ES2972473T3

ES2972473T3 - Receptores acoplados a proteína G mutantes y métodos para elaborarlos

Info

Publication number: ES2972473T3
Application number: ES12196192T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Richard Heal; Richard Henderson; Christopher Gordon Tate; Malcolm Peter Weir
Original assignee: Nxera Pharma UK Ltd
Current assignee: Nxera Pharma UK Ltd
Priority date: 2007-12-08
Filing date: 2008-12-08
Publication date: 2024-06-12
Anticipated expiration: 2028-12-08
Also published as: DK2220229T3; JP2011505800A; EP2220229B1; US8748182B2; WO2009071914A2; PL2568045T3; JP2015133973A; GB0724051D0; GB2467830A; JP6567291B2; WO2009071914A3; EP2568045B1; EP2568045A1; CA2708037A1; EP2220229A2; CA2708037C; GB201000387D0; AU2008332896B2; AU2008332896A1; GB2467830B

Abstract

Un método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método: (a) identificar en la secuencia de aminoácidos de uno o más mutantes de un primer GPCR parental con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, con respecto al primer GPCR parental, la posición o posiciones en las que uno o más mutantes tener al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y (b) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una ventana o ventanas de i más o menos 5 residuos donde i es el posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada con respecto al segundo GPCR original; en el que el segundo GPCR puede alinearse con el primer GPCR y la posición o posiciones correspondientes se identifican mediante alineación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores acoplados a proteína G mutantes y métodos para elaborarlos

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones y se refiere a receptores acoplados a proteína G (GPCR) mutantes y a métodos para seleccionar aquellos con estabilidad aumentada. En particular, se refiere a la selección y preparación de GPCR mutantes que tienen estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes en comparación con sus respectivas proteínas originales. Es más probable que tales proteínas sean cristalizables y, por tanto, susceptibles de determinación de estructura, que las proteínas originales. También son útiles para estudios de descubrimiento y desarrollo de fármacos.

Durante los últimos 20 años, la tasa de determinación de las estructuras de las proteínas de membrana ha aumentado gradualmente, pero la mayor parte del éxito se ha producido en la cristalización de proteínas de membrana de bacterias en lugar de eucariotas [1]. Las proteínas de membrana bacterianas han sido más fáciles de sobreexpresar usando técnicas convencionales enEscherichia colique las proteínas de membrana eucariotas [2,3] y las proteínas bacterianas a veces son mucho más estables en detergente, siendo la estabilidad en detergente un requisito previo esencial para la purificación y cristalización. Los proyectos de secuenciación del genoma también han permitido la clonación y expresión de muchos homólogos de un transportador o canal iónico específico, lo que también mejora enormemente las posibilidades de éxito durante la cristalización. Sin embargo, de las 120 estructuras diferentes de proteínas de membrana que se han resuelto hasta la fecha, sólo existen siete estructuras de proteínas integrales de membrana de mamíferos (http://blanco.biomol.uci.edu/); cinco de estas proteínas de membrana se purificaron a partir de fuentes naturales y son estables en disoluciones de detergente. Aparte de las dificultades para sobreexpresar proteínas de membrana eucariotas, a menudo tienen poca estabilidad en disoluciones de detergente, lo que restringe severamente la variedad de condiciones de cristalización que pueden explorarse sin su desnaturalización o precipitación inmediata. Idealmente, las proteínas de membrana deberían permanecer estables durante muchos días en cualquier disolución de detergente dada, pero los detergentes que son más adecuados para el crecimiento de cristales con calidad de difracción tienden a ser los detergentes más desestabilizadores, es decir, aquellos con cadenas alifáticas cortas y grupos de cabeza pequeños o cargados. También pretenden resolverse las estructuras de las proteínas de membrana humanas, porque son necesarias para ayudar al desarrollo de agentes terapéuticos por parte de la industria farmacéutica; a menudo existen diferencias sustanciales en la farmacología de los receptores, canales y transportadores de diferentes mamíferos, mientras que los genomas de levaduras y bacterias pueden no incluir proteínas homólogas. Por tanto, existe una necesidad abrumadora de desarrollar una estrategia genérica que permita la producción de proteínas de membrana integrales eucariotas estables en detergentes para la cristalización y determinación de la estructura y potencialmente para otros fines, tales como aplicaciones de selección de fármacos, bioensayos y biosensores.

Las proteínas de membrana han evolucionado para ser lo suficientemente estables en la membrana para garantizar la viabilidad celular, pero no han evolucionado para ser estables en una disolución de detergente, lo que sugiere que podrían hacerse evolucionar artificialmente las proteínas de membrana y aislar mutantes estables en detergentes [4]. Esto se demostró posteriormente para dos proteínas bacterianas, la diacilglicerol cinasa (DGK) [5,6] y la bacteriorrodopsina [7]. La mutagénesis aleatoria de DGK identificó mutaciones puntuales específicas que aumentaban la termoestabilidad y, cuando se combinaban, el efecto era aditivo, de modo que el mutante óptimamente estable tenía una semivida de 35 minutos a 80 °C en comparación con una semivida de 6 minutos a 55 °C para la proteína nativa [6]. Se demostró que el trímero del mutante DGK resistente a los detergentes se había vuelto estable en SDS y, por tanto, es probable que la estabilización del estado oligomérico desempeñara un papel importante en la termoestabilización. Aunque el objetivo de la mutagénesis era producir una proteína de membrana adecuada para la cristalización, la estructura de DGK aún ha de determinarse y no ha habido informes de cristalización exitosa. Un estudio adicional sobre la bacteriorrodopsina mediante mutagénesis de barrido de cisteína a lo largo de la hélice B demostró que no era posible predecir qué residuos de aminoácidos conducirían a la termoestabilidad tras la mutación ni estaba claro por qué se había producido la termoestabilización cuando se estudiaba en el contexto de la estructura [7].

Los GPCR constituyen una familia muy grande de proteínas que controlan muchos procesos fisiológicos y son las dianas de muchos fármacos eficaces. Por tanto, tienen una importancia farmacológica considerable. Se proporciona una lista de GPCR en Foordet al.(2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288. Los GPCR son generalmente inestables cuando se aíslan y, a pesar de esfuerzos considerables, no ha sido posible cristalizar ninguno excepto la rodopsina bovina, que naturalmente es excepcionalmente estable.

Los GPCR son dianas farmacomanipulables y se hace referencia particularmente a Overingtonet al.(2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996 que indica que más de una cuarta parte de los fármacos actuales tienen un GPCR como diana.

Se cree que los GPCR existen en múltiples conformaciones distintas que están asociadas con diferentes clases farmacológicas de ligandos, tales como agonistas y antagonistas, y que alternan entre estas conformaciones para poder funcionar (Kenakin T. (1997) Ann N Y Acad Sci 812, 116-125).

Se apreciará que los métodos de la invención no incluyen un método tal como se describe en D'Antonaet al.,incluyendo la unión de [3H]CP55940 a un receptor cannabinoide humano 1 (T210A) mutante constitutivamente inactivo en el que el residuo de Thr en la posición 210 se reemplaza por un residuo de Ala.

El documento WO02059346 describe receptores constitutivamente activos, hipersensibles y no funcionales como agentes terapéuticos novedosos.

El documento EP1376132 describe un modelo estructural de GPCR y un método para diseñar la unión al ligando a GPCR usando el modelo estructural.

El documento WO2008068534 describe una estructura cristalina del receptor beta1 adrenérgico de pavo.

Zhouet al.,2000 J Biol Chem 275(10): 6975-6979 describen una metodología para construir una proteína de membrana termoestable.

Bowie, 2001 Current Opinion in Structural Biol 11(4): 397-402 es una revisión sobre la estabilización de proteínas de membrana.

Zhanget al.,2007 Applied and Environmental Microbiology 73(9) describen cómo la adoptación de enlaces de hidrógeno seleccionados e interacciones iónicas de la estructura de fitasa deAspergillus fumigatusmejora la termoestabilidad de fitasa PhyA deAspergillus niger.

Rasmussenet al.,2007 Nature 450:383-387 describen la estructura cristalina del GPCR beta2-adrenérgico humano.

D'Antonaet al.,2006 Brain Research 1108(1): 1-11 describen cómo una mutación del receptor cannabinoide 1 proximal al motivo DRY da como resultado una actividad constitutiva y revela interacciones intramoleculares involucradas en la activación del receptor.

Lehmannet al.,2000 Biochimica et Biophysica Acta 1543(2): 418-415 describen el concepto de consenso para la ingeniería de termoestabilidad de proteínas.

Lattionet al.,febrero de 1999, Letters 457 (3) describen mutantes constitutivamente activos del receptor beta1 adrenérgico.

Berchicheet al.,2007 J Biol Chem 282(8) describen cómo la evaluación directa de las conformaciones mutantes CXCR4 revela un vínculo complejo entre la estructura del receptor y la activación de G(alfa)(i).

Lefévreet al.,1997 Nucleic Acids Research describen cómo la mutagénesis por estiramiento de alanina es un método simple y eficaz para investigar la estructura y función de las proteínas.

Kristiansen, 2004 Pharmacology and Therapeutics 103: 21-80 describe mecanismos moleculares de unión, señalización y regulación de ligandos dentro de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G; y enfoques de modelado molecular y mutagénesis para la estructura y función del receptor.

Folkertsmaet al.,2004 J Mol Biol 341(2): 321-335 describen cómo un enfoque basándose en familias revela la función de los residuos en el dominio de unión al ligando del receptor nuclear.

Serrano-Vegaet al.,2008 PNAS 105(3): 877-882 describen la termoestabilización conformacional del receptor beta1 adrenérgico en una forma resistente a los detergentes.

Magnaniet al.,2008 PNAS 105(3): 10744-10749 describen la estabilidad coevolutiva y la homogeneidad conformacional del receptor de adenosina A (2a) humano.

Warneet al.,2008 Nature 454(7203): 486-491 describen la estructura de un receptor acoplado a proteína G p1-adrenérgico.

La lista o discusión de un documento aparentemente publicado anteriormente en esta memoria descriptiva no debe necesariamente tomarse como un reconocimiento de que el documento forma parte del estado de la técnica o es de conocimiento general común.

Se ha descubierto que existen dos problemas graves asociados al intento de cristalizar los GPCR, concretamente, su falta de estabilidad en detergente y el hecho de que existen en múltiples conformaciones. Para funcionar, los GPCR han evolucionado para alternar entre al menos dos conformaciones distintas, la forma unida a agonista y la forma unida a antagonista, y los cambios entre estas dos conformaciones pueden producirse espontáneamente en ausencia de ligando. Por tanto, es probable que cualquier receptor purificado contenga una mezcla de conformaciones. Simplemente añadir ligandos a los GPCR durante los ensayos de cristalización no ha dado como resultado la determinación de su estructura. Por tanto, para mejorar la probabilidad de cristalización, se seleccionaron mutaciones que mejoraron la estabilidad del GPCR y, además, bloquearon preferentemente el receptor en una conformación específica biológicamente relevante.

Se decidió ver si era posible la estabilización de un GPCR en una conformación particular biológicamente relevante y si el efecto era lo suficientemente grande como para mejorar significativamente las posibilidades de obtener cristales con calidad de difracción. En el ejemplo 1, se eligió como objeto de prueba para este estudio el receptor p1-adrenérgico (PAR) de eritrocitos de pavo [8] por varios motivos. El PAR es un receptor acoplado a proteína G (GPCR) que tiene una farmacología bien desarrollada con muchos ligandos disponibles comercialmente y en forma radiomarcada. Además, la sobreexpresión de PAR ha sido particularmente exitosa usando el sistema de expresión de baculovirus y puede purificarse en cantidades de miligramos en una forma funcional [9]. En el ejemplo 2, se usó un receptor de adenosina humano y en el ejemplo 3, se usó un receptor de neurotensina de rata.

Se encontró que las mutaciones termoestabilizadoras estaban ampliamente dispersas en las secuencias del receptor beta1 adrenérgico de pavo, el receptor de adenosina humano, el receptor de neurotensina de rata y el receptor muscarínico humano. La figura 17 muestra una alineación de tales secuencias con la secuencia del beta-2AR humano de modo que cuando las mutaciones termoestabilizadoras se colocan en las secuencias entonces, en 11 casos de un total de 70, dos secuencias contienen mutaciones en la misma posición (denotada con una estrella en la figura 17). Se ha determinado que esto es estadísticamente muy significativo (p < 0,00002). Por tanto, se apreciará que una vez que se han identificado una o más mutaciones estabilizadoras en un GPCR, puede generarse un GPCR adicional con estabilidad aumentada alineando las secuencias de aminoácidos de los GPCR y realizando la misma una o más mutaciones en la posición o posiciones correspondientes. Este concepto se ejemplifica claramente en la figura 26, en la que las seis mutaciones termoestabilizadoras en p1-m23 de pavo se transfirieron directamente al receptor P2 humano. El mutante resultante, p2-m23, tenía una Tm 12 °C mayor que la del receptor p2 humano.

Además, se ha descubierto que no sólo las posiciones correspondientes de una secuencia alineada de un GPCR adicional son predictivas para identificar mutaciones termoestabilizadoras, sino que también es estadísticamente más probable que las ventanas de aminoácidos alrededor de una mutación termoestabilizadora identificada a partir de secuencias alineadas contengan mutaciones termoestabilizadoras adicionales en comparación con el azar. Esto se ejemplifica claramente en la figura 33 en la que se muestran secuencias alineadas de B1, NTR, A2A con mutaciones termoestabilizadoras marcadas. De 62 mutaciones, de las cuales 18 están alineadas exactamente en las posiciones correspondientes, otras 31 están alineadas dentro de una ventana deimás o menos 4 residuos en la que otra mutación termoestabilizadora está en laiaposición. Esto es estadísticamente muy significativo (p < 0,00001).

Por tanto, se aprecia que una vez que se han identificado una o más mutaciones estabilizadoras en un GPCR, puede generarse un GPCR adicional con estabilidad aumentada alineando las secuencias de aminoácidos de los GPCR y realizando una o más mutaciones dentro de la ventana de aminoácidos en cualquier lado de la posición que corresponde a la mutación termoestabilizadora.

La invención proporciona diversos métodos tal como se define en las reivindicaciones para producir un GPCR mutante con estabilidad de conformación aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original. En la medida en que se dan a conocer otros métodos en el presente documento, se incluyen simplemente con fines de referencia.

En el presente documento se describe simplemente con fines de referencia un método para producir un GPCR mutante con estabilidad aumentada en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(a) identificar en la secuencia de aminoácidos de uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el primer GPCR original, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y

(b) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR en la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original.

aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con el primer GPCR original.

Pueden proporcionarse uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el primer GPCR original, de modo que puede analizarse su secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se puede seleccionar y preparar un mutante estabilizado tal como se describe a continuación y en los ejemplos. Un método para seleccionar un receptor acoplado a proteína G (GPCR) mutante con estabilidad aumentada comprende:

(i) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original,

(ii) seleccionar un ligando, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando el GPCR reside en una conformación particular,

(iii) determinar si el o cada GPCR mutante cuando reside en la conformación particular tiene estabilidad aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad del GPCR original cuando reside en la misma conformación particular con respecto a la unión a ese ligando, y

(iv) seleccionar aquellos mutantes que tienen estabilidad aumentada en comparación con el GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado.

En el contexto de los métodos de la presente invención, el uno o más mutantes del primer GPCR original, o el uno o más mutantes de un GPCR original en la etapa (a), son uno o más mutantes modificados por ingeniería de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano de tipo natural que tienen al menos un aminoácido reemplazado en comparación con el GPCR humano de tipo natural, y que tienen termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR humano de tipo natural;

mediante el cual el uno o más GPCR mutantes tienen una duración de vida prolongada de una conformación agonista en relación con la conformación agonista del GPCR humano de tipo natural en condiciones desnaturalizantes de calor, manifestándose la duración de vida prolongada por la retención de la capacidad de unión al ligando agonista o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se ponen en contacto con el agonista antes de someterse a calor o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se someten a calor antes de ponerse en contacto con el agonista,

o mediante el cual el uno o más GPCR mutantes tienen una duración de vida prolongada de una conformación antagonista en relación con la conformación antagonista del GPCR humano de tipo natural en condiciones desnaturalizantes de calor, manifestándose la duración de vida prolongada por la retención de la capacidad de unión al ligando antagonista o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se ponen en contacto con el antagonista antes de someterse a calor o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se someten a calor antes de ponerse en contacto con el antagonista,

caracterizado además porque el GPCR humano de tipo natural es un GPCR de clase 1, clase 2 o clase 3; y caracterizado además porque el al menos un aminoácido reemplazado está en un motivo estructural seleccionado del grupo que consiste en una interfaz helicoidal, un acodamiento de hélice, una hélice opuesta a un acodamiento de hélice, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica en la capa límite hidrófoba-hidrófila, una región de bucle y un bolsillo de unión a proteínas.

En la medida en que se dan a conocer métodos que implican otros mutantes del primer GPCR original u otros mutantes del GPCR original en la etapa (a), se incluyen simplemente con fines de referencia.

Los inventores han apreciado que, para mejorar la probabilidad de cristalización de un GPCR en una forma biológicamente relevante (que es, por tanto, farmacológicamente útil), es deseable no sólo aumentar la estabilidad de la proteína, sino también que la proteína tenga esta mayor estabilidad cuando está en una conformación particular. La conformación se determina mediante un ligando seleccionado y es una conformación biológicamente relevante, en particular una conformación farmacológicamente relevante. Por tanto, los mutantes de un primer GPCR original que tienen estabilidad aumentada son mutantes que tienen una termoestabilidad aumentada de una conformación particular, es decir, tienen termoestabilidad conformacional aumentada. Por tanto, los métodos de la invención pueden usarse para crear GPCR estables y conformacionalmente bloqueados mediante mutagénesis. Por ejemplo, tras la selección de GPCR mutantes que tienen estabilidad aumentada en una conformación particular, puede identificarse la posición de las mutaciones estabilizadoras en la secuencia de aminoácidos. Luego puede usarse la realización de una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos en otro GPCR en la posición o posiciones correspondientes para producir un GPCR mutante con estabilidad aumentada en una conformación particular en relación con su GPCR original. Los GPCR mutantes son efectivamente formas más puras de las moléculas originales en el sentido de que una proporción mucho mayor de ellas ocupa un estado conformacional particular. La selección deliberada de una conformación de receptor elegida resuelta a partir de otras conformaciones mediante el uso de un ligando (o ligandos) que se une preferentemente a esta conformación es una característica importante del método de selección descrito anteriormente. Por tanto, puede considerarse que el método del primer aspecto de la invención es un método para producir GPCR mutantes que pueden dirigirse fácilmente a la cristalización.

En una revisión del genoma farmacomanipulable realizada por Hopkins y Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730, la tabla 1 contiene una lista de familias de proteínas, muchas de las cuales son GPCR. Overingtonet al.(2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996 proporcionan más detalles sobre las dianas farmacológicas, y la figura 1 indica que más de una cuarta parte de los fármacos actuales seleccionan como diana los GPCR. Hay 52 dianas de GPCR para fármacos disponibles por vía oral de un total de 186 dianas en esta categoría.

Los GPCR adecuados para su uso en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, receptor padrenérgico, receptor de adenosina, en particular receptor de adenosina A<2>a y receptor de neurotensina (NTR). Otros GPCR adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen los enumerados en Hopkins y Groom mencionado anteriormente. Además, la Unión Internacional de Farmacología produce una lista de GPCR (Foordet al.(2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288, y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphardb.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward). Se observará que los GPCR se dividen en diferentes clases, principalmente en función de sus similitudes en la secuencia de aminoácidos. También se dividen en familias según los ligandos naturales a los que se unen. Todos los GPCR están incluidos en el alcance de la invención.

Las secuencias de aminoácidos (y las secuencias de nucleótidos de los ADNc que las codifican) de muchos GPCR están fácilmente disponibles, por ejemplo, mediante referencia a GenBank. En particular, Foordet al.mencionado anteriormente proporcionan los símbolos de genes humanos y las identificaciones de genes humanos, de ratón y de rata de Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Debe indicarse también que debido a que la secuencia del genoma humano está sustancialmente completa, las secuencias de aminoácidos de los GPCR humanos pueden deducirse a partir de la misma.

Aunque el GPCR puede derivarse de cualquier fuente, se prefiere particularmente que sea de una fuente eucariota. Se prefiere particularmente que se derive de una fuente vertebrada tal como un mamífero o un ave. Se prefiere particularmente que el GPCR se derive de rata, ratón, conejo o perro o de primate no humano o de ser humano, o de pollo o pavo. Para evitar dudas, se incluye en el significado de “derivado de” que un ADNc o gen se obtuvo originalmente usando material genético de la fuente, pero que la proteína puede expresarse posteriormente en cualquier célula huésped. Por tanto, quedará claro que un GPCR eucariota (tal como un GPCR de ave o de mamífero) puede expresarse en una célula huésped procariota, tal comoE. coli,pero se considerará derivado de aves o mamíferos, según sea el caso.

En algunos casos, el GPCR puede componerse de más de una subunidad diferente. Por ejemplo, el receptor peptídico relacionado con el gen de la calcitonina requiere la unión de una proteína de hélice transmembrana única (RAMP1) para adquirir sus características fisiológicas de unión al ligando. Las proteínas efectoras, accesorias, auxiliares o que interactúan con GPCR que se combinan con el GPCR para formar o modular un complejo funcional se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, cinasas receptoras, proteínas G y arrestinas (Bockaertet al.(2004) Curr Opinion Drug Discov y Dev 7, 649-657).

Cuando se selecciona un GPCR mutante con estabilidad aumentada en el método de selección descrito anteriormente, los mutantes del GPCR original pueden producirse de cualquier manera adecuada y proporcionarse en cualquier forma adecuada. Por tanto, por ejemplo, puede prepararse una serie de mutantes específicos de la proteína original en los que cada residuo de aminoácido en toda o parte de la proteína original se cambia independientemente por otro residuo de aminoácido. Por ejemplo, puede ser conveniente realizar mutaciones en aquellas partes de la proteína que se predice que atravesarán la membrana. Se conoce la estructura tridimensional de la rodopsina (Liet al.(2004) J Mol Biol 343, 1409-1438; Palczewskiet al.(2000) Science 289, 739-745) al igual que la estructura del receptor p2-adrenérgico humano (Rasmussenet al.(2007) Nature 450, 383-387; Cherezovet al.(2007) Science 318:1258-65; Rosenbaumet al.(2007) Science 318:1266-1273), y es posible modelar determinados GPCR usando estas estructuras. Por tanto, convenientemente, las partes del GPCR a mutar pueden basarse en modelado. De manera similar, hay programas informáticos disponibles que modelan regiones transmembrana de GPCR basándose en la hidrofobia (Kyle y Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132), y pueden usarse tales modelos al seleccionar partes de la proteína a mutar. Puede emplearse mutagénesis dirigida al sitio convencional, o pueden usarse procedimientos basados en la reacción en cadena de la polimerasa bien conocidos en la técnica. Es posible, pero menos deseable, utilizar métodos de presentación en ribosomas en la selección de la proteína mutante.

Normalmente, cada aminoácido seleccionado se reemplaza por Ala (es decir, mutagénesis de exploración de Ala), aunque puede reemplazarse por cualquier otro aminoácido. Si el aminoácido seleccionado es Ala, puede reemplazarse convenientemente por Leu. Alternativamente, el aminoácido puede reemplazarse por Gly (es decir, mutagénesis de exploración de Gly), lo que puede permitir un empaquetamiento más estrecho de hélices vecinas que pueden bloquear la proteína en una conformación particular. Si el aminoácido seleccionado es Gly, puede reemplazarse convenientemente por Ala.

Aunque el aminoácido usado para reemplazar el aminoácido dado en una posición particular es normalmente un aminoácido que se produce de manera natural, normalmente un aminoácido “codificable”, puede ser un aminoácido no natural (en cuyo caso la proteína normalmente se produce mediante síntesis química o mediante el uso de ARNt de aminoacilo no naturales). Un aminoácido “codificable” es aquel que se incorpora a un polipéptido mediante traducción de ARNm. También es posible crear aminoácidos no naturales o introducir enlaces no peptídicos en una posición determinada mediante modificación química covalente, por ejemplo, mediante tratamiento postraduccional de la proteína o semisíntesis. Estas modificaciones postraduccionales pueden ser naturales, tales como fosforilación, glicosilación o palmitoilación, o sintéticas o biosintéticas.

Alternativamente, los mutantes pueden producirse mediante un procedimiento de mutagénesis aleatoria, que puede ser de la proteína completa o de una porción seleccionada de la misma. Los procedimientos de mutagénesis aleatoria se conocen bien en la técnica.

Convenientemente, cuando se selecciona un GPCR mutante con estabilidad aumentada, el GPCR mutante tiene un aminoácido reemplazado en comparación con la proteína original (es decir, está mutado en una posición de aminoácido). De esta manera, puede evaluarse la contribución a la estabilidad de un reemplazo de un solo aminoácido. Sin embargo, el GPCR mutante sometido a ensayo para determinar su estabilidad puede tener más de un aminoácido reemplazado en comparación con la proteína original, tal como 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 reemplazos. Tal como se comenta con más detalle a continuación, pueden realizarse combinaciones de mutaciones basándose en los resultados del método de selección. Se ha descubierto que, en algunos casos específicos, la combinación de mutaciones en una única proteína mutante conduce a un aumento adicional de la estabilidad. Por tanto, se apreciará que el método de selección puede usarse de manera iterativa, por ejemplo, llevándolo a cabo para identificar mutaciones únicas que aumentan la estabilidad, combinando esas mutaciones en un GPCR mutante único que es el GPCR proporcionado luego en la parte (i) del método. Por tanto, pueden seleccionarse proteínas mutantes con mutaciones múltiples usando el método de selección.

Cuando se selecciona un GPCR mutante con estabilidad aumentada, no es necesario que el GPCR original sea la proteína que se produce de manera natural. Convenientemente, puede ser una versión modificada por ingeniería que pueda expresarse en un organismo huésped adecuado, tal comoEscherichia coli.Por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 1, una versión modificada por ingeniería conveniente del receptor p-adrenérgico de pavo es una que está truncada y carece de los residuos 1-33 de la secuencia de aminoácidos (es decir, PAP<34>-<424>). El GPCR original puede ser una forma truncada de la proteína que se produce de manera natural (truncada en uno cualquiera o ambos extremos), o puede ser una fusión, o bien con la proteína que se produce de manera natural o bien con un fragmento de la misma. Alternativa o adicionalmente, el GPC<r>original, en comparación con un GPCR que se produce de manera natural, puede modificarse para mejorar, por ejemplo, la solubilidad, la estabilidad proteolítica (por ejemplo, mediante truncamiento, deleción de bucles, mutación de sitios de glicosilación o mutación de cadenas laterales de aminoácidos reactivos tales como la cisteína). En cualquier caso, el GPCR original es una proteína que puede unirse al ligando seleccionado, ligando que se sabe que se une al GPCR que se produce de manera natural. Convenientemente, el GPCR original es uno que, tras la adición de un ligando apropiado, puede afectar una o más de las actividades posteriores que comúnmente se sabe que se ven afectadas por la activación de la proteína G.

Sin embargo, se apreciará que, cuando se selecciona un GPCR mutante con estabilidad aumentada, la estabilidad del mutante debe compararse con la de un progenitor para poder evaluar un aumento en la estabilidad.

En el método de selección, se selecciona un ligando, siendo el ligando uno que se une al GPCR original cuando reside en una conformación particular. Normalmente, el ligando se unirá a una conformación del GPCR original (y puede hacer que el GPCR adopte esta conformación), pero no se unirá tan fuertemente a otra conformación que el GPCR pueda adoptar. Por tanto, puede considerarse que la presencia del ligando estimula al GPCR a adoptar la conformación particular. Por tanto, se puede considerar que el método de selección es una forma de seleccionar GPCR mutantes que están atrapados en una conformación de relevancia biológica (por ejemplo, estado unido a ligando) y que son más estables con respecto a esa conformación.

La conformación particular en la que reside el GPCR en la etapa (iii) corresponde a la clase de ligando seleccionado en la etapa (ii).

Preferiblemente, el ligando seleccionado es de la clase de ligandos agonistas y la conformación particular es una conformación agonista, o el ligando seleccionado es de la clase de ligandos antagonistas y la conformación particular es una conformación antagonista.

Preferiblemente, el ligando seleccionado es de la clase de ligandos agonistas y la conformación particular en la que reside el GPCR en la etapa (iii) es la conformación agonista.

Preferiblemente, la afinidad de unión al ligando seleccionado para el receptor mutante debe ser igual o mayor que la del receptor de tipo natural; los mutantes que presentan una unión significativamente reducida al ligando seleccionado normalmente se rechazan.

Por “ligando” se incluye cualquier molécula que se una al GPCR y que haga que el GPCR resida en una conformación particular. El ligando es preferiblemente uno que hace que más de la mitad de las moléculas de GPCR en total tengan una conformación particular.

Se conocen muchos ligandos adecuados.

Normalmente, el ligando es un agonista completo y puede unirse al GPCR y puede provocar una respuesta biológica completa (100 %), medida por ejemplo mediante acoplamiento de proteína G, acontecimientos de señalización posteriores o un resultado fisiológico tal como la vasodilatación. Por tanto, normalmente, la respuesta biológica es el intercambio GDP/GTP en una proteína G, seguido de la estimulación de la ruta efectora relacionada. La medición, normalmente, es el intercambio GDP/GTP o un cambio en el nivel del producto final de la ruta (por ejemplo, AMPc, GMPc o fosfatos de inositol). El ligando también puede ser un agonista parcial y puede unirse al GPCR y puede provocar una respuesta biológica parcial (<100 %).

El ligando también puede ser un agonista inverso, que es una molécula que se une a un receptor y reduce su actividad basal (es decir, no estimulada por el agonista) a veces incluso a cero.

El ligando también puede ser un antagonista, que es una molécula que se une a un receptor y bloquea la unión de un agonista, impidiendo así una respuesta biológica. Los agonistas inversos y los agonistas parciales pueden, bajo ciertas condiciones del ensayo, ser antagonistas.

Los ligandos anteriores pueden ser ortostéricos, por lo que se incluye el significado de que se combinan con el mismo sitio que el agonista endógeno; o pueden ser alostéricos o alotópicos, por lo que se incluye el significado de que se combinan con un sitio distinto del sitio ortostérico. Los ligandos anteriores pueden ser sintópicos, por lo que se incluye el significado de que interactúan con otros ligandos en el mismo sitio o en uno superpuesto. Pueden ser reversibles o irreversibles.

En relación con los antagonistas, pueden ser superables, por lo que se incluye el significado de que el efecto máximo del agonista no se reduce ni mediante el tratamiento previo ni con el tratamiento simultáneo con el antagonista; o pueden ser insuperables, por lo que se incluye el significado de que el efecto máximo del agonista se reduce mediante o bien un tratamiento previo o bien un tratamiento simultáneo con un antagonista; o pueden ser neutros, por lo que se incluye el significado de que el antagonista es uno sin actividad agonista inversa o agonista parcial. Los antagonistas normalmente son también agonistas inversos.

Los ligandos para su uso en el método de selección también pueden ser moduladores alostéricos tales como moduladores alostéricos positivos, potenciadores, moduladores alostéricos negativos e inhibidores. Pueden tener actividad como agonistas o agonistas inversos por sí mismos o pueden tener actividad sólo en presencia de un agonista o agonista inverso, en cuyo caso se usan en combinación con tales moléculas para unirse al GPCR. Neubiget al.(2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606 describen diversas clases de ligandos.

Preferiblemente, los ligandos mencionados anteriormente son restos orgánicos o inorgánicos pequeños, pero pueden ser péptidos o polipéptidos. Normalmente, cuando el ligando es un resto orgánico u orgánico pequeño, tiene un M<r>de desde 50 hasta 2000, tal como desde 100 hasta 1000, por ejemplo, desde 100 hasta 500.

Normalmente, el ligando se une al GPCR con una K<d>de desde mM hasta pM, tal como en el intervalo de |iM (micromolar) hasta nM. Generalmente, se prefieren los ligandos con la Kd más baja.

Los ligandos de moléculas orgánicas pequeñas se conocen bien en la técnica; por ejemplo, véanse los ejemplos a continuación. Otros ligandos de moléculas pequeñas incluyen 5HT, que es un agonista completo en el receptor 5HT1A; eltoprazina, que es un agonista parcial del receptor 5HT1A (véase Newman-Tancrediet al.(1997) Neuropharmacology 36, 451-459); (+)-butaclamol y espiperona son agonistas inversos del receptor D2 de dopamina (véase Roberts y Strange (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 34-42); y WIN55212-3 es un antagonista neutro de CB2 (Savinainenet al.(2005) Br. J. Pharmacol. 145, 636-645).

El ligando puede ser un peptidomimético, un ácido nucleico, un ácido peptidonucleico (PNA) o un aptámero. Puede ser un ion tal como Na<+>o Zn<2+>, un lípido tal como oleamida o un hidrato de carbono tal como heparina. El ligando puede ser un polipéptido que se une al GPCR. Tales polipéptidos (entre los cuales se incluyen oligopéptidos) son normalmente de desde M<r>500 hasta M<r>50.000, pero puede ser más grande. El polipéptido puede ser una proteína que interactúa con GPCR que se produce de manera natural u otra proteína que interactúa con GPCR, o un derivado o fragmento de la misma, siempre que se una selectivamente al GPCR en una conformación particular. Las proteínas que interactúan con GPCR incluyen aquellas asociadas con la señalización y aquellas asociadas con el tráfico, que a menudo actúan a través de dominios PDZ en la porción C terminal del GPCR.

Los polipéptidos que se sabe que se unen a determinados GPCR incluyen cualquiera de una proteína G, una arrestina, una proteína RGS, una cinasa receptora de proteína G, una RAMP, una proteína 14-3-3, una NSF, una periplaquina, una espinofilina, una GPCR cinasa, una tirosina cinasa receptora, un canal iónico o subunidad del mismo, una anquirina y una proteína Shanks u Homer. Otros polipéptidos incluyen las subunidades NR1 o NR2a del receptor NMDA, calcyon, o una región de entramado de dominio de fibronectina. El polipéptido puede ser uno que se una a un dominio extracelular de un GPCR, tal como fibulina-1. El polipéptido puede ser otro GPCR, que se une al GPCR seleccionado en un heterooligómero. Una revisión de las interacciones proteína-proteína en los GPCR se encuentra en Milligan y White (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22, 513-518, o en Bockaertet al.(2004) Curr. Opinion Drug Discov. Dev. 7, 649-657.

El ligando de polipéptido puede ser convenientemente un anticuerpo que se une al GPCR. El término “anticuerpo” incluye anticuerpos que se producen de manera natural, anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. También se incluyen anticuerpos y moléculas modificados por ingeniería que son similares a los anticuerpos en sus características de unión, incluyendo moléculas Fv de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos de dominio (dAb). También se hace mención a los anticuerpos de camélidos y los anticuerpos de camélidos modificados por ingeniería. Tales moléculas que se unen a GPCR se conocen en la técnica y en cualquier caso pueden prepararse usando tecnología bien conocida. Los anticuerpos adecuados incluyen los usados actualmente en radioinmunoensayo (RIA) para GPCR, ya que tienden a reconocer epítopos conformacionales. El polipéptido también puede ser una proteína de unión basada en una región de entramado modular, tal como proteínas de repetición de anquirina, proteínas de repetición de armadillo, proteínas ricas en leucina, proteínas de repetición de tetratriopéptidos o proteínas de repetición de anquirina diseñadas (DARPin) o proteínas basadas en dominios de lipocalina o fibronectina o andamios de Affilin basados en ubiquitina humana o gamma-cristalina humana.

En una realización de la invención, el ligando se une covalentemente al GPCR, tal como una proteína G o una proteína de fusión arrestina. Algunos GPCR (por ejemplo, el receptor de trombina) se escinden en el extremo N-terminal mediante una proteasa y el nuevo extremo N-terminal se une al sitio agonista. Por tanto, tales GPCR son fusiones naturales de GPCR-ligando.

Se apreciará que el uso de anticuerpos u otros polipéptidos de unión “universales” (tales como proteínas G que se sabe que se acoplan con muchos GPCR diferentes) puede ser particularmente ventajoso en el uso del método en GPCR “huérfanos” para los cuales se desconocen el ligando natural y los ligandos de moléculas pequeñas.

Una vez que se ha seleccionado el ligando en el método de selección, se determina entonces si el o cada GPCR mutante tiene estabilidad aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con el GPCR original con respecto a la unión a ese ligando. Se apreciará que esta etapa (iii) es una en la que se determina si el o cada GPCR mutante tiene una estabilidad aumentada (en comparación con su progenitor) para la conformación particular que se determina mediante el ligando seleccionado. Por tanto, el GPCR mutante tiene una estabilidad aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado, tal como se mide mediante la unión al ligando o mientras se une al ligando seleccionado. Tal como se comenta a continuación, se prefiere particularmente que se evalúe la estabilidad aumentada mientras se une al ligando seleccionado.

La estabilidad aumentada se mide convenientemente mediante una duración de vida prolongada del mutante en las condiciones impuestas que pueden conducir a la inestabilidad (tales como calor, condiciones de detergentes fuertes, agentes caotrópicos, etc.). La desestabilización en la condición impuesta normalmente se determina midiendo la desnaturalización o pérdida de estructura. Tal como se comenta a continuación, esto puede manifestarse por una pérdida de la capacidad de unión al ligando o una pérdida de indicadores de estructura secundaria o terciaria.

Tal como se describe con respecto a la figura 12 a continuación (que representa una realización particular preferida), existen diferentes formatos de ensayo que pueden usarse para determinar la estabilidad del GPCR mutante.

En una realización, el GPCR mutante puede ponerse en contacto con un ligando antes de someterse a un procedimiento en el que se determina la estabilidad del mutante (el GPCR mutante y el ligando permanecen en contacto durante el periodo de prueba). Por tanto, por ejemplo, cuando el método se usa para seleccionar GPCR mutantes que en una conformación se unen a un ligando y que tienen termoestabilidad mejorada, el receptor se pone en contacto con el ligando antes de calentarse, y luego la cantidad de ligando unido al receptor después del calentamiento puede usarse para expresar la termoestabilidad en comparación con el receptor original. Esto proporciona una medida de la cantidad de GPCR que retiene la capacidad de unión al ligando después de la exposición a condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, calor), que a su vez es un indicador de estabilidad. En una realización alternativa (pero menos preferida), el GPCR mutante se somete a un procedimiento en el que se determina la estabilidad del mutante antes de ponerse en contacto con el ligando. Por tanto, por ejemplo, cuando el método se usa para seleccionar receptores de membrana mutantes que en una conformación se unen a un ligando y que tienen termoestabilidad mejorada, el receptor se calienta en primer lugar, antes de ponerse en contacto con el ligando, y luego la cantidad de ligando unido al receptor puede usarse para expresar termoestabilidad. Nuevamente, esto proporciona una medida de la cantidad de GPCR que retiene la capacidad de unión al ligando después de la exposición a las condiciones desnaturalizantes.

En ambas realizaciones, se apreciará que la comparación de la estabilidad del mutante se realiza con referencia a la molécula original en las mismas condiciones.

Se apreciará que en ambas realizaciones, los mutantes que se seleccionan son aquellos que tienen estabilidad aumentada cuando residen en la conformación particular en comparación con la proteína original que reside en la misma conformación particular.

La ruta preferida puede depender del GPCR específico y dependerá del número de conformaciones accesibles a la proteína en ausencia de ligando. En la realización descrita en la figura 12, se prefiere que el ligando esté presente durante la etapa de calentamiento porque esto aumenta la probabilidad de que se seleccione la conformación deseada.

De lo anterior, se apreciará que el método de selección incluye un método para seleccionar un GPCR mutante con termoestabilidad aumentada, comprendiendo el método (i) proporcionar uno o más mutantes de un GPCR original, (ii) seleccionar un antagonista o un agonista que se une al GPCR original, (iii) determinar si el o cada mutante tiene termoestabilidad aumentada cuando está en presencia de dicho antagonista o agonista midiendo la capacidad del GPCR mutante para unirse a dicho antagonista o agonista seleccionado a una temperatura particular y después de un tiempo particular en comparación con el GPCR original y (iv) seleccionar aquellos GPCR mutantes que se unen más a dicho antagonista o agonista seleccionado a la temperatura particular y después del tiempo particular que el GPCR original en las mismas condiciones. En la etapa (iii), normalmente se usa un periodo de tiempo fijo a la temperatura particular para medir la capacidad del GPCr mutante para unirse a dicho antagonista o agonista seleccionado. En la etapa (iii), normalmente se eligen una temperatura y un tiempo en los que la unión de dicho antagonista o agonista seleccionado por el GPCR original se reduce en un 50 % durante el periodo de tiempo fijado a esa temperatura (lo que es indicativo de que el 50 % del receptor está inactivado; “cuasi” Tm).

Convenientemente, cuando el ligando se usa para someter a ensayo el GPCR (es decir, se usa para determinar si está en un estado no desnaturalizado), el ligando se marca de manera detectable, por ejemplo, se marca radioactivamente o se marca con fluorescencia. En otra realización, la unión al ligando puede evaluarse midiendo la cantidad de ligando no unido usando un sistema de detección secundario, por ejemplo, un anticuerpo u otro compañero de unión de alta afinidad unido covalentemente a un resto detectable, por ejemplo, una enzima que puede usarse en un ensayo colorimétrico (tal como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante). También puede usarse la metodología FRET. Se apreciará que el ligando usado para analizar el GPCR mutante para determinar su estabilidad no necesita ser el mismo ligando seleccionado en la etapa (ii) del método, sino que debe ser un miembro de la misma clase de ligando, por ejemplo, agonista o antagonista, tal como que se está midiendo la misma clase conformacional del receptor.

Aunque es conveniente medir la estabilidad del GPCR original y mutante usando la capacidad de unirse a un ligando como indicador de la presencia de una proteína no desnaturalizada, se conocen otros métodos en la técnica. Por ejemplo, los cambios en los espectros de fluorescencia pueden ser un indicador sensible del desplegamiento, mediante o bien el uso de fluorescencia de triptófano intrínseco o bien el uso de sondas fluorescentes extrínsecas tales como 1-anilino-8-naftalenosulfonato (ANS), por ejemplo, tal como se implementa en el método Thermofluor™ (Mezzasalmaet al.,J Biomol Screening, 2007, abril;12(3):418-428). La estabilidad proteolítica, el intercambio deuterio/hidrógeno medido mediante espectrometría de masas, geles nativos azules, electroforesis de zona capilar, espectros de dicroísmo circular (DC) y dispersión de luz también pueden usarse para medir el desplegamiento por pérdida de señales asociadas con la estructura secundaria o terciaria. Sin embargo, todos estos métodos requieren que la proteína se purifique en cantidades razonables antes de que puedan usarse (por ejemplo, cantidades elevadas de pmol/nmol), mientras que el método descrito en los ejemplos usa cantidades de pmol de GPCR esencialmente sin purificar.

En una realización preferida, en la etapa (ii) se seleccionan dos o más ligandos de la misma clase, provocando la presencia de cada uno de ellos que el GPCR resida en la misma conformación particular. Por tanto, en esta realización, pueden usarse uno o más ligandos (ya sean naturales o no naturales) de la misma clase (por ejemplo, agonista completo o agonista parcial o antagonista o agonista inverso). La inclusión de múltiples ligandos de la misma clase en este proceso, ya sea en serie o en paralelo, minimiza el riesgo teórico de modificar por ingeniería y seleccionar inadvertidamente conformaciones de receptores con mutaciones múltiples sustancialmente diferentes al progenitor, por ejemplo, en cuanto a su sitio de unión, pero que todavía pueden, debido a cambios compensatorios, unirse al ligando. Pueden usarse las siguientes etapas para mitigar este riesgo:

1. Seleccionar un conjunto químicamente distinto (por ejemplo, n=2-5) de ligandos, en una clase farmacológica común tal como demuestra, por ejemplo, un ensayo de unión o funcional o espectroscópico. Debe pensarse que estos ligandos se unen a una región espacial común del receptor, tal como demuestran, por ejemplo, estudios de unión competitiva que usan receptores de tipo natural y/o mutados, y/o mediante modelado molecular, aunque no necesariamente expresarán un farmacóforo común.

2. Realizar mutantes de receptores únicos o múltiples destinados a aumentar la estabilidad y someter a ensayo la unión estrecha usando el conjunto completo de ligandos. Los ensayos pueden paralelizarse, multiplejarse o ejecutarse en serie.

3. Confirmar la autenticidad del mutante del receptor estabilizado midiendo, por ejemplo, la isoterma de unión para cada ligando y midiendo el cambio de estabilidad con el ligando (la ventana normalmente debe estrecharse en comparación con el tipo natural).

Para protegerse contra cambios en la afinidad aparente provocados por perturbaciones en el sitio de unión tras la mutación, preferiblemente deben usarse ligandos de la misma clase farmacológica, pero de diferente clase química, para perfilar el receptor. Normalmente, estos deberían mostrar cambios similares en la afinidad (mutante frente a progenitor, por ejemplo, tipo natural) a pesar de tener diferentes propiedades de reconocimiento molecular. Es preferible que los experimentos de unión se realicen usando ligandos marcados dentro de la misma clase farmacológica.

No obstante, debe reconocerse que pueden existir sustratos conformacionales que son específicos de clases químicas de ligando dentro de la misma clase farmacológica, y estos pueden estabilizarse específicamente en el procedimiento dependiendo de la clase química del ligando seleccionado.

Normalmente, el ligando seleccionado se une al GPCR mutante con una potencia similar a su unión al GPCR original. Normalmente, los valores de Kd para el ligando particular que se une al GPCR mutante y al GPCR original están entre 5 y 10 veces uno del otro, tal como entre 2 y 3 veces. Normalmente, la unión del ligando al GPCR mutante en comparación con el GPCR original no sería más de 5 veces más débil y no más de 10 veces más fuerte.

Normalmente, los receptores mutantes que se han estabilizado en la conformación seleccionada deberían unirse al ligando seleccionado con una afinidad aproximadamente igual (es decir, normalmente entre 2 y 3 veces) o mayor afinidad que el receptor original. Para los mutantes con conformación agonista, los mutantes normalmente se unen a los agonistas con la misma o mayor afinidad que el GPCR original y normalmente se unen a antagonistas con la misma o menor afinidad que el GPCR original. De manera similar, para los mutantes con conformación antagonista, los mutantes normalmente se unen a los antagonistas con la misma o mayor afinidad que el GPCR original y normalmente se unen a agonistas con la misma o menor afinidad que el GPCR original. Los mutantes que presentan una reducción significativa (normalmente superior a 2-3 veces) en la afinidad por el ligando seleccionador normalmente se rechazan.

Normalmente, el orden de clasificación de unión de un conjunto de ligandos de la misma clase es comparable, aunque puede haber una o dos inversiones en el orden, o puede haber un valor atípico del conjunto.

En una realización adicional, pueden usarse dos o más ligandos que se unen simultáneamente al receptor en la misma conformación, por ejemplo, un modulador alostérico y un agonista ortostérico.

Para evitar dudas, y tal como se desprende de los ejemplos, no es necesario usar múltiples ligandos para que el método sea eficaz.

En una realización adicional del método de selección, puede ser ventajoso seleccionar aquellos GPCR mutantes que, si bien todavía pueden unirse al ligando seleccionado, no pueden unirse, o se unen menos fuertemente que el GPCR original, a un segundo ligando seleccionado que está en una clase diferente al primer ligando. Por tanto, por ejemplo, el GPCR mutante puede ser uno que se seleccione basándose en que tiene estabilidad aumentada con respecto a la unión a un antagonista seleccionado, pero el GPCR mutante así seleccionado se somete a prueba adicionalmente para determinar si se une a un agonista completo (o se une menos fuertemente a un agonista completo que su GPCR original). Se seleccionan mutantes que no se unen (o tienen una unión reducida) al agonista completo. De esta manera, se realiza una selección adicional de un GPCR que está bloqueado en una conformación particular.

Se apreciará que el ligando seleccionado (con respecto a la parte (ii) del método) y el (segundo) ligando adicional tal como se comentó anteriormente, pueden ser cualquier par de clases de ligando, por ejemplo: antagonista y agonista completo; agonista completo y antagonista; antagonista y agonista inverso; agonista inverso y antagonista; agonista inverso y agonista completo; agonista completo y agonista inverso; etcétera.

Se prefiere que el receptor mutante se una al (segundo) ligando adicional con una afinidad que sea inferior al 50 % de la afinidad que tiene el receptor original por el mismo (segundo) ligando adicional, más preferiblemente inferior al 10 % y todavía más preferiblemente inferior al 1 % o al 0,1 % o al 0,01 % de afinidad por el receptor original. Por tanto, la Kd para la interacción del segundo ligando con el receptor mutante es mayor que para el receptor original. Tal como se muestra en el ejemplo 1, el receptor p-adrenérgico mutante pAR-m23 (que se seleccionó mediante el método de la invención usando un antagonista) se une a un agonista 3 órdenes de magnitud más débilmente que su progenitor (es decir, Kd es 1000 x mayor). De manera similar, en el ejemplo 2, el receptor de adenosina A2a mutante Rant21 se une al agonista 2-4 órdenes de magnitud más débilmente que su progenitor.

Este tipo de contraselección es útil porque puede usarse para dirigir el procedimiento de mutagénesis de manera más específica (y, por tanto, de manera más rápida y eficaz) a lo largo de una ruta hacia una conformación pura tal como define el ligando.

Preferiblemente, el GPCR mutante en el método de selección se proporciona en una forma solubilizada adecuada en la que mantiene la integridad estructural y está en una forma funcional (por ejemplo, puede unirse al ligando). Se usa un sistema de solubilización apropiado, tal como un detergente adecuado (u otro agente anfipático) y un sistema tampón, que el experto en la técnica puede elegir para que sea eficaz para la proteína particular. Los detergentes típicos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, dodecilmaltósido (<d>D<m>) o CHAPS u octilglucósido (OG) o muchos otros. Puede ser conveniente incluir otros compuestos tales como hemisuccinato de colesterol o el propio colesterol o heptano-1,2,3-triol. Puede ser útil la presencia de glicerol, prolina o betaína. Es importante que el GPCR, una vez solubilizado de la membrana en la que reside, sea suficientemente estable para someterse a ensayo. Para algunos GPCR, DDM será suficiente, pero puede añadirse glicerol u otros polioles para aumentar la estabilidad con fines de ensayo, si se desea. Puede lograrse una estabilidad adicional para fines de ensayo, por ejemplo, solubilizando en una mezcla de DDM, CHAPS y hemisuccinato de colesterol, opcionalmente en presencia de glicerol. Para GPCR particularmente inestables, puede ser deseable solubilizarlos usando digitonina o anfipoles u otros polímeros que puedan solubilizar los GPCR directamente desde la membrana, en ausencia de detergentes tradicionales y mantener la estabilidad normalmente permitiendo que un número significativo de lípidos permanezcan asociados con el GPCR. Los nanodiscos también pueden usarse para solubilizar proteínas de membrana extremadamente inestables en una forma funcional.

Normalmente, el GPCR mutante en el método de selección se proporciona en un extracto en bruto (por ejemplo, de la fracción de membrana de la célula huésped en la que se ha expresado, tal como E.coli).Puede proporcionarse en una forma en la que la proteína mutante normalmente comprende al menos el 75 %, más normalmente al menos el 80 % o el 85 % o el 90 % o el 95 % o el 98 % o el 99 % de la proteína presente en la muestra. Por supuesto, normalmente se solubiliza tal como se comentó anteriormente, por lo que el GPCR mutante suele estar asociado con moléculas de detergente y/o moléculas de lípidos.

En el contexto de los métodos de la invención, el uno o más GPCR mutantes del primer GPCR original o el uno o más mutantes del GPCR original en la etapa (a), son uno o más mutantes modificados por ingeniería de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano de tipo natural que tienen al menos un aminoácido reemplazado en comparación con el GPCR humano de tipo natural, y que tienen termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR humano de tipo natural;

En relación con una mayor estabilidad al calor (es decir, termoestabilidad), esto puede determinarse fácilmente midiendo la unión al ligando o usando métodos espectroscópicos tales como fluorescencia, DC o dispersión de luz a una temperatura particular. Normalmente, cuando el GPCR se une a un ligando, la capacidad del GPCR para unirse a ese ligando a una temperatura particular puede usarse para determinar la termoestabilidad del mutante. Puede ser conveniente determinar una “cuasi Tm”, es decir, la temperatura a la que se inactiva el 50 % del receptor en las condiciones establecidas después de la incubación durante un periodo de tiempo determinado (por ejemplo, 30 minutos). Los GPCR mutantes de termoestabilidad aumentada tienen una cuasi Tm aumentada en comparación con sus progenitores.

En relación con una mayor estabilidad frente a un detergente o a un caotropo, normalmente el GPCR se incuba durante un tiempo definido en presencia de un detergente de prueba o un agente caotrópico de prueba y la estabilidad se determina usando, por ejemplo, unión al ligando o un método espectroscópico tal como se comentó anteriormente.

En relación con un pH extremo, se elegiría un pH de prueba típico (por ejemplo, en el intervalo de 4,5 a 5,5 (pH bajo) o en el intervalo de 8,5 a 9,5 (pH alto).

Debido a que se usan detergentes relativamente fuertes durante los procedimientos de cristalización, se prefiere que el GPCR mutante sea estable en presencia de tales detergentes. El orden de “dureza” de determinados detergentes es DDM, C<11>^ Cío ^-Cg ^-Cs maltósido o glucósido, óxido de laurildimetilamina (LDAO) y SDS. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea más estable frente a cualquiera de maltósido o glucósido Cg, maltósido o glucósido Cs, LDAO y SDS, por lo que se prefiere que estos detergentes se usen para pruebas de estabilidad.

Debido a su facilidad de determinación, se prefiere que se determine la termoestabilidad, y los mutantes del primer GPCR original son aquellos mutantes que tienen una termoestabilidad aumentada en comparación con la proteína original. Se apreciará que el calor actúa como agente desnaturalizante y esto puede eliminarse fácilmente enfriando la muestra, por ejemplo colocándola sobre hielo. Se cree que la termoestabilidad también puede ser una guía para la estabilidad frente a otros agentes desnaturalizantes o condiciones desnaturalizantes. Por tanto, es probable que una termoestabilidad aumentada se traduzca en estabilidad en los detergentes desnaturalizantes, especialmente aquellos que son más desnaturalizantes que el DDM, por ejemplo, aquellos detergentes con un grupo de cabeza más pequeño y una cadena alquílica más corta y/o con un grupo de cabeza cargado. Se ha descubierto que un GPCR termoestable también es más estable frente a detergentes fuertes. Cuando se usa un pH extremo como condición desnaturalizante, se apreciará que esto puede eliminarse rápidamente añadiendo un agente neutralizante. De manera similar, cuando se usa un caotropo como agente desnaturalizante, el efecto desnaturalizante puede eliminarse diluyendo la muestra por debajo de la concentración en la que el caotropo ejerce su efecto caotrópico.

En una realización adicional del método de selección se determina si el GPCR mutante seleccionado puede acoplarse a una proteína G. También se prefiere que se determine si el GPCR mutante seleccionado puede unirse a una pluralidad de ligandos de la misma clase que el ligando seleccionador con una extensión y/o un orden de clasificación de afinidad comparable al del GPCR original.

En una realización particular del método de selección, el GPCR es el receptorp-adrenérgico (por ejemplo, de pavo) y el ligando es dihidroalprenolol (DHA), un antagonista.

En una realización preferida adicional del método de selección, el GPCR es el receptor de adenosina A<2>a (A<2>aR) (por ejemplo, de ser humano) y el ligando es ZM 241385 (4-[2-[[7-amino-2-(2-furil)[1,2,4]-triazolo[2,3-a][1,3,5]triazin-5-il]amino]etil]fenol), un antagonista o NECA (5'-N-etilcarboxamido adenosina), un agonista. En todavía una realización preferida adicional del método de selección, el GPCR es el receptor de neurotensina (NTR) (por ejemplo, de rata) y el ligando es neurotensina, un agonista.

Un método para preparar un GPCR mutante con estabilidad aumentada comprende:

(i) llevar a cabo el método de selección descrito anteriormente

(ii) identificar la posición o posiciones del residuo o residuos de aminoácidos mutados en el GPCR o los GPCR mutantes que se han seleccionado por una mayor estabilidad, y

(iii) sintetizar un GPCR mutante que contiene una mutación en una o más de las posiciones identificadas. Tal como puede observarse en los ejemplos, sorprendentemente, los cambios en un único aminoácido dentro del GPCR pueden aumentar la estabilidad de la proteína en comparación con la proteína original con respecto a una condición particular en la que la proteína reside en una conformación particular. Por tanto, en una realización del método para preparar un GPCR mutante con estabilidad aumentada, se cambia un único residuo de aminoácido de la proteína original en la proteína mutante. Normalmente, el residuo de aminoácido se cambia por el residuo de aminoácido encontrado en el mutante sometido a prueba en la selección. Sin embargo, puede reemplazarse por cualquier otro residuo de aminoácido, tal como cualquier residuo de aminoácido que se produce de manera natural (en particular, un residuo de aminoácido “codificable”) o un aminoácido no natural. Generalmente, por conveniencia, el residuo de aminoácido se reemplaza por uno de los otros 19 aminoácidos codificables. Preferiblemente, es el residuo de aminoácido reemplazado el que está presente en el mutante seleccionado en el método de selección.

También tal como puede observarse en los ejemplos, puede obtenerse un aumento adicional de la estabilidad reemplazando más de uno de los aminoácidos de la proteína original. Normalmente, cada uno de los aminoácidos reemplazados es uno que ha sido identificado usando el método de selección. Normalmente, cada aminoácido identificado se reemplaza por el aminoácido presente en la proteína mutante aunque, tal como se indicó anteriormente, puede reemplazarse con cualquier otro aminoácido.

Normalmente, cuando se prepara un GPCR mutante con estabilidad aumentada, el GPCR mutante contiene, en comparación con la proteína original, desde 1 hasta 10 aminoácidos reemplazados, preferiblemente desde 1 hasta 8, normalmente desde 2 hasta 6 tal como 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos reemplazados.

Se apreciará que los múltiples mutantes pueden estar sujetos al método de selección. En otras palabras, pueden proporcionarse múltiples mutantes en la etapa (i) del método de selección. Se apreciará que mediante los métodos de selección y preparación descritos anteriormente, pueden prepararse múltiples GPCR mutagenizados, cuya conformación se ha seleccionado para crear una proteína mutante de múltiples puntos muy estable.

Por tanto, el uno o más mutantes del primer GPCR original en la etapa (a) pueden contener una pluralidad de mutaciones en comparación con el primer GPCR original.

El uno o más mutantes de un primer GPCR original en la etapa (a) pueden prepararse mediante cualquier método adecuado. Convenientemente, la proteína mutante está codificada por una molécula de ácido nucleico adecuada y se expresa en una célula huésped adecuada. Pueden prepararse moléculas de ácido nucleico adecuadas que codifican para el GPCR mutante usando técnicas de clonación convencionales, mutagénesis dirigida y PCR tal como se conoce bien en la técnica. Los sistemas de expresión adecuados incluyen sistemas de expresión constitutivos o inducibles en bacterias o levaduras, sistemas de expresión de virus tales como baculovirus, virus del bosque semliki y lentivirus, o transfección transitoria en células de insectos o mamíferos. Las células huésped adecuadas incluyen células deE. coli, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Spodoptera frugiperdayTrichoplusiani.Las células huésped animales adecuadas incluyen HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40, etc. Se sabe que algunos GPCR requieren lípidos específicos (por ejemplo, colesterol) para funcionar. En ese caso, es deseable seleccionar una célula huésped que contenga el lípido. Además o alternativamente, el lípido puede añadirse durante el aislamiento y la purificación de la proteína mutante. Se apreciará que estos sistemas de expresión y células huésped también pueden usarse en la provisión del GPCR mutante en la parte (a) del método del primer aspecto de la invención. Los métodos de biología molecular para clonar y diseñar genes y ADNc, para mutar ADN y para expresar polipéptidos a partir de polinucleótidos en células huésped se conocen bien en la técnica, tal como se ejemplifica en “Molecular Cloning, a laboratory manual”, tercera edición, Sambrook, J. y Russell, D.W. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.

Receptor B-adrenérgico mutante

Los receptores p-adrenérgicos se conocen bien en la técnica. Comparten homología de secuencia entre sí y se unen a la adrenalina.

En una realización, el GPCR mutante de un primer GPCR original es un receptor p-adrenérgico mutante que, en comparación con el correspondiente receptor p-adrenérgico de tipo natural, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor p-adrenérgico de pavo tal como se establece en la figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338.

El receptor p-adrenérgico mutante puede ser un mutante de cualquier receptor p-adrenérgico siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácidos tal como se indica con referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor p-adrenérgico de pavo dada.

Se prefiere particularmente que el GPCR mutante de un primer GPCR original sea uno que tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor p-adrenérgico de pavo dada, tal como se determina usando MacVector y CLUSTALW (Thompsonet al.(1994) Nucl. Acids Res.

22, 4673-4680). Más preferiblemente, el receptor mutante de un primer GPCR original tiene al menos el 30 % o al menos el 40 % o al menos el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos. Generalmente existe un mayor grado de identidad de secuencia de aminoácidos que se conserva alrededor del sitio ortostérico (“activo”) al que se une el ligando natural.

Tal como se describe en el ejemplo 1 y la figura 1 a continuación, el reemplazo individual de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia p-adrenérgica original de pavo (tal como se muestra en la figura 9) conduce a un aumento de la termoestabilidad: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338.

Por tanto, el GPCR mutante de un primer GPCR original puede ser un receptor p-adrenérgico de pavo mutante en el que, en comparación con su progenitor, uno o más de estos residuos de aminoácidos se han reemplazado por otro residuo de aminoácido. Los GPCR mutantes de un primer GPCR original también pueden ser receptores p-adrenérgicos mutantes de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original están reemplazados por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el progenitor puede ser un receptor p-adrenérgico que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien con la proteína que se produce de manera natural o bien con un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión al ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor p-adrenérgico que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor p-adrenérgico de pavo cuando el receptor p-adrenérgico de pavo y el otro receptor p-adrenérgico se comparan usando MacVector y CLUSTALW.

La figura 9 muestra una alineación entre el receptor p-adrenérgico de pavo y los receptores p-adrenérgicos p1, p2 y p3 humanos.

Puede observarse que Ile 72 de p1 humano corresponde a Ile 55 de receptor p-adrenérgico de pavo; Ile 47 de p2 humano corresponde a Ile 55 de receptor p-adrenérgico de pavo; y Thr51 de p3 humano corresponde a Ile 55 de receptor p-adrenérgico de pavo. Otros residuos de aminoácidos correspondientes en p1, p2 y p3 humanos pueden identificarse fácilmente con referencia a la figura 9.

Se prefiere que el aminoácido particular se reemplace por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular es una Ala, se prefiere que se reemplace por una Leu (por ejemplo, véase Ala 234, Ala 282 y Ala 334 p-adrenérgica de pavo en la figura 1).

Se prefiere que el GPCR mutante de un primer GPCR original sea un receptor p-adrenérgico mutante que tenga un aminoácido diferente en comparación con su progenitor en más de una posición de aminoácido, ya que es probable que esto proporcione una mayor estabilidad. Los mutantes del receptor p1 humano particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos están reemplazados por otro residuo de aminoácido: K85, M107, Y244, A316, F361 y F372. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Pueden usarse receptores p1 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 ó 6 mutaciones tal como se describió anteriormente.

Los mutantes del receptor p2 humano particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes aminoácidos están reemplazados por otro residuo de aminoácido: K60, M82, Y219, C265, L310 y F321. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Pueden usarse receptores p2 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 ó 6 mutaciones tal como se describió anteriormente.

La figura 26 muestra el efecto sobre la termoestabilidad cuando seis mutaciones termoestabilizadoras enpi-m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) se transfirieron directamente al receptorp2 humano (mutaciones equivalentes K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M), formandop2-m23 humano. Las Tm parap2 yp2-m23 humanos fueron de 29 °C y 41 °C respectivamente, lo que ejemplifica así la transferibilidad de mutaciones termoestabilizadoras de un receptor a otro receptor. Por tanto, un mutante del receptorp2 humano particularmente preferido es uno que comprende las mutaciones K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M.

Los mutantes del receptorp3 humano particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes aminoácidos se reemplazan por otro residuo de aminoácido: W64, M86, Y224, P284, A330 y F341. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Pueden usarse receptoresp3 humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 ó 6 mutaciones tal como se describió anteriormente.

Combinaciones de mutaciones particularmente preferidas se describen con detalle en las tablas 1 y 2 en el ejemplo 1, y el uno o más GPCR mutantes de un primer GPCR original incluyen los receptoresp-adrenérgicos de pavo mutantes, y también incluyen receptoresp-adrenérgicos mutantes en los que los aminoácidos en la posición correspondiente se han reemplazado por otro aminoácido, normalmente el mismo aminoácido indicado en las tablas 1 y 2 en el ejemplo 1.

Mutantes particularmente preferidos son aquellos que contienen mutaciones en los aminoácidos que corresponden al residuo de aminoácido dado con referencia al receptorp-adrenérgico de pavo: (R68S, Y227A, A282L, A334L) (véase m6-10 en la tabla 2 a continuación); (M90V, Y227A, F338M) (véase m7-7 en la tabla 2 a continuación); (R68S, M90V, V230A, F327A, A334L) (véase m10-8 en la tabla 2 a continuación); y (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) (véase m23 en la tabla 2 a continuación).

Receptor de adenosina mutante

Los receptores de adenosina se conocen bien en la técnica. Comparten homología de secuencia entre sí y se unen a la adenosina.

En una realización, el GPCR mutante de un primer GPCR original es un receptor de adenosina mutante que, en comparación con la adenosina de tipo natural correspondiente, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de adenosina A<2a>humano tal como se establece en la figura 10: Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315, Ala 54, Val 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239.

El receptor de adenosina mutante puede ser un mutante de cualquier receptor de adenosina siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácidos tal como se indica con referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor de adenosina A<2a>humano dada.

Se prefiere particularmente que el GPCR mutante de un primer GPCR original sea uno que tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor de adenosina A<2a>humano dada, tal como se determina usando MacVector y CLUSTALW. Preferiblemente, el GPCR mutante de un primer GPCR original tiene al menos el 30 % o al menos el 40 % o al menos el 50 % o al menos el 60 % de identidad de secuencia. Normalmente, existe un mayor grado de conservación de secuencia en el sitio de unión de adenosina.

Tal como se describe en el ejemplo 2 a continuación, el reemplazo individual de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia del receptor de adenosina A<2a>humano (tal como se muestra en la figura 10) conduce a un aumento en la termoestabilidad cuando se mide con el agonista 5'-N-etilcarboxamidoadenosina (NECA):

Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315.

El reemplazo de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia del receptor A<2a>humano (tal como se muestra en la figura 10) conduce a un aumento en la termoestabilidad cuando se mide con el antagonista ZM 241385 (4-[2-[[7-amino-2-(2-furil)[1,2,4]-triazolo [2,3-a][1,3,5]triazin-5-il]amino]etil]fenol):

Ala 54, Val 57, His 75, Thr 88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151, Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239.

Por tanto, el GPCR mutante de un primer GPCR original puede ser receptores de adenosina A<2a>humanos mutantes en los que, en comparación con su progenitor, uno o más de estos residuos de aminoácidos se han reemplazado por otro residuo de aminoácido. Los GPCR mutantes de un primer GPCR original también pueden ser receptores de adenosina mutantes de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se reemplazan por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el progenitor puede ser un receptor de adenosina que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien con la proteína que se produce de manera natural o bien con un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión al ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor de adenosina que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor de adenosina A<2a>humano cuando el receptor de adenosina A<2a>humano y el otro receptor de adenosina se comparan usando MacVector y CLUSTALW.

La figura 10 muestra una alineación entre el receptor de adenosina A<2a>humano y otros tres receptores de adenosina humanos (A2b, A3 y A1).

Puede observarse que, por ejemplo, Ser 115 en el receptor A<2b>(indicado como AA2BR) corresponde a Gly 114 en el receptor A<2a>. De manera similar, puede observarse que Ala 60 en el receptor A<3>(indicado como AA3R) corresponde a Ala 54 en el receptor A<2a>, etcétera. Otros residuos de aminoácidos correspondientes en los receptores de adenosina humanos A<2b>, A<3>y A<1>pueden identificarse fácilmente haciendo referencia a la figura 10. Se prefiere que el aminoácido particular en el progenitor se reemplace por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular en el progenitor es una Ala, se prefiere que se reemplace por una Leu.

Se prefiere que el GPCR mutante de un primer GPCR original sea un receptor de adenosina mutante que tenga un aminoácido diferente en comparación con su progenitor en más de una posición de aminoácido. Los receptores de adenosina A<2b>humanos particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos están reemplazados por otro residuo de aminoácido: A55, T89, R123, L236 y V240. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Pueden usarse receptores de adenosina A<2b>humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describió anteriormente.

Los receptores de adenosina A<3>humanos particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos están reemplazados por otro residuo de aminoácido: A60, T94, W128, L232 y L236. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Pueden usarse receptores de adenosina A<3>humanos mutantes que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describió anteriormente.

Los receptores de adenosina A<1>humanos particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes residuos están reemplazados: A57, T91, A125, L236 y L240. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Combinaciones de mutaciones particularmente preferidas se describen con detalle en el ejemplo 2. El uno o más GPCR mutantes de un primer GPCR original incluyen estos receptores de adenosina A<2a>humanos mutantes, y también incluyen otros receptores de adenosina mutantes en los que los aminoácidos en las posiciones correspondientes se han reemplazado por otro aminoácido, normalmente el mismo aminoácido tal como se indica en el ejemplo 2.

Mutantes del receptor de adenosina particularmente preferidos son aquellos que contienen mutaciones en los aminoácidos que corresponden al residuo amino dado con referencia al receptor de adenosina A2a humano: (A54L, K122A, L235A) (Rant 17); (A54L, T88A, V239A, A204L) (Rant 19); y (A54L, T88A, V239A, K122A) (Rant 21).

Receptor de neurotensina mutante

Los receptores de neurotensina se conocen en la técnica. Comparten homología de secuencia y se unen a la neurotensina.

En una realización, el GPCR mutante de un primer GPCR original es un receptor de neurotensina mutante que, en comparación con el correspondiente receptor de neurotensina de tipo natural, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se establece en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante de un primer GPCR original sea uno que tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor de neurotensina de rata dada, tal como se determina usando MacVector y CLUSTALW. Preferiblemente, el GPCR mutante tiene al menos el 30 % o al menos el 40 % o al menos el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos.

El receptor de neurotensina mutante puede ser un mutante de cualquier receptor de neurotensina siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácidos tal como se indica con referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor de neurotensina de rata dada.

Tal como se describe en el ejemplo 3 a continuación, el reemplazo individual de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia del receptor de neurotensina de rata (tal como se muestra en las figuras 11 y 28) conduce a un aumento de la termoestabilidad cuando se considera con respecto a la ausencia de neurotensina. Leu 72, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Lys 176, Thr 179, Met 181, Ser 182, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Leu 256, Asn 262, Val 268, Met 293, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Ser 362, Ala 385, Cys 386, Trp 391, Arg 392, His 393, Lys 397, Pro 399.

Tal como se describe en el ejemplo 3 a continuación, el reemplazo individual de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia del receptor de neurotensina de rata (tal como se muestra en las figuras 11 y 28) conduce a un aumento de la termoestabilidad cuando se considera con respecto a la presencia de neurotensina. Ala 69, Ala 73, Ala 86, Ala 90, His 103, Val 165, Glu 166, Ala 177, Arg 183, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Ile 260, Thr 279, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Pro 389, Gly 390, Arg 395.

Por tanto, el GPCR mutante de un primer GPCR original puede ser un receptor de neurotensina de rata mutante en el que, en comparación con su progenitor, uno o más de estos residuos de aminoácidos se han reemplazado por otro residuo de aminoácido. Los GPCR mutantes de un primer GPCR original también pueden ser receptores de neurotensina mutantes de otras fuentes en los que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se reemplazan por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el progenitor puede ser un receptor de neurotensina que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien con la proteína que se produce de manera natural o bien con un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión al ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor de neurotensina que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor de neurotensina de rata cuando se comparan el receptor de neurotensina de rata y el otro receptor de neurotensina usando MacVector y CLUSTALW.

La figura 11 muestra un alineamiento entre el receptor de neurotensina de rata y dos receptores de neurotensina 1 y 2 humanos. Puede observarse, por ejemplo, que Ala 85 del receptor de neurotensina 1 humano corresponde a Ala 86 del receptor de neurotensina de rata, que Phe 353 del receptor de neurotensina 1 humano corresponde a Phe 358 del receptor de neurotensina de rata, etcétera. Otros residuos de aminoácidos correspondientes en los receptores de neurotensina 1 y 2 humanos pueden identificarse fácilmente con referencia a la figura 11.

Se prefiere que el aminoácido particular en el progenitor se reemplace por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular en el progenitor es una Ala, se prefiere que se reemplace por una Leu.

Se prefiere que el GPCR mutante de un primer GPCR original sea un receptor de neurotensina mutante que tenga un aminoácido diferente en comparación con su progenitor en más de una posición de aminoácido. Los receptores de neurotensina humana (NTR1) particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos están reemplazados por otro residuo de aminoácido: Ala 85, His 102, Ile 259, Phe 337 y Phe 353. Normalmente, los residuos de aminoácido dados se reemplazan por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo).

Pueden usarse receptores de neurotensina humanos mutantes (NTR1) que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describió anteriormente.

Los receptores de neurotensina humanos (NTR2) particularmente preferidos son aquellos en los que uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos están reemplazados por otro residuo de aminoácido:<v>54, R69, T229, P331 y F347. Normalmente, el residuo de aminoácido dado se reemplaza por Ala o Val o Met o Leu o Ile (a menos que ya sean ese residuo). Se prefieren los receptores de neurotensina mutantes humanos (NTR2) que tienen combinaciones de 3 ó 4 ó 5 mutaciones tal como se describió anteriormente.

Combinaciones de mutaciones particularmente preferidas se describen con detalle en el ejemplo 3. El uno o más GPCR mutantes de un primer GPCR original incluyen estos receptores de neurotensina de rata mutantes, y también incluyen otros receptores de neurotensina mutantes en los que los aminoácidos en las posiciones correspondientes se han reemplazado por otro aminoácido, normalmente el mismo aminoácido indicado en el ejemplo 3.

Los mutantes del receptor de neurotensina particularmente preferidos son aquellos que contienen mutaciones en los residuos de aminoácidos que corresponden al residuo de aminoácido dado con referencia al receptor de neurotensina de rata: (F358A, A86L, I260A, F342A) (Nag7m); (F358A, H103A, I260A, F342A) (Nag7n).

Receptor muscarínico mutante

Los receptores muscarínicos se conocen en la técnica. Comparten homología de secuencia y se unen a la muscarina.

En una realización, el GPCR mutante de un primer GPCR original es un receptor muscarínico mutante que, en comparación con el correspondiente receptor muscarínico de tipo natural, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor muscarínico humano M1 tal como se establece en la figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 y Met 384. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante sea uno que tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia del receptor muscarínico humano dada, tal como se determina usando MacVector y CLUSTALW. Preferiblemente, el GPCR mutante tiene al menos el 30 % o al menos el 40 % o al menos el 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos.

El receptor muscarínico mutante puede ser un mutante de cualquier receptor muscarínico siempre que esté mutado en una o más de las posiciones de aminoácidos tal como se indica con referencia a la secuencia de aminoácidos del receptor muscarínico dada.

Por tanto, el GPCR mutante de un primer GPCR original puede ser un receptor muscarínico humano mutante que, en comparación con su progenitor, uno o más de estos residuos de aminoácidos se han reemplazado por otro residuo de aminoácido. El GPCR mutante de un primer GPCR original también puede ser un receptor muscarínico mutante de otras fuentes en el que uno o más aminoácidos correspondientes en el receptor original se reemplazan por otro residuo de aminoácido. Para evitar dudas, el progenitor puede ser un receptor muscarínico que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, ya sea con la proteína que se produce de manera natural o con un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión al ligando.

Por “residuo de aminoácido correspondiente” se incluye el significado del residuo de aminoácido en otro receptor muscarínico que se alinea con el residuo de aminoácido dado en el receptor muscarínico humano cuando se comparan el receptor muscarínico humano y el otro receptor muscarínico usando MacVector y CLUSTALW. Se prefiere que el aminoácido particular se reemplace por una Ala. Sin embargo, cuando el residuo de aminoácido particular es una Ala, se prefiere que se reemplace por una Leu.

Se prefiere que los GPCR mutantes de un primer GPCR original, incluyendo los receptores p-adrenérgicos, de adenosina y de neurotensina mutantes, tengan una termoestabilidad aumentada en comparación con su progenitor cuando están en presencia o ausencia de un ligando del mismo. Normalmente, el ligando es un antagonista, un agonista completo, un agonista parcial o un agonista inverso, ya sea ortostérico o alostérico. Tal como se analizó anteriormente, el ligando puede ser un polipéptido, tal como un anticuerpo.

Se prefiere que el GPCR mutante de un primer GPCR original, por ejemplo, un receptor p-adrenérgico mutante o un receptor de adenosina mutante o un receptor de neurotensina mutante sea al menos 2 °C más estable que su progenitor, preferiblemente al menos 5 °C más estable, más preferiblemente al menos 8 °C más estable e incluso más preferiblemente al menos 10 °C o 15 °C o 20 °C más estable que su progenitor. Normalmente, la termoestabilidad de los receptores originales y mutantes se mide en las mismas condiciones. Normalmente, la termoestabilidad se somete a ensayo en una condición en la que el GPCR reside en una conformación particular. Normalmente, esta condición seleccionada es la presencia de un ligando que se une al GPCR.

Se prefiere que el GPCR mutante de un primer GPCR original, cuando se solubiliza y purifica en un detergente adecuado, tenga una termoestabilidad similar a la rodopsina bovina purificada en dodecil maltósido. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante de un primer GPC<r>original conserve al menos el 50 % de su actividad de unión al ligando después de calentar a 40 °C durante 30 minutos. Se prefiere además que el GPCR mutante de un primer GPCR original conserve al menos el 50 % de su actividad de unión al ligando después de calentar a 55 °C durante 30 minutos.

Una vez que se ha identificado un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con un primer GPCR original, los inventores han razonado que pueden generarse GPCR adicionales realizando la misma una o más mutaciones estabilizadoras en posiciones correspondientes en un GPCR adicional.

Un GPCR original puede ser un GPCR que tiene una secuencia que se produce de manera natural, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien con la proteína que se produce de manera natural o bien con un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la capacidad de unión al ligando. En el contexto de la presente invención, el primer GPCR original es un GPCR humano de tipo natural que es un GPCR de clase 1, clase 2 o clase 3. Normalmente, identificar la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original implica alinear sus secuencias de aminoácidos con la del GPCR original, por ejemplo, usando el programa Clustal W (Thompsonet al.,1994). Por “posición o posiciones correspondientes” se incluye el significado de la posición en la secuencia de aminoácidos de un segundo GPCR que se alinea con la posición en la secuencia de aminoácidos del primer GPCR, cuando el primer y el segundo GPCR se comparan mediante alineación, por ejemplo, usando MacVector y Clustal W. Por ejemplo, tal como se muestra en la alineación de la figura 17, las seis mutaciones estabilizadoras en pi-m23 de pavo (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) están en posiciones que corresponden a residuos K60, M82, Y219, C265, L310, F321 en el receptor p2 humano.

Habiendo identificado la posición o posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácidos de un segundo GPCR, los aminoácidos en esas posiciones se reemplazan por otro aminoácido. Normalmente, los aminoácidos se reemplazan por los mismos aminoácidos que reemplazaron los aminoácidos en las posiciones correspondientes en el mutante del primer GPCR original (a menos que ya sean ese residuo). Por ejemplo, en la posición 68 en pi-m23 de pavo (R68S), se reemplazó un residuo de arginina con un residuo de serina. Por tanto, en la posición correspondiente en el receptor p2 humano, la posición 60 (K60), el residuo de lisina se reemplaza preferiblemente con un residuo de serina.

Pueden realizarse mutaciones en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, tal como se describió anteriormente y usando técnicas bien establecidas en la técnica.

En el contexto de la presente invención, el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original o con el GPCR original en la etapa (a), (ii) puede alinearse con el primer GPCR original o con el GPCR original en la etapa (a) de modo que la posición o posiciones correspondientes puedan identificarse mediante alineación y (iii) sea de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original o que el GPCR original en la etapa (a). De lo contrario, se apreciará que el segundo GPCr puede ser cualquier otro GPCR. Por ejemplo, las mutaciones estabilizadoras en un GPCR de una especie pueden transferirse a un segundo GPCR de otra especie. De manera similar, las mutaciones estabilizadoras en una isoforma particular del GPCR pueden transferirse a un segundo GPCR que sea una isoforma diferente. Preferiblemente, el segundo GPCR original es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original. Los análisis filogenéticos han dividido los GPCR en tres clases principales según la similitud de la secuencia de proteínas, es decir, clases 1, 2 y 3 cuyos prototipos son la rodopsina, el receptor de secretina y los receptores metabotrópicos de glutamato, respectivamente (Foordet al.(2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288). Por tanto, el segundo GPCR puede ser un GPCR que sea de la misma clase de GPCR que el primer GPCR original. De manera similar, los GPCR se han dividido en familias en función de ligandos naturales tales como glutamato y GABA. Por tanto, el segundo GPCR puede ser de la misma familia de GPCR que el primer GPCR original. La Unión Internacional de Farmacología ha elaborado una lista de clases y familias de GPCR (Foordet al.(2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphardb.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward.

Se apreciará que el segundo GPCR original debe poder alinearse con el primer GPCR original de modo que las posiciones correspondientes de las mutaciones en el primer GPCR puedan determinarse en el segundo GPCR. Por tanto, el segundo GPCR original tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original y más preferiblemente al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original. Sin embargo, algunos GPCR tienen una baja identidad de secuencia (por ejemplo, los GPCR de las familias B y C) y al mismo tiempo son muy similares en cuanto a estructura.

Tal como se describe en el ejemplo 6, un análisis estadístico realizado sobre alineamientos de GPCR mutantes indica que no sólo las posiciones correspondientes de una secuencia alineada de un GPCR adicional son predictivas en la identificación de mutaciones estabilizadoras sino también que las ventanas de aminoácidos alrededor de una mutación estabilizadora identificada a partir de secuencias alineadas son estadísticamente más propensos a contener más mutaciones estabilizadoras en comparación con una distribución aleatoria.

Esto se ejemplifica claramente en la figura 33 en la que se muestran secuencias alineadas del receptor beta 1 adrenérgico, del receptor de neurotensina y del receptor de adenosina A2A con mutaciones termoestabilizadoras marcadas. De 62 mutaciones, de las cuales 18 están alineadas exactamente en las posiciones correspondientes, otras 31 están alineadas dentro de una ventana de i más o menos 4 residuos donde otra mutación termoestabilizadora está en la posición i. Esto es estadísticamente muy significativo (p<0,0004). Además, se observa significación estadística para identificar mutaciones termoestabilizadoras dentro de una ventana de residuos de tamaño i más o menos 3 (p = 0,0015), i más o menos 2 (p = 0,0053) y i más o menos 1 (p = 0,008) de cualquier otra posición de termoestabilización dada dentro del alineamiento de secuencias de GPCR.

Por consiguiente, los inventores han razonado que una vez que se ha identificado un GPCR mutante con estabilidad aumentada en relación con un primer GPCR original, pueden generarse GPCR adicionales realizando una o más mutaciones estabilizadoras en la secuencia de aminoácidos del GPCR adicional dentro de una ventana deimás o menos 5 residuos, dondeies la posición correspondiente a la mutación estabilizadora en el GPCR original.

Por tanto, la invención proporciona un método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con un GPCR original, comprendiendo el método:

(a) identificar en la secuencia de aminoácidos de uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad de conformación aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo en relación con el primer GPCR original, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPC<r>original, y

(b) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una ventana o ventanas deimás o menos 5 residuos dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original;

en el que el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original, (ii) puede alinearse con el primer GPCR original de modo que la posición o posiciones correspondientes puedan identificarse mediante alineación y (iii) es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original;

y en el que el uno o más mutantes del primer GPCR original son uno o más mutantes modificados por ingeniería de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano de tipo natural que tienen al menos un aminoácido reemplazado en comparación con el GPCR humano de tipo natural, y que tienen termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR humano de tipo natural;

Tal como se describió anteriormente, normalmente, identificar la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original implica alinear su secuencia de aminoácidos con la del GPCR original, por ejemplo, usando el programa Clustal W (Thompsonet al.,1994).

Por “ventana o ventanas de i más o menos 5 residuos” se incluye el residuo o residuos de aminoácidos en la posición o posiciones correspondientes de la una o más mutaciones estabilizadoras en el mutante del primer GPCR original, y los cinco residuos de aminoácidos anteriores y los cinco residuos de aminoácidos posteriores a cada uno de tales residuo o residuos. Por tanto, cuando el mutante del primer GPCR original tiene dos mutaciones estabilizadoras, habría dos ventanas de i más o menos 5 residuos, la primera correspondiente a i más o menos 5 residuos donde i es la posición correspondiente a la primera mutación estabilizadora y el segundo corresponde a i más o menos 5 residuos donde i es la posición correspondiente a la segunda mutación estabilizadora, etcétera. Lo mismo se aplica a cada una de las ventanas i más o menos 4, i más o menos 3, i más o menos 2 y i más o menos 1 que se mencionan a continuación.

Se aprecia que cuando hay más de una ventana, pueden realizarse una o más mutaciones en una o más de las ventanas. Por ejemplo, dentro de cada ventana i más o menos 5, pueden estar mutados uno o más de losi-5, i-4, i-3, i-2, i-1, i, i+1, i+2, i+3, i+4e i+5 residuos de aminoácidos. Alternativamente, pueden estar mutados sólo uno o más de los residuos de aminoácidos en una ventana.

En una realización particularmente preferida, en la etapa (b), una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR se realizan dentro de una ventana o ventanas deimás o menos 4 residuos, dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original. Por “ventana o ventanas deimás o menos 4 residuos” se incluye el residuo o residuos de aminoácidos en la posición o posiciones correspondientes de la una o más mutaciones estabilizadoras en el mutante del primer GPCR original, y los tres residuos de aminoácidos anteriores y los tres residuos de aminoácidos posteriores a cada uno de tal residuo o residuos. Por tanto, dentro de cadaimás o menos 4 ventanas, pueden estar mutados uno o más de los i-4,i-3, i-2, i-1, i, i+1, i+2, i+3e i+4 residuos de aminoácidos.

En otra realización, en la etapa (b), una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR se realizan dentro de una ventana o ventanas deimás o menos 3 residuos, dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original. Por “ventana o ventanas deimás o menos 3 residuos” se incluye el residuo o residuos de aminoácidos en la posición o posiciones correspondientes de la una o más mutaciones estabilizadoras en el mutante del primer GPCR original, y los tres residuos de aminoácidos anteriores y los tres residuos de aminoácidos posteriores a cada uno de tal residuo o residuos. Por tanto, dentro de cadaimás o menos 3 ventanas, pueden estar mutados uno o más de losi-3, i-2, i-1, i, i+1, i+2e i+3 residuos de aminoácido.

En otra realización, en la etapa (b), una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR se realizan dentro de una ventana o ventanas deimás o menos 2 residuos, dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original. Por “ventana o ventanas deimás o menos 2 residuos” se incluye el residuo o residuos de aminoácidos en la posición o posiciones correspondientes de la una o más mutaciones estabilizadoras en el mutante del primer GPCR original, y los dos residuos de aminoácidos anteriores y los dos residuos de aminoácidos posteriores a cada uno de tal residuo o residuos. Por tanto, dentro de cadaimás o menos 2 ventanas, pueden estar mutados uno o más de losi-2, i-1, i, i+1e i+2 residuos de aminoácido.

En otra realización, en la etapa (b), una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR se realizan dentro de una ventana o ventanas deimás o menos 1 residuo, dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original. Por “ventana o ventanas deimás o menos 1 residuo” se incluye el residuo o residuos de aminoácidos en la posición o posiciones correspondientes de la una 0 más mutaciones estabilizadoras en el mutante del primer GPCr original, y el residuo de aminoácido anterior y el residuo de aminoácido posterior a cada uno de tal residuo o residuos. Por tanto, dentro de cadaimás o menos 1 ventana, pueden estar mutados uno o más de los i-1,ie i+1 residuos de aminoácido.

Las preferencias para el primer y segundo GPCR se definen anteriormente con respecto al primer aspecto de la invención.

Tal como se describe en el ejemplo 7, un análisis estadístico realizado en GPCR mutantes reveló que no sólo las mutaciones estabilizadoras se encuentran cerca unas de otras en la secuencia primaria, sino que también se encuentran espacialmente cerca unas de otras en el espacio tridimensional.

Por consiguiente, los inventores han razonado que una vez que se ha identificado un GPCR mutante con estabilidad aumentada con respecto a un primer GPCR original, pueden generarse GPCR adicionales realizando una o más mutaciones estabilizadoras en la secuencia de aminoácidos del GPCR adicional que se encuentran espacialmente cerca en tres dimensiones a la posición correspondiente a la mutación estabilizadora en el GPCR original.

Por tanto, la invención también proporciona un método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo en relación con un GPCR original, comprendiendo el método:

(a) identificar en la secuencia de aminoácidos de uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo en relación con el primer GPCR original, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCr original, y

(b) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de 12 A del átomo de Ca, o dentro de una distancia de 8 A de cualquier átomo del residuo de aminoácidoi,dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original; en el que el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original, (ii) puede alinearse con el primer GPCR original de modo que la posición o posiciones correspondientes puedan identificarse mediante alineación y (iii) es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original;

Por “secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de” se refiere a todos los residuos de aminoácidos que están dentro de esa distancia del átomo de Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácido i, donde i es el residuo de aminoácido en la posición o posiciones correspondientes en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de 12 A del átomo Cadel residuoiincluye todos aquellos residuos de aminoácidos que están dentro de los 12 A del átomo Cadel residuoi,por ejemplo, dentro de 11 A, 10 A, 9 A, 8 A, 7 A, 6 A, 5 A, 4 A o 3 A del átomo de Cadel residuoi.La secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de 8 A de cualquier átomo de residuoi,incluye todos aquellos residuos de aminoácidos que están dentro de 8 A de cualquier átomo de residuoi,por ejemplo, dentro de 7 A, 6 A, 5 A, 4 A o 3 A de cualquier átomo de residuoi.Se dice que un residuo de aminoácido está dentro de una distancia particular del átomo Cadel residuoisi el átomo de Cade ese residuo de aminoácido está dentro de la distancia particular del átomo de Cadel residuoi.Por ejemplo, se considerará que un residuo de aminoácido está dentro de una distancia de 12 A del Cadel residuoisi el átomo de Cade ese residuo de aminoácido está dentro de una distancia de 12 A del Cadel residuoi,etcétera. De manera similar, se dice que un residuo de aminoácido está dentro de una distancia particular de cualquier átomo de residuoisi cualquier átomo de ese residuo de aminoácido está dentro de la distancia particular de cualquier átomo de residuoi.Por ejemplo, se considerará que un residuo de aminoácido está dentro de una distancia de 8 A de cualquier átomo de residuoisi algún átomo de ese residuo de aminoácido está dentro de una distancia de 8 A de cualquier átomo del residuoi.Por tanto, se apreciará que existen dos criterios de distancia, el primero entre átomos de Cade ambos residuos y el segundo entre cualesquiera átomos de ambos residuos, y puede usarse cualquiera de los métodos.

Las distancias son aquellas medidas basándose en coordenadas en tres dimensiones. Por ejemplo, las distancias normalmente se miden mediante geometría convencional a partir de las coordenadas X, Y y Z de los dos átomos (por ejemplo, raíz cuadrada (;((x1-x2)2 (y1-y2)2 (z1-z2)2)).

Por “cualquier átomo” se incluye cualquier átomo del residuo de aminoácidoi.Por ejemplo, puede ser un átomo de hidrógeno o un átomo que no sea de hidrógeno. El átomo puede ser un átomo de la cadena lateral del aminoácido o puede ser un átomo de la cadena principal.

Se aprecia que cuando se conoce la estructura del segundo GPCR, las distancias se miden cuando la proteína se pliega en su estado nativo. De lo contrario, las distancias podrán medirse dentro de un modelo estructural del segundo GPCR. Los modelos estructurales pueden generarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo los que se describen a continuación con respecto al cuarto aspecto de la invención. Por ejemplo, el modelo estructural puede ser un modelo generado por ordenador basándose en homología o usando métodos de predicción de estructurasde novo(Qianet al.Nature (2007) 450: 259-64).

Se aprecia que cualquier residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de dicha distancia puede estar mutado. Pueden realizarse mutaciones en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, tal como se describió anteriormente y usando técnicas bien establecidas en la técnica.

Las preferencias para el primer y segundo GPCR son tal como se definieron anteriormente.

Los inventores también han razonado que la identificación de motivos estructurales en los que residen una o más mutaciones en un GPCR mutante con estabilidad aumentada será útil para producir GPCR mutantes adicionales con estabilidad aumentada.

Por consiguiente, la invención también proporciona un método para producir un receptor acoplado a proteína G (GPCR) mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

a) proporcionar uno o más mutantes de un primer GPCR original con una estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo en relación con el primer GPCR original

b) identificar en un modelo de proteína de membrana estructural el motivo o motivos estructurales en los que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y

c) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un motivo o motivos estructurales correspondientes en un segundo GPCR original, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original;

en el que el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original, (ii) puede alinearse con el primer GPCR original de modo que los motivo o motivos estructurales correspondientes pueden identificarse mediante alineación y (iii) es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original;

o mediante el cual el uno o más GPCR mutantes tienen una duración de vida prolongada de una conformación antagonista en relación con la conformación antagonista del GPCR humano de tipo natural en condiciones desnaturalizantes de calor, manifestándose la duración de vida prolongada por la retención de la capacidad de unión al ligando antagonista o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se ponen en contacto con el antagonista antes de someterse a calor o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se someten a calor antes de ponerse en contacto con el antagonista

caracterizado además porque el GPCR humano de tipo natural es un GPCR de clase 1, clase 2 o clase 3; y

caracterizado además porque el al menos un aminoácido reemplazado está en un motivo estructural seleccionado del grupo que consiste en una interfaz helicoidal, un acodamiento de hélice, una hélice opuesta a un acodamiento de hélice, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica en la capa límite hidrófoba-hidrófila, una región de bucle y un bolsillo de unión a proteínas.

Puede usarse el mapeo de mutaciones estabilizadoras en uno o más modelos estructurales conocidos para identificar motivos estructurales particulares en los que residen dichas mutaciones estabilizadoras. Se han mapeado mutaciones estabilizadoras del receptor p1-adrenérgico en modelos estructurales del receptor p2-adrenérgico (Rasmussenet al.(2007) Nature 450, 383-387; Cherezovet al.(2007) Science 318:1258-65; Rosenbaumet al.(2007) Science 318:1266-1273) para identificar tales motivos. Por ejemplo, la tabla (vi) enumera las mutaciones del receptor p1-adrenérgico de pavo que se han mapeado en el receptor p2-adrenérgico humano y describe los motivos estructurales correspondientes en los que residen. Tal como se analiza en el ejemplo 4, el mapeo de la mutación Y227A (equivalente a Y219 en el receptor p2 humano) en el receptor p2-adrenérgico humano revela su posición en la interfaz entre hélices, de modo que la mutación puede mejorar el empaquetamiento en la interfaz helicoidal (véanse las figuras 15, 16 y 23). De manera similar, el mapeo de la mutación M90V (equivalente a M82 en el receptor P<2>humano) en el receptor b2-adrenérgico humano revela que está en la hélice 2 en un punto donde la hélice presenta un acodamiento (véanse las figuras 15, 16 y 20). Se descubrió que otras mutaciones residen en otros motivos estructurales, incluyendo superficies de hélice transmembrana que apuntan hacia la bicapa lipídica, regiones límite hidrófobas-hidrófilas, bolsillos de unión a proteínas y regiones de bucle (véase la tabla (vi) y las figuras 18-19, 21-22 y 24-25).

Tales motivos estructurales, en virtud de que contienen mutaciones estabilizadoras, son importantes para determinar la estabilidad de las proteínas. Por tanto, dirigir mutaciones a estos motivos facilitará la generación de GPCR mutantes estabilizados. De hecho, hubo varios casos en los que se mapeó más de una mutación al mismo motivo estructural. Por ejemplo, las mutaciones Y227A, V230A y A234L en el receptor p1-adrenérgico de pavo se mapearon a la misma interfaz helicoidal, las mutaciones V89L y M90V se mapearon al mismo acodamiento de hélice y las mutaciones F327A y A334L se mapearon a la misma superficie helicoidal que apunta hacia la bicapa lipídica (tabla (vi)). Por tanto, cuando se ha identificado una mutación estabilizadora, la determinación del motivo estructural en el que se ubica esa mutación permitirá la identificación de mutaciones estabilizadoras adicionales.

Se apreciará que el uno o más mutantes de un primer GPCR original en el segundo aspecto de la invención pueden seleccionarse o prepararse tal como se describió anteriormente. Por consiguiente, el uno o más mutantes de un primer GPCR original pueden ser cualquiera de los mutantes específicos descritos anteriormente, por ejemplo, receptores p-adrenérgicos, receptores de adenosina, receptores de neurotensina o receptores muscarínicos mutantes. Por tanto, el método del segundo aspecto de la invención también puede usarse para crear GPCR estables y conformacionalmente bloqueados mediante mutagénesis. Por ejemplo, tras la selección de GPCR mutantes que tienen estabilidad aumentada en una conformación particular, pueden identificarse los motivos estructurales en los que residen tales mutaciones estabilizadoras. Luego puede usarse la realización de una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define el motivo estructural correspondiente en otro GPCR para producir un GPCR mutante con estabilidad aumentada en una conformación particular con respecto a su GPCR original.

Se ha realizado un alineamiento de secuencia múltiple de las secuencias de aminoácidos de los receptores beta-2AR humano, NTR1 de rata, beta-1 AR de pavo, de adenosina A2aR humano y muscarínico M1 humano (figura 17) que muestra que, cuando las mutaciones termoestabilizadoras identificadas (véanse los ejemplos 1-3) están situadas en las secuencias, entonces en 11 casos de un total de 70, dos secuencias contienen mutaciones en la misma posición (denotadas en la figura 17 con una estrella). Sin desear limitarse a ninguna teoría, los inventores creen que las mutaciones termoestabilizadoras en estas posiciones deberían tener una transferibilidad mejorada para mapear en un modelo de proteína de membrana estructural. Por tanto, en una realización, el mutante del primer GPCR original es un receptor beta-2AR humano mutante, NTR1 de rata, AR beta-1 de pavo, de adenosina A2aR humano o muscarínico M1 humano que, en comparación con su receptor original correspondiente, tiene un aminoácido en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del AR beta2 humano tal como se establece en la figura 17: Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 y Val 317.

Para identificar el motivo o motivos estructurales, las mutaciones estabilizadoras se mapean en una estructura conocida de una proteína de membrana.

Por “proteína de membrana” quiere decirse una proteína que está unida o asociada con una membrana de una célula u orgánulo. Preferiblemente, la proteína de membrana es una proteína de membrana integral que está permanentemente integrada en la membrana y sólo puede retirarse usando detergentes, disolventes no polares o agentes desnaturalizantes que alteren físicamente la bicapa lipídica.

El modelo estructural de una proteína de membrana puede ser cualquier modelo estructural adecuado. Por ejemplo, el modelo puede ser una estructura cristalina conocida. Los ejemplos de estructuras cristalinas de GPCR incluyen rodopsina bovina (Palczewski, K.et al.,Science 289, 739-745. (2000)) y el receptor p2-adrenérgico humano (Rasmussenet al.,Nature 450, 383-7 (2007); Cherezovet al.(2007) Science 318:1258-65; Rosenbaumet al.(2007) Science 318:1266-1273). Las coordenadas para la estructura del receptor p2-adrenérgico humano puede encontrarse en el RCSB Protein Data Bank con los códigos de registro: 2rh 1, 2r4r y 2r4s. Otros ejemplos de una estructura cristalina de GPCR incluyen el receptor p-adrenérgico de pavo (Warneet al.(2008) Nature 454: 486-91), cuyas coordenadas pueden encontrarse en el RCSB Protein Data Bank (PDB) con el código de registro: 2vt4 y el receptor de adenosina A2A humano (Jaakolaet al.(2008) Science 322: 1211 1217), cuyas coordenadas pueden encontrarse en el PDB RCSB con el código de registro: 3eml. Alternativamente, el modelo estructural puede ser un modelo generado por ordenador basándose en homología o usando métodos de predicción de estructurasde novo(Qianet al.Nature (2007) 450: 259-64).

Se apreciará que las mutaciones estabilizadoras de un GPCR mutante determinado pueden mapearse en un modelo estructural de cualquier proteína de membrana que tenga suficiente similitud estructural con el GPCR. En particular, el dominio de la proteína de membrana debe tener suficiente similitud estructural con el dominio GPCR en el que reside la mutación estabilizadora, para que una mutación determinada sea transferible.

Un dominio proteico se define normalmente como un conjunto discretamente plegado de elementos de estructura secundaria que pueden permanecer solos como una proteína única o formar parte de una proteína más grande en combinación con otros dominios. Comúnmente es una unidad evolutiva funcional.

Los GPCR son esencialmente proteínas de dominio único, excluyendo aquellas con grandes dominios N-terminales. Por tanto, normalmente, el modelo estructural es el de una proteína de membrana que comprende al menos un dominio que tiene suficiente similitud estructural con el GPCR.

La similitud estructural puede determinarse indirectamente mediante el análisis de la identidad de secuencia o directamente mediante la comparación de estructuras.

Con respecto a la identidad de secuencia, la secuencia de aminoácidos que codifica para el dominio GPCR en el que el mutante tiene al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, está alineada con una secuencia de aminoácidos que codifica para un dominio de una proteína de membrana para la cual está disponible un modelo estructural. Se apreciará que una o más de estas secuencias pueden contener una secuencia insertada o extensiones N-terminal o C-terminal que son adicionales al dominio central conservado. Para una alineación óptima, tales secuencias se retiran para no sesgar el análisis. Las proteínas de membrana con suficiente identidad de secuencia en todo el dominio en cuestión pueden usarse como modelo estructural para mapear mutaciones. Se ha demostrado que, para los dominios de proteínas solubles, su estructura 3D está ampliamente conservada por encima del 20 % de identidad de secuencia y bien conservada por encima del 30 % de identidad, aumentando el nivel de conservación estructural a medida que la identidad de secuencia aumenta hasta el 100 % (Ginalski, K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177). Por tanto, se prefiere que el modelo de proteína de membrana estructural sea un modelo de una proteína de membrana que contenga un dominio que comparta al menos el 20 % de identidad de secuencia con el dominio GPCR mutante que contiene al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y más preferiblemente al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos el 95%o el 99%de identidad de secuencia.

La identidad de secuencia puede medirse mediante el uso de algoritmos tales como BLAST o PSI-BLAST (Altschulet al.,NAR (1997), 25, 3389-3402.) o métodos basándose en modelos ocultos de Markov (Eddy Set al.,J Comput Biol (1995) Spring 2 (1) 9-23). Normalmente, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede determinarse usando cualquier programa informático adecuado, por ejemplo, el programa GAP del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin y se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula en relación con los polipéptidos cuya secuencia se ha alineado de manera óptima. Alternativamente, la alineación puede realizarse usando el programa Clustal W (Thompsonet al.,1994). Los parámetros usados pueden ser los siguientes: parámetros de alineación rápida por pares: tamaño de K-tupla (palabra); 1, tamaño de ventana; 5, penalización por hueco; 3, número de diagonales superiores; 5. Método de puntuación: x por ciento. Múltiples parámetros de alineación: penalización por apertura de hueco; 10, penalización por extensión de hueco; 0,05. Matriz de puntuación: BLOSUM.

Además de la identidad de secuencia, la similitud estructural puede determinarse directamente mediante comparación de modelos estructurales. Pueden usarse modelos estructurales para detectar regiones de similitud estructural que no son evidentes únicamente mediante el análisis de secuencia y que pueden ser o no contiguas en la secuencia. Por ejemplo, se cree que los GPCR de las familias B y C comparten estructuras similares; sin embargo, su identidad de secuencia es muy baja. De manera similar, las acuaporinas transportadoras de agua SoPip2 de espinacas, AqpZ deE. coli,AqpM deMethanococcus,Aqp4 de rata, Aqp1 humana y Aqp0 de oveja comparten una identidad de secuencia baja, pero todas tienen estructuras similares.

Pueden construirse modelos estructurales de alta fidelidad para proteínas de estructura desconocida usando paquetes de software convencional tal como MODELLER (Sali A y Blundell T, J Mol Biol (1993) 234(3) 779-815), en el que la estructura se modela a partir de una estructura conocida de una proteína homóloga. Este modelado mejora al aumentar la identidad de secuencia. Normalmente, la identidad de secuencia entre la secuencia de estructura desconocida y una secuencia de estructura 3D conocida es superior al 30 % (Ginalski, K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177). Además, los métodos de predicción de estructurasde novobasados únicamente en secuencias pueden usarse para modelar proteínas de estructura desconocida (Qianet al.,(2007) Nature 450:259-64). Una vez que las estructuras se han determinado experimentalmente o se han obtenido mediante modelado, pueden detectarse regiones de similitud estructural mediante comparación directa de dos o más estructuras 3D. Pueden, por ejemplo, comprender elementos de estructura secundaria de una arquitectura y topología particulares que pueden detectarse mediante el uso de software tales como DALI (Holm, L y Sander, C (1996) Science 273, 595-603). Pueden comprender disposiciones locales de cadenas laterales de aminoácidos y la estructura polipeptídica, o conjuntos específicos de átomos o grupos de átomos en una disposición espacial particular, que también pueden detectarse, por ejemplo, mediante el uso de representaciones teóricas gráficas (Artymiuk, Pet al.,(2005) J Amer Soc Info Sci Tech 56 (5) 518-528). En este enfoque, los átomos o grupos de átomos dentro de las proteínas o regiones de proteínas que van a compararse se representan normalmente como los nodos de un gráfico, y describiéndose los bordes del gráfico los ángulos y las distancias entre los nodos. Los patrones comunes en estos gráficos indican motivos estructurales comunes. Este enfoque puede ampliarse para incluir cualquier descriptor de átomos o grupos de átomos, tales como donante o aceptor de enlaces de hidrógeno, hidrofobia, forma, carga o aromaticidad; por ejemplo, las proteínas pueden mapearse espacialmente según tales descriptores usando GRID y esta representación se usa como base para la búsqueda de similitudes (Baroniet al.(2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294). Las descripciones de los métodos, la disponibilidad de software y las pautas para la selección de parámetros, umbrales y tolerancias definida por el usuario se describen en las referencias proporcionadas anteriormente.

En una realización preferida, el modelo de proteína de membrana estructural es un modelo de GPCR estructural. Se apreciará que el modelo estructural de un GPCR puede ser un modelo del primer GPCR original. Por ejemplo, las mutaciones estabilizadoras dentro de un GPCR mutante que tiene estabilidad aumentada pueden mapearse directamente en la primera estructura del GPCR original e identificarse los motivos estructurales en los que se ubican tales mutaciones. Cuando se desconoce la estructura del primer GPCR original, pueden usarse modelos estructurales de otros GPCR. Por ejemplo, las mutaciones estabilizadoras en un GPCR de una especie pueden mapearse en un modelo estructural conocido del mismo GPCR de otra especie. De manera similar, las mutaciones estabilizadoras en una isoforma de GPCR particular pueden mapearse en un modelo estructural conocido de otra isoforma de GPCR. Además, las mutaciones estabilizadoras de un GPCR pueden mapearse en un GPCR de la misma clase o familia. La Unión Internacional de Farmacología ha elaborado una lista de clases y familias de GPCR (Foordet al.(2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward.

Tal como se describió anteriormente, se apreciará que el modelo estructural puede ser de cualquier GPCR siempre que tenga suficiente similitud estructural en todo el dominio en el que el GPCR mutante tenga al menos un aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original. Por tanto, se prefiere que el GPCR comparta al menos el 20 % de identidad de secuencia con el mutante del primer GPCR original en todo el dominio proteico que contiene al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y más preferiblemente al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos el 95%o el 99%de identidad de secuencia. Sin embargo, los inventores reconocen que el umbral de identidad de secuencia del 20 % no es absoluto. Los GPCR con menos del 20 % de identidad de secuencia en relación con el primer GPCR original también pueden servir como modelo estructural al que se transfieren mutaciones estabilizadoras, en el que la baja identidad de secuencia se contrarresta con otras similitudes, incluyendo, por ejemplo, la presencia de los mismos motivos de secuencia, que se unen a la misma proteína G o que tienen la misma función, o que tienen sustancialmente los mismos gráficos de hidropatía en comparación con el primer GPCR original.

El mapeo de mutaciones estabilizadoras en el modelo estructural puede realizarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, normalmente, la secuencia de aminoácidos del GPCR para el cual está disponible el modelo estructural está alineada con la secuencia de aminoácidos del mutante del primer GPCR original. La posición o posiciones de al menos un residuo de aminoácido diferente en el GPCR mutante en relación con el primer GPCR original pueden localizarse entonces en la secuencia de aminoácidos del GPCR para el que está disponible un modelo estructural.

Por “motivo estructural” se incluye el significado de una descripción tridimensional de la ubicación en un modelo estructural GPCR de una mutación termoestabilizadora. Por ejemplo, el motivo estructural puede ser cualquier motivo estructural secundario o terciario dentro del GPCR. Por “motivo estructural terciario” se incluye cualquier descriptor de átomos o grupos de átomos, tales como donante o aceptor de enlaces de hidrógeno, hidrofobia, forma, carga o aromaticidad. Por ejemplo, las proteínas pueden mapearse espacialmente según tales descriptores usando GRID y esta representación puede usarse como base para definir un motivo estructural (Baroniet al.(2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294).

La tabla (vi) enumera los motivos estructurales en los que se encontró que residían las mutaciones estabilizadoras del receptorp1-adrenérgico de pavo. Tal como se observa en la tabla, las mutaciones se ubican en varias localidades distintas. Tres mutaciones se encuentran en regiones de bucle que se predice que serán accesibles al disolvente acuoso. Ocho mutaciones se encuentran en las hélicesatransmembrana y apuntan hacia la bicapa lipídica; tres de estas mutaciones están cerca del final de las hélices y puede considerarse que están en la capa límite hidrófoba-hidrófila. Se encuentran ocho mutaciones en las interfaces entre hélicesatransmembrana, tres de las cuales están o bien dentro de una región acodada o distorsionada de la hélice y otras dos mutaciones se producen en una hélice pero son adyacentes a una o más hélices que contienen un acodamiento adyacente en espacio al residuo mutado. Estas últimas mutaciones podrían afectar el empaquetamiento de los aminoácidos dentro de la región acodada, lo que podría dar como resultado una termoestabilización. Otra mutación se encuentra en un bolsillo de unión al sustrato.

Por consiguiente, en una realización, el motivo estructural es cualquiera de una interfaz helicoidal, un acodamiento de hélice, una hélice opuesta a un acodamiento de hélice, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica en la capa límite hidrófobahidrófila, una región de bucle o un bolsillo de unión a proteínas.

La identificación de un motivo estructural en el que reside una mutación estabilizadora sugiere la importancia de ese motivo en la estabilidad de las proteínas. Por tanto, realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un motivo o motivos estructurales correspondientes en un segundo GPCR original debería proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original.

La secuencia de aminoácidos que define un motivo estructural es la secuencia de aminoácidos primaria de los residuos de aminoácidos que se combinan en la estructura secundaria o terciaria de la proteína para formar el motivo estructural. Se apreciará que una secuencia de aminoácidos primaria de este tipo puede comprender residuos de aminoácidos contiguos o no contiguos. Por tanto, identificar la secuencia de aminoácidos que define el motivo estructural implicará determinar los residuos implicados y posteriormente definir la secuencia. Pueden realizarse mutaciones en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, tal como se describió anteriormente y usando técnicas bien establecidas en la técnica.

Por “motivo o motivos estructurales correspondientes”, quiere decirse el motivo o motivos estructurales análogos identificados en el modelo estructural que están presentes en el segundo GPCR original. Por ejemplo, si se identificara una interfaz helicoidal, la interfaz helicoidal correspondiente en el segundo GPCR original sería la interfaz entre las hélices que son análogas a las hélices presentes en el modelo estructural. Si se identificó un acodamiento de hélice, el acodamiento de hélice correspondiente sería el acodamiento en la hélice que es análogo a la hélice acodada presente en el modelo estructural. Puede identificarse un motivo o motivos estructurales análogos en el segundo GPCR original buscando secuencias de aminoácidos similares en la secuencia del segundo GPCR original que definen el motivo o motivos en el modelo estructural, por ejemplo, mediante alineación de secuencias. Además, en la técnica se encuentran ampliamente disponibles algoritmos informáticos que pueden usarse para predecir la presencia de motivos proteicos basándose en una secuencia de aminoácidos. Por tanto, basándose en la posición relativa de un motivo particular dentro de la secuencia de aminoácidos y su posición con respecto a otros motivos, puede identificarse fácilmente un motivo estructural análogo. Se apreciará que si está disponible un modelo estructural del segundo GPCR original, el motivo o motivos estructurales análogos pueden mapearse directamente en la estructura de la proteína. Normalmente, la secuencia de aminoácidos que define el motivo estructural análogo tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con la secuencia que define el motivo en el modelo estructural, más preferentemente al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % y el 90 % de identidad de secuencia y aún más preferiblemente el 95 % y el 99 % de identidad de secuencia.

En una realización, el segundo GPCR original es el primer GPCR original. Para evitar dudas, el segundo GPCR original puede tener la secuencia que se produce de manera natural del primer GPCR original, o puede ser una forma truncada o puede ser una fusión, o bien con la proteína que se produce de manera natural o bien con un fragmento de la misma, o puede contener mutaciones en comparación con la secuencia que se produce de manera natural, siempre que conserve la unión del ligando.

En una realización alternativa, el segundo GPCR original no es el primer GPCR original. Por ejemplo, puede haberse identificado un mutante de un primer GPCR original que tiene estabilidad aumentada pero se desea generar un mutante de un GPCR diferente con estabilidad aumentada. En el contexto de la presente invención, el segundo GPCR original es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original tal como se describió anteriormente. Sin embargo, se apreciará que el segundo GPCR original puede ser cualquier GPCR conocido siempre que comparta suficiente similitud estructural con el primer GPCr original, de modo que contenga un motivo estructural correspondiente en el que la mutación estabilizadora del mutante del primer GPCR original reside. Por tanto, el segundo GPCR original tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia en relación con el primer GPCR original y más preferiblemente al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de identidad de secuencia. Sin embargo, tal como se mencionó anteriormente, algunos GPCR tienen una baja identidad de secuencia (por ejemplo, los GPCR de las familias B y C) pero son similares en estructura.

Tal como se comenta en el ejemplo 8, los inventores han descubierto superponiendo modelos de homología de los receptores de adenosina A2A, muscarínico 1 y neurotensina, con la estructura del receptor adrenérgico beta 1 de pavo, que no sólo pueden determinarse las relaciones espaciales entre mutantes, sino también pueden evaluarse los “puntos calientes” de mutantes para determinar su significación estadística. Por “puntos calientes” quiere decirse un grupo de residuos de aminoácidos que, cuando se someten a mutación, dan lugar a una mayor estabilidad en relación con un GPCR original. Es probable que tales puntos calientes que son altamente significativos estadísticamente estén presentes en otras estructuras de GPCR y, por tanto, su determinación puede usarse para identificar GPCR mutantes con estabilidad aumentada en relación con un GPCR original. Se aprecia que los puntos calientes pueden corresponderse o no con los motivos estructurales señalados en el tercer aspecto de la invención. Por ejemplo, los residuos que definen un punto caliente no pertenecen necesariamente al mismo motivo estructural, tal como una cadena en hélice o beta.

Por tanto, la invención también proporciona un método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(a) proporcionar uno o alinear más de un modelo tridimensional de uno o más mutantes de un GPCR con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo en relación con un GPCR original;

(b) identificar en la secuencia de aminoácidos del uno o más mutantes, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original; (c) determinar dentro de una distancia establecida d A del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, el número de otras posiciones de cualquier modelo alineado en el que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original;

(d) determinar si el número de otras posiciones representa un agrupamiento estadísticamente significativo; y (e) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de d A del átomo de Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácido en la posición que corresponde al centro del agrupamiento estadísticamente significativo y en la que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original;

en el que el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el GPCR original en la etapa (a); (ii) puede alinearse con el GPCR original en la etapa (a) de modo que la posición o posiciones correspondientes puedan identificarse mediante alineación y (iii) es de la misma clase o familia de GPCR que el GPCR original en la etapa (a);

y en el que el uno o más mutantes de un GPCR original en la etapa (a) son uno o más mutantes modificados por ingeniería de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano de tipo natural que tienen al menos un aminoácido reemplazado en comparación con el GPCR humano de tipo natural, y que tienen termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR humano original de tipo natural;

o mediante el cual el uno o más GPCR mutantes tienen una duración de vida prolongada de una conformación antagonista en relación con la conformación antagonista del GPCR humano de tipo natural en condiciones desnaturalizantes de calor, manifestándose la duración de vida prolongada por la retención de la capacidad de unión al ligando antagonista o bien cuando uno o más más GPCR mutantes se ponen en contacto con el antagonista antes de someterse a calor o bien cuando el uno o más GPCR mutantes se someten a calor antes de ponerse en contacto con el antagonista,

caracterizado además porque el GPCR humano de tipo natural es un GPCR de clase 1, de clase 2 o de clase 3; y

Por modelo “tridimensional”, se incluye tanto estructuras conocidas como modelos predictivos de una estructura tridimensional de un GPCR mutante que tiene una estabilidad aumentada en relación con un GPCR original, por ejemplo, modelos generados basándose en homología o usando métodos de predicción de estructurasde novoconocidos en la técnica (Quianet al.,Nature (2007) 450:259-64), tal como se describió anteriormente. Se aprecia que cuando hay más de un modelo, los modelos pueden ser de GPCR mutantes de diferentes GPCR originales. Convenientemente, cuando hay más de un modelo, los modelos son de GPCR mutantes que pertenecen a la misma familia o clase. La Unión Internacional de Farmacología ha elaborado una lista de clases y familias de GPCR (Foordet al.(2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) y esta lista se actualiza periódicamente en http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForward. Se aprecia además que pueden alinearse modelos tridimensionales de cualquier GPCR mutante siempre que compartan suficiente similitud estructural. Por tanto, cuando hay más de un modelo de un GPCR mutante, se prefiere que los GPCR mutantes compartan al menos el 20 % de identidad de secuencia entre sí y más preferiblemente al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 80 % o el 90 % de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos el 95 % o el 99 % de identidad de secuencia. Sin embargo, los GPCR con menos del 20 % de identidad de secuencia entre sí aún pueden alinearse cuando la baja identidad de secuencia se contrarresta con otras similitudes, incluyendo, por ejemplo, la presencia de los mismos motivos de secuencia que se unen a la misma proteína G o que tienen la misma función, o que tienen sustancialmente los mismos gráficos de hidropatía.

En una realización particularmente preferida, el modelo tridimensional puede ser una cualquiera o más de las estructuras cristalinas P1-AR de pavo (Warneet al.(2008) Nature 454: 486-91; código de registro de pdb 2vt4), la estructura cristalina del receptor de adenosina A2A humano (Jaakolaet al.(2008) Science 322: 1211-1217; código de registro de PDB 3eml), o modelos generados de un GPCR mutante con estabilidad aumentada en relación con un GPCR original, tal como el receptor de adenosina A2A, el receptor muscarínico 1 o el receptor de neurotensina, basándose en su homología con, por ejemplo, el P1-AR de pavo. Se aprecia que pueden usarse uno cualquiera o más modelos de un GPCR mutante divulgado en el presente documento, tales como el receptor P-adrenérgico, el receptor de adenosina, el receptor de neurotensina y el receptor muscarínico descritos anteriormente.

Normalmente, el modelo se genera por ordenador. Los modelos informáticos pueden generarse o visualizarse mediante programas de software disponibles comercialmente. Los ejemplos de programas de software incluyen, pero no se limitan a, QUANTA (Accelrys.COPYRIGHT.2001, 2002), O (Joneset al.,Acta Crystallogr. A47, págs.

110-119 (1991)) y RIBBONS (Carson, J. Appl. Crystallogr., 24, págs. 9589-961 (1991)).

Preferiblemente, se proporciona más de un modelo tridimensional, es decir, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 modelos. Se aprecia que cuantos más modelos se proporcionen, mayores serán las posibilidades de definir un agrupamiento estadísticamente significativo que pueda mapearse en otros GPCR para producir GPCR con estabilidad aumentada. Sin embargo, aún pueden definirse agrupamientos significativos usando un solo modelo, en cuyo caso el modelo no está alineado con ningún otro modelo.

Por “alinear” quiere decirse que los modelos tridimensionales de uno o más mutantes de un GPCR con estabilidad aumentada en relación con un GPCR original se superponen para minimizar la distancia promedio (o media cuadrática) entre átomos equivalentes de cada modelo. Por ejemplo, los modelos pueden rotarse y trasladarse para minimizar la distancia promedio (o media cuadrática). Los modelos tridimensionales pueden alinearse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, algoritmos tales como en LSQMAN (Kleywegt y Jones (1994) A super position, CCP4/<e>S<f>-<e>A<c>BM, Newsletter on Protein Crystallography, 31: 9-14) o el algoritmo Superpose en MOE (Chemical Computing Group Inc) o el programa Superpose Folding Motif en QUANTA (Accelrys Inc).

Una vez alineados los modelos, se determina dentro de una distancia establecidadA del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, el número de otras posiciones de cualquier modelo alineado en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original. Por ejemplo, para una posición determinada en un modelo tridimensional de un GPCR mutante en la que ese mutante tiene un residuo de aminoácido diferente en comparación con su GPCR original, se determina el número de otras posiciones de cualquier modelo alineado (en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original) dentro de una distancia establecida dedA del átomo de Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácido en esa posición.

Se dice que una posición en la que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original está dentro de una distancia establecida dedA del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido particular, si el átomo de Cao cualquier átomo del aminoácido en esa posición (dependiendo de si se usa el método del “átomo de Ca” o de “cualquier átomo”) está dentro dedA del átomo de Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácido particular. Por ejemplo, cuando se usa el método de “átomo de Ca”, se dice que una posición en la que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original está dentro de una distancia establecida dedA del átomo Cade un residuo de aminoácido particular, si el átomo Cadel aminoácido en esa posición está dentro dedA del átomo Cadel residuo de aminoácido particular. De manera similar, cuando se usa el método de “cualquier átomo”, se dice que una posición en la que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original está dentro de una distancia establecida de d A desde cualquier átomo de un residuo de aminoácido particular, si algún átomo del aminoácido en esa posición está dentro dedA de cualquier átomo del residuo de aminoácido particular. Se aprecia que en el caso de un solo modelo, solo se determina dentro de una distancia establecida dedA del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido particular. Cuando hay más de un modelo, se determina el número de posiciones dentro de cualquier modelo alineado de uno o más GPCR mutantes, en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, dentro de una distancia establecida dedA del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido particular.

La distancia establecidadA es la medida basándose en coordenadas en tres dimensiones tal como se describió anteriormente, desde el átomo de Cao cualquier átomo de un residuo de aminoácido particular, y cubre un modelo (en el caso de que se use un solo modelo) o cubre todos los modelos alineados (en el caso de que se use más de un modelo).

Preferiblemente, la distancia establecidadA del átomo de Cade un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, es al menos 2 A, 3 A, 4 A, 5 A, 6 A, 7 A, 8 A, 9 A, 10 A, 11 A o 12 A. Preferiblemente la distancia establecidadA es al menos 4 A. En una realización particularmente preferida, la distancia establecidadA del átomo de Caes cualquiera de 6 A u 8 A o 10 A o 12 A y lo más preferiblemente 10 A o 12 A. Normalmente, la distancia establecidadA es 12 A o menos.

Preferiblemente, la distancia establecidadA de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, es al menos 2 A, 3 A, 4 A, 5 A, 6 A, 7 A, 8 A, 9 A, 10 A, 11 A o 12 A. En una realización particularmente preferida, la distancia establecidadA de cualquier átomo es cualquiera de 4 A, 6 A, 8 A o 10 A y lo más preferiblemente 8 A o 10 A. Normalmente, la distancia establecidadA es 12 A o menos.

Se aprecia que las distancias preferidas son aquellas que dan lugar a un agrupamiento estadísticamente significativo tal como se describe a continuación.

Por “cualquier átomo”, se incluye cualquier átomo del residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original. Por ejemplo, puede ser un átomo de hidrógeno o un átomo que no sea de hidrógeno. El átomo puede ser un átomo de la cadena lateral del aminoácido o puede ser un átomo de la cadena principal.

Una vez que se ha determinado el número de otras posiciones de cualquier modelo alineado en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, es necesario evaluar si esto representa un agrupamiento estadísticamente significativo.

Por “grupo estadísticamente significativo” quiere decirse que el número de otras posiciones identificadas dentro de una distancia establecida d del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, es mayor que el número que se esperaría por casualidad. Normalmente, se dice que un grupo es estadísticamente significativo si el número de otras posiciones identificadas es significativo al nivel del 95 % (es decir,p<0,05). Se prefiere particularmente que los grupos sean estadísticamente significativos de modo quep<0,001.

La significación de un grupo puede determinarse usando cualquier método adecuado en la técnica. Por ejemplo, tal como se describe en el ejemplo 8, se generó una distribución aleatoria para representar el número inicial de posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, dentro de una distancia establecida del átomo de Cao cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original. Una distribución aleatoria de este tipo se generó asignando aleatoriamente N posiciones a la totalidad de un GPCR mutante, donde N es el número de mutaciones estabilizadoras verdaderas (es decir, el número de posiciones en las que el mutante tiene al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original). Esto se repite para cualquier modelo alineado donde se use más de un modelo. Una vez que se completen estos mapeos asignados aleatoriamente, puede determinarse la distribución (promedio y desviación estándar) de los tamaños de los agrupamientos a diferentes distancias. Normalmente, dicha distribución aleatoria se producirá a partir de al menos 5.000, 10.000 o 20.000 asignaciones aleatorias de este tipo y se supone que está distribuida normalmente alrededor de una media. Se aprecia que deberían calcularse tales distribuciones aleatorias para una distancia establecida dada, por ejemplo, una distribución aleatoria para 6 A y una distribución aleatoria para 8 A. Una vez determinado el tamaño promedio y la desviación estándar de los tamaños de los agrupamientos a partir de una distribución aleatoria a una distancia establecida, puede calcularse la importancia de la existencia de un agrupamiento de un tamaño determinado usando principios estadísticos convencionales. Por ejemplo, usando la distribución normal, la importancia de un agrupamiento de tamañonpuede calcularse según la fórmula: Z = (x -p/a), donde x es el tamaño del agrupamientoo,pes el tamaño promedio del agrupamiento,aes la desviación estándar de la distribución de los agrupamientos y Z es el valor de significancia. Se apreciará que el número de posiciones identificadas puede aproximarse en cuanto a desviaciones estándar al número esperado por casualidad y aún ser significativo al nivel del 95 %.

Si se encuentra que el número de posiciones identificadas dentro de una distancia establecida del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido, en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, es significativo, entonces se ha identificado un agrupamiento estadísticamente significativo que comprende aminoácidos que tienen más probabilidades de ser importantes para determinar la estabilidad de las proteínas, es decir, se han definido un punto caliente o puntos calientes. El centro del agrupamiento, es decir, el residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el mutante tiene un residuo de aminoácido diferente en comparación con su GPCR original, puede mapearse entonces en un segundo GPCR para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original. Por ejemplo, pueden realizarse una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCr dentro de la misma distancia establecida del Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácido en la posición o posiciones correspondientes en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original. Por ejemplo, si se identificó un agrupamiento dentro de 10 A de Cadel residuo X en un GPCR mutante particular, entonces pueden realizarse una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de 10 A de Cadel residuo de aminoácido que corresponde al residuo X en el segundo GPCR. Por tanto, una vez que se han identificado agrupamientos estadísticamente significativos en un GPCR mutante, pueden usarse para identificar mutaciones estabilizadoras en otros GPCR.

Tal como se describe en el ejemplo 8, cuando se ha identificado más de un grupo, puede ser útil definir el centro de varios agrupamientos y usarlo como el centro del radio para un superagrupmiento que puede usarse para identificar posiciones de mutación en otras secuencias.

Por tanto, la invención también incluye un método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(a) proporcionar uno o alinear más de un modelo tridimensional de uno o más mutantes de un GPCR con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con un GPCR original;

(b) identificar en la secuencia de aminoácidos del uno o más mutantes, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original; (c) determinar dentro de una distancia establecidadA del átomo de Ca o de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, el número de otras posiciones del modelo o el más de un modelo alineado en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original;

(d) determinar si el número de otras posiciones representa un agrupamiento estadísticamente significativo; (e) determinar el centro de dos o más agrupamientos estadísticamente significativos identificados en (d); y (f) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de x A desde la posición que corresponde al centro de los dos o más agrupamientos estadísticamente significativos, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original

en el que el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el GPCR original en la etapa (a); (ii) puede alinearse con el GPCR original en la etapa (a) de modo que la posición que corresponde al centro de los dos o más agrupamientos estadísticamente significativos puede identificarse mediante alineación y (iii) es de la misma clase o familia de GPCR que GPCR original en la etapa (a);

y en el que el uno o más mutantes de un GPCR original en la etapa (a) son uno o más mutantes modificados por ingeniería de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano de tipo natural que tienen al menos un aminoácido reemplazado en comparación con el GPCR humano de tipo natural, y que tienen termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR humano de tipo natural;

Por “centro de dos o más agrupamientos estadísticamente significativos” quiere decirse el punto en el espacio tridimensional que corresponde al centro de los dos o más agrupamientos. Este puede ser el centro geométrico determinado por la cobertura de todas las coordenadas (x, y, z) de los puntos centrales de cada agrupamiento, o el centro de gravedad de dos o más agrupamientos. Normalmente, el centro en cada caso se determina usando paquetes de software informático tal como se conoce bien en la técnica. Alternativamente, por “centro de dos o más agrupamientos estadísticamente significativos” quiere decirse el residuo de aminoácido que está más cerca al centro de los dos o más agrupamientos tal como se definió anteriormente (centro geométrico o centro de gravedad). Por “residuo de aminoácido que está más cerca a” quiere decirse que cualquier átomo de ese aminoácido es el átomo más cercano al centro, de todos los átomos de la proteína.

Se aprecia que el centro puede corresponder al centro de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 agrupamientos.

El centro de agrupamientos estadísticamente significativos puede mapearse entonces en un segundo GPCR y usarse para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original. Por ejemplo, pueden realizarse una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de x A de la posición que corresponde al centro de los agrupamientos estadísticamente significativos, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original.

Cuando el centro se define como un punto en el espacio tridimensional en un GPCR mutante particular, la posición que corresponde al centro es el punto en el segundo GPCR que se alinea con el punto central cuando se compara un modelo tridimensional del segundo GPCR con el modelo del GPCR mutante. Cuando el centro se define como el residuo de aminoácido que está más cerca a dicho punto en un GPCR mutante particular, la posición que corresponde al centro es el átomo de CI del residuo de aminoácido en el segundo GPCR que se alinea con dicho residuo de aminoácido en el GPCR mutante cuando se comparan los dos GPCR usando MacVector y CLUSTALW.

La distancia x A es la distancia de la posición que corresponde al centro de los agrupamientos estadísticamente significativos, que proporciona un radio suficiente para capturar todos los agrupamientos individuales que juntos forman el superagrupamiento. Tal como se comentó anteriormente, se apreciará que la distancia x A puede ser de un átomo de CI o de un punto en el espacio tridimensional.

Se aprecia que puede someterse a mutación cualquier residuo de aminoácido en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de dicha distancia. Pueden realizarse mutaciones en una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, tal como se describió anteriormente y usando técnicas bien establecidas en la técnica. Las preferencias para el segundo GPCR se definen anteriormente con respecto al primer aspecto de la invención, en el que la referencia al primer GPCR corresponde al GPCR mutante en el que se ha identificado un agrupamiento estadísticamente significativo en la etapa (d).

Dado que existen potencialmente miles de mutaciones que pueden detectarse en un GPCR en cuanto a aumento de estabilidad, resulta ventajoso centrarse en mutaciones concretas que se sabe que son importantes para conferir estabilidad. Por tanto, se apreciará que los diversos métodos de la invención pueden usarse en un método para seleccionar GPCR mutantes con estabilidad aumentada. En particular, la realización de los métodos de la invención puede usarse para dirigir mutaciones a residuos de aminoácidos particulares (es decir, aquellos en posiciones particulares, aquellos cercanos a una posición particular en cuanto a proximidad de secuencia primaria, y aquellos cercanos a una posición particular en cuanto a proximidad tridimensional) o a secuencias de aminoácidos que definen motivos estructurales importantes para determinar la estabilidad, o a residuos de aminoácidos que forman parte de un agrupamiento para el cual se ha determinado que es significativamente más probable que comprenda aminoácidos importantes para determinar la estabilidad.

Por consiguiente, en una realización, el método de la invención comprende además:

(I) seleccionar un ligando, siendo el ligando uno que se une al segundo GPCR original cuando el GPCR reside en una conformación particular

(II) determinar si el o cada mutante del segundo GPCR original cuando reside en una conformación particular tiene estabilidad aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad del segundo GPCR original cuando reside en la misma conformación particular con respecto a la unión a ese ligando, y

(III) seleccionar aquellos mutantes que tienen estabilidad aumentada en comparación con el segundo GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado.

Se observará que las etapas (I), (II) y (III) corresponden a las etapas (ii), (iii) y (iv) del método de selección descrito anteriormente. Por consiguiente, las preferencias para el ligando y los métodos para evaluar la estabilidad son tal como se definieron anteriormente con respecto al método de selección.

Convenientemente, se realizan los métodos de la invención y se evalúa la estabilidad de los mutantes resultantes como anteriormente. Luego pueden repetirse los métodos de la invención, convirtiéndose uno o más mutantes resultantes generados en la primera ronda en el primer GPCR original en la primera etapa de cada método en una ronda posterior. Por tanto, se apreciará que los métodos pueden usarse de manera iterativa, por ejemplo, llevando a cabo un método para identificar mutaciones individuales con estabilidad aumentada, combinando esas mutaciones en un GPCR mutante único, que luego constituye el GPCR original proporcionado en la primera etapa de cada método. Los métodos pueden repetirse hasta que se hayan identificado suficientes mutaciones estabilizadoras.

Por ejemplo, en una realización particularmente preferida de la invención, la una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR se realizan dentro de tamaños de ventana progresivamente crecientes. Normalmente, en primer lugar se usa un tamaño de ventana pequeño y se identifican las mutaciones estabilizadoras de ese subconjunto de secuencia, seguido de la exploración de residuos adicionales en tamaños de ventana crecientes hasta que se haya encontrado el número deseado de mutaciones. Por tanto, en una primera ronda, pueden realizarse una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una ventana o ventanas deimás o menos un residuo, dondeies la posición o posiciones correspondientes en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original. Puede evaluarse la estabilidad de los mutantes resultantes y seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad aumentada en comparación con el segundo GPCR original. Luego, el método puede repetirse realizando una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una ventana o ventanas deimás o menos dos residuos, y así sucesivamente. Alternativamente, el primer tamaño de ventana analizado puede serimás o menos dos, tres o cuatro residuos. Se aprecia que una vez que se han identificado suficientes mutaciones no hay necesidad de ampliar la ventana adicionalmente.

De manera similar, en una realización particularmente preferida de la invención, la una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR se realizan dentro de distancias progresivamente crecientes del átomo de Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácidoi.Normalmente, en primer lugar se usa una distancia pequeña y se identifican las mutaciones estabilizadoras de ese subconjunto de secuencia, seguido de la exploración de residuos adicionales a distancias crecientes hasta que se haya encontrado el número deseado de mutaciones. Por tanto, en una primera ronda, pueden realizarse una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de<6>A del átomo de Ca, o dentro de una distancia de 4 A de cualquier átomo del residuo de aminoácidoi,dóndeies la posición o posiciones correspondientes en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original. Puede evaluarse la estabilidad de los mutantes resultantes y seleccionar aquellos mutantes que tienen una estabilidad aumentada en comparación con el segundo GPCR original. Luego, el método puede repetirse realizando una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de<8>A del átomo de Ca, o dentro de una distancia de<6>A de cualquier átomo de residuo de aminoácidoi,etcétera. Se aprecia que una vez que se han identificado suficientes mutaciones no hay necesidad de aumentar la distancia adicionalmente.

También se divulga en el presente documento un GPCR mutante con estabilidad aumentada en relación con su GPCR original producido mediante los métodos de la invención.

Los GPCR mutantes así producidos y divulgados en el presente documento pueden tener una estabilidad aumentada ante cualquiera de calor, un detergente, un agente caotrópico y un pH extremo.

Los GPCR mutantes así producidos y divulgados en el presente documento pueden tener una termoestabilidad aumentada.

Los GPCR mutantes así producidos y divulgados en el presente documento pueden tener una termoestabilidad aumentada en comparación con su progenitor cuando están en presencia o ausencia de un ligando del mismo. Normalmente, el ligando es un antagonista, un agonista completo, un agonista parcial o un agonista inverso, ya sea ortostérico o alostérico. Tal como se comentó anteriormente, el ligando puede ser un polipéptido, tal como un anticuerpo.

El GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede ser al menos 2 °C más estable que su progenitor, preferiblemente al menos 5 °C más estable, más preferiblemente al menos<8>°C más estable e incluso más preferiblemente al menos 10 °C o 15 °C o 20 °C más estable que su progenitor. Normalmente, la termoestabilidad de los receptores originales y mutantes se mide en las mismas condiciones. Normalmente, se somete a ensayo la termoestabilidad en una condición en la que el GPCR reside en una conformación particular. Normalmente, esta condición seleccionada es la presencia de un ligando que se une al GPCR.

El GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede, cuando se solubiliza y purifica en un detergente adecuado, tiene una termoestabilidad similar a la rodopsina bovina purificada en dodecil maltósido. Se prefiere particularmente que el GPCR mutante conserve al menos el 50 % de su actividad de unión al ligando después de calentarlo a 40 °C durante 30 minutos. Se prefiere además que el GPCR mutante conserve al menos el 50 % de su actividad de unión al ligando después de calentarlo a 55 °C durante 30 minutos.

El GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede ser un GPCR mutante que, en comparación con su receptor original, tiene al menos un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones: (i) según la numeración de las receptorp-adrenérgico de pavo tal como se establece en la figura 9: Ile 55, Gly<6 7>, Arg<6 8>, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338, (ii) según la numeración del receptor de adenosina A<2>a humano tal como se establece en la figura 10: Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315, (iii) según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se establece en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala<86>, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Iie 253, Leu 256, Iie 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399, y (iv) según la numeración del receptor muscarínico tal como se establece en la figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 y Met 384.

La alineación de las secuencias de aminoácidos del AR p1 de pavo, del receptor de adenosina humano, del receptor de neurotensina de rata y del receptor muscarínico humano en la figura 17, muestra que en 11 de 70 casos, dos secuencias contienen mutaciones en la misma posición, es decir, en las siguientes posiciones según la numeración del AR beta2 humano como se establece en la figura 17: Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 y Val 317. Por tanto, el GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede ser uno que tenga, en comparación con su receptor original, un aminoácido diferente en una cualquiera o más de estas posiciones.

El GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede ser un receptor p-adrenérgico mutante. Por ejemplo, el receptor p-adrenérgico mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor p-adrenérgico de pavo tal como se establece en la figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg<68>, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338.

El GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede ser un receptor de adenosina mutante. Por ejemplo, el receptor de adenosina mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de adenosina A<2>a humano tal como se establece en la figura 10: Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315.

El GPCR mutante así producido y divulgado en el presente documento puede ser un receptor de neurotensina mutante. Por ejemplo, el receptor de neurotensina mutante puede tener al menos un residuo de aminoácido diferente en un motivo estructural en el que el receptor mutante en comparación con su receptor original tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a cualquiera de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se establece en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala<86>, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399.

Los GPCR mutantes divulgados en el presente documento son útiles para estudios de cristalización y son útiles en programas de descubrimiento de fármacos. Pueden usarse en mediciones biofísicas de parámetros cinéticos y termodinámicos del receptor/ligando, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial o técnicas basadas en fluorescencia. Pueden usarse en cribados de unión al ligando y se pueden acoplar a superficies sólidas para su uso en cribados de alto rendimiento o como chips biosensores. Pueden usarse chips biosensores que contienen GPCR mutantes para detectar moléculas, especialmente biomoléculas.

La divulgación también incluye un polinucleótido que codifica para un GPCR mutante divulgado en el presente documento. En particular, se incluyen polinucleótidos que codifican para el receptor p-adrenérgico mutante o los receptores de adenosina mutantes o los receptores de neurotensina mutantes divulgados en el presente documento. El polinucleótido puede ser ADN o puede ser ARN. Normalmente, está comprendido en un vector, tal como un vector que puede usarse para expresar dicho GPCR mutante. Los vectores adecuados son aquellos que se propagan y/o permiten la expresión en células bacterianas, de mamíferos o de insectos.

La divulgación también incluye células huésped, tales como células bacterianas o eucariotas, que contienen un polinucleótido que codifica para el GPCR mutante. Las células adecuadas incluyen células deE. coli,células de levadura, células de mamíferos y células de insectos.

La invención se describirá ahora con más detalle con respecto a las siguientes figuras y ejemplos. En la medida en que las figuras y ejemplos incluyan objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones, el objeto se incluye meramente con fines de referencia.

Figura 1. Cambios de aminoácidos en PAR que conducen a termoestabilidad. El cociente de estabilidad indica el % de actividad de unión restante de los mutantes después de calentar la muestra durante 30 min a 32 °C. Todos los valores están normalizados a PAR<34-424>(50 %, mostrado como una línea discontinua) para eliminar cualquier variabilidad experimental entre ensayos. Las barras muestran la estabilidad de cada mutante. Las letras en el eje x indican el aminoácido presente en el mutante. El aminoácido original y su posición en PAR<34-424>se indica a continuación. Las barras correspondientes al mismo aminoácido en PAR<34-424>son del mismo color con flechas que indican las mejores mutaciones. Los errores se calcularon a partir de mediciones duplicadas; posteriormente se sometieron a ensayo de nuevo los mejores mutantes para determinar la Tm para cada mutación individual y para dar un orden de clasificación de estabilidad preciso para cada mutante (véase el ejemplo 1).

Figura 2. Cadenas laterales en rodopsina que se encuentran en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestables en PAR<34-424>. Los residuos de aminoácidos equivalentes en rodopsina a los residuos de aminoácidos mutados en PAR<34-424>estaban ubicados en la estructura de la rodopsina, basándose en una alineación entre la rodopsina, el receptor adrenérgico p i, el receptor de neurotensina y el receptor de adenosina A<2>a (datos no mostrados). Las cadenas laterales en la misma hélice transmembrana se muestran como modelos de llenado de espacio en el mismo color. El nombre y la posición de los residuos de aminoácidos son los de la rodopsina.

Figura 3. Evolución de la termoestabilidad en PAR. A partir de pAR-m10-8, las combinaciones de mutaciones se reordenaron sistemáticamente para encontrar la combinación óptima de mutaciones (véase también la tabla 2).

Figura 4. Estabilidad de pAR-m23 y PAR<34-424>en el estado apo o que contiene el antagonista unido [3H]-DHA. Para determinar la Tm en ausencia de ligando (estado apo, líneas discontinuas), se incubaron receptores solubilizados en detergente durante 30 minutos a las temperaturas indicadas antes de realizar el ensayo de unión. Para la determinación de la Tm de la forma unida al antagonista (líneas continuas), se preincubaron receptores solubilizados en detergente con [3H]-DHA, seguido de incubación a las temperaturas indicadas. PAR-m23 (círculos) y PAR<34-424>(cuadrados). Los puntos de datos provienen de mediciones duplicadas en un experimento representativo.

Figura 5. Unión competitiva de agonistas a pAR-m23 y PAR<34-424>. Los ensayos de unión se realizaron en receptores parcialmente purificados en DDM; pAR-m23 (triángulos) y PAR<34-424>(cuadrados). Se usó [3H]-DHA en una concentración tres veces mayor que la K<d>de receptor parcialmente purificado (véase Métodos). La unión de [3H]-DHA compitió con concentraciones crecientes de los agonistas, norepinefrina (a) e isoprenalina (b), o con un antagonista, alprenolol (c). Se calcularon logCEso y los valores de CE<50>correspondientes para los diferentes ligandos mediante regresión no lineal usando el software GraphPad Prism y el error para logCE5o fue inferior al 10 %. Las CE<50>para la unión del ligando a PAR<34-424>y pAR-m23 son: norepinefrina, PAR<34-424>1,5 |iM, pAR-m23 3,7 mM; isoprenalina, PAR<34-424>330 nM, pAR-m2320 |iM; alprenolol, PAR 78 nM, pAR-m23112 nM.

Figura 6. Estabilidad de pAR-m23 y PAR<34-424>en cinco detergentes diferentes. Se purificaron parcialmente muestras de PAR<34-424>(a) y pAR-m23 (b) solubilizadas en DDM en columnas de agarosa Ni-NTA permitiendo el intercambio en diversos detergentes diferentes: DDM (cuadrados), DM (triángulos), OG (triángulos invertidos), LDAO (rombos) y NG (círculos). El PAR es tan inestable en OG, NG y LDAO que no fue posible medir ninguna actividad después de la purificación a 6 °C. Los ensayos se llevaron a cabo tal como se describe en los Métodos y la Tm se muestra en la intersección entre las curvas y la línea discontinua. Los resultados provienen de mediciones duplicadas en un experimento representativo realizado en paralelo. (c) Fotomicrografía de un cristal del mutante pAR-m23, que mostró buen orden mediante difracción de rayos X.

Figura 7. Curva de termoestabilidad de PAR<34-424>(Tm). Los ensayos de unión se realizaron usando [3H]-dihidroalprenolol (DHA) como radioligando tal como se describe en “Métodos”. Las muestras se calentaron durante 30 minutos a diferentes temperaturas antes del ensayo. La Tm representa la temperatura a la cual la unión disminuyó al 50 %, valor mostrado como una línea discontinua. Los puntos de datos provienen de duplicados de un solo experimento. Este experimento se ha repetido varias veces con resultados similares.

Figura 8. Ensayos de unión de saturación de membranas de PAR<34-424>y pAR-m23. Los ensayos de unión se realizaron tal como se describe en “Métodos” usando [3H]-dihidroalprenolol (DHA) como radioligando; PAR<34-424>(a) y pAR-m23 (b). Los gráficos de Scatchard se muestran como recuadros junto con los valores correspondientes para Bmáx y kD. Los puntos de datos provienen de duplicados de dos experimentos independientes para cada proteína. Los datos se analizaron mediante regresión no lineal usando el software Prism (GraphPad).

Figura 9. Alineación del receptor p-adrenérgico de pavo con los receptores pi, p2 y p3 humanos.

Figura 10. Alineación de los receptores de adenosina humanos.

Figura 11. Alineación de los receptores de neurotensina.

Figura 12. Diagrama de flujo que muestra los dos formatos de ensayo diferentes de ligando (+) y ligando (-) usados para determinar la termoestabilidad del receptor.

Figura 13. Perfil farmacológico del receptor de adenosina A2a mutante termoestable, Rant21. Unión de saturación de (A) el antagonista y de (B) el agonista a receptores solubilizados. (C-F) Inhibición de la unión de [3H]ZM241385 mediante concentraciones crecientes de antagonistas (C) XAC y (D) teofilina, y agonistas (E) NECA y (F) R-PIA; la unión de [3H]ZM241385 (10 nM) en ausencia de ligando no marcado se ajustó al 100 %. Cada receptor solubilizado se incubó con ligandos durante una hora en hielo en tampón de unión (Tris 50 mM, pH 7,5 y DDM al 0,025 %) que contenía NaCl 400 mM (A, C-F). Los datos mostrados provienen de dos experimentos independientes con cada punto de datos medido por triplicado. Los valores de K<d>y Ki se dan en la tabla (iii).

Figura 14. Los mutantes termoestables muestran una menor dependencia de los lípidos (A) y una mayor supervivencia a una mayor concentración de DDM (B) al calentarse en comparación con el receptor de tipo natural. Los receptores se solubilizaron en DDM al 1 % (diluido en Tris 50 mM, pH 7,5 y NaCl 400 mM) y se inmovilizaron en agarosa Ni-NTA para la etapa IMAC. El intercambio de tampón que contenía la concentración adecuada de DDM y/o lípidos se realizó durante los lavados y la elución de las perlas de Ni-NTA.

Figura 15. Mapeo de las mutaciones en m23 M90V, Y227A, A282L y F338M en el receptor beta1 adrenérgico de pavo en residuos homólogos (M82, Y219, C265 y A321 respectivamente) en la estructura del receptor adrenérgico beta2 humano (Rasmussenet al.(2007) Nature 15;383-387; códigos de registro pdb 2R4R y 2R4S) revela su posición en una interfaz helicoidal y un acodamiento de hélice respectivamente. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p<1>-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio marcados.

Figura 16. Mapeo de mutaciones en m23 en el receptor beta1 adrenérgico de pavo en residuos homólogos en la estructura del receptor beta2 adrenérgico humano (Cherezovet al.(2007) Science, 318:1258-65; código de registro de pdb 2RH1). La traza de Ca del p2AR se muestra con el resto de fusión (lisozima T4) eliminado. Las seis mutaciones en pAR-m23 (R<68>S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) son equivalentes a los residuos de aminoácidos K60, M82, Y219, C265, L310, F321 en el p2AR humano. Lys60 está en el extremo intracelular de la hélice 1 y apunta hacia la interfaz lípido-agua. Met82 está cerca del centro de hélice 2 y apunta hacia el bolsillo de unión a ligandos; la distancia más cercana entre el sustrato carazolol y la cadena lateral de Met es 5,7 A. Tyr219 está hacia el extremo intracelular de la hélice 5 y está en la interfaz hélice 5-hélice<6>. Cys265 está al final de la región del bucle entre las hélices 5 y<6>y apunta en dirección opuesta a las regiones transmembrana. Leu310 y Phe321 están ambos en la hélice 7 y ambos apuntan hacia la bicapa lipídica.

Figura 17. Alineamiento de secuencias múltiples de receptores beta-2AR humano, NTR1 de rata, AR beta-1 de pavo, de adenosina A2aR humano y muscarínico M1 humano. En cada secuencia, las mutaciones termoestabilizadoras están marcadas con un recuadro. Las mutaciones que se producen en dos o más secuencias se indican con una estrella.

Figura 18. Mapeo de la mutación I55A del beta1AR de pavo (I47 del beta2AR humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en la interfaz entre 3 hélices (H1, acodamiento H2, acodamiento H7). Izquierda: vista lateral; derecha: vista superior.

Figura 19. Mapeo de la mutación V89L del beta1AR de pavo (V81 del beta2AR humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en el acodamiento de la hélice 2. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p<1>-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista superior.

Figura 20. Mapeo de la mutación M90V del beta1AR de pavo (M82 del beta2AR humano) en la estructura de beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en un acodamiento de la hélice 2 orientada hacia el bolsillo de unión. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p<1>-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista superior.

Figura 21. Mapeo de la mutación I129V del beta1AR de pavo (I121 del beta2AR humano) en la estructura del beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación se encuentra opuesta a un acodamiento en la hélice 5. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p1-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista inferior.

Figura 22. Mapeo de la mutación F338M del beta1AR de pavo (F321 del beta2AR humano) en la estructura del beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en un acodamiento en la hélice 7. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p1-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista superior.

Figura 23. Mapeo de la mutación Y227A del beta1AR de pavo (Y219 del beta2AR humano) en la estructura del beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en la interfaz hélice-hélice. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p1-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista inferior.

Figura 24. Mapeo de la mutación A282L del beta1AR de pavo (C265 del beta2AR humano) en la estructura del beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en la región de bucle. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p1-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista superior.

Figura 25. Mapeo de la mutación R68S del beta1AR de pavo (K60 del beta2AR humano) en la estructura del beta2AR humano (código de registro de pdb 2RH1). La mutación está en el límite lípido-agua, apuntando hacia el disolvente. Las hélices están numeradas y el antagonista unido se muestra como un modelo de llenado de espacio. Los residuos de aminoácidos en posiciones equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras en el receptor p1-adrenérgico de pavo se muestran como modelos de llenado de espacio y están marcados con flechas para mayor claridad. Izquierda: vista lateral; derecha: vista superior en ángulo.

Figura 26. Comparación de las termoestabilidades de tres receptores p-adrenérgicos (p1 de pavo (■), p1 humano (▼) y p2 humano (•)) y dos receptores termoestabilizados (p1-m23 de pavo (A) y p2-m23 humano (♦)). Las seis mutaciones termoestabilizadoras en p1-m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) se transfirieron directamente al receptor p2 humano (K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M) produciendo p2-m23, basándose en la alineación en la figura 9. Los mutantes resultantes se expresaron transitoriamente en células de mamíferos, se solubilizaron en dodecilmaltósido al 0,1 % y se sometieron a ensayo para determinar su termoestabilidad en el formato de ligando negativo (calentando el estado apo, extinguiendo en hielo, añadiendo 3H-DHA). Las Tm aparentes para pi y p2-m23 de pavo fueron de 23 °C y 45 °C respectivamente, dando una ATm de 22 °C tal como se observó anteriormente en receptor expresado enE. coli.Las Tm para p2 y p2-m23 humanos fueron de 29 °C y 41 °C respectivamente, lo que muestra que el receptor en estado apo se estabilizó a 12 °C. Esto ejemplifica el principio de la transferibilidad de mutaciones termoestabilizadoras de un receptor a otro, que en este caso son idénticas en un 59 %. El receptor pi humano (Tm~12 °C) es mucho menos estable que el receptor p1 de pavo.

Figura 27. Porcentaje de identidad del receptor pi-adrenérgico de pavo, el receptor de adenosina humano y el receptor de neurotensina de rata con respecto a los receptores p-adrenérgicos humanos, los receptores de adenosina humanos y los receptores de neurotensina humanos, respectivamente.

Figura 28. Alineación de los receptores de neurotensina.

Figura 29. Alineamiento de secuencia entre el piAR de pavo y los pAR humanos. Los extremos N-terminal y C-terminal de las secuencias se eliminaron en las alineaciones. Se destacan las mutaciones en la secuencia de pavo que corresponden a las presentes en m23 (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A y F338M), así como aquellas que corresponden con otras mutaciones termoestabilizadoras (véase la leyenda). Los rectángulos debajo de la alineación indican la posición de los dominios transmembrana y la posición de la hélice 8. Los rectángulos abiertos indican residuos conservados en todas las secuencias y residuos conservados en tres de las cuatro secuencias (véase la leyenda).

Figura 30. Ensayos de expresión y unión de piAR de pavo y PAR humanos en células HEK. La unión del ligando se calculó con el radioligando [3H]DHA en una concentración de 80 nM. (a) Unión del ligando de células solubilizadas con DDM al 2 %, (b) Unión del ligando de membranas; (c) Expresión de receptores mutantes beta1AR-m23 humanos en células HEK293 transfectadas transitoriamente medida mediante la unión de radioligando de dihidroalprenolol tritiado. Todos los receptores en esta figura contienen inicialmente los seis mutantes equivalentes a R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A y F338M en beta1AR de pavo. Los niveles de expresión se muestran para receptores individuales con el reemplazo adicional de aminoácidos; (d) las estabilidades de los mutantes beta1AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 68 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C, 42 °C y 47 °C; (e) las estabilidades de los mutantes beta1AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 90 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C, 42 °C y 47 °C; (f) las estabilidades de los mutantes betalAR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 227 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C, 42 °C y 47 °C; (g) expresión de receptores mutantes beta1AR-m23 humanos en células HEK293 transfectadas transitoriamente medida mediante la unión de radioligando de dihidroalprenolol tritiado. Todos los receptores en esta figura contienen inicialmente los seis mutantes equivalentes a R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A y F338M en betalAR de pavo. Los niveles de expresión se muestran para receptores individuales con el reemplazo adicional de aminoácidos; (h) las estabilidades de los mutantes beta1AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 227 o 282 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C, 47 °C y 52 °C; (i) las estabilidades de los mutantes beta1AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 327 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C, 47 °C y 52 °C; (j) las estabilidades de los mutantes beta1AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 338 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C, 47 °C y 52 °C; (k) curvas de termoestabilidad para beta1AR-m23 y m23 humanos con diferentes residuos en la posición 68; (l) expresión de receptores mutantes beta2AR-m23 humanos en células HEK293 transfectadas transitoriamente medida mediante la unión de radioligando de dihidroalprenolol tritiado. Todos los receptores en esta figura contienen inicialmente los seis mutantes equivalentes a r68S, M90V, Y227A, A282L, F327A y F338M en betalAR de pavo. Los niveles de expresión se muestran para receptores individuales con el reemplazo adicional de aminoácidos; (m) las estabilidades de los mutantes beta2AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 68 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C y 41 °C; (n) las estabilidades de los mutantes beta2ARm23 humanos en los que el aminoácido en la posición 90 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C y 41 °C; (o) las estabilidades de los mutantes beta2AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 227 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C y 41 °C; (p) expresión de receptores mutantes beta2AR-m23 humanos en células HEK293 transfectadas transitoriamente medida mediante la unión de radioligando de dihidroalprenolol tritiado. Todos los receptores en esta figura contienen inicialmente los seis mutantes equivalentes a R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A y F338M en betalAR de pavo. Los niveles de expresión se muestran para receptores individuales con el reemplazo adicional de aminoácidos; (q) las estabilidades de los mutantes beta2AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 282 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C y 41 °C; (r) las estabilidades de los mutantes beta2AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 327 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C y 41 °C; (s) las estabilidades de los mutantes beta2AR-m23 humanos en los que el aminoácido en la posición 327 está alterado se indican en el gráfico. Cada mutante se calentó a tres temperaturas diferentes durante 30 minutos y los gráficos de barras muestran el porcentaje de unión restante a 4 °C y 41 °C; (t) curvas de termoestabilidad para beta2AR-m23 humano con diferentes residuos en las posiciones 68 o 282. V, control de vector; B, P1AR de pavo; 1, p1AR-Cdel humano; 2, P2AR humano. Los experimentos se realizaron tal como se explica en los métodos del ejemplo 5. Las copias de receptor/células se calcularon a partir de la radiactividad unida al receptor. Las medidas se tomaron por duplicado.

Figura 31. Efecto de una cantidad creciente de detergente en la actividad de los PAR. (a) P1AR de pavo, (b) p1AR-Cdel humano y (c) p2AR humano. La unión del ligando se calculó con [3H]DHA 80 nM. Las barras representan la actividad, en dpm, del receptor solubilizado con DDM al 0,01 %, al 0,05 %, al 0,1 %, al 0,5 % y al 1 %. Los experimentos se realizaron tal como se explica en los métodos. Las mediciones se tomaron por duplicado.

Figura 32. Estabilidad de piAR de pavo y piAR-Cdel y P2AR humanos con y sin mutaciones estabilizadoras. La Tm se determinó incubando la muestra durante 30 min a diferentes temperaturas antes del ensayo con [3H]DHA 80 nM. Los experimentos se realizaron con muestras solubilizadas en DDM al 0,1 % (líneas X) y al 0,01 % (líneas X). (A) P1AR de pavo, (B) p1AR-Cdel humano, (C) P2AR humano, (D) p1AR-m23 de pavo, (E) P1AR-Cdel-m23 humano y (F) p2AR-m23 humano. Los puntos de datos provienen de mediciones duplicadas.

Figura 33. Alineación de A2A, B1 y NTR con mutaciones estabilizadoras determinadas experimentalmente resaltadas y sombreadas dependiendo de la aparición conjunta entre secuencias.

Figura 34. Alineación de los receptores A2AA humano, B1AR de pavo, NTR de rata y M1 humano, con cierta variación en las regiones de bucle.

Figura 35. Efecto del tamaño de la ventana sobre el enriquecimiento (A) y la cobertura (B).

Figura 36. Cobertura frente a enriquecimiento para todos los receptores para diferentes tamaños de ventana. Figura 37. Parte superior: enriquecimiento frente a cobertura para la identificación de Tm basándose en el método de CI y de cualquier átomo. Parte inferior: enriquecimiento frente a cobertura para la identificación de Tm basándose en el método basado en secuencia.

Figura 38. Estadísticas de cobertura y enriquecimiento basadas en secuencia y estructura. Los puntos de datos derivados de la estructura están encerrados dentro de la línea oscura, mientras que las estadísticas derivadas de la secuencia están encerradas dentro de la línea clara.

Figura 39. (A) Agrupamiento 1. Agrupamiento que se mapeó a TM3/5/6 de NTR (rojo), TM3/5 de B1 (verde) y TM6 de A2AA (azul). (B) Agrupamiento 2. Agrupamiento que se mapeó a la parte inferior de TM5 NTR (rojo), B1 (verde) y A2AA (azul). (C) Agrupamiento 3. Agrupamiento que se mapeó a la parte inferior de TM6 A2AA (azul) y NTR (rojo). (D) Agrupamiento 4. Agrupamiento que se mapeó a TM1/2 y 7 de B1 (verde) y TM7 de NTR (rojo). (E) Agrupamiento 5. Agrupamiento que se mapeó a TM5 de B1 (verde), NTR (rojo) y A2AA (azul). (F) Agrupamiento 6. Agrupamiento 6 se mapeó a TM5 de B1 (verde), NTR (rojo) y A2AA (azul). (G) Agrupamiento 7. Agrupamiento que se mapeó a TM6 de NTR (rojo) y A2AA (azul). (H) Agrupamiento 8. Agrupamiento 8 se mapeó a TM6 de NTR (rojo) y A2AA (azul). (I) Agrupamiento 9. Agrupamiento 9 se mapeó a TM1 y 7 de B1 (verde) y TM7 de NTR (rojo). (J) Agrupamiento 10. Agrupamiento 10 se mapeó a TM5 de NTR (rojo) y B1 (verde). (K) Agrupamiento 11. Agrupamiento 11 se mapeó a TM5 de NTR (rojo), B1 (verde) y A2AA (azul). (L) Agrupamiento 12. Agrupamiento 12 se mapeó a TM4 de B1 (verde), A2AA (azul) y M1 (magenta). (M) Agrupamiento 13. Agrupamiento 13 se mapeó a TM5 de B1 (verde), A2AA (azul) y NTR (rojo).

Figura 40. Muestra una superposición de todos los agrupamientos en un radio de 6A.

Figura 41. Un agrupamiento propuesto de agrupamientos de radio de 15 A que cubre todos los agrupamientos estadísticamente significativos identificados.

Ejemplo 1: Estabilización conformacional del receptor P-adrenérgico en forma resistente a los detergentesResumen

Hay más de 500 receptores acoplados a proteína G (GPCR) no odorantes codificados por el genoma humano, muchos de los cuales se prevé que son posibles dianas terapéuticas, pero sólo hay una estructura disponible, la de la rodopsina bovina, para representar la totalidad de la familia. Hay muchos motivos para la falta de progreso en la determinación de la estructura de GPCR, pero se plantea la hipótesis de que mejorar la estabilidad frente a los detergentes de estos receptores y simultáneamente bloquearlos en una conformación preferida mejorará en gran medida las posibilidades de cristalización. Se desarrolló una estrategia genérica para el aislamiento de mutantes termoestables solubilizados en detergente de un GPCR, el receptor P-adrenérgico, basada en mutagénesis de exploración de alanina seguida de un ensayo de estabilidad del receptor. De los 318 mutantes sometidos a prueba, 15 mostraron un aumento medible en la estabilidad. Después de la optimización del residuo de aminoácido en el sitio de cada mutación inicial, se construyó un receptor óptimamente estable combinando mutaciones específicas. El receptor mutante más estable, PAR-m23, contenía 6 mutaciones puntuales que condujeron a una Tm de 21 °C superior a la de la proteína nativa y, en presencia del antagonista unido, PAR-m23 era tan estable como la rodopsina bovina. Además, PAR-m23 fue significativamente más estable en una amplia gama de detergentes ideales para la cristalización y estaba preferentemente en una conformación antagonista en ausencia de ligando.

Resultados

Selección de mutaciones individuales que aumentan la termoestabilidad del receptorB1-adrenéraico

ElPAR de eritrocitos de pavo es una diana ideal para estudios estructurales porque está bien caracterizado y se expresa a niveles elevados en células de insectos usando el sistema de expresión de baculovirus [10,11]. La mejor sobreexpresión dePAR se obtiene usando una versión truncada del receptor que contiene los residuos 34-424 (PAR<34>-<424>) [9] y éste se usó como punto de partida para este trabajo. Se usó mutagénesis de exploración de alanina para definir los residuos amino enPAR<34-424>que, al mutar, alteraba la termoestabilidad del receptor; si había una alanina presente en la secuencia, se mutaba a un residuo de leucina. Se realizaron un total de 318 mutaciones en los residuos de aminoácidos 37-369, una región que abarca los siete dominios transmembrana y 23 residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal; no se obtuvieron mutaciones en 15 residuos amino debido a la fuerte estructura secundaria en el molde de ADN. Después de secuenciar cada mutante para garantizar la presencia de la mutación deseada únicamente, los receptores se expresaron funcionalmente enE. coliy se sometieron a ensayo para determinar su estabilidad.

El ensayo de termoestabilidad se realizó en receptores solubilizados en detergente no purificados calentando los receptores a 32 °C durante 30 minutos, extinguiendo la reacción en hielo y luego realizando un ensayo de unión de radioligando, usando el antagonista [3H]-dihidroalprenolol, para determinar el número de moléculas dePAR<34-424>funcionales restantes en comparación con el control sin calentar. Calentar elPAR<34-424>sin mutar a 32 °C durante 30 min antes del ensayo redujo la unión hasta aproximadamente el 50 % del control sin calentar (figura 7); todos los datos de los mutantes se normalizaron incluyendo elPAR<34-424>sin mutar como control en cada ensayo realizado. En la primera ronda de selección, dieciocho mutantes mostraron un aumento aparente en la estabilidad, manteniendo más del 75 % de la unión del antagonista después del calentamiento y expresándose enE. colia al menos el 50 % de los niveles dePAR<34-424>nativo. En vista de la posibilidad de aumentar aún más la estabilidad de estos mutantes, cada uno de los 18 residuos se mutó en 2-5 residuos de aminoácidos alternativos de tamaño o carga variable (figura 1). De estos 18 mutantes, 12 no mejoraron con cambios adicionales, 5 tenían mejor termoestabilidad si estaba presente otro aminoácido y una mutación de la primera selección resultó ser un falso positivo. Además, tres residuos que no se estabilizaron tras la mutación a alanina (V89, S151, L221) se mutaron a una gama de otros residuos de aminoácidos; las dos posiciones que, cuando mutaron a alanina, no afectaron a la termoestabilidad tampoco se vieron afectadas por otros cambios. En cambio, V89 mostró menos termoestabilidad cuando mutó a alanina, pero la termoestabilidad aumentó cuando mutó a Leu. Por tanto, la exploración de alanina inicial proporcionó con éxito dos tercios de los mejores residuos de aminoácidos de los sometidos a prueba para cualquier posición dada.

La posición y el entorno predichos para cada uno de los 16 residuos amino que proporcionaron los mejores aumentos en la termoestabilidad cuando mutaron se determinaron alineando la secuencia dePAR con la de rodopsina, cuya estructura se conoce (figura 2). Se predijo que catorce de estos residuos estarían presentes en hélicesatransmembrana, prediciéndose que cinco de los residuos estarían orientados hacia los lípidos y prediciéndose que 4 estarían profundamente enterrados y el resto estarían en las superficies de contacto entre las hélices. Se esperaría que algunos de estos residuos interactuarían entre sí en la estructura dePAR, tales como los aminoácidos consecutivos G67 y R68 (V63 y Q64 en rodopsina) o los aminoácidos dentro del agrupamiento Y227, R229, V230 y A234 en la hélice 5 (<y>223, Q225, L226 y V230 en rodopsina). Otros residuos de aminoácidos que podrían interactuar enPAR eran Q194A en el bucle externo 2 y D322A en el bucle externo 3 (G182 y P285 en rodopsina, respectivamente).

El aumento en la estabilidad que proporcionó cada mutación individual aPAR<34-424>se determinó midiendo la Tm para cada mutante (resultados no mostrados); Tm en este contexto es la temperatura que proporcionó una disminución del 50 % en la unión funcional después de calentar el receptor durante 30 minutos. Cada mutación aumentó la Tm dePAR<34-424>en 1-3 °C, con la excepción de M90A e Y227A que aumentaron la Tm en 8 °C.

Combinación de mutaciones para preparar un receptor óptimamente estable

Inicialmente, se combinaron mutaciones que mejoraban la termoestabilidad y que estaban adyacentes entre sí en la secuencia de aminoácidos primaria dePAR. Se expresaron y sometieron a ensayo construcciones que contenían las mutaciones G67A y R68S, o diferentes combinaciones de las mutaciones en el extremo de la hélice 5 (Y227A, R229Q, V230A y A234L); los valores de Tm (resultados no mostrados) fueron sólo 1-3 °C más altos que la Tm paraPAR<34-424>y un mutante era en realidad ligeramente menos estable, lo que sugiere que la combinación de mutaciones adyacentes entre sí en la secuencia de aminoácidos primaria no mejora la termoestabilidad en gran medida. Posteriormente, se combinaron las mutaciones que se predijo que estaban distantes entre sí en la estructura. Las reacciones PCR se realizaron usando diversas mezclas de cebadores para combinar hasta 5 mutaciones diferentes de manera aleatoria y luego se sometió a prueba la termoestabilidad (tabla 1). La mejor de estas combinaciones aumentó la Tm más de 10 °C en comparación con la Tm dePAR<34>-<424>. En algunos casos, hubo un claro efecto aditivo sobre la Tm con la incorporación secuencial de mutaciones individuales. Esto se observa en una serie de 3 mutantes, m4-1, m4-7 y m4-2, aumentándose la Tm en 2 °C con la adición de V230A a m4-1 y aumentándose la Tm 3 °C adicionales con la mutación adicional D332A en m4-7. Todos los mutantes que contenían Y227A y M90A mostraron un aumento en la Tm de 10 °C o más. Sólo estas dos mutaciones juntas aumentaron la Tm dePAR<34-424>en 13 °C (m7-5); sin embargo, la unión total del antagonista fue menor del 50%de PAR<34>-<424>, lo que sugiere una expresión alterada de este mutante. La adición de F338M a m7-5 no aumentó la termoestabilidad, pero aumentó los niveles de expresión funcional enE. coli.

Tabla 1. Combinaciones de mutaciones por PCR. Se realizaron 10 reacciones PCR combinando diferentes pares de cebadores que contenían las mutaciones seleccionadas. Las reacciones PCR con éxito se muestran en la tabla. La estabilidad de estos nuevos mutantes se sometió a ensayo tal como se describe en la figura 7 y se calculó la Tm. Los resultados se muestran como media ± E.E. de duplicados.

Los mutantes más termoestables obtenidos, que todavía se expresaban a niveles elevados enE. coli,fueron m6-10, m7-7 y m10-8. Estos mutantes contenían colectivamente un total de 10 mutaciones diferentes, produciéndose 8 mutaciones en al menos dos de los mutantes. Se realizó una segunda ronda de mutagénesis usando m10-8 como molde y añadiendo o reemplazando mutaciones presentes en m6-10 y m7-7 (figura 3); algunas de estas mutaciones estaban muy cerca en la secuencia de aminoácidos primaria de PAR y, por tanto, no eran aditivas tal como se indicó anteriormente, pero muchas mutaciones mejoraron adicionalmente la Tm (tabla 2). Por ejemplo, intercambiar dos mutaciones en m10-8, para crear m18, aumentó la Tm hasta 49,6 °C y añadir A282L para preparar m23 aumentó la Tm 3 °C adicionales hasta 52,8 °C. Esto produjo el mutante de PA<34-424>más termoestable hasta ahora y se denominará pAR-m23.

Tabla 2. Mejora de la mejor combinación de mutaciones. Estos nuevos mutantes se obtuvieron mezclando los cambios presentes en los mutantes m6-10, m7-7 y m10-8 por PCR. La estabilidad de estos nuevos mutantes se sometió a ensayo tal como se describe en la figura 7 y se calculó la Tm. Los resultados se muestran como media ± E.E. de duplicados.

Los ensayos de termoestabilidad usados para desarrollar los mutantes de PAR<34-424>se realizaron calentando el receptor en ausencia del antagonista, pero se sabe bien que el ligando unido estabiliza los receptores. Por tanto, los ensayos de estabilidad para PAR<34-424>y pAR-m23 se repitieron con el antagonista unido a los receptores durante la etapa de calentamiento (figura 4). Tal como se esperaba, la Tm del receptor que contenía el antagonista unido durante la incubación fue mayor que la del receptor sin antagonista. Para PAR<34>-<424>, la Tm fue 6 °C mayor con el antagonista unido, y para pAR-m23, la Tm aumentó 2 °C hasta 55 °C; el menor aumento en la termoestabilidad observado para pAR-m23 cuando se une el antagonista sugiere que el receptor ya se encuentra en una conformación similar al estado unido al antagonista más estable que PAR<34-424>(véase también a continuación). La Tm de pAR-m23 con antagonista unido es muy similar a la Tm de la rodopsina en estado oscuro en dodecilmaltósido (DDM) [12], cuya estructura se ha resuelto por dos laboratorios independientes [13,14]. Esto sugirió que pAR-m23 es suficientemente estable para la cristalización.

Caracterización de PAR-m23

Las tres actividades características medidas para pAR-m23 y PAR<34-424>para identificar el efecto de las seis mutaciones fueron la afinidad de la unión del antagonista, las eficacias relativas de la unión del agonista y la capacidad de pAR-m23 para acoplarse a proteínas G. Experimentos de unión por saturación a membranas usando el antagonista [3H]-dihidroalprenolol (figura 8) mostró que la afinidad de unión a pAR-m23 (Kd 6,5 ± 0,2 nM, n=2) fue ligeramente menor que para pAR34-424 (K<d>2,8 ± 0,1 nM, n=2), lo que sugiere que no hay grandes perturbaciones en la estructura de pAR-m23 en la conformación unida al antagonista. Esto es compatible con la observación de que ninguna de las mutaciones en pAR-m23 se corresponde con los aminoácidos que se cree que están implicados en la unión del ligando. A diferencia de la unión del antagonista, la eficacia de la unión del agonista por pAR-m23 es 3 órdenes de magnitud más débil que para pAR34-424 (figura 5). La potencia del agonista isoprenalina es sistemáticamente menor en pAR-m23 y pAR34-424 que para el agonista nativo norepinefrina, lo que indica que es probable que la conformación unida al agonista de los dos receptores sea similar. Sin embargo, la gran disminución en la eficacia agonista en pAR-m23 en comparación con pAR34-424 indica que las 6 mutaciones en pAR-m23 han bloqueado el receptor preferentemente en una conformación unida al antagonista. Desde la perspectiva de la cristalización, esto es una ventaja adicional para la termoestabilización, porque es esencial disponer de una población de proteínas conformacionalmente homogénea para la producción de cristales con calidad de difracción.

Todos los ensayos de termoestabilidad usados para derivar pAR-m23 se realizaron en receptores solubilizados en DDM. El objetivo del procedimiento de termoestabilización era producir un receptor que sea ideal para la cristalografía, lo que significa que sea estable en una variedad de detergentes diferentes y no sólo en DDM. Por tanto, se sometió a prueba la estabilidad de pAR-m23 y pAR en una variedad de detergentes diferentes, concentrándose en detergentes pequeños que se usan preferentemente para cristalizar proteínas de membrana integrales.

Se solubilizaron en DDM membranas preparadas a partir deE. colique expresan pAR-m23 o pAR34-424, se unieron a Ni-NTA agarosa y luego se lavaron con DDM, decilmaltósido (DM), octilglucósido (OG), óxido de laurildimetilamina (LDAO) o nonilglucósido (NG). Se realizaron ensayos de estabilidad sobre los receptores de cada uno de los diferentes detergentes (figura 6). pAR34-424 sólo fue estable en DDM y DM, sin receptores activos eluyendo de la resina lavada con OG, NG o LDAO. En cambio, pAR-m23 funcional todavía estaba presente en todos los detergentes y pudo determinarse la Tm. Tal como se esperaba, los detergentes más pequeños fueron considerablemente más desnaturalizantes que DDM (Tm de 52 °C) o DM (Tm de 48 °C), con Tm de 25 °C (NG), 23 °C (LDAO) y 17 °C (OG). La diferencia en la Tm entre pAR-m23 y pAR34-424 es de aproximadamente 20 °C, independientemente de si los receptores se solubilizaron en DDM o DM; por tanto, no es sorprendente que no pueda encontrarse pAR34-424 activo ni siquiera en NG porque la Tm prevista sería de aproximadamente 5 °C, dando así como resultado una rápida inactivación del receptor en las condiciones usadas para la purificación. La estrategia de selección usada para la generación de pAR-m23 se eligió deliberadamente para basarse en la termoestabilidad, porque es mucho más sencilla de aplicar que seleccionar la estabilidad en detergentes de fuerza creciente. Sin embargo, está claro que aumentar la termoestabilidad de pAR34-424 también dio como resultado una tolerancia creciente a detergentes pequeños ideales para cristalizar proteínas de membrana integrales.

Cristalización de GPCR mutante

Los intentos anteriores de cristalizar varios constructos diferentes del receptor beta-adrenérgico de pavo fracasaron. Durante muchos años, a pesar de experimentar con una variedad de condiciones, usando tanto la secuencia nativa como varios constructos truncados y con bucles delecionados, no se obtuvieron cristales.

Sin embargo, una vez que las mutaciones estabilizadoras de pAR-m23 se transfirieron a los constructos, se obtuvieron varios cristales diferentes en diferentes detergentes y diferentes condiciones.

Los cristales más estudiados hasta ahora se obtuvieron usando el constructo beta-36 purificado (residuos de aminoácidos 34-367 del receptor beta de pavo que contienen los siguientes cambios: mutaciones puntuales C116L y C358A; las 6 mutaciones puntuales termoestabilizadoras en m23; reemplazo de los residuos de aminoácidos 244-278 por la secuencia ASKRK; una etiqueta His6 C-terminal) expresado en células de insectos usando el sistema de expresión de baculovirus, después de transferir el receptor al detergente octil-tioglucósido.

El precipitante usado fue PEG600 o PEG1000 y los cristales obtenidos son placas alargadas.

También se han llevado a cabo experimentos para comprobar si, una vez definidas las condiciones de cristalización usando el receptor estabilizado, era posible obtener cristales usando el constructo no estabilizado original. Era posible que se hubieran obtenido cristales similares o quizás muy pequeños, pero, de hecho, el “tipo natural” (es decir, la estructura inicial a partir de la cual comenzó la mutagénesis) nunca proporcionó ningún cristal.

Los cristales tienen forma de placa con el grupo espacial C2 y difractan bien, aunque las dimensiones de celda varían según las condiciones de congelación usadas.

En general, una vez estabilizado un GPCR, puede someterse a una variedad de técnicas bien conocidas para la determinación de la estructura. La técnica más común para cristalizar proteínas de membrana es mediante difusión en fase de vapor (20, 21), habitualmente usando inicialmente unos miles de condiciones de cristalización establecidas mediante dispositivos robóticos comerciales (22). Sin embargo, a veces los cristales formados por difusión en fase de vapor son pequeños y desordenados, por lo que pueden emplearse entonces técnicas adicionales. Una técnica implica la cocristalización (por difusión en fase de vapor) de la proteína de membrana con anticuerpos que se unen específicamente a epítopos conformacionales sobre la superficie de las proteínas (23, 24); esto aumenta la superficie hidrófila de la proteína y puede formar fuertes contactos cristalinos. Una segunda alternativa es usar una matriz de cristalización diferente que comúnmente se denomina fase cúbica lipídica o mesofase lipídica (25, 26), que también se ha desarrollado en una plataforma robótica (27). Esto ha demostrado ser muy exitoso para producir cristales de proteínas de alta calidad con sólo pequeñas superficies hidrófilas, por ejemplo, bacteriorrodopsina (28). Las estructuras de las proteínas de membrana también pueden determinarse con alta resolución mediante cristalografía electrónica (29).

La evolución de pAR-m23 a partir de PAR<34-424>mediante una combinación de mutagénesis de exploración de alanina y la selección de mutantes termoestables ha dado como resultado un GPCR ideal para cristalografía. La Tm para pAR-m23 es 21 °C mayor que para PAR<34-424>y, en presencia de antagonista, pAR-m23 tiene una estabilidad similar a la rodopsina. La Tm aumentada de pAR-m23 ha dado como resultado una estabilidad aumentada en una variedad de detergentes pequeños que inactivan PAR<34>-<424>. Además, la estrategia de selección empleada dio como resultado un receptor que está preferentemente en la conformación unida al antagonista, lo que también mejorará las posibilidades de obtener cristales, porque la población de conformaciones de receptores será más homogénea que para PAR<34-424>de tipo natural. Por tanto, se ha conseguido un procedimiento de estabilización conformacional en un único procedimiento de selección.

No está del todo claro por qué las mutaciones particulares que se han introducido conducen a la termoestabilización del receptor. Las posiciones equivalentes en la rodopsina sugieren que los residuos de aminoácidos mutados podrían apuntar a la bicapa lipídica, al centro del receptor o a las superficies de contacto entre estos dos entornos. Dadas las dificultades para tratar de comprender las complejidades de la termoestabilización de proteínas solubles [15], parece poco probable que las proteínas de membrana sean más fáciles de comprender; se descubrió que no había ningún patrón particular en los residuos de aminoácidos en PAR que, cuando mutaban, condujeran a la termoestabilidad. Sin embargo, dado que casi el 5 % de los mutantes producidos eran más estables que el receptor nativo, la mutagénesis de exploración de alanina representa una estrategia eficiente para identificar rápidamente mutantes termoestables.

El procedimiento que se ha usado para generar pAR-m23 es igualmente aplicable a cualquier proteína de membrana que tenga un ensayo conveniente para detectar actividad en la forma solubilizada en detergente. Si bien se ha seleccionado la estabilidad en función de la temperatura como el parámetro primario más conveniente, el procedimiento puede extenderse fácilmente para someter a prueba principalmente la estabilidad, por ejemplo, en un detergente fuerte, un pH extremo o en presencia de sales caotrópicas. La estabilización conformacional de una variedad de receptores, canales y transportadores humanos los hará mucho más susceptibles a la cristalografía y también permitirá mejorar la resolución de las proteínas de membrana que ya han sido cristalizadas. Es de esperar que la estabilización conformacional permita que la cristalización de proteínas de membrana se convierta en un problema mucho más tratable con una mayor probabilidad de éxito rápido de lo que es actualmente. Esto debería permitir la cristalización rutinaria de proteínas de membrana humanas en la industria farmacéutica, dando como resultado una valiosa información estructural para el desarrollo de fármacos.

Métodos

Materiales. El receptor pi-adrenérgico truncado de pavo (PAR<34>-<424>) [9] fue amablemente proporcionado por el Dr. Tony Warne (Laboratorio de Biología Molecular del MRC, Cambridge, Reino Unido). Este constructo de PAR que codifica para los residuos 34-424 contiene la mutación C116L para mejorar la expresión [11] y una etiqueta C-terminal de 10 histidinas para la purificación. 1-[4,6-propil-3H]-dihidroalprenolol ([3H]-DHA) fue suministrado por Amersham Bioscience, la sal de bitartrato de (+)-L-norepinefrina, el clorhidrato de (-)-isoprenalina, la sal de tartrato de (-)-alprenolol y el clorhidrato de s-propranolol fueron de Sigma.

Mutagénesis de BAR. El ADNc de PAR se ligó en pRGIlI para permitir la expresión funcional de PAR enE. colicomo una proteína de fusión MalE [16]. Los mutantes se generaron mediante PCR usando el plásmido de expresión como molde usando la metodología QuikChange II (Stratagene). Las reacciones PCR se transformaron en células ultracompetentes XL10-Gold (Stratagene) y los clones individuales se secuenciaron completamente para comprobar que sólo estaba presente la mutación deseada. Se combinaron diferentes mutaciones aleatoriamente mediante PCR incluyendo todos los pares de cebadores que introdujeron las siguientes mutaciones: Mut4, G67A, G068A, V230A, D322A y F327A; Mut6, R068S, Y227A, A234L, A282L y A334L; Mut7, M90V, I129V, Y227A, A282L y F338M; Mut10, R68S, M90V, V230A, F327A y A334L. Se transformaron las mezclas de PCR y se secuenciaron los clones para determinar exactamente qué mutaciones se introdujeron.

Expresión de proteínas y preparaciones de membranas. La expresión de PAR y de los mutantes se realizó en células XL10 (Stratagene). Se hicieron crecer cultivos de 50 ml de medio 2xTY que contenía ampicilina (100 |ig/ml) a 37 °C con agitación hasta una DO6oo=3 y luego se indujo con IPTG 0,4 mM. Los cultivos inducidos se incubaron a 25 °C durante 4 h y luego se recogieron las células mediante centrifugación a 13.000 xg durante 1 min (alícuotas de 2 ml) y se almacenaron a -20 °C. Para los ensayos, las células se rompieron mediante congelación-descongelación (cinco ciclos), se resuspendieron en 500 |il de tampón [Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM e inhibidores de proteasas (Complete™, Roche)]. Después de una incubación durante 1 h a 4 °C con 100 |ig/ml de lisozima y ADNasa I (Sigma), las muestras se solubilizaron con DDM al 2 % en hielo durante 30 minutos. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación (15.000 xg, 2 min, 4 °C) y el sobrenadante se usó directamente en ensayos de unión de radioligando.

Para preparaciones de membranas a gran escala, se hicieron crecer 2 l y 6 l de cultivos deE. colide PAR y Mut23, respectivamente, tal como se describió anteriormente. Las células se recogieron mediante centrifugación a 5.000 xg durante 20 min, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de Tris 20 mM pH 7,5 que contenía 1x cóctel de inhibidores de proteasas (Complete™ libre de EDTA, Roche); se añadió 1 mg de ADNasa I (Sigma) y se llevó el volumen final a 100 ml. Las células se rompieron mediante una prensa francesa (2 pases, 20.000 psi) y se centrifugaron a 12.000 xg durante 45 min a 4 °C para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante (membranas) se centrifugó a 200.000 xg durante 30 min a 4 °C; el sedimento de membrana se resuspendió en 15 ml de Tris 20 mM pH 7,5 y se almacenó en alícuotas de 1 ml a -80 °C después de la ultracongelación en nitrógeno líquido. La concentración de proteína se determinó mediante el método de negro de amido [17]. Estas muestras se usaron en ensayos de unión de radioligando después de descongelarlas y solubilizarlas en DDM al 2 % tal como anteriormente.

Para los ensayos de competencia, además de someter a prueba diferentes detergentes, el PAR solubilizado en DDM se purificó parcialmente con Ni-NTA agarosa (Qiagen). Se añadieron 200 |il de Ni-NTA agarosa a 2 ml de muestras solubilizadas (10 mg/ml de proteína de membrana) en Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, imidazol 20 mM pH 8 y se incubaron durante 1 h a 4 °C. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 13.000 xg durante 30 s y se lavaron dos veces con 250 |il de tampón (Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, imidazol 20 mM) que contenía detergente (DDM al 0,1 %, DM al 0,1 %, LDAO al 0,1 %, NG al 0,3 % u OG al 0,7 %).

Los receptores se eluyeron en 2 x 100 |il de tampón (NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, imidazol 250 mM pH 8, más el detergente relevante). La K<d>para la unión de [3H]-DHA a PAR<34-424>y BAR-m23 semipurificados fue de 3,7 nM y 12,5 nM, respectivamente, y la concentración final de [3H]-DHA usada en los ensayos de competencia fue 3 veces la Kd, es decir, 12 nM para PAR<34-424>y 40 nM para pAR-m23.

Ensayos de termoestabilidad y de unión de radioligando. Los ensayos de unión en un único punto contenían Tris 20 mM pH 8, NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, DDM al 0,1 % (o el detergente correspondiente) con [3H]-DHA 50 nM y 20-100 |ig de proteína de membrana en un volumen final de 120 |il; el equilibrado fue durante 1 h a 4 °C. La termoestabilidad se evaluó incubando la mezcla de ensayo de unión, con o sin [3H]-DHA, a la temperatura especificada durante 30 minutos; las reacciones se colocaron en hielo y se añadió [3H]-DHA según fuera necesario y se equilibró durante una hora adicional. Los radioligandos libres y unidos al receptor se separaron mediante filtración en gel tal como se describió previamente [18]. La unión no específica se determinó en presencia de 1 |iM de s-propranolol. Las curvas de saturación se obtuvieron usando un intervalo de concentración de [3H]-DHA de desde 0,4 nM hasta 100 nM. Los ensayos de competencia se realizaron usando una concentración de [3H]-DHA de 12 nM para PAR<34-424>y de 40 nM para pAR-m23 (es decir, tres veces la K<d>) y diversas concentraciones de ligandos no marcados (0-100 mM). La radiactividad se contó en un contador de centelleo líquido Beckman LS6000 y los datos se analizaron mediante regresión no lineal usando el software Prism (GraphPad).

Ubicación de mutaciones termoestables de BAR-m23 en la estructura de rodopsina. El archivo pdb para la estructura de rodopsina, código de registro 1GZM [14], se descargó del sitio web del Banco de Datos de Proteínas (www.pdb.org) y se mostró en el programa PyMOLX11Hybrid (DeLano Scientific). Los residuos de aminoácidos equivalentes en la rodopsina para las mutaciones termoestables en PAR se ubicaron en la estructura de rodopsina basándose en una alineación entre los cuatro GPCR con los que se está más familiarizados, concretamente rodopsina, receptor p1-adrenérgico, receptor de neurotensina y receptor de adenosina A<2>a [19].

Ejemplo 2: Mutantes del receptor de adenosina A<2>a (A<2>aR) con termoestabilidad aumentada

1. Se han preparado 315 mutantes dirigidos al sitio entre los residuos 2-316 de A<2>aR.

2. Se ha sometido a ensayo la termoestabilidad de todos estos mutantes usando un ensayo que mide la unión de agonistas y antagonistas después de la etapa de calentamiento (formato de ligando (-) tal como se describe en la figura 12).

a. 26 mutantes mostraron una termoestabilidad mejorada cuando se midieron con 3H-NECA (agonista):

G114A, G118A, L167A, A184L, R199A, A203L, L208A, Q210A, S213A, E219A, R220A, S223A, T224A,

Q226A, K227A, H230A, L241A, P260A, S263A, L267A, L272A, T279A, N284A, Q311A, P313A, K315A.

b. 18 mutantes mostraron una termoestabilidad mejorada cuando se sometieron a ensayo con 3H-ZM241385 (antagonista): A54L, V57A, H75A, T88A, G114A, G118A, T119A, K122A, G123A, P149A, E151A, G152A, A203L, A204L, A231L, L235A, V239A.

3. Las mutaciones se han combinado para generar mutantes en una supuesta conformación antagonista. A<2>aR de tipo natural tiene una Tm de 31 °C con ZM241385 unido.

a. Rant17 A54L+K122A+L235A Tm de 48 °C (con ZM241385 unido)

b. Rant19 A54L,T88A,V239A+A204L Tm de 47 °C (con ZM241385 unido)

C. Rant21 A54L,T88A,V239A+K122A Tm de 49 °C (con ZM241385 unido)

4. Se han combinado mutaciones de la selección de agonistas, pero sólo han conducido a un nivel muy bajo de mejora en la Tm de 2 °C.

Tabla (i). Lista de mutaciones estabilizadoras de A2aR. Los mutantes se expresaron enE. coli,se solubilizaron en DDM al 2 % glicerol al 10 % y se sometieron a prueba para determinar la unión del ligando, usando el agonista [3H]-NECA (derecha) y el antagonista [3H]-ZM241385 (izquierda). Las concentraciones de radioligandos fueron de 6-10 veces superiores a su K<d>medida para el receptor de tipo natural. La expresión del receptor activo se evaluó mediante la unión del ligando a 4 °C. La estabilidad se sometió a ensayo calentando el receptor solubilizado en su estado apo a 30 °C durante 30 minutos y luego midiendo la actividad de unión residual. En estas condiciones, la actividad de tipo natural disminuye al 50 % (D.E.=15 %). Los datos obtenidos para la expresión y la estabilidad se normalizaron con respecto a valores de tipo natural. Las mutaciones incluidas en rondas posteriores de mutagénesis fueron aquellas cuya expresión fue > 30-40 % y estabilidad > 130-140 % en comparación con el tipo natural. Las líneas en negrita indican un agrupamiento de mutaciones.

Agonista Antagonista

Mutación Expresión (%) Estabilidad (%) Mutación Expresión (%) Estabilidad (%) wt 100 100 wt 100 100

S090A 151 151 A054L 90 140

G114A 62 143 V057A 44 144

G118A 71 151 H075A 82 152

L167A 41 174 T088A 67 230

A184L 140 150 73 153

R199A 73 202 84 148

A203L 42 172 90 148

L208A 276 215 52 153

Q210A 46 155 90 158

S213A 40 140 54 215

E219A 96 221 63 173

R220A 84 250 70 156

S223A 57 146 111 132

T224A 142 276 40 181

Q226A 119 217 90 148

K227A 87 222 85 140

H230A 57 154 91 134

L241A 139 156

P260A 70 169

S263A 60 158

L267A 40 187

L272A 34 157

T279A 125 158

N284A 64 151

Q311A 49 164

P313A 44 148

K315A 64 186

Tabla (ii). Estabilidad de las mejores combinaciones. Los receptores se solubilizaron en DDM al 1%(sin glicerol). Se obtuvo un perfil de fusión calentando el receptor solubilizado a diferentes temperaturas en ausencia (estado apo) o presencia de ligando (estado ocupado por ligando). Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La D.E. es < 1 °C.

Tm (°C) Tm (°C)

- agonista agonista - antagonista antagonista wt 21 29 wt 31 32 (A184L/R199A/L272A) 26 34 (A54L/T88A/V239A) 42 46 Rag 23 (Rag 1+F79A/L208A) 22 38 Rant 21 (Rant 5+K122A) 41 49

Tabla (iii). Resumen de resultados de los ensayos de competencia de A<2>aR de tipo natural solubilizado en detergente y del mutante termoestable Rant 21. Los valores son representativos de dos experimentos independientes. Cada punto de datos se sometió a ensayo por triplicado y se representó gráficamente como media ± DE. Cada receptor solubilizado se incubó con ligandos durante una hora en hielo en tampón de unión (Tris 50 mM pH 7,5 y D<d>M al 0,025 %) que contenía NaCl 400 mM. La unión de [3H]-ZM241385 (10 nM) en ausencia de ligando no marcado se ajustó al 100 %. Los datos mostrados provienen de dos experimentos independientes en los que cada punto de datos se midió por triplicado. La incubación de muestras con ligandos se realizó durante 1 hora en hielo con [3H]-ZM241385 a una concentración de 10 nM. Los valores de Ki se calcularon según la ecuación de Cheng y Prusoff usando la ecuación de regresión no lineal del software Prism, aplicando una K<d>para [3H]-ZM241385 de 12 nM para el tipo natural y de 15 nM para Rant 21. Rant 21 no se unió a NECA lo suficiente para una determinación de Ki precisa (por tanto, se indica como > 1 * 10-1). La afinidad de Rant21 por la unión del agonista se debilita 232 veces para R-PIA y al menos 1900 veces para NECA.

Ki (M)

Competidor

wt Rant 21

XAC 2,3 * 10-6 2,3 * 10-6

Teofilina 1,5 * 10-3 0,9 * 10-3

NECA 7,0 * 10-6 > 1 * 10-1

R-PIA 1,6 * 10-5 3,6 * 10-3

Tabla (iv). Resumen de resultados de los ensayos de saturación de A<2>aR de tipo natural solubilizado en detergente y de mutantes termoestables. Los valores son representativos de tres experimentos independientes. Cada punto de datos se sometió a ensayo por triplicado y se representó gráficamente como media ± DE. Los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten usando la ecuación de regresión no lineal del software Prism.

K<d>(nM)

Receptor --------------------------------------------------------------------------------------------------

[3H]-NECA (agonista) [3H]-ZM241385 (antagonista)

wt 32 ± 1 12 ± 3

Rag 1 26 ± 0,4 26 ± 0,5

Rag 23 21 ± 1 62 ± 1

Rant 21 >450 15 ± 3

Tabla (v). Resumen de la estabilidad de receptores de tipo natural y mutantes en diferentes detergentes. La solubilización de los receptores y el intercambio de detergente se realizaron durante la etapa de IMAC. La D.E. es < 1 °C. No fue posible determinar la Tm para algunas combinaciones receptor-detergente porque el receptor era demasiado inestable (f).

Tm (°C)

Unión del agonista Unión del antagonista

wt Rag 23 wt Rant 21

DDM al 0,01 % 27 34 25 39

DM al 0,1 % 23 29 10 28

NM al 0,3 % 22 28 < 4 25

NG al 0,3 % f f f 22

OG al 0,6 % <9 16 f 23

LDAO al 0,003 % 28 38 32 42

FC12 al 0,006 % 37 39 43 49

Ejemplo 3: Mutantes del receptor de neurotensina (NTR) con termoestabilidad aumentada

1. Se han preparado 340 mutantes dirigidos al sitio entre los residuos 61-400 de NTR.

2. Inicialmente, se sometió a ensayo la termoestabilidad de todos estos mutantes usando un ensayo que mide la unión de 3H-neurotensina (agonista) después de la etapa de calentamiento. 24 mutaciones condujeron a un aumento pequeño pero significativo en la termoestabilidad: A356L, H103A, D345A, A86L, A385L, Y349A, C386A, K397A, H393A, 1116A, F358A, S108A, M181A, R392A, D113A, G209A, L205A, L72A, A120L, P399A, Y351A, V268A, T207A, A155L, S362A, F189A, N262A, L109A, W391A, T179A, S182A, M293A, L256A, F147A, D139A, S100A, K176A, L111A, A90L, N270A.

3. Los mutantes sometidos a prueba para determinar la termoestabilidad mediante calentamiento en ausencia del agonista volvieron a someterse a prueba usando un ensayo ligeramente diferente en el que los mutantes se calentaron en presencia de 3H-neurotensina (formato de ligando (+) en la figura 12). Los mutantes con termoestabilidad mejorada son: A69L, A73L, A86L, A90L, H103A, V165A, E166A, G215A, V229A, M250A, I253A, A177L, R183A, I260A, T279A, T294A, G306A, L308A, V309A, L310A, V313A, F342A, F358A, V360A, S362A, N370A, S373A, F380A, A385L, P389A, G390A, R395A.

4. También hay mutantes que tienen un nivel de expresión significativamente potenciado en comparación con el receptor de tipo natural y que podrían usarse para aumentar los niveles de producción de preceptores para la cristalización: A86L, H103A, F358A, S362A, N370A, A385L, G390A. Todos estos también tienen una termoestabilidad aumentada.

5. Las combinaciones preferidas son

a. Nag7m F358A+A86L+I260A+F342A Tm de 51 °C (con neurotensina unida)

b. Nag7n F358A+H103A+I260A+F342A Tm de 51 °C (con neurotensina unida)

La NTR de tipo natural tiene una Tm de 35 °C con neurotensina unida.

Ejemplo 4: Identificación de motivos estructurales en los que residen mutaciones estabilizadoras de GPCR

Se ha determinado la estructura del receptor p2-adrenérgico (20, 21), que es el 59 % idéntico al receptor p1 de pavo, pero con un perfil farmacológico claramente diferente (22, 23). Para determinar los motivos estructurales en los que residen las mutaciones estabilizadoras del receptor p1 de pavo, se mapearon las mutaciones sobre la estructura dep2 humano (21).

Los receptores beta-adrenérgicos se alinearon en primer lugar usando ClustalW en el paquete MacVector; se destacaron las mutaciones termoestabilizadoras enp1 de pavo junto con el residuo correspondiente en la secuencia dep2 humana. El modelo dep2 humano (código de registro de pdb 2RH1) se visualizó en Pymol y los aminoácidos deseados se mostraron como modelos de relleno de espacio mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los motivos estructurales en los que estaban ubicadas las mutaciones estabilizadoras se determinaron mediante inspección visual.

La tabla (vi) enumera las posiciones equivalentes en el receptorp2 correspondientes a las mutaciones termoestabilizadoras enpAR-m23 y los motivos estructurales en los que residen.

Tal como se observa en la tabla (vi), las mutaciones se ubican en varias localidades distintas. Tres mutaciones se encuentran en regiones de bucle que se predice que serán accesibles al disolvente acuoso (bucle). Ocho mutaciones se encuentran en las hélicesatransmembrana y apuntan hacia la bicapa lipídica (lípido); tres de estas mutaciones están cerca del extremo de las hélices y puede considerarse que están en la capa límite hidrófila (límite lipídico). Ocho mutaciones se encuentran en las superficies de contacto entre hélicesatransmembrana (interfaz hélice-hélice), tres de las cuales están dentro de una región acodada o distorsionada de la hélice (acodamiento) y otras dos mutaciones se producen en una hélice pero son adyacentes a una o más de otras hélices que contienen un acodamiento adyacente en el espacio al residuo mutado (acodamiento opuesto). Estas últimas mutaciones podrían afectar al empaquetamiento de los aminoácidos dentro de la región acodada, lo que podría dar como resultado una termoestabilización. Otra mutación está en un bolsillo de unión al sustrato (bolsillo).

Tabla (vi). Posición en la estructura dep2 humana de los residuos de aminoácidos equivalentes a las mutaciones termoestabilizadoras encontradas en el receptorp1 de pavo y los motivos estructurales en los que residen.

Tales motivos estructurales, en virtud de que contienen mutaciones estabilizadoras, son importantes para determinar la estabilidad de las proteínas. Por tanto, dirigir mutaciones a estos motivos facilitará la generación de GPCR mutantes estabilizados. De hecho, hubo varios casos en los que más de una mutación se mapeó al mismo motivo estructural. Por ejemplo, las mutaciones Y227A, V230A y A234L en el receptorp1-adrenérgico de pavo se mapearon todas ellas a la misma interfaz helicoidal, las mutaciones V89L y M90V se mapearon al mismo acodamiento helicoidal y las mutaciones F327A y A334L se mapearon a la misma superficie helicoidal que apunta hacia la bicapa lipídica (tabla (vi)). Por tanto, cuando se ha identificado una mutación estabilizadora, la determinación del motivo estructural en el que se ubica esa mutación permitirá la identificación de mutaciones estabilizadoras adicionales.

Ejemplo 5: Transferibilidad de mutaciones estabilizadoras entre receptores B-adrenéraicos

Resumen

Se han descrito seis mutaciones puntuales que estabilizaron el receptor B1-adrenérgico (AR) de pavo. El mutante, B1AR-m23, alcanzó una Tm aparente de 21 °C mayor que la proteína nativa cuando se solubilizó en dodecilmaltósido (DDM). Estas mutaciones ayudaron a la cristalización y a la determinación de la estructura de una versión truncada de la proteína. Ahora se comprobó la transferibilidad de estas mutaciones estabilizadoras a B1AR y B2AR humanos. El análisis de estabilidad reveló que B1AR humano es mucho más inestable y dependiente de lípidos que B1AR de pavo, mientras que B2AR es más estable que cualquiera de ellos. En ambos casos, las mutaciones aumentaron la Tm de los receptores, especialmente para B1AR en presencia de detergente. Otros cambios en estos residuos mostraron que las mutaciones originales de B1AR de pavo funcionaron bien tanto para los BAR humanos como para los de pavo, revelando la importancia de las mutaciones en estos residuos concretos.

Métodos

Materiales. Se clonaron B1, B2 y B3 humanos en pcDNA3.1+. Estas construcciones fueron proporcionadas por el Centro de Recursos de ADNc de Ciencia y Tecnología de Missouri. (www.cdna.org). B1AR (BAR<34>-<424>) y la versión mutada B1AR-m23 de pavo se describen en Serrano-Vegaet al.(PNAS (2008) 105: 877). Ambos fueron clonados en pcDNA3. 1 -[4,6-propil-3H]dihidroalprenolol ([3H]-DHA) fue suministrado por Amersham Bioscience.

Mutagénesis. Los receptores humanos se mutaron mediante PCR usando cebadores que contenían las mutaciones deseadas tal como se describe en la referencia. La región C-terminal de B1 humano también se truncó mediante PCR usando un cebador que contenía una deleción después de Leu463. Las reacciones PCR se llevaron a cabo usando polimerasa KOD (Novagen).

Expresión. Las proteínas se expresaron mediante transfecciones transitorias en células HEK usando el reactivo Gene Juice (Novagen). Después de la transfección, las células se incubaron durante 48 horas y se recogieron alícuotas de 1 ml en una concentración de 2 millones de células/ml mediante centrifugación y se almacenaron a -20 °C. Para los ensayos, las células se resuspendieron en 500 |il de tampón [Tris 75 mM pH 8/MgCb 12,5 mM/EDTA 5 mM/inhibidores de proteasas (Complete™; Roche)] que contenía diferentes cantidades de detergente dodecilmaltósido (DDM).

Ensayos de termoestabilidad y de unión del ligando. Los ensayos de unión se llevaron a cabo incubando 40 |il de muestra con [3H]-DHA 80 nM en un volumen final de 120 |il de tampón [Tris 75 mM pH 8/MgCb 12,5 mM/EDTA 5 mM/DDM al 0,01 %]. El equilibrado fue durante 1 h a 4 °C. Los radioligandos libres y unidos al receptor se separaron mediante filtración en gel tal como se describió anteriormente (referencia de Tony). La termoestabilidad se calculó incubando las muestras en ausencia de ligando durante 30 min a diferentes temperaturas y los datos se analizaron mediante regresión no lineal usando el software Prism (GraphPad).

Resultados

Expresión y termoestabilidad de B1AR y B2AR humanos

Se han descrito seis mutaciones en el receptor B1-adrenérgico (AR) de pavo, construcción B1AR-m23, que estabilizaron la proteína cuando se solubilizó en detergente y la desplazaron a la conformación unida al antagonista (Serrano-Vegaet al.,PNAS (2008) 105: 877). Esta termoestabilización en una determinada conformación fue esencial para la cristalización del receptor (Warneet al.,Nature (2008) 454: 486). Ahora se estudió la transferibilidad de estas mutaciones a otros receptores de la misma familia. B1AR de pavo tiene el 76 % y el 59 % de identidad con B1AR y el B2AR humanos respectivamente (los extremos N-terminal y C-terminal se eliminaron en las alineaciones). La mayoría de las mutaciones termoestabilizadoras se conservan entre los BAR de pavo y humano (figura 29). Estas mutaciones se encuentran preferentemente en las regiones transmembrana, más conservadas. Por tanto, era posible que las mutaciones que estabilizaron B1AR de pavo también pudieran estabilizar B1AR y B2AR humanos.

En primer lugar se analizaron la expresión y la estabilidad de los tipos naturales. Las construcciones se expresaron en células HEK mediante transfecciones transitorias. La expresión se calculó mediante ensayo de unión con el radioligando 1-[4,6-propil-3H]dihidroalprenolol ([3H]-DHA). La expresión de B1AR humano fue muy baja, por lo que el extremo C-terminal se truncó después de Leu463 para aumentar la expresión. La proteína truncada p1AR-Cdel aumentó la expresión 5 veces con respecto al tipo natural (datos no mostrados). Como resultado, p1AR-Cdel y P2AR humanos tuvieron niveles de actividad similares cuando se sometieron a ensayo en membranas, menores que los de P1AR de pavo (figura 30A). Sin embargo, cuando se solubilizó con DDM al 2 %, la actividad de P1AR-Cdel humano disminuyó drásticamente (figura 30B). Esta desestabilización debida al detergente aparentemente no afectó a P1AR de pavo ni a P2AR humano. La sensibilidad al detergente se midió solubilizando las muestras en cantidades crecientes de detergente, desde el 0,01 % hasta el 1 %, este último todavía por encima de la c.m.c. aunque la solubilización no es completa (figura 31). Todo esto se llevó a cabo a 4 °C. PIAR de pavo y P2AR humano mostraron la misma actividad en todas las condiciones, menos actividad con DDM al 0,01 % posiblemente debido a la solubilización parcial, pero P1AR-Cdel humano tenía una clara sensibilidad al detergente (esto también se observó en el tipo natural, P1AR, datos no mostrados).

La termoestabilidad de los receptores se comprobó calculando la Tm en presencia de DDM al 0,1 % o al 0,01 % (figura 32A). En presencia de una baja cantidad de detergente, los tres presentaron una Tm similar, siendo la más baja para P1AR-Cdel humano (31 °C, 28 °C y 30 °C para P1AR de pavo, P1AR-Cdel humano y P2AR humano, respectivamente). Sin embargo, cuando se solubilizaron con DDM al 0,1 %, P1AR de pavo y P1AR-Cdel humano fueron más inestables, especialmente P1AR-Cdel humano (23 °C y 12 °C, respectivamente). Esto reveló que ambos dependen de los lípidos, mientras que P2AR humano es tan estable solubilizado (29 °C) como en membranas (30 °C). Por tanto, trabajar con P2AR humano es especialmente ventajoso para purificar o cristalizar el receptor, y también debería facilitar la estabilización de otros receptores, al menos tanto como P2AR humano.

Efecto de las mutaciones estabilizadoras de P1AR-m23 de pavo en BAR humanos

Se mutaron P1AR-Cdel y P2AR humanos para incorporar los cambios correspondientes presentes en P1AR-m23 de pavo (R68S, M90V, Y227A, A282L, f327A y F338M). Se calculó la Tm de todos los mutantes que portaban mutaciones m23 para comparar la estabilidad con y sin mutaciones (figura 31). En todos los casos, la Tm aumentó, especialmente cuando se añadió una gran cantidad de detergente (aumento de 22 °C, 15 °C y 12 °C para P1AR de pavo, P1AR-Cdel humano y P2AR humano, respectivamente). En el caso de P1AR-m23 de pavo, las mutaciones hicieron que el receptor fuera más estable cuando se solubilizó. No hubo diferencias en la Tm entre más o menos cantidades de detergente (Tm de 45 °C cuando se solubilizó con DDM al 0,1 % o al 0,01 %). P1AR-Cdel-m23 humano aumentó la estabilidad en ambas condiciones (cantidad de detergente alta (27 °C) y baja (33 °C)) y todavía es sensible al detergente, pero menos que el tipo natural. Para P2AR-m23 humano, la Tm fue de 41 °C y 40 °C para el 0,1 % y el 0,01 % respectivamente, aproximadamente 10 grados por encima del tipo natural.

Nueva ronda de mutagénesis para aumentar la termoestabilidad en PAR humanos

Se seleccionaron nuevos cambios para los aminoácidos en los PAR humanos correspondientes a los implicados en la estabilización de m23 en pavo y el aminoácido en la posición I129 de P1AR de pavo, que notificó buenos resultados en experimentos previos (véanse los ejemplos 1-4). Las figuras 30C-K resumen los resultados para P1AR-Cdel-m23 humano. Es destacable que no hubo grandes mejoras con respecto al mutante original. Las mutaciones más interesantes se produjeron en el residuo correspondiente a I129 en P1AR de pavo. Se calculó la Tm para los cambios más prometedores en este residuo y se obtuvo 38 °C cuando se mutó a glicina y 40 °C cuando se mutó a alanina. La Tm para P1AR-Cdel-m23 humano fue de 31 °C (estas muestras se solubilizaron con DDM al 0,05 %). Se observó una situación similar para los cambios en P2AR-m23 humano (figuras 30L-T). En este caso, la actividad medida fue más sensible a los cambios que en P1AR-m23 humano. Sólo un cambio a alanina, en el residuo correspondiente a I129 de pavo, mejoró la estabilidad, 5 °C por encima del tipo natural.

Ejemplo 6: Análisis de mutaciones estabilizadoras en función de la posición de alineación

Resumen

Se han realizado análisis computacionales y estadísticos sobre conjuntos de datos de mutaciones termoestabilizadoras (Tm) de cuatro GPCR diferentes: receptor de adenosina humano 2A (A2AA), receptor P1-adrenérgico de pavo (B1), receptor de neurotensina 1 de rata (NTR) y receptor muscarínico humano (M1). Los objetivos de este trabajo eran identificar la probabilidad estadística de alineación de mutaciones basándose en la secuencia para determinar si podrían construirse modelos predictivos a partir de los datos existentes que puedan ser útiles para mejorar la eficiencia de futuras campañas de exploración de mutaciones.

Se realizaron experimentos para evaluar el grado de significación estadística para que estén alineadas las Tm identificadas para los receptores B1, A2AA, M1 y NTR. Para ello, se alinearon las secuencias y se contaron los números de posiciones de alineación que contenían al menos dos mutaciones. Este número se comparó con las estadísticas generadas a partir de una distribución de 10.000 mapeos de secuencias en los que a las mutaciones se les asignaron aleatoriamente posiciones de secuencia.

Los resultados de este estudio mostraron que la alineación entre todos los pares de secuencias (excepto aquellos que involucran a M1) fue muy significativa y que la alineación entre grupos de secuencias también fue muy significativa.

Basándose en estos resultados, se determinó además si el uso de una ventana de residuos para definir una coincidencia también conducía a resultados estadísticamente significativos. La mayoría de las mutaciones estabilizadoras (Tm) existen en los dominios transmembrana helicoidales, de manera que posiblemente estén mapeándose en regiones helicoidales similares que están relacionadas espacialmente, aunque no se encuentran en posiciones de alineación idénticas. Como tal, se determinó el número de coincidencias de alineación identificadas en diferentes tamaños de ventana. Estos datos mostraron que la significación estadística generalmente aumenta al aumentar el tamaño de ventana y el tamaño de ventana más significativo fue de 9 (es decir, ventana =imás o menos 4 ). Estos datos respaldan que la aparición conjunta de Tm en “regiones” es muy estadísticamente significativa.

Tras la determinación de que la aparición conjunta de Tm es muy significativa tanto en cuanto a alineación exacta como en cuanto a alineación de ventana, se realizaron experimentos para evaluar la capacidad de estas métricas para identificar Tm. Se realizó una serie de experimentos en los que se usaron datos de 3 receptores para predecir las ubicaciones de Tm en una cuarta secuencia de receptor. Este análisis revela que este enfoque da como resultado un enriquecimiento de la tasa de aciertos de hasta 2 veces (es decir, el 100 %) en comparación con el método aleatorio existente. El método es aplicable a los receptores B1, A2A y NTR pero no al receptor M1.

Se espera que el método sea útil para reducir el número de mutaciones que deben realizarse en un nuevo receptor, usando el método óptimo en primer lugar un tamaño de ventana pequeño, identificando las mutaciones estabilizadoras de ese subconjunto de secuencia y luego explorando más residuos en un tamaño de ventana creciente, dependiendo de si se han encontrado suficientes mutaciones.

Resultados

Análisis de posición de Tm

Se generó una alineación de secuencias de A2AA, p1, NTR y M1 usando el programa ClustalW (figura 34). Generalmente, esta alineación es muy similar a la de la figura 17, con alguna variación en las regiones de bucle. Usando la alineación, las mutaciones termoestabilizadoras (Tm) identificadas se mapearon a secuencias y se calculó la significación estadística para:

1. aparición conjunta de Tm entre pares de secuencias; y

2. aparición conjunta de Tm entre grupos de secuencias (conjuntos de 3 o la totalidad de las secuencias) Las estadísticas se vieron facilitadas por la generación de un conjunto de datos de 10.000 asignaciones de Tm aleatorias (mutante termoestabilizador) (es decir, mismo número por secuencia que en los datos verdaderos) que proporcionó una distribución normal de estadísticas de aparición conjunta (media y desviación estándar) que podrían compararse con los valores observados. Los análisis iniciales revelaron que algunas de las apariciones conjuntas de posiciones de alineación de las Tm notificadas son muy significativas. La tabla A muestra la probabilidad (valor de p) de aparición conjunta de secuencias por pares según una distribución normal de resultados del muestreo aleatorio:

Cuando se consideran múltiples secuencias, la significación estadística de las apariciones conjuntas se registró en la tabla B:

A partir de este análisis puede concluirse que todas las apariciones conjuntas de Tm, excepto aquellas que involucran la secuencia de M1, son estadísticamente significativas. Se obtienen datos similares usando la alineación de la figura 17.

Consideración de ventanas de residuos

En una estructura helicoidal, los residuos dentro de las posiciones i a i+4 están espacialmente próximos entre sí. Puesto que la mayoría de las Tm están ubicadas en dominios helicoidales, en lugar de buscar la alineación de la posición exacta de las Tm, se usó una ventana para representar las posiciones i->i+4 para determinar si esto proporcionaría un método alternativo para hacer coincidir las Tm entre sí en diferentes secuencias. Se consideró que hacer coincidir un área general de la hélice (o vuelta) en lugar de una posición exacta de la hélice puede representar un concepto importante para predecir las posiciones de estabilización de la hélice. Claramente, no todo el receptor es helicoidal, pero al menos el 80 % de las Tm identificadas por los presentes inventores hasta la fecha se encuentran en tales regiones.

Para someter a prueba este concepto, se realizaron estudios en los que, para una Tm determinada en la alineación, se determinó el número de coincidencias con otras Tm dentro de una ventana determinada a partir de la Tm de consulta. Además, también se calculó el número promedio de Tm en la ventana. Los resultados de este análisis para el alineación de las 4 secuencias (B1, A2AA, M1 y NTR) se muestran en la tabla C:

Una ventana se define comoimás o menos n, dondei= el residuo de referencia y n = residuos a cada lado (por tanto,imás o menos 5 residuos equivale a una ventana de 11 aminoácidos).

Los datos revelaron que, a medida que aumentaba el tamaño de ventana, aumentaba tanto la significación estadística de las coincidencias observadas como la significación estadística del número promedio de Tm por ventana de coincidencia. El número de coincidencias fue estadísticamente significativo en todos los tamaños de ventana.

La significación de estos datos es que es más probable que las Tm existan más cerca de otras Tm en posiciones alineadas con un tamaño de ventana de 9 (es decir, lo más estadísticamente significativo) y cuando una Tm está cerca de otra Tm, también es más probable que esté más cerca de otras Tm (la densidad promedio de Tm en las ventanas de 9 y 11 es mayor de 5).

Curiosamente, el tamaño de ventana óptimo de 9 se correlaciona con el número de residuos en una vuelta de hélice en cualquier dirección.

Basándose en estos resultados estadísticos, fue interesante considerar las implicaciones prácticas de usar el método de coincidencia de ventana en cuanto a predicción de Tm. Por tanto, se realizaron una serie de estudios simples en los que, para cada una de las 4 secuencias para las que hay datos de Tm disponibles, se usaron las otras 3 secuencias para predecir posibles posiciones de Tm usando el método de ventana. Por ejemplo, usando datos de Tm de NTR, B1 y A2AA, se aplicó el método de ventana para predecir las posiciones de Tm en M1. La tasa de aciertos de la predicción de ventana podría calcularse entonces comparándola con los datos de Tm conocidos para la secuencia. Estos resultados se muestran en la tabla D.

Los datos revelaron que, para las cuatro dianas, el concepto de coincidencia de ventana predice la posición de la mutación. El factor de enriquecimiento se define como número promedio inicial de residuos por Tm/número promedio de residuos por selección de Tm y representa la mejora de la predicción con respecto a una selección aleatoria. La cobertura se define simplemente como la fracción de Tm conocidas identificadas en la selección. Las tasas de enriquecimiento con un tamaño de ventana de 11 están entre el 39 % (M1) y el 65 % (B1) por encima de las aleatorias. Curiosamente, ninguna de las Tm de M1 se alinea con ninguna de las Tm para las otras 3 secuencias; sin embargo, el concepto de ventana proporciona cierta capacidad predictiva para esta secuencia, aunque sólo en tamaños de ventana más grandes. Para todos los receptores existe una compensación entre la cobertura de aciertos (número de Tm identificadas) y el tamaño de ventana.

La figura 35 muestra el efecto del tamaño de ventana sobre la cobertura y el enriquecimiento. La consideración importante es cuántas Tm se requieren para cada secuencia para estabilizar el receptor lo suficiente como para permitir la cristalización, lo que dictará el tamaño de ventana requerido. La figura 36 muestra el enriquecimiento frente a la cobertura para cada uno de los receptores en diferentes tamaños de ventana.

Curiosamente, a pesar de la significación estadística del tamaño de ventana creciente cuando se consideran todas las secuencias juntas, una ventana más pequeña (3) muestra las mejores tasas de enriquecimiento para las secuencias de B1, NTR y A2AA. Sólo M1 tiene el enriquecimiento más grande en tamaños de ventanas más grandes.

Ejemplo 7: Mapeo en 3D y estadísticas de las Tm

Resumen

En el ejemplo 6 se describieron procedimientos que determinaron la significación estadística de la aparición conjunta de alineaciones de secuencias de mutaciones termoestabilizadoras. En principio, el estudio análogo puede realizarse mediante un análisis de Tm mapeadas estructuralmente, con distancias entre las mutaciones cuantificadas a partir de coordenadas en 3D.

Por tanto, se realizaron estudios para determinar la significación estadística de la aparición conjunta de Tm por la distancia espacial entre las Tm para conjuntos de datos existentes en comparación con una distribución aleatoria y hasta qué punto los conjuntos de Tm existentes pueden usarse para predecir las ubicaciones de Tm en otro receptor. Además, se han comparado los resultados de estos estudios con las predicciones basadas en secuencias y se ha considerado dónde están los “puntos calientes” estructurales de las Tm al considerar múltiples conjuntos de Tm y cómo puede definirse la significación estadística de éstos (véase el ejemplo 8).Métodos

Para realizar estos estudios se necesitaron modelos estructurales de los receptores en cuestión. Se construyeron dos conjuntos de modelos de homología basados en las estructuras disponibles dep2 (modelos:p1, A2AA, M1, NTR) yp1 (modelos: A2AA, M1, NTR) usando protocolos de modelado de homología disponibles en MOE. Para los requisitos de los estudios actuales no se hizo ningún esfuerzo para aplicar el enfoque de modelado Origami® para predecir los estados de unión de agonistas de estos receptores, en lugar de comparar los estados antagonistas para los receptores en cuestión. Se consideró que las diferencias estructurales entre los estados antagonistas y agonistas de los receptores no alterarían las estadísticas generales de las distancias entre Tm. Cada modelo de receptor se construyó usando la alineación que se muestra en la figura 34. Los modelos finales se minimizaron usando un campo de fuerza AMBER, con una cubierta de disolvente explícita de ciclohexano para la capa transmembrana y moléculas de agua para los dominios intracelular y extracelular.

Las mutaciones se mapearon a las estructuras del receptor mediante un procedimiento automatizado escrito en MOE (Chemical Computing Group, Inc.) para leer las mutaciones de un archivo de texto y asignarlas a la estructura. El conjunto de mutaciones usadas para los receptores se describen en la figura 33.

Para proporcionar la base para el análisis estadístico, también se requirió un conjunto de mapeos de mutaciones aleatorias. Este conjunto de datos se obtuvo asignando aleatoriamente el mismo número de mutaciones a cada estructura de receptor que la cantidad de Tm conocidas. Esto se realizó 1000 veces, que representa 67000 mapeos de Tm con datos de coordenadas. Este conjunto de datos se consideró lo suficientemente grande como para proporcionar una distribución estadística representativa a partir de la cual pudieran realizarse comparaciones de los datos reales.

Resultados

Mapeo de distancias de Tm

Se calcularon dos medidas diferentes de distancia entre Tm mapeadas. La primera era simplemente la distancia entre los átomos de Cade los residuos. La segunda era la distancia entre cualquier átomo de dos residuos. Para cada Tm se registró el número de otras Tm encontradas dentro de una distancia determinada. Para el método de Ca, las distancias usadas fueron 6Á, 8Á, 10Á y 12Á. Para el método de cualquier átomo, las cubiertas de distancia usadas fueron 4Á, 6Á y 8Á.

El análisis también se aplicó a los 1.000 mapeos de Tm aleatorios, proporcionando una media y una desviación estándar a cada radio a partir de las cuales puede calcularse la significación de los datos observados. Los resultados del método de Case muestran en la tabla E a continuación.

Los datos muestran que los números promedio (media) de las Tm encontradas dentro de todos los radios son mayores que las encontradas para la distribución aleatoria (media aleatoria) y que estos valores son estadísticamente significativos (p<0,005). Además, a medida que aumenta el radio, la diferencia entre el valor observado y la distribución aleatoria se vuelve más significativa. Los datos determinados por los criterios de cualquier átomo se muestran en la tabla F a continuación:

Los datos muestran que los números promedio (media) de las Tm encontradas dentro de todos los radios medidos son mayores que las encontradas para la distribución aleatoria (media aleatoria) y que estos valores también son estadísticamente significativos (p<0,005). Tal como se esperaba, se identifican más Tm dentro de un radio determinado en comparación con el método de Caanálogo, ya que también se incluyen contactos de cadenas laterales. El hecho de que los valores depdel método de cualquier átomo sean más bajos indica que las posiciones de cadenas laterales pueden ser importantes para las ubicaciones de Tm y las distancias entre ellas.

Identificación de Tm usando criterios de distancia

Basándose en los resultados obtenidos a partir del mapeo de la estructura de Tm de que el número de Tm identificadas es estadísticamente significativo en comparación con una distribución aleatoria, se consideró importante evaluar la utilidad de esto en su capacidad para predecir las ubicaciones de Tm en un receptor no observado en los datos de entrenamiento. Los estudios se realizaron de manera similar al análisis de predicción de Tm basado en secuencia descrito en el ejemplo 6. Para cada receptor de entrep1, A2AA, NTR y M1, se usaron las mutaciones conocidas para los otros 3 como base para la identificación estructural de las ubicaciones de Tm candidatas. Se usó tanto el método de Cacomo de cualquier átomo, usándose diferentes radios en cada caso. Se analizaron tanto una serie de modelos basados en la estructura dep1 de pavo (código de PDB: 2vt4) como una serie de modelos basados en la estructura dep2 humano (código de registro de PDB: 2rh 1), lo que permitió analizar la sensibilidad de los resultados a las diferencias en el molde estructural.

La tabla G a continuación muestra las capacidades de predicción del método de Capara los moldes basados enP2 y la tabla H muestra las capacidades de predicción del método de cualquier átomo para los moldes basados enP2.

Tabla G: Búsqueda de estructura - contacto definido por el método de CI, molde de B2

N.°

N.° promedio

Sitios de

iones Tm Tm promedio de

Diana<Distancia>

ALongitud mutac de residuos Factor de

miento<Cobertura>previstos identificadas totales

conocidas residuos por nivel enriqueci

por Tm inicial de

Tm

M1 6 416 193 3 5 64,33 83,20 1,29 0,6

8 416 229 3 5 76,33 83,20 1,09 0,6

10 416 261 4 5 65,25 83,20 1,28 0,8

12 416 289 5 5 57,80 83,20 1,44 1

NTR 6 327 151 13 24 11,62 13,63 1,17 0,541667 8 327 201 18 24 11,17 13,63 1,22 0,75 10 327 250 20 24 12,50 13,63 1,09 0,833333 12 327 280 23 24 12,17 13,63 1,12 0,958333 A2AA 6 296 197 11 17 17,91 17,41 0,97 0,647059

8 296 233 15 17 15,53 17,41 1,12 0,882353 10 296 264 16 17 16,50 17,41 1,06 0,941176 12 296 274 16 17 17,13 17,41 1,02 0,941176 B1 6 320 173 16 21 10,81 15,24 1,41 0,761905 8 320 206 16 21 12,88 15,24 1,18 0,761905 10 320 244 19 21 12,84 15,24 1,19 0,904762 12 320 263 20 21 13,15 15,24 1,16 0,952381

Tabla H: Búsqueda de estructura - contacto definido por el método de cualquier átomo o residuo, molde de B2 N.°

N.° promedio

Sitios de Tm promedio de

Diana<Distancia>

ALongitud mutaciones Tm tales de residuos Factor de previstos identificadas to

conocidas residuos por nivel enriquecimiento<Cobertura>por Tm inicial de

Tm

M1 4 416 233 3 5 77,67 83,20 1,07 0,6

6 416 261 5 5 52,20 83,20 1,59 1 8 416 285 5 5 57,00 83,20 1,46 1 10 416 302 5 5 60,40 83,20 1,38 1 NTR 4 327 210 18 24 11,67 13,63 1,17 0,75

6 327 247 20 24 12,35 13,63 1,10 0,833333 8 327 277 23 24 12,04 13,63 1,13 0,958333 10 327 298 24 24 12,42 13,63 1,10 1 A2AA 4 296 227 14 17 16,21 17,41 1,07 0,823529

6 296 257 16 17 16,06 17,41 1,08 0,941176 8 296 274 16 17 17,13 17,41 1,02 0,941176 10 296 282 17 17 16,59 17,41 1,05 1

B1 4 320 205 15 21 13,67 15,24 1,11 0,714286

6 320 232 18 21 12,89 15,24 1,18 0,857143 8 320 262 21 21 12,48 15,24 1,22 1 10 320 272 21 21 12,95 15,24 1,18 1

Tal como se esperaba, la cobertura de las Tm para ambos métodos aumenta al aumentar el radio. Generalmente, los enriquecimientos no son muy altos: ~10-20 % para las estructuras de NTR, A2AA y B1, pero de hasta ~60 % para la estructura de M1. Aunque los factores de enriquecimiento son similares dependiendo de si las cadenas laterales se tienen en cuenta en las métricas de distancia, la cobertura de las predicciones correctas es generalmente mejor con los criterios de distancia de cualquier átomo. Esto implica que los cálculos que incluyen las cadenas laterales permiten la identificación de más Tm que con el método de CI, con el mismo factor de enriquecimiento.

Los resultados del mismo análisis realizado en modelos construidos basándose en la estructura dep1 de pavo se muestran en las siguientes tablas.

La tabla I a continuación muestra las capacidades de predicción del método de CI para los moldes basados enp1 y la tabla J muestra las capacidades de predicción del método de cualquier átomo para los moldes basados enp1.

Tabla I: Búsqueda de estructura - contacto definido por el método de CI, molde de B1

N.°

N.° promedio

Sitios de Tm promedio de

Diana<Distancia>

ALongitud mutaciones Tm de residuos Factor de previstos identificadas totales

conocidas residuos por nivel enriquecimiento<Cobertura>por Tm inicial de

Tm

M1 6 416 187 3 5 62,33 83,20 1,33 0,6

8 416 223 3 5 74,33 83,20 1,12 0,6 10 416 253 4 5 63,25 83,20 1,32 0,8 12 416 284 5 5 56,80 83,20 1,46 1 NTR 6 327 139 12 24 11,58 13,63 1,18 0,5 8 327 192 16 24 12,00 13,63 1,14 0,666667 10 327 243 20 24 12,15 13,63 1,12 0,833333 12 327 276 24 24 11,50 13,63 1,18 1 A2AA 6 296 192 12 17 16,00 17,41 1,09 0,705882

8 296 232 15 17 15,47 17,41 1,13 0,764706 10 296 256 16 17 16,00 17,41 1,09 0,882353 12 296 270 17 17 15,88 17,41 1,10 1

B1 6 274 173 12 17 14,42 16,12 1,12 0,705882

8 274 210 13 17 16,15 16,12 1,00 0,764706 10 274 239 15 17 15,93 16,12 1,01 0,882353 12 274 257 17 17 15,12 16,12 1,07 1

Tabla J: Búsqueda de estructura - contacto definido por el método de cualquier átomo o residuo, molde de B1 N.°

N.° promedio

Sitios de

Diana<Distancia>iones Tm Tm promedio de

ALongitud mutac ales de residuos Factor de previstos identificadas tot

conocidas residuos por nivel enriquecimiento<Cobertura>por Tm inicial de

Tm

M1 4 416 223 3 5 74,33 83,20 1,12 0,6

6 416 251 5 5 50,20 83,20 1,66 1 8 416 279 5 5 55,80 83,20 1,49 1 10 416 293 5 5 58,60 83,20 1,42 1 NTR 4 327 188 15 24 12,53 13,63 1,09 0,625

6 327 229 19 24 12,05 13,63 1,13 0,791667 8 327 267 22 24 12,14 13,63 1,12 0,916667 10 327 289 24 24 12,04 13,63 1,13 1 A2AA 4 296 218 14 17 15,57 17,41 1,12 0,823529

6 296 246 16 17 15,38 17,41 1,13 0,941176 8 296 269 17 17 15,82 17,41 1,10 1 10 296 276 17 17 16,24 17,41 1,07 1

B1 4 274 198 12 17 16,50 16,12 0,98 0,705882

6 274 230 15 17 15,33 16,12 1,05 0,882353 8 274 255 17 17 15,00 16,12 1,07 1 10 274 269 17 17 15,82 16,12 1,02 1

Los resultados son muy similares a los del molde de p2, con enriquecimientos similares observados para los cuatro receptores y coberturas más altas con factores de enriquecimiento dados que generalmente se observan para el método de cualquier átomo.

Curiosamente, usando cualquiera de los criterios de molde y de distancia, los enriquecimientos son sistemáticamente mayores para el receptor M1. Esto contrasta con el método de secuencia donde las tasas de enriquecimiento son mucho más bajas para este receptor. Esto indica que algunas de las mutaciones de M1 posiblemente están relacionadas estructuralmente con otras Tm en otros receptores, aunque estadísticamente no hay suficientes para garantizarlo.

Otra conclusión es que las tasas de enriquecimiento son mayores para el método de exploración de secuencias (con la excepción de M1) en comparación con el método de exploración de estructuras, aunque las coberturas son mayores para el enfoque basado en estructuras. Quizás se espere que, dado el conjunto adicional de relaciones intrahelicoidales reveladas en 3D entre Tm mapeadas, la cobertura pueda ser mayor con este método, pero quizás sea inesperado que un análisis de sólo secuencia proporcione enriquecimientos más altos.

Los siguientes gráficos representan gráficamente los factores de enriquecimiento frente a los valores de cobertura para los análisis basados en estructura y en secuencia.

La figura 37 muestra las relaciones entre enriquecimiento y cobertura tanto para el método de Cacomo para el método de cualquier átomo para el trabajo basado en el molde dep1. En general, el método de cualquier átomo proporcionó una mejor cobertura con tasas de enriquecimiento similares a las del método de CI.

En la figura 38 se muestra una comparación de la identificación de Tm basada en secuencia frente a la basada en estructura y es una combinación de las figuras 37 y 36.

Estos datos muestran que los métodos de predicción de Tm basados en estructura y basados en secuencia proporcionan diferentes perfiles de cobertura frente a capacidades de enriquecimiento. Dependiendo de los requisitos sobre si es deseable una mayor cobertura o un mayor enriquecimiento, puede seleccionarse un método u otro. La excepción es el receptor M1, para el cual el enfoque basado en estructura funciona mejor tanto en cuanto a enriquecimiento como en cuanto a cobertura.

Ejemplo 8: Análisis de agrupamientos de Tm

Resumen

El análisis de la estructura de Tm descrito en la sección previa muestra que las Tm están estadísticamente más juntas en promedio de lo esperado según una distribución aleatoria y que esto se traduce de manera útil en la capacidad de identificar Tm en un receptor basándose en las Tm identificadas en otros receptores. Si bien este análisis se ha basado en promedios y conjuntos de Tm conjuntamente, puede realizarse un análisis interesante para identificar la significación de agrupamientos específicos de Tm dentro del conjunto de datos. La identificación de tales agrupamientos puede dar como resultado la comprensión de la importancia estructural de Tm particulares. Además, estos agrupamientos pueden usarse para seleccionar como diana regiones específicas de un receptor para la exploración de Tm, basándose en estadísticas de apariciones de conjuntos de valores conocidos.

Métodos

Las distribuciones aleatorias de Tm calculadas para los estudios de mapeo estructural se usaron para derivar estadísticas sobre la significación de agrupamientos de Tm en estructuras superpuestas de receptoresp1, A2AA, NTR y M1 (basados en la estructura dep1). A partir de la distribución de mapeos aleatorios, se calcularon los números medios y las desviaciones estándar de los agrupamientos a cada radio usando el método de Cay se supuso que se ajustaban a una distribución normal. Luego se calculó la significación de cada agrupamiento identificado a radios diferentes a partir de los mapeos de Tm reales y se guardaron los agrupamientos estadísticamente significativos para su análisis. La tabla K resume estos agrupamientos. Los agrupamientos identificados a 6 A tienen la significación más baja (p= 0,054).

Tabla K: Agrupamientos estadísticamente significativos

Radio N.° Tamaño Significación Residuos (número según Ballesteros y Weinstein en negrita)

10 A 1 11 0,000127 NTR:VAL1603,43, NTR:MET2505,51, NTR:ASN2575,58,

NTR:VAL3096,36, NTR:LEU3106,37, NTR:VAL3136,40, NTR:ALA3166,43, B1:ILE1293,40, B1:TYR2275,58,

A2AA:LEU2356,38, A2AA: VAL2396,41

8 A 2 7 0,0017 NTR:ASN2575,58, B1:TYR2275,58, B1:ARG2295,60,

B1:ALA2345,65, A2AA:ALA2035,64, A2AA:ALA2045,65,

NTR:ILE2605,61

3 7 0,0017 NTR:GLY3066,33, NTR:LEU3106,37, NTR:VAL3136,40,

NTR:SER373, A2AA:ALA2316,34, A2AA:LEU2356,38,

NTR:VAL3096,36

4 7 0,0017 NTR:PHE3587,42, NTR:VAL3607,44, B1:ILE551,46,

B1:MET902,53, B1:ALA3347,44, B1: PHE3387,48,

NTR:SER3627,46

5 7 0,0017 NTR:ASN2575,58, B1:TYR2275,58, B1:ARG2295,60,

B1:ALA2345,65, A2AA:ALA2035,64, A2AA:ALA2045,65,

B1: VAL2305,61

6 A 6 6 0,054 NTR:ASN2575,58, B1:TYR2275,58, B1:ARG2295,60,

A2AA:ALA2035,64, NTR:ILE2605,61

7 6 0,054 NTR:GLY3066,33, NTR:LEU3106,37, A2AA:ALA2316,34,

A2AA:LEU2356,38, NTR:VAL3096,36

8 6 0,054 NTR:LEU3106,37, NTR:ALA3166,43, A2AA:LEU2355,66,

A2AA: VAL2396,41, NTR:VAL3136,40

9 6 0,054 NTR:VAL3607,44, B1 :ILE551,46, B1:ALA3347,44, B1:

PHE3387,48, NTR:SER3627,46

10 6 0,054 NTR:ASN2575,58, NTR:ILE2605,61, B1:TYR2275,58, B1

VAL2305,61, B1:ARG2295,60

11 6 0,054 NTR:ASN2575,58, B1:TYR2275,58, B1:ARG2295,60,

A2AA:ALA2035,64, B1: VAL2305,61

12 6 0,054 B1:VAL160, A2AA:THR1194,40, A2AA:GLY1234,44,

ACM1_HUMANA:MET1454,45, A2AA:LYS1224,43

13 6 0,054 NTR:ILE2605,61, B1: VAL2305,61, B1:ALA2345,65,

A2AA:ALA2045,65, A2AA:ALA2035,64

Los resultados muestran que, de las 67 Tm que se mapean a los cuatro receptores, sólo 26 se mapean a agrupamientos estadísticamente significativos (a 8 A y 10 A). De estos, los agrupamientos 1, 2, 3 y 5 comparten algunos de los mismos residuos, siendo el agrupamiento 4 estructuralmente distinto. Como tal, sólo dos áreas de los GPCR contienen agrupamientos de Tm estadísticamente significativos. Los únicos residuos en los agrupamientos a 6 A que se encuentran fuera de los agrupamientos a 8 ó 10 A se encuentran en el agrupamiento 12, que se asigna a TM4 (véase la figura 39, que incluye los agrupamientos 6-13).

La mayoría de los agrupamientos se mapean a la parte inferior de TM5, TM6 y la mitad de TM7, con otro ubicado en el extremo intracelular de TM4 (un agrupamiento a 6 A). Curiosamente, casi todos estos residuos están ubicados hacia la porción intracelular del receptor. Otro aspecto interesante es que casi todos los agrupamientos, con la excepción del agrupamiento más grande (agrupamiento 1) y el agrupamiento 4 que se mapean a dos hélices transmembrana, están ubicadas en la misma hélice. Esto explica por qué el método basado en secuencia funciona bien en comparación con el método de estructura: hay secciones de 1-2 vueltas de las hélices 4, 5, 6 y 7 que dominan los datos de TM existentes (cuando se observan en cuanto a agrupamiento estadístico).

Como tal, estos datos sugieren que podría lograrse una selección de Tm basada en estructura mejorada seleccionando un centro de todos los agrupamientos importantes y usándolo como centro del radio para un superagrupamiento que maximizaría el enriquecimiento de la selección.

Por ejemplo, una esfera de radio 15 A colocada en el centro de los agrupamientos principales cubriría 459 residuos (de un total de 1359) de los cuatro receptores pero predeciría 39 de 67 mutaciones termoestabilizadoras. Como tal, esto representa un factor de enriquecimiento de 1,72 y una cobertura de 0,58 en la predicción de Tm. Se sugiere que esto representa un buen equilibrio entre enriquecimiento y cobertura puesto que aproximadamente se cubre sólo un tercio de la secuencia. Como método, este agrupamiento del enfoque de agrupamientos requeriría que se recopilen datos de termoestabilidad para ~130 residuos de los cuales se esperaría que se identificaran 2/3 de todas las mutaciones posibles. Esto es una mejora con respecto a los datos de selección de estructura mostrados en el ejemplo 7 y se basa en el hecho de que, dentro de los conjuntos de Tm, hay agrupamientos estadísticamente significativos que pueden dirigirse hacia la porción intracelular del GPCR. Este agrupamiento se ilustra en la siguiente figura 41.

El papel estructural y funcional de estos residuos del agrupamiento es interesante y puede proporcionar una explicación de por qué las mutaciones en estas posiciones estabilizan al receptor.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(a) identificar en la secuencia de aminoácidos de uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con el primer GPCR original, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCr original, y

(b) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una ventana o ventanas de i más o menos 5 residuos, donde i es la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original;

2. Método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(a) identificar en la secuencia de aminoácidos de uno o más mutantes de un primer GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con el primer GPCR original, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPC<r>original, y

(b) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de 12 A del átomo de Cao dentro de una distancia de 8 A de cualquier átomo del residuo de aminoácidoi,dondeies la posición o posiciones correspondientes, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad aumentada en relación con el segundo GPCR original;

3. Método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(a) proporcionar uno o más mutantes de un primer GPCR original con una estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con el primer GPCR original

(b) identificar en un modelo de proteína de membrana estructural el motivo o motivos estructurales en los que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el primer GPCR original, y realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un motivo o motivos estructurales correspondientes en un segundo GPCR original, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original; en el que el segundo GPCR original (i) tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el primer GPCR original, (ii) puede alinearse con el primer GPCR original de modo que el motivo o motivos estructurales correspondientes pueden identificarse mediante alineación y (iii) es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original;

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uno o más mutantes del primer GPCR original en la etapa (a) se obtienen mediante un método que comprende:

(i) proporcionar uno o más mutantes de un primer GPCR original,

(iii) determinar si el o cada GPCR mutante cuando reside en una conformación particular tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad del primer GPCR original cuando reside en la misma conformación particular con respecto a la unión a ese ligando, y (iv) seleccionar aquellos mutantes que tienen estabilidad conformacional aumentada en comparación con el primer GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la afinidad de unión del uno o más mutantes del primer GPCR es sustancialmente igual o mayor que la afinidad de unión del progenitor por el ligando seleccionado.

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, en el que las etapas (i)-(iv) se repiten durante una o más rondas, representándose los mutantes seleccionados del primer GPCR que tienen una estabilidad aumentada en la etapa (iv) el GPCR original en una ronda posterior del método.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que en la etapa (ii) se seleccionan dos o más ligandos, la presencia de cada uno hace que el GPCR resida en la misma conformación particular.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que se selecciona un GPCR mutante en la etapa (iv) que tiene una capacidad reducida para unirse a un ligando de una clase diferente al ligando seleccionado en la etapa (ii) en comparación con su progenitor.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en el que se determina si el GPCR mutante seleccionado en la etapa (iv) puede acoplarse a una proteína G, o en el que se determina si el GPCR mutante seleccionado en la etapa (iv) puede unirse a una pluralidad de ligandos de la misma clase que el ligando seleccionador con una extensión y/u orden de clasificación de afinidad comparable al del GPCR original.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el uno o más mutantes del primer GPCR original en la etapa (a) se obtienen mediante un método que comprende:

(I) seleccionar uno o mutantes que tienen estabilidad conformacional aumentada en relación con un GPCR original según las etapas (i) a (iv) según cualquiera de las reivindicaciones 4-9,

(II) identificar la posición o posiciones de los residuos de aminoácidos mutados o residuos en el GPCR o los GPCR mutantes que se han seleccionado por una estabilidad conformacional aumentada, y

(III) sintetizar uno o más GPCR mutantes que contienen un aminoácido de reemplazo en una o más de las posiciones identificadas.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el uno o más mutantes del primer GPCR original en la etapa (a) contienen una pluralidad de mutaciones en comparación con el primer GPCR original.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el GPCR mutante del primer GPCR original es un receptor p-adrenérgico mutante tal como uno que, en comparación con su correspondiente receptor original, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor p-adrenérgico de pavo tal como se establece en la figura 9: Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gin 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338, opcionalmente en el que el receptor padrenérgico mutante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 20 % idéntica a la del receptor padrenérgico de pavo cuya secuencia se establece en la figura 9.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el GPCR mutante del primer GPCR original es un receptor de adenosina mutante tal como uno que, en comparación con su correspondiente receptor original, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de adenosina A<2>a humano tal como se establece en la figura 10: Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gin 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gin 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315, opcionalmente en el que el receptor de adenosina mutante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 20 % idéntica a la del receptor de adenosina A<2>a humano cuya secuencia se establece en la figura 10.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el GPCR mutante del primer GPCR original es un receptor de neurotensina mutante tal como uno que, en comparación con su correspondiente receptor original, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor de neurotensina de rata tal como se establece en la figura 11: Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, lie 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, Pro 399, opcionalmente en el que el receptor de neurotensina mutante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 20 % idéntica a la del receptor de neurotensina de rata cuya secuencia se establece en la figura 11.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el GPCR mutante del primer GPCR original es un receptor muscarínico mutante tal como uno que, en comparación con el correspondiente receptor muscarínico de tipo natural, tiene un aminoácido diferente en una posición que corresponde a una cualquiera o más de las siguientes posiciones según la numeración del receptor muscarínico humano tal como se establece en la figura 17: Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383 y Met 384, opcionalmente en el que el receptor muscarínico mutante tiene una secuencia de aminoácido que es al menos el 20 % idéntica a la del receptor de neurotensina de rata cuya secuencia se establece en la figura 17.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en el que el modelo de proteína de membrana estructural es de una proteína de membrana integral tal como una proteína de membrana integral que tiene al menos el 20 % de identidad de secuencia con el mutante del primer GPCR original en la etapa (a) a través del dominio proteico en el que el mutante tiene al menos un aminoácido diferente en relación con el primer GPCR original, o tal como una proteína de membrana integral que es un GPCR, opcionalmente un GPCR que es de la misma clase o familia de GPCR que el primer GPCR original, o en el que el modelo de proteína de membrana estructural es un modelo de receptor adrenérgico p2 humano o rodopsina bovina.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-16, en el que el motivo estructural es cualquiera de una interfaz helicoidal, un acodamiento de hélice, una hélice opuesta a un acodamiento de hélice, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica, una superficie de hélice que apunta hacia la bicapa lipídica en la capa límite hidrófoba-hidrófila, una región de bucle o un bolsillo de unión a proteínas.

18. Método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(b) identificar en la secuencia de aminoácidos del uno o más mutantes, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original; (c) determinar dentro de una distancia establecidadA del átomo de Ca o de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, el número de otras posiciones del modelo o el más de un modelo alineado en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original; y

(d) determinar si el número de otras posiciones representa un agrupamiento estadísticamente significativo; y (e) realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia dedA del átomo de Cao de cualquier átomo del residuo de aminoácido en la posición que corresponde al centro del agrupamiento estadísticamente significativo y en la que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original;

19. Método para producir un GPCR mutante con estabilidad conformacional aumentada en condiciones desnaturalizantes tales como calor, un detergente, un agente caotrópico o un pH extremo, en relación con su GPCR original, comprendiendo el método:

(b) identificar en la secuencia de aminoácidos del uno o más mutantes, la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original; (c) determinar dentro de una distancia establecidadA del átomo de Cao de cualquier átomo de un residuo de aminoácido en la posición o posiciones en las que el uno o más mutantes tienen un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original, el número de otras posiciones del modelo o el más de un modelo alineado en las que el uno o más mutantes tienen al menos un residuo de aminoácido diferente en comparación con el GPCR original; y

(d) determinar si el número de otras posiciones representa un agrupamiento estadísticamente significativo; determinar el centro de dos o más agrupamientos estadísticamente significativos identificados; y realizar una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos que define un segundo GPCR dentro de una distancia de x A de la posición que corresponde al centro de los dos o más agrupamientos estadísticamente significativos, para proporcionar uno o más mutantes de un segundo GPCR original con estabilidad conformacional aumentada en relación con el segundo GPCR original;

y en el que el uno o más mutantes de un GPCR original en la etapa (a) son uno o más mutantes modificados por ingeniería de un receptor acoplado a proteína G (GPCR) humano de tipo natural que tienen al menos un aminoácido reemplazado en comparación con el GPCR humano de tipo natural., y que tienen termoestabilidad conformacional aumentada en comparación con el GPCR humano de tipo natural;

20. Método según la reivindicación 18 ó 19, en el que el uno o más modelos tridimensionales es un modelo de uno cualquiera o más de un GPCR mutante definido en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, o en el que al menos 2, 3, 4, 5 ó 10 modelos están alineados, o en el que la distancia establecidadA del átomo de Caes de 12 A o menos, o en el que la distancia establecidadA de cualquier átomo es de 12 A o menos, o en el que el agrupamiento estadísticamente significativo es uno que es significativo al nivel del 95 % (p< 0,05).

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-20, que comprende además:

(I) seleccionar un ligando, siendo el ligando uno que se une al segundo GPCR original cuando el GPCR reside en una conformación particular;

(II) determinar si el o cada mutante del segundo GPCR original cuando reside en una conformación particular tiene estabilidad conformacional aumentada con respecto a la unión al ligando seleccionado en comparación con la estabilidad del segundo GPCR original cuando reside en la misma conformación particular con respecto a la unión a ese ligando, y

(III) seleccionar aquellos mutantes que tienen estabilidad conformacional aumentada en comparación con el segundo GPCR original con respecto a la unión al ligando seleccionado.

22. Método según la reivindicación 4 ó 21, en el que la conformación particular en la que reside el GPCR en la etapa (iii) o (II) corresponde a la clase de ligando seleccionado en la etapa (ii) o (I), y opcionalmente en el que el ligando seleccionado es de la clase de ligandos agonistas y la conformación particular es una conformación agonista, o el ligando seleccionado es de la clase de ligandos antagonistas y la conformación particular es una conformación antagonista.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-22, en el que el ligando es uno cualquiera de un agonista completo, un agonista parcial, un agonista inverso y un antagonista, o en el que el ligando es un polipéptido que se une al GPCR, tal como cualquiera de un anticuerpo, una anquirina, una proteína G, una proteína RGS, una arrestina, una GPCR cinasa, una tirosina cinasa receptora, una RAMP, una NSF, un GPCR, una subunidad NR1 o NR2a del receptor NMDA, o calcyon, o un fragmento o derivado de los mismos que se une al GPCR.

24. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-23, en el que la afinidad de unión del uno o más mutantes del segundo GPCR es sustancialmente igual o mayor que la afinidad de unión del segundo GPCR original por el ligando seleccionado.