＡＲ構造において互いに相互作用していると予測されるだろう。βＡＲ中で相互作用し得る他のアミノ酸残基は、外側のループ２のＱ１９４Ａ及び外側のループ３のＤ３２２Ａであった（ロドプシンにおけるＧ１８２及びＰ２８５の各々）。
個々の変異の各々がβＡＲ３４−４２４に与えた安定性の増大は、各変異体のＴｍを測定することによって決定した（結果示さず）；ここでＴｍは３０分間に亘って受容体を加熱した後の機能的な結合における５０％の低減を与える温度である。８℃までＴｍを増大させたＭ９０Ａ及びＹ２２７Ａを除いて、各変異は１から３℃でβＡＲ３４−４２４のＴｍを増大させた。
最適な安定受容体を作製するための変異の組み合わせ
最初に、βＡＲの一次アミノ酸配列において互いに隣接する、熱安定性を改善した変異を組み合わせた。Ｇ６７Ａ及びＲ６８Ｓという変異又はヘリックス５の末端の変異の異なる組み合わせ（Ｙ２２７Ａ、Ｒ２２９Ｑ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌ）を含有する構築物を発現させて、アッセイした；Ｔｍ値（結果示さず）は、βＡＲ３４−４２４のＴｍよりも１から３℃のみ高く、１つの変異は実際には僅かにより安定でないものであり、一次アミノ酸配列において互いに隣接する変異の組み合わせは大きく熱安定性を改善するものではないことが示唆された。続いて、構造において互いに離れていると予測された変異を組み合わせた。各種のプライマー混合物を使用してＰＣＲ反応を実施し、無作為な様式で５つの異なる変異を組み合わせ、次いで、熱安定性について試験した（表１）。これらの組み合わせの最も良好なものは、βＡＲ３４−４２４のＴｍと比較して１０℃より大きくＴｍを増大させた。幾つかの場合では、個々の変異の連続的な包含でＴｍに対しては相加的な効果が明らかに存在した。これは一連の３つの変異体、ｍ４−１、ｍ４−７、及びｍ４−２において認められ、ｍ４−１に対するＶ２３０Ａの付加はＴｍを２℃増大させ、ｍ４−７におけるＤ３３２Ａという付加的な変異はＴｍをさらに３℃増大させる。Ｙ２２７Ａ及びＭ９０Ａを含有する変異体の全ては、１０℃以上のＴｍの増大を示した。これらの２つの変異が共に、βＡＲ３４−４２４のＴｍを１３℃まで増大させたが（ｍ７−５）、アンタゴニスト結合全体はβＡＲ３４−４２４の５０％であり、これらの変異体の発現低下が示唆された。ｍ７−５に対するＦ３３８Ｍの添加は熱安定性を増大しなかったが、大腸菌における機能的な発現のレベルを増大させた。
最初に、βＡＲの一次アミノ酸配列において互いに隣接する、熱安定性を改善した変異を組み合わせた。Ｇ６７Ａ及びＲ６８Ｓという変異又はヘリックス５の末端の変異の異なる組み合わせ（Ｙ２２７Ａ、Ｒ２２９Ｑ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌ）を含有する構築物を発現させて、アッセイした；Ｔｍ値（結果示さず）は、βＡＲ３４−４２４のＴｍよりも１から３℃のみ高く、１つの変異は実際には僅かにより安定でないものであり、一次アミノ酸配列において互いに隣接する変異の組み合わせは大きく熱安定性を改善するものではないことが示唆された。続いて、構造において互いに離れていると予測された変異を組み合わせた。各種のプライマー混合物を使用してＰＣＲ反応を実施し、無作為な様式で５つの異なる変異を組み合わせ、次いで、熱安定性について試験した（表１）。これらの組み合わせの最も良好なものは、βＡＲ３４−４２４のＴｍと比較して１０℃より大きくＴｍを増大させた。幾つかの場合では、個々の変異の連続的な包含でＴｍに対しては相加的な効果が明らかに存在した。これは一連の３つの変異体、ｍ４−１、ｍ４−７、及びｍ４−２において認められ、ｍ４−１に対するＶ２３０Ａの付加はＴｍを２℃増大させ、ｍ４−７におけるＤ３３２Ａという付加的な変異はＴｍをさらに３℃増大させる。Ｙ２２７Ａ及びＭ９０Ａを含有する変異体の全ては、１０℃以上のＴｍの増大を示した。これらの２つの変異が共に、βＡＲ３４−４２４のＴｍを１３℃まで増大させたが（ｍ７−５）、アンタゴニスト結合全体はβＡＲ３４−４２４の５０％であり、これらの変異体の発現低下が示唆された。ｍ７−５に対するＦ３３８Ｍの添加は熱安定性を増大しなかったが、大腸菌における機能的な発現のレベルを増大させた。
大腸菌において依然として高レベルで発現した、最も熱安定である得られた変異体は、ｍ６−１０、ｍ７−７、及びｍ１０−８であった。これらの変異体は合計して全部で１０の異なる変異を含有し、８つの変異はそれらの変異体の少なくとも２種に存在していた。ｍ１０−８を鋳型として使用し、ｍ６−１０及びｍ７−７に存在する変異を添加又は置換することによって、変異誘発の二順目を実施した（図３）；これらの変異の幾つかはβＡＲの一次アミノ酸配列において非常に近接していたため、上述のように付加的でなかったが、多数の変異はＴｍをさらに改善した（表２）。例えば、ｍ１０−８における２つの変異を交換して、ｍ１８を作製すると、４９．６℃までＴｍを上昇させ、Ａ２８２Ｌを添加してｍ２３を作製すると、Ｔｍをさらに３℃増大させ５２．８℃とした。これによって、これまでで最も熱安定であるβＡＲ３４−４２４が生産され、βＡＲ−ｍ２３と称する。
βＡＲ３４−４２４変異体を開発するために使用する熱安定性アッセイは、アンタゴニストの不在下において受容体を加熱することによって実施したが、結合したリガンドが受容体を安定化することがよく知られている。したがって、βＡＲ３４−４２４及びβＡＲ−ｍ２３についての安定性アッセイは、加熱工程の間に受容体に結合したアンタゴニストを用いて繰り返した（図４）。予測されるように、インキュベーションの間に結合したアンタゴニストを含有する受容体のＴｍは、アンタゴニストの不在下における受容体のＴｍよりも高いものであった。βＡＲ３４−４２４については、結合したアンタゴニストを用いて６℃高く、βＡＲ−ｍ２３については、Ｔｍが２℃増えて５５℃となった；アンタゴニストが結合した際にβＡＲ−ｍ２３について観察された熱安定性のより小さな増大は、当該受容体は既に、βＡＲ３４−４２４よりも、アンタゴニストが結合した状態に類似するより安定な立体構造にあることを示唆する（下記参照）。アンタゴニストが結合したβＡＲ−ｍ２３のＴｍは、２つの独立した研究所によってその構造が解析された（非特許文献１２及び１３）、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）中の暗状態のロドプシンのＴｍに非常に似ている（非特許文献１２）。このことは、βＡＲ−ｍ２３が結晶化について十分に安定であることを示唆する。
βＡＲ−ｍ２３の特性決定
６種の変異の効果を同定するためにβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ３４−４２４について測定した３種の特徴的な活性は、アンタゴニスト結合の親和性、アゴニスト結合の相対的な効果、βＡＲ−ｍ２３のＧタンパク質への結合能であった。アンタゴニストである［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（図８）を使用した膜への飽和結合実験は、βＡＲ−ｍ２３に対する結合の親和性（ＫＤ６．５±０．２ｎＭ，ｎ＝２）がβＡＲ３４−４２４（ＫＤ２．８±０．１ｎＭ，ｎ＝２）よりも僅かに低いことを示し、アンタゴニスト結合立体構造ではβＡＲｍ２３の構造に大きなゆらぎが存在することを示唆している。このことは、βＡＲ−ｍ２３における変異のいずれも、リガンド結合に関与すると解されているアミノ酸に相当するものではないことと一致する。アンタゴニスト結合と対照的に、βＡＲ−ｍ２３によるアゴニスト結合の効果は、βＡＲ３４−４２４よりも３桁弱いものである（図５）。アゴニストであるイソプレナリンの有効性は、天然のアゴニストであるノルエピネフリンよりも、βＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ３４−４２４において一貫して低く、当該２つの受容体のアゴニスト結合立体構造は類似している可能性を示唆する。しかしながら、βＡＲ３４−４２４と比較した際のβＡＲ−ｍ２３におけるアゴニストの効力における大きな低減は、βＡＲ−ｍ２３における６種の変異が、アンタゴニストが結合した立体構造に選択的に固定化されていることを示唆する。立体構造の予測からすると、このことは、回折に使用し得る品質の結晶の生産のために立体構造が均一なタンパク質集団を有することが重要であるため、熱安定性に予期せぬ利点を加える。
６種の変異の効果を同定するためにβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ３４−４２４について測定した３種の特徴的な活性は、アンタゴニスト結合の親和性、アゴニスト結合の相対的な効果、βＡＲ−ｍ２３のＧタンパク質への結合能であった。アンタゴニストである［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（図８）を使用した膜への飽和結合実験は、βＡＲ−ｍ２３に対する結合の親和性（ＫＤ６．５±０．２ｎＭ，ｎ＝２）がβＡＲ３４−４２４（ＫＤ２．８±０．１ｎＭ，ｎ＝２）よりも僅かに低いことを示し、アンタゴニスト結合立体構造ではβＡＲｍ２３の構造に大きなゆらぎが存在することを示唆している。このことは、βＡＲ−ｍ２３における変異のいずれも、リガンド結合に関与すると解されているアミノ酸に相当するものではないことと一致する。アンタゴニスト結合と対照的に、βＡＲ−ｍ２３によるアゴニスト結合の効果は、βＡＲ３４−４２４よりも３桁弱いものである（図５）。アゴニストであるイソプレナリンの有効性は、天然のアゴニストであるノルエピネフリンよりも、βＡＲ−ｍ２３及びβＡＲ３４−４２４において一貫して低く、当該２つの受容体のアゴニスト結合立体構造は類似している可能性を示唆する。しかしながら、βＡＲ３４−４２４と比較した際のβＡＲ−ｍ２３におけるアゴニストの効力における大きな低減は、βＡＲ−ｍ２３における６種の変異が、アンタゴニストが結合した立体構造に選択的に固定化されていることを示唆する。立体構造の予測からすると、このことは、回折に使用し得る品質の結晶の生産のために立体構造が均一なタンパク質集団を有することが重要であるため、熱安定性に予期せぬ利点を加える。
βＡＲ−ｍ２３に用いた熱安定性アッセイの全ては、ＤＤＭに可溶化した受容体に対して実施した。熱安定化プロセスの目的は、ＤＤＭのみではなく各種の異なる界面活性剤中で安定である結晶学的に理想的な受容体を生産することであった。したがって、本発明者は、内在性膜タンパク質の結晶化において選択的に使用される小さな界面活性剤に集中して、各種の異なる界面活性剤中においてβＡＲ−ｍ２３及びβＡＲの安定性を試験した。
βＡＲ−ｍ２３又はβＡＲ３４−４２４を発現する大腸菌から調製した膜をＤＤＭ中で可溶化し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースに結合させ、次いで、ＤＤＭ、デシルマルトシド（ＤＭ）、オクチルグルコシド（ＯＧ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）、又はノニルグルコシド（ＮＧ）のいずれかを用いて洗浄した。安定性アッセイを異なる界面活性剤の各々中の受容体に対して実施した（図６）。βＡＲ３４−４２４はＤＤＭ及びＤＭにおいてのみ安定であり、ＯＧ、ＮＧ、又はＬＤＡＯで洗浄した樹脂から溶出した活性受容体は存在しなかった。対照的に、機能的なβＡＲ−ｍ２３は全ての界面活性剤中に依然として存在し、Ｔｍを測定し得た。予測されるように、より小さな界面活性剤が、ＤＤＭ（Ｔｍ５２℃）又はＤＭ（Ｔｍ４８℃）のいずれかよりも顕著に変性させ、２５℃（ＮＧ）、２３℃（ＬＤＡＯ）、及び１７℃（ＯＧ）のＴｍであった。受容体をＤＤＭ又はＤＭのいずれに可溶化したかにかかわらず、βＡＲ−２３及びβＡＲ３４−４２４の間のＴｍの差は約２０℃である；したがって、予測されるＴｍは約５℃であり、かくして、精製に使用した条件下で受容体が迅速に不活性化したため、活性βＡＲ３４−４２４はＮＧ中においてさえ認められないことは驚くべきことではない。厳しさを増している界面活性剤中における安定性に関して選択するよりも利用するのがかなり単純であるため、βＡＲ−ｍ２３の生産に使用した所定の戦略は、熱安定性に基づいて意図的に選択した。しかしながら、βＡＲ３４−４２４の熱安定性の増大は、内在性膜タンパク質の結晶化に理想的な小さな界面活性剤に対する耐性の増大をもたらす。
変異体ＧＰＣＲの結晶化
シチメンチョウβ−アドレナリン受容体の幾つかの異なる構築物を結晶化する以前の試みは失敗した。各種の条件で実験したにもかかわらず、天然の配列並びに幾つかの切断型及びループ欠失構築物の双方の使用によっては、長年に亘って、結晶が得られなかった。
シチメンチョウβ−アドレナリン受容体の幾つかの異なる構築物を結晶化する以前の試みは失敗した。各種の条件で実験したにもかかわらず、天然の配列並びに幾つかの切断型及びループ欠失構築物の双方の使用によっては、長年に亘って、結晶が得られなかった。
しかしながら、βＡＲ−ｍ２３に由来する安定化変異を前記構築物に転用すると、幾つかの異なる結晶が、異なる界面活性剤及び異なる条件において得られた。
これまで最も研究された結晶は、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞において発現させた精製β−３６構築物（以下の変化：点変異Ｃ１１６Ｌ及びＣ３５８Ａを含有するシチメンチョウβ受容体のアミノ酸残基３４−３６７；ｍ２３の６つの熱安定化点変異；配列ＡＳＫＲＫを用いたアミノ酸残基２４４−２７８の置換；Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ）を使用して、当該受容体を界面活性剤であるオクチルチオグルコシドに移した後に得られた。使用した沈殿剤は、ＰＥＧ６００又はＰＥＧ１０００であり、得られた結晶は細長いプレート状であった。
実験を実施して、安定化受容体を使用した結晶化条件を規定して、本来の非安定化構築物を使用して結晶が得ることが可能であったか否かを確認した。同様に又はおそらく非常に小さな結晶を得ることが可能であるかもしれないが、実際には、「野生型」（すなわち、変異誘発させる出発構造）は結晶を生じなかった。
前記結晶は、空間群Ｃ２及び良好に回折するプレート状であり、使用した凍結条件に依存してセル寸法が変化する。
一般的には、ＧＰＣＲが安定化されると、各種のよく知られた各種の構造決定技術に供してよい。最も一般的な膜タンパク質結晶化技術は、多くの場合には市販の機械装置を使用して設定した数千の結晶化条件をまず使用する（非特許文献２２）、蒸気拡散（非特許文献２０及び２１）によるものである。しかしながら、蒸気拡散によって形成される結晶は小さく且つ不規則である場合があるため、次いで付加的な技術を使用してよい。１つの技術は、タンパク質表面の立体構造エピトープに特異的に結合する抗体と膜タンパク質との共結晶化（蒸気拡散による）を伴う（非特許文献２３及び２４）；このことによって、タンパク質の親水性表面を増やし、且つ、強力な結晶接触を形成し得る。第二の代替的な方法は、脂質立方相又は脂質中間相のいずれかと一般的に称される結晶化マトリックスを使用することであり（非特許文献２５及び２６）、機械的なプラットホームにも開発されている（非特許文献２７）。このことは、小さな親水性表面のみを有するタンパク質、例えば、細菌ロドプシンの高品質な結晶の生産に関して成功を確実なものとする（非特許文献２８）。膜タンパク質構造は、電子線結晶学によって高分解能で測定されてもよい（非特許文献２９）。
アラニンスキャニング変異誘発及び熱安定変異体の選択の併用によるβＡＲ３４−４２４からβＡＲ−ｍ２３への進化は、結晶学に理想的なＧＰＣＲをもたらした。βＡＲ−ｍ２３のＴｍは、アンタゴニストの存在下においてβＡＲ３４−４２４よりも２１℃高く、βＡＲ−ｍ２３はロドプシンと同様の安定性を有している。βＡＲ−ｍ２３のＴｍの増大は、βＡＲ３４−４２４を不活化する各種の小さな界面活性剤における安定性の増大をもたらす。加えて、使用した選択戦略は、受容体の立体構造の集団は野生型のβＡＲ３４−４２４よりも均一であるため、結晶を得る可能性を改善する選択的にアンタゴニストが結合した立体構造にある受容体をもたらした。かくして、本発明者は、単独の選択法において立体構造を安定化する方法を完成した。
本発明者が導入した特定の変異が受容体の熱安定化をもたらす原因は全く明らかではない。ロドプシンにおける対応する位置は、変異したアミノ酸残基は脂質二重層を向いているか、受容体の中心を向いているか、又は２つの環境の間の界面に存在する。複雑な可溶性タンパク質の熱安定化を理解する試みにおける困難性を考慮すると（非特許文献１５）、膜タンパク質はより容易に理解されるようではない；本発明者は、変異した際に熱安定性をもたらすβＡＲにおけるアミノ酸残基に特定のパターンは存在しないことを確認した。しかしながら、生産した約５％の変異体は天然の受容体より安定であったため、アラニンスキャニング変異誘発は、迅速に熱安定性変異体を同定する効率的な戦略であることが示される。
βＡＲ−ｍ２３の生産に本発明者が使用した手法は、界面活性剤可溶化形態における活性を検出するための簡便なアッセイを有する任意の膜タンパク質に等しく適用可能である。本発明者は、最も簡便な主要なパラメータとして、温度の関数としての安定性を選択したが、該手法は、主に安定性、例えば、厳しい界面活性剤、極端なｐＨ、又はカオトロピック塩の存在下における安定性についての試験に容易に拡張可能である。各種のヒト受容体、チャンネル、及びトランスポーターの立体構造安定化は、それらを結晶学により適したものとし、既に結晶化されている膜タンパク質についての分解能も改善するであろう。立体構造安定化が、膜タンパク質結晶化を、現在よりも迅速に成功する可能性が大きい、より扱いやすい問題とすることを可能にすることが望まれる。これによって、製薬業界におけるヒト膜タンパク質の日常的な結晶化を可能にし、薬剤開発への価値のある立体構造の洞察を可能にするはずである。
方法
材料
シチメンチョウ由来の切断型のβ１アドレナリン受容体（βＡＲ３４−４２４）（非特許文献９）は、Ｄｒ Ｔｏｎｙ Ｗａｒｎｅ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって快く提供された。３４−４２４残基をコードするβＡＲ構築物は、Ｃ１１６Ｌ変異を含有して発現を改善し（非特許文献１１）、精製のために１０ヒスチジンのＣ末端タグを含有している。１−［４，６−プロピル−３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［３Ｈ］−ＤＨＡ）はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供され、（＋）Ｌ−ノルエピネフリン酒石酸水素塩、（−）イソプレナリン塩酸、（−）アルプレノロール酒石酸塩、及びｓ−プロプラノロール塩酸はＳｉｇｍａからのものである。
材料
シチメンチョウ由来の切断型のβ１アドレナリン受容体（βＡＲ３４−４２４）（非特許文献９）は、Ｄｒ Ｔｏｎｙ Ｗａｒｎｅ（ＭＲＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）によって快く提供された。３４−４２４残基をコードするβＡＲ構築物は、Ｃ１１６Ｌ変異を含有して発現を改善し（非特許文献１１）、精製のために１０ヒスチジンのＣ末端タグを含有している。１−［４，６−プロピル−３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（［３Ｈ］−ＤＨＡ）はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供され、（＋）Ｌ−ノルエピネフリン酒石酸水素塩、（−）イソプレナリン塩酸、（−）アルプレノロール酒石酸塩、及びｓ−プロプラノロール塩酸はＳｉｇｍａからのものである。
βＡＲの変異誘発
βＡＲ ｃＤＮＡは、ｐＲＧＩＩＩにライゲートし、ＭａｌＥ融合タンパク質としての大腸菌におけるβＡＲの機能的な発現を可能にした（非特許文献１６）。変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ方法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、発現プラスミドを鋳型として使用してＰＣＲによって産生した。ＰＣＲ反応物は、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、個々のクローンを完全に配列決定して、所望の変異のみが存在していることを調べた。異なる変異は、以下の変異：Ｍｕｔ４、Ｇ６７Ａ、Ｇ０６８Ａ、Ｖ２３０Ａ、Ｄ３２２Ａ、及びＦ３２７Ａ；Ｍｕｔ６、Ｒ０６８Ｓ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２３４Ｌ、Ａ２８２Ｌ、及びＡ３３４Ｌ；Ｍｕｔ７、Ｍ９０Ｖ、Ｉ１２９Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、及びＦ３３８Ｍ；Ｍｕｔ１０、Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｖ２３０Ａ、Ｆ３２７Ａ、及びＡ３３４Ｌを導入する全てのペアのプライマーを含めることによって、ＰＣＲによって無作為に組み合わせた。ＰＣＲ混合物を形質転換して、クローンは配列決定して変異が確かに導入されていることを測定した。
βＡＲ ｃＤＮＡは、ｐＲＧＩＩＩにライゲートし、ＭａｌＥ融合タンパク質としての大腸菌におけるβＡＲの機能的な発現を可能にした（非特許文献１６）。変異体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ方法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、発現プラスミドを鋳型として使用してＰＣＲによって産生した。ＰＣＲ反応物は、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、個々のクローンを完全に配列決定して、所望の変異のみが存在していることを調べた。異なる変異は、以下の変異：Ｍｕｔ４、Ｇ６７Ａ、Ｇ０６８Ａ、Ｖ２３０Ａ、Ｄ３２２Ａ、及びＦ３２７Ａ；Ｍｕｔ６、Ｒ０６８Ｓ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２３４Ｌ、Ａ２８２Ｌ、及びＡ３３４Ｌ；Ｍｕｔ７、Ｍ９０Ｖ、Ｉ１２９Ｖ、Ｙ２２７Ａ、Ａ２８２Ｌ、及びＦ３３８Ｍ；Ｍｕｔ１０、Ｒ６８Ｓ、Ｍ９０Ｖ、Ｖ２３０Ａ、Ｆ３２７Ａ、及びＡ３３４Ｌを導入する全てのペアのプライマーを含めることによって、ＰＣＲによって無作為に組み合わせた。ＰＣＲ混合物を形質転換して、クローンは配列決定して変異が確かに導入されていることを測定した。
タンパク質発現及び膜調製物
βＡＲ及び変異体の発現は、ＸＬ１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において実施した。５０ｍｌのアンピシリン含有（１００μｇ／ｍｌ）２×ＴＹ培地の培養物を、ＯＤ６００＝３まで浸透しながら３７℃で増殖させ、次いで、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導した培養物は、４時間に亘って２５℃でインキュベートし、次いで、細胞を１３，０００×ｇで１分に亘って遠心分離することによって回収し（２ｍｌの一定分量）、−２０℃で保存した。アッセイに関しては、細胞を凍結融解（５サイクル）によって破砕し、５００μｌの緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）］に再懸濁した。１００μｇ／ｍｌリソザイム及びＤＮアーゼ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃で１時間に亘ってインキュベートした後に、氷上で３０分に亘ってサンプルを２％ＤＤＭに可溶化した。不溶性物質を遠心分離（１５，０００×ｇ、２分、４℃）によって除去し、上清を放射リガンド結合アッセイに直接使用した。
βＡＲ及び変異体の発現は、ＸＬ１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において実施した。５０ｍｌのアンピシリン含有（１００μｇ／ｍｌ）２×ＴＹ培地の培養物を、ＯＤ６００＝３まで浸透しながら３７℃で増殖させ、次いで、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導した培養物は、４時間に亘って２５℃でインキュベートし、次いで、細胞を１３，０００×ｇで１分に亘って遠心分離することによって回収し（２ｍｌの一定分量）、−２０℃で保存した。アッセイに関しては、細胞を凍結融解（５サイクル）によって破砕し、５００μｌの緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）］に再懸濁した。１００μｇ／ｍｌリソザイム及びＤＮアーゼ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を用いて４℃で１時間に亘ってインキュベートした後に、氷上で３０分に亘ってサンプルを２％ＤＤＭに可溶化した。不溶性物質を遠心分離（１５，０００×ｇ、２分、４℃）によって除去し、上清を放射リガンド結合アッセイに直接使用した。
大規模膜調製のために、βＡＲ及びＭｕｔ２３各々の２Ｌ及び６Ｌの大腸菌培養物を上述のように増殖させた。２０分間に亘る５，０００×ｇの遠心分離によって細胞を回収し、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ）を含有する１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５にペレットを再懸濁した。１ｍｇのＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）を添加して、終容量を１００ｍｌとした。細胞をＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ（２ｐａｓｓａｇｅｓ、２０，０００ｐｓｉ）によって破砕し、１２，０００×ｇで４５分間に亘って４℃で遠心分離して細胞残屑を除去した。上清（膜）を２００，０００×ｇで３０分間に亘って４℃で遠心分離した；膜ペレットは１５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５に再懸濁して、液体窒素で迅速に凍結した後に１ｍｌの一定分量で−８０℃において保存した。タンパク質濃度はアミノブラック法によって測定した（非特許文献１７）。これらのサンプルは、融解後に放射リガンド結合アッセイにおいて使用し、上述の２％ ＤＤＭに可溶化した。
競争アッセイに関しては、異なる界面活性剤を試験することと共に、ＤＤＭ可溶化βＡＲをＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）で部分的に精製した。２００μｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールｐＨ ８中の２ｍｌの可溶化サンプル（１０ｍｇ／ｍｌの膜タンパク質）に添加し、１時間に亘って４℃でインキュベートした。インキュベート後に、サンプルを１３，０００×ｇで３０秒間に亘って遠心分離し、界面活性剤（０．１％ＤＤＭ、０．１％ＤＭ、０．１％ＬＤＡＯ、０．３％ＮＧ、又は０．７％ＯＧのいずれか）を含有する２５０μｌの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で二回洗浄した。
受容体は、２×１００μｌの緩衝液（０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭイミダゾールｐＨ８、及び関連の界面活性剤）に溶出した。半精製したβＡＲ３４−４２４及びβＡＲ−ｍ２３に対する［３Ｈ］−ＤＨＡ結合についてのＫＤは、各々３．７ｎＭ及び１２．５ｎＭであり、競争アッセイにおいて使用した［３Ｈ］の終濃度は３倍のＫＤでありβＡＲ３４−４２４については１２ｎＭでありβＡＲ−ｍ２３については４０ｎＭであった。
放射リガンド結合及び熱安定性アッセイ
単独の点の結合アッセイは、１２０μｌの終濃度において、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＤＤＭ（又は対応する界面活性剤）を５０ｎＭ［３Ｈ］−ＤＨＡ及び２０から１００μｇの膜タンパク質と共に含有した；平衡化は１時間、４℃であった。３０分間に亘って特定の温度で［３Ｈ］−ＤＨＡを使用して又は使用せずに、結合アッセイ混合物をインキュベートすることによって、熱安定性を評価した；反応は氷上で実施し、必要であれば［３Ｈ］−ＤＨＡを添加して、さらに１時間平衡化した。受容体結合放射リガンド及び遊離の放射リガンドは、以前に開示されているようにゲル濾過によって分離した（非特許文献１８）。非特異的結合は、１μＭのｓ−プロプラノロールの存在下で測定した。飽和曲線は、０．４ｎＭから１００ｎＭの広範な［３Ｈ］−ＤＨＡ濃度を使用して得られた。競争アッセイは、βＡＲ３４−４２４については１２ｎＭの濃度の［３Ｈ］−ＤＨＡを使用して実施し、βＡＲ−ｍ２３については４０ｎＭの濃度の［３Ｈ］−ＤＨＡを使用して実施し（すなわち、３倍のＫＤ）、各種の濃度の未標識のリガンド（０から１００ｍＭ）を用いて実施した。放射活性はＢｅｃｋｍａｎ ＬＳ６０００液体シンチレーションカウンターで計測し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰によってデータを分析した。
単独の点の結合アッセイは、１２０μｌの終濃度において、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、０．４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＤＤＭ（又は対応する界面活性剤）を５０ｎＭ［３Ｈ］−ＤＨＡ及び２０から１００μｇの膜タンパク質と共に含有した；平衡化は１時間、４℃であった。３０分間に亘って特定の温度で［３Ｈ］−ＤＨＡを使用して又は使用せずに、結合アッセイ混合物をインキュベートすることによって、熱安定性を評価した；反応は氷上で実施し、必要であれば［３Ｈ］−ＤＨＡを添加して、さらに１時間平衡化した。受容体結合放射リガンド及び遊離の放射リガンドは、以前に開示されているようにゲル濾過によって分離した（非特許文献１８）。非特異的結合は、１μＭのｓ−プロプラノロールの存在下で測定した。飽和曲線は、０．４ｎＭから１００ｎＭの広範な［３Ｈ］−ＤＨＡ濃度を使用して得られた。競争アッセイは、βＡＲ３４−４２４については１２ｎＭの濃度の［３Ｈ］−ＤＨＡを使用して実施し、βＡＲ−ｍ２３については４０ｎＭの濃度の［３Ｈ］−ＤＨＡを使用して実施し（すなわち、３倍のＫＤ）、各種の濃度の未標識のリガンド（０から１００ｍＭ）を用いて実施した。放射活性はＢｅｃｋｍａｎ ＬＳ６０００液体シンチレーションカウンターで計測し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して非線形回帰によってデータを分析した。
ロドプシン構造におけるβＡＲ−ｍ２３熱安定変異の位置
登録コードが１ＧＺＭ［１４］であるロドプシン構造のｐｄｂファイルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔｅ Ｂａｎｋウェブサイト（www.pdb.org）からダウンロードし、ＰｙＭＯＬＸ１１Ｈｙｂｒｉｄ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プログラムに表示した。βＡＲにおける熱安定変異についての、ロドプシンの対応するアミノ酸残基は、本発明者のよく知っている４つのＧＰＣＲ、すなわち、ロドプシン、β１アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、及びアデノシンＡ２ａ受容体の間のアラインメントに基づいてロドプシン構造に配置した（非特許文献１９）。
登録コードが１ＧＺＭ［１４］であるロドプシン構造のｐｄｂファイルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔｅ Ｂａｎｋウェブサイト（www.pdb.org）からダウンロードし、ＰｙＭＯＬＸ１１Ｈｙｂｒｉｄ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プログラムに表示した。βＡＲにおける熱安定変異についての、ロドプシンの対応するアミノ酸残基は、本発明者のよく知っている４つのＧＰＣＲ、すなわち、ロドプシン、β１アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、及びアデノシンＡ２ａ受容体の間のアラインメントに基づいてロドプシン構造に配置した（非特許文献１９）。
実施例２：増大した熱安定性を有するアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）の変異体
１．３１５の部位特異的変異体を、Ａ２ａＲの２から３１６残基の間に作製した。
２．これらの変異体の全てを、加熱工程後のアゴニスト及びアンタゴニスト結合測定アッセイを使用して熱安定性についてアッセイした（図１２に記載のリガンド（−）フォーマット）。
ａ．３Ｈ−ＮＥＣＡ（アゴニスト）と共に測定した際に、２６の変異体が改善された熱安定性を示した：Ｇ１１４Ａ、Ｇ１１８Ａ、Ｌ１６７Ａ、Ａ１８４Ｌ、Ｒ１９９Ａ、Ａ２０３Ｌ、Ｌ２０８Ａ、Ｑ２１０Ａ、Ｓ２１３Ａ、Ｅ２１９Ａ、Ｒ２２０Ａ、Ｓ２２３Ａ、Ｔ２２４Ａ、Ｑ２２６Ａ、Ｋ２２７Ａ、Ｈ２３０Ａ、Ｌ２４１Ａ、Ｐ２６０Ａ、Ｓ２６３Ａ、Ｌ２６７Ａ、Ｌ２７２Ａ、Ｔ２７９Ａ、Ｎ２８４Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｐ３１３Ａ、Ｋ３１５Ａ。
ｂ．３Ｈ−ＺＭ２４１３８５（アンタゴニスト）と共にアッセイした際に、１８の変異体が改善された熱安定性を示した：Ａ５４Ｌ、Ｖ５７Ａ、Ｈ７５Ａ、Ｔ８８Ａ、Ｇ１１４Ａ、Ｇ１１８Ａ、Ｔ１１９Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｇ１２３Ａ、Ｐ１４９Ａ、Ｅ１５１Ａ、Ｇ１５２Ａ、Ａ２０３Ｌ、Ａ２０４Ｌ、Ａ２３１Ｌ、Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３９Ａ。
３．変異を組み合わせて、推定上のアンタゴニストの立体構造において変異体を産生した。野生型Ａ２ａＲはＺＭ２４１３８５が結合した状態で３１℃のＴｍを有する。
a.Rant17 A54L+K122A+L235A Tm 48℃ (ZM241385 結合)
b.Rant19 A54L,T88A,V239A+A204L Tm 47℃ (ZM241385 結合)
c.Rant21 A54L,T88A,V239A+K122A Tm 49℃ (ZM241385 結合)
４．アゴニストスクリーニングよる変異を組み合わせたが、＋２℃のＴｍという非常に低レベルの改善のみをもたらした。
１．３１５の部位特異的変異体を、Ａ２ａＲの２から３１６残基の間に作製した。
２．これらの変異体の全てを、加熱工程後のアゴニスト及びアンタゴニスト結合測定アッセイを使用して熱安定性についてアッセイした（図１２に記載のリガンド（−）フォーマット）。
ａ．３Ｈ−ＮＥＣＡ（アゴニスト）と共に測定した際に、２６の変異体が改善された熱安定性を示した：Ｇ１１４Ａ、Ｇ１１８Ａ、Ｌ１６７Ａ、Ａ１８４Ｌ、Ｒ１９９Ａ、Ａ２０３Ｌ、Ｌ２０８Ａ、Ｑ２１０Ａ、Ｓ２１３Ａ、Ｅ２１９Ａ、Ｒ２２０Ａ、Ｓ２２３Ａ、Ｔ２２４Ａ、Ｑ２２６Ａ、Ｋ２２７Ａ、Ｈ２３０Ａ、Ｌ２４１Ａ、Ｐ２６０Ａ、Ｓ２６３Ａ、Ｌ２６７Ａ、Ｌ２７２Ａ、Ｔ２７９Ａ、Ｎ２８４Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｐ３１３Ａ、Ｋ３１５Ａ。
ｂ．３Ｈ−ＺＭ２４１３８５（アンタゴニスト）と共にアッセイした際に、１８の変異体が改善された熱安定性を示した：Ａ５４Ｌ、Ｖ５７Ａ、Ｈ７５Ａ、Ｔ８８Ａ、Ｇ１１４Ａ、Ｇ１１８Ａ、Ｔ１１９Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｇ１２３Ａ、Ｐ１４９Ａ、Ｅ１５１Ａ、Ｇ１５２Ａ、Ａ２０３Ｌ、Ａ２０４Ｌ、Ａ２３１Ｌ、Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３９Ａ。
３．変異を組み合わせて、推定上のアンタゴニストの立体構造において変異体を産生した。野生型Ａ２ａＲはＺＭ２４１３８５が結合した状態で３１℃のＴｍを有する。
a.Rant17 A54L+K122A+L235A Tm 48℃ (ZM241385 結合)
b.Rant19 A54L,T88A,V239A+A204L Tm 47℃ (ZM241385 結合)
c.Rant21 A54L,T88A,V239A+K122A Tm 49℃ (ZM241385 結合)
４．アゴニストスクリーニングよる変異を組み合わせたが、＋２℃のＴｍという非常に低レベルの改善のみをもたらした。
実施例３：増大した熱安定性を有するニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）の変異体
１．３４０部位特異的変異体を、ＮＴＲの６１から４００残基の間に作製した。
２．まず、これらの変異体の全てを、加熱工程後に３Ｈ−ニューロテンシン（アゴニスト）結合を測定するアッセイを使用して熱安定性についてアッセイした。２４の変異体は、熱安定性おける小さいが顕著な増大をもたらした：Ａ３５６Ｌ、Ｈ１０３Ａ、Ｄ３４５Ａ、Ａ８６Ｌ、Ａ３８５Ｌ、Ｙ３４９Ａ、Ｃ３８６Ａ、Ｋ３９７Ａ、Ｈ３９３Ａ、Ｉ１１６Ａ、Ｆ３５８Ａ、Ｓ１０８Ａ、Ｍ１８１Ａ、Ｒ３９２Ａ、Ｄ１１３Ａ、Ｇ２０９Ａ、Ｌ２０５Ａ、Ｌ７２Ａ、Ａ１２０Ｌ、Ｐ３９９Ａ、Ｙ３５１Ａ、Ｖ２６８Ａ、Ｔ２０７Ａ、Ａ１５５Ｌ、Ｓ３６２Ａ、Ｆ１８９Ａ、Ｎ２６２Ａ、Ｌ１０９Ａ、Ｗ３９１Ａ、Ｔ１７９Ａ、Ｓ１８２Ａ、Ｍ２９３Ａ、Ｌ２５６Ａ、Ｆ１４７Ａ、Ｄ１３９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｋ１７６Ａ、Ｌ１１１Ａ、Ａ９０Ｌ、Ｎ２７０Ａ。
３．アゴニストの非存在下における加熱によって熱安定性について試験した変異体を、変異体を３Ｈ−ニューロテンシンの存在下で加熱する僅かに異なるアッセイを使用して再試験した（図１２におけるリガンド（＋）フォーマット）。改善された熱安定性を有する変異体は：Ａ６９Ｌ、Ａ７３Ｌ、Ａ８６Ｌ、Ａ９０Ｌ、Ｈ１０３Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｅ１６６Ａ、Ｇ２１５Ａ、Ｖ２２９Ａ、Ｍ２５０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ａ１７７Ｌ、Ｒ１８３Ａ、Ｉ２６０Ａ、Ｔ２７９Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｇ３０６Ａ、Ｌ３０８Ａ、Ｖ３０９Ａ、Ｌ３１０Ａ、Ｖ３１３Ａ、Ｆ３４２Ａ、Ｆ３５８Ａ、Ｖ３６０Ａ、Ｓ３６２Ａ、Ｎ３７０Ａ、Ｓ３７３Ａ、Ｆ３８０Ａ、Ａ３８５Ｌ、Ｐ３８９Ａ、Ｇ３９０Ａ、Ｒ３９５Ａ。
４．野生型の受容体と比較して顕著に向上した発現レベルを有する変異体も存在し、結晶化のための受容体生産レベルを促進するために使用し得る：Ａ８６Ｌ、Ｈ１０３Ａ、Ｆ３５８Ａ、Ｓ３６２Ａ、Ｎ３７０Ａ、Ａ３８５Ｌ、Ｇ３９０Ａ。これら全てが熱安定性を増大させた。
５．好ましい組み合わせは、
a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A Tm 51℃ (ニューロテンシン結合)
b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A Tm 51℃ (ニューロテンシン結合)
野生型のＮＴＲは、ニューロテンシンが結合した状態で３５℃のＴｍを有する。
１．３４０部位特異的変異体を、ＮＴＲの６１から４００残基の間に作製した。
２．まず、これらの変異体の全てを、加熱工程後に３Ｈ−ニューロテンシン（アゴニスト）結合を測定するアッセイを使用して熱安定性についてアッセイした。２４の変異体は、熱安定性おける小さいが顕著な増大をもたらした：Ａ３５６Ｌ、Ｈ１０３Ａ、Ｄ３４５Ａ、Ａ８６Ｌ、Ａ３８５Ｌ、Ｙ３４９Ａ、Ｃ３８６Ａ、Ｋ３９７Ａ、Ｈ３９３Ａ、Ｉ１１６Ａ、Ｆ３５８Ａ、Ｓ１０８Ａ、Ｍ１８１Ａ、Ｒ３９２Ａ、Ｄ１１３Ａ、Ｇ２０９Ａ、Ｌ２０５Ａ、Ｌ７２Ａ、Ａ１２０Ｌ、Ｐ３９９Ａ、Ｙ３５１Ａ、Ｖ２６８Ａ、Ｔ２０７Ａ、Ａ１５５Ｌ、Ｓ３６２Ａ、Ｆ１８９Ａ、Ｎ２６２Ａ、Ｌ１０９Ａ、Ｗ３９１Ａ、Ｔ１７９Ａ、Ｓ１８２Ａ、Ｍ２９３Ａ、Ｌ２５６Ａ、Ｆ１４７Ａ、Ｄ１３９Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｋ１７６Ａ、Ｌ１１１Ａ、Ａ９０Ｌ、Ｎ２７０Ａ。
３．アゴニストの非存在下における加熱によって熱安定性について試験した変異体を、変異体を３Ｈ−ニューロテンシンの存在下で加熱する僅かに異なるアッセイを使用して再試験した（図１２におけるリガンド（＋）フォーマット）。改善された熱安定性を有する変異体は：Ａ６９Ｌ、Ａ７３Ｌ、Ａ８６Ｌ、Ａ９０Ｌ、Ｈ１０３Ａ、Ｖ１６５Ａ、Ｅ１６６Ａ、Ｇ２１５Ａ、Ｖ２２９Ａ、Ｍ２５０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ａ１７７Ｌ、Ｒ１８３Ａ、Ｉ２６０Ａ、Ｔ２７９Ａ、Ｔ２９４Ａ、Ｇ３０６Ａ、Ｌ３０８Ａ、Ｖ３０９Ａ、Ｌ３１０Ａ、Ｖ３１３Ａ、Ｆ３４２Ａ、Ｆ３５８Ａ、Ｖ３６０Ａ、Ｓ３６２Ａ、Ｎ３７０Ａ、Ｓ３７３Ａ、Ｆ３８０Ａ、Ａ３８５Ｌ、Ｐ３８９Ａ、Ｇ３９０Ａ、Ｒ３９５Ａ。
４．野生型の受容体と比較して顕著に向上した発現レベルを有する変異体も存在し、結晶化のための受容体生産レベルを促進するために使用し得る：Ａ８６Ｌ、Ｈ１０３Ａ、Ｆ３５８Ａ、Ｓ３６２Ａ、Ｎ３７０Ａ、Ａ３８５Ｌ、Ｇ３９０Ａ。これら全てが熱安定性を増大させた。
５．好ましい組み合わせは、
a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A Tm 51℃ (ニューロテンシン結合)
b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A Tm 51℃ (ニューロテンシン結合)
野生型のＮＴＲは、ニューロテンシンが結合した状態で３５℃のＴｍを有する。
実施例４：安定化ＧＰＣＲ変異が存在する構造モチーフの同定
β２アドレナリン受容体の構造を決定した（非特許文献２０及び２１）。それはシチメンチョウβ１受容体と５９％同一であったが、はっきりと異なる薬理学的プロフィールを有していた（非特許文献２２及び２３）。シチメンチョウβ１受容体の安定化変異が存在する構造モチーフを決定するために、本発明者は、ヒトβ２構造に変異をマッピングした（非特許文献２１）。
β２アドレナリン受容体の構造を決定した（非特許文献２０及び２１）。それはシチメンチョウβ１受容体と５９％同一であったが、はっきりと異なる薬理学的プロフィールを有していた（非特許文献２２及び２３）。シチメンチョウβ１受容体の安定化変異が存在する構造モチーフを決定するために、本発明者は、ヒトβ２構造に変異をマッピングした（非特許文献２１）。
ＭａｃＶｅｃｔｏｒパッケージにおいてＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、βアドレナリン受容体を最初に整列（アライン）した；シチメンチョウβ１における熱安定化変異を、ヒトβ２配列における対応する残基と同様にハイライトした。ヒトβ２モデル（ｐｄｂ登録コード２ＲＨ１）はＰｙｍｏｌで可視化し、所望のアミノ酸を、当該技術分野において既知の標準的な手法によって空間充填モデルとして示した。安定化変異が存在する構造モチーフは、目視検査によって決定した。
表（ｖｉ）は、βＡＲ−ｍ２３の熱安定化変異に対応するβ２受容体における対応する位置及びそれらが存在する構造モチーフの一覧である。
表（ｖｉ）から認められるように、変異体は、多数の異なる位置に存在している。３つの変異は、水性溶媒に接近可能であることが予測されるループ領域に存在する（ループ）。８の変異は、膜貫通α−ヘリックスに存在し、脂質二重層を示す（脂質）；これらの変異の３つはヘリックスの末端付近に存在し、親水性境界層に存在していると解されてよい（脂質境界）。８の変異は膜貫通α−ヘリックスの間の界面に存在することが認められ（ヘリックス−ヘリックス界面）、そのうち３つはヘリックスのねじれた又は曲がった領域内のいずれかに存在し（ねじれ）、他の２つの変異は一つのヘリックスで生じているが、変異した残基に対して空間をあけて近接するねじれを含有する1つ又は複数の他のヘリックスと近接している（反対側のねじれ）。これらの後者の変異は、ねじれた領域内のアミノ酸のパッケージングに影響を与え、熱安定化をもたらし得る。他の変異は、基質結合ポケットに存在する（ポケット）。
その様な構造モチーフは、それらが安定化変異を含有するために、タンパク質安定性の測定において重要である。したがって、これらのモチーフを変異の標的とすることは、安定化したＧＰＣＲ変異体の産生を容易にする。事実、２以上の変異を同一の構造モチーフにマッピングした幾つかの例が存在する。例えば、Ｙ２２７Ａ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌといったシチメンチョウβ１アドレナリン受容体における変異は全て、同一のヘリックス界面にマッピングされ、Ｖ８９Ｌ及びＭ９０Ｖといった変異は同一のヘリックスのねじれにマッピングされ、Ｆ３２７Ａ及びＡ３３４Ｌといった変異は脂質二重層を示す同一のヘリックス表面にマッピングされた（表（ｖｉ））。かくして、1つの安定化変異が同定された際における、変異が存在する構造モチーフの決定は、更なる安定化変異の同定を可能にするであろう。
実施例５：βアドレナリン受容体間の安定化変異の伝達性
まとめ
我々はシチメンチョウβ１アドレナリン受容体（ＡＲ）を安定化させた６点の変異を記載した。変異体β１ＡＲ−ｍ２３は、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）に溶解したとき天然タンパク質よりも高い２１℃の見かけＴｍに達した。これらの変異はタンパク質の切断型の結晶化と構造決定を助けた。今、我々はヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲへのこれら安定化変異の伝達性を調べた。安定性解析は、ヒトβ１ＡＲがシチメンチョウβ１ＡＲよりも更に不安定であり脂質依存性である一方、β２ＡＲはそれらの何れよりもより安定であることを明らかにした。双方の場合、特に界面活性剤の存在下でβ１ＡＲに対して、変異は受容体のＴｍを増加させた。これらの残基における他の変化は、シチメンチョウβ１ＡＲの元の変異がシチメンチョウについてのヒトβＡＲの場合と同様に作用したことを示しており、 この具体的な残基における変異の重要性を明らかにした。
まとめ
我々はシチメンチョウβ１アドレナリン受容体（ＡＲ）を安定化させた６点の変異を記載した。変異体β１ＡＲ−ｍ２３は、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）に溶解したとき天然タンパク質よりも高い２１℃の見かけＴｍに達した。これらの変異はタンパク質の切断型の結晶化と構造決定を助けた。今、我々はヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲへのこれら安定化変異の伝達性を調べた。安定性解析は、ヒトβ１ＡＲがシチメンチョウβ１ＡＲよりも更に不安定であり脂質依存性である一方、β２ＡＲはそれらの何れよりもより安定であることを明らかにした。双方の場合、特に界面活性剤の存在下でβ１ＡＲに対して、変異は受容体のＴｍを増加させた。これらの残基における他の変化は、シチメンチョウβ１ＡＲの元の変異がシチメンチョウについてのヒトβＡＲの場合と同様に作用したことを示しており、 この具体的な残基における変異の重要性を明らかにした。
方法
材料。 ヒトβ１、β２及びβ３をｐｃＤＮＡ３．１＋中にクローニングした。これらのコンストラクションはMissouri S&T cDNA Resource center (http://www.cdna.org)によって与えられた。シチメンチョウβ１ＡＲ（βＡＲ３４−４２４）、及び変異型β１ＡＲ−ｍ２３はSerrano-Vega et al (PNAS (2008) 105: 877)に記載されている。双方をｐｃＤＮＡ３中にクローニングした。１−［４，６−プロピル−３Ｈ］ジヒドロアルプレノロール（［３Ｈ］ＤＨＡ）はAmersham Bioscienceによって供給された。
材料。 ヒトβ１、β２及びβ３をｐｃＤＮＡ３．１＋中にクローニングした。これらのコンストラクションはMissouri S&T cDNA Resource center (http://www.cdna.org)によって与えられた。シチメンチョウβ１ＡＲ（βＡＲ３４−４２４）、及び変異型β１ＡＲ−ｍ２３はSerrano-Vega et al (PNAS (2008) 105: 877)に記載されている。双方をｐｃＤＮＡ３中にクローニングした。１−［４，６−プロピル−３Ｈ］ジヒドロアルプレノロール（［３Ｈ］ＤＨＡ）はAmersham Bioscienceによって供給された。
変異誘発。 ヒト受容体を、参考文献に記載されたように所望の変異を含むプライマーを使用してＰＣＲによって変異させた。ヒトβ１のＣ末端領域をまたＬｅｕ４６３の後に欠失を含むプライマーを使用してＰＣＲによって切断した。ＰＣＲ反応はＫＯＤポリメラーゼ(Novagen)を使用して実施した。
発現。 試薬Gene Juice (Novagen)を使用してＨＥＫ細胞中で一過性形質移入によってタンパク質を発現させた。形質移入後、細胞を４８時間インキュベートし、２百万細胞/mlの濃度の１ｍｌのアリコートを遠心分離によって集め、−２０℃で保存した。アッセイのために、細胞を、異なった量の界面活性剤ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）を含む５００μｌのバッファー［７５ｍＭのトリス，ｐＨ８／１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２／５ｍＭのＥＤＴＡ／プロテアーゼ阻害剤(Complete;Roche)]に再懸濁させた。
リガンド結合及び熱安定性アッセイ。 結合アッセイは、１２０μｌの最終体積のバッファー［７５ｍＭのトリス，ｐＨ８／１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２／５ｍＭのＥＤＴＡ／０．０１％のＤＤＭ］中で４０μｌの試料を８０ｎＭの［３Ｈ］ＤＨＡと共にインキュベートして実施した。平衡は４℃で１時間であった。受容体結合及び遊離放射性リガンドを、過去に記載されているようにして(ref Tony)、ゲル濾過によって分離した。異なった温度でリガンドの不存在下で３０分試料をインキュベートして熱安定性を計算し、データをＰｒｉｓｍソフトウェア(GraphPad)を使用して非線形回帰法によって解析した。
結果
ヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲの発現及び熱安定性
我々は、界面活性剤に溶解させ、それをアンタゴニスト結合立体構造に置換したときタンパク質を安定化したコンストラクションβ１ＡＲ−ｍ２３であるシチメンチョウβ１−アドレナリン受容体（ＡＲ）における６つの変異を記載した(Serrano-Vega et al, PNAS (2008) 105: 877)。ある立体構造におけるこの熱安定化は受容体の結晶化に必須であった(Warne et al, Nature (2008) 454: 486)。さて、我々は同じファミリーにおけるこれらの変異の他の受容体への伝達性を研究した。シチメンチョウβ１ＡＲは、ヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲとそれぞれ７６％及び５９％の同一性を有している（アラインメントでＮ末端及びＣ末端を除去）。殆どの熱安定化変異は、シチメンチョウ及びヒトβＡＲｓの間で保存されている（図２９）。これらの変異は膜貫通領域では優先的により保存されている。従って、シチメンチョウβ１ＡＲを安定化させた変異がヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲをまた安定化させうることが可能であった。
ヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲの発現及び熱安定性
我々は、界面活性剤に溶解させ、それをアンタゴニスト結合立体構造に置換したときタンパク質を安定化したコンストラクションβ１ＡＲ−ｍ２３であるシチメンチョウβ１−アドレナリン受容体（ＡＲ）における６つの変異を記載した(Serrano-Vega et al, PNAS (2008) 105: 877)。ある立体構造におけるこの熱安定化は受容体の結晶化に必須であった(Warne et al, Nature (2008) 454: 486)。さて、我々は同じファミリーにおけるこれらの変異の他の受容体への伝達性を研究した。シチメンチョウβ１ＡＲは、ヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲとそれぞれ７６％及び５９％の同一性を有している（アラインメントでＮ末端及びＣ末端を除去）。殆どの熱安定化変異は、シチメンチョウ及びヒトβＡＲｓの間で保存されている（図２９）。これらの変異は膜貫通領域では優先的により保存されている。従って、シチメンチョウβ１ＡＲを安定化させた変異がヒトβ１ＡＲ及びβ２ＡＲをまた安定化させうることが可能であった。
我々は野生型の発現と安定性を最初に分析した。一過性形質移入によってＨＥＫ細胞中でコンストラクションを発現させた。発現は、放射性リガンド１−［４，６−プロピル−３Ｈ］ジヒドロアルプレノロール（［３Ｈ］ＤＨＡ）を用いた結合アッセイによって計算した。ヒトβ１ＡＲに対する発現は非常に低かったので、発現を増大させるためにＬｅｕ４６３の後でＣ末端を切断した。切断したタンパク質β１ＡＲ−Ｃｄｅｌは野生型に対して発現を５倍に増大させた（データは示さず）。その結果、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ及びβ２ＡＲは、膜でアッセイしたとき、シチメンチョウ β１ＡＲより低く、類似した活性レベルを有していた（図３０Ａ）。しかしながら、２％のＤＤＭで溶解させたとき、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌの活性は劇的に減衰した（図３０Ｂ）。界面活性剤によるこの不安定化は明らかにシチメンチョウβ１ＡＲ又はヒトβ２ＡＲに影響を及ぼさなかった。界面活性剤に対する感受性を、０．０１％から１％の増大量の界面活性剤中に試料を溶解させ測定したが、この最後のものは、溶解は完全ではないが尚もｃ．ｍ．ｃより上である（図３１）。全ては４℃で実施された。シチメンチョウβ１ＡＲ及びヒトβ２ＡＲは、全ての条件下で同じ活性を示し、おそらくは部分的な溶解のため０．０１％のＤＤＭでは活性が少ないが、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌは界面活性剤に対して明らかな感受性を有していた（これはまた野生型β１ＡＲにおいても観察された。データは示さず）。
受容体の熱安定性を、０．１％又は０．０１％のＤＤＭの存在下でＴｍを計算することによって調べた（図３２Ａ）。低い量の界面活性剤の存在下では、それらの３つが類似のＴｍを提示し、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌに対するものが最も低かった（シチメンチョウβ１ＡＲ、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ及びヒトβ２ＡＲそれぞれに対して３１℃、２８℃及び３０℃）。しかしながら、０．１％のＤＤＭで溶解させた場合、シチメンチョウβ１ＡＲ及びヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌはより不安定であり、特にヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌである（それぞれ２３℃及び１２℃）。これは、それらの双方が脂質依存的であるが、ヒトβ２ＡＲは膜におけるように（３０℃）安定溶解される（２９℃）ことを明らかにした。従って、ヒトβ２ＡＲでの作業は、受容体を精製し又は結晶化するために特に有利であり、少なくともヒトβ２ＡＲと同じほど、他の受容体の安定化をまた容易にすべきである。
ヒトβＡＲｓ中におけるシチメンチョウβ１ＡＲ−ｍ２３安定化変異の効果
ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ及びβ２ＡＲを変異させて、シチメンチョウβ１ＡＲ−ｍ２３（Ｒ６８Ｓ，Ｍ９０Ｖ，Ｙ２２７Ａ，Ａ２８２Ｌ，Ｆ３２７Ａ及びＦ３３８Ｍ）中に存在する対応する変化を導入した。ｍ２３変異を有する全ての変異体のＴｍを計算して、変異のあるときと変異のないときで安定性を比較した（図３１）。全ての場合、Ｔｍは増加し、特に多い量の界面活性剤を加えた場合はしかりであった（シチメンチョウβ１ＡＲ、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ及びヒトβ２ＡＲに対して２２℃、１５℃及び１２℃の増加）。シチメンチョウβ１ＡＲ−ｍ２３の場合、変異は受容体を溶解したときにより安定にした。界面活性剤の量が多いか少ないかでＴｍに差はなかった（０．１％又は０．０１％のＤＤＭを用いて溶解させたとき４５℃のＴｍ）。ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ−ｍ２３は両方の条件下で（多い（２７℃）及び少ない（３３℃）量の界面活性剤）安定性が増大し、界面活性剤に対してなお感受性があったが、野生型より少なかった。ヒトβ２ＡＲ−ｍ２３の場合、Ｔｍは０．１％及び０．０１％に対してそれぞれ４１℃及び４０℃であり、野生型より約１０℃高かった。
ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ及びβ２ＡＲを変異させて、シチメンチョウβ１ＡＲ−ｍ２３（Ｒ６８Ｓ，Ｍ９０Ｖ，Ｙ２２７Ａ，Ａ２８２Ｌ，Ｆ３２７Ａ及びＦ３３８Ｍ）中に存在する対応する変化を導入した。ｍ２３変異を有する全ての変異体のＴｍを計算して、変異のあるときと変異のないときで安定性を比較した（図３１）。全ての場合、Ｔｍは増加し、特に多い量の界面活性剤を加えた場合はしかりであった（シチメンチョウβ１ＡＲ、ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ及びヒトβ２ＡＲに対して２２℃、１５℃及び１２℃の増加）。シチメンチョウβ１ＡＲ−ｍ２３の場合、変異は受容体を溶解したときにより安定にした。界面活性剤の量が多いか少ないかでＴｍに差はなかった（０．１％又は０．０１％のＤＤＭを用いて溶解させたとき４５℃のＴｍ）。ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ−ｍ２３は両方の条件下で（多い（２７℃）及び少ない（３３℃）量の界面活性剤）安定性が増大し、界面活性剤に対してなお感受性があったが、野生型より少なかった。ヒトβ２ＡＲ−ｍ２３の場合、Ｔｍは０．１％及び０．０１％に対してそれぞれ４１℃及び４０℃であり、野生型より約１０℃高かった。
ヒトβＡＲｓにおける熱安定性を増加させるための変異誘発の新規実験
シチメンチョウにおけるｍ２３安定化に関与しているものに対応するヒトβＡＲｓ中のアミノ酸に対して新しい変化を選択し、シチメンチョウβ１ＡＲのＩ１２９位のアミノ酸に過去の実験において良好な結果が報告されている（実施例１−４を参照）。図３０Ｃ−Ｋはヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ−ｍ２３に対する結果をまとめている。元の変異体について大きな改善がなかったことは注目すべきことである。最も興味深い変異は、シチメンチョウ β１ＡＲのＩ１２９に対応する残基にあった。我々はこの残基の最も見込みのある変化に対してＴｍを計算し、グリシンに変異させたときに３８℃を得、アラニンに変異させたときに４０℃を得た。ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ−ｍ２３に対するＴｍは３１℃であった（これらの試料は０．０５％のＤＤＭで溶解させた）。類似の状況がヒトβ２ＡＲ−ｍ２３における変化について観察された（図３０Ｌ−Ｔ）。この場合、測定した活性は、ヒトβ１ＡＲ−ｍ２３におけるよりも変化により感受性があった。シチメンチョウのＩ１２９に対応する残基中におけるアラニンへの一つだけの変化が野生型に対して５℃、安定性を改善した。
シチメンチョウにおけるｍ２３安定化に関与しているものに対応するヒトβＡＲｓ中のアミノ酸に対して新しい変化を選択し、シチメンチョウβ１ＡＲのＩ１２９位のアミノ酸に過去の実験において良好な結果が報告されている（実施例１−４を参照）。図３０Ｃ−Ｋはヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ−ｍ２３に対する結果をまとめている。元の変異体について大きな改善がなかったことは注目すべきことである。最も興味深い変異は、シチメンチョウ β１ＡＲのＩ１２９に対応する残基にあった。我々はこの残基の最も見込みのある変化に対してＴｍを計算し、グリシンに変異させたときに３８℃を得、アラニンに変異させたときに４０℃を得た。ヒトβ１ＡＲ−Ｃｄｅｌ−ｍ２３に対するＴｍは３１℃であった（これらの試料は０．０５％のＤＤＭで溶解させた）。類似の状況がヒトβ２ＡＲ−ｍ２３における変化について観察された（図３０Ｌ−Ｔ）。この場合、測定した活性は、ヒトβ１ＡＲ−ｍ２３におけるよりも変化により感受性があった。シチメンチョウのＩ１２９に対応する残基中におけるアラニンへの一つだけの変化が野生型に対して５℃、安定性を改善した。
実施例６：アラインメント位置の関数としての安定化変異の解析
要約
我々は、４つの異なるＧＰＣＲ：ヒトアデノシン受容体２Ａ（Ａ２ＡＡ）、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体（Ｂ１）、ラットニューロテンシン受容体１（ＮＴＲ）及びヒトムスカリン受容体（Ｍ１）からの熱安定化変異（Ｔｍ）のデータセットについてコンピュータ及び統計解析を実施した。この研究の目的は、更なる変異スキャニングキャンペーンの効率を改善するのに有用性を用いる既存のデータから予測モデルを構築できるかどうかを決定するために配列に基づく変異のアラインメントの統計的尤度を同定することであった。
要約
我々は、４つの異なるＧＰＣＲ：ヒトアデノシン受容体２Ａ（Ａ２ＡＡ）、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体（Ｂ１）、ラットニューロテンシン受容体１（ＮＴＲ）及びヒトムスカリン受容体（Ｍ１）からの熱安定化変異（Ｔｍ）のデータセットについてコンピュータ及び統計解析を実施した。この研究の目的は、更なる変異スキャニングキャンペーンの効率を改善するのに有用性を用いる既存のデータから予測モデルを構築できるかどうかを決定するために配列に基づく変異のアラインメントの統計的尤度を同定することであった。
実験は、Ｂ１、Ａ２ＡＡ、Ｍ１及びＮＴＲ受容体に対して同定されたＴｍがアラインされるという統計的有意性の度合いを評価するために実施した。これを行うために、配列を整列させ、少なくとも２つの変異を含むアラインメントの数をカウントした。この数を、変異が無作為にあてがわれた配列位置であった１００００の配列マッピングの分布から作成された統計と比較した。
この研究の結果は、（Ｍ１を含むものを除く）全ての対の配列間のアラインメントは非常に有意であり、配列群間のアラインメントがまた非常に有意であったことを示している。
この研究の結果は、（Ｍ１を含むものを除く）全ての対の配列間のアラインメントは非常に有意であり、配列群間のアラインメントがまた非常に有意であったことを示している。
これらの結果に基づいて、一致を定義するために残基のウィンドウを使用することがまた統計的に有意な結果に導かれるかどうかが更に決定された。大部分の安定化変異（Ｔｍ）は、それらが、同一のアラインメント位置ではないけれども、空間的に関連している類似のヘリカル領域におそらくはマッピングされるように、ヘリカルな膜貫通ドメイン中に存在している。而して、異なったウィンドウサイズで同定されたアラインメントの一致の数を決定した。このデータは、統計的有意差が一般にウィンドウサイズの増加と共に増加し、最も有意なウィンドウサイズは９（つまり、ウィンドウ＝ｉプラス又はマイナス４）であったことを示している。このデータは、「領域」内のＴｍの共起性が非常に統計的に有意であることを裏付けている。
Ｔｍの共起性が正確なアラインメントとウィンドウアラインメントについて非常に統計的に有意であるという決定後に、Ｔｍを同定するためのこれらの測定基準の能力を評価するために実験を実施した。４番目の受容体配列におけるＴｍ位置を予想するために３つの受容体からのデータが使用された一連の実験を実施した。この分析は、このアプローチが既存の無作為法と比較して２倍まで（つまり１００％）のヒット率濃縮を生じることを明らかにする。該方法は、Ｂ１、Ａ２Ａ及びＮＴＲ受容体に対して適用可能であるがＭ１受容体にはそうではなかった。
該方法は、新しい受容体についてなされなければならない変異の数の減少に有用であることが予想され、最適な方法は、小さいウィンドウ内サイズを最初に使用し、その配列サブセットから安定化変異を同定し、ついで十分な変異が見出されたかどうかに応じて増加したウィンドウサイズで更なる残基をスキャンするものである。
該方法は、新しい受容体についてなされなければならない変異の数の減少に有用であることが予想され、最適な方法は、小さいウィンドウ内サイズを最初に使用し、その配列サブセットから安定化変異を同定し、ついで十分な変異が見出されたかどうかに応じて増加したウィンドウサイズで更なる残基をスキャンするものである。
結果
Ｔｍ位置解析
A2AA, β1, NTR及び M1配列のアラインメントを、プログラムClustalWを使用して作製した(図３４)。一般に、このアラインメントは図１７のものと非常に類似しており、ループ領域にある程度の変化がある。
アラインメントを使用して、同定した熱安定化変異（Ｔｍ）を配列にマッピングし、以下について統計的な有意性を計算した：
１．配列の対の間でのＴｍの共起性
２．配列群間でのＴｍの共起性（３又は全ての配列のセット）
統計は、観察値と比較できる共起性統計（平均と標準偏差）の正規分布を与えた１００００のランダムなＴｍ（熱安定化変異体）割当（つまり真のデータと同じ配列当たりの数）のデータセットの生成によって容易にされた。最初部分析は、報告されたＴｍのアラインメント位置共起性の幾らかは非常に有意であることを明らかにした。表Ａは無作為サンプリングからの結果の正規分布に従った対配列共起性の尤度（ρ値）を示している：
複数の配列を考慮した場合、共起性の統計的有意性を表Ｂに記録した：
この解析から、Ｍ１配列を含むものとは異なる全てのＴｍ共起性が統計的に意味があると結論付けることができる。装用のデータが、図１７からのアラインメントを使用して得られる。
Ｔｍ位置解析
A2AA, β1, NTR及び M1配列のアラインメントを、プログラムClustalWを使用して作製した(図３４)。一般に、このアラインメントは図１７のものと非常に類似しており、ループ領域にある程度の変化がある。
アラインメントを使用して、同定した熱安定化変異（Ｔｍ）を配列にマッピングし、以下について統計的な有意性を計算した：
１．配列の対の間でのＴｍの共起性
２．配列群間でのＴｍの共起性（３又は全ての配列のセット）
統計は、観察値と比較できる共起性統計（平均と標準偏差）の正規分布を与えた１００００のランダムなＴｍ（熱安定化変異体）割当（つまり真のデータと同じ配列当たりの数）のデータセットの生成によって容易にされた。最初部分析は、報告されたＴｍのアラインメント位置共起性の幾らかは非常に有意であることを明らかにした。表Ａは無作為サンプリングからの結果の正規分布に従った対配列共起性の尤度（ρ値）を示している：
残基ウィンドウの考慮
ヘリカル構造において、ｉからｉ＋４の位置内の残基は互いに空間的に近接している。Ｔｍの大部分はヘリカルドメインに位置しているため、Ｔｍの正確な位置アラインメントを探すよりもむしろ、我々はｉ−＞ｉ＋４の位置を表すウィンドウを使用して、これが互いに異なった配列においてＴｍを一致させるための代替法を提供するかどうかを決定した。正確なヘリックス位置よりも一般的なヘリックス面積（又はターン）に一致させることがヘリックス安定化位置を予測するための重要な概念を表しうることが考えられた。明らかに、受容体の必ずしも全てがヘリカルではないが、我々がこれまで同定したＴｍの少なくとも８０％がそのような領域にある。
ヘリカル構造において、ｉからｉ＋４の位置内の残基は互いに空間的に近接している。Ｔｍの大部分はヘリカルドメインに位置しているため、Ｔｍの正確な位置アラインメントを探すよりもむしろ、我々はｉ−＞ｉ＋４の位置を表すウィンドウを使用して、これが互いに異なった配列においてＴｍを一致させるための代替法を提供するかどうかを決定した。正確なヘリックス位置よりも一般的なヘリックス面積（又はターン）に一致させることがヘリックス安定化位置を予測するための重要な概念を表しうることが考えられた。明らかに、受容体の必ずしも全てがヘリカルではないが、我々がこれまで同定したＴｍの少なくとも８０％がそのような領域にある。
この概念を試すために、アラインメントにおいて与えられたＴｍに対して、他のＴｍとの一致数をクエリーＴｍから与えられたウィンドウ内で決定する研究を実施した。また、ウィンドウ内のＴｍの平均数をまた計算した。４つの配列（Ｂ１，Ａ２ＡＡ，Ｍ１及びＮＴＲ）のアラインメントに対するこの解析の結果を表Ｃに示す。
ウィンドウはｉプラス又はマイナスｎとして定義され、ここで、ｉ＝参照残基、ｎ＝何れかの側の残基である（従って、ｉプラス又はマイナス５残基は１１個のアミノ酸のウィンドウに等しい）。
データは、ウィンドウサイズが増大すると、観察された一致の統計的有意性が増加し、一致当たりのＴｍｓの平均数の統計的有意性も増加することを明らかにしている。一致の数は全てのウィンドウサイズで統計的に有意であった。
このデータの有意性は、Ｔｍｓが９のウィンドウサイズを持つアライン位置における他のＴｍｓにより接近して存在している可能性がより高い（つまり、最も統計的に有意）ことであり、Ｔｍが他のＴｍに近い場合、また他のＴｍｓにより接近している可能性がより高い（９及び１１のウィンドウでの平均Ｔｍ密度は５より大きい）。
興味深いことに、９の最適なウィンドウサイズは何れかの方向のヘリックスターンにおける残基の数に相関する。
データは、ウィンドウサイズが増大すると、観察された一致の統計的有意性が増加し、一致当たりのＴｍｓの平均数の統計的有意性も増加することを明らかにしている。一致の数は全てのウィンドウサイズで統計的に有意であった。
このデータの有意性は、Ｔｍｓが９のウィンドウサイズを持つアライン位置における他のＴｍｓにより接近して存在している可能性がより高い（つまり、最も統計的に有意）ことであり、Ｔｍが他のＴｍに近い場合、また他のＴｍｓにより接近している可能性がより高い（９及び１１のウィンドウでの平均Ｔｍ密度は５より大きい）。
興味深いことに、９の最適なウィンドウサイズは何れかの方向のヘリックスターンにおける残基の数に相関する。
これらの統計的な結果に基づき、Ｔｍ予測の点でウィンドウ一致法を使用することの実際的な意味を考えることは興味深かった。従って、Ｔｍデータが利用できる４つの配列の各々について他の３つの配列を、ウィンドウ法を使用して潜在的なＴｍ位置を予想するために使用した一連の簡単な研究を実施した。例えば、ＮＴＲ、Ｂ１及びＡ２ＡＡからのＴｍデータを使用して、ウィンドウ法を適用してＭ１におけるＴｍ位置を予想した。ついで、ウィンドウ予想のヒット率を、その配列に対する既知のＴｍデータと比較して計算することができた。これらの結果は表Ｄに示す。
データは、４つ全ての標的に対して、ウィンドウ一致概念が変異位置を予測できることを明らかにした。濃縮係数はＴｍ当たりの残基のベースライン平均数／Ｔｍスクリーニング当たりの平均残基数として定義され、無作為スクリーニングに対する予測性の改善を表す。被覆率はスクリーニングにおいて同定された既知のＴｍｓの割合として単に定義される。１１のウィンドウサイズの濃縮率は、無作為に対して３９％（Ｍ１）から６５％（Ｍ１）の間である。 興味深いことに、Ｍ１のＴｍｓの何れも他の３つの配列に対するＴｍｓの何れともアラインしないが、ウィンドウの概念は、大きなウィンドウサイズにおいてのみであるが、この配列に対するある程度の予測能を提供する。全ての受容体に対して、ヒット被覆率（同定されたＴｍｓの数）とウィンドウサイズの間にトレードオフがある。
図３５は被覆率と濃縮についてのウィンドウサイズの効果を示している。重要な考慮は、要求されるウィンドウサイズを支配する結晶化を可能にするのに十分に受容体を安定化させるために各配列にいくらのＴｍｓが必要となるかである。図３６は異なったウィンドウサイズでの受容体の各々に対する濃縮対被覆率を示している。
興味深いことに、全ての配列を併せて考慮する場合の増大したウィンドウサイズの統計的有意性にも拘わらず、より小さいウィンドウ（３）がＢ１、ＮＴＲ及びＡ２ＡＡ配列に対して最良な濃縮割合を示している。Ｍ１だけがより大きなウィンドウサイズで最も高い濃縮を有していた。
興味深いことに、全ての配列を併せて考慮する場合の増大したウィンドウサイズの統計的有意性にも拘わらず、より小さいウィンドウ（３）がＢ１、ＮＴＲ及びＡ２ＡＡ配列に対して最良な濃縮割合を示している。Ｍ１だけがより大きなウィンドウサイズで最も高い濃縮を有していた。
実施例７：３ＤマッピングとＴｍｓの統計
まとめ
実施例６において、熱安定化変異の配列アラインメント共起性の統計的有意性を決定した手順を記載した。原理的には、三次元座標から定量された変異間の距離を用いて、構造的にマッピングされたＴｍｓの解析によって類似の研究を実施することができる。
従って、我々は、無作為分布と比較した既存のデータ集合に対するＴｍ間の空間的距離によってＴｍ共起性の統計的有意性と、他の受容体上のＴｍｓの位置を予測するためにＴｍｓの既存の集合が使用できる度合いを決定する研究を実施した。更に、我々はこれらの研究の結果を配列ベース予想と比較し、複数のＴｍ集合を考慮するときＴｍｓの構造「ホットスポット」がどこであるか、またこれらの統計的有意性が如何にして定義されるかを考慮した（実施例８を参照）。
まとめ
実施例６において、熱安定化変異の配列アラインメント共起性の統計的有意性を決定した手順を記載した。原理的には、三次元座標から定量された変異間の距離を用いて、構造的にマッピングされたＴｍｓの解析によって類似の研究を実施することができる。
従って、我々は、無作為分布と比較した既存のデータ集合に対するＴｍ間の空間的距離によってＴｍ共起性の統計的有意性と、他の受容体上のＴｍｓの位置を予測するためにＴｍｓの既存の集合が使用できる度合いを決定する研究を実施した。更に、我々はこれらの研究の結果を配列ベース予想と比較し、複数のＴｍ集合を考慮するときＴｍｓの構造「ホットスポット」がどこであるか、またこれらの統計的有意性が如何にして定義されるかを考慮した（実施例８を参照）。
方法
これらの研究を実施するために、問題の受容体の構造モデルが必要とされた。２セットのホモロジーモデルを、ＭＯＥで利用できるホモロジーモデリングプロトコルを使用して、β２（モデル：β１，Ａ２ＡＡ，Ｍ１，ＮＴＲ）及びβ１（モデル：Ａ２ＡＡ，Ｍ１，ＮＴＲ）の利用できる構造に基づいて構築した。現在の研究の要求に対しては、問題の受容体のアンタゴニスト状態を比較することよりもむしろ、これらの受容体のアゴニスト結合状態を予測するためにＯｒｉｇａｍｉ（登録商標）モデリングアプローチの適用を努力無しになした。アンタゴニスト及びアゴニスト受容体状態の間の差異はＴｍｓ間の距離の全体の統計を変えることはないと考えた。
各受容体モデルを、図３４に示すアラインメントを使用して構築した。最終モデルは、膜貫通相に対してシクロヘキサンの明確な溶媒シェルを、細胞内及び細胞外ドメインに対して水分子を用いて、ＡＭＢＥＲ力場を使用して最小化した。
これらの研究を実施するために、問題の受容体の構造モデルが必要とされた。２セットのホモロジーモデルを、ＭＯＥで利用できるホモロジーモデリングプロトコルを使用して、β２（モデル：β１，Ａ２ＡＡ，Ｍ１，ＮＴＲ）及びβ１（モデル：Ａ２ＡＡ，Ｍ１，ＮＴＲ）の利用できる構造に基づいて構築した。現在の研究の要求に対しては、問題の受容体のアンタゴニスト状態を比較することよりもむしろ、これらの受容体のアゴニスト結合状態を予測するためにＯｒｉｇａｍｉ（登録商標）モデリングアプローチの適用を努力無しになした。アンタゴニスト及びアゴニスト受容体状態の間の差異はＴｍｓ間の距離の全体の統計を変えることはないと考えた。
各受容体モデルを、図３４に示すアラインメントを使用して構築した。最終モデルは、膜貫通相に対してシクロヘキサンの明確な溶媒シェルを、細胞内及び細胞外ドメインに対して水分子を用いて、ＡＭＢＥＲ力場を使用して最小化した。
変異は、テキストファイルから変異を読み取り、それらを構造に割り当てるためにＭＯＥ(Chemical Computing Group Inc)に書かれた自動化手順を使用して受容体構造にマッピングした。受容体に使用した変異のセットを図３３に記載する。
統計的解析の基礎を提供するために、一セットのランダム変異マッピングがまた必要とされた。このデータセットは既知のＴｍｓの数と同じ数の変異を各受容体構造に無作為に割り当てることによって得ることができた。これは、座標データで６７０００のＴｍマッピングを表す１０００回実施した。このデータセットは、実際のデータの比較がなされうる代表的な統計分布を提供するのに十分に大きいと考えられた。
統計的解析の基礎を提供するために、一セットのランダム変異マッピングがまた必要とされた。このデータセットは既知のＴｍｓの数と同じ数の変異を各受容体構造に無作為に割り当てることによって得ることができた。これは、座標データで６７０００のＴｍマッピングを表す１０００回実施した。このデータセットは、実際のデータの比較がなされうる代表的な統計分布を提供するのに十分に大きいと考えられた。
結果
Ｔｍ距離マッピング
マップされたＴｍｓ間の距離の二つの異なった尺度を計算した。最初のものは単に残基のＣα原子間の距離であった。第二のものは二つの残基の任意の原子間の距離であった。
各Ｔｍに対して、与えられた距離内に見出される他のＴｍの数を記録した。Ｃα法では、距離は６Å、８Å、１０Å及び１２Åであった。任意原子法では、シェル距離は４Å、６Å及び８Åであった。
解析をまた１０００のランダムなＴｍマッピングに適用し、観察されたデータの有意性が計算できる各半径での平均と標準偏差を提供した。Ｃα法に対する結果を以下の表Ｅに示す。
Ｔｍ距離マッピング
マップされたＴｍｓ間の距離の二つの異なった尺度を計算した。最初のものは単に残基のＣα原子間の距離であった。第二のものは二つの残基の任意の原子間の距離であった。
各Ｔｍに対して、与えられた距離内に見出される他のＴｍの数を記録した。Ｃα法では、距離は６Å、８Å、１０Å及び１２Åであった。任意原子法では、シェル距離は４Å、６Å及び８Åであった。
解析をまた１０００のランダムなＴｍマッピングに適用し、観察されたデータの有意性が計算できる各半径での平均と標準偏差を提供した。Ｃα法に対する結果を以下の表Ｅに示す。
データは、全半径内に見出されたＴｍｓの平均数（平均）がランダム分布に対して見出されたもの（ランダム平均）よりも高いこと、またこれらの値が統計的に有意であること（ｐ＜０．００５）を示している。更に、半径が大きくなるにつれて、観察された値とランダム分布の間の差がより顕著になる。任意原子基準によって決定されたデータは、以下の表Ｆに示す。
データは、全半径内に見出されたＴｍｓの平均数（平均）がランダム分布に対して見出されたもの（ランダム平均）よりも高いこと、またこれらの値が統計的に有意であること（ｐ＜０．００５）を示している。予想されたように、側鎖接触がまた含められるので、類似のＣα法と比較して、より多くのＴｍｓが与えられた半径内に同定される。任意原子法のρ値が低いという事実は、Ｔｍ一及びその間の距離に対して側鎖位置が重要であることを示している。
距離基準を使用するＴｍの同定
同定されたＴｍｓの数がランダム分布と比較して統計的に意味があるとのＴｍ構造マッピングから得られた結果に基づいて、トレーニングデータに見られない受容体上のＴＭＳの位置を予測するためにその能力内におけるこれの有用性を評価することは重要であると考えられた。研究は、実施例６に記載されたＴｍ予測解析に基づくシークエンスと同様にして実施した。β１、Ａ２ＡＡ、ＮＴＲ及びＭ１からの各受容体に対して他の３に対する既知の変位を候補Ｔｍ位置の同定の基礎として使用した。Ｃα及び任意原子法の双方をそれぞれの場合に異なった半径で使用した。シチメンチョウβ１構造（ＰＤＢコート：２ｖｔ４）に基づく一セットのモデルとヒトβ２構造（ＰＤＢ受託コード：２ｒｈ１）に基づく一セットのモデルの双方を解析し、結果が構造テンプレートの差に如何に感受性があるかの解析が可能になった。
同定されたＴｍｓの数がランダム分布と比較して統計的に意味があるとのＴｍ構造マッピングから得られた結果に基づいて、トレーニングデータに見られない受容体上のＴＭＳの位置を予測するためにその能力内におけるこれの有用性を評価することは重要であると考えられた。研究は、実施例６に記載されたＴｍ予測解析に基づくシークエンスと同様にして実施した。β１、Ａ２ＡＡ、ＮＴＲ及びＭ１からの各受容体に対して他の３に対する既知の変位を候補Ｔｍ位置の同定の基礎として使用した。Ｃα及び任意原子法の双方をそれぞれの場合に異なった半径で使用した。シチメンチョウβ１構造（ＰＤＢコート：２ｖｔ４）に基づく一セットのモデルとヒトβ２構造（ＰＤＢ受託コード：２ｒｈ１）に基づく一セットのモデルの双方を解析し、結果が構造テンプレートの差に如何に感受性があるかの解析が可能になった。
以下の表Ｇはβ２ベーステンプレートに対するＣα法の予測能力を示し、表Ｈはβ２ベーステンプレートに対する任意原子法の予測能力を示している。
予想されるように、双方の方法でのＴｍｓの被覆率は半径の増加と共に増加する。一般に、濃縮はＮＴＲ、Ａ２ＡＡ及びＢ１構造に対してあまり高くなく〜１０−２０％であるが、Ｍ１構造に対して〜６０％濃縮までである。側鎖を距離マトリックスにおいて考慮するかどうかに応じて濃縮係数は同様であるが、正しい予測の被覆率は任意原子距離基準の場合に一般に良好である。これは、側鎖を含める計算が、同じ濃縮係数において、ＣＩ法でよりも多くのＴｍｓの同定を可能にすることを意味している。
シチメンチョウβ１構造に基づき構築されたモデルで実施された同解析の結果を次の表に示す。
シチメンチョウβ１構造に基づき構築されたモデルで実施された同解析の結果を次の表に示す。
以下の表Ｉはβ１ベーステンプレートに対するＣＩ法の予測能力を示し、表Ｊはβ１ベーステンプレートに対する任意原子法の予測能力を示している。
結果はβ２テンプレートのものと非常に類似しており、４つ全ての受容体に対して類似の濃縮が見られ、与えられた濃縮係数でのより高い被覆率が任意原子法で一般に見られる。
興味深いことに、何れのテンプレート及び何れの距離基準を使用しても、濃縮はＭ１受容体に対して一貫して高い。これは、濃縮率がこの受容体に対して更に低い配列法と対照的である。これは、統計的には信頼性が十分ではないが、Ｍ１変異の幾つかが他の受容体における他のＴｍｓに構造的に関連している可能性があることを示している。
別の結論は、被覆率は構造ベースアプローチの場合により高いが、濃縮率は構造スキャニングアプローチと比較して配列スキャニングアプローチの場合により高い（但し、Ｍ１は例外）ことである。マッピングされたＴｍｓ間に３Ｄで明らかにされた余分のセットのヘリックス内関係が与えられた場合、被覆率はこの方法の場合により高いことがおそらく予想されるが、配列のみの解析がより高い濃縮をもたらすことはおそらく予想されない。
興味深いことに、何れのテンプレート及び何れの距離基準を使用しても、濃縮はＭ１受容体に対して一貫して高い。これは、濃縮率がこの受容体に対して更に低い配列法と対照的である。これは、統計的には信頼性が十分ではないが、Ｍ１変異の幾つかが他の受容体における他のＴｍｓに構造的に関連している可能性があることを示している。
別の結論は、被覆率は構造ベースアプローチの場合により高いが、濃縮率は構造スキャニングアプローチと比較して配列スキャニングアプローチの場合により高い（但し、Ｍ１は例外）ことである。マッピングされたＴｍｓ間に３Ｄで明らかにされた余分のセットのヘリックス内関係が与えられた場合、被覆率はこの方法の場合により高いことがおそらく予想されるが、配列のみの解析がより高い濃縮をもたらすことはおそらく予想されない。
次のグラフは構造ベース及び配列ベースの解析の濃縮係数対被覆率値をプロットする。
図３７は、β１テンプレートベース研究に対してＣα及び任意原子法双方に対する濃縮及び被覆率の関係を示している。一般に、任意原子法はＣＩ法と同様の濃縮率でより良好な被覆率を可能にした。
配列ベース対構造ベースのＴｍ同定の比較は図３８に示され、図３７及び３６の複合である。
これらのデータは、構造ベース及び配列ベースＴｍ予測法が、被覆率対濃縮能力の異なったプロファイルを提供することを示している。より大なる被覆率か又はより大なる濃縮が望まれるかどうかについての要求に応じて、他方よりも一方を選択することができる。例外は、構造ベースアプローチが濃縮及び被覆率に関して共により良好に作用するＭ１受容体の場合である。
図３７は、β１テンプレートベース研究に対してＣα及び任意原子法双方に対する濃縮及び被覆率の関係を示している。一般に、任意原子法はＣＩ法と同様の濃縮率でより良好な被覆率を可能にした。
配列ベース対構造ベースのＴｍ同定の比較は図３８に示され、図３７及び３６の複合である。
これらのデータは、構造ベース及び配列ベースＴｍ予測法が、被覆率対濃縮能力の異なったプロファイルを提供することを示している。より大なる被覆率か又はより大なる濃縮が望まれるかどうかについての要求に応じて、他方よりも一方を選択することができる。例外は、構造ベースアプローチが濃縮及び被覆率に関して共により良好に作用するＭ１受容体の場合である。
実施例８：Ｔｍクラスター解析
まとめ
先のセクションに記載したＴｍ構造解析は、Ｔｍｓが無作為分布に従って予想されたよりも平均で全て統計的に近いことであり、これが他の受容体において同定されたＴｍｓに基づいて受容体中にＴｍｓを同定する能力まで有効に形が変わることを示している。この解析はＴｍｓ全体の平均と集合に基づいている一方、データ集合内におけるＴｍｓの特異的クラスターの有意性の同定について興味深い解析を実施することができる。かかるクラスターの同定は、特定のＴｍｓの構造的重要性の理解を生じうる。加えて、これらのクラスターは、既知のものの集合の発生の統計に基づいてＴｍスキャニングのための受容体の特異的呂言う基を標的とするために使用することができる。
まとめ
先のセクションに記載したＴｍ構造解析は、Ｔｍｓが無作為分布に従って予想されたよりも平均で全て統計的に近いことであり、これが他の受容体において同定されたＴｍｓに基づいて受容体中にＴｍｓを同定する能力まで有効に形が変わることを示している。この解析はＴｍｓ全体の平均と集合に基づいている一方、データ集合内におけるＴｍｓの特異的クラスターの有意性の同定について興味深い解析を実施することができる。かかるクラスターの同定は、特定のＴｍｓの構造的重要性の理解を生じうる。加えて、これらのクラスターは、既知のものの集合の発生の統計に基づいてＴｍスキャニングのための受容体の特異的呂言う基を標的とするために使用することができる。
方法
構造的マッピング研究のために計算したＴｍｓの無作為分布を使用して、β１、Ａ２ＡＡ、ＮＴＲ及びＭ１受容体（β１構造に基づく）。無作為マッピングの分布から、Ｃα法を使用して各半径でのクラスターの平均数と標準偏差を計算し、正規分布に合致すると仮定した。実際のＴｍマッピングから異なった半径で同定された各クラスターの有意性をついで計算し、統計的に有意なクラスターを解析のために取っておいた。表Ｋはこれらのクラスターをまとめている。６Åで同定されたクラスターは最も低い有意性であった(ρ = 0.054)。
構造的マッピング研究のために計算したＴｍｓの無作為分布を使用して、β１、Ａ２ＡＡ、ＮＴＲ及びＭ１受容体（β１構造に基づく）。無作為マッピングの分布から、Ｃα法を使用して各半径でのクラスターの平均数と標準偏差を計算し、正規分布に合致すると仮定した。実際のＴｍマッピングから異なった半径で同定された各クラスターの有意性をついで計算し、統計的に有意なクラスターを解析のために取っておいた。表Ｋはこれらのクラスターをまとめている。６Åで同定されたクラスターは最も低い有意性であった(ρ = 0.054)。
結果は、４種の受容体にマッピングする６７のＴｍｓから２６だけが統計的に有意なクラスター（８Å及び１０Å）にマッピングすることを示している。これらのクラスターの内、１、２、３及び５が、構造的に区別されるクラスター４と同じ残基の幾つかを共有している。而して、ＧＰＣＲｓの２領域のみがＴｍｓの統計的に有意なクラスターを含む。８又は１０Åのクラスターの外側に見出される６Åにおけるクラスター中の唯一の残基はクラスター１２に見出され、これがＴＭ４にマッピングされる（クラスター６−１３を含む図３９を参照）。
クラスターは大体はＴＭ５、ＴＭ６の底部及び中央ＴＭ７にマッピングし、他のものはＴＭ４の細胞内端部上に位置している（６Åクラスター）。興味深いことに、これらの残基の全てが受容体の細胞内部分に向けて位置している。他の興味深い観点は、最も大きいクラスター（クラスター１）と二つの膜貫通ヘリックスにマッピングするクラスター４を除いて全てのクラスターが全て同じヘリックス上に位置している点である。これは、配列ベースの方法が構造方法と比較したときなぜ良好に作用するかを説明する−（統計的クラスタリングの観点で見たとき）既存のＴＭデータの大半を支配するヘリックス４、５、６及び７の１−２ターン部分が存在している。
而して、このデータは、改善された構造ベースのＴｍスクリーニングが、全ての重要なクラスターの中心を選択し、スクリーニングの濃縮を最大にしうるスーパークラスターの半径中心としてこれを使用することによってなすことができることを示唆している。
クラスターは大体はＴＭ５、ＴＭ６の底部及び中央ＴＭ７にマッピングし、他のものはＴＭ４の細胞内端部上に位置している（６Åクラスター）。興味深いことに、これらの残基の全てが受容体の細胞内部分に向けて位置している。他の興味深い観点は、最も大きいクラスター（クラスター１）と二つの膜貫通ヘリックスにマッピングするクラスター４を除いて全てのクラスターが全て同じヘリックス上に位置している点である。これは、配列ベースの方法が構造方法と比較したときなぜ良好に作用するかを説明する−（統計的クラスタリングの観点で見たとき）既存のＴＭデータの大半を支配するヘリックス４、５、６及び７の１−２ターン部分が存在している。
而して、このデータは、改善された構造ベースのＴｍスクリーニングが、全ての重要なクラスターの中心を選択し、スクリーニングの濃縮を最大にしうるスーパークラスターの半径中心としてこれを使用することによってなすことができることを示唆している。
例えば、主要クラスターの中心に位置させられた半径１５Åの球は４種の受容体から４５９の残基（合計１３５９から）をカバーするが、６７の熱安定化変異から３９を予測しうる。而して、これは、１．７２の濃縮係数とＴｍ予想における０．５８の被覆率を表す。これは、配列のおよそ１／３のみが被覆されるので、濃縮と被覆の良好なバランスを表すことが示唆される。一方法として、このクラスター群のクラスターのアプローチは、我々が全ての可能な変異の２／３を同定することが期待されるものから集められる〜１３０残基に対して熱安定性データを必要としうる。これは、実施例７に示された構造スクリーニングデータについての改善であり、ＧＰＣＲの細胞内部分に向けて標的化できる統計的に有意なクラスターがＴｍセット内に存在しているという事実に依存している。このクラスターは次の図４１に示す。
これらのクラスター残基の構造的及び機能的役割は興味深く、これらの位置における変異がなぜ受容体を安定化するかの説明を提供しうる。
これらのクラスター残基の構造的及び機能的役割は興味深く、これらの位置における変異がなぜ受容体を安定化するかの説明を提供しうる。
Claims (17)
- 親ＧＰＣＲに対して増大した立体構造安定性を有する候補変異体ＧＰＣＲを選択するための方法であって、
（Ａ）変性条件下で特定の立体構造において、変性条件下で同じ特定の立体構造における第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体のアミノ酸配列において、一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の位置を同定することであって、
第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が、
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）親ＧＰＣＲがアゴニスト立体構造及びアンタゴニスト立体構造から選択される特定の立体構造にあるときに該親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択することであって、ここで、
（ａ）アゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられ；及び
（ｂ）アンタゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アンタゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられる、選択すること、
（ｉｉｉ）選択されたリガンドの結合に関して特定の立体構造にあるときの前記又は各変異体ＧＰＣＲが、そのリガンドの結合に関して同じ特定の立体構造にあるときの第一の親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した立体構造安定性を有するか否かを、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨから選択される変性条件下においてリガンド結合能の変化を測定することにより決定すること、及び
（ｉｖ）選択したリガンドの結合に関して、第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する変異体を選択すること
を含む方法によって得ることができる、同定すること、及び
（Ｂ）（ｉ）一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する、工程（Ａ）において同定された一又は複数の位置に対応する一又は複数の位置で、第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の候補変異体を提供する、作製すること、；（ｉｉ）ｉプラス又はマイナス５残基の一又は複数のウィンドウ内において、第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の候補変異体を提供する、作製することであって、ここでｉは、第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する、工程（Ａ）において同定された一又は複数の位置に対応する一又は複数の位置に対応するものである、作製すること；又は（ｉｉｉ）アミノ酸残基ｉのＣα原子から１２Åの距離内、又はアミノ酸残基ｉ内の任意の原子から８Åの距離内に、第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の候補変異体を提供する、作製することであって、ここで、ｉは、第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する、工程（Ａ）において同定された一又は複数の位置に対応する一又は複数の位置に対応するものである、作製すること、
を含み、第二のＧＰＣＲは、（ｉ）第一のＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有し；（ｉｉ）対応する位置がアラインメントにより決定し得るように、第一のＧＰＣＲと整列することが可能であり；及び（ｉｉｉ）第一のＧＰＣＲと同じＧＰＣＲのクラス又はファミリーである、方法。 - 親ＧＰＣＲに対して増大した立体構造安定性を有する候補変異体ＧＰＣＲを選択するための方法であって、
（Ａ）変性条件下で特定の立体構造において、変性条件下で同じ特定の立体構造の第一の親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供することであって、
第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が、
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）親ＧＰＣＲがアゴニスト立体構造及びアンタゴニスト立体構造から選択される特定の立体構造にあるときに該親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択することであって、ここで、
（ａ）アゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられ；及び
（ｂ）アンタゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アンタゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられる、選択すること、
（ｉｉｉ）選択されたリガンドの結合に関して特定の立体構造にあるときの前記又は各変異体ＧＰＣＲが、そのリガンドの結合に関して同じ特定の立体構造にあるときの第一の親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した立体構造安定性を有するか否かを、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨから選択される変性条件下においてリガンド結合能の変化を測定することにより決定すること、及び
（ｉｖ）選択したリガンドの結合に関して、第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する変異体を選択すること
を含む方法によって得ることができる、提供すること、及び
（Ｂ）一又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の構造モチーフを構造膜タンパク質モデル中で同定することであって、一又は複数の構造モチーフが、ヘリックス界面、ヘリックスのねじれ、ヘリックスのねじれの反対側のヘリックス、脂質二重層に向いたヘリックス表面、疎水性−親水性境界層の脂質二重層を向いたヘリックス表面、ループ領域、又はタンパク質結合ポケットの何れかである、同定すること、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）において同定された一又は複数の構造モチーフに対応する第二の親ＧＰＣＲにおける一又は複数の対応する構造モチーフを定めるアミノ酸配列に、一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の候補変異体を提供する、作製すること
を含み、第二のＧＰＣＲは、（ｉ）対応する一又は複数の構造モチーフがアラインメントにより決定し得るように、第一のＧＰＣＲと整列することが可能であり；（ｉｉ）第一のＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有し；及び（ｉｉｉ）第一のＧＰＣＲと同じＧＰＣＲのクラス又はファミリーである、方法。 - 第一のＧＰＣＲの一又は複数の変異体の結合親和性が、選択されるリガンドに対する親の結合親和性と実質的に同じかそれより大きい請求項１又は２に記載の方法。
- 工程（ｉ）−（ｉｖ）が一又は複数回繰り返され、工程（ｉｖ）における増大した安定性を有する第一のＧＰＣＲの選択された変異体が方法の次の回における親ＧＰＣＲを表す請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
- 工程（ｉｉ）において、二以上のリガンドが選択され、それぞれの存在がＧＰＣＲを同じ特定の立体構造になるようにさせる請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
- 工程（ｉｖ）において、その親と比較して、工程（ｉｉ）で選択したリガンドと異なるクラスのリガンドに結合する能力が低減した変異体ＧＰＣＲを選択する請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
- 工程（ｉｖ）において選択された変異体ＧＰＣＲがＧタンパク質に共役できるか、又は工程（ｉｖ）において選択された変異体ＧＰＣＲが、親ＧＰＣＲに匹敵する伝播及び／又は親和性の順番で選択リガンドと同じクラスの複数のリガンドに結合できるかが決定される請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
- 工程（Ａ）における第一の親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が、第一の親ＧＰＣＲと比較して複数の変異を含んでいる請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
- 第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲが、その対応する親受容体と比較して、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした次の位置：Ｉｌｅ５５、Ｇｌｙ６７、Ａｒｇ６８、Ｖａｌ８９、Ｍｅｔ９０、Ｇｌｙ９８、Ｉｌｅ１２９、Ｓｅｒ１５１、Ｖａｌ１６０、Ｇｌｎ１９４、Ｇｌｙ１９７、Ｌｅｕ２２１、Ｔｙｒ２２７、Ａｒｇ２２９、Ｖａｌ２３０、Ａｌａ２３４、Ａｌａ２８２、Ａｓｐ３２２、Ｐｈｅ３２７、Ａｌａ３３４、及びＰｈｅ３３８の何れか一又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有している、変異体βアドレナリン受容体であり、任意選択的に、該変異体βアドレナリン受容体は、配列を図９に記載したシチメンチョウβアドレナリン受容体のものと少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、その対応する親受容体と比較して、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした次の位置：Ｇｌｙ１１４、Ｇｌｙ１１８、Ｌｅｕ１６７、Ａｌａ１８４、Ａｒｇ１９９、Ａｌａ２０３、Ｌｅｕ２０８、Ｇｌｎ２１０、Ｓｅｒ２１３、Ｇｌｕ２１９、Ａｒｇ２２０、Ｓｅｒ２２３、Ｔｈｒ２２４、Ｇｌｎ２２６、Ｌｙｓ２２７、Ｈｉｓ２３０、Ｌｅｕ２４１、Ｐｒｏ２６０、Ｓｅｒ２６３、Ｌｅｕ２６７、Ｌｅｕ２７２、Ｔｈｒ２７９、Ａｓｎ２８４、Ｇｌｎ３１１、Ｐｒｏ３１３、及びＬｙｓ３１５の何れか一又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有している変異体アデノシン受容体であり、任意選択的に、変異体アデノシン受容体が、配列を図１０に記載したヒトアデノシンＡ２ａ受容体のものと少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、その対応する親受容体と比較して、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けした次の位置：Ａｌａ６９、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ａｌａ８６、Ａｌａ９０、Ｓｅｒ１００、Ｈｉｓ１０３、Ｓｅｒ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｌｅｕ１１１、Ａｓｐ１１３、Ｉｌｅ１１６、Ａｌａ１２０、Ａｓｐ１３９、Ｐｈｅ１４７、Ａｌａ１５５、Ｖａｌ１６５、Ｇｌｕ１６６、Ｌｙｓ１７６、Ａｌａ１７７、Ｔｈｒ１７９、Ｍｅｔ１８１、Ｓｅｒ１８２、Ａｒｇ１８３、Ｐｈｅ１８９、Ｌｅｕ２０５、Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｙ２０９、Ｇｌｙ２１５、Ｖａｌ２２９、Ｍｅｔ２５０、Ｉｌｅ２５３、Ｌｅｕ２５６、Ｉｌｅ２６０、Ａｓｎ２６２、Ｖａｌ２６８、Ａｓｎ２７０、Ｔｈｒ２７９、Ｍｅｔ２９３、Ｔｈｒ２９４、Ｇｌｙ３０６、Ｌｅｕ３０８、Ｖａｌ３０９、Ｌｅｕ３１０、Ｖａｌ３１３、Ｐｈｅ３４２、Ａｓｐ３４５、Ｔｙｒ３４９、Ｔｙｒ３５１、Ａｌａ３５６、Ｐｈｅ３５８、Ｖａｌ３６０、Ｓｅｒ３６２、Ａｓｎ３７０、Ｓｅｒ３７３、Ｐｈｅ３８０、Ａｌａ３８５、Ｃｙｓ３８６、Ｐｒｏ３８９、Ｇｌｙ３９０、Ｔｒｐ３９１、Ａｒｇ３９２、Ｈｉｓ３９３、Ａｒｇ３９５、Ｌｙｓ３９７、及びＰｒｏ３９９の何れか一又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有している変異体ニューロテンシン受容体であり、任意選択的に、変異体ニューロテンシン受容体が、配列を図１１に記載したラットニューロテンシン受容体のものと少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有し；又は第一の親ＧＰＣＲの変異体ＧＰＣＲは、対応する野生型のムスカリン受容体と比較して、図１７に記載のヒトムスカリン受容体の番号付けした次の位置：Ｌｅｕ６５、Ｍｅｔ１４５、Ｌｅｕ３９９、Ｉｌｅ３８３及びＭｅｔ３８４の何れか一又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有している変異体ムスカリン受容体であり、変異体ムスカリン受容体が、配列を図１７に記載したラットニューロテンシン受容体のものと少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
- 構造膜タンパク質モデルが、
タンパク質ドメインにわたって、工程（Ａ）の第一の親ＧＰＣＲの変異体と少なくとも２０％の配列同一性を有する内在性膜タンパク質の構造膜タンパク質モデルであって、変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸を有する構造膜タンパク質モデル、
ＧＰＣＲである内在性膜タンパク質の構造膜タンパク質モデルであって、ＧＰＣＲが、任意選択的に第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲのクラス又はファミリーのＧＰＣＲである、構造膜タンパク質モデル、又は
ヒトβ２アドレナリン受容体又はウシロドプシンのモデルである、請求項２〜８の何れか一項に記載の方法。 - その親ＧＰＣＲに対して増大した立体構造安定性を有する候補変異体ＧＰＣＲを選択するための方法であって、
（Ａ）変性条件下で特定の立体構造において、変性条件下で同じ特定の立体構造における親ＧＰＣＲに対して増大した安定性を有するＧＰＣＲの一又は複数の変異体の一の三次元モデルを提供すること、又は一又は複数の三次元モデルを整列させることであって、
ＧＰＣＲの一又は複数の変異体が、
（ｉ）親ＧＰＣＲの一又は複数の変異体を提供すること、
（ｉｉ）親ＧＰＣＲがアゴニスト立体構造及びアンタゴニスト立体構造から選択される特定の立体構造にあるときに該親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択することであって、ここで、
（ａ）アゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられ；及び
（ｂ）アンタゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アンタゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられる、選択すること、
（ｉｉｉ）選択されたリガンドの結合に関して特定の立体構造にあるときの前記又は各変異体ＧＰＣＲが、そのリガンドの結合に関して同じ特定の立体構造にあるときの第一の親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した立体構造安定性を有するか否かを、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨから選択される変性条件下においてリガンド結合能の変化を測定することにより決定すること、及び
（ｉｖ）選択したリガンドの結合に関して、第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する変異体を選択すること
を含む方法によって得ることができる、提供すること、又は整列させること、
（Ｂ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の位置を、一又は複数の変異体のアミノ酸配列中に同定すること、
（Ｃ）一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して異なったアミノ酸残基を有する一又は複数の位置におけるアミノ酸残基のＣα原子又は前記アミノ酸残基内の任意の原子から設定距離１２Å内に、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する他の位置の数を前記モデル又は整列された一を超えるモデルから決定すること、及び
（Ｄ）（ｉ）他の位置の数が統計的に有意なクラスターを表すかどうかを決定し、もしそうなら、一又は複数の変異体が親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１個の異なるアミノ酸残基を有する一又は複数の対応する位置のアミノ酸残基のＣα原子又は前記アミノ酸残基内の任意の原子から１２Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した立体構造安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の候補変異体を提供する、作製することであって、第二のＧＰＣＲは、（Ｉ）対応する一又は複数の位置がアラインメントにより決定し得るように、工程（Ａ）において親ＧＰＣＲと整列することが可能であり；（ＩＩ）工程（Ａ）における親ＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有し；及び（ＩＩＩ）工程（Ａ）における親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲのクラス又はファミリーである、作製すること；又は
（ｉｉ）他の位置の数が統計的に有意なクラスターを表すかどうかを決定し；同定された二以上の統計的に有意なクラスターの中心を決定し、及び二以上の統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置から１５Åの距離内に第二のＧＰＣＲを定めるアミノ酸配列中に一又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲに対して増大した立体構造安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの一又は複数の候補変異体を提供する、作製することであって、第二のＧＰＣＲは、（Ｉ）二以上の統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置がアラインメントにより決定し得るように、工程（Ａ）において親ＧＰＣＲと整列することが可能であり、；（ＩＩ）工程（Ａ）における親ＧＰＣＲと少なくとも７０％の配列同一性を有し；及び（ＩＩＩ）工程（Ａ）における親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲのクラス又はファミリーであり、距離１５Åは、個々のクラスターの全てを捕捉するのに十分な半径をもたらす二以上の統計的に有意なクラスターの中心に対応する位置からの距離である、作製すること
を含む方法。 - 一又は複数の三次元モデルが請求項１０に記載の変異体ＧＰＣＲの何れか一又は複数のモデルである請求項１１に記載の方法。
- 少なくとも２、３、４、５又は１０のモデルが整列せしめられる、請求項１１に記載の方法。
- 統計的に有意なクラスターが、９５％レベルで有意である（ρ＜０．０５）ものである、請求項１１に記載の方法。
- （ｉ）第二の親ＧＰＣＲがアゴニスト立体構造及びアンタゴニスト立体構造から選択される特定の立体構造にあるときに、該第二の親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択することであって、ここで、
（ａ）アゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられ；及び
（ｂ）アンタゴニストリガンドは、一又は複数の変異体に結合することにより、アンタゴニスト立体構造において増大した立体構造安定性を有する一又は複数の変異体を選択するために用いられる、選択すること；
（ｉｉ）選択されたリガンドの結合に関してある特定の立体構造にあるときの第二の親ＧＰＣＲの前記又は各変異体が、そのリガンドの結合に関して同じ特定の立体構造にあるときの第二の親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した立体構造安定性を有するか否かを、熱、界面活性剤、カオトロピック剤及び極端なｐＨから選択される変性条件下においてリガンド結合能の変化を測定することにより決定すること、及び
（ｉｉｉ）選択したリガンドの結合に関して、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造安定性を有する変異体を選択すること
をさらに含む請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。 - リガンドが、完全アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト及びアンタゴニストの何れか一つであり、又はリガンドが、ＧＰＣＲに結合するポリペプチドであり、又はリガンドが抗体、アンキリン、Ｇタンパク質、ＲＧＳタンパク質、アレスチン、ＧＰＣＲキナーゼ、レセプターチロシンキナーゼ、ＲＡＭＰ、ＮＳＦ、ＧＰＣＲ、ＮＭＤＡレセプターサブユニットＮＲ１又はＮＲ２ａ、又はカルシオン（calcyon）、又はＧＰＣＲに結合する誘導体の何れかである請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
- 第二のＧＰＣＲの一又は複数の変異体の結合親和性が、選択したリガンドについての第二の親ＧＰＣＲの結合親和性と実質的に同一であるか又はそれ以上である請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
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