CN101605810A - 嵌合的人甜味-鲜味和鲜味-甜味受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含一种T1R(T1R1或T1R2)的胞外部分或其变体或片段和另一种T1R(T1R1或T1R2)的跨膜部分或其变体或片段的嵌合味觉受体,优选与T1R3多肽和合适的G蛋白相关联。这种嵌合味觉受体可用于鉴定甜味和鲜味配体的测定法中,以及用于鉴定甜味和鲜味增强剂的测定法。此外,这些嵌合味觉受体和表达该受体的细胞可用于作图和确定特定的甜味和鲜味配体在哪里与它们各自的受体相互作用,并阐明受体激活的机制。

Description

嵌合的人甜味-鲜味和鲜味-甜味受体
发明领域
本发明涉及新的嵌合的人和啮鼠动物的味觉受体多肽、编码核酸序列、表达这些嵌合味觉受体多肽的细胞,以及它们在鉴定味觉调节剂,尤其是甜味和鲜味调节剂中的用途。
发明背景
人T1R家族味觉受体包括hT1R1、2和3。T1R属于C类G-蛋白偶联受体,并且每种C类GPCR由一个大的N端胞外结构域和一个C端7跨膜结构域组成。已经普遍知道hT1R1和hT1R3形成了调节鲜味转导的异聚受体(heteromeric receptor)并且其识别鲜味促味剂(tastant),而hT1R2和hT1R3形成调节甜味转导的异聚受体并且其识别甜味促味剂。因此已知鲜味受体(hT1R1/hT1R3)和甜味受体(hT1R2/hT1R3)均具有相同的亚基hT1R3。
本发明的简述和目标
本发明的一个目标是产生嵌合味觉受体多肽,其响应鲜味和/或甜味刺激和/或增强由其它化合物引起的鲜味和甜味(umami and/orsweet)。
本发明的另一个目标是在测定法中使用这种嵌合味觉受体多肽,用于鉴定本身调节甜味或鲜味和/或增强由其它化合物引起的鲜味和甜味的化合物。
更特别地,本发明的一个目标是通过组合T1R1和T1R2味觉受体基因的部分而产生编码嵌合味觉受体的DNA融合体,并且与相同或不同物种的T1R3味觉受体共表达而产生响应甜味和/或鲜味刺激或增强由其它化合物引起的鲜味和甜味的嵌合味觉受体。
更特别地,本发明的一个目标是产生嵌合味觉受体,其通过这样产生:将T1R1多肽,或编码DNA,优选hT1R1或mT1R1或rT1R1的胞外结构域的全部或部分与T1R2多肽或编码DNA,优选hT1R2、rT1R2或mT1R2或其部分的跨膜结构域的全部或部分组合,而产生鲜味-甜味嵌合味觉受体多肽或编码DNA。
而且更特别地,本发明的一个目标是产生嵌合味觉受体,其通过这样产生:将T1R2多肽或编码DNA,优选hT1R2、rT1R2或mT1R2的胞外结构域的全部或部分与T1R1多肽或编码DNA,优选hT1R1或mT1R1或rT1R1的跨膜结构域的全部或部分组合,而以产生嵌合的甜味-鲜味受体多肽或编码DNA。
本发明的另一个目标是提供包含于SEQ ID NO:1-4中的特异性hT1R1-2和hT1R2-1核酸序列和多肽序列。
本发明的另一个目标是在合适的宿主细胞中,优选HEK-293细胞中表达这些编码嵌合味觉受体的核酸序列,其另外优选表达G蛋白和T1R3核酸序列。
本发明的另一个目标是在测定法中使用这些细胞,用于鉴定调节甜味或鲜味的分子,例如鲜味和甜味味觉配体以及鲜味和甜味增强剂。
附图简述
图1包含了称为hT1R2-1的根据本发明的嵌合的甜味-鲜味受体的核酸序列(SEQ ID NO:1),所述hT1R2-1包含与人T1R1的跨膜结构域融合的人T1R2的胞外结构域。
图2包含了称为hT1R2-1的根据本发明的嵌合的甜味-鲜味受体的多肽序列(SEQ ID NO:2),所述hT1R2-1包含人T1R2的细胞外部分和人T1R1的跨膜部分。
图3包含了称为hT1R1-2的根据本发明的嵌合味觉受体的核酸序列(SEQ ID NO:3),所述hT1R1-2包含hT1R1的胞外结构域和hT1R2的跨膜结构域。
图4包含称为hT1R1-2的根据本发明的嵌合受体的多肽序列(SEQID NO:4),并包含本发明中使用的嵌合的G蛋白G16gust44的蛋白质序列(SEQ ID NO:5),嵌合的G蛋白G16gust44含有融合至味导素(gustducin)的44羧基端氨基酸的Gα16的N-端部分。
图5包含了天然的T1R2/T13、T1R1/T1R3,以及嵌合的甜味-鲜味hT1R2-1/T1R3和嵌合的鲜味-甜味hT1R1-2/T1R3的示意图。
图6包含了人和小鼠以及大鼠的T1R1、T1R2和T1R3的核酸序列和蛋白质序列(SEQ ID NO:6-17)。
图7包含了使用HEK-293细胞的钙成像试验的结果,该细胞表达图1中的嵌合hT1R2-1受体,结果显示除了环己氨基磺酸盐外,这种嵌合味觉受体响应试验的所有增甜剂(蔗糖、果糖、D-Trp、Acek、甘素(Dulcin))。
图8包含了比较不同增甜剂激活天然的hT1R2/hT1R3受体相较于嵌合hT1R2-1(SEQ ID NO:2)的有效浓度(EC50)的试验结果。
图9包含了试验结果,结果显示环己氨基磺酸盐增强了HEK-293细胞系中的天冬酰苯丙氨酸甲酯(aspartame)应答,所述细胞系稳定表达主体嵌合的hT1R2-1和未经修饰的hT1R3序列。
图10包含了一个试验,该试验显示环己氨基磺酸盐增强了在稳定的HEK-293细胞系中的D-色氨酸应答,所述细胞系表达hT1R2-1嵌合味觉受体和未经修饰的hT1R3序列。
图11包含了一个试验,该试验显示环己氨基磺酸盐增强了在稳定的细胞系中的蔗糖应答,所述细胞系表达主体hT1R2-1嵌合味觉受体和未经修饰的hT1R3序列。
图12包含了一个试验,该试验显示环己氨基磺酸盐增强了在稳定的HEK-293细胞系中的果糖应答,所述细胞系表达主体嵌合受体hT1R2-1和未经修饰的hT1R3序列。
图13包含了一个试验,该试验显示环己氨基磺酸盐增强了在稳定的HEK-293细胞系中由专利鲜味激动剂化合物(称为‘807)引起的应答,并显示鲜味化合物‘807激活了嵌合的hT1R2-1味觉受体,其中所述细胞系表达主体嵌合受体hT1R2-1和未经修饰的hT1R3序列。
图14包含了一个试验,该试验显示专利鲜味配体激动剂化合物‘807增强了表达hT1R2-1和hT1R3的稳定的HEK-293细胞系中的天冬酰苯丙氨酸甲酯应答。
图15包含了一个试验,该试验显示表达嵌合受体hT1R1-2(SEQ IDNO:3)和rT1R 3受体的稳定的HEK-293细胞系的应答,并显示这种嵌合受体响应鲜味配体L-Glu、L-Asp和L-AP4,以及显示了该响应由IMP或GMP的存在增强。
图16显示MSG激活根据本发明的嵌合的hT1R1-2/rT1R3受体通过IMP增强。
发明详述
在具体描述本发明前,给出了以下定义。
术语“T1R”族包括这样的多态变异体、等位基因、突变体和同系物:(1)与下文中,以及Zuker(同上)(2001)和Adler(同上)(2001)申请案中公开的T1R具有约30-40%的氨基酸序列同一性,更特别是约40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%的氨基酸序列同一性,所述申请案通过引用约25个氨基酸,优选50-100个以上的氨基酸的窗口作为参考;(2)特异性结合对抗包含选自下文中公开的T1R,及其保守修饰的变体的免疫源的抗体;(3)在严格条件下与选自在下文中公开的T21DNA序列,及其保守修饰的变体的序列特异性杂交(大小为至少约100,任选至少约500-1000个核苷酸);(4)含有与选自下文中公开的T1R氨基酸序列的氨基酸序列至少约40%一致的序列;或者(5)由在严格杂交条件下与所述T1R序列杂交的引物扩增。
特别地,这些“T1R”包括具有本申请中提供的核酸序列和氨基酸序列的称为hT1R1、hT1R2、hT1R3、rT1R1、rT1R2、rT1R3、mT1R1、mT1R2和mT1R3的味觉受体GPCR,及其变体、等位基因、突变体、直系同源物和嵌合体,其特异性地结合和/或响应甜味或鲜味配体包括激活剂、抑制剂和增强剂。优选地,这里的T1R是源自T1R1多肽和T1R2多肽或它们相应的DNA编码序列的部分的嵌合序列。如在此举例说明的,根据本发明的优选嵌合T1R含有一个T1R,即T1R1或T1R2的胞外区和另一个T1R(T1R1或T1R2)的跨膜区。
从拓扑上来说,某些化学感受性GPCR具有“N-端结构域”、“胞外结构域”、含有7个跨膜区以及相应的胞质和细胞外环区的“跨膜结构域”、“胞质区”和“C端区”(参见,例如Hoon等,Cell,96:541-51(1999);Buck&Axel,Cell,65:175-87(1991))。这些区可用本领域技术人员已知的方法进行结构鉴定,例如鉴定疏水结构域和亲水结构域的序列分析程序(参见,例如Stryer,Biochemistry,(3rded.1988);也参见任意的许多基于互联网的序列分析程序,如在dot.imgen.bcm.tmc.edu中找到的那些)。这些区可用于产生嵌合蛋白质并可用于本发明的体外测定,例如配体结合测定。
因此,“胞外结构域”指从细胞膜突出并暴露于细胞的细胞外面的T1R多肽的结构域。该区将包括暴露于细胞的细胞外面的“N-端结构域”,以及暴露于细胞的细胞外面的跨膜结构域的细胞外环区,即在跨膜区2和3、跨膜区4和5、跨膜区6和7之间的细胞外环区。“N-端结构域”从N端开始并延伸到接近跨膜区的起始部分的区域。这些胞外区可用于体外配体结合测定,可溶相(soluble phase)和固相两者。此外,在下面描述的跨膜区也可与胞外区联合或独自参与配体结合,并因此也可用于体外配体结合测定。人、大鼠和小鼠T1R1、T1R2和T1R3的胞外区或结构域包含于图6中。
含有7个跨膜“区”的“跨膜结构域”指位于细胞膜内的T1R多肽的结构域,并且还可包含相应的胞质(细胞内)和细胞外的环区,也称为跨膜“区”。7个跨膜区以及细胞外和胞质环区可用标准方法鉴定,如用在Kyte&Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105-32(1982))中描述的,或在Stryer(同上)中描述的方法鉴定。人、大鼠和小鼠T1R1、T1R2和T1R3的跨膜结构域或跨膜区也包含于图6中。
“胞质结构域”指面向细胞内部的T1R蛋白质的结构域,例如,“C端结构域”和跨膜结构域的细胞内环区,例如在跨膜区1和2、跨膜区3和4、跨膜区5和6之间的细胞内环区。“C端结构域”指从最后的跨膜区末端跨越到蛋白质的C端的区域,并且其通常位于细胞质内。
术语“7-跨膜受体”指属于跨膜蛋白质超家族的多肽,其具有跨越细胞膜7次的7个区(因此,这7个区称为“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)。
术语“配体-结合区”指源于化学传感或味觉受体的序列,其实质上整合了跨膜结构域II至VII(TM II至VII)。该区可能能够结合配体,并且更特别地,结合引起味觉的化合物。
术语“质膜转运结构域(plasma membrane translocationdomain)”或简称为“转运结构域”表示一种多肽结构域,当其整合进多肽编码序列的氨基端时,能以高效率“陪伴(chaperone)”或“转运”该杂合(“融合”)蛋白至细胞质膜。一个示例性的“转运结构域”源自人视紫红质受体多肽(一种7一跨膜受体)的氨基端。另一种已知的转运结构域是牛视紫红质序列并也可用于促进转运。源于视紫红质的序列在转运7-跨膜融合蛋白至质膜中是特别有效的。
在用于检测调节T1R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定法的上下文中,短语“功能效应(functional effect)”包括对间接或直接处于所述受体影响下的任何参数的测定,例如,功能、物理和化学效应。其包括体外、体内和离体的配体结合、离子流、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或脱磷酸、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如,cAMP、cGMP、IP3或细胞内Ca2+)的改变,并还包括其它的生理效应,例如神经递质或激素释放的增加或减少。
“测定功能效应”是指用于增加或减少间接或直接处于T1R家族成员的影响下的参数,例如功能、物理和化学效应的化合物的测定法。这种功能效应可通过本领域技术人员已知的任何手段测量,例如光谱特征(例如荧光指数、吸收率指数、折射率)、流体动力学性质(例如形状)、层析性能或可溶性性质的改变、膜片钳、电压敏感性染料、全细胞电流、放射性同位素流量(radioisotope efflux)、可诱导的标记、卵母细胞的T1R基因表达;组织培养细胞T1R表达;T1R基因的转录激活;配体结合测定;电压、膜电位和电导率改变;离子流测定;细胞内第二信使例如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3)的改变;细胞内钙水平的改变;神经递质释放等。
T1R蛋白质受体的“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”可交换使用,指用有关味觉转导的体外和体内测定法鉴定的抑制性、激活性或调节性分子,例如配体、激动剂、拮抗剂,以及它们的同系物和模拟物。抑制剂是这样的化合物,其例如结合至T1R蛋白质受体、部分或完全阻断刺激、减少、防止、延缓激活、失活、失敏或下调味觉转导,例如拮抗剂。激活剂是这样的化合物,其例如结合至T1R蛋白质受体、刺激、增加、打开、激活、促进、增强激活作用;致敏或上调味觉转导,例如激动剂。调节剂包括这样的化合物,其例如改变受体与细胞外蛋白质的相互作用,所述的细胞外蛋白质结合激活剂或抑制剂;G蛋白;激酶(例如,视紫红质激酶和β-肾上腺素能受体激酶的同系物,它们参与了受体的失活和脱敏);以及抑制蛋白(arrestin),其也使受体失活和脱敏。调节剂包括遗传修饰形式的T1R家族成员,例如具有改变的活性,以及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小的化学分子等。在本发明中,调节剂特别包括甜味配体(激动剂或拮抗剂)、鲜味配体(激动剂或拮抗剂)、甜味增强剂和鲜味增强剂以及甜味或鲜味抑制剂。
这种用于抑制剂或激活剂的测定法包括,例如在细胞或细胞膜中表达T1R家族成员;在存在或没有调节,例如甜味和鲜味化合物的化合物时施用推定的调节剂化合物;并然后测定对味觉转导的功能效应,如上文中描述的。将含有用潜在的激活剂、抑制剂或调节剂处理过的T1R家族成员的样品或检测品与无抑制剂、激活剂或调节剂的对照样品比较,用以检验调节的程度。将照样品(未经调节剂处理)赋为100%的相对T1R活性值。当T1R活性值相对于对照为约80%,任选50%或25-0%时,实现了T1R的抑制。当T1R活性值相对于对照为约110%,任选150%,任选200-500%或1000-3000%更高时,实现了T1R的激活。在本发明中,这些测定法将采用嵌合T1R,其含有T1R1或T1R2的细胞外部分的全部或部分和另一种T1R(即T1R2或T1R1)的跨膜结构域的全部或部分。
如在此使用的,术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”指没有其它的、不同的化合物的状态,在其天然状态中本发明化合通常与所述的其它的、不同的化合物在一起。优选地,“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”表示以重量计,组合物含有给定样品的质量的至少0.5%、1%、5%、10%或20%,并最优选至少50%或75%。在一个优选的实施方案中,这些术语指以重量计,本发明化合物含有给定样品的质量的至少95%。如在此使用的,当涉及核酸或蛋白质时,核酸或蛋白质的术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”,也指与哺乳动物,尤其是人体内天然存在的纯化或浓度状态不同的状态。大于哺乳动物(尤其人)体内天然存在的任何水平的纯化或浓度,包括:(1)从其它相关的结构或化合物纯化或(2)与在哺乳动物(尤其人)体内通常不与其关联的结构或化合物关联,是在“分离的”意义范围之内。根据本领域技术人员已知的多种方法和过程,可以分离在此描述的核酸或蛋白质或者核酸或蛋白质的类型,或相反将其与本来通常不与其关联的结构或化合物关联。
如在此使用的,术语“分离的”在涉及核酸或多肽时,指不同于哺乳动物(尤其人)体内天然存在的纯化或浓度状态。大于体内天然存在的任何水平的纯化或浓度,包括:(1)从其它天然存在的相关结构或化合物纯化,或(2)与体内通常不与其关联的结构或化合物关联,是在如在此使用的“分离的”意义范围之内。根据本领域技术人员已知的多种方法和过程,可以分离在此描述的核酸或多肽,或相反将其与本来通常不与其关联的结构或化合物关联。
如在此使用的,术语“扩增”指使用任意合适的扩增方法用于产生或检测重组的或天然表达的核酸,如下文中详细描述的。例如,本发明提供了方法和试剂(例如,特异性的寡核苷酸引物对),用于在体内或体外扩增(例如通过聚合酶链式反应,PCR)本发明的天然表达的核酸(例如,基因组的或mRNA)或重组的核酸(例如,cDNA)(例如,本发明的引起味觉的化合物-结合序列)。
术语“表达载体”指为了在任意的细胞,包括原核细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中体外或体内组成型或诱导型表达本发明的核酸序列的任意重组表达系统。该术语包括线性的或环状的表达系统。该术语包括保持为游离型基因或整合进宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可具有自我复制的能力或不具有该能力,即,在细胞中只进行瞬时表达。该术语包括只含重组核酸转录所需的最少元件的重组表达盒。
术语“库”表示为不同核酸或多肽分子的混合物的制备物,例如通过用简并引物对扩增核酸而产生的重组产生的感觉的,尤其是味觉的受体配体-结合区的文库,或分离的整合了扩增的配体-结合区的载体的集合,或每种随机用至少一种编码味觉受体的载体转染的细胞混合物。
术语“核酸”或“核酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸。该术语包括含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸,即寡核苷酸。该术语还包括具有合成骨架的类似核酸的结构。
除非另外说明,特殊的核酸序列还隐含地包括其经保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)和互补序列,以及明确指出的序列。具体而言,简并密码子取代可通过产生这样的序列来实现:例如该序列中一个或多个选择的密码子的第三个位置用混合的-碱基(mixed-base)和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等,Nucleic AcidRes.,19:5081(1991);Ohtsuka等,J.Biol.Chem.,260:2605-08(1985);Rossolini等,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多聚核苷酸交换使用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在这里可交换地使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物,并适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
在此描述的“转运结构域”、“配体-结合区”和嵌合受体的组合物也包括具有基本符合示例性序列的结构和活性的“类似物”或“保守变体”以及“模拟物”(“肽模拟物”)。因此,术语“保守变体”或“类似物”或“模拟物“指具有经修饰的氨基酸序列而该变化基本上没有改变该多肽的(保守变体的)结构和/或活性的多肽,如在此定义的。这些包括氨基酸序列的经保守修饰的变体,即氨基酸取代、添加或删除对蛋白质活性不关键的那些残基,或用具有相似性质(例如,酸性、碱性、正电性或负电性、极性或非极性等)的残基取代氨基酸,这样即使关键的氨基酸的取代也基本上不会改变结构和/或活性。
更特别地,“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特殊的核酸序列,经保守修饰的变体指编码相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸,或者其中核酸不编码氨基酸序列时指基本上相同的序列。由于遗传密码子的简并,大量的功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质。
例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在丙氨酸由一个密码子确定的每个位置处,可将该密码子改变成任意描述的相应密码子而不会改变编码的多肽。
这种核酸变异是“沉默变异(silent variation)”,其为经保守修饰的变异的一种。这里的编码多肽的每种核酸序列也描述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到,可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG,其通常为甲硫氨酸的唯一密码子,以及TGG,其通常为色氨酸的唯一密码子)来产生功能相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每种沉默变异在每种描述的序列中是隐含的。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域所熟知的。例如,选择保守取代的一个示例性准则包括(初始的残基之后为示例性的取代):ala/gly或ser;arg/lys;asn/gln或his;asp/glu;cys/ser;gln/asn;gly/asp;gly/ala或pro;his/asn或gln;ile/leu或val;leu/ile或val;lys/arg或gln或glu、met/leu或tyr或ile;phe/met或leu或tyr;ser/thr;thr/ser;trp/tyr;tyr/trp或phe;val/ile或leu。一个备选的示例性准则使用了下面的6个组,每组含有彼此为保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、4)精氨酸(R)、赖氨酸(I);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W),(同样参见,例如Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984);Schultz和Schimer,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag(1979))。本领域的技术人员将理解,上面确定的取代不是唯一可能的保守取代。例如,为了某些目的,人们可以将所有带电荷的氨基酸看作是彼此保守的取代,而不管它们是带正电荷还是带负电荷。而且,改变、添加或删减编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的个别的取代、删减或添加,也可认为是“经保守修饰的变异”。
术语“模拟物”和“肽模拟物”指具有与多肽,例如,本发明的转运结构域、配体-结合区或嵌合受体基本相同的结构和/或功能特征的合成化合物。模拟物可完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成,或者可以是部分天然的肽氨基酸和部分非-天然的氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物还可以整合任意数量的天然氨基酸的保守取代,只要这种取代也基本上不会改变该模拟物的结构和/或活性。
与作为保守变体的本发明多肽一样,常规试验将确定模拟物是否在本发明的范围内,即确定它的结构和/或功能基本没有改变。多肽模拟物组合物可以含有非天然结构成分的任意组合,所述的非天然结构成分通常来自3种结构组:a)不同于天然的酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团;b)非天然的残基代替天然存在的氨基酸残基;或c)诱导二级结构拟态(mimicry),即诱导或稳定二级结构,例如β-转角、γ-转角、β-片层、α-螺旋构象等的残基。多肽在其残基的全部或一些是通过不同于天然肽键的化学手段连接时可鉴定为模拟物。个别的肽模拟物残基可通过肽键、其它化学键或偶联手段,例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能的马来酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)连接。可作为传统的酰胺键(“肽键”)连接的备选的连接基团包括,例如酮亚甲基(例如,-C(=O)-CH2替换-C(=O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2NH)、乙烯、链烯烃(CH=CH)、醚(CH2O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4)、噻唑、反酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见,例如Spatola,Chemistry andBiochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,267-357,Marcell Dekker,Peptide Backbone Modifications,NY(1983))。多肽也可依据含有全部或一些非天然的残基代替天然存在的氨基酸残基而鉴定为模拟物;非天然的残基在科学和专利文献中充分描述。
“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组分。例如,有用的标记包括32P、荧光染料、电子高密度试剂(electron-dense reagent)、酶(例如,如通常在ELISA中使用的)、生物素、异羟洋地黄毒苷配基,或可以例如通过整合放射性标记进肽中而使得可检测或可以用于检测与该肽特异性反应的抗体的半抗原和蛋白质。
“经标记的核酸探针或寡核苷酸”是这样一种探针或寡核苷酸:其通过连接物或化学键共价结合至标记物,或者通过离子键、范德华力、静电或氢键非共价结合至标记物,这样该探针的存在可通过检测结合至探针的标记物的存在来测定。
如在此使用的,“核酸探针或寡核苷酸”定义能够通过一种或多种类型的化学键,通常通过互补碱基配对,通常通过氢键形成来结合至互补序列的靶标核酸的核酸。如在此使用的,探针可包括天然的碱基(即A、G、C或T)或经修饰的碱基(7-脱氮鸟嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷等)。此外,探针中的碱基可通过不同于磷酸二酯键的键连接,只要它不干扰杂交。因此,例如,探针可以是其中组成的碱基通过肽键而不是磷酸二酯键连接的肽核酸。本领域的技术人员将理解,取决于杂交条件的严格性,探针可结合与探针序列缺少完全互补性的靶序列。探针任选用例如同位素、发色团、发光团、色原体直接标记,或者用例如抗生蛋白链菌素复合物可随后结合至其上的生物素间接标记。通过检测探针的存在或不存在,人们可检测选择序列或子序列的存在或不存在。
术语“异源的”在用于核酸的部分时表示,该核酸含有两个或多个子序列,所述子序列在本质上彼此不具有相同的亲缘关系。例如,核酸通常是重组产生的,具有设计来产生新的核酸的、来自不相关的基因的两个或多个序列,例如,来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区。同样,异源蛋白质表示该蛋白质含有两个或多个子序列所述子序列在本质上不具有相同的亲缘关系(例如,融合蛋白)。
“启动子”定义为引导核酸转录的一组核酸序列。如在此使用的,启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列,例如,在聚合酶11型启动子的情形中,为TATA元件。启动子还任选包括远端增强子(distal enhancer)或抑制元件(repressor element),其可位于离转录起始位点数千个碱基对之多处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。术语“有效连接的”指核酸表达控制序列(例如启动子,或一组转录因子结合位点)和另一核酸序列之间的功能性连接,其中所述的表达控制序列引导对应所述的另一序列的核酸的转录。
如在此使用的,“重组”指合成的或相反在体外操纵产生的多聚核苷酸(例如,“重组多聚核苷酸”),指在细胞或其它生物系统中用重组多聚核苷酸产生基因产物的方法,或者指由重组多聚核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组手段”还包括将具有多个来自不同来源的编码区或结构域或启动子序列的核酸连接进表达盒或载体中,用于表达,例如诱导或组成表达含有本发明的转运结构域的融合蛋白和用本发明引物扩增的核酸序列。
短语“选择性(或特异性)杂交”指当核苷酸序列存在于复杂混合物(例如,整个细胞或文库DNA或RNA)中时,在严格杂交条件下分子仅与特定的核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。
短语“严格杂交条件”指这样一种条件:在该条件下探针将与其靶标子序列杂交,通常是在核酸的复杂混合物中,但是不会与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的,并且在不同的环境下将会不同。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导在Tijssen,Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)中找到。通常,在确定的离子强度、pH下,选择严格条件为比特定序列的热解链温度(Tm)约低5-10℃。Tm指这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下):在该温度下,平衡时,50%的与靶标互补的探针与靶序列杂交(在靶序列过量存在时,在Tm下,平衡时50%的探针被占据)。严格条件是其中盐浓度低于约1.0M钠离子,通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐),pH为7.0-8.3,并且对于短的探针(例如10-50个核苷酸)温度至少约30℃,而对于长的探针(例如大于50个核苷酸)温度至少约60℃的那些条件。严格条件也可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺实现。对于选择性或特异性杂交,阳性信号是背景的至少2倍,任选是背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件可以是如下:50%甲酰胺、5xSSC和1%SDS,在42℃下孵育,或者5xSSC、1%SDS,在65℃下孵育,在65℃下于0.2xSSC和0.1%SDS中洗涤。这种杂交和洗涤步骤可进行例如1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。
如果它们编码的多肽基本相关,在严格条件下不互相杂交的核酸仍然是基本相关的。例如,当核酸的一个拷贝用遗传密码允许的最大密码子简并产生时出现这种情况。在这种情形中,核酸通常在中度严格杂交条件下杂交。示例性的“中度严格杂交条件”包括在37℃下于40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲液中杂交,并在45℃下于1xSSC中洗涤。这种杂交和洗涤步骤可以进行例如1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。阳性杂交是背景的至少2倍。一般技术人员将容易认识到,可以利用备选的杂交和洗涤条件来提供类似的严格性。
“抗体”指特异性结合和识别抗原的含有来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括k、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及多种免疫球蛋白的可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε,其又分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成,每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每一条链的N-端确定了主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
“嵌合抗体”是这样一种抗体分子:在该抗体分子中,(a)恒定区或其部分经改变、取代或交换,以致抗原结合位点(可变区)连接至不同的或改变的类型、效应子作用(effector function)和/或物种的恒定区,或连接至赋予该嵌合抗体新特性的完全不同的分子,例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等;或(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或代换。
“抗-T1R”抗体是特异性结合由T1R基因、cDNA或其子序列编码的多肽的抗体或抗体片段。
术语“免疫测定法”是一种用抗体来特异性结合抗原的测定法。免疫测定法的特征是利用特殊抗体的特异性结合特性来分离、靶向和/或定量抗原。
短语“特异性(或选择性)结合”至抗体或,“特异性(或选择性)免疫反应”,在涉及蛋白质或肽时,指确定蛋白质的异源群体中和其它生物制品中的蛋白质存在的结合反应。因此,在指定的免疫测定法条件下,特异性抗体至少两倍于背景地结合至特定蛋白质,并基本上不会显著量地结合样品中存在的其它蛋白质。在该条件下特异性结合抗体可能需要根据其对特殊蛋白质的特异性而选择的抗体。
例如,可选择产生来对抗来自特定物种例如大鼠、小鼠或人的T1R家族成员的多克隆抗体以只获得这样的克隆抗体:其与T1R多肽或其致免疫部分特异性地发生免疫反应,且不与其它蛋白质反应,除了所述T1R多肽的直系同源物或多态变异体及等位基因外。这种选择可通过筛减掉与来自其它物种的T1R分子或其它T1R分子交叉反应的抗体而实现。也可选择只识别T1R GPCR家族成员而不识别来自其它家族的GPCR的抗体。多种免疫测定法形式可用于选择与特殊蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如,固相ELISA免疫测定法常规用于选择与蛋白质特异性免疫应应的抗体(参见,例如Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,(1988),关于可用于测定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述)。通常特异性或选择性反应将是背景信号或背景噪声的至少2倍,并更典型地是大于10-100倍于背景。
短语“选择性地与...结合”指核酸与另一核酸“选择性地杂交”的能力,如上定义的,或指抗体与蛋白质“选择性(或特异性)”结合的能力,如上定义的。
术语“表达载体”指为了在任意的细胞,包括原核细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中体外或体内组成型或诱导型表达本发明的核酸序列的任意重组表达系统。该术语包括线性的或环状的表达系统。该术语包括保持为游离型基因或整合进宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可具有自我复制的能力或不具有该能力,即,在细胞中只进行瞬时表达。该术语包括只含重组核酸转录所需的最少元件的重组表达盒。
“宿主细胞”表示含有表达载体并支持该表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌细胞,或真核细胞例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞如CHO、HeLa、HEK-293等,如培养的细胞、外植体,以及体内细胞。
基于上述内容,本发明涉及这样的发现:可构建含有相同或不同物种的T1R1和T1R2的部分的嵌合受体,该嵌合受体在与相同或不同物种的完整或经修饰的T1R3序列共表达时特异性地响应鲜味和/或甜味化合物,并且这些嵌合味觉受体的激活通过甜味或鲜味增强化合物而增强。因此,这些嵌合受体可用于测定法中来筛选甜味和鲜味配体(促味剂),以及用于筛选增强或抑制由其它甜味或鲜味化合物引起的甜味或鲜味味觉的化合物。
如在图1-4中显示的,为了确定主体嵌合受体在用于鉴定味觉调节化合物的基于细胞的测定法中的效力,本发明者构建了称为hT1R2-1的、含有hT1R2和hT1R1的部分的嵌合味觉受体,其由hT1R2N-端胞外结构域和hT1R1C端7-跨膜结构域组成,以及含有hT1R1胞外结构域和hT1R2C端7-跨膜结构域的hT1R1-2。当这些嵌合受体在稳定表达该嵌合受体以及杂乱嵌合G蛋白G16-t25或G16g44的HEK-293细胞系中与人或啮鼠动物T1R3序列共表达时,得到的嵌合的甜味-鲜味嵌合受体或嵌合的鲜味-甜味受体是有功能的并且特异性地响应甜味和/或鲜味配体化合物和增强剂,其中所述的G16-t25或G16g44分别含有Gα16的N-端部分和转导素或味导素的25或44个羧基-端氨基酸。
特别地,据显示hT1R2-1(SEQ ID NO:1和2)特异性地响应增甜剂和鲜味化合物两者,并且显示该受体的活性通过甜味激动剂环己氨基磺酸盐增强并通过称为‘807和‘336的鲜味化合物激活,‘807和‘336在更低的浓度时也起到增强剂的作用。同样,据显示该嵌合受体不响应IMP或MSG,并且还显示IMP对由其它鲜味化合物引起的应答无增强效应。这表明hT1R1的细胞外区不是所有鲜味化合物与鲜味受体相互作用所必需的,但是它的确影响了MSG和IMP相互作用并且是该作用所需的。而且,显示环己氨基磺酸盐(天然受体的一种甜味激动剂)具有增强剂性质的结果表明,该化合物可与不同于它与天然甜味受体相互作用时的味觉受体部分相互作用。
特别是,据显示hT1R1-2(SEQ ID NO:3和4)响应鲜味化合物包括L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-AP4,并且该嵌合味觉受体的活性通过5’核苷酸IMP和GMP增强。正如所注意到的,这些结果表明hT1R1的细胞外部分参与识别一些鲜味配体和它们的增强剂。相反,包括糖类、甜味氨基酸(sweet amino acid)和合成的增甜剂的试验的甜味化合物都未激活hT1R1-2(SEQ ID NO:3和4)。
更特别地,本发明者产生了稳定的HEK-293细胞系,该细胞系组成型表达hT1R2-1或hT1R1-2和T1R3序列(即hT1R3或rT1R3),以及嵌合的G蛋白G16-g44或G16-t25,G16-g44由融合至味导素的最后44个氨基酸的Gα16的N-端部分组成,G16-t25由Gα16的N-端部分和由编码转导素的C端尾部(最后的25个氨基酸残基)的密码子取代的最后的25个密码子组成。因此在得到的嵌合的G蛋白中,Gα16的最后25个氨基酸为转导素蛋白质序列的最后25个氨基酸残基取代,或为源自味导素的最后44个氨基酸取代。
采用表达hT1R2-1的稳定的HEK-293细胞系,本发明者试验了包括蔗糖、果糖、D-色氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯、环己氨基磺酸盐、糖精和甘素的增甜剂的效应。(图7)除了环己氨基磺酸盐,所有这些增甜剂激活了hT1R2-1/hT1R3嵌合受体,表明hT1R2C端7-跨膜结构域不是甜味受体(hT1R2/hT1R3)与这些增甜剂相互作用所必需的。如图9-12中显示的,环己氨基磺酸盐增强了通过天冬酰苯丙氨酸甲酯、D-色氨酸、蔗糖和果糖对该嵌合受体的激活。如图13中显示的,专利鲜味配体‘807诱导了该嵌合受体的活性,并且该活性通过环己氨基磺酸盐得以进一步增强。
在另外的实验中,本发明者还试验了多种鲜味化合物和增强剂对该稳定的细胞系的作用,包括L-谷氨酸单钠盐(MSG)、IMP、‘807和‘336对嵌合的HT1R2-1受体的作用。发现MSG或IMP对所述嵌合的甜味-鲜味受体没有影响。而且,IMP对在稳定细胞系中表达的受体的活性没有增强效应,表明hT1R1N-端胞外结构域显然是MSG/IMP与鲜味受体(hT1R1/hT1R3)相互作用所需的。使用相同的稳定的HEK293细胞系还观察到,名为‘807和‘336的专利鲜味配体强烈激活了该嵌合受体。这些结果将说明,hT1R1N-端结构域显然不是这些化合物与鲜味受体相互作用并激活鲜味受体所必需的。
本发明者试验了环己氨基磺酸盐作为增强剂的作用,因为环己氨基磺酸盐是本发明者先前已证明与hT1R3C端7-跨膜结构域相互作用的增甜剂。如所提到的,先前发现环己氨基磺酸盐是甜味受体(hT1R2/hT1R3)的激动剂和鲜味受体(hT1R1/hT1R3)的增强剂。因此,本发明者进行了试验来阐明环己氨基磺酸盐对主体嵌合hT1R2-1受体响应天然的和合成的甜味配体(包括天冬酰苯丙氨酸甲酯、D-色氨酸、蔗糖、果糖)的影响,和对‘807的效应的影响,反之亦然,以及对‘807对天冬酰苯丙氨酸甲酯应答的效应的影响。
特别是如图9-12中显示的,观察到环己氨基磺酸盐增强了hT1R2-1对多种增甜剂(天冬酰苯丙氨酸甲酯、D-色氨酸、蔗糖、果糖)的应答,并观察到环己氨基磺酸盐独自不能激活该甜味-鲜味嵌合受体(hT1R2-1/hT1R3),但增强了其在稳定的hT1R2-1/hT1R3细胞系中对该增甜剂和鲜味化合物‘807和‘336的应答。这些结果显示,环己氨基磺酸盐(甜味受体(hT1R2/hT1R3)的激动剂)对该甜味-鲜味嵌合受体(hT1R2-1/hT1R3)起类似增强剂的作用。
如所提到的,‘807和‘336显示与hT1R1C端跨膜结构域相互作用。除了激活甜味-鲜味嵌合受体,还观察到‘807和‘336在更低的浓度时增强了所述的嵌合的甜味-鲜味受体的活性。
如上面提到的,还用表达嵌合的hT1R1-2受体、嵌合的G16gust44蛋白质,以及大鼠T1R3序列的HEK-293细胞系进行了试验,试验显示这种嵌合味觉受体响应了鲜味化合物并且其活性通过IMP和GMP增强。
因此,基于上述内容,根据本发明的嵌合-甜味-鲜味嵌合受体或嵌合的鲜味-甜味受体,以及表达这些嵌合味觉受体的稳定的或瞬时的细胞系可用于鉴定甜味增强剂、鲜味增强剂、增甜剂和鲜味分子。而且,这些嵌合味觉受体和表达这些嵌合味觉受体的细胞系可用于作图研究(mapping study)和功能研究,用以确定甜味和鲜味配体在哪些残基处与它们各自的味觉受体相互作用。而且,这些分子可用于阐明甜味和鲜味受体的激活以及激活的增强的机理。
如下文中进一步详细论述的,这些杂合受体可用于申请者较早的有关T1R的申请案中公开的任意筛选测定法,包括在2001年7月3日申请的US序列号09/897,427和在2002年6月26日申请的US序列号10/179,373。将这些专利申请案和其中引用的参考文献在此通过全文引入作为参考。此外,如下面讨论的,这些杂合受体可用在这里公开的任意表达载体和细胞表达。然而,用于表达的优选细胞包括通常在GPCR测定法中使用的细胞,例如HEK-293、CHO、COS、MDK、BHK、猴L细胞和(蛙)卵母细胞。
在基于功能细胞的测定法例如在下文中论述的那些中,所述的嵌合受体将优选与合适的G蛋白例如杂乱G蛋白如Gα15、Gα16、转导素、味导素、Gq蛋白、G i蛋白或嵌合G蛋白如源自Gα16和味导素的嵌合蛋白质一起表达。在这里举例说明的是源自G16和转导素或味导素的嵌合G蛋白。
而且,应该理解,虽然本申请案举例说明了具体的甜味-鲜味和嵌合的鲜味-甜味核酸及蛋白质序列,本发明进一步考虑它们的变体,例如与之具有至少80%序列同一性、更优选与之具有至少90%序列同一性,并且更典型地与之具有95、96、97、98或99%序列同一性的核酸序列和多肽。类似地,这些嵌合的序列可与野生型或变体T1R3序列,即与人或啮鼠动物T1R3具有至少80%序列同一性,更典型地与之具有至少90%序列同一性,并且更典型地与之具有至少95、96、97、98或99%序列同一性的变体一起表达。
用主体嵌合味觉受体鉴定的鲜味和甜味配体以及增强剂的味觉调节作用将优选在人或动物品尝试验证实。例如,将证实它们单独或与其它化合物(甜味化合物或鲜味化合物)联合调节甜味或鲜味。可将这些化合物在多种组合物包括食物、饮料、药物和化妆品中用作风味添加剂。
优选地,这些测定法将利用表达编码hT1R的DNA的试验细胞,所述hT1R具有其中一种在下文中确定的氨基酸序列。然而,期望保留这些嵌合的甜味-鲜味或鲜味-甜味受体的功能特性,即响应一些甜味或鲜味化合物或其增强剂化合物,的这些受体多肽的片段、直系同源物、变体或嵌合体在这些测定法中也将是有用的。这些变体的实例包括剪接变体、单核苷酸多态性、等位基因变体,以及通过重组或化学手段产生的突变体,或天然存在的突变体。用于分离和表达T1R的手段在下文中陈述,所述的T1R用于本发明的测定法以及用于考虑用于本发明的测定法中,以鉴定抑制这些受体的激活的化合物。
T1R的分离和表达
本发明的T1R或其片段或变体的分离和表达可以用基于本申请案中公开的T1R核酸序列构建的探针或引物,通过成熟完善的克隆方法实现。相关的T1R也可用在此公开的序列和已知的基于计算机的搜索方法,例如BLAST序列搜索来从人或其它物种的基因组数据库中鉴定。在一个特殊的实施方案中,在此公开的假基因(pseudogene)可用于鉴定功能等位基因或相关的基因。
然后可将表达载体用于感染或转染宿主细胞用于功能性表达这些序列。这些基因和载体可在体外或体内产生和表达。技术人员将认识到,用于改变和控制核酸表达的理想表现型可通过调控本发明载体内的基因和核酸(例如,启动子、增强子等)的表达或活性获得。可以使用描述用于增加或减少表达或活性的任意已知方法。本发明可与本领域已知的任何方法或实验设计协同实践,这在科学和专利文献中有详细的描述。
备选地,这些核酸可通过熟知的化学合成技术在体外合成,如例如在Carruthers,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-18(1982);Adams,Am.Chem.Soc.,105:661(1983);Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440-3444(1997);Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373-380(1995);Blommers,Biochemistry33:7886-7896(1994);Narang,Meth.Enzymol.68:90(1979);Brown,Meth.Enzymol.68:109(1979);Beaucage,Tetra.Lett.22:1859(1981);U.S.Pat.No.4,458,066中描述的。双链DNA片段可随后通过合成互补链并将这两条链在合适的条件下一起退火获得,或通过用合适的引物序列,利用DNA聚合酶添加互补链获得。
用于操作核酸,例如用于产生序列突变、亚克隆、标记探针、序列测定、杂交等的方法在科学和专利文献中有详细描述。参见,例如Sambrook,ed.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(1989);Ausubel,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1997);Tijssen,ed.,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology:Hybridization With NucleicAcid Probes,Part I,Theory and Nucleic Acid Preparation,Elsevier,N.Y.(1993)。
核酸、载体、壳体、多肽等可以通过本领域技术人员熟知的许多一般手段中的任意一种来分析和定量。这些方法包括,例如分析生物化学方法如NMR、分光光度法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC),以及高扩散色谱法(hyperdiffusion chromatography);多种免疫方法,例如流体或凝胶沉淀素反应(fluid or gel precipitin reaction)、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫荧光测定法、DNA印迹分析、RNA印迹分析、斑点印记分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR;其它的核酸或靶标或信号放大方法、放射性标记术、闪烁计数法,以及亲合色谱法。
寡核苷酸引物可用于扩增编码T1R配体-结合区的核酸。在此描述的核酸也可用扩增方法克隆或定量测量。扩增方法也是本领域熟知的,并包括例如聚合酶链式反应(PCR)(Innis ed.,PCR Protocols,aGuide to Methods and Applications,Academic Press,N.Y.(1990);Innis ed.,PCR Strategies,Academic Press,Inc.,N.Y.(1995))、连接酶链式反应(LCR)(Wu,Genomics,4:560(1989);Landegren,Science,241:1077(1988);Barringer,Gene,89:117(1990))、转录扩增(Kwoh,PNAS,86:1173(1989))、自主序列复制(Guatelli,PNAS,87:1874(1990))、Qβ复制酶扩增(Smith,J.Clin.Microbiol.,35:1477-91(1997))、自动化的Q-β复制酶扩增测定法(Burg,Mol.Cell.Probes,10:257-71(1996)),以及其它的RNA聚合酶介导的方法(例如,NASBA、Cangene、Mississauga、Ontario)。也参见,Berger,Methods Enzymol.,152:307-16(1987);Sambrook;Ausubel;U.S.Pat.No.4,683,195和4,683,202;Sooknanan,Biotechnology,13:563-64(1995)。
一旦扩增,核酸,单独地或作为文库,可根据本领域已知的方法克隆,如果需要,用常规的分子生物学方法克隆进多种载体的任意一种中;用于在体外克隆扩增的核酸的方法例如在U.S.Pat.No.5,426,039中描述。为了促进扩增的序列的克隆,可将限制性内切酶位点“嵌入”PCR引物对中。例如,将Pst I和Bsp E1位点设计进本发明的示例性引物对中。这些特殊的限制位点具有这样的序列:其在连接时,位于它们剪接进其中的7-跨膜受体“供体”编码序列的“框内”(配体-结合区编码序列在7-跨膜多肽的内部,因此,如果期望该构建体在限制性内切酶剪接位点下游翻译,应避免在框外面发生;如果插入的配体-结合区基本上含有跨膜VII区的大部分,则这可能不需要)。可以设计引物保留“供体”7-跨膜受体的初始序列。备选地,引物可编码是保守的取代(例如对于疏水性残基是疏水性的,见上面论述的)或功能上有利的取代(例如,不会阻止插入质膜,不会导致受肽酶裂解,不会导致受体的异常折叠等)的氨基酸。
可设计引物对来选择性地扩增T1R蛋白质的配体-结合区。对于不同的配体这些结合区可不同;因此,对于一种配体可能是最小的结合区的结合区可能对于另一种可能的配体来说太有限了。因此,可能要扩增含有不同结构域结构的不同大小的结合区;例如7-跨膜T1R的跨膜(TM)结构域II到VII,III到VII、III到VI或从II到VI,或其变体(例如,仅特殊结构域的子序列,打乱结构域的顺序等)。
由于许多7-跨膜T1R蛋白质的结构域结构和序列是已知的,熟练的技术人员可容易地选择结构域旁侧和结构域内部的序列作为模板序列来设计简并的扩增引物对。例如,编码结构域区II到VII的核酸序列可用引物对通过PCR扩增产生。为了扩增含有跨膜结构域I(TM I)序列的核酸,简并引物可从编码上述T1R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸设计。这种简并引物可用于产生整合了TM I到TM III、TM I到TM IV、TM I到TM V、TM I到TM VI或从TM I到TM VII的结合区。其它简并引物可基于在此提供的其它T1R家族的共有序列设计。这种简并引物可用于产生整合了TM III到TM IV、TM III到TM V、TM III到TM VI或TM III到TM VII的结合区。
用于设计简并引物对的范例是本领域熟知的。例如,COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)策略的计算机程序在http://blocks.fhcrc.org/codehop.html上可获得,并且其直接链接自BlockMaker多个序列比对站点,用于从一组相关的蛋白质序列,如已知的味觉受体配体-结合区开始的杂合引物预测(参见,例如Rose,Nucleic Acids Res.,26:1628-35(1998);Singh,Biotechniques,24:318-19(1998))。
用于合成寡核苷酸引物对的手段是本领域熟知的。可以使用“天然的”碱基对或合成的碱基对。例如,人造核碱基的使用提供了用以操纵引物序列和产生更复杂的扩增产物混合物的多用途方法。多个人造核碱基家族能通过内部键的旋转设想多个氢成键方向,来提供用于简并分子识别的手段。这些类似物整合进PCR引物的单个位置使得能产生复杂的扩增产物文库。参见,例如Hoops,Nucleic Acids Res.,25:4866-71(1997)。非极性分子也可用于模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非-氢-成键形状模拟物可重现有效且选择性地针对胸腺嘧啶的非极性形状模拟物(参见,例如Morales,Nat.Struct.Biol,5:950-54(1998))。例如,两个简并碱基可以是嘧啶碱6H、8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤(参见,例如Hill,PNAS,95:4258-63(1998))。本发明的示例性简并引物整合了核碱类似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲酰-2’-脱氧-胞苷、3’-[2-氰乙基)--N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(序列中的术语“P”,见上文)。这种嘧啶类似物与嘌呤,包括A和G残基形成氢键。
与在此公开的味觉受体基本一致的多态变异体、等位基因和种间同系物可用上述的核酸探针分离。备选地,表达文库可通过用产生对抗T1R多肽的抗血清或纯化的抗体检测免疫表达的同系物,用于克隆T1R多肽及其多态变异体、等位基因和种间同系物,所述的抗血清或抗体还识别和选择性结合T1R同系物。
编码味觉受体的配体-结合区的核酸可通过用合适的(完全的或简并的)引物对扩增(例如,PCR)合适的核酸序列产生。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA,或者是源自味觉受体-表达细胞的mRNA或cDNA。
在一个实施方案中,可以构建杂合蛋白质-编码序列,该序列含有编码融合至转运序列的嵌合的或天然的T1R的核酸。还提供了杂合T1R,其含有转运基序和其它家族的化学感受器,尤其是味觉受体的引起味觉的化合物的结合区。这些核酸序列可有效连接至转录或翻译控制元件,例如转录起始序列和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、多腺苷酸化序列,以及其它可用于将DNA转录成RNA的序列。在重组表达盒、载体和转基因的构建中,启动子片段可用于在所有期望的细胞或组织中引导期望的核酸的表达。
在另一个实施方案中,融合蛋白可以包括C-端或N-端转运序列。此外,融合蛋白可以包含另外的元件,例如用于蛋白质检测、纯化或其它应用的元件。促进检测和纯化的结构域包括,例如金属螯合肽如多聚组氨酸标签(polyhistidine tract)、组氨酸-色氨酸模块,或使得能在固定的金属上纯化的其它结构域;麦芽糖-结合蛋白;使得能在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域;或在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp,Seattle Wash)中使用的结构域。
在转运结构域(用于有效的质膜表达)和新翻译的多肽的其它部分之间包含可切割的连接序列,例如凝血酶原激酶识别基序(见,例如Ottavi,Biochimie,80:289-93(1998))、枯草杆菌蛋白酶识别基序(见,例如Polyak,Protein Eng.,10:615-19(1997));肠激酶识别基序(Invitrogen,San Diego,Calif.)等可用于促进纯化。例如,一种构建体可以包含连接至6个组氨酸残基的编码多肽的核酸序列,6个组氨酸残基为硫氧还蛋白、肠激酶切割位点(参见,例如Williams,Biochemistry,34:1787-97(1995)),以及C-端转运结构域。组氨酸残基促进检测和纯化,而肠激酶切割位点提供了用于从融合蛋白的剩余部分纯化期望的蛋白质的方法。与编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用有关的技术在科学和专利文献中有详细描述(参见,例如Kroll,DNA Cell.Biol,.12:441-53(1993))。
含有配体-结合区编码序列的表达载体(作为单独的表达载体或作为表达载体文库)可通过多种常规技术引入基因组或引入细胞的细胞质或细胞核中并表达,所述技术在科学和专利文献中有详细描述。参见,例如Roberts,Nature,328:731(1987);Berger同上;Schneider,Protein Expr.Purif.,6435:10(1995);Sambrook;Tijssen;Ausubel。来自生物制剂和实验设备的生产商的产品信息也提供了有关已知的生物学方法的信息。载体可从天然来源分离,从例如ATCC或GenBank库这些来源获得,或者通过合成或重组方法制备。
核酸可在于细胞中稳定或短暂表达的表达盒、载体或病毒(例如附加型表达系统)中表达。可整合选择标记进表达盒和载体中以赋予转化的细胞和序列可选表现型。例如,选择标记可编码游离基因维持和复制,这样不需要整合进宿主的基因组中。例如,标记可编码抗菌素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如,chlorosulfuron或Basta),以允许选择用期望的DNA序列转化的那些细胞(参见,例如Blondelet-Rouault,Gene,190:315-17(1997);Aubrecht,J.Pharmacol.Exp.Ther.,281:992-97(1997))。由于赋予对物质如新霉素或潮霉素的抗性的可选择的标记基因只能在组织培养中利用,化学抗性基因也可在体外和体内用作可选标记。
嵌合的核酸序列可编码在任意的7-跨膜多肽内的T1R配体-结合区。由于7-跨膜受体多肽具有类似的一级序列和二级结构以及三级结构,结构性结构域(例如胞外结构域、TM结构域、胞质结构域等)可容易通过序列分析确定。例如,同源模建、傅里叶分析和螺旋周期性检测可确定和鉴定具有7-跨膜受体序列的7个结构域。快速傅里叶变换(FFT)算法可用于评估表征分析序列的疏水性和变异性的性质的主周期(dominant period)。周期性检测增强(Periodicity detectionenhancement)和α螺旋周期指数可以如由例如Donnelly,ProteinSci.,2:55-70(1993)进行的进行。其它的比对和模建算法是本领域熟知的(参见,例如Peitsch,Receptors Channels,4:161-64(1996);Kyte&Doolittle,J.Md.Biol.,157:105-32(1982);和Cronet,Protein Eng.,6:59-64(1993))。
本发明还不仅包括具有指定的天然和嵌合的T1R核酸序列及氨基酸序列的核酸分子和多肽,而且包括它们的片段,特别是例如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸或更多核苷酸的片段,以及例如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多氨基酸的多肽片段。任选地,核酸片段可编码能够结合产生来对抗T1R家族成员的抗体的抗原多肽。此外,本发明的蛋白质片段可任选是能够结合至产生来对抗T1R家族成员的抗体的抗原多肽。
还考虑的是嵌合蛋白质,其含有至少一种在此描述的T1R多肽之一的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多,所述氨基酸连接至另外的、代表另一种GPCR,优选7跨膜超家族成员的全部或部分的氨基酸。这些嵌合体可由目前的受体和另一种GPCR制备,或者它们可通过组合两种或多种当前的受体制备。在一个实施方案中,该嵌合体的一个部分对应于,或源自本发明的T1R多肽的跨膜结构域。在另一实施方案中,嵌合体的一部分对应于,或源自在此描述的T1R多肽的一个或多个跨膜区,并且剩余部分可来自另一种GPCR。嵌合受体是本领域熟知的,并且用于产生它们的技术以及对用于整合进其中的G蛋白-偶联受体的结构域或片段的选择和边界也是熟知的。因此,本领域技术人员的这种知识可容易地用于产生这种嵌合受体。这种嵌合受体的使用可提供,例如在此具体公开的受体之一的味觉选择性特性,外加另一种受体,例如在当前领域的检测系统中使用的熟知的受体的信号转导特性。
例如,区域如配体-结合区、胞外结构域、跨膜结构域、跨膜结构域、胞质结构域、N-端结构域、C-端结构域,或其任意组合可共价地连接至异源蛋白质。例如,T1R跨膜区可连接至异源GPCR的跨膜结构域,或者异源GPCR的胞外结构域可连接至T1R跨膜区。其它异源蛋白的选择可包括,例如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶多肽、谷氨酸受体,以及视紫红多肽,例如视紫红质如牛视紫红质的N-端片段。
使用不同的宿主细胞用于表达本发明的T1R、片段或变体也在本发明的范围之内。为了获得编码本发明的T1R、片段或变体的克隆的基因或核酸,例如cDNA的高水平表达,技术人员通常将目标核酸序列亚克隆进表达载体中,所述表达载体含有用以引导转录的强启动子、转录/翻译终止子,并且如果用于编码蛋白质的核酸,则含有用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域熟知的并例如在Sambrook等中描述。优选地,真核生物表达系统用于表达主体hT1R受体。
可以使用用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞中的任何熟知的方法。这些包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质融合、电穿孔、脂质体、显微注射、等离子载体(plasma vector)、病毒载体和任意的其它熟知方法用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞中的(参见,例如Sambrook等)。唯一需要的是,使用的特殊遗传工程操作能够成功地将至少一种核酸分子引入能够表达目标T1R、片段或变体的宿主细胞中。
在将表达载体引入进细胞后,将转染的细胞在有利于表达目标受体、片段或变体的条件下培养,然后用标准技术从培养基中收获细胞。这种技术的实例是本领域熟知的。参见,例如WO 00/06593,其将以符合本公开内容的方式通过引入作为参考。
用于检测调节根据本发明的T1R的活性的化合物的测定法
用于确定试验化合物是否在体外和体内都特异性结合本发明的T1R多肽的方法和组合物在下文中描述。可监控细胞生理学的多个方面,用以评估配体-结合至天然存在的或嵌合的T1R的效力。这些测定可在通过标准方法产生的表达T1R多肽的完整细胞、经透化的细胞,或膜片断上实施。
味觉受体结合引起味觉的化合物并起始化学刺激转导成电信号。激活的或经抑制的G蛋白将随后改变靶标酶、通道和其它效应蛋白质的性质。一些实施例是通过视觉系统中的转导素激活cGMP磷酸二酯酶、通过激动型G蛋白激活腺苷酸环化酶,通过Gq和其它同种G蛋白激活磷脂酶C,以及通过Gi和其它G蛋白调节不同的通道。也可检验下游结果,例如由磷脂酶C产生的二酰基甘油和IP3,以及接下来的,由IP3进行的钙动员。
该测定法的主体嵌合T1R多肽将通常选自具有包含于SEQ ID NO.2和4中的序列的多肽,或其片段或经保守性修饰的变体。
备选地,该测定法的嵌合T1R蛋白质或多肽可源于真核宿主细胞,并且可以包括与SEQ ID NO:2或4具有氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其经保守性修饰的变体。通常,所述的氨基酸序列同一性将是至少30%,优选30-40%,更优选50-60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。任选地,该测定法的T1R蛋白质或多肽可包含T1R的一个区域,例如胞外结构域、跨膜区、胞内结构域、配体-结合结构域等。任选地,T1R多肽或其部分,可共价连接至异源蛋白质而产生用于在此描述的测定法的嵌合蛋白质。
T1R活性的调节剂可以用如上描述的T1R蛋白质或多肽(重组的或天然出现的)检测。T1R蛋白质或多肽可以在细胞中分离、表达、在源于细胞的膜中表达、在组织中或在动物中表达,所述的表达是重组的或天然发生的。例如,可以使用舌切片、来自舌的分离的细胞、转化的细胞或细胞膜。调节可以用其中一种在此描述的体外或体内测定法来检测。
调节剂的检测
下面描述了用于体外和体内测定试验化合物是否特异性结合至本发明的T1R受体的组合物和方法。可以监控细胞生理学的许多方面来评估结合至本发明的T1R多肽的效果。这些测定法可以在表达化学感受器的完整细胞上、经透化处理的细胞上或通过标准方法产生的细胞膜片断上或体外用从头合成的蛋白质进行。
在体内,味觉受体结合味觉调节化合物并起始化学刺激转换成电信号。活化的或抑制的G蛋白将随后改变靶标酶、通道和其它效应蛋白质的性质。一些实施例是由视觉系统中的转导蛋白激活cGMP磷酸二酯酶、由激动型G蛋白激活的腺苷酸环化酶、由Gq和其它同源G蛋白激活的磷脂酶C,以及由Gi和其它G蛋白调控的不同通道。也可以检验下游的作用,例如由磷脂酶C产生的二酰基甘油和IP3,以及接下来,由IP3进行的钙动员。
备选地,该测定法的T1R蛋白质或多肽可源于真核宿主细胞,并且可以包括与在此公开的T1R多肽或其片段或经保守性修饰的变体具有氨基酸序列同一性的氨基酸序列。通常,所述的氨基酸序列同一性将为至少35-50%,或任选75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。任选地,该测定法的T1R蛋白质或多肽可包含T1R的一个区域,例如胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞内结构域、配体-结合结构域等。进一步,如上面描述的,T1R多肽或其结构域,可共价连接至异源蛋白质而产生用于在此描述的测定法的嵌合蛋白质。
T1R受体活性的调节剂可以用如上描述的T1R蛋白质或多肽(重组的或天然出现的)检测。T1R蛋白质或多肽可以在细胞中分离、表达、在源于细胞的膜中表达、在组织中或在动物中表达,所述的表达是重组的或天然发生的。例如,可以使用舌切片、来自舌的分离的细胞、转化的细胞或细胞膜。调节可以用其中一种在此描述的体外或体内测定法来检测。
1.体外结合测定法
味觉传导也可以用本发明的T1R多肽,以溶解状态或固体状态的反应体外检验。在一个特别的实施方案中,T1R配体-结合结构域可以体外用于溶解或固体状态的反应中来测定配体结合。
有可能的是配体-结合结构域可由N-端结构域和胞外结构域的另外部分,例如跨膜结构域的胞外环区一起形成。
已经用其它GPCR,例如代谢型谷氨酸盐受体进行了体外结合测定法,(参见,例如Han和Hampson,J.Biol.Chem.274:10008-10013(1999))。这些测定法可能涉及置换经放射或荧光标记的配体,测量内荧光的改变或蛋白水解敏感性的变化等。
结合根据本发明的T1R多肽的配体可在溶液中、在双层膜中(任选连接至固相上)、在脂单层中或小囊泡中检测。调节剂的结合可以用例如,光谱特征的改变(例如荧光指数、吸收率指数、折射率)、流体动力学性质(例如形状)、层析性能或可溶性性质的改变来检测。
在本发明的一个优选的实施方案中,使用了[35S]GTPγS结合测定法。如上面描述的,一旦激活GPCR,G蛋白复合物的Gd亚基受到刺激交换结合的GDP为GTP。配体介导的G蛋白交换活性的刺激可以在测量加入的放射标记的[35S]GTPγS在存在假定配体时结合至G蛋白的生化测定法中测量。通常,将含有目标化学感受器的膜与G蛋白混合。将潜在的抑制剂和/或激活剂和[35S]GTPγS加入测定法中,并测量[35S]GTPγS与G蛋白的结合。结合可以通过液体闪烁计数或通过本领域已知的任意其它手段,包括闪烁亲近测定法(SPA)测量。在其它的测定法中,可利用荧光标记的GTPγS。
2.荧光偏振测定法
在另一实施方案中,基于荧光偏振(“FP”)的测定法可用于检测和监控配体结合。荧光偏振是一种用于测量平衡结合、核酸杂交和酶促活性的多用途实验室技术。荧光偏振测定法在它们不需要分离步骤例如离心、过滤、层析、沉淀或电泳方面是相同的。这些测定法直接在溶液中或不需要固定相实时地进行。偏振值可以重复地并且在加入试剂后测量,因为测量偏振是快速的并且不破坏样品。通常,该技术可用于测量从低的皮摩尔到微摩尔水平的荧光团的偏振值。这部分描述荧光偏振如何可以以简单且定量的方式来测量配体结合至本发明的T1R多肽。
当用平面偏振光激发荧光标记的分子时,其发出具有与其分子转动反比例的偏光度的光。大的荧光标记分子在激发状态过程中保持相对稳定(在荧光素的情形中为4纳秒),并且光的偏振在激发和发射之间保持相对恒定。小的荧光标记分子在激发状态过程中快速旋转并且偏振在激发和发射之间显著变化。因此,小分子具有低的偏振值而大分子具有高的偏振值。例如,单链的荧光素标记的寡核苷酸具有相对低的偏振值,但是当其杂交杂交至互补链时,其具有更高的偏振值。当用FP来检测和监控激活或抑制本发明的化学感受器的引发味觉的化合物结合时,可以使用荧光标记的引发味觉的化合物或自发荧光的引发味觉的化合物。
荧光偏振(P)定义为:
P = [ Int par - Int perp ] [ Int par + Int perp ]
其中,Intpar是平行于激发光平面的发射光的强度,而Intperp是与激发光平面垂直的发射光的强度。P是光强度的比率,为无量纲数。例如,BeaconTM和Beacon 2000TM系统可以用于这些测定法。这些系统通常以毫偏光度(millipolarization)单位表示偏光度(1个偏光度单位=1000mP单位)。
分子转动和分子大小之间的关系通过Perrin方程描述,并且读者参考Jolley,M.E.(1991),Journal of Analytical Toxicology,pp.236-240(将其引入作为参考),该文献对该等式给出了详尽解释。概括来说,Perrin等式描述了偏光度直接与转动驰豫时间,即分子转过大约68.5°的角度需要的时间成比例。转动驰豫时间通过下面的方程与粘度(eta.)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)相关:2(转动驰豫时间)=3VRT。
转动驰豫时间对于小分子(例如荧光素)小(≈纳秒),而对大分子(例如免疫球蛋白)大(100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定,转动驰豫时间,并且因而偏光度直接与分子体积相关。分子体积的变化可能是由于荧光标记分子与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或构象变化。例如,已经将荧光偏振用于测量通过蛋白酶、DNA酶和RNA酶进行的大的荧光素标记的聚合物的酶促裂解。其也已经用于测量蛋白质/蛋白质相互作用的平衡结合、抗体/抗原结合和蛋白质/DNA结合。
A.固态和溶解状态的高通量测定法
在又一个实施方案中,本发明提供了使用T1R多肽或表达T1R多肽的细胞或组织的溶解的测定法。在另一实施方案中,本发明提供了高通量模式的基于固相的体外测定法,其中T1R多肽或表达T1R多肽的细胞或组织连接至固相基质上或味觉刺激化合物上,并且与T1R受体接触,并且用合适的标签或对抗T1R受体的抗体检测结合。
在本发明的高通量测定法中,在一天筛选数千种不同的调节剂或配体是可能的。特别是,微量滴定板的每个孔可用于进行独立的针对选择的潜在调节剂的测定,或者,如果要观察浓度或孵育时间效应,每5-10个孔可检测单个调节剂。因而,单个标准的微量滴定板可以测定大约100(例如96)个调控剂。如果使用1536孔板,则单个板可容易地测定大约1000个-大约1500种不同的化合物。在每个板空中测定多种化合物也是可能的。有可能每天测定几个不同的板;使用本发明的集成系统,测定法筛选多达大约6,000-20,000种不同化合物的测定筛选是可能的。更近一些,已经发展了用于试剂操作的微流体方法(microfluidic approach)。
目标分子可以通过共价或非共价键,例如通过标签,直接或间接结合至固态成分。所述的标签可以是多种成分的任意一种。通常,将结合标签的分子(标签结合剂)固定在固体支持物上,并将经标记的目标分子(例如目标味觉转导分子)通过所述标签和标签结合剂的相互作用而连接至该固体支持物上。
可以基于文献中详细描述的已知的分子相互作用,使用许多标签和标签结合剂。例如,如果标签具有天然的结合剂,例如,生物素、蛋白A或蛋白G,可将其与合适的标签结合剂(抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链菌素、中性链亲和素、免疫球蛋白的Fc区等)。具有天然结合剂的分子例如生物素的抗体也是可广泛获得的,以及可获得合适的标签结合剂(参见SIGMA Tmmunochemicals 1998 catalogue SIGMA,St.Louis Mo.)。
类似地,任何半抗原或抗原化合物可与合适的抗体结合使用,以形成标签/标签结合剂对。成千上万种特异性抗体可商业获得并且许多其它的抗体在文献中描述。例如,在一种普通的配置中,标签是第一抗体而标签结合剂是识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用,受体-配体相互作用也合适作为标签和标签结合剂对。例如,细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如,细胞受体-配体相互作用,如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、化学因子受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘连蛋白家族、整合素家族、选择素家族等;参见,例如Pigott&Power,The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。类似地,毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片类、类固醇等)、细胞内受体(例如,介导多种小配体,例如类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D;肽的效应的受体)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合体构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可以与多种细胞受体相互作用。
合成的聚合物,例如聚氨基甲酸乙酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚醋酸酯也可以形成合适的标签或标签结合剂。许多其它标签/标签结合剂对也可用于在此描述的测定系统,这对本领域技术人员在阅读本公开内容后是显而易见的。
普通的连接物例如肽、聚醚等可以作为标签,并且包括多肽序列,例如约5-200个氨基酸之间的聚甘氨酸序列。这些柔性的连接物是本领域技术人员已知的。例如聚(乙二醇)连接物可从ShearwaterPolymers,Inc.Huntsville,Ala获得。这些连接物任选具有酰胺键、巯基键或杂官能键。
标签结合剂用目前可利用的多种方法中的任意一种固定至固体基质上。固体基质通常通过曝露全部或部分基质于将化学基团固定至与标签结合剂的一部分反应的表面的化学试剂而衍生或官能化。例如,适合用于连接至较长的链部分的基团将包括胺、羟基、巯基和羧基。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可用于使多种表面,例如玻璃表面官能化。文献中详细描述了这种固相生物聚合物测定法的构建。参见,例如,Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成);Geysen等,J.Immun.Meth.,102:259-274(1987)(描述在针上合成固相成分);Frank&Doring,Tetrahedron,44:60316040(1988)(描述在纤维素盘上合成多种肽序列);Fodor等,Science,251:767-777(1991);Sheldon等,Clinical Chemistry,39(4):718-719(1993)和Kozal等,Nature Medicine,2(7):753759(1996)(都描述了固定于固体基质上的生物聚合物的测定)。用于固定标签结合剂于基质赏的非化学方法包括其它普通的方法,例如加热、通过UV射线交联等。
3.基于细胞的测定法
在一个优选的实施方案中,T1R蛋白在真核细胞中以未经修饰的形式或作为嵌合的、变体的或截短的受体表达,具有或优选没有促进其成熟和靶向通过分泌途径的异源的、伴侣序列。这种T1R多肽可以在任何真核细胞,例如HEK-293细胞中表达。优选地,所述细胞包括功能性G蛋白,例如
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或嵌合的
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味导素或转导素或能耦合嵌合受体至胞内信号途径或偶联至信号蛋白例如磷脂酶C的嵌合G蛋白例如G16gust44。T1R受体在这类细胞中的活化可以用任何标准方法检测,例如通过检测细胞内钙的变化,所述的细胞内钙的变化通过检测细胞中FURA-2依赖性荧光。这种测定法是在本申请案中介绍的试验发现的基础。
激活的GPCR受体通常是磷酸化该受体的C-端尾(以及还有可能是其它位点)的激酶的底物。因而,激活剂将促进32P从放射标记的ATP转移至该受体,这可以用闪烁计数器测定。C-端的磷酸化将促进类似抑制蛋白(arrestin)的蛋白质的结合,并干扰G蛋白的结合。对GPCR信号转导和测定信号转导的方法的全面综述,参见例如Methods in Enzymology,vols.237 and 238(1994)and volume 96(1983);Bourne等,Nature,10:349:117-27(1991);Bourne等,Nature,348:125-32(1990);Pitcher等,Annu.Rev.Biochem.,67:653-92(1998)。
可通过将用推定的T1R调节剂处理过的根据本发明的嵌合T1R多肽的反应与未经处理的对照样品或含有已知的“阳性”对照的样品的反应比较测定T1R调控。这种推定的T1R调节剂可包括抑制或活化T1R多肽活性的分子。在一个实施方案中,将用激活T1R的化合物处理的对照样品赋给100的相对T1R活性值。当T1R活性值相对对照样品是大约90%,任选50%、任选25-0%时,实现了对T1R多肽的抑制。当T1R活性值相对于对照是110%、任选150%、200-500%或1000-2000%时,实现了对T1R多肽的激活。
离子流的变化可以通过测定表达T1R多肽的细胞或膜的离子极化(即电势)的变化来估计。测定细胞极化的变化的一个手段是通过用压钳制技术和膜片钳技术测量电流的变化(从而测量的极化的变化)(参见,例如,“细胞贴附”式、“内面向外”式和“全细胞”式,例如Ackerman等,New Engl.J Med.,336:1575-1595(1997))。全细胞电流用标准的方法方便地测定。其它已知的测定法包括:放射标记的离子流测定法和使用电压敏感染料的荧光测定法(参见,例如,Vestergarrd-Bogind等,J.Membrane Biol.,88:67-75(1988);Gonzales&Tsien,Chem.Biol.,4:269-277(1997);Daniel等,J.Pharmacol.Meth.,25:185-193(1991);Holevinsky等,J.Membrane Biology,137:59-70(1994))。
试验化合物对所述多肽的功能的影响可以通过检验上面描述的任何参数来测量。影响GPCR活性的任何合适的生理变化可用于估计试验化合物对本发明的多肽的影响。当用完整的细胞或动物测定功能性后果时,也可以测量多种效应,例如递质释放、激素释放、已知的或未鉴定的遗传标记的转录改变(例如,RNA印迹)、细胞代谢的改变,例如细胞生长或pH改变,以及细胞内第二信使例如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的改变。
用于GPCR的优选测定法包括加载了离子或电压敏感染料来报告受体活性的细胞。用于测定这种受体的活性的测定法也可以使用已知的其它G蛋白偶联受体的激动剂和拮抗剂作为对照来评估试验化合物的活性。在用于鉴定调节化合物(例如,激动剂、拮抗剂)的测定法中,将分别用离子敏感或膜电压敏感荧光指示剂监控细胞质内的离子水平的变化或细胞膜电压的变化。在可以采用的离子敏感指示剂和电压探针中是在Molecular Probes 1997 Catalog中公开的那些。对于G蛋白偶联受体,杂乱G蛋白例如
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可用于选择的测定法(Wilkie等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,88:10049-10053(1991))。备选地,可以使用其它G蛋白例如味导素或转导素和嵌合的G蛋白Gα16gust44或G16g44。
受体激活起始了随后的细胞内事件,例如第二信使的增加。一些G蛋白偶联受体的激活刺激了通过磷脂酶C-介导的磷脂酰肌醇的水解形成肌醇三磷酸(IP3)(Berridge&Irvine,Nature,312:315-21(1984))。IP3然后刺激了细胞内的钙离子储备的释放。因而,细胞质的钙离子水平的变化,或第二信使水平例如IP3的变化可用于评估G蛋白偶联受体功能。表达这种G蛋白偶联受体的细胞可以表现出由钙从细胞内储备释放和细胞外的钙通过质膜离子通道进入两者的贡献引起的增加的细胞质钙水平。
在一个优选的实施方案,T1R多肽活性通过在具有杂乱G蛋白的异源细胞中表达T1R基因,该G蛋白将该受体与磷脂酶C信号转导途径连接(参见Offermanns&Simon,J.Biol.Chem.,270:15175-15180(1995))。优选地,该细胞系是HEK-293(其不正常表达T1R基因),并且杂乱G蛋白是
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(Offermarms&Simon,同上)或嵌合G蛋白例如Gα16gust44。味觉转导的调控通过测量细胞内Ca2+水平的变化测量,所述的Ca2+水平响应通过施用与T1R多肽结合的分子调控T1R信号转导途径而改变。Ca2+水平的改变任选用荧光Ca2+指示剂染料和荧光成像来测量。
在另一个实施方案中,可以根据美国专利5,436,128(在此通过引入作为参考)分析磷脂酰肌醇(PI)水解。简单来说,该测定法涉及用3H-肌醇标记细胞48小时或更多小时。将标记的细胞用试验化合物处理1小时。溶解处理过的细胞病在氯仿-甲醇-水中萃取,随后通过离子交换色谱分离磷酸肌醇并通过闪烁计数定量。通过计算存在激动剂时的cpm与存在缓冲液对照时的cpm的比率而测定刺激的倍数。同样,通过计算存在拮抗剂时的cpm与存在缓冲液对照(其可以含有或不含有激动剂)时的cpm的比率而测定抑制的倍数。
其它受体测定法可以涉及测定细胞内的环核苷酸,例如cAMP或cGMP的水平。在其中受体的激活导致环核苷酸水平降低的情形中,在加入激活受体的化合物至该测定法中的细胞前,曝露细胞于增加细胞内环核苷酸水平的试剂,例如福斯高林可能是优选的。在一个实施方案中,细胞内的cAMP或cGMP的变化可以用免疫测定法测量。可将Offermanns&Simon,J.Bio.Chem.,270:15175-15180(1995)中描述的方法用于测定cAMP的水平。而且,也可将Felley-Bosco等,Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.,11:159-164(1994)中描述的方法用于测定cGMP的水平。此外,用于测量cAMP和/或cGMP的测定试剂盒在美国专利4,115,538中描述,将其在此通过引入作为参考。
在另一个实施方案中,可以测量转录水平来评估试验化合物对信号转导的效果。将含有目标T1R多肽的宿主细胞与试验化合物接触足够的时间来实现任何相互作用,并然后测量基因表达的水平。实现这种相互作用的时间的量可以通过试验测定,例如通过进行一个时程并测量作为时间函数的转录水平。转录的量可以通过使用本领域技术人员已知为合适的任何方法来测量。例如,目标蛋白质的mRNA表达可以用RNA印迹检测,或者它们的多肽产物可以用免疫测定法鉴定。备选地,使用报告基因的基于转录的测定法可以如U.S.Pat.No.5,436,128(在此将其通过引入作为参考)中描述的使用。报告基因可以是,例如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外,可以将目标蛋白质用作通过连接至第二种报告物例如绿色荧光蛋白的间接的报告物(参见,例如Mistili&Spector,Nature Biotechnology,15:961-964(1997))。
然后将转录的量与在缺少试验化合物时相同细胞中的转录量比较,或者可以将其与缺少目标T1R多肽的基本一致的细胞中的转录量比较。基本一致的细胞可以源于从其制备重组细胞的相同细胞,但是其没有被通过引入异源DNA而修饰。转录量的任何不同表明试验化合物已经以某些方式改变了目标T1R多肽的活性。
4.表达化学感受器的转基因非人动物
表达本发明的一种或多种味觉受体序列的非人动物也可用于受体测定法。这种表达可以用于通过用试验化合物接触用编码化学感受器或其配体结合区的核酸稳定或瞬时转染的非人动物,并测定该动物是否对该试验化合物特异性结合至所述受体多肽复合物起反应,来测定所述试验化合物是否特异性结合至体内的哺乳动物味觉跨膜受体复合物上。
用本发明的载体转染或感染的动物对鉴定和表征可结合至一种特定的受体或一组受体的味觉刺激物的测定法是特别有用的。这种载体感染的表达人味觉受体序列的动物可用于体内筛选味觉刺激物和它们对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或行为的影响。
感染/表达核酸和载体(单独地,或作为文库)的手段是本领域所熟知的。多种单个细胞、器官或整个动物的参数可以通过多种手段测量。本发明的T1R序列可以例如,通过递送感染剂(infecting agent)如腺病毒表达载体,在动物味觉组织中表达。
内源性味觉受体基因可以保持功能性,并且可仍然表现野生型(天然的)活性。在其它情况中,如果期望所有的味觉受体活性是通过引入的外源性杂合受体产生,优选使用基因剔除的品系(knockoutline)。用于构建非人转基因动物,特别是转基因小鼠的方法,以及用于产生转化的细胞的重组构建体的选择和准备是本领域所熟知的。
“基因敲除的”细胞的构建体和动物是基于哺乳动物细胞中特殊基因的表达水平可以通过引入新的用于打断要抑制的基因的DNA序列的一些部分的DNA序列至基因组中而降低或完全废除这个前提。而且,“基因捕获插入(gene trap insertion)”可用于打断宿主基因,并且小鼠胚胎干(ES)细胞可用于产生基因剔除的转基因动物(参见Holzschu,Transgenic Res 6:97-106(1997))。外源序列的插入通常是通过互补核酸序列之间的同源重组。所述的外源序列是要修饰的靶基因的某些部分,例如外显子序列、内含子序列或转录调控序列,或能够影响所述靶基因表达的水平的任何基因组序列;或其组合。多能胚胎干细胞中通过同源重组的基因靶向(Gene targeting)使得人们能精确地修饰目标基因组序列。任何技术可用于产生、筛选、繁殖基因剔除的动物,例如参见Bijvoet,Hum.Mol.Genet.7:53-62(1998);Moreadith,J.Mol.Med.75:208-216(1997);Tojo,Cytotechnology 19:161-165(1995);Mudgett,Methods Mol.Biol.48:167-184(1995);Longo,Transgenic Res.6:321-328(1997);U.S.Pat.Nos.5,616,491;5,464,764;5,631,153;5,487,992;5,627,059;5,272,071;WO 91/09955;WO 93/09222;WO 96/29411;WO  95/31560;WO 91/12650。
本发明的核酸也可以用作试剂来产生“基因剔除的”人细胞和它们的子代。同样,本发明的核酸也可以用作试剂来在小鼠中产生“基因替换(knock-ins)”。人或大鼠T1R基因序列可以替换小鼠基因组中的同源T1R。以这种方式,产生了表达人或大鼠T1R的小鼠。这种小鼠然后可用于分析人或大鼠T1R的功能,以及用于鉴定这种T1R的配体。
调节剂
作为T1R家族成员的调节剂检验的化合物可以是任何小的化合物或生物实体(biological entity),例如蛋白质、糖、核酸或脂。备选地,调节剂可以是遗传改变形式的T1R家族成员。通常,试验化合物可以是小的化学分子和肽。基本上任何化合物可在本发明的测定法中用作潜在的调节剂或配体,尽管最经常使用可溶解于含水或有机(特别是基于DMSO的)溶液的化合物。通过自动化测定步骤并且从任何方便的来源提供化合物给测定法,它们通常平行进行(例如,在机器人测定法(robotic assay)中在微量滴定板上以微量滴定的形式),可以设计测定法来筛选大的化学库。应该理解,有许多化合物供应商,包括Sigma(St.Louis,Mo.)、Aldrich(St.Louis,Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo.)、Fluka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs,Switzerland)等。
在一个实施方案中,高通量筛选方法涉及提供含有大量潜在的治疗性化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合化学库或肽库。然后在一种或多种如在此描述的测定法中筛选这种“组合化学库”或“配体库”,以鉴定显示出期望的特征性活性的那些库成员(特殊的化学物类或亚类)。因而鉴定的化合物可作为常规的“先导化合物”或可将它们本身用作潜在的或实际的消费品。
组合化学库是通过组合许多化学“结构单元”由化学合成或生物合成生成的各种化合物的集合。例如,线性组合化学库例如多肽库是通过以给定化合物长度(即,多肽化合物中的氨基酸数目)的每一种可能的方式组合一组化学结构单元(氨基酸)而形成。上百万种化合物可以通过这种组合混合化学结构单元而合成。
组合化学库的准备和筛选是本领域技术人员所熟知的。这种组合化学库包括,但不限于肽库(参见,例如U.S.Pat.No.5,010,175、Furka,Int.J.Pept.Prot.Re s.,37:487-93(1991)和Houghton等,Nature,354:84-88(1991))。也可以使用用于产生化学多样性库的其它化学。这种化学包括但不限于:肽模拟物(例如,WO91/19735)、编码的肽(例如WO 93/20242)、随机的生物寡聚物(例如WO 92/00091)、苯并二氮卓类(例如,U.S.Pat.No.5,288,514)、diversomers例如乙内酰脲类、苯并二氮卓类和二肽类(Hobbs等,PNAS.,90:6909-13(1993))、插烯多肽类(Hagihara等,J.Amer.Chem.Soc.,114:6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽类肽模拟物(Hirschmann等,J.Amer.Chem.Soc.,114:9217-18(1992))、小花化合物库的类似的有机合(Chen等,J.Amer.Chem.Soc.,116:2661(1994))、寡氨基甲酸酯类(Cho等,Science,261:1303(1993))、肽酰磷酸酯类(Campbell等,J.Org.Chem.,59:658(1994))、核酸库(Ausubel,Berger和Sambrook,都同上)、肽核酸库(U.S.Pat.No.5,539,083)、抗体库(Vaughn等,NatureBiotechnology,14(3):309-14(1996)和PCT/US96/10287)、糖类库(Liang等,Science,274:1520-22(1996)和U.S.Pat.No.5,593,853)、小有机分子库(苯并二氮卓类,Baum,C&EN,Jan 18,page33(1993);噻唑烷酮类和间噻嗪酮类,U.S.Pat.No.5,549,974;吡咯烷类,U.S.Pat.Nos.5,525,735和5,519,134;吗啉代化合物,U.S.Pat.No.5,506,337;苯并二氮卓类,5,288,514等)。
用于准备组合库的设备是可商业获得的(参见,例如357MPS,390MPS(Advanced Chem Tech,Louisville Ky.)、Symphony(Rainin,Woburn,Mass.)、433A(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)、9050 Plus(Millipore,Bedford,Mass.))。而且,许多组合库本身是可商业获得的(参见,例如,ComGenex,Princeton,N.J.;Tripos,Inc.,St.Louis,Mo.;3D Pharmaceuticals,Exton,Pa.;MartekBiosciences,Columbia,Md.等)。
在本发明的一方面,T1R调节剂可用于任何食品、糖果、药物组合物或其成分因而以期望的方式调节所述产品、组合物或成分的味觉。例如,可加入引发甜味或鲜味感觉的T1R调节剂来给产品或组合物提供改善的甜味或鲜味,而可加入增强甜味或鲜味的T1R调节剂来增强组合物(例如食品或饮品)中的另一种化合物或组合物的甜味或鲜味。而且,本发明提供了鉴定食物、饮料和药物中发现的甜味或鲜味化合物和增强剂并产生对缺少或具有低的品质的食物、饮料和药物的味道改善手段。
本发明鉴定的化合物的用途
可以将根据本发明鉴定的化合物加入至食物、饮料或药物组合物来调节甜味或鲜味。
如先前所述的,优选地是,在基于受试者细胞的测定法中鉴定的化合物的味觉调节性质将在品尝试验,例如人的品尝试验中确认。
试剂盒
主体嵌合T1R基因和它们的同系物是用于鉴定味觉受体、用于法医学(forensics)和亲子关系确定以及用于检验味觉转导的有用工具。特异性杂交至T1R核酸的T1R家族成员-特异性试剂,例如T1R探针和引物,以及特异性结合T1R蛋白的T1R特异性试剂,例如T1R抗体用于检验味觉细胞逼到和味觉转导调节。
检测样品中T1R家族成员的DNA和RNA存在的核酸测法发包括本领域技术人员已知的许多技术,例如DNA印迹分析、RNA印迹分析、斑点印迹、RNA酶保护、S1分析、扩增技术例如PCR和原位杂交。例如,在原位杂交中,将靶核酸从其细胞环境释放出来,这样使得能用于在细胞内杂交而同时保留细胞形态用于随后的判读和分析。下面的文章提供了原位杂交技术的综述。Singer等,Biotechniques,4:230250(1986);Haase等,Methods in Virology,vol.VII,189-226(1984);以及Names等,eds.,Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach(1987)。而且,T1R蛋白可以用上面描述的多种免疫测定法技术检测。通常将试验化合物与阳性对照(例如表达重组T1R蛋白的样品)和阴性对照两者比较。
本发明也提供用于筛选T1R家族成员的调节剂的试剂盒。这种试剂盒可以从容易获得的材料和试剂制备。例如,这种试剂盒可以包含任意一种或多种以下材料:T1R核酸或蛋白、试管和用于检测T1R活性的说明书。任选地,试剂盒含有功能性T1R多肽。取决于试剂盒的计划的使用者和使用者的特别需要,可以根据本发明制备多种多样的试剂盒。
虽然现在在本发明中已经作了一般性描述,但通过参考下面的实施例将会对相同内容更容易理解,所述的实施例以说明的方式给出并且无意于作为限制。应该理解,可以对在此公开的示例性实施例做出多种修饰和改变而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
构建了编码包含于SEQ ID NO:1中的杂合hT1R2-1核酸序列和包含于SEQ ID NO:3中的嵌合鲜味-甜味hT1R1-2核酸序列的核酸序列。第一hT1R2-1序列含有hT1R2的胞外结构域和hT1R1的跨膜结构域,而第二序列含有hT1R1的胞外结构域和hT1R2的跨膜结构域。产生了HEK-293细胞系,其稳定产生这些杂合味觉受体。特别是,产生了稳定组成型表达嵌合hT1R2-1序列、hT1R3和嵌合G蛋白G16-t25的稳定的HEK-293细胞系,其共表达hT1R2-1、hT1R3和这种嵌合G蛋白。而且,构建了稳定的HEK-293细胞系,其稳定构成型表达嵌合hT1R1-2、rT1R3和另一种嵌合G蛋白G16g44,G16g44包含G16的N-端残基和最后的44个羧基端残基用相应的味导素的44个残基取代。将这些稳定的HEK-293细胞系用于如下面的实施例中描述的甜味和鲜味配体和增强剂的测定法。
实施例2
将实施例1中的稳定的hT1R2-1细胞系用于筛选图7中显示的浓度的许多甜味配体,并且通过荧光成像检测对细胞内钙和hT1R2-1受体活性的影响。这些测定法显示,除了环已氨基磺酸盐外,所有试验的甜味化合物激活了检测浓度的嵌合hT1R2-1受体。也将特定的甜味化合物天门冬酰苯丙氨酸甲酯、D-Trp、蔗糖、果糖和环已氨基磺酸盐对hT1R2-1/hT1R3的有效浓度(EC50)与这些相同的化合物在用于激活野生型的甜味受体hT1R2/hT1R3时的EC50相比较。这些结果包含于图8中。
实施例3
进行了一种测定法来测定环已氨基磺酸盐对由天冬酰苯丙氨酸甲酯激活嵌合hT1R2-1味觉受体的效果。如图9中显示的,加入环已氨基磺酸盐增强了hT1R2-1稳定细胞系中的天冬酰苯丙氨酸甲酯响应。如图9中显示的,缺少环已氨基磺酸盐时天冬酰苯丙氨酸甲酯的EC50是0.97,而存在10mM环已氨基磺酸盐时天冬酰苯丙氨酸甲酯的EC50是0.44。而且,如分别通过图10-12中的试验结果显示的,环已氨基磺酸盐也增强了D-色氨酸、蔗糖和果糖激活hT1R2-1。
实施例4
还进行了测定法来评价环已氨基磺酸盐对由称为‘807专利鲜味配体激活hT1R2-1(SEQ ID NO:2)的效果。如图13中显示的,环已氨基磺酸盐增强了‘807的活性。在不存在环已氨基磺酸盐时‘807的EC50值是0.42,而存在5mM的环已氨基磺酸盐时‘807的EC50值是0.31。而且,如图14中显示的,‘807化合物增强了hT1R2-1对天冬酰苯丙氨酸甲酯的活化响应。
实施例5
如图15中显示的,也测定了存在和缺少IMP、GMP和CMP时测定了共表达hT1R1-2和rT1R3的稳定细胞系中的嵌合鲜味-甜味受体hT1R1-2(SEQ ID NO:4)对多种鲜味配体(L-Glu、L-Asp和L-AP4)和对D-Glu的响应。发现试验的鲜味配体激活了嵌合鲜味-甜味受体。如图16中显示的,进一步进行试验来评价IMP对MSG诱导的hT1R1-2(SEQ ID NO:4)活化的效果。如那里的试验结果显示的,基于其中存在和缺少IMP时的EC50值,IMP化合物作为增强剂起作用。

Claims (67)

1.杂合味觉受体,其包含一种人T1R的胞外结构域或其部分和另一种T1R的跨膜结构域或其部分。
2.权利要求1的杂合受体,其中两种所述T1R都是人的或啮齿动物的。
3.权利要求1的嵌合受体,其中所述T1R包含T1R1和T1R2。
4.权利要求3的嵌合受体,其中所述T1R1和T1R2包含人T1R1和人T1R2。
5.称为hT1R2-1的嵌合甜味-鲜味受体,其包含于SEQ ID NO:2中。
6.称为hT1R1-2的嵌合鲜味-甜味受体,其包含于SEQ ID NO:4中。
7.编码根据权利要求1-6中任一项的嵌合味觉受体的核酸序列。
8.权利要求7的核酸序列,其包含于SEQ ID NO:1中。
9.权利要求7的核酸序列,其包含于SEQ ID NO:3中。
10.细胞,其表达如权利要求7中列出的核酸序列。
11.权利要求10的细胞,其中所述核酸序列包含于SEQ ID NO:1中。
12.权利要求10的细胞,其中所述核酸序列包含于SEQ ID NO:3中。
13.权利要求10的细胞,其选自细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、卵母细胞、两栖动物细胞、禽细胞和昆虫细胞。
14.权利要求13的细胞,其是哺乳动物细胞或卵母细胞。
15.权利要求14的细胞,其选自HEK-293细胞、CS细胞、BHK细胞、猴L细胞、非洲绿猴细胞、CHO细胞、LtK细胞和卵母细胞。
16.权利要求15的细胞,其是HEK-293细胞。
17.权利要求10的细胞,其额外地表达G蛋白,所述G蛋白选自杂乱G蛋白、Gq蛋白、转导素、Gi蛋白、味导素、转导素和其嵌合体。
18.权利要求10的细胞,其额外表达T1R3序列。
19.异聚味觉受体,其含有与另一T1R多肽结合的根据权利要求1-6任一项的嵌合味觉受体多肽。
20.权利要求19的异聚味觉受体,其中所述另一T1R多肽是人T1R3或啮齿动物的T1R3多肽。
21.表达权利要求19的异聚味觉受体的细胞。
22.表达权利要求20的异聚味觉受体的细胞。
23.权利要求21的细胞,其是哺乳动物细胞或卵母细胞。
24.权利要求22的细胞,其是哺乳动物细胞或卵母细胞。
25.权利要求23的细胞,其选自HEK-293细胞、COS细胞、CHO细胞、BHK细胞、LtK细胞、猴L细胞、非洲绿猴细胞和卵母细胞。
26.权利要求24的细胞,其选自HEK-293细胞、BHK细胞、COS细胞、CHO细胞、Ltk细胞、猴L细胞、非洲绿猴细胞和卵母细胞。
27.权利要求25的细胞,其是HEK-293细胞。
28.权利要求26的细胞,其是HEK-293细胞。
29.权利要求19的细胞,其表达G蛋白。
30.权利要求20的细胞,其表达G蛋白。
31.嵌合味觉受体,其包含人T1R1胞外结构域或其部分或变体,以及人T1R2跨膜结构域或其部分或变体。
32.嵌合味觉受体,其包含啮齿动物T1R1胞外结构域或其部分或变体,以及啮齿动物T1R2跨膜结构域或其部分或变体。
33.嵌合味觉受体,其包含人T1R2胞外结构域或其部分或变体,以及人T1R1跨膜结构域或其部分或变体。
34.嵌合味觉受体,其包含啮齿动物T1R2胞外结构域或其部分或变体,以及啮齿动物T1R1跨膜结构域或其部分或变体。
35.编码根据权利要求31-34中任一项的嵌合味觉受体的核酸序列。
36.稳定表达根据权利要求35的核酸序列的细胞。
37.瞬时表达根据权利要求35的核酸序列的细胞。
38.用于鉴定推定的味觉调节化合物的筛选测定法,所述方法包括:
(i)让根据权利要31-34中任一项的嵌合味觉受体与至少一种推定的味觉调节化合物接触,所述的味觉受体与T1R3多肽或其变体或片段结合,并且
(ii)检测所述化合物是否特异性结合和/或调节所述嵌合味觉受体多肽的活性。
39.权利要求38的测定法,其中在人或动物品尝试验中进一步评价所述阳性化合物来确认其对味觉的效果。
40.权利要求38的测定法,所述测定法包括测定所述化合物对由另一种化合物激活所述嵌合味觉受体的影响,以便检测其是否起到增强剂的功能。
41.权利要求40的测定法,其中所述其它化合物是甜味配体。
42.权利要求40的测定法,其中所述其它化合物是鲜味配体。
43.权利要求40的测定法,其中在将所述嵌合味觉受体与已知的所述嵌合味觉受体的激活剂接触前,将所述的嵌合受体与所述推定的味觉调节剂预先孵育。
44.权利要求43的测定法,其中在测定所述推定的味觉调节化合物的效果前,将所述嵌合味觉受体与所述嵌合味觉受体的已知激活剂预先孵育。
45.权利要求41的测定法,其中所述甜味配体是天然的增甜剂或人造增甜剂。
46.权利要求38的测定法,其中所述的嵌合受体包含于细胞膜上。
47.权利要求38的测定法,其中所述的嵌合味觉受体由细胞表达。
48.权利要求47的测定法,其中所述的细胞是哺乳动物细胞或卵母细胞。
49.权利要求38的测定法,其是荧光测定法。
50.权利要求38的测定法,其是电生理测定法。
51.权利要求38的测定法,其是结合测定法。
52.权利要求38的测定法,其中所述嵌合受体直接地或间接地共价或非共价连接至固相上。
53.权利要求38的测定法,其是结合测定法。
54.权利要求53的测定法,其是竞争结合测定法。
55.权利要求38的测定法,其检测所述推定的味觉调节化合物对细胞内离子的作用。
56.权利要求55的测定法,其中所述离子是钙离子。
57.权利要求56的测定法,其中所述化合物对钙离子的作用用膜敏感染料或电压敏感染料检测。
58.权利要求57的测定法,其中所述的读取是荧光测定。
59.权利要求38的测定法,其检测所述推定的味觉调节化合物对离子极化的作用。
60.权利要求38的测定法,其检测所述化合物对第二信使水平的作用。
61.权利要求60的测定法,其中所述第二信使是IP3。
62.权利要求38的测定法,其检测所述推定的味觉调节化合物对细胞内环核苷酸的作用。
63.权利要求62的测定法,其中所述核苷酸是cGMP或cAMP。
64.权利要求38的测定法,其使用荧光成像。
65.权利要求38的测定法,其检测所述化合物对G蛋白结合GTPγS的作用。
66.权利要求38的测定法,其用于检测鲜味增强剂。
67.权利要求38的测定法,其用于检测甜味增强剂。
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