CN101467040A - 对乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的宁和地那铵的人t2r受体和鉴定人苦味调节剂的相关测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以下发现：T2R味觉感受器家族中的特异性人味觉感受器对特定的苦味配体，即，对乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的宁和地那铵作出反应。本发明进一步涉及这些感受器在鉴定配体的测定法中的应用，所鉴定的配体调节这些味觉感受器的活化并且可以用作食品、饮料和药物中的添加剂以调节(阻断)与T2R－相关的苦味。

Description

对乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的宁和地那铵的人T2R受体和鉴定人苦味调节剂的相关测定方法

相关申请

本申请要求2005年2月8日提交的美国临时申请顺序号US60/650,555的优先权。本申请还涉及2002年7月10日提交的美国顺序号US 10/191,058和2001年4月5日提交的美国顺序号US09/825,882。将所有这些临时和非临时申请完整地引入本文作为参考。这些申请涉及对人苦味味觉感受器(hT2R)的鉴定和对活化这些特异性hT2R的配体的鉴定。

发明领域

本发明涉及对活化许多以前报导的涉及苦味感觉的T2R家族中的人G-蛋白偶联受体(GPCR)的阐明。具体地，本发明涉及如下发现：hT2R8、hT2R54和hT2R75对苦味配体雷尼替丁作出特异性反应；hT2R54对可在某些使用者中引起苦味余味的非类固醇抗炎药对乙酰氨基酚作出特异性反应；hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75对苦味配体苯甲酸地那铵作出特异性反应；和hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54和hT2R75对苦味毒素士的宁作出特异性反应。

基于这些发现，这些人味觉感受器、其片段或变体或嵌合体，包括直向同源物、剪接变体、单核苷酸多态性(SNPS)及其遗传工程突变体可用于测定法，优选基于高流通量细胞的测定法，这些测定法用于鉴定调节(优选阻断)士的宁、对乙酰氨基酚、雷尼替丁和地那铵以及结构相关化合物和活化这些感受器的其它化合物的苦味的化合物。使用这些测定方法鉴定的化合物可以用作食品、饮料或药物产品的添加剂以便改善其味道。

相关领域的描述

人可以识别的基本味道之一是苦味。到目前为止，对苦味的生理学了解得非常不够。目前的研究已经开始阐明味觉生物学(Lindemann，Nature(2001))。目前认为许多苦味化合物通过与细胞表面受体发生相互作用产生苦味。这些受体属于与胞内G蛋白发生相互作用的七个跨膜区受体的家族。

在本发明之前约5年，在人或啮齿动物中鉴定了新的GPCR家族，称作T2R(Adler等，Cell 100(6)：693-702(2000)；Chandrashekar等，Cell 100(6)：703-711(2000)；Matsunami H，Montmayeur J P，Buck L B.Nature 404(6778)：601-4(2000))。在发现T2R基因家族后不久产生了大量证据提示T2R包含一类至少在啮齿动物和人体内表达的味觉感受器，它们介导对苦味化合物的反应。例如，发现T2R基因在舌和腭上皮细胞的味觉感受器细胞亚类中特异性表达。其次，发现人T2R之一(hT2R1)的基因位于与对苦味化合物6-正-丙基-2-硫尿嘧啶在人体内的敏感性相关的染色体座位上(Adler等，(同上)(2000))。第三，发现小鼠T2R之一(mT2R5)位于与苦味化合物环己酰亚胺在小鼠中的敏感性相关的染色体座位上。另外在报导发现了T2R基因家族及其在苦味转导中的预期作用后不久证实，小鼠T2R，特别是mT2R5可以活化味转导素，即在味细胞中特异性表达并且与苦味刺激转导相关的G蛋白(Wong等，Nature381：796-800(1996))。mT2R5对味转导素的活化仅在对环己酰亚胺作出反应时发生(Chandrashekar等，(同上)(2000)。因此，提出了mT2R家族介导小鼠中的苦味反应，而hT2R家族介导人中的苦味反应。在这一相同的Chandrasekhar参考文献中，证实了一种人T2R，即hT2R4由地那铵特异性活化(Chandrashekar等，(同上)2000)。然而，本研究中使用的有效地那铵浓度(1.5mM)非常高，即高于报导的地那铵对人的苦味阈值10.sup.5-倍(Saroli，Naturwissenschaften 71：428-429(1984))。因此，Chandrashekhar没有令人信服地使特异性苦味配体与任何hT2R相对应。

还预先假定了每个hT2R都能够结合多种苦味配体。这一假定基于以下事实：hT2R家族仅由约40种不同基因组成，而人可以识别数以百计的为苦味的不同化合物。已经预先报导了hT2R的序列并且披露在公开的PCT申请中，即Zuker等的申请(WO 01/18050 A2，(2001))和Adler等的申请(WO 01/77676 A1(2001))，将这两个申请完整地引入本文作为参考。这一由Senomyx(该申请的受让人)提交的Adler的PCT申请披露了该申请涉及的hT2R基因序列和相应的多肽以及其它hT2R基因和多肽。这一Adler的PCT申请正确鉴定了这些不同的hT2R序列编码苦味味觉感受器并且列举了活化作为这些hT2R基因的推定靶标的人的苦味的典型苦味配体。然而，这一在先的Senomyx申请不包含在这里使用特异性苦味配体和特异性人苦味味觉感受器的实验例中举例说明的功能性测定方法，它们确定了hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75的特定苦味配体结合特异性。

最初，研究T2R功能的困难之一在于这些受体不易于在培养的哺乳动物细胞系中表达。为了改善T2R表达，使来自充分表达的GPCR的N-末端序列，即视紫质与T2R序列连接(Chandrashekar等，(同上)2000)。该N-末端标记因可利用的抗体还易于监测蛋白质表达。尽管视紫质标记的掺入改善了某些T2R在哺乳动物细胞系中的表达，但就功能性研究而言，它们中的许多仍然无法得到足够充分的表达。在不同的方法中，mT2R5在昆虫Sf9细胞中得到成功表达并且用于使用生化GTPγS结合测定法的功能性研究(Chandrashekar等，(同上)2000)。

在申请人的在先专利申请US顺序号10/191,058中，申请人在哺乳动物细胞(HEK-293细胞系)中表达了特异性hT2R并且进行了基于细胞的测定，这些测定鉴定了特异性活化三种不同的人T2R，即hT2R4、hT2R44和hT2R61的苦味配体；将该专利申请引入本文作为参考。

然而，虽然已经报导并且了解到人T2R的成员调节人的苦味，但是对鉴定活化其它人T2R受体的特异性配体仍然存在需求。对于不同的人T2R的结合特性的更深入的了解非常有益，因为这将更有利于其在选择具有所需味道调节特性的化合物中的应用，所述的味道调节特性即阻断或抑制供人食用的食品、饮料或药物中特异性苦味化合物的味道。

发明概述

为此，本发明涉及如下发现：T2R家族中的几种味觉感受器，特别是hT2R8、hT2R54和hT2R75由苦味化合物雷尼替丁特异性活化；hT2R54由已知在某些使用者中引起苦味余味的止痛化合物对乙酰氨基酚特异性活化；hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75由众所周知的苦味配体苯甲酸地那铵特异性活化和hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54和hT2R75由苦味毒素士的宁特异性活化。

使用基于细胞的测定方法获得了这些发现，所述的测定方法使用表达特定T2R的细胞在有和没有特异性苦味配体存在下测定了T2R的活性。特别是，如下文更详细描述的，在其表面上表达以上鉴定的特异性T2R并且表达嵌合G蛋白的HEK细胞系用于检测胞内钙浓度改变的基于细胞的测定法，并且发现以上鉴定的特异性T2R由特异性苦味化合物(雷尼替丁、苯甲酸地那铵、士的宁和对乙酰氨基酚)特异性活化，而其它hT2R在相似条件下未被活化。

因此，本发明包括这些人味觉感受器在测定方法，优选高流通量测定法中鉴定阻断雷尼替丁、苯甲酸地那铵、士的宁和对乙酰氨基酚以及相关和其它苦味化合物活化这些受体的化合物的应用。

本发明还包括这样的方法，这些方法包括证实这些化合物阻断品尝试验中的苦味。此外，本发明包括所鉴定的化合物在食品、饮料和药物中抑制苦味，例如与药物产品中对乙酰氨基酚相关的苦味的应用。

发明目的

本发明的一个目的在于鉴定调节，优选阻断hT2R8、hT2R54或hT2R75或其片段、变体、直向同源物或嵌合体活化的化合物，所述的hT2R8、hT2R54或hT2R75或其片段、变体、直向同源物或嵌合体由雷尼替丁或结构上与雷尼替丁相关的活化这些受体中的至少一种的化合物活化。

本发明的另一个目的在于鉴定调节，优选阻断hT2R54或其片段、变体、直向同源物或嵌合体活化的化合物，所述的hT2R54或其片段、变体、直向同源物或嵌合体由对乙酰氨基酚或结构上与之相关的活化hT2R54的化合物活化。

本发明的另一个目的在于鉴定调节，优选阻断hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75活化的化合物，所述的hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75由地那铵或结构上与之相关的特异性活化这些受体中的至少一种的化合物活化。

本发明的另一个具体目的在于鉴定调节，优选阻断hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54或hT2R75活化的化合物，所述的hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54或hT2R75由士的宁或结构上与之相关的特异性活化所述受体中的至少一种的化合物活化。

本发明的另一个具体目的在于在鉴定调节，优选阻断雷尼替丁或结构相关化合物活化所述受体中的至少一种的化合物的测定方法中使用包含或(稳定或瞬时)表达hT2R8、hT2R54或hT2R75或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的细胞或细胞膜。

本发明的另一个具体目的在于在鉴定调节，优选阻断对乙酰氨基酚或结构相关化合物活化所述受体的化合物的测定方法中使用包含或(稳定或瞬时)表达hT2R54或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的细胞或细胞膜。

本发明的另一个具体目的在于在鉴定调节，优选阻断地那铵或结构相关化合物活化所述受体的化合物的测定方法中使用包含或(瞬时或稳定)表达hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的细胞或细胞膜。

本发明的另一个目的在于在鉴定调节，优选阻断士的宁或结构相关化合物活化所述受体中的至少一种的化合物的测定方法中使用包含或(瞬时或稳定)表达hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54或hT2R75或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的细胞或细胞膜。

本发明的一个更具体的目的在于在基于细胞的测定方法中使用细胞，优选哺乳动物、两栖动物或昆虫细胞，例如表达与其偶联的G蛋白，例如G_α15、G_α16、味转导素或其嵌合体的HEK293T细胞，所述的基于细胞的测定方法用于检测胞内钙的改变以便检测调节由雷尼替丁、对乙酰氨基酚、地那铵或士的宁活化上述人味觉感受器之一的化合物。

本发明的另一个目的在于证实所鉴定的化合物调节，优选阻断苦味，例如因雷尼替丁、对乙酰氨基酚、地那铵或士的宁在品尝试验，优选在人的品尝试验中引起的苦味。

本发明的另一个目的在于使用在本文所述的测定方法中鉴定的化合物作为调节，优选阻断由特异性活化这些味觉感受器的化合物诱导的苦味的组合物中的添加剂。本发明的优选目的在于使用抑制hT2R54的化合物来阻断包含对乙酰氨基酚的药物组合物，特别是儿科用药的苦味。

附图详细描述

附图1包含表示hT2R8、hT2R54和hT2R75对10μM的雷尼替丁作出反应，但对相同浓度下的蔗糖不作出反应的钙成像实验结果。

附图2表示hT2R8和hT2R54对雷尼替丁的剂量反应。

附图3包含表示hT2R54对10μM的对乙酰氨基酚作出特异性反应，但对相同浓度下的DPBS或水杨苷不作出反应的钙成像实验结果。

附图4表示hT2R54对对乙酰氨基酚和地那铵的剂量反应。

附图5包含表示hT2R10、hT2R8、hT2R61、hT2R54、hT2R75和hT2R13对苯甲酸地那铵作出特异性反应的钙成像实验结果。

附图6表示hT2R8对地那铵的剂量反应。

附图7包含揭示出hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54和hT2R75对士的宁作出特异性反应的钙成像实验结果。

发明详述

在具体描述本发明之前，提供下列定义。

术语＂T2R＂家族包括如下特征的多态变体、等位基因、突变体和同源物：(1)与下文披露的T2R具有约30-40％的氨基酸序列同一性，更具体的是约40，50，60，70，75，80，85，90，95，96，97，98或99％的氨基酸序列同一性，并且在Zuker(同上)(2001)和Adler(同上)(2001)申请(引入本文作为参考)中在约25个氨基酸，最佳50-100个氨基酸的窗内；(2)特异性结合针对包含选自下文披露的T2R序列及其保守性修饰的变体的氨基酸序列的免疫原产生的抗体；(3)在严格杂交条件下与选自下文披露的T2R DNA序列及其保守性修饰的变体的序列特异性杂交(具有至少约100，任选地至少约500-1000个核苷酸的大小)；(4)包含至少约40％与选自下文披露的T2R氨基酸序列的氨基酸序列相同的序列；或(5)由在严格杂交条件下与所述T2R序列特异性杂交的引物扩增。

特别地，这些＂T2R′s＂包括称作hT2R8，hT2R9，hT2R10，hT1R13，hT2R54，hT2R61和hT2R75的具有本申请中所提供的核酸序列和氨基酸序列的味觉感受器GPCR及其如下文所述特异性结合苦味配体，即雷尼替丁、对乙酰氨基酚、地那铵和/或士的宁的变体、等位基因、突变体、直向同源物和嵌合体。

尽管T2R基因在蛋白质和DNA水平上均表现出显著的序列趋异，但是已经发现迄今为止分离的所有T2R均包含某些共有序列，特别是与前述Adler等WO 01/77676 A1(2001)和Zuker等WO 01/18050 A2中鉴定的T2R共有序列相同或与所述的T2R共有序列具有至少70-75％的序列同一性的区域，将所述的两个申请引入本文作为参考。

从拓扑学来看，某些化学感受GPCR具有＂N-末端结构域＂，＂胞外域＂，包含七个跨膜区的＂跨膜结构域＂和相应的胞质和胞外环，即＂胞质区＂和＂C-末端区＂(例如，参见Hoon等，Cell，96：541-51(1999)；Buck & Axe1，Cell，65：175-87(1991))。可以使用本领域技术人员公知的方法，诸如鉴定疏水性和亲水性结构域的序列分析程序从结构上鉴定这些区域(例如，参见Stryer，Biochemistry，(第3版，1988)；另外，参见许多基于互联网的序列分析程序中的任一种，诸如在dot.imgen.bcm.tmc.edu上存在的那些程序)。这些区域可用于制备嵌合蛋白并且可用于本发明的体外测定方法，例如配体结合测定法。

＂胞外域＂因此意指从细胞膜中凸出来的并且暴露于细胞的胞外表面上的T2R多肽的结构域。这类区域可以包括暴露于细胞的胞外表面上的＂N-末端结构域＂和暴露于细胞的胞外表面上的跨膜结构域的胞外环，即跨膜区2与3，跨膜区4与5和跨膜区6与7之间的胞外环。＂N-末端结构域＂从N-末端开始并且延伸至接近跨膜区起始处的区域。这些胞外区域可用于体外配体结合测定，即有可溶性的，又有固相的。此外，下述跨膜区也可以与胞外区共同或单独参与配体结合并且因此也可用于体外配体结合测定。

包含七个跨膜＂区＂的＂跨膜结构域＂意指位于质膜内并且还可以包括也称作跨膜＂区＂的相应胞质(胞内)和胞外环的T2R多肽的结构域。可以使用如Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-32(1982))或Stryer，文献同上中所述的标准方法鉴定七个跨膜区及胞外和胞质环。

＂胞质域＂意指面向细胞内部的T2R蛋白结构域，例如，＂C-末端结构域＂和跨膜结构域的胞内环，例如跨膜区1与2，跨膜区3与4和跨膜区5与6之间的胞内环。＂C-末端结构域＂意指从最后一个跨膜区的末端延伸到蛋白质的C-末端且通常位于胞质内的区域。

术语＂7-跨膜受体＂意指属于具有横跨质膜7次的七个区域的跨膜蛋白超家族的多肽(因此，这七个区域被称作＂跨膜＂或＂TM＂结构域TM I-TM VII)。嗅觉和某些味觉感受器家族各自属于该超家族。7-跨膜受体多肽具有相似的和特有的一级、二级和三级结构，如以下详细讨论的。

术语＂配体结合区＂意指来源于实质上并入跨膜结构域II-VII(TMII-VII)的化学感受或味觉感受器的序列。该区域能够结合配体，且更具体地说，能够结合诱发味觉的化合物。

术语＂质膜转运结构域＂或简称为＂转运结构域＂意指功能上与典型的转运结构域(5’-MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV；SEQ ID NO：1)等效的多肽结构域。这些肽结构域在被掺入多肽编码序列的氨基末端时能够以极大的效率＂陪伴＂杂合(＂融合＂)蛋白或将所述蛋白＂转运＂到细胞膜上。这种特定的＂转运结构域＂最初来源于人视紫质受体多肽，即7-跨膜受体的氨基末端。另一种转运结构域来源于牛视紫质序列并且也可用于促进转运。视紫质衍生序列特别有效地将7-跨膜融合蛋白转运到质膜上。

＂功能等效性＂意指结构域在相似条件下与典型SEQ ID NO：1同样有效地将新近翻译的蛋白质转运到质膜上的能力和效率；可以如本文所述测定(以定量的方式)和比较相对效率。可以通过常规筛选根据在细胞(哺乳动物、非洲蟾蜍属(Xenopus)等)中将新近合成的多肽转运到质膜上的效率确定属于本发明范围的结构域，其效率与20个氨基酸长度的转运结构域SEQ ID NO：1的效率相同。

在用于测试调节T2R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定方法中的术语＂功能作用＂包括确定间接或直接在该受体影响下的任何参数，例如功能、物理和化学作用。它包括体外、体内和离体情况下的配体结合、离子流的改变、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或脱磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如cAMP、cGMP、IP3或胞内Ca²⁺)，并且还包括其它生理作用，诸如神经递质或激素释放的增加或减少。

所谓＂确定功能作用＂意指对可以增加或降低间接或直接在T2R家族成员影响下的参数，例如功能、物理和化学作用的化合物的测定方法。可以通过本领域技术人员公知的任何方式测定这类功能作用，例如，光谱特征(例如荧光、吸收度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解度特性、膜片钳、电压灵敏染料、全细胞电流、放射性同位素射流、诱导型标记、卵母细胞T2R基因表达的改变；组织培养细胞T2R表达；T2R基因的转录活化；配体结合测定；电压、膜电位和电导率改变；离子流测定；胞内第二信使，诸如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3)的改变；胞内钙水平的改变；神经递质释放等。

T2R蛋白受体的＂抑制剂＂、＂活化剂＂和调节剂＂可以互换使用，是指使用体外和体内味觉转导测定法鉴定的抑制、活化或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂及其同系物和模拟物。抑制剂为例如结合，部分或完全阻断刺激、降低、预防、延缓活化、灭活、脱敏或减量调节味觉转导的化合物，例如拮抗剂。活化剂为例如结合、刺激、增加、开启、触发、促进、增强活化、致敏或增量调节味觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改变受体与如下成分相互作用的化合物：结合活化剂或抑制剂的胞外蛋白(例如ebnerin和疏水性载体家族中的其它成员)；G蛋白；激酶(例如视紫质激酶及受体失活和脱敏中所涉及的β肾上腺素能受体激酶的同系物)；和也使受体失活和脱敏的抑制蛋白。调节剂包括T2R家族成员的基因修饰形式，例如具有改变的活性，以及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。

这类抑制剂和活化剂的测定方法包括：例如表达细胞或细胞膜中的T2R家族成员，在有或没有调节例如苦味化合物的化合物存在下施用推定的调节剂化合物，且然后如上所述测定对味觉转导的功能作用。将包含用潜在的活化剂、抑制剂或调节剂处理的T2R家族成员的样品或测定方法与不使用抑制剂、活化剂或调节剂处理的对照样品进行比较，以便检验调节程度。将对照样品(未用调节剂处理)指定为具有100％的相对T2R活性值。在T2R活性值相对于对照而言约为80％，任选地为50％或25-0％时实现对T2R的抑制。在T2R活性值相对于对照而言为110％，任选地为150％，任选地为200-500％或1000-3000％以上时实现对T2R的活化。

本文所用的“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”意指不含本发明的化合物一般以其天然状态与之结合的其它不同的化合物。优选，“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”意指其组成构成指定样品质量(按重量计)的至少0.5％，1％，5％，10％或20％且最优选至少50％或75％。在一个优选的实施方案中，这些术语是指占指定样品的质量(以重量计)至少95％的本发明的化合物。本文所用的术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”在指一种核酸或蛋白质，或多种核酸或蛋白质时，也指不同于天然存在于哺乳动物，尤其是人体内的状态的纯化或浓缩的状态。大于天然存在于哺乳动物，尤其是人体内的程度的纯化或浓缩的任何程度属于＂分离的＂含义，所述程度包括：(1)从其它相关结构或化合物中纯化或(2)与在哺乳动物，尤其是人体中一般不与之结合的结构或化合物结合。可以按照本领域技术人员公知的各种方法和过程分离本文所述的核酸或蛋白质或核酸或蛋白质类，或相反使之与它们本质上一般不结合的结构或化合物结合。

本文所用的术语＂分离的＂在指核酸或多肽时意指不同于天然存在于哺乳动物，尤其是人体内的状态的纯化或浓缩状态。大于天然存在于体内的程度的纯化或浓缩的任何程度属于本文所用的＂分离的＂含义，所述程度包括：(1)从其它天然存在的相关结构或化合物中纯化；或(2)与一般在体内不与结合的结构或化合物结合。可以按照本领域技术人员公知的各种方法和过程分离本文所述的核酸或多肽，或相反使之与它们本质上一般不结合的结构或化合物结合。

本文所用的术语＂扩增＂意指如以下详细描述的使用任何合适的扩增技术产生或检测重组或天然表达的核酸。例如，本发明提供了用于在体内或体外扩增(例如通过聚合酶链反应PCR)本发明的天然表达的(例如基因组或mRNA)或重组的(例如cDNA)核酸(例如本发明的结合诱发味觉的化合物的序列)的方法和试剂(例如特异性寡核苷酸引物对)。

术语＂表达载体＂意指目的在于在任何细胞中以组成型或诱导型方式体外或体内表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统，所述的细胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括仍然为附加型或整合入宿主细胞基因组的表达系统。这些表达系统可以具有或不具有自我复制的能力，即在细胞内仅驱动瞬时表达。该术语包括仅包含转录重组核酸所需的最少元件的重组表达＂盒＂。

术语＂文库＂意指为不同核酸或多肽分子的混合物的制品，诸如重组产生的感受器，特别是通过使用简并引物对扩增核酸产生的味觉感受器配体结合区的文库，或并入扩增的配体结合区的载体的分离收集物，或各自被编码味觉感受器的至少一种载体随机转染的细胞混合物。

术语＂核酸＂或＂核酸序列＂意指单链或双链形式的脱氧核苷酸或核苷酸寡核苷酸。该术语包括包含已知天然核苷酸类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语还包括具有合成主链的核酸样结构。

除非另外指明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守性修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，可以通过产生例如一个或多个选择的密码子中的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列实现简并密码子置换(Batzer等，Nucleic Acid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.，260：2605-08(1985)；Rossolini等，MoL Cell.Probes，8：91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

术语＂多肽＂、＂肽＂和＂蛋白质＂在本文中可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

本文所述的＂转运结构域＂、＂配体结合区＂和嵌合受体组合物还包括具有基本上相当于典型序列的结构和活性的＂类似物＂或＂保守性变体＂和＂模拟物＂(＂肽模拟物＂)。因此，术语＂保守性变体＂或＂类似物＂或＂模拟物＂意指具有修饰的氨基酸序列的多肽，使得其中的改变基本上不会改变如本文所定义的多肽(保守性变体)的结构和/或活性。这些术语包括氨基酸序列的保守性修饰变化，即，那些对蛋白质活性而言并不关键的残基的氨基酸置换、添加或缺失或用具有相似特性的残基(例如酸性、碱性、带正电荷或带负电荷、极性或非极性等)置换氨基酸，使得甚至关键的氨基酸置换也基本上不会改变结构和/或活性。

更具体地说，＂保守性修饰的变体＂适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守性修饰的变体意指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，意指基本上相同的序列。因为遗传密码子的简并性，所以大量功能相同的核酸编码任何指定的蛋白质。

例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一由密码子限定丙氨酸的位置上，该密码子可以被改变成任何所述的相应密码子，但不会改变编码的多肽。

这类核酸变化为＂沉默变化＂，其为保守性修饰变化的一个种类。编码多肽的本文的每个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变化。本领域技术人员公认可以修饰核酸中的每一密码子(除一般为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和一般为色氨酸的唯一密码子TGG外)以便产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变化均暗示了每个所述的序列。

提供功能类似氨基酸的保守置换表为本领域众所周知的。例如，一种选择保守置换的典型指导原则包括(原始残基后面跟随典型置换)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。可选择的典型指导原则使用如下的6种基团，它们各自包含彼此为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(另外参见：例如Creighton，Proteins，W.H.Freeman和Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag(1979))。本领域技术人员会意识到上述置换并非唯一可能的保守置换。例如，为了某些目的，可以将所有带电荷的氨基酸视为彼此保守置换，无论它们是带正电荷还是负电荷。此外，还可以将在编码的序列中改变、添加或缺失单一氨基酸或较小百分比的氨基酸的各置换、缺失或添加视为＂保守性修饰变化＂。

术语＂模拟物＂和＂肽模拟物＂意指具有基本上相同的多肽类结构和/或功能特征，例如本发明的转运结构域、配体结合区或嵌合受体的合成化合物。模拟物可以完全由合成的非天然氨基酸类似物组成，或可以为部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物还可以掺入任何量的天然氨基酸保守置换，只要这类置换也基本上不会改变该模拟物的结构和/或活性。

就为保守性变体的本发明的多肽而言，常规实验可以确定模拟物是否在本发明范围内，即其结构和/或功能基本上未改变。多肽模拟物组合物可以包含非天然结构成分的任意组合，这些非天然结构成分一般来自三种结构基团：a)非天然酰胺键(＂肽键＂)连接的残基连接基团；b)代替天然存在的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构拟态，即诱导或稳定二级结构的残基，例如β转角、γ转角、β片层、α螺旋构象等。多肽可以在其所有或某些残基通过化学方式而非天然肽键连接时被表征为模拟物。各肽模拟物残基可以通过肽键、其它化学键或偶联方式连接，诸如，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯类、双官能马来酰亚胺类、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可以作为传统的酰胺键(＂肽键＂)连接的备选的连接基包括：例如南五味子酮(例如，对于--C(.＝O)--NH--)的--C(.＝.O)--CH₂、氨基亚甲基(CH₂NH)、亚乙基、烯烃(CH.dbd.CH)、醚(CH₂O)、硫醚(CH₂-S)、四唑(CN₄)、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(例如，参见Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，267-357，Marcell Dekker，PeptideBackbone Modifications，NY(1983))。多肽还可以通过包含所有或某些非天然残基代替天然存在的氨基酸残基被表征为模拟物；非天然残基在科学和专利文献中进行了充分的描述。

＂标记＂或＂可检测部分＂为通过分光光度、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的组合物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子密试剂、酶(例如，如ELISA中通常使用的)、生物素、地高辛配基或可以例如通过将放射性标记掺入肽而成为可检测的或用于检测与肽特异性反应的抗体的半抗原和蛋白质。

＂标记的核酸探针或寡核苷酸＂是通过接头或化学键以共价形式或通过离子键、范德瓦尔斯键、静电或氢键以非共价形式与标记结合，使得可以通过检测与探针结合的标记的存在检测探针的存在的标记的核酸探针或寡核苷酸。

将本文所用的＂核酸探针或寡核苷酸＂定义为能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基对，通常通过氢键形成结合互补序列的靶核酸的核酸。本文所用的探针可以包括天然(即A、G、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，探针中的碱基可以通过非磷酸二酯键的键合而连接，只要它不会干扰杂交。因此，例如，探针可以为肽核酸，其中成分碱基通过非磷酸二酯键的肽键连接。本领域技术人员可以理解，根据杂交条件严格性的不同，探针可以使缺乏完整互补性的靶序列与该探针序列结合。任选地如用同位素、发色团、发光团、色原直接标记探针或如用随后链霉抗生物素复合物可以与其结合的生物素间接标记探针。通过测定存在或不存在探针，可以检测存在或不存在选择的序列或亚序列。

术语＂异源＂在用于指核酸的部分时表示该核酸包含两种或多种实际上发现彼此并非具有相同的亲缘关系的亚序列。例如，一般可以通过重组方式生产核酸，它们具有两种或多种来自排列形成新的功能核酸的无关基因的序列，例如来自一种来源的启动子和来自另一种来源的编码区。类似地，异源蛋白表示该蛋白质包含两种或多种实际上发现彼此并非具有相同的亲缘关系的亚序列(例如融合蛋白)。

将＂启动子＂定义为指导核酸转录的一系列核酸序列。本文所用的启动子包括接近转录起始位点的必需核酸序列，诸如就聚合酶11型启动子而言，为TATA元件。启动子还任选地包括远侧增强子或阻抑元件，它们可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。＂组成型＂启动子为在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。＂诱导型＂启动子为在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语＂可操作地连接＂意指核酸表达控制序列(诸如启动子或转录因子结合位点阵列)与第二种核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导相当于第二种序列的核酸的转录。

本文所用的＂重组＂意指合成或以另外的方式在体外操作的多核苷酸(例如＂重组多核苷酸＂)，使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法，或由重组多核苷酸编码的多肽(＂重组蛋白质＂)。＂重组方式＂还包括将具有各种来自不同来源的编码区或结构域或启动子序列连入表达盒或载体，以便表达，例如诱导型或组成型表达包含本发明转运结构域和使用本发明的引物扩增的核酸序列的融合蛋白。

用语＂选择性(或特异性)杂交＂意指在严格杂交条件下分子仅与特定的核苷酸序列结合、双链结合或杂交，此时该序列存在于复合混合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中。

用语＂严格杂交条件＂意指探针可与其靶亚序列(一般在核酸的复合混合物中)杂交，但不与其它序列杂交的条件。严格条件为序列依赖性的并且在不同的环境中是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导原则可以在Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology--Hybridisation withNucleic Probe，＂Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays＂(1993)中找到。一般而言，将严格条件选择为低于特异性序列在确定的离子强度、pH下的热解链点(Tm)约5-10℃。Tm为50％的与靶标互补的探针与平衡态的靶序列杂交时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(当靶序列在Tm下以过量存在时，50％的探针在平衡状态下)。严格条件为其中在pH7.0-8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，一般约为0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)且对短探针而言(例如10-50个核苷酸)温度至少约30℃而对长探针而言(例如大于50个核苷酸)至少约60℃的条件。还可以通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺达到严格条件。为了选择性或特异性杂交，阳性信号至少为背景的2倍，任选10倍于背景杂交。典型的严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5xSSC和1％ SDS，在42℃下孵育；或5xSSC、1％SDS，在65℃下孵育与在65℃下0.2xSSC和0.1％ SDS中洗涤。例如，可以将这类杂交和洗涤步骤进行例如1，2，5，10，15，30，60分钟或60分钟以上。

在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上相关的，条件是它们编码的多肽是基本上相关的。例如，这种情况在使用遗传密码子所允许的最大密码子简并性生成核酸拷贝时发生。在这类情况中，核酸一般在中等严格杂交条件下杂交。典型的＂中等严格杂交条件＂包括在37℃下在40％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS缓冲液中杂交和在45℃下在1xSSC中洗涤。例如，可以将这类杂交和洗涤步骤进行1，2，5，10，15，30，60分钟或60分钟以上。阳性杂交至少为背景的2倍。本领域技术人员易于认识到备选的杂交和洗涤条件可以用于提供类似严格性的条件。

＂抗体＂意指包含特异性结合和识别抗原的来自免疫球蛋白基因或其片段的构架区的多肽。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及众多免疫球蛋白可变区基因。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε，依次确定了免疫球蛋白的类型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条＂轻＂链(约25kDa)和一条＂重＂链(约50-70kDa)。每条链的N-末端确定了主要导致抗原识别的约100-110个或110个以上氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别意指这些轻链和重链。

＂嵌合抗体＂为抗体分子，其中：(a)恒定区或其部分被改变，置换或交换，以便抗原结合部位(可变区)与不同或改变的类型，效应子功能和/或种类或给所述嵌合抗体赋予新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等的恒定区连接；或(b)可变区或其部分被改变，被具有不同或改变的抗原特异性的可变区置换或与之交换。

＂抗-T2R＂抗体为特异性结合由T2R基因、cDNA或其亚序列编码的多肽的抗体或抗体片段。

术语＂免疫测定＂为使用特异性结合抗原的抗体的测定法。免疫测定的特征在于使用使用特定抗体的特异性结合特性分离，靶向和/或定量抗原。

术语＂特异性(或选择性)结合＂抗体或＂特异性(或选择性)与...发生免疫反应＂在指蛋白质或肽时意指确定蛋白质和其它生物学样品的异源性群体中存在该蛋白质的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定抗体结合特定蛋白质至少为背景的2倍并且基本上不会大量结合样品中存在的其它蛋白质。在这类条件下特异性结合抗体可能需要根据其对特定蛋白质的特异性选择的抗体。

例如，可以从诸如大鼠、小鼠或人这类具体物种中选择对T2R家族产生的多克隆抗体以便仅获得那些与T2R多肽或其免疫原性部分发生特异性免疫反应，而不与其它蛋白质发生特异性免疫反应的多克隆抗体，除了T2R多肽的直向同源物或多态变体和等位基因以外。可以通过扣除与来自其它物种的T2R分子或其它T2R分子交叉反应的抗体进行这种选择。还可以选择仅识别T2R GPCR家族成员，但不识别来自其它家族的GPCR的抗体。各种免疫测定方式可以用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测定选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(例如，参见Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，(1988)，有关可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件的描述)。一般而言，特异性或选择性反应至少为背景信号或噪声的2倍，并且更典型的是高于背景的10-100倍。

术语＂选择性与...结合＂意指如上所定义的核酸与另一种核酸＂选择性杂交＂的能力或如上所定义的抗体＂选择性(或特异性)结合＂蛋白质的能力。

术语＂表达载体＂意指目的在于在任何细胞中以组成型或诱导型方式在体外或体内表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统，所述的细胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括仍然为附加型或整合入宿主细胞基因组的表达系统。这些表达系统可以具有或不具有自我复制的能力，即在细胞内仅驱动瞬时表达。该术语包括仅包含转录重组核酸所需的最少元件的重组表达＂盒＂。

所谓＂宿主细胞＂意指包含表达载体并且支持该表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以为：原核细胞，诸如大肠杆菌；或真核细胞，诸如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，诸如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。

基于以上描述，本发明提供了用于鉴定化合物的测定方法，所述的化合物调节，优选阻断由苦味化合物导致的上述的人苦味味觉感受器的特异性活化，所述的苦味化合物即雷尼替丁、对乙酰氨基酚、地那铵、士的宁或结构相关化合物。特别是，本发明提供了用于鉴定化合物的基于细胞的测定方法，所述的化合物调节(例如阻断)hT2R8、hT2R54或hT2R75对雷尼替丁或结构相关化合物的活化；hT2R54对对乙酰氨基酚或结构相关化合物的活化；hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75对苯甲酸地那铵或结构相关化合物的活化；或hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54或hT2R75对士的宁或结构相关化合物的活化。预计这些化合物可调节与这些人受试者的味觉感受器相关的苦味。这一结果可以在品尝试验中得以证实。

使用HEK293表达系统和其它出版物以及本受让人提交的专利申请，例如美国顺序号US10/191,058和US09/825,882中报导的钙成像法确定上述味觉感受器特异性应答苦味配体，即乙酰氨基酚、苯甲酸地那铵、士的宁和雷尼替丁，将所述的两个申请完整地引入本文作为参考。更具体地说，本发明人用特定的hT2R与嵌合G蛋白(G16 gust 44)一起转染了HEK293细胞，所述的嵌合G蛋白包含通过用味转导素的那些氨基酸残基置换羧基-44的氨基酸残基修饰的G_α14G蛋白序列，并且本发明人通过钙成像法记录了这些细胞对特异性苦味配体的反应。

如附图1中所示，发现hT2R8、hT2R54和hT2R75对10μM浓度下的雷尼替丁作出反应，但对相同浓度下的蔗糖无反应。因此，这些细胞或其它功能上表达这些受体的细胞可以用于鉴定调节雷尼替丁活化，优选阻断这些受体的雷尼替丁活化的化合物的测定方法。

此外，如附图2中所示，观察到hT2R8和hT2R54以剂量依赖性方式作出特异性反应，其中味觉检测阈值为78μM(n＝4)。

此外，如附图3中所示，使用这些相同的钙成像实验观察到hT2R54对10μM下的对乙酰氨基酚作出特异性反应，但对相同浓度下的DPBS或水杨苷无反应。

这一结果在评价hT2R54对地那铵和对乙酰氨基酚的剂量反应的实验中得以证实(其中人对对乙酰氨基酚的苦味阈值为1.25μM并且；对地那铵的EC50为0.38μM而对对乙酰氨基酚的EC50为1.83μM)。这些结果证实了功能上表达hT2R54的细胞可以用于鉴定调节苦味的配体的测定方法，所述的调节苦味的配体特别是调节由对乙酰氨基酚、地那铵或结构相关化合物引起的苦味的化合物。这是一个重大发现，例如倘若对乙酰氨基酚广泛应用于药物，包括那些用于儿童的药物中，并且其中鉴定阻断与之相关的苦味的化合物可以改善这类化合物的适口性并且增进其在口服剂型中的应用。

此外，如附图5中所示，类似的钙成像实验揭示出hT2R10、hT2R8、hT2R61、hT2R54、hT2R75和hT1R13特异性应答苯甲酸地那铵。附图6中包含的实验证实了hT2R8以剂量特异性方式对地那铵作出反应(EC50为0.45mM且味觉检测阈值为24mM)。

这些结果表明功能上表达hT2R8、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75味觉感受器任一种的细胞可以用于鉴定调节与hT2R8、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75相关的苦味，例如由地那铵或结构相关化合物引起的苦味的配体的测定方法中。

最后，使用相同的钙成像实验获得的附图7中包含的结果揭示出hT2R8、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75各自特异性应答士的宁。

基于以上描述，功能上表达hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75味觉感受器中至少一种的细胞可以用于鉴定调节与hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75中任一种相关的苦味，特别是由地那铵、对乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的宁或结构相关化合物引起的苦味的化合物的测定方法中。

优选这些测定方法将使用表达编码具有下文鉴定的氨基酸序列之一的hT2R的DNA的测试细胞。然而，预计保持这些苦味味觉感受器的功能特性，即对某些苦味化合物作出反应的这些受体多肽的片段、直向同源物、变体或嵌合体也可用于这些测定方法中。这类变体的实例包括剪接变体、单核苷酸多态性、等位基因变体和通过重组或化学手段产生或天然存在的突变。下文叙述用于本发明的测定方法和打算用于本发明以鉴定抑制这些受体活化的化合物的测定方法中的T2R的分离和表达方式。

T2R的分离和表达

可以通过充分确立的克隆操作步骤，使用基于本申请中披露的T2R核酸序列构建的探针或引物对本发明的T2R或其片段或变体进行分离和表达。还可以使用本文披露的序列和公知的基于计算机的检索技术，例如BLAST序列检索从人或其它物种的基因组数据库中鉴定相关的T2R序列。在一个具体的实施方案中，本文披露的假基因可以用于鉴定功能性等位基因或相关基因。

表达载体然后可以用于感染或转染用于这些序列功能性表达的宿主细胞。在体外或体内制备和表达这些基因和载体。本领域技术人员可以认识到用于改变和控制核酸表达的所需表型可以通过调节本发明载体内基因和核酸(例如启动子、增强子等)的表达或活性而获得。可以使用对于增加或降低表达或活性描述的任何公知的方法。可以结合在科学和专利文献中充分描述的本领域公知的任何方法或方案实施本发明。

另外，可以通过如在例如下列文献中所述的众所周知的化学合成技术在体外合成这些核酸：Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-18(1982)；Adams，Am.Chem.Soc，105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，Free Radio.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；美国专利US4,458,066。然后可以通过合成互补链并且使这些链在适当条件下一起退火或通过使用带有合适的引物序列的DNA聚合酶增加互补链获得双链DNA片段。

用于操纵核酸，诸如，例如在序列中产生突变，亚克隆，标记探针，测序，杂交等的技术充分描述在科学和专利文献中。例如，参见Sambrook，ed.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Ausubel，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；Tijssen，ed.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology：Hybridization With NucleicAcid Probe，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Elsevier，N.Y.(1993)。

可以通过本领域技术人员众所周知的大量一般方式中的任一种分析核酸、载体、壳体、多肽等并且对其定量。这些方式包括：例如分析生物化学方法，诸如NMR、分光光度法、放射照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)和超扩散色谱法、各种免疫学方法，例如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、DNA印迹分析、RNA印迹分析、斑点印迹分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶或信号扩增方法、放射性标记、闪烁计数和亲和色谱法。

寡核苷酸引物可以用于扩增编码T2R配体结合区的核酸。还可以使用扩增技术克隆或定量测定本文所述的核酸。扩增方法也为本领域众所周知的并且包括：例如聚合酶链反应(PCR)(Innis ed.，PCRProtocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press，N.Y.(1990)；Innis ed.，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995))；连接酶链反应(LCR)(Wu，Genomics，4：560(1989)；Landegren，Science，241：1077(1988)；Barringer，Gene，89：117(1990))；转录扩增(Kwoh，PNAS，86：1173(1989))；自动维持序列扩增(Guatelli，PNAS，87：1874(1990))；Qβ复制酶扩增(Smith，J.Clin.Microbiol，35：1477-91(1997))；自动化Q-β复制酶扩增测定(Burg，MoL Cell.Probe，10：257-71(1996))；和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)。例如，参见Berger，Methods EnzymoL，152：307-16(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利US4,683,195和US4,683,202；Sooknanan，Biotechnology，13：563-64(1995)。

一旦扩增，那么如果需要，就可以使用常规的分子生物学方法，按照本领域公知的方法将单个或作为文库的核酸克隆入多种载体的任一种中；例如，用于克隆体外扩增的核酸的方法描述在美国专利US5,426,039中。为了有利于克隆扩增的序列，可以将限制酶位点＂构建入＂PCR引物对。例如，将Pst I和Bsp E1位点设计成本发明的典型引物对的组成部分。这些特定的限制位点具有在连接时就它们所剪接入的7-膜受体＂供体＂编码序列而言为＂框内＂的序列(连接结合区编码序列为7-膜多肽固有的，因此，如果需要在限制酶剪接位点的下游翻译该构建体，那么应避免异读框结果；如果插入的配体结合区包含基本上大部分的跨膜VII区，那么这种情况可能不是必需的)。可以将引物设计成保留＂供体＂7-膜受体的原始序列。另外，引物可以编码为保守置换(例如对疏水性残基而言为疏水性的，参见上文的讨论)或功能良性置换(例如不会阻止质膜插入，导致通过肽酶的切割，导致受体的异常折叠等)的氨基酸残基。

可以将引物对设计成选择性扩增T2R蛋白的配体结合区。这些结合区可以因不同的配体而不同；因此，可以为一种配体的最小结合区的可能对于第二种潜在的配体却过于有限。因此，可以扩增包含不同结构域结构的不同大小的结合区；例如，7-跨膜T2R的跨膜(TM)结构域II-VII，III-VII，III-VI或II-VI或其变化形式(例如，只有特定结构域的亚序列，使该结构域的顺序混合等)。

因为许多7-膜T2R蛋白的结构域结构和序列为已知的，所以本领域技术人员易于选择结构域侧翼序列和内在结构域序列作为设计简并扩增引物对的模型序列。例如，可以通过使用引物对的PCR扩增生成编码结构域II-VII区的核酸序列。为了扩增包含跨膜结构域I(TMI)序列的核酸，可以由编码上述T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸设计简并引物。这类简并引物可以用于产生并入TM I-TM III、TMI-TM IV、TM I-TM V、TM I-TM VI或TM I-TM VII的结合区)。可以基于本文提供的其它T2R家族共有序列设计其它简并引物。这种简并引物可以用于产生并入TM III-TM IV、TM III-TM V、TM III-TM VI或TM III-TM VII的结合区。

设计简并引物对的范例为本领域众所周知的。例如，可进入COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)策略计算机程序并且直接与用于从一组称作味觉感受器配体结合区的相关蛋白质序列开始进行杂合引物预测的BlockMaker多序列比对站点连接(例如，参见Rose，Nucleic AcidsRes.，26：1628-35(1998)；Singh，Biotechniques，24：318-19(1998))。

合成寡核苷酸引物对的方式为本领域众所周知的。可以使用“天然”碱基对或合成碱基对。例如，使用人造核碱基提供了操纵引物序列和生成更复杂的扩增产物混合物的通用手段。不同家族的人造核碱基能够采取通过内部键旋转的多氢键取向，以便提供用于简并分子识别的方式。将这些类似物掺入PCR引物的单一位置能够生成扩增产物的复合文库。例如，参见Hoops，Nucleic Acids Res.，25：4866-71(1997)。非极性分子也可以用于模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键键合形状模拟物相对于胸腺嘧啶的非极性形状模拟物而言可以有效而选择性地复制(例如，参见Morales，Nat.Struct.Biol.，5：950-54(1998))。例如，两种简并碱基可以为嘧啶碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(例如，参见Hill，PNAS，95：4258-63(1998))。本发明典型的简并引物并入核碱基类似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脱氧-胞苷，3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(序列中的术语“P”，参见上文)。这种嘧啶类似物与嘌呤形成氢键，包括A和G残基。

可以使用上述核酸探针分离基本上与本文披露的味觉感受器相同的多态变体、等位基因和种间同源物。另外，可以将表达文库用于通过使用对T2R多肽形成的也可以识别并且选择性结合T2R同源物的抗血清或纯化的抗体以免疫学方式检测表达的同源物克隆T2R多肽类及其多态变体、等位基因和种间同源物。

可以通过使用合适的(完全的和简并的)引物对扩增(例如PCR)合适的核酸序列产生编码味觉感受器配体结合区的核酸。扩增的核酸可以为来自任何细胞或组织的基因组DNA或来源于表达味觉感受器的细胞的mRNA或cDNA。

在一个实施方案中，可以构建包含编码与转运序列融合的T2R的核酸的杂合蛋白编码序列。还提供了包含转运基元和其它家族的化学感受器，特别是味觉感受器的诱发味觉的化合物结合区的杂合T2R。这些核酸序列可操作地与转录或翻译控制元件，例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列和其它适用于将DNA转录成RNA的序列连接。在构建重组表达盒、载体和转基因的过程中，启动子片段可以用于指导所有所需细胞或组织中所需核酸的表达。

在另一个实施方案中，融合蛋白可以包括C-末端或N-末端转运序列。此外，融合蛋白可以包含额外的元件，例如用于蛋白质检测、纯化或其它应用的元件。有利于检测和纯化的结构域包括：例如金属螯合肽类，诸如聚组氨酸序列段、组氨酸-色氨酸组件或能够在固定化金属上纯化的其它结构域；麦芽糖结合蛋白；能够在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域；或用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(ImmunexCorp，Seattle Wash.)的结构域。

在转运结构域(用于有效质膜表达)与新翻译多肽的剩余部分之间包含可切割接头序列，诸如因子Xa(例如，参见Ottavi，Biochimie，80：289-93(1998))、枯草杆菌蛋白酶识别基元(例如，参见Polyak，Protein Eng.，10：615-19(1997))、肠激酶(Invitrogen，SanDiego，Calif.)等可以用于促进纯化。例如，一种构建体可以包括编码核酸序列的多肽，所述的核酸序列与6个组氨酸残基连接，随后是硫氧还蛋白、肠激酶切割位点(例如，参见Williams，Biochemistry，34：1787-97(1995))和C-末端转运结构域。组氨酸残基有利于检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了从该融合蛋白的剩余部分中纯化所需蛋白质的手段。关于编码融合蛋白的载体的技术和融合蛋白的应用充分描述在科学和专利文献中(例如，参见Kroll，DNA Cell.Biol，.12：441-53(1993))。

可以将作为单个表达载体或作为表达载体文库的包含配体结合区编码序列的表达载体导入基因组或导入细胞的胞质或核中并且通过各种常规技术表达，这些技术充分描述在科学和专利文献中。例如，参见Roberts，Nature，328：731(1987)；Berger文献同上；Schneider，Protein Exper.Purif.，6435：10(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供了有关已知生物学方法的信息。可以从获自诸如ATCC或GenBank文库这类来源的天然来源分离载体或通过合成或重组方法制备它们。

可以在稳定或瞬时地在细胞中表达的表达盒、载体或病毒(例如附加型表达系统)中表达核酸。可以将选择标记掺入表达盒和载体中以便在转化细胞和序列上赋予选择性表型。例如，选择标记可以编码附加型维持和复制，以便无需整合入宿主基因组。例如，标记可以编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如chlorosulfuron或Basta)以便允许选择用所需DNA序列转化的那些细胞(例如，参见Blondelet-Rouault，Gene，190：315-17(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.，281：992-97(1997))。因为赋予底物，如新霉素或潮霉素抗性的选择性标记基因只能用于组织培养中，所以化学抗性基因也用作体外和体内选择性标记。

嵌合核酸序列可以编码任何7-跨膜多肽内的T2R配体结合区。因为7-跨膜受体多肽具有类似的一级序列和二级和三级结构，所以易于通过序列分析鉴定结构域(例如胞外域、TM结构域、胞质域等)。例如，同源性模拟、傅里叶分析和螺旋周期性检测可以鉴定和表征具有7-跨膜受体序列的七结构域。快速傅里叶变换(FFT)算法可以用于评价表征所分析的序列的疏水性和变异性的特征的显性周期。例如，可以如例如Donnelly，Protein Sci.，2：55-70(1993)所述进行周期性检测强化和算出α螺旋周期性指数。其它序列比对和模拟算法为本领域众所周知的(例如，参见Peitsch，Receptors Channels，4：161-64(1996)；Kyte & Doolittle，J.Md.Biol.，157：105-32(1982)；和Cronet，Protein Eng.，6：59-64(1993)。

本发明还不仅包括具有指定核酸和氨基酸序列的核酸分子和多肽，而且包括其片段，特别是例如40，60，80，100，150，200或250个核苷酸或250个以上核苷酸的片段以及例如10，20，30，50，70，100或150个或150个以上氨基酸的多肽片段。任选地，所述的核酸片段可以编码能够结合针对T2R家族成员产生的抗体的抗原性多肽。此外，本发明的蛋白质片段可以任选地为能够结合针对T2R家族成员产生的抗体的抗原性片段。

还关注包含本文所述T2R多肽类中至少一种的至少10，20，30，50，70，100或150个或150个以上氨基酸的嵌合蛋白质，其与代表另一种GPCR，优选7跨膜超家族成员的全部或部分的额外氨基酸偶联。这些嵌合体可以由本发明的受体和另一种GPCR制成，或它们可以通过合并本发明的受体中的两种或多种制成。在一个实施方案中，该嵌合体的一个部分相当于或来源于本发明的T2R多肽的跨膜结构域。在另一个实施方案中，嵌合体的一个部分相当于或来源于本文所述的T2R多肽的跨膜区中的一个或多个，并且剩余的部分或多个部分可以来源于另一种GPCR。嵌合受体为本领域众所周知的，并且用于生成它们的技术和用于掺入其中的G蛋白偶联受体的结构域或片段的选择和边界也为众所周知的。因此，本领域技术人员易于将该此知识用于生成这类嵌合受体。例如，这类嵌合受体的应用可以提供本文具体披露的受体之一所特有的味觉选择性，其与另一种受体，诸如用于现有技术测定系统中的众所周知的受体信号转导特征相联系。

例如，诸如配体结合区、胞外域、跨膜结构域、胞质域、N-末端结构域、C-末端结构域或其任何组合这类区可以与异源蛋白共价连接。例如，T2R跨膜区可以与异源GPCR跨膜结构域连接或异源GPCR胞外域可以与T2R跨膜区连接。其它选择的异源蛋白可以包括：例如，绿色荧光蛋白、β-gal、谷氨酸受体和视紫质N-末端。

用于表达本发明的T2R、片段或变体的宿主细胞也在本发明范围内。为了获得高水平的克隆的基因或核酸，诸如编码本发明的T2R、片段或变体的cDNA的表达，本领域技术人员一般将所关注的核酸序列亚克隆入表达载体，该表达载体包含指导转录的强启动子，转录/翻译终止子并且如果就编码蛋白质的核酸而言，包含用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域众所周知的并且例如描述在Sambrook等中。然而，可以使用细菌或真核表达系统。

可以使用将外源性核苷酸序列导入宿主细胞的众所周知的操作法中的任一种。它们包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源性遗传物质导入宿主细胞的其它众所周知的方法(例如，参见Sambrook等)。唯一必要的是所用的特定基因工程操作法能够成功地将至少一种核酸分子导入能够表达所关注的T2R、片段或变体的宿主细胞。

在将表达载体导入细胞后，在有利于表达所关注的受体、片段或变体的条件下培养转染的细胞，然后使用标准技术从培养物中回收细胞。这类技术的实例为本领域众所周知的。例如，参见WO 00/06593，以与本说明书披露内容一致的方式将该文献引入作为参考。

用于检测调节本发明的T2R活性的化合物的测定方法

用于在体外和体内确定测试化合物是否特异性结合本发明的T2R多肽的方法和组合物如下所述。可以监测细胞生理学的许多方面以便评价配体结合天然存在的或嵌合T2R的作用。可以对表达T2R多肽的完整细胞、对透化细胞或对通过标准方法产生的膜组分进行这些测定。

味觉感受器结合诱发味觉的化合物并且启动将化学刺激转换成电信号。活化的或抑制的G蛋白质又可以改变靶酶、通道或其它效应蛋白的特性。某些实例为在视觉系统中转导素活化cGMP磷酸二酯酶、刺激性G蛋白活化腺苷酸环化酶、Gq和其它关连G蛋白活化磷脂酶C和Gi和其它G蛋白质调节不同的通道。还可以检验下游结果，诸如磷脂酶C产生二酰基甘油和IP3和反过来IP3导致钙动员。

本测定方法中的T2R蛋白质或多肽一般选自具有包含在SEQ IDNOS.：3，5，7，9，11，13或15中的序列的多肽或其片段或保守性修饰的变体。

另外，本测定方法中的T2R蛋白质或多肽可以来源于真核宿主细胞并且可以包括与SEQ ID NOS.：3，5，7，9，11，13或15具有氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其保守性修饰的变体。一般而言，氨基酸序列同一性为至少30％，优选地为30-40％，更具体地说为50-60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％。任选地，本测定方法中的T2R蛋白质或多肽可以包含T2R多肽的区，诸如胞外域、跨膜区、胞质域、配体结合域等。任选地，T2R多肽或其部分可以与异源蛋白共价连接以便生成用于本文所述测定方法中的嵌合蛋白。

可以使用如上所述的重组或天然存在的T2R蛋白质或多肽测试T2R活性调节剂。可以分离，在细胞中表达，在来源于细胞的膜中表达，在组织或动物中表达重组或天然存在的T2R蛋白质或多肽。例如，可以使用舌切片，从舌上剖离的细胞，转化的细胞或膜。可以使用本文所述的体外或体内测定方法之一测试调节。

调节剂的检测

用于体外和体内确定测试化合物是否特异性结合本发明的T2R受体的组合物和方法如下所述。可以监测细胞生理学的许多方面以便评价配体结合本发明T2R多肽的作用。可以对表达化学感受器的细胞、透化细胞或通过标准方法或体外使用重新合成的蛋白质产生的膜组分进行这些测定。

在体内，味觉感受器结合味觉调节化合物并且启动将化学刺激转换成电信号。活化的或抑制的G蛋白质又可改变靶酶、通道或其它效应蛋白的特性。某些实例为在视觉系统中转导素活化cGMP磷酸二酯酶、刺激性G蛋白活化腺苷酸环化酶、Gq和其它关连G蛋白活化磷脂酶C和Gi和其它G蛋白质调节不同的通道。还可以检验下游结果，诸如磷脂酶C产生二酰基甘油和IP3和反过来IP3导致钙动员。

另外，本测定方法中的T2R蛋白质或多肽可以来源于真核宿主细胞并且可以包括与本文披露的T2R多肽具有氨基酸序列同一性的氨基酸亚序列或其保守性修饰的变体。一般而言，氨基酸序列同一性为至少35-50％，或任选地为75％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％。任选地，本测定方法中的T2R蛋白质或多肽可以包含T2R蛋白质的结构域，诸如胞外域、跨膜区、跨膜结构域、胞质域、配体结合域等。此外，如上所述，T2R蛋白质或其结构域可以与异源蛋白共价连接以便生成用于本文所述测定方法中的嵌合蛋白。

可以使用如上所述的重组或天然存在的T2R蛋白质或多肽测试T2R受体活性调节剂。可以分离，在细胞中表达，在来源于细胞的膜中表达，在组织或动物中表达重组或天然存在的T2R蛋白质或多肽。例如，可以使用舌切片，从舌上剖离的细胞，转化的细胞或膜。可以使用本文所述的体外或体内测定方法之一测试调节。

1.体内结合测定

还可以使用可溶性或固态反应，应用本发明的T2R多肽检验味觉转导。在一个特定的实施方案中，可以将T2R配体结合域体外用于可溶性或固态反应，以便测定配体结合。

可以由N-末端结构域与胞外域的额外部分，诸如跨膜结构域的胞外环一起形成配体结合域。

已经将体外结合测定与其它GPCR，诸如代谢型谷氨酸受体一起使用(例如，参见Han和Hampson，J.Biol.Chem.274：10008-10013(1999))。这些测定法可以包括置换放射性或荧光标记的配体，测定特性荧光的改变或蛋白水解敏感性的改变等。

可以在溶液，任选地与固相结合的双层膜，脂单层或小囊泡中测试与本发明的T2R多肽结合的配体。例如，可以使用光谱特征(例如荧光、吸收度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解度特性的改变测试调节剂的结合。

在本发明的一个优选实施方案中，使用^[35S]GTPγS结合测定。如上所述，在GPCR活化时，G蛋白复合物的Gα亚单位受到刺激以便将结合的GDP换成GTP。可以在测定有推定配体存在下添加的放射性标记的^[35S]GTPγS与G蛋白结合的生化测定中测定配体介导的刺激G蛋白交换活性。一般而言，将包含所关注的化学感受器的膜与G蛋白混合。将可能的抑制剂和/或活化剂和^[35S]GTPγS加入到测定体系中并且测定^[35S]GTPγS与G蛋白的结合。可以通过液体闪烁计数或通过本领域中公知的任何其它方式，包括闪烁亲近测定法(SPA)测定结合。在其它测定方式中，可以使用荧光标记的^[35S]GTPγS。

2.荧光偏振测定

在另一个实施方案中，基于荧光偏振(＂FP＂)的测定法可以用于检测和监测配体结合。荧光偏振为用于测定平衡结合、核酸杂交和酶促活性的通用实验室技术。荧光偏振测定法的相似性在于它们无需分离步骤，诸如离心、过滤、色谱、沉淀或电泳。这些测定可以实时，直接在溶液中进行并且无需固定相。可以反复并且在添加试剂后测定偏振值，因为测定偏振是快速的并且不会破坏样品。一般而言，这种技术可以用于测定从低皮摩尔到微摩尔水平的荧光团的偏振值。这部分描述了荧光偏振如何可以以简单和定量方式用于测定配体与本发明的T2R多肽的结合。

当用平面偏振光激发荧光标记的分子时，它发射具有与其分子旋动成反比的偏振度的光。大的荧光标记的分子在激发态过程中保持相对稳定(就荧光素而言为4纳秒)并且光的偏振在激发与发射之间保持相对恒定。小的荧光标记的分子在激发态过程中快速旋转并且偏振在激发与发射之间显著改变。因此，小分子具有低偏振值且大分子具有高偏振值。例如，单链荧光素标记的寡核苷酸具有相对低的偏振值，而当其与互补链杂交时，它具有较高的偏振值。当使用FP检测并且监测可以活化或抑制本发明的化学感受器的引起味觉的化合物结合时，可以使用荧光标记的诱发味觉的化合物或自身荧光的诱发味觉的化合物。

将荧光偏振(P)定义为：1P＝Int-Int Int+Int。

如果PI为与激发光平面平行的发射光强度并且Int perp.为与激发光平面垂直的发射光强度，那么为光强度之比的P为无维数。例如，Beacon和Beacon 2000系统可以与这些测定法结合使用。这类系统一般以毫偏振单位表示偏振(1偏振单位＝1000mP单位)。

分子旋动与尺寸之间的关系由Perrin等式描述并且读者可以参照Jolley，M.E.(1991)在Journal of Analytical Toxicology，pp.236-240中所述，该文献中给出了该等式的全面解释。概括地说，Perrin等描述了偏振与转动弛豫时间成正比，所述的时间为分子通过约68.5度的角旋转所需的时间。转动弛豫时间与粘度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)相关，由如下等式表示：2转动弛豫时间＝3V RT。

转动弛豫时间就小分子(例如荧光素)而言较短(约1纳秒)，而就大分子(例如免疫球蛋白)而言较长(约100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，那么转动弛豫时间和由此的偏振与分子体积直接相关。分子体积的改变可以归因于与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或荧光标记分子的构象变化。例如，荧光偏振已经用于测定蛋白酶DNA酶和RNA酶对大的荧光素标记的聚合物的酶促切割。荧光偏振也已经用于测定蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合和蛋白质/DNA结合的平衡结合。

A.固态和可溶性高流通量测定

在另一个实施方案中，本发明提供了使用T2R多肽的可溶性测定法；或表达T2R多肽的细胞或组织。在另一个实施方案中，本发明提供了以高流通量方式基于固相的体外测定法，其中使T2R多肽或表达T2R多肽的细胞或组织与固相基质或味觉刺激化合物结合且与T2R受体接触，并且使用合适的标记或针对T2R受体产生的抗体检测结合。

在本发明的高流通量测定中，在一天内可以筛选多达数千种不同的调节剂或配体。特别是，可以使用微量滴定板的各孔进行针对所选择的潜在调节剂的单独测定，或如果要观察浓度或孵育时间效应，那么每5-10个孔可以测试一种单一调节剂。因此，单一标准微量滴定板可以检测约100(例如96)种调节剂。如果使用1536个孔的平板，那么单一平板可以容易地检测约1000-约1500种不同的化合物。还能够检测在各平板孔中的多种化合物。能够每天检测几个不同的平板；能够使用本发明的综合系统进行多达约6,000-20,000种不同化合物的测定筛选。近来已经研发了用于试剂操作的微观流控方法。

所关注的分子可以与固态成分通过共价或非共价键，例如通过标记直接或间接结合。所述的标记可以为多种成分中的任一种。一般而言，使结合标记的分子(标记结合物)固定在固体支持物上并且使所关注的标记的分子(例如所关注的味觉转导分子)通过标记和标记结合物的相互作用与固体支持物结合。

基于文献中充分描述的已知的分子相互作用，可以使用许多标记和标记结合物。例如，如果标记具有天然结合物，例如，生物素、A蛋白或G蛋白，那么它可以与合适的标记结合物(抗生物素蛋白、链霉抗生物素、中性抗生物素(neutravidin)、免疫球蛋白的Fc区等)联用。也可以广泛利用具有天然结合物，诸如生物素的分子的抗体和合适的标记结合物(参见SIGMA Immunochemicals 1998目录SIGMA，St.Louis Mo.)。

类似地，任何半抗原或抗原化合物可以与合适的抗体联用以便形成标记/标记结合物对。数以千计的特异性抗体为商购的并且许多额外的抗体描述在文献中。例如，在一种常用的构型中，标记为第一种抗体并且标记结合物为识别第一种抗体的第二种抗体。除抗体-抗原相互作用外，受体-配体相互作用也适合作为标记和标记结合物对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用，诸如运铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙黏素家族、整联蛋白家族、选凝素家族等；例如，参见Pigott & Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。类似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片制剂、类固醇等)、胞内受体(例如，它们介导各种小配体，包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D；肽类的作用)、药物、凝集素、糖类、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖类、蛋白质、磷脂类和抗体均可以与各种细胞受体发生相互作用。

合成的聚合物，诸如聚氨基甲酸酯类、聚酯类、聚碳酸酯类、聚脲类、聚酰胺类、聚乙烯亚胺类、聚亚芳基硫醚类、聚硅氧烷类、聚酰亚胺类和聚乙酸酯类也可以形成合适的标记或标记结合物。许多其它标记/标记结合物对也可用于本文所述的测定系统中，因为这对本领域技术人员而言在阅读本说明书后即可显而易见。

常用的连接物，诸如肽类、聚醚类等也可以用作标记并且包括多肽序列，诸如约5-200个氨基酸的聚甘氨酸序列。这类挠性连接物为本领域技术人员公知的。例如，聚(乙二醇)连接物可购自ShearwaterPolymers，Inc.Huntsville，Ala。这些连接物任选地具有酰胺键、巯基键或异功能键。

使用目前可利用的多种方法中的任一种使标记结合物与固相基质固定。固相基质通常通过使该基质的全部或部分接触化学试剂而衍生或官能化，所述的化学试剂使化学基团固定在与标记结合物的一部分反应的表面上。例如，适合于与较长链部分连接的基团可以包括胺类、羟基、巯基和羧基。氨基烷基硅烷类和羟基烷基硅烷类可以用于使各种表面，诸如玻璃表面官能化。这类固相生物聚合物阵列的构建充分描述在文献中。例如，参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc，85：2149-2154(1963)(描述了例如肽类的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.，102：259-274(1987)(描述了插针上的固相成分的合成)；Frank & Doring，Tetrahedron，44：60316040(1988)(描述了纤维素圆盘上的各种肽序列的合成)；Fodor等，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry，39(4)：718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine，2(7)：753759(1996)(均描述了固定在固相基质上的生物聚合物的阵列)。

用于使标记结合物与基质固定的非化学方法包括其它常用的方法，诸如加热、通过UV照射交联等。

3.基于细胞的测定

在一个优选的实施方案中，在真核细胞中以未修饰的形式表达T2R蛋白质或将其表达为嵌合、变体或截短的受体，这些受体具有或优选地不具有有利于其成熟和通过分泌途径靶向的异源的伴侣蛋白序列。可以在任何真核细胞，诸如HEK-293细胞中表达这类T2R多肽。优选这些细胞包含功能性G蛋白，例如G_α15，其能够使嵌合受体与胞内信号传导途径或与信号蛋白，诸如磷脂酶C偶联。可以使用任何标准的方法，诸如通过经检测细胞中FURA-2依赖性荧光检测胞内钙改变来检测T2R受体在这类细胞中的活化。这类测定是在本申请中提供的实验发现的基础。

活化的GPCR受体通常为使该受体C-末端尾(并且也可能是其它位点)磷酸化的激酶的底物。因此，活化剂会促进32P从放射性标记的ATP转移至该受体，可以使用闪烁计数器检测这一过程。C-末端尾的磷酸化会促进抑制蛋白样蛋白质的结合并且干扰G蛋白的结合。就GPCR信号转导和检测信号转导的方法的一般性综述而言，例如，参见Methods in Enzymology，vols.237and238(1994)and volume 96(1983)；Bourne等，Nature，10：349：117-27(1991)；Bourne等，Nature，348：125-32(1990)；Pitcher等，Annu.Rev.Biochem.，67：653-92(1998)。

可以通过比较用推定的T2R调节剂处理的T2R多肽的反应与未处理的对照样品或包含已知＂阳性＂对照的样品的反应来评价T2R调节。这类推定的T2R调节剂可以包括抑制或活化T2R多肽活性的分子。在一个实施方案中，将用活化T2R的化合物处理的对照样品指定为相对T2R活性值为100。当T2R活性值相对于对照样品而言为约90％，任选地为50％，任选地为25-0％时，实现对T2R多肽的抑制。当T2R活性值相对于对照样品而言为110％，任选地为150％，200-500％或1000-2000％时，实现对T2R多肽的活化。

可以通过确定表达T2R多肽的细胞或膜的离子极化(即电位)的改变来评价离子流的改变。确定细胞极化改变的一种方式是使用电位钳和膜片钳技术(例如，参见＂细胞粘附＂式、＂内定外＂式和＂全细胞＂式，例如Ackerman等，New Engl.J Med.，336：1575-1595(1997))测定电流的改变(由此测定极化的改变)。使用标准便利地确定全细胞电流。其它公知的测定方法包括：放射性标记的离子流测定法和使用电压敏感性染料的荧光测定法(例如，参见Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol，88：67-75(1988)；Gonzales & Tsien，Chem.Biol.，4：269-277(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等，J.Membrane Biology，137：59-70(1994))。

可以通过检验上述参数中的任一个测定测试化合物对多肽功能的影响。影响GPCR活性的任何合适的生理学改变均可以用于评价测试化合物对本发明多肽的影响。当使用完整细胞或动物确定功能结果时，还可以测定多种效应，诸如递质释放、激素释放、已知的和未表征的遗传标记(例如RNA印迹)的转录改变、诸如细胞生长这类细胞代谢的改变或pH改变和诸如Ca.sup.2+、IP3、cGMP或cAMP这类胞内第二信使的改变。

GPCR的优选测定方法包括负荷了离子或电压敏感性染料的细胞以便报告受体活性。用于确定这类受体活性的测定法也可以使用已知的其它G蛋白偶联受体的激动剂和拮抗剂作为对照品以便评价测试化合物的活性。在用于鉴定调节化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定法中，分别使用离子敏感性或膜电压荧光指示剂监测胞质或膜电压中离子水平的改变。可以使用的离子敏感性指示剂和电压探针披露在Molecular Probe 1997目录中。就G蛋白偶联受体而言，混栖G蛋白，诸如G_α15和G_α16可以用于选择的测定法中(Wilkie等，Proc.Nat′lAcad.Sci.，88：10049-10053(1991))。

受体活化启动了随后的胞内事件，例如第二信使的增加。活化某些G蛋白偶联受体刺激通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇水解肌醇三磷酸(IP3)的形成(Berridge & Irvine，Nature，312：315-21(1984))。IP3反过来刺激胞内钙离子贮备的释放。因此，胞质钙离子水平的改变或第二信使水平，诸如IP3的改变可以用于评价G蛋白偶联受体功能。表达这类G蛋白偶联受体的细胞可以展示出增加的胞质钙水平，这里由于从胞内贮备中的钙释放和通过质膜离子通道的胞外钙进入所起的作用。

在一个优选的实施方案中，通过在含有使受体与磷脂酶C信号转导途径连接的混栖G蛋白的异源细胞中表达T2R基因测定T2R多肽活性(参见Offermanns & Simon，J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995))。任选地，细胞系为HEK-293(其通常不表达T2R基因)且混栖G蛋白为G_α15(Offermanns & Simon，文献同上)。通过测定胞内Ca²⁺水平的改变检测味觉转导调节，所述的改变是对通过给予与T2R多肽关联的分子调节T2R信号转导途径的响应。任选地使用荧光Ca²⁺指示剂染料和荧光成像测定Ca²⁺水平的改变。

在另一个实施方案中，可以按照美国专利US5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解，将该专利引入本文作为参考。简言之，该测定方法包括用3H-肌醇将细胞标记48或48小时以上。用测试化合物将标记的细胞处理1小时。裂解经处理的细胞并且用氯仿-甲醇-水提取，此后，通过离子交换色谱法分离肌醇磷酸并且通过闪烁计数进行定量。通过计算在有激动剂存在下的cpm与有缓冲对照品存在下的cpm之比确定刺激倍数。同样，通过计算在有拮抗剂存在下的cpm与有缓冲对照品(其可以包含激动剂，也可以不含激动剂)存在下的cpm之比确定抑制倍数。

其它受体测定法可以包括确定胞内环核苷酸，例如cAMP或cGMP的水平。在受体活化导致环核苷酸水平下降的情况下，可以优选的是使细胞接触增加胞内环核苷酸水平的活性剂，例如福斯高林，此后在测定中将受体活化化合物加入到细胞中。在一个实施方案中，可以使用免疫测定法测定胞内cAMP或cGMP的改变。描述在Offermanns &Simon，J.Bio.Chem.，270：15175-15180(1995)中的方法可以用于确定cAMP的水平。同样，描述在Felley-Bosco等，Am.J.Resp.Celland Mol.Biol.，11：159-164(1994)中的方法可以用于测定cGMP的水平。此外，用于测定cAMP和/或cGMP的测定试剂盒描述在美国专利US 4,115,538中，将该专利引入本文作为参考。

在另一个实施方案中，可以测定转录水平以便评价测试化合物对信号转导的作用。使包含所关注的T2R多肽的宿主细胞与测试化合物接触足够的时间以便进行任何相互作用，然后测定基因表达水平。可以根据经验，诸如通过控制时间进程并且测定作为时间函数的转录水平来确定进行这类相互作用的时间长度。可以通过使用本领域技术人员已知为合适的任何方法测定转录的量。例如，可以使用RNA印迹检测所关注的蛋白质的mRNA表达或可以使用免疫测定法鉴定其多肽产物。另外，可以如美国专利US 5,436,128(引入本文作为参考)中所述使用应用报道基因的基于转录的测定法。报道基因可以为，例如，氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，所关注的蛋白质可以通过与第二报道分子，诸如绿色荧光蛋白连接被用作间接报道分子(例如，参见Mistili & Spector，Nature Biotechnology，15：961-964(1997))。

然后将转录的量与在没有测试化合物存在下的相同细胞中的转录量进行比较，或可以将其与在缺乏所关注的T2R多肽的基本上相同的细胞中转录的量进行比较。基本上相同的细胞可以来源于由此制备重组细胞，但尚未通过导入异源DNA被修饰的相同的细胞。转录量方面的任何差异均表明测试化合物以某种方式改变了所关注的T2R多肽的活性。

4.表达化学感受器的转基因非人动物

表达本发明的一种或多种味觉感受器序列的非人动物也可以用于受体测定。这类表达可以用于确定测试化合物是否通过下列步骤在体内特异性结合哺乳动物的味觉跨膜受体复合物：使被编码化学感受器的核酸或其配体结合区稳定或瞬时转染的非人动物与测试化合物接触，并且确定该动物是否通过特异性结合受体多肽复合物对测试化合物作出反应。

被本发明的载体转染或感染的动物特别可用于鉴定和表征可以结合特异性受体或受体组的味觉刺激物的测定法。这类载体感染的表达人味觉感受器序列的动物可以用于体内筛查味觉刺激物及其对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或行为的作用。

单独或作为文库感染/表达核酸和载体的手段为本领域众所周知的。可以通过多种手段测定多种单个细胞、器官或完整动物参数。例如，可以通过用感染物，例如腺病毒表达载体递送在动物味觉组织中表达本发明的T2R序列。

内源性味觉感受器基因可以保持功能性并且野生型(天然)活性仍然可以存在。在其它情况中，如果需要通过导入的外源性杂合受体实现全部味觉感受器活性，那么优选使用基因敲除系。构建非人转基因动物，特别是转基因小鼠以及选择和制备用于产生转化细胞的重组构建体的方法为本领域众所周知的。

基于如下前提构建＂基因敲除＂细胞和动物：可以通过将新的DNA序列导入基因组降低或完全取消特定基因在哺乳动物细胞中的表达水平，所述的新的DNA序列用于间断欲抑制的基因的DNA序列的某一部分。此外，＂基因捕获插入＂可以用于破坏宿主基因，并且小鼠胚胎干(ES)细胞可以用于产生基因敲除的转基因动物(例如，参见Holzschu，Transgenic Res 6：97-106(1997))。一般通过互补核酸序列之间的同源重组插入外源序列。外源序列为所要修饰的靶基因的某一部分，诸如外显子、内含子或转录调节序列或能够影响靶基因表达水平的任何基因组序列；或其组合。在多能胚胎干细胞中通过同源重组的基因寻靶能够精确地修饰所关注的基因组序列。任何技术都可以用于产生、筛选、繁殖基因敲除动物，例如，参见Bijvoet，Hum.MoI.Genet.7：53-62(1998)；Meredith，J.MoL Med.75：208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19：161-165(1995)；Mudgett，Methods MoL Biol.48：167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6：321-328(1997)；美国专利US5,616,491；US5,464,764；US 5,631,153；US 5,487,992；US 5,627,059；US 5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO·91/12650。

本发明的核酸还可以用作产生＂基因敲除＂人细胞及其子代的试剂。同样，本发明的核酸也可以用作在小鼠中产生＂基因敲入＂的试剂。人或大鼠T2R基因序列可以替代小鼠基因组中的直向同源物T2R。按照这种方式，产生表达人或大鼠T2R的小鼠。然后可以将这种小鼠用于分析人或大鼠T2R的功能，和用于鉴定这类T2R的配体。

调节剂

测试的作为T2R家族成员调节剂的化合物可以为任何小的化合物或生物实体，诸如蛋白质、糖、核酸或脂质。另外，调节剂可以为T2R家族成员的基因工程形式。一般而言，测试化合物可以为小的化学分子和肽类。基本上任何化合物均可以在本发明的测定方法中用作潜在的调节剂或配体，不过，通常可以将化合物溶于水或有机(尤其是基于DMSO的)溶液。可以设计测定方法以便通过使测定步骤自动化并且为测定提供来自任何便利来源的化合物来筛选大的化学文库，所述的测定一般平行进行(例如，在自动测定法中的微量滴定板上的微量滴定格中)。应该意识到有许多化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)，Aldrich(St.Louis，Mo.)，Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)，FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。

在一个实施方案中，高流通量筛选方法包括提供包含大量潜在的治疗化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后如本文所述在一种或多种测定法中筛选这类＂组合化学文库＂或＂配体文库＂以便鉴定那些展示出所需特征活性的文库成员(特别是化学种类或亚类)。由此鉴定的化合物可以用作常规的＂引导化合物＂或自身可以用作潜在的或实际的消费产品。

组合化学文库为通过化学合成或生物合成，通过合并许多化学＂结构单元＂，诸如试剂产生的不同化合物的集合。例如，通过按照每种可能的方式为指定化合物长度(即，多肽化合物中氨基酸的数目)合并一组化学结构单元(氨基酸)形成线性组合化学文库，诸如多肽文库。可以通过这类化学结构单元的组合混合合成数以百万计的化合物。

组合化学文库的制备和筛选为本领域技术人员众所周知的。这类组合化学文库包括，但不限于肽文库(例如，参见美国专利US5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-93(1991)和Houghton等，Nature，354：84-88(1991))。还可以使用产生化学多样性文库的其它化学物质。这类化学物质包括，但不限于：类肽(例如WO 91/19735)；编码的肽类(例如WO 93/20242)；随机生物寡聚物(例如WO 92/00091)；苯并二氮

类(例如美国专利US 5,288,514)；diversomers，诸如乙内酰脲类、苯并二氮

类和二肽类(Hobbs等，PNAS.，90：6909-13(1993))；插烯多肽类(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc，114：6568(1992))；具有葡萄糖主链的非肽类肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc，114：9217-18(1992))；小化合物文库中的类似有机合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc，116：2661(1994))；低聚氨基甲酸酯类(Cho等，Science，261：1303(1993))；肽基膦酸酯类(Campbell等，J.Org.Chem.，59：658(1994))；核酸文库(Ausubel，Berger，和Sambrook，所有文献均参见上文)；肽核酸文库(美国专利US 5,539,083)；抗体文库(Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)；碳水化合物文库(Liang等，Science，274：1520-22(1996)和美国专利US 5,593,853)；小有机分子文库(苯并二氮

类，Baum，C&EN，Jan18，第33页(1993)；噻唑烷酮类和间噻唑酮类，美国专利US5,549,974；吡咯烷类，美国专利US 5,525,735和US 5,519,134；吗啉代化合物，美国专利US 5,506,337；苯并二氮

类，US 5,288,514等)。

用于制备组合文库的装置为可商购的(例如，参见357MPS，390MPS(Advanced Chem.Tech，Louisville Ky.)，Symphony(Rainin，Woburn，Mass.)，433A(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)，9050 Plus(Millipore，Bedford，Mass.))。此外，许多组合文库自身为可商购的(例如，参见ComGenex，Princeton，N.J.；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；MartekBiosciences；Columbia，Md.等)。

在本发明的一个方面中，T2R调节剂可以用于任何食品、糖果、药物组合物或其组分以便由此以所需方式调节产品、组合物或组分的味道。例如，可以加入强化苦味感觉的T2R调节剂以便使产品或组合物具有苦味，而可以加入阻断苦味感觉的T2R调节剂以便阻断产品或组合物的苦味。

本发明所鉴定的化合物的应用

可以将按照本发明鉴定的化合物加入到食品、饮料或药物组合物中，以便调节，优选阻断因苦味化合物，例如雷尼替丁、对乙酰氨基酚、地那铵和/或士的宁或结构相关和其它体苦味化合物活化hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT1R13、MT2R54、hT2R61和/或hT2R75引起的苦味。例如，阻断对乙酰氨基酚或相关化合物活化hT2R54的化合物可以用作药物中的添加剂以便阻断与对乙酰氨基酚相关的苦味。例如，可以将这些化合物加入到包含对乙酰氨基酚的儿科用药物制剂中或以有效抑制苦味的用量加入。

阻断hT2R8或hT2R54、hT2R75活化的化合物可以用于食品、饮料或药物产品中以便阻断雷尼替丁或其它活化这些受体的苦味化合物，例如结构相关化合物的苦味。特别是，预计使用所披露的测定方法鉴定的化合物可以包含在任何含有雷尼替丁的组合物中以便抑制与之相关的苦味。

此外，抑制地那铵活化hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75的化合物可用作食品、饮料或药物制剂中的添加剂以便阻断可归因于这些受体活化的苦味。因为地那铵为非常强烈的苦味化合物，所以抑制这些受体的化合物应当有效抑制多种苦味化合物的苦味。这一结果通过如下事实证实：地那铵活化许多不同的苦味味觉感受器并且进一步已知地那铵衍生物也活化T2R。类似地，在阻断hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54和/或hT2R75活化的测定方法中鉴定的化合物有可能用作食品、饮料和药物中的添加剂，以便阻断与活化这类受体的化合物，例如士的宁或相关化合物的苦味。优选地，在品尝试验，例如人品尝试验中证实在基于主题T2R细胞的测定方法中鉴定的化合物的味觉调节特性。

试剂盒

T2R基因及其同源物为用于鉴定味觉感受器细胞，用于法医和亲子关系确定以及用于检验味觉转导的有用工具。与T2R核酸，诸如T2R探针和引物特异性杂交的T2R家族成员特异性试剂和与T2R蛋白质，例如T2R抗体特异性结合的T2R特异性试剂用于检验味细胞表达和味觉转导调节。

对样品中的T2R家族成员中存在DNA和RNA的核酸测定方法包括许多本领域技术人员公知的技术，诸如DNA印迹分析、RNA印迹分析、斑点印迹、RNA酶保护、S1分析、扩增技术，诸如PCR和原位杂交。例如，在原位杂交中，靶核酸从其细胞环境中释放，如此可用于细胞内的杂交，同时维持细胞形态以便随后的解释和分析。下列文章中提供了原位杂交技术的概述：Singer等，Biotechniques，4：230250(1986)；Haase等，Methods in Virology，vol.VII，189-226(1984)；和Names等，eds.，Nucleic Acid Hybridization：A PracticalApproach(1987)。此外，可以使用上述各种免疫测定技术检测T2R蛋白质。一般将测试样品同时与阳性对照(例如表达重组T2R蛋白质的样品)和阴性对照进行比较。

本发明还提供了用于筛选T2R家族成员调节剂的试剂盒。这类试剂盒可以由易于得到的材料和试剂制备。例如，这类试剂盒可以包含下列材料中的任意一种或多种：T2R核酸或蛋白质、反应试管和测试T2R活性的说明书。任选地，该试剂盒包含功能性T2R多肽。可以按照本发明制备各种各样的试剂盒和成分，这取决于试剂盒的预期使用者和该使用者的具体需求。

由于一般性地描述了本发明，所以通过参照下列实施例更易于理解本发明，这些实施例作为说明提供，而并非打算起限定作用。应当理解可以在不背离本发明的实质和范围的情况下对本文披露的典型实施方案进行各种改进和改变。

实施例

实施例1

在本实施例中，我们证实苦味化合物雷尼替丁特异性活化具有本申请中包含的DNA序列的hT2R8、hT2R54和hT2R75人苦味感受器。

在检测胞内钙浓度改变的基于细胞的测定法中测定雷尼替丁对这些受体的活化。简言之，通过基于磷酸Ca²⁺或脂质的系统使用包含特定hT2R54核酸序列的质粒瞬时转染稳定表达大T-细胞抗原和嵌合G蛋白(G16gust44)的人胚胎肾细胞。将瞬时转染的细胞接种入24孔培养平板并且使功能表达进行总计48小时。然后将细胞与对钙具有特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；Molecular Probe)一起孵育，所述的荧光染料提供快速、简便和可靠的用于检测细胞内部钙浓度改变的基于荧光的方法。将雷尼替丁加入到细胞中引起导致PLC活化和随后胞内钙浓度增加的信号级联放大。这种钙浓度的增加改变了细胞内部钙染料的荧光特性。使用荧光显微镜检和特定设计软件(ImagingWorkbench，Axon)监测这些改变。我们使用这种方法观察到雷尼替丁在10mM下特异性活化各自表达hT2R8、hT2R54和hT2R75的细胞(增加胞内钙浓度)，但对蔗糖无反应。

实施例2

将在其细胞表面上稳定表达高水平的hT2R8或hT2R54的HEK-G16gust44细胞系用于高流通量筛选测定。在这一平台中，在测定前18-24小时将细胞接种入96孔或384孔培养平板。然后将细胞与荧光钙敏感性染料(Molecular Devices)一起孵育并激发且在标准荧光强度平板读出器(FLIPR或VIPR)中读取。我们使用这种方法能够进一步表征雷尼替丁对hT2R8和hT2R54的作用。我们发现雷尼替丁以典型的剂量反应关系活化hT2R8和hT2R54(参见附图2)。

实施例3

在本实施例中，我们证实苦味化合物对乙酰氨基酚特异性活化具有本申请中SEQ ID NO：10中包含的DNA序列的hT2R54人苦味感受器。

在检测胞内钙浓度改变的基于细胞的测定法中测定对乙酰氨基酚对该受体的活化。简言之，通过基于磷酸Ca²+或脂质的系统使用包含特定hT2R54核酸序列的质粒瞬时转染稳定表达大T-细胞抗原和嵌合G蛋白(G16gust44)的人胚胎肾细胞。将瞬时转染的细胞接种入24孔培养平板并且使功能表达进行总计48小时。然后将细胞与对钙具有特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；Molecular Probe)一起孵育，所述的荧光染料提供快速、简便和可靠的用于检测细胞内部钙浓度改变的基于荧光的方法。将对乙酰氨基酚加入到细胞中引起导致PLC活化和随后胞内钙浓度增加的信号级联放大。这种钙浓度的增加改变了细胞内部钙染料的荧光特性。使用荧光显微镜检和特定设计软件(ImagingWorkbench，Axon)监测这些改变。我们使用这种方法观察到对乙酰氨基酚特异性活化表达hT2R54的细胞(增加胞内钙浓度)(参见附图3)。

实施例4

将在其细胞表面上稳定表达高水平的hT2R54的HEK-G16gust44细胞系用于高流通量筛选测定。在这一平台中，在测定前18-24小时将细胞接种入96孔或384孔培养平板。然后将细胞与荧光钙敏感性染料(Molecular Devices)一起孵育并激发且在标准荧光强度平板读出器(FLIPR或VIPR)中读取。我们使用这种方法能够进一步表征对乙酰氨基酚对hT2R54的作用。我们发现对乙酰氨基酚以典型的剂量反应关系活化hT2R54(参见附图4)。

实施例5

在本实施例中，我们证实强苦味化合物苯甲酸地那铵特异性活化具有本申请中包含的DNA序列的hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75人苦味感受器。

在检测胞内钙浓度改变的基于细胞的测定法中测定苯甲酸地那铵对这些受体的活化。简言之，通过基于磷酸Ca²⁺或脂质的系统使用包含特定hT2R54核酸序列的质粒瞬时转染稳定表达大T-细胞抗原和嵌合G蛋白(G16gust44)的人胚胎肾细胞。将瞬时转染的细胞接种入24孔培养平板并且使功能表达进行总计48小时。然后将细胞与对钙具有特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；Molecular Probe)一起孵育，所述的荧光染料提供快速、简便和可靠的用于检测细胞内部钙浓度改变的基于荧光的方法。将苯甲酸地那铵加入到细胞中引起导致PLC活化和随后胞内钙浓度增加的信号级联放大。这种钙浓度的增加改变了细胞内部钙染料的荧光特性。使用荧光显微镜检和特定设计软件(Imaging Workbench，Axon)监测这些改变。我们使用这种方法观察到苯甲酸地那铵特异性活化各自表达hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75的细胞(增加胞内钙浓度)(参见附图5)。

实施例6

将在其细胞表面上稳定表达高水平的hT2R8的HEK-G16gust44细胞系用于高流通量筛选测定。在这一平台中，在测定前18-24小时将细胞接种入96孔或384孔培养平板。然后将细胞与荧光钙敏感性染料(Molecular Devices)一起孵育并激发且在标准荧光强度平板读出器(FLIPR或VIPR)中读取。使用这种方法我们发现苯甲酸地那铵以典型的剂量反应关系活化hT2R8(参见附图6)。

实施例7

在本实施例中，我们证实强苦味化合物士的宁特异性活化具有本申请中包含的DNA序列的hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54和hT2R75人苦味感受器。

在检测胞内钙浓度改变的基于细胞的测定法中测定士的宁对这些受体的活化。简言之，通过基于磷酸Ca²⁺或脂质的系统使用包含特定hT2R54核酸序列的质粒瞬时转染稳定表达大T-细胞抗原和嵌合G蛋白(G16gust44)的人胚胎肾细胞。将瞬时转染的细胞接种入24孔培养平板并且使功能表达进行总计48小时。然后将细胞与对钙具有特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；Molecular Probe)一起孵育，所述的荧光染料提供快速、简便和可靠的用于检测细胞内部钙浓度改变的基于荧光的方法。将士的宁加入到细胞中引起导致PLC活化和随后胞内钙浓度增加的信号传导级联。这种钙浓度的增加改变了细胞内部钙染料的荧光特性。使用荧光显微镜检和特定设计软件(Imaging Workbench，Axon)监测这些改变。我们使用这种方法观察到士的宁特异性活化各自表达hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R54和hT2R75的细胞(增加胞内钙浓度)。

Senomyx hT2R8

DNA序列(SEQ ID NO：2)

ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGA

TACATTGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAAT

TTAGTTATCGCCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTT

TATACAAAAAACAAACAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACC

ACCTGCCTTAATGTCTTCTATTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAA

ATTGATATGGTGGTGCACTGGATCCTGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATA

GTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCAATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGT

AAAATACCATACTTTGAACCCTTaACTCTCTTTAACCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCA

TTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGCAAATAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCC

AGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTTATCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCT

TCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGTGGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATT

CTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGCAGACATTTGTCAGAATGCTG

ACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA

蛋白质序列(SEQ ID NO：3)

MFSPADNIFIILITGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYILTN

LVIARICLISVMVVNGIVIVLNPDVYTKNKQQIVIFTFWTFANYLNMWIT

TCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMVVHWILLGCFAISLLVSLIAAI

VLSCDYRFHAIAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPLTLFNLFAIVPFIVSLIS

FFLLVRSLWRHTKQIKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSFIFFFFLYYIS

SILMTFSYLMTKYKLAVEFGEIAAILYPLGHSLILIVLNNKLRQTFVRML

TCRKIACMI

Senomyx hT2R9

DNA序列(SEQ ID NO：4)

ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGA

TTCATTGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGC

TTGGCCATCTCCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACA

TATGGCAATAGCGTGCTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACT

TCTTGCCTCAGTATCTTCTATTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAG

ATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTCTTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGAT

GATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGTCATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCA

GGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGTGATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTG

TTACTTTTCTCCCTgGTTAGACACACCAAGCAGATTCGACTGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAG

GCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTCCTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTT

ATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGGTGACATAGTAACTGTCATTTTCCCA

TCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTCTGAAGATGTTAAGATTTGTG

AAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG

蛋白质序列(SEQ ID NO：5)

MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILIS

LAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSVLVSIVNVVWTFANNSSLWFT

SCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKND

DMWYHLFKVSHEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMVPFILCLISFFL

LLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAIKAVIIFLLLLIVYYPVFLV

MTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFV

KCFLRRRKPFVP

Senomyx hT2R10

DNA序列(SEQ ID NO：6)

ATGCTACGTGTAGTGGAAGGCATCTTCATTTTTGTTGTAGTTAGTGAGTCAGTGTTTGGGGTTTTGGGGAATGGA

TTTATTGGACTTGTAAACTGCATTGACTGTGCCAAGAATAAGTTATCTACGATTGGCTTTATTCTCACCGGCTTA

GCTATTTCAAGAATTTTTCTGATATGGATAATAATTACAGATGGATTTATACAGATATTCTCTCCAAATATATAT

GCCTCCGGTAACCTAATTGAATATATTAGTTACTTTTGGGTAATTGGTAATCAATCAAGTATGTGGTTTGCCACC

AGCCTCAGCATCTTCTATTTCCTGAAGATAGCAAATTTTTCCAACTACATATTTCTCTGGTTGAAGAGCAGAACA

AATATGGTTCTTCCCTTCATGATAGTATTCTTACTTATTTCATCGTTACTTAATTTTGCATACATTGCGAAGATT

CTTAATGATTATAAAACGAAGAATGACACAGTCTGGGATCTCAACATGTATAAAAGTGAATACTTTATCAAgCAG

ATTTTGCTAAATCTGGGAGTCATTTTCTTCTTTACACTATCCCTAATTACATGTATTTTTTTAATCATTTCCCTT

TGGAGACACAACAGGCAGATGCAATCGAATGTGACAGGATTGAGAGACTCCAACACAGAAGCTCATGTGAAGGCA

ATGAAAGTTTTGATATCTTTCATCATCCTCTTTATCTTGTATTTTATAGGCATGGCCATAGAAATATCATGTTTT

ACTGTGCGAGAAAACAAACTGCTGCTTATGTTTGGAATGACAACCACAGCCATCTATCCCTGGGGTCACTCATTT

ATCTTAATTCTAGGAAACAGCAAGCTAAAGCAAGCCTCTTTGAGGGTACTGCAGCAATTGAAGTGCTGTGAGAAA

AGGAAAAATCTCAGAGTCACATAG

蛋白质序列(SEQ ID NO：7)

MLRVVEGIFIFVVVSESVFGVLGNGFIGLVNCIDCAKNKLSTIGFILTGL

AISRIFLIWIIITDGFIQIFSPNIYASGNLIEYISYFWVIGNQSSMWFAT

SLSIFYFLKIANFSNYIFLWLKSRTNMVLPFMIVFLLISSLLNFAYIAKI

LNDYKTKNDTVWDLNMYKSEYFIKQILLNLGVIFFFTLSLITCIFLIISL

WRHNRQMQSNVTGLRDSNTEAHVKAMKVLISFIILFILYFIGMAIEISCF

TVRENKLLLMFGMTTTAIYPWGHSFILILGNSKLKQASLRVLQQLKCCEK

RKNLRVT

Senomyx hT2R13

DNA序列(SEQ ID NO：8)

ATGGAAAGTGCCCTGCCGAGTATCTTCACTCTTGTAATAATTGCAGAATTCATAATTGGGAATTTGAGCAATGGA

TTTATAGTACTGATCAACTGCATTGACTGGGTCAGTAAAAGAGAGCTGTCCTCAGTCGATAAACTCCTCATTATC

TTGGCAATCTCCAGAATTGGGCTGATCTGGGAAATATTAGTAAGTTGGTTTTTAGCTCTGCATTATCTAGCCATA

TTTGTGTCTGGAACAGGATTAAGAATTATGATTTTTAGCTGGATAGTTTCTAATCACTTCAATCTCTGGCTTGCT

ACAATCTTCAGCATCTTTTATTTGCTCAAAATAGCGAGTTTCTCTAGCCCTGCTTTTCTCTATTTGAAGTGGAGA

GTAAACAAAGTGATTCTGATGATACTGCTAGGAACCTTGGTCTTCTTATTTTTAAATCTGATACAAATAAACATG

CATATAAAAGACTGGCTGGACCGATATGAAAGAAACACAACTTGGAATTTCAGTATGAGTGACTTTGAAACATTT

TCAGTGTCGGTCAAATTCACTATGACTATGTTCAGTCTAACACCATTTACTGTGGCCTTCATCTCTTTTCTCCTG

TTAATTTTCTCCCTGCAGAAACATCTCCAGAAAATGCAACTCAATTACAAAGGACACAGAGACCCCAGGACCAAG

GTCCATACAAATGCCTTGAAAATTGTGATCTCATTCCTTTTATTCTATGCTAGTTTCTTTCTATGTGTTCTCATA

TCATGGATTTCTGAGCTGTATCAGAACACAGTGATCTACATGCTTTGTGAGACGATTGGAGTCTTCTCTCCTTCA

AGCCACTCCTTTCTTCTGATTCTAGGAAACGCTAAGTTAAGACAGGCCTTTCTTTTGGTGGCAGCTAAGGTATGG

GCTAAACGATGA

蛋白质序列(SEQ ID NO：9)

MESALPSIFTLVIIAEFIIGNLSNGFIVLINCIDWVSKRELSSVDKLLII

LAISRIGLIWEILVSWFLALHYLAIFVSGTGLRIMIFSWIVSNHFNLWLA

TIFSIFYLLKIASFSSPAFLYLKWRVNKVILMILLGTLVFLFLNLIQINM

HIKDWLDRYERNTTWNFSMSDFETFSVSVKFTMTMFSLTPFTVAFISFLL

LIFSLQKHLQKMQLNYKGHRDPRTKVHTNALKIVISFLLFYASFFLCVLI

SWISELYQNTVIYMLCETIGVFSPSSHSFLLILGNAKLRQAFLLVAAKVW

AKR

Senomyx hT2R54

DNA序列(SEQ ID NO：10)

ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTT

GCTGAATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAG

GCAGTTTCCACAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCATGATGTTA

GAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTT

ATATTCTTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTC

TCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTT

ATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCC

TCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATT

GTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATG

GGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCACATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTT

CTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTGTGG

AATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGG

CTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA

蛋白质序列(SEQ ID NO：11)

MTKLCDPAESELSPFLITLILAVLLAEYLIGIIANGFIMAIHAAEWVQNK

AVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKISF

IFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVF

ISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGI

VTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAIKAISYF

LILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQIIMAAYPASHSILLIQDNPG

LRRAWKRLQLRLHLYPKEWTL

Senomyx hT2R61

DNA序列(SEQ ID NO：12)

ATGATAACTTTTCTACCCATCATTTTTTCCAGTCTGGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGC

TTCATAGCACTGGTAAATTCCATTGAGTCGTTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCT

CTGGCGGTCTCCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAACTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTT

AATAGTGTAGAAGTAAGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTGATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACT

ACCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACTTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTT

AAGAGTGTCATTCTGGTGATGTTGTTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAAT

GAGATTGTGCGGACAAAAGAATTTGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAATTGAAGAGTGCAATGTACTTTTCA

AATATGACTGTAACCATGGTAGCAAACTTAGTACCCTTCACTCTGACCCTACTATCTTTTATGCTGTTAATCTGT

TCTTTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCGTGGTAAAGGATCTCAAGATCCCAGCACGAAGGTCCACATA

AAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGG

AGTTTTGGAAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTATTAGATTCAGCTATCCTTCAATCCAC

CCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTTTGGCAAATGAGGTACTGG

GTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG

蛋白质序列(SEQ ID NO：13)

MITFLPIIFSSLVVVTFVIGNFANGFIALVNSIESFKRQKISFADQILTA

LAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFNSVEVRTTAYNIWAVINHFSNWLAT

TLSIFYLLKIANFSNFIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACHLFVINMN

EIVRTKEFEGNMTWKIKLKSAMYFSNMTVTMVANLVPFTLTLLSFMLLIC

SLCKHLKKMQLRGKGSQDPSTKVHIKALQTVISFLLLCAIYFLSIMISVW

SFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVFWQMRYW

VKGEKTSSP

Senomyx hT2R75

DNA序列(SEQ ID NO：14)

ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTACATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGC

TTCATAGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCT

CTGGCAGTCTCCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTATTAGTATTAAATTGGTATGCAACTGAGTTGAATCCAGCTTTT

AACAGTATAGAAGTAAGAATTACTGCTTACAATGTCTGGGCAGTAATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACT

AGCCTCAGCATATTTTATTTGCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTT

AAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTATTGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAAT

CAGATTATATGGACAAAAGAATATGAAGGAAACATGACTTGGAAGATCAAACTGAGGAGTGCAATGTACCTTTCA

AATACAACGGTAACCATCCTAGCAAACTTAGTTCCCTTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGT

TCTCTGTGTAAACATCTCAAAAAGATGCAGCTCCATGGCAAAGGATCTCAAGATCCCAGCATGAAGGTCCACATA

AAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATTTACTTTCTGTCCATAATCATGTCAGTTTGG

AGTTTTGAGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCGAAGCTATTGCATTCAGCTATCCTTCAACCCAC

CCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTTTGTGGCATGTGAGGTACTGG

GTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG

蛋白质序列(SEQ ID NO：15)

MITFLPIIFSILIVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTA

LAVSRVGLLWVLVLNWYATELNPAFNSIEVRITAYNVWAVINHFSNWLAT

SLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMN

QIIWTKEYEGNMTWKIKLRSAMYLSNTTVTILANLVPFTLTLISFLLLIC

SLCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHIKALQTVTSFLLLCAIYFLSIIMSVW

SFESLENKPVFMFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKLKQTFLSVLWHVRYW

VKGEKPSSS

尽管前面的详述已经描述了本发明的几个实施方案，但是应当理解以上描述仅为例示性的而并不用来限定所披露的本发明。本发明仅由随后的权利要求所限定。

Claims (118)

1.用于鉴定调节对雷尼替丁作出特异性反应的选自hT2R8、hT2R54和hT2R75的人苦味味觉感受器的化合物的测定方法，该方法包括：

i.筛选对雷尼替丁或结构相关化合物诱导被雷尼替丁或结构相关化合物活化的hT2R8、hT2R54、hT2R75或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的活化具有作用的化合物；和

ii.基于所述化合物对由雷尼替丁或结构相关化合物活化所述感受器的作用确定其是否调节与hT2R8、hT2R54和/或hT2R75相关的苦味。

2.权利要求1所述的测定方法，其中所述的hT2R8选自：

i.SEQ ID NO：3中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：2中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的测定方法，其中所述的hT2R54选自：

i.SEQ ID NO：11中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：10中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：11中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1所述的测定方法，其中所述的hT2R75选自：

i.SEQ ID NO：15中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：14中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：15中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在细胞膜上表达。

6.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在分离的细胞膜上表达。

7.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在完整细胞上表达。

8.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在真核细胞上表达。

9.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由两栖动物、哺乳动物或昆虫细胞表达。

10.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞上表达。

11.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其为荧光测定法。

12.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其为结合测定法。

13.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，该方法通过测定所述化合物对胞内离子浓度的影响来检测该化合物的作用。

14.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对胞内钠或钙的作用。

15.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对细胞膜电位的作用。

16.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对所述的味觉感受器的转录的作用。

17.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中基于所述的化合物在阻断所述的味觉感受器与雷尼替丁的相互作用的能力选择该化合物。

18.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对胞内cAMP、cGMP或IP3的作用。

19.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器包含所述味觉感受器的胞外域或跨膜区。

20.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的测定方法使用钙特异性荧光染料检测钙的改变。

21.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的测定方法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测胞内钙的改变。

22.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在溶液中。

23.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其为检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的改变的结合测定法。

24.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用。

25.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用，所述的G蛋白选自转导素、味转导素、G_α15和G_α16。

26.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其为荧光偏振测定法。

27.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器与固相基质结合。

28.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其为高流通量测定法。

29.权利要求1-4中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由HEK293细胞表达。

30.用于鉴定调节特异性应答对乙酰氨基酚的苦味味觉感受器的化合物的测定方法，其中所述的味觉感受器是hT2R54，该方法包括：

i.筛选对对乙酰氨基酚或结构相关化合物诱导被对乙酰氨基酚或结构相关化合物活化的hT2R54或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的活化具有作用的化合物；和

ii.基于所述化合物对由对乙酰氨基酚或结构相关化合物活化所述感受器的作用确定其是否调节hT2R54。

31.权利要求30所述的测定方法，其中所述的hT2R54选自：

i.SEQ ID NO：11中包含的多肽；

ii.由与SEQ ID NO：10中包含的核酸序列特异性杂交的核酸序列编码的多肽；或

iii.与SEQ ID NO：11中包含的多肽具有至少90％序列同一性的多肽。

32.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在分离的细胞膜上表达。

33.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在完整的细胞上表达。

34.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在真核细胞上表达。

35.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在两栖动物、哺乳动物或昆虫细胞上表达。

36.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞上表达。

37.权利要求30或31所述的测定方法，其为荧光测定法。

38.权利要求30或31所述的测定方法，其为结合测定法。

39.权利要求30或31所述的测定方法，用于通过测定所述化合物对胞内离子浓度的作用来检测该化合物的作用。

40.权利要求30或31所述的测定方法，用于检测所述化合物对胞内钠或钙的作用。

41.权利要求30或31所述的测定方法，用于检测所述化合物对细胞膜电位的作用。

42.权利要求30或31所述的测定方法，用于检测所述化合物对所述的味觉感受器的转录的作用。

43.权利要求30或31所述的测定方法，其中基于所述化合物阻断所述的味觉感受器与对乙酰氨基酚相互作用的能力选择所述的化合物。

44.权利要求30或31所述的测定方法，用于检测所述的化合物对胞内cAMP、cGMP或IP3的作用。

45.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器包含所述的味觉感受器的胞外域或跨膜区。

46.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的测定方法使用钙特异性荧光染料检测钙的改变。

47.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的测定方法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测胞内钙的改变。

48.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在溶液中。

49.权利要求30或31所述的测定方法，其为检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度改变的结合测定法。

50.权利要求30或31所述的测定方法，用于检测所述化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用。

51.权利要求30或31所述的测定方法，用于检测所述的化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用，所述的G蛋白选自转导素、味转导素、G_α15和G_α16。

52.权利要求30或31所述的测定方法，其为荧光偏振测定法。

53.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器与固相基质结合。

54.权利要求30或31所述的测定方法，其为高流通量测定法。

55.权利要求30或31所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由HEK293细胞表达。

56.用于鉴定调节对苯甲酸地那铵作出特异性反应的苦味味觉感受器的化合物的测定方法，所述的苦味味觉感受器选自hT2R8、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75，该方法包括：

i.筛选对苯甲酸地那铵或结构相关化合物诱导被苯甲酸地那铵或结构相关化合物活化的hT2R8、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的活化具有作用的化合物；和

ii.基于所述化合物对由苯甲酸地那铵或结构相关化合物活化所述感受器的作用确定其是否调节hT2R8、hT2R10、hT1R13、hT2R54、hT2R61和hT2R75。

57.权利要求56所述的测定方法，其中所述的hT2R8选自：

i.SEQ ID NO：3中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：2中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

58.权利要求56所述的测定方法，其中所述的hT2R10选自：

i.SEQ ID NO：4中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：6中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：4中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

59.权利要求56所述的测定方法，其中所述的hT2R13选自：

i.SEQ ID NO：9中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：8中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：9中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

60.权利要求56所述的测定方法，其中所述的hT2R54选自：

i.SEQ ID NO：11中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：10中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：11中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

61.权利要求1所述的测定方法，其中所述的hT2R61选自：

i.SEQ ID NO：13中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：12中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：13中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

62.权利要求56所述的测定方法，其中所述的hT2R75选自：

i.SEQ ID NO：15中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：14中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：15中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

63.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器以细胞膜表达。

64.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器以分离的细胞膜表达。

65.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器以完整细胞表达。

66.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器以真核细胞表达。

67.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由两栖动物、哺乳动物或昆虫细胞表达。

68.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞表达。

69.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其为荧光测定法。

70.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其为结合测定法。

71.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于通过测定所述化合物对胞内离子浓度的作用来检测该化合物的作用。

72.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对胞内钠或钙的作用。

73.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对细胞膜电位的作用。

74.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对所述的味觉感受器的转录的作用。

75.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中基于所述化合物阻断所述的味觉感受器与地那铵相互作用的能力选择所述的化合物。

76.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对胞内cAMP、cGMP或IP3的作用。

77.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器包含所述的味觉感受器的胞外域或跨膜区。

78.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的测定方法使用钙特异性荧光染料检测钙的改变。

79.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的测定方法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测胞内钙的改变。

80.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在溶液中。

81.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其为检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度改变的结合测定法。

82.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用。

83.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用，所述的G蛋白选自转导素、味转导素、G_α15和G_α16。

84.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其为荧光偏振测定法。

85.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器与固相基质结合。

86.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其为高流通量测定法。

87.权利要求56-62中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由HEK293细胞表达。

88.用于鉴定调节对士的宁作出特异性反应的人味觉感受器的化合物的测定方法，所述的人味觉感受器选自hT2R8、hT2R9、hT1R10、hT2R54和hT2R75，该方法包括：

i.筛选对士的宁或结构相关化合物诱导被士的宁或结构相关化合物活化的hT2R8、hT2R9、hT1R10、hT2R54和hT2R75或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的活化具有作用的化合物；和

ii.基于所述化合物对由士的宁或结构相关化合物活化所述感受器的作用确定其是否调节与hT2R8、hT2R9、hT1R10、hT2R54和hT2R75相关的苦味。

89.权利要求88所述的测定方法，其中所述的hT2R8选自：

i.SEQ ID NO：3中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：2中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

90.权利要求88所述的测定方法，其中所述的hT2R9选自：

i.SEQ ID NO：5中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：4中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：5中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

91.权利要求1所述的测定方法，其中所述的hT2R10选自：

i.SEQ ID NO：4中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：6中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：7中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

92.权利要求88所述的测定方法，其中所述的hT2R54选自：

i.SEQ ID NO：11中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：10中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：11中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

93.权利要求88所述的测定方法，其中所述的hT2R75选自：

i.SEQ ID NO：15中包含的氨基酸序列；

ii.由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：14中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：15中包含的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

94.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在细胞膜上表达。

95.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在分离的细胞膜上表达。

96.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在完整细胞上表达。

97.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在真核细胞上表达。

98.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由两栖动物、哺乳动物或昆虫细胞表达。

99.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞表达。

100.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其为荧光测定法。

101.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其为结合测定法。

102.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于通过测定所述化合物对胞内离子浓度的作用来检测该化合物的作用。

103.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对胞内钠或钙的作用。

104.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对细胞膜电位的作用。

105.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对所述的味觉感受器的转录的作用。

106.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中基于所述化合物阻断所述的味觉感受器与士的宁相互作用的能力选择所述的化合物。

107.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对胞内cAMP、cGMP或IP3的作用。

108.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器包含所述的味觉感受器的胞外域或跨膜区。

109.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的测定方法使用钙特异性荧光染料检测钙的改变。

110.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的测定方法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测胞内钙的改变。

111.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器在溶液中。

112.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其为检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度改变的结合测定法。

113.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于检测所述化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用。

114.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，用于检测所述的化合物对所述的味觉感受器与G蛋白复合的作用，所述的G蛋白选自转导素、味转导素、G_α15和G_α16。

115.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其为荧光偏振测定法。

116.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器与固相基质结合。

117.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其为高流通量测定法。

118.权利要求88-93中任意一项所述的测定方法，其中所述的味觉感受器由HEK293细胞表达。

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