CN113230256A - 士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用 - Google Patents

士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开了士的宁在制备调控肝细胞中UGT1A4表达的产品中应用，以及士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用，所述肝细胞为人肝细胞HL‑7702。本发明通过分析UGT1A4报告基因的活性在各浓度士的宁干预下的影响及机制，明确UGT1A4与士的宁的关系及作用机制，为进一步研究士的宁代谢及合成临床用药提供一定的实验依据。

Description

士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用。
背景技术
马钱子是马钱子科植物马钱(Strychnos nux-vomica L.)的干燥成熟种子，又名番木鳖，有着良好的通络止痛、散结消肿的功效，因其毒性强烈严重影响临床使用；而士的宁是马钱子主要有效成分和毒性成分，在血液中代谢最快，在肝脏中代谢最慢，研究其生物代谢对其临床合理和安全运用具有重要意义。
作为生物体内Ⅱ期代谢过程中主要的结合酶，葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)在维持内源性代谢物(如胆红素和类固醇)的平衡和去除外源代谢物(如各类化学药物和食物)方面发挥着至关重要的作用。课题组前期研究指出，在弱碱性下士的宁可逐渐地代谢成为一种葡萄糖酸代谢产物，其较为重要的一种代谢亚酶就是葡萄糖醛酸转移酶1A4(UGT1A4)，而肝脏则是较为重要的代谢部位。UGTs酶的表达受各种转录调控因子调控，组成型雄烷受体(CAR)、孕烷X受体(PXR)和芳香烃受体在调控下游UGTs靶基因的表达中起着非常关键的作用。但士的宁是否影响正常人肝细胞中UGT1A4的表达，且这种调控是否与PXR和CAR信号通路存在相关性尚不明晰。并且至今，也没有士的宁与人肝细胞UGT1A4的表达相关性的研究和报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过分析UGT1A4报告基因的活性在各浓度士的宁干预下的影响及机制，明确UGT1A4与士的宁的关系及作用机制，为进一步研究士的宁代谢及合成临床用药提供一定的实验依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供士的宁在制备调控肝细胞中UGT1A4表达的产品中应用。
优选的是，所述士的宁通过PXR调控通路诱导肝细胞中UGT1A4表达，且所述UGT1A4表达与所述士的宁呈剂量依赖关系。
优选的是，随着所述士的宁剂量升高可以增加肝细胞中UGT1A4的表达，并明显降低士的宁的毒性。
优选的是，所述肝细胞包括人肝细胞HL-7702。
优选的是，所述士的宁源自马钱子。
优选的是，所述产品为药物或动物模型。
本发明还提供一种士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用，所述肝细胞为人肝细胞HL-7702。
本发明公开了以下技术效果：
本研究主要通过双荧光素酶报告基因法以及脂质体瞬时转染方法，分析UGT1A4报告基因的活性在各浓度士的宁干预下的影响及机制，明确UGT1A4与士的宁的关系及作用机制，结果发现，士的宁对HL-7702中UGT1A4和PXR在转录和蛋白水平有明显的上调作用，对CAR在转录和蛋白水平没有明显影响。士的宁对HL-7702细胞中UGT1A4的诱导作用主要通过PXR调控通路实现。该作用机制的发现为进一步研究士的宁代谢及合成临床用药提供一定的实验依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为士的宁对HL-7702细胞活力的影响
Figure BDA0003104978020000031
与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；
图2为士的宁对HL-7702中UGT1A4表达的影响
Figure BDA0003104978020000032
1.对照组；2.士的宁低剂量组；3.士的宁中剂量组；4.士的宁高剂量组；5.利福平组；注：与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；
图3为士的宁对HL-7702中PXR表达的影响
Figure BDA0003104978020000033
1.对照组；2.士的宁低剂量组；3.士的宁中剂量组；4.士的宁高剂量组；5.利福平组；注：与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；
图4为士的宁对HL-7702中CAR表达的影响
Figure BDA0003104978020000034
1.对照组；2.士的宁低剂量组；3.士的宁中剂量组；4.士的宁高剂量组；5.CITCO组；注：与对照组比较，***P<0.001；
图5为士的宁对hPXR介导的UGT1A4的诱导作用
Figure BDA0003104978020000035
1.对照组；2.士的宁低剂量组；3.士的宁中剂量组；4.士的宁高剂量组；5.利福平组；注：与对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；
图6为士的宁对hCAR介导的UGT1A4的诱导作用
Figure BDA0003104978020000036
1.对照组；2.士的宁低剂量组；3.士的宁中剂量组；4.士的宁高剂量组；5.CITCO组；注：与对照组比较，***P<0.001；
图7为hPXR siRNA对PXR表达的影响；
图8为士的宁对hPXR沉默后HL-7702中UGT1A4表达的影响
Figure BDA0003104978020000041
Figure BDA0003104978020000042
1.对照组；2.士的宁低剂量组；3.士的宁中剂量组；4.士的宁高剂量组；5.利福平组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
1、材料与方法
1.1细胞株及质粒正常人肝细胞株HL-7702，购自武汉博士德生物公司；pcDNA3.1(+)-hPXR高表达质粒、pcDNA3.1(+)-hCAR高表达质粒、pGL3-UGT1A4-luc报告基因质粒、pRL-TK内参质粒，均由上海吉凯基因生物公司提供。
1.2药物及试剂士的宁，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：100756；利福平，美国Sigma公司，批号：1604009；组成性雄烷受体激动剂(CITCO)，美国APExBIO公司，批号：3689；DMEM培养基(批号：1338043)、胎牛血清(批号：10099-141)，美国Gibco公司；RNA提取试剂(批号：15596026)和lipotransfection3000(批号：123564)，美国Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit(批号：135600)、
Figure BDA0003104978020000051
Green Realtime PCR Master Mix(批号：26200)均为日本TOYOBO公司；兔抗人PXR(批号：4223)、CAR(批号：5023)一抗，美国Proteintech公司；Anti-UGT1A4一抗，美国Abcam公司，批号：ab192424；hPXR siRNA(批号：sc-1689)和scramble siRNA(批号：sc-1567)，美国Santa cruz公司；UGT1A4、PXR、CAR、β-actin引物由日本TaKaRa设计合成；ECL检测试剂盒，美国Thermo公司，批号：32019；其他国产分析纯试剂均购于广州浩玛生物有限公司。
1.3细胞培养
HL-7702细胞采用DMEM培养液(其中含有10％胎牛血清，青、链霉素各100U·mL-1)培养，培养环境为37℃、5％CO2，当细胞逐渐生长而近90％左右的瓶底后，采用0.25％的胰酶进行消化传代处理。
1.4士的宁对HL-7702细胞活力的影响
HL-7702细胞经胰酶消化后在6孔培养板中进行接种(2×105·mL-1)，各个孔均为2mL，在24h之后再将培养液去掉，PBS进行洗涤处理之后再将新鲜的培养液添加进去。细胞随机分为对照组、不同浓度士的宁组(10、20、40、80、160、320pmol·L-1)，药物干预24、48h后，参照CCK8试剂盒说明书测定细胞活性。
1.5荧光定量RT-PCR检测HL-7702细胞UGT1A4、PXR、CAR mRNA的表达
采用胰酶消化之后，在6孔培养板中进行接种(2×105·mL-1)，各个孔均为2mL，在24h之后再将培养液去掉，PBS进行洗涤处理之后再将新鲜的培养液添加进去。细胞随机分为对照组及士的宁高(40pmol·L-1)、中(20pmol·L-1)、低(10pmol·L-1)剂量组，药物干预24h后收集细胞。通过Trizol法来进行细胞总RNA的提取处理，RNA纯度则通过紫外分光光度分析计来进行实验测定，RNA完整性则是利用1.5％琼脂糖凝胶电泳的方法来准确测定。通过逆转录反应来对RNA样品进行处理，最终实现cDNA模板的合成，进而根据试剂盒的说明内容来展开PCR：在95℃的温度下进行30s的预变性，然后在95℃下进行5s的变性，再于60℃下进行30s的退火处理，该过程的循环共计40次，在各个循环中均进行GAPDH扩增设置以得到相应的内参对照。进行标准曲线的绘制，且选择2-△△Ct法来进行CAR、PXR以及UGT1A4的相对表达量的计算。扩增产物如表1所示。
表1 引物序列及扩增产物大小
Figure BDA0003104978020000061
Figure BDA0003104978020000071
1.6 Western Blot检测HL-7702细胞UGT1A4、PXR、CAR蛋白表达
细胞种板及分组同上。在完成了细胞的收集之后，再根据说明书的内容来进行蛋白的提取，然后进行浓度的实验测定。对于各个孔，均进行50μg的上样，通过12％聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法来进行样品的有效分离，然后转移蛋白到PVDF膜之上，在室温的条件下，采用5％脱脂奶粉来进行2h的封闭，再将一抗溶液(UGT1A4 1:1000，PXR 1:2000，CAR 1:2000)加入进去，4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，共进行3次，每次均为10min，在室温条件下对已经进行HRP标记的1:15000二抗溶液进行时长为2h的孵育，当已经完成了洗膜之后，再添加ECL液进去以进行显色曝光。
1.7士的宁对瞬时共转染hPXR的HL-7702细胞中UGT1A4的影响
在24孔板中接种正处于生长对数期的细胞，每孔1×105个，那些已经进行了纯化而且经过鉴定的内参质粒、报告质粒以及表达质粒等，将会被转入HL-7702细胞之中。采用OPTI-MEM培养基稀释质粒，对各孔而言，具体比例如下：pRL-TK 20μg、pGL3-UGT1A4-luc160μg、pcDNA3.1(+)-hPXR 320μg，稀释后的质粒与脂质体充分混匀，室温静置20min，形成所需的脂质体-DNA复合物。以每孔50μL的量将DNA-脂质体复合物加入24孔板，5％CO2、37℃培养6h后，将细胞与利福平(10μmol·L-1)及士的宁高(40pmol·L-1)、中(20pmol·L-1)、低剂量(10pmol·L-1)孵育24h，进行荧光素酶测定，利福平为阳性对照。
1.8士的宁对瞬时共转染hCAR的HL-7702细胞中UGT1A4的影响
种板及转染操作同上，每孔具体比例如下：pRL-TK 20μg、pGL3-UGT1A4-luc 96μg、pcDNA3.1(+)-hPXR 384μg，以每孔50μl的量将DNA-脂质体复合物加入24孔板，5％CO2、37℃培养6h后，将细胞分别与CITCO(10μmol·L-1)及士的宁高(40pmol·L-1)、中(20pmol·L-1)、低剂量(10pmol·L-1)孵育24h，进行荧光素酶测定，CITCO为阳性对照。
1.9报告基因检测
收集“1.7”和“1.8”的细胞，UGT1A4报告基因活性的具体检测方法及计算参考文献(夏延哲等.旱莲草单体对人孕烷X受体调控CYP3A4转录表达的调节作用)进行。
1.10士的宁对hPXR沉默后HL-7702细胞中UGT1A4 mRNA和蛋白的影响
HL-7702细胞经胰酶消化后接种于6孔培养板中，每孔1×105个，待细胞生长融合至40％，每孔加入100nmol·L-1siRNA(hPXR或scramble)和3μL转染试剂，培养6h后更换正常培养基，继续培养48h后加入不同浓度士的宁(10、20、40pmol·L-1)继续培养24h后，收集细胞检测UGT1A4蛋白表达水平，利福平为阳性对照。
1.11统计学处理方法
将收集到的具体数据输入SPSS 13.0for Windows软件进行统计分析，计量资料结果以均数±标准差
Figure BDA0003104978020000081
表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1士的宁对HL-7702细胞活力的影响
与对照组相比，10、20、40pmol·L-1士的宁干预24、48h后对细胞活力的基本没有影响，毒性较小。80、160pmol·L-1士的宁干预24、48h后对细胞活力有一定影响(P<0.05)，320pmol·L-1士的宁干预24、48h后对细胞活力影响比较明显(P<0.01)。结果见图1。
2.2士的宁对HL-7702细胞中UGT1A4、PXR、CAR mRNA表达的影响
与对照组相比，20pmol·L-1士的宁干预24h后对UGT1A4、PXR mRNA表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；40pmol·L-1士的宁干预24h后对UGT1A4、PXR mRNA的表达明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.001)；10pmol·L-1士的宁对UGT1A4、PXRmRNA的表达没有显著影响；与对照组相比，10、20、40pmol·L-1士的宁干预24h后对CAR mRNA的表达没有显著影响(P>0.05)。结果见表2。
表2 士的宁对HL-7702中UGT1A4、PXR、CAR mRNA表达的影响
Figure BDA0003104978020000091
Figure BDA0003104978020000092
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
2.3士的宁对HL-7702细胞中UGT1A4、PXR、CAR蛋白表达的影响
与对照组相比，20、40pmol·L-1士的宁干预24h后对UGT1A4蛋白表达有上调作用，差异具有统计学意义(P<0.01)；20、40pmol·L-1士的宁干预24h后对PXR蛋白表达有显著上调作用，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.001)；10pmol·L-1的士的宁对PXR以及UGT1A4蛋白的表达没有明显影响，结果见图2、3。
与对照组相比，10、20、40pmol·L-1士的宁干预24h后对CAR蛋白表达没有显著影响(P>0.05)，结果见图4。
2.4士的宁瞬时共转染hPXR或hCAR的HL-7702中UGT1A4报告基因的影响
与对照组比，20、40pmol·L-1士的宁干预24h后能通过激活hPXR对UGT1A4报告基因的诱导活性显著增加，具有浓度依赖性，差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.001)，10pmol·L-1士的宁干预24h后对UGT1A4报告基因诱导活性增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图5。
与对照组比，10、20、40pmol·L-1士的宁干预24h后对hCAR介导UGT1A4报告基因活性无显著诱导效应，结果见图6。
2.5士的宁对hPXR沉默后HL-7702细胞中UGT1A4蛋白的影响
从图7可知，与scramble siRNA相比，hPXR siRNA干扰后，PXR蛋白水平明显下调，说明siRNA沉默PXR成功。沉默PXR后，20、40pmol·L-1士的宁干预24h后对UGT1A4蛋白表达的没有上调作用，与对照组比差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图8。
药物在生物体内进行Ⅱ期代谢时，UGTs酶可将大约35％的药物进行催化进而产生葡萄糖醛酸化反应。UGT酶根据基因序列分为UGT1家族和UGT2家族，UGT1A4是UGT1中的重要的一个亚族，参与含有一级胺和二级胺结构药物的体内代谢。目前发现的UGT单酶中，只有UGT1A4具有催化士的宁葡糖醛酸化代谢反应的能力，但具体机制不明。
上述试验结果可见，低剂量士的宁对UGT1A4在转录和蛋白水平的表达均无影响，中剂量及高剂量士的宁对UGT1A4在转录和蛋白水平的表达均有上调作用。UGT1A4是葡萄醛酸代谢反应的关键代谢酶，随着士的宁的剂量的升高，UGT1A4的表达升高，表明该酶的代谢作用强，有利于降低士的宁的毒性。
低剂量士的宁对PXR在转录和蛋白水平的表达均无影响，中剂量及高剂量士的宁对PXR在转录和蛋白水平的表达均有上调作用，但各剂量的士的宁对CAR在转录和蛋白水平均无影响，提示核受体PXR对UGT1A4表达起关键调节作用。
士的宁中、高剂量通过PXR诱导UGT1A4报告基因的活性，而士的宁各剂量对CAR介导的UGT1A4报告基因无活性；此外，UGT1A4是hPXR的靶基因，士的宁主要通过PXR通路来调控UGT1A4靶基因的表达。在此基础上，本研究进一步利用siRNA干扰技术沉默PXR，观察沉默PXR基因后，士的宁对UGT1A4蛋白表达的上调作用是否有影响，从结果来看，沉默PXR后，中、高剂量士的宁对UGT1A4表达的上调作用被明显减弱，进一步明确士的宁通过激活核受体PXR影响UGT1A4表达。
综上所述，士的宁主要通过激活核受体PXR，上调Ⅱ相代谢酶UGT1A4的转录和蛋白水平，核受体CAR几乎不参与其中。这为之后深入研究士的宁在动物模型中对UGT1A4的作用具有重要作用，对进一步探讨其对核受体PXR和CAR的差异效应机制奠定基础。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.士的宁在制备调控肝细胞中UGT1A4表达的产品中应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述士的宁通过PXR调控通路诱导肝细胞中UGT1A4表达，且所述UGT1A4表达与所述士的宁呈剂量依赖关系。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，随着所述士的宁剂量升高可以增加肝细胞中UGT1A4的表达，并明显降低士的宁的毒性。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝细胞包括人肝细胞HL-7702。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述士的宁源自马钱子。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药物或动物模型。
7.士的宁在制备肝细胞代谢药物中的应用，其特征在于，所述肝细胞为人肝细胞HL-7702。
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