CN101416055A - 被咖啡中的苦味分子(绿原酸内酯)激活的人t2r受体的鉴定和用于鉴定人苦味调节剂的相关测定法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及T2R味觉受体家族中的特定人味觉受体对特定的苦味化合物即绿原酸内酯化合物发生响应，所述化合物至少部分导致许多咖啡饮料的苦味的发现。本发明还涉及在测定法中使用此类受体鉴定调节绿原酸内酯和相关化合物对此类味觉受体的激活的配体，和为了改变(阻断)T2R相关性苦味，可将所述配体用作食物、饮料和药物的添加剂和/或将其从食物、饮料和药物中除去。优选实施方案是将已鉴定的化合物用作咖啡和咖啡风味的食物、饮料和药物中的添加剂。

Description

被咖啡中的苦味分子(绿原酸内酯)激活的人T2R受体的鉴定和用于鉴定人苦味调节剂的相关测定法

相关应用

本申请涉及2002年7月10日提交的涉及美国系列No.10/191,058和2001年4月5日提交的美国系列No.09/825,882，所述两个申请都在此以其全文引用作为参考。这些申请涉及hT2R的鉴定和其在测定中用于鉴定激活特定T2R的配体的用途。此类配体用于调节味觉，特别是苦味。

发明领域

本发明涉及苦味化合物的阐明，所述苦味化合物激活许多之前报导的参与苦味感觉的T2R家族中的人G蛋白偶联受体(GPCR)。特别地，本发明涉及发现：hT2R8、hT2R14和hT2R54对绿原酸内酯发生特异性响应，所述绿原酸内酯是至少部分形成咖啡的苦味的原因。因此，可使用受试者T2R鉴定化合物，所述化合物调节(优选阻断)苦味，例如咖啡中发现的苦味化合物和相关的苦味促味剂的苦味。

更特别地，本发明显示受试人苦味受体、其片段或变体或嵌合物(包括其直系同源物(ortholog)、剪接变体、单核苷酸多态性(SNPS)和基因工程改造的突变体)在用于鉴定化合物的测定法优选基于高通量细胞的测定法中是有用的，所述化合物调节(优选阻断)绿原酸内酯分子以及结构相关性化合物和激活此类受体的其他化合物的苦味。可将使用这些测定法鉴定的化合物在食物、饮料或药品中用作添加剂以改善其味道。此外，本发明涉及为了减少或消除激活受试者T2R的苦味化合物而进行处理和配制的改良的食品、饮料和药物。

相关领域描述

人可识别的一种基本味觉是苦味。直至最近对苦味的生理学仍然知之甚少。近年来的研究已开始阐明味觉生物学(Lindemann，Nature(2001))。现在认为许多苦味化合物通过与细胞表面受体相互作用来产生苦味。这些受体属于与细胞内G蛋白相互作用的7个跨膜结构域受体的家族。已在人和啮齿类动物中鉴定了称为T2R的GPCR新家族(Adler等人，Cell 100(6)：693-702(2000)；Chandrashekar等人，Cell 100(6)：703-711(2000)；Matsunami H，Montmayeur J P，BuckLB.Nature 404(6778)：601-4(2000))。几个证据线索显示T2R介导对苦味化合物的反应。首先，T2R基因在舌和腭上皮的味觉感觉器细胞的亚群中特异性表达。第二，人T2R中的一种(hT2R1)的基因位于在人中与对苦味化合物6-正-丙基-2-硫脲嘧啶的敏感性相关的染色体基因座中(Adler等人，(Id.)(2000))。第三，小鼠T2R中的一种(mT2R5)的基因位于小鼠中与对苦味化合物环己酰亚胺的敏感性相关的染色体基因座中。也显示mT2R5可激活味导素(gustducin)(在味觉细胞中特异性表达的G蛋白)和与苦味刺激转导相关(Wong等人，Nature 381：796-800(1996))。mT2R5对味导素的激活只在对环己酰亚胺的响应中发生(Chandrashekar等人，(Id.)(2000)。因此，有人提出mT2R家族在小鼠中介导苦味反应，而hT2R家族在人中介导苦味反应。已鉴定了几种作为某些苦味配体的受体的人T2R(Chandrashekar等人，(Id.)2000；Bufe等人，(Id.)2002；Kim等人Science 299，2003；Pronin等人，Chemical Senses 29，2004；Behrens等人，BBRC 319，2004；Kuhn等人，J.Neuroscience 24，2004；Bufe等人，Current Biology，15，2005)。也显示各hT2R能够结合多种苦味配体。该假说基于这样的事实，即hT2R家族只由24个已鉴定的成员组成，然而人可识别数百种不同的苦味化合物。之前已报导了hT2R的序列，其公开于Zuker等人(WO 01/18050 A2，(2001))和Adler等人(WO 01/77676 A1(2001))的公开的PCT申请中，其两者在此以其全文引用作为参考。

研究T2R功能的一个困难是这些受体不易在培养的哺乳动物细胞系中表达。为了提高T2R的表达，将来自良好表达的GPCR(视紫红质)的N末端序列附着至T2R序列(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。由于可获得的抗体的原因，该N-末端标记也使得能够容易地监测蛋白表达。尽管视紫红质标记的整合提高了一些T2R在哺乳动物细胞系中的表达，但它们中的许多的表达仍然不足以进行功能研究。在不同的方法中，使mT2R5在昆虫Sf9细胞中成功表达，然后通过使用化学GTPγ S结合测定法将其用于功能研究(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。

在本申请者的早期专利申请，美国系列No.10/191,058(此处引用作为参考)中，申请者发现了特异性激活3种不同的人T2R的配体。此外，本申请人在2005年2月8日提交了进一步鉴定特异性结合7种特定的人T2R的苦味配体(包括对乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的宁和苯甲酸地那铵(denatonium))和相关测定法的美国临时系列No.60/650,555。

然而，尽管有已报导的内容和理解T2R成员调节苦味，但仍存在对激活特定T2R受体的特异性配体的鉴定的需要。对不同的T2R特别是人T2R的结合特性的更多的理解将是非常有益的，因为其将更有利于其在选择具有希望的味觉调节特性的化合物(即阻断或抑制特定苦味化合物的味道的化合物)中的用途。

此外，在对本发明的特定关联性中，存在对鉴定可用于抑制与咖啡相关的苦味的化合物的特殊需要。一方面近年来在美国和世界咖啡的消费已显著增加，但许多咖啡饮者的主要抱怨是许多咖啡引起了苦味余味。因此，鉴定使咖啡展示苦味余味的化合物和/或鉴定阻断咖啡的苦味余味的测定法对于产生具有改善的可口性的咖啡是有益的。关于这一点，已报导咖啡的烘焙与加工对咖啡中的绿原酸内酯的形成具有作用(Furah等人，J.Agric.Food Chem.53(5)：1505-13(2005)；Variyar等人，J.Agric.Food Chem.51(27)：7495-50(2003))。

发明概述

由于是一原因，本发明涉及下述发现：T2R家族中的几种受体特别是hT2R8、hT2R14和hT2R54对咖啡中发现的绿原酸内酯发生特异性响应，所述绿原酸内酯假定是(至少部分是)形成咖啡饮料的苦味的原因。

使用基于细胞的测定法获得这些发现，所述测定法使用在特定苦味配体存在和不存在的情况下表达特定T2R的细胞测量T2R的活性。特别地，如下文中更详细描述的，在检测细胞内钙浓度的变化的基于细胞的测定中使用HEK细胞系(所述细胞系在它们的表面上表达上面鉴定的特定T2R和进一步表达在功能上与所述T2R偶联的嵌合G蛋白)，并发现所述细胞系被咖啡以及其他食物和饮料中发现的特定苦味化合物(许多绿原酸内酯分子)特异性激活，然而其他hT2R在相似的条件下不被激活。

因此，本发明包括这些人味觉受体在测定法(优选高通量测定法)中鉴定化合物的用途，所述化合物调节(优选阻断)绿原酸内酯、其衍生物和其他苦味化合物对此类受体的激活。

此外，本发明还涉及此类受体用于鉴定咖啡和其他苦味食品以及饮料中引起苦味的化合物的用途。

本发明也包括测定方法，所述方法包括评价已鉴定的调节化合物在人中的效应或其他味觉试验的效果，以及评价已鉴定的化合物对苦味的效应的额外步骤。此外，本发明包括已鉴定的化合物在食品、饮料和药物中用作香料或调味剂(taste modulator)的用途，即抑制苦味例如与咖啡饮料和咖啡风味食物相关的苦味的用途。

本发明的目的

本发明的目的是鉴定阻断化合物，所述化合物阻断咖啡中发现的绿原酸内酯分子或激活至少一种此类T2R受体的结构上与该绿原酸内酯相关的化合物对hT2R8、hT2R14或hT2R54或其片段、变体、直系同源物或嵌合物的激活。

本发明的明确目的是鉴定化合物，所述化合物阻断咖啡中包含的3CoQAL(绿原酸内酯)、结构上与其相关的、激活一种或所有此类hT2R的化合物对hT2R58、hT2R14和hT2R54或其片段、变体、直系同源物或嵌合物的激活。

本发明的另一个明确的目的是鉴定化合物，所述化合物阻断咖啡中发现的3CQAL和4CQAL(绿原酸内酯)或结构上与其相关的化合物对hT2R8、hT2R14和hT2R54的激活，所述结构上与其相关的化合物激活至少一种此类受体。

本发明的另一个明确的目的是鉴定化合物，所述化合物阻断咖啡饮料中发现的4FQAL(绿原酸内酯)或结构上与其相关的化合物对hT2R8和hT2R54的激活，所述结构上与绿原酸内酯相关的化合物特异性激活该受体。

本发明的另一个明确的目的是在测定法中使用包含或表达(稳定地或瞬时地)hT2R8、hT2R14或hT2R54或其片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物的细胞或细胞膜鉴定化合物，所述化合物阻断由绿原酸内酯和相关苦味化合物例如3CoQAL、3CQAL和4FQAL对至少一种所述受体的激活。

本发明的甚至更明确的目的是在基于细胞的测定法(所述测定法检测细胞内钙的变化)中使用表达与其偶联的G蛋白(例如，G_α 15、G_a 16、味导素、转导蛋白或其嵌合物例如G_α 16味导素嵌合物或G_α 16转导蛋白嵌合物)的细胞，优选哺乳动物、两栖动物或昆虫的细胞例如HEK293T细胞以检测化合物，所述化合物调节(优选阻止或抑制)咖啡饮料中包含的绿原酸内酯和相关化合物例如3CoQAL、3CQAL、4CQAL和4FQAL对上述人味觉受体中的一种的激活。

本发明的另一个目的是在味觉试验优选人味觉试验中验证已鉴定的化合物调节(优选抑制或阻断)例如绿原酸内酯和相关苦味化合物例如在咖啡饮料中发现的所述化合物引起的苦味。

本发明的另一个目的是，为了抑制或阻止由特异性地激活此类味觉受体的化合物引起的苦味，将在此处描述的测定法中鉴定的化合物用作组合物中的添加剂或调味剂。本发明优选目的是为了阻断含有绿原酸内酯的食物、饮料和药物(优选咖啡或咖啡风味的饮料和食物)的苦味，使用抑制至少上面已鉴定的人T2R受体的激活的化合物。

附图详述

图1包括各种绿原酸内酯的结构。

图2显示hT2R8、hT2R14和hT2R54对所述绿原酸内酯中的一种(3CoQAL)的剂量响应。

图3包含显示hT2R8、hT2R14和hT2R54对图1中描述的两种绿原酸内酯3CQAL和4CQAL的特异性响应的钙成像实验的结果。

图4包含显示hT2R8和hT2R54以剂量依赖性的方式对图1中描述的另一种绿原酸内酯4FQAL的响应的钙成像实验的结果。

发明详述

在明确地描述本发明之前，提供下列定义。

术语“T2R”家族包括多态性变体(polymorphic variant)、等位基因、突变体和同源物，所述同源物：(1)在大约25个氨基酸，最优50-100个氨基酸的窗口上具有对下文和此处引用作为参考的Zuker(Id)(2001)和Adler(Id.)(2001)的申请中公开的T2R大约30-40％的氨基酸序列同一性，更优选大约40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的氨基酸序列同一性；(2)特异性结合用包含选自下文中公开的T2R序列和其保守性修饰的变体的氨基酸序列的免疫原产生的抗体；(3)在严紧杂交条件下对选自对下文中公开的T2RDNA序列和其保守性修饰的变体特异性杂交(任意地，大小为至少大约100个核苷酸；至少大约500-1000个核苷酸)；(4)包含对选自下文中公开的T2R氨基酸序列的氨基酸序列至少大约40％的同一性的序列或(5)使用在严紧杂交条件下对公开的T2R序列特异性杂交的引物进行扩增。

特别地，此类T2R包括称为hT2R8、hT1R14和hT2R54的味觉受体GPCR(其具有本申请中提供的核酸序列和氨基酸序列)和其特异性结合苦味配体(即绿原酸内酯和其衍生物例如3CQAL、4CQAL、3CoQAL和4FQAL)的变体、等位基因、突变体、直系同源物和嵌合物，所述苦味配体至少促成咖啡饮料的苦味。

尽管T2R基因在蛋白质和DNA水平上展示显著的序列趋异性，但发现所有迄今为止分离的T2R在特定区域包含共有序列，所述共有序列对之前在Adler等人(WO 01/77676 A1(2001)和Zuker等人WO01/18050 A2(两者在此以其全文引用作为参考)中鉴定的T2R共有序列同一或具有所述T2R共有序列或具有对该T2R共有序列至少70-75％的序列同一性。

在拓扑学上，某些化学感觉GPCR具有“N末端结构域”、“细胞外结构域”、包含7个跨膜区域的“跨膜结构域”和对应的细胞质和细胞外环、“细胞质区域”和“C末端区域”(参见，例如，Hoon等人，Cell，96：541-51(1999)；Buck & Axel，Cell，65：175-87(1991))。可使用本领域技术人员已知的方法在结构上鉴定这些区域，所述方法是例如鉴定疏水性和亲水性构域的序列分析程序(参见，例如，Stryer，Biochemistry，(第3版，1988)；也参见许多基于互联网的序列分析程序中的任一种程序)。这些区域用于产生嵌合蛋白和用于本发明的体外测定，例如配体结合测定。

因而“细胞外结构域”是指从细胞膜伸出的并暴露于细胞的细胞外表面的T2R多肽的结构域。该区域可包括暴露于细胞的细胞外表面的“N末端结构域”和暴露于细胞的细胞外表面的跨膜结构域的细胞外环，即跨膜区域2和3之间、跨膜区域4和5之间以及跨膜区域6和7之间的细胞外环。所述“N末端结构域”始于N末端并延伸至接近跨膜区的起始位点的区域。这些细胞外区域用于溶性相和固相的体外配体结合测定。此外，下面描述的跨膜区也可与细胞外区域一起或单独地参与配体结合，从而也用于体外配体结合测定。

包含7个跨膜“区”的“跨膜结构域”是指位于质膜内的T2R的结构域，其也可包含对应的细胞质(细胞内)和细胞外环，也称为跨膜“区”。可使用标准方法，如Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-32(1982))，或Stryer(同上)中描述的方法鉴定所述7个跨膜区和细胞外和细胞质环。

“胞浆区(Cytoplasmic domain)”是指面对细胞内部的T2R蛋白的结构域，例如“C末端结构域”和跨膜结构域的细胞内环，例如跨膜区1和2之间、跨膜区3和4之间以及跨膜区5和6之间的细胞内环。“C末端结构域”是指横跨最后一个跨膜区的末端至蛋白的C末端的区域，其通常位于细胞质内。

术语“7-跨膜受体”是指属于具有7个区域、横跨质膜7次(从而，所述7个区域称为“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)的跨膜蛋白的亚家族的多肽。嗅觉和某些味觉受体的亚家族各自属于该超家族。7-跨膜受体多肽具有相似的特征性一级、二有和三级结构，如下面进一步详细描述的。

术语“配体结合区”是指来源于化学感觉受体或味觉受体的、基本上包含跨膜结构域II至VII(TM II至VII)的序列。该区域可能能够结合配体，更特别地味觉引发化合物(taste elicitingcompound)。

术语“质膜转位结构域(plasma membrane translocationdomain)”或简单地“转位结构域”是指功能上等同于示例性转位结构域(5’-MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV；SEQ ID NO：1)的多肽。这些肽结构域，当整合入多肽编码序列的氨基末端时，可非常有效地将杂交(“融合”)蛋白“伴护”或“转位”至细胞质膜。该特定的“转位结构域”最初来源于人视紫红质受体多肽(7-跨膜受体)的氨基末端。另一种转位结构域来源于牛视紫红质序列并且也用于帮助转位。来源于视紫红质的序列在将7-跨膜融合蛋白转位至质膜中特别有效。

“功能等同性”是指结构域在在相似条件下将新翻译的蛋白转移至质膜的能力和效率与示例性SEQ ID NO：1的一样有效；如此处所描述的，可测量(在数量方面)和比较相对效率。可通过常规筛选就它们与20个氨基酸长的转位结构域SEQ ID NO：1相同的将新合成的多肽转位至细胞(哺乳动物、非洲蟾蜍等)的质膜的功效确定落在本发明的范围内的结构域。

在用于检测调节T2R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定法的上下文中，术语“功能效应”包括间接或直接在受体的影响下的任何参数例如功能、物理和化学效应的确定。其包括体外、体内和离体的配体结合、离子流、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如，cAMP、cGMP、IP3或细胞内Ca²⁺)的改变，也包括其他生理效应例如神经递质或激素释放的增加或减少。

“确定功能效应”是指对增加或减少间接或直接在T2R家族成员影响下的参数例如功能性、物理学和化学效应的化合物的测定。可通过本领域技术人员已知的方法测量此类功能性效应，例如光谱特征(例如，荧光、吸光率、折射率)、流体动力学(例如，形状)、色谱或溶解度性质、膜片钳、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素流出、可诱导的标记、孵母细胞T2R基因的表达的变化；组织培养细胞T2R的表达；T2R基因的转录激活；配体结合测定；电压、膜电位和导电系数的变化；离子流测定；细胞内第二信使例如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化；细胞内钙水平的变化；神经递质的释放等。

T2R蛋白受体的“抑制剂”、“激活物”和“调节剂”可互换使用，表示使用味觉转导的体外和体内测定法鉴定的抑制、激活或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源物和模拟物。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断刺激、减少、防止、延迟激活味觉转导、使味觉转导失活或下调味觉转导的化合物，例如拮抗剂。激活物是例如结合、刺激、增加、打开、激活、增强味觉转导、使味觉转导灵敏或上调味觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改变受体与结合激活物或抑制剂的细胞外蛋白的相互作用的化合物(例如，ebnerin和疏水载体家族的其他成员)；G蛋白；激酶(例如，视紫红质激酶和参与使受体失活和脱敏的β-肾上腺素能受体激酶的同源物)；和也使受体失活和脱敏的抑制蛋白。调节剂包括T2R家族成员的经基因工程改造的形式，例如具有改变的活性的形式，以及天然发生的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。

用于抑制剂和激活物的这些测定包括，例如，在细胞或细胞膜中表达T2R家族成员，在调节例如苦味化合物的化合物存在或不存在的情况下使用假定的调节剂化合物，然后如上面所描述的，确定对苦味转导的功能效应。将包含用潜在的激活物、抑制剂或调节剂处理的T2R家族成员的样品或测定与不含抑制剂、激活物或调节剂的对照样品比较以检查调节的程度。赋予对照样品(未用调节剂处理的)100％的相对T2R活性。当相对于对照的T2R活性值是大约80％，任意地50％或25-0％时获得对T2R的抑制。当相对于对照的T2R活性值是110％，任意地150％，任意地200-500％或1000-3000％更高时，获得对T2R的激活。

术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”此处是指不含在本发明的化合物的天然状态下通常与其结合的其他的、不同的化合物的状态。优选地，“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”是指组合物包含按重量计算至少0.5％、1％、5％、10％或20％和最优选至少50％或75％的给定的样品的量。在一个优选实施方案中，这些术语是指本发明的化合物包含按重量计算至少95％的给定样品的量。如此处所用的，术语“纯化的”、“基本上纯化的”和“分离的”，当指核酸或蛋白时，也指与哺乳动物特别是人身体中天然发生的纯度或浓度不同的纯化状态或浓度。大于在哺乳动物特别是人体中天然发生的浓度的任何程度的纯度或浓度，包括(1)与其他结合的结构或化合物分离的纯化或(2)与在哺乳动物特别是人的身体中通常不与其结合的结构或化合物的结合，在“分离的”的涵义之内。可按照本领域技术人员熟知的许多方法和程序分离此处描述的核酸或蛋白或核酸或蛋白的种类或使其与在天然状况下通常不与它们结合的结构或化合物结合。

如此处所用的，术语“分离的”，当指核酸或多肽时，是指与在哺乳动物特别是人的身体内天然发生的纯度或浓度不同的纯化状态或浓度。大于体内天然发生的纯度或浓度的任何程度的纯度或浓度(包括(1)从其他天然发生的结合的结构或化合物分离的纯化，或(2)与通常在体内不与其结合的结合或化合物的结合)在此处使用的“分离的”的涵义之内。可按照本领域技术人员已知的许多方法和程序分离此处描述的核酸或多肽或使其与在天然状态下通常不与它们结合的结构或化合物结合。

如此处所用的，术语“增加”和“扩增”是指如下面详细描述的，使用任何合适的扩增方法产生或检测重组或天然表达的核酸。例如，本发明提供了用于体内或体外扩增(例如，通过聚合酶链式反应，PCR)本发明的天然表达的(例如，基因组或mRNA)或重组的(例如，cDNA)核酸(例如本发明的味觉引发化合物结合序列)的方法和试剂(例如，特定的寡核苷酸引物对)。

术语“表达载体”是指用于体外或体内，在任何细胞(包括原核细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中组成地或可诱导地表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持附加体或整合入宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有自我修复的能力或不具有该能力，即，只在细胞中驱动瞬时表达。该术语包括只包含重组核酸的转录所需要的最小元件的重组表达盒。

术语“文库”是指作为不同核酸或多肽分子的混合物的制剂，例如重组产生的感觉(特别是味觉)受体配体结合区(通过使用简并引物对扩增核酸产生的)或分离的整合扩增的配体结合区的载体的集合或各自用至少一个编码味觉受体的载体随机转染的细胞的混合物。

术语“核酸”或“核酸序列”是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语包括包含已知的天然核苷酸的类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语也包括具有合成的主链的核酸样结构。

除非另外指出，特定核酸序列也暗指包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子置换可通过产生例如其中用混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤核苷置换一个或多个选择的密码子的第三位置的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260：2605-08(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”此处可互换使用，表示氨基酸的聚合物。该术语用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物和天然发生的氨基酸聚合物以及非天然发生的氨基酸聚合物。

此处描述的“转位结构域”、“配体结合区”和嵌合受体组合物也包括具有基本上对应于示例性序列的结构和活性的“类似物”或“保守性变体”和“模拟物”(“模拟肽(peptidomimetics)”)。因此，术语“保守性变体”或“类似物”或“模拟物”是指多肽，所述多肽具有这样的经修饰的氨基酸序列以致于变化不显著地改变此处定义的多肽的(保守性变体的)结构和/或活性。这些包括氨基酸序列的保守性修饰的变化，即对于蛋白活性不是至关重要的残基的氨基酸置换、添加或缺失，或使用具有相似性质(例如，酸性、碱性、带正电荷或负电荷、极性或非极性等)的残基进行的氨基酸的置换，这样即使至关重要的氨基酸的置换也基本上不改变结构和/或活性。

更特别地，“保守性修饰的变体”用于氨基酸和核苷酸序列。对于特定的核苷酸序列，保守性修饰的变体是指编码同一的或基本上同一的氨基酸序列的序列，或其中核酸不编码氨基酸的序列，基本上同一的序列。因为遗传密码子的简并性，因此许多功能性同一的核酸编码任何给定的蛋白。

例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码确定的每一个位置上，可将密码子改变成任何所述的对应密码子而不改变编码的多肽。

这样的核酸变异是“沉默变异(silent variation)”，其是保守性修饰的变异的一种。此处编码多肽的每一个核酸序列也描述了该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可改变核酸中的各个密码子(除了AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上同一的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变异隐含在各描述的序列中。

提供功能相似的氨基酸的保守性置换表在本领域内是熟知的。例如，选择保守性置换的一个示例性方针包括(原始残基后接着示例性置换)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或hls；asp/glu；cys/ser；gin/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gin；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。备选的示例性方针使用下列6个组，各个组包含互为保守性置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苏氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(也参见，例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman和Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag(1979))。本领域技术人员将认识到上面鉴定的置换不是唯一可能的保守性置换。例如，为了一些目的，人们可将所有带电荷的氨基酸当作相互之间的保守性置换而无论它们是带正电荷还是带负电荷。此外，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的单个置换、缺失或添加也可被认为是“保守性修饰的变异”。

术语“模拟物”和“肽模拟物”是指具有基本上与多肽例如本发明的转位结构域、配体结合区或嵌合受体相同的结构和/或功能特征的合成的化合物。模拟物可以完全由氨基酸的合成的、非天然类似物组成，或可以是部分天然肽氨基酸与部分非天然的氨基酸类似物的嵌合分子。所述嵌合物也可整合任何量的天然氨基酸保守性置换，只要所述置换也不显著改变模拟物的结构和/或活性。

关于作为保守性变体的本发明的多肽，常规实验将确定模拟物是否在本发明的范围内，即，其结构和/或功能基本上不被改变。多肽模拟物组合物可包含非天然结构组分的任何组合，所述结构组分通常来自3个结构组：a)除于天然酰胺键(“肽键”)外的残基连接组；b)取代天然发生的氨基酸残基的非天然残基；或c)诱导二级结构模拟物即诱导或稳定二级结构例如β转角、γ转角、β折叠片、α螺旋形成等的残基。当所有或一些其残基通过除了天然肽键外的化学方法连接时多肽可表征为模拟物。单个肽模拟物残基可由肽键、其他化学键或偶联方法例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环已基碳二亚胺(DCC)或N，N′二异丙基碳酰亚胺(DIC)连接。可作为常规的酰胺键(“肽键”)连接的另一选择的连接基团包括例如酮亚甲基(ketomethylene)(例如，对于--C(.dbd.O)—NH--为--C(.dbd.O)-CH₂)、氨甲烯基(aminomethylene)(CH₂NH)、烯基、烯烃基(CH.dbd.CH)、醚(CH₂O)、硫醚(CH₂--S)、四唑(CN₄)、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(参见，例如，Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，267-357，Marcell Dekker，Peptide Backbone Modifications，NY(1983))。通过包含所有或一些非天然残基以取代天然发生的氨基酸残基也可将多肽表征为模拟物；在科学和专利文献中详尽地描述了非天然残基。

“标记”或“可检测的部分”是可通过分光光度法、光化学法、生物化学法或化学方法检测的组分。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子密度剂、酶(例如，如通常用于ELISA)、生物素、地高辛或半抗原和可通过例如将放射性标记整合入肽中来使其可被检测的蛋白或用于检测与肽特异性反应的抗体的蛋白。

“标记的核酸探针或寡核苷酸”是通过连接体或化学键共价地，或通过离子键、范德瓦尔斯力、静电或氢键非共价地结合标记的核酸探针或寡核苷酸，这样可通过检测结合所述探针的标记的存在来检测探针的存在。

如此处所用的，“核酸探针或寡核苷酸”定义为能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键的形成结合互补序列靶核酸的核酸。如此处所用的，探针可包含天然(即，A、G、C或T)或经修饰的碱基(7-deazaguanosine、肌苷等)。此外，可通过肽键而不是磷酸二酯键连接键探针中的碱基，只要其不干扰杂交。因此，例如，探针可以是其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键连接的肽核酸。本领域技术人员理解依赖于杂交条件的严紧度，探针可结合与该探针序列缺乏完全互补的靶序列。探针任意地可用同位素、发色团、发光团、色原体(chromogen)直接标记或用例如链霉抗生物素复合物可随后标记的生物素间接标记。通过测定探针的存在或不存在，可检测选择的序列或亚序列(subsequence)的存在或不存在。

术语“异源的”，当用于指核酸的部分时，表示核酸包含两个或更多个相互之间在天然状况下未发现处于相同亲缘关系中的序列。例如，所述核酸通常是通过重组产生的，使两个或多个来自不相关基因的序列(例如来自一种来源的启动子和来自另一种来源的编码区)排列，从而产生具有新功能的核酸。类似地，异源蛋白显示该蛋白包含两个或更多个相互之间在天然状况下未发现处于相同亲缘关系中的序列(例如，融合蛋白)。

“启动子”定义为指导核酸转录的核酸序列的排列。如此处所用的，启动子包括靠近转录起始位点的必需核酸序列，例如在聚合酶11型启动子的情况下，是TATA元件。启动子任意地也包含远侧增强子或阻抑物元件，所述元件可位于离转录起始位点多达数千碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“有效连接的”是指核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点的排列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。

如此处所用的，“重组体”是指合成的或体外操作的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)、使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统中产生基因产物的方法，或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组方法”也包括将具有来自不同来源的不同编码区或结构域或启动子的核酸连接入表达盒或载体，以表达例如可诱导地或组成地表达包含本发明的转位结构域的融合蛋白和使用本发明的引物扩增的核酸序列。

短语“对......选择性(或特异性)杂交”是指在严紧条件下使分子只对特定的核苷酸序列结合、形成双链体或杂交，当杂交时该序列以复杂混合物(例如，总细胞或文库DNA或RNA)的形式存在。

短语“严紧杂交条件”是指在探针对其靶序列(通常以核酸的复杂混合物的形式存在)杂交而不与其他序列杂交时的条件。严紧杂交条件是序列依赖性的并且在不同的环境中是不同的。更长的序列明确地在更高的温度下杂交。在Tijssen，Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridisation with Nucleic Probes，＂Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays＂(1993)中查找到对于核酸杂交的更详尽的指导方针。一般地，选择严紧条件使之比确定的离子强度、pH下的特定序列的热解链温度(Tm)低大约5至10℃。Tm是在平衡时50％的与靶互补的探针对靶序列杂交时所处的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(当靶序列过量存在时，在Tm下，50％的探针在平衡时被结合)。严紧条件是其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度低于大约1.0M钠离子，通常大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)和对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度是至少大约30℃，对于长探针(例如，超过50个核苷酸)至少大约60℃的条件。通过加入去稳定剂例如甲酰胺也可获得严紧条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的2倍，任意地是背景杂交的10倍。示例性严紧杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5xSSC和1％ SDS，在42℃下温育或5xSSC、1％ SDS，在65℃下温育，在65℃下在0.2xSSC和0.1％ SDS中洗涤。进行该杂交和洗涤步骤，进行例如1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。

如果它们编码的多肽是显著相关的，在严紧条件下相互之间不杂交的核酸仍然是显著相关的。这可在例如使用遗传密码子允许的最大密码子简并性产生核酸的拷贝时发生。在该情况下核酸通常在中等严紧杂交条件下杂交。示例性“中等严紧杂交条件”包括在37℃下在40％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS的缓冲液中的杂交和在45℃下在1xSSC中的洗涤。可将该杂交和洗涤步骤进行1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。阳性杂交是背景的至少2倍。本领域技术人员将容易地认识到可选择的杂交和洗涤条件可用于提供相似的严紧条件。

“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的构架区或其片段、特异性结合和识别抗原的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因和无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，这反过来分别定义了免疫球蛋白的种类，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示例性免疫球蛋白(抗体)结构单位由四聚体组成。各个四聚体由两个相同的多肽链对组成，各多肽链对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重”链(大约50-70kDa)。各链的N末端界定了大约100至110或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些重链和重链。

“嵌合抗体”是这样的抗体分子，即在该分子中：(a)恒定区或其部分被改变、取代或交换以使抗原结合位点(可变区)连接至不同的或改变的种类、效应子功能和/或物种的恒定区，或连接至给嵌合抗体赋予新的性质的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被改变、取代或与具有不同或改变的抗原特异性的可变区交换。

“抗-T2R”抗体是特异性结合由T2R基因、cDNA或其亚序列编码的多肽的抗体或抗体片段。

术语“免疫测定法”是使用特异性结合抗原的抗体的测定法。免疫测定法的特征在于使用特定抗体的特异性结合性质分离、靶向和/或定量抗原。

短语对抗体的“特异发(或选择性)结合”或“与......特异性(或选择性)免疫反应”，当指蛋白或肽时，是指确定蛋白在异源蛋白群体和其他生物中存在的结合反应。因此，在已设计的免疫测定条件下，指定的抗体对特定蛋白的结合高于背景至少2倍并且基本上不以显著的量结合存在于样品中的其他蛋白。在这样的条件下对抗体的特异性结合可能需要就其对于特定蛋白的特异性选择的抗体。

例如，可选择针对来自特定物种例如大鼠、小鼠或人的T2R家族的成员产生的多克隆抗体以只获得这样的多克隆抗体，所述多克隆抗体与T2多肽或其免疫原性部分发生特异性免疫反应而不与其他蛋白(除了T2R多肽的直系同源物或多态性变体和等位基因以外)发生特异性免疫反应。可通过扣除与来自其他物种的T2R分子或其他T2R分子交叉反应的抗体来实现该选择。也可选择只识别T2R GPCR家族成员而非来自其他家族的GPCR的抗体。可使用许多免疫测定形式来选择与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法常规地用于选择与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，(1988)，关于可用于确定特定的免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。通常特异性或选择性反应至少为背景信号或噪声的两倍，更常见地超过10至100倍的背景。

短语“与......选择性结合”是指核酸与另一种核酸进行如上定义的“选择性杂交”的能力，或抗体对蛋白进行如上定义的“选择性(或特异性)”结合的能力。

术语“表达载体”是指用于在体外或体内、在任何细胞(包括原核细胞、酵母细胞、真菌、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中组成型或诱导型地表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统，该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持附加型或整合入宿主细胞基因组的表达系统。表达系统可具有自我复制的能力或不具有自我复制的能力，即，只在细胞中驱动瞬时表达。该术语包括只包含重组核酸转录所需要的是最小元件的重组表达盒。

“宿主细胞”是指包含表达载体并且支持所述表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞例如酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞例如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培养细胞、外植体和体内细胞。

基于上述内容，本发明提供了用于鉴定化合物的测定法，所述化合物调节(优选阻断)苦味化合物(例如咖啡和其他食物或饮料中发现的绿原酸内酯和结构相产性化合物)对之前鉴定的人苦味受体的特异性激活。特别地，本发明提供了用于鉴定化合物的基于细胞的测定法，所述化合物调节咖啡中发现的化合物即绿原酸内酯例如图1中包括的绿原酸内酯对特定的人T2R的激活。特别地，本发明包括发现：hT2R8、hT2R14或hT2R54被绿原酸内酯3CoQAL或结构相关性化合物激活；hT2R8、hT2R14或hT2R54被绿原酸内酯3CQAL和4FQAL或结构相关性化合物激活；或hT2R8和hT2R54被绿原酸内酯4FQAL或结构相关性化合物激活。如所指出的，图1中包含这些指定的绿原酸内酯和其他化合物的结构。预期使用本发明的测定法鉴定的化合物可调节与人受试者中的此类苦味受体相关的苦味。这将在味觉试验中得到验证。

使用其他出版物和由本人Assignee提交的专利申请例如美国系列No.10/191,058和09/825,882(两者在此以其全文引用作为参考)中报导的HEK293表达系统和钙成像方法确定上述味觉受体对苦味配体(即咖啡中发现的绿原酸内酯例如3CQAL、4CQAL、3CoQAL和4FQAL)发生特异性反应。更特别地，本发明者用特定的hT2R和嵌合G蛋白(G16gust44)(其包含通过用味导素的羧基-44氨基酸残基取代G_α 16G蛋白的羧基-44氨基酸残基修饰的G_α 16G蛋白)一起转染HEK293细胞，然后通过钙成像方法记录这些细胞对特定苦味配体的反应。

如图2中所显示的，发现hT2R8、hT2R14和hT2R54以剂量依赖性的方式对不同浓度的3CoQAL发生反应。相反地，这些细胞不对相同浓度的蔗糖发生反应。因此，这些细胞或功能性表达此类受体的其他细胞可在测定中用于鉴定化合物(所述化合物调节苦味化合物即绿原酸内酯对此类受体的激活)例如阻断此类受体的3CoQAL活的化合物。

此外，如图3中所示，也观察到表达hT2R8、hT2R14或hT2R54的HEK-293细胞对2mM浓度的绿原酸内酯3CQAL和4CQAL发生特异性反应。相反地，这些细胞对蔗糖(对照)不发生反应。

此外，如图4中所示，使用这些相同的钙成像方法观察到表达hT2R8或hT2R54的HEK-293细胞以剂量信赖性的方式对绿原酸内酯4FQAL发生特异性反应。相比之下，这些细胞对蔗糖不发生反应。

这些结果表明功能性表达hT2R8、hT2R14和hT2R54味觉受体中的任一种的细胞可在测定中用于鉴定配体，所述配体调节与苦味相关的hT2R8、hT2R14或hT2R54，所述苦味由例如咖啡饮料和其他包含绿原酸内酯的苦味食物、饮料或药物中发现的绿原酸内酯或结构相关性化合物引起。

优选地，这些测定法使用表达编码具有下文中鉴定的一个氨基酸序列的hT2R的DNA的受试细胞。然而，预期此类受体多肽的保留这些苦味受体的功能特征(即对一些苦味化合物起反应)的片段、直系同源物、变体或嵌合物也可用于这些测定法。此类变体的实例包括剪接变体、单核苷酸多态性、等位基因变体和由重组或化学方法产生的或天然发生的突变。下面显示用于分离和表达T2R的方法，所述T2R用于本发明的测定法和涉及在本发明用于鉴定抑制此类受体的激活的化合物的测定法。

T2R的分离和表达

可通过良好建立的克隆方法，使用基于本申请中公开的T2R核酸序列构建的探针或引物进行本发明的T2R或其片段或变体的分离和表达。也可使用此处公开的序列和已知的基于计算机的搜寻技术例如BLAST序列搜寻从人或其他物种的基因组数据库中鉴定相关的T2R序列。在特定的实施方案中，可将此处公开的假基因用于鉴定功能等位基因或相关的基因。

然后可将表达载体用于感染或转染宿主细胞以功能性表达这些序列。可在体外或体内产生和表达这些基因和载体。本领域技术人员将认识到可通过在本发明的载体内调节基因和核酸(例如，启动子、增强子等)的表达或活性获得改变和控制核酸表达的希望的表型。可使用任何描述用于增加或减少表达或活性的已知方法。可结合科学和专利文献中详尽描述的本领域内已知的任何方法或方案实施本发明。

备选地，可通过熟知的化学合成技术例如Carruthers，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-18(1982)；Adams，Am.Chem.Soc，105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，Free Radic.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；美国专利4,458,066中描述的技术体外合成这些核酸。然后通过合成互补链，在合适的条件下将链退火在一起，或通过使用DNA聚合酶和合适的引物序列加入互补链来获得双链DNA片段。

用于核酸操作例如用于在序列中产生突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交等的技术详细地描述于科学和专利文献中。参见，例如，Sambrook，编著，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nded.)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Ausubel，编著，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；Tijssen，编著，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology：Hybridization With NucleicAcid Probes，第I部分，Theory and Nucleic Acid Preparation，Elsevier，N.Y.(1993)。

可通过许多本领域技术人员熟知的常用方法中的任一种方法分析和定量核酸、载体、衣壳(capsid)、多肽等。这些方法包括例如分析生物化学方法例如NMR、分光光度法、放射照相术(radiography)、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)和高融合层析(hyperdiffusion chromatography)、各种免疫学方法，例如，流体或凝胶沉淀素反应(fluid or gel precipitin reaction)、免疫扩散、免疫电泳法、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、Southern分析、Northern分析、斑点印迹分析(dot-blot analysis)、凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信号扩增方法、放射性标记、闪烁计数和亲和层析。

可使用寡核苷酸引物扩增编码T2R配体结合区的核酸。也可使用扩增技术克隆或定量测定此处描述的核酸。扩增方法在本领域内是熟知的，其包括例如聚合酶链式反应(PCR)(Innis编著，PCR Protocols，a Guide to Methods and Applicati ons，Academic Press，N.Y.(1990)；Innis编著，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995))；连接酶链式反应(LCR)(Wu，Genomics，4：560(1989)；Landegren，Science，241：1077(1988)；Barringer，Gene，89：117(1990))；转录扩增(Kwoh，PNAS，86：1173(1989))；自主序列复制(Guatelli，PNAS，87：1874(1990))；Q β复制酶扩增(Smith，J.Clin.Microbiol.，35：1477-91(1997))；自动化Q β复制酶扩增测定(Burg，Mol.Cell.Probes，10：257-71(1996))；和其他RNA酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)。也参见，Berger，Methods Enzymol，152：307-16(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology，13：563-64(1995)。

扩增后，如果想要，可按照本领域内已知的方法使用常规的分子生物学方法将核酸单个地或以文库的方式克隆入许多种载体中的任一种载体；用于克隆体外扩增的核酸的方法描述于例如美国专利5,426,039。为了帮助克隆扩增的序列，可将限制性内切酶位点“克隆入”PCR引物对。例如，将Pst I和Bsp E1位点设计在本发明的示例性引物对中。这些特定的限制性位点具有这样的序列，当所述序列被连接时，其相对于它们被剪接入的7-膜受体“供体”编码序列是“符合读框的”(配体结合区编码序列内化入7-膜多肽内，因而，如果希望构建体在限制性内切酶剪接位点的下游被翻译，应当避免不符合读框的结果，如果插入的配体结合区包含绝大部分跨膜VII区，这可以不是必需的)。可设计引物以保留“供体”7-膜受体的原始序列。备选地，引物可编码作为保守性置换(例如，对于疏水残基使用疏水残基，参见上面的讨论)或功能上有利的置换(例如，不阻止质膜插入，通过肽酶产生切割，导致受体的异常折叠等)的氨基酸残基。

可设计引物对以使之选择性扩增T2R蛋白的配体结合区。这些结合区对于不同的配体可发生变化；从而，对于一种配体可以是最小结合区的区域对于第二潜在配体太小而不能成为结合区。因此，可扩增包含不同结构域结构的不同大小的结合区；例如，7-跨膜T2R的跨膜(TM)结构域II至VII、III至VII、III至VI或II至VI或其变体(例如，只是特定结构域的亚序列，混合结构域的顺序，等)。

由于许多7-膜T2R蛋白的结构域结构和序列是已知的，因此本领域技术人员可容易地选择侧连接结构域的序列和结构域内部序列作为模型序列以设计简并扩增引物对。例如，可通过PCR扩增，使用引物对产生编码结构域II至VII的核酸序列。为了扩增包含跨膜结构域I(TMI)序列的核酸，可根据编码上述T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸设计简并引物。该简并引物可用于产生包含TM I至TM III、TM I至TM IV、TM I至TM V、TM I至TM VI或TM I至TM VII的结合区。可基于此处提供的其他T2R家族共有序列设计其他简并引物。这样的简并引物可用于产生包含TM III至TM IV、TM III至TM V、TM III至TM VI或TM III至TM VII的结合区。

设计简并引物对的范例在本领域内是熟知的。例如，COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide引物(CODEHOP)策略计算机程序可从http://blocks.fhcrc.org/codehop.html获得，其与用于始于成组相关蛋白序列如已知的味觉受体配体结合区的杂交引物的预测的BlockMaker多序列比对位点直接链接(参见，例如，Rose，Nucleic Acids Res.，26：1628-35(1998)；Singh，Biotechniques，24：318-19(1998))。

合成寡核苷酸引物对的方法在本领域内是熟知的。可使用“天然”碱基对或合成的碱基对。例如，人造核碱基的使用为操作引物序列和产生更复杂的扩增产物的混合物提供了通用方法。人造核碱基的不同家族能够通过内部键的旋转采取多种氢键取向，从而提供简并分子识别的方法。这些类似物至PCR引物的单个位置中的整合允许产生复杂的扩增产物文库。参见，例如，Hoops，Nucleic Acids Res.，25：4866-71(1997)。也可将非极性分子用于模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键结合形状模拟物可有效地复制并且选择性针对胸腺嘧啶的非极性形状模拟物(参见，例如，Morales，Nat.Struct.Biol.，5：950-54(1998))。例如，两种简并碱基可以是嘧啶碱基6H，8H-3，4-二羟基嘧啶[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(参见，例如，Hill，PNAS，95：4258-63(1998))。本发明的示例性简并引物包含核碱基类似物5′-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2′-脱氧-胞嘧啶，3’-[(2-氰乙基)--(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(序列中的“P”项，参见上面)。该嘧啶类似物与嘌呤(包括A和G残基)形成氢键。

可使用上述的核酸探针分离多态性变体、等位基因和基本上与此处公开的味觉受体同一的种间同源物。备选地，通过使用针对T2R多肽产生的抗血清或纯化的抗体(所述血清或抗体也识别和选择性结合T2R同源物)对表达的同源物进行免疫学检测，可使用表达文库克隆T2R多肽和其多态性变体、等位基因和种间同源物。

可通过使用合适的(完全互补的或简并)引物对扩增(例如，PCR)合适的核酸序列来产生编码味觉受体的配体结合区的核酸。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或来源于表达味觉受体的细胞的mRNA或cDNA。

在一个实施方案中，可构建包含融合至转位序列的编码T2R的核酸的编码杂交蛋白的序列。也提供了包含思位基元和其他家族的化学感觉受体特别是味觉受体的味觉引发化合物结合区的杂交T2R。这些核酸序列可有效连接至转录或翻译控制元件，例如，转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷化序列和用于将DNA转录成RNA的其他序列。在重组表达盒、载体和转基因的构建中，可将启动子片段用于指导希望的核酸在所有希望的细胞或组织中表达。

在另一个实施方案中，融合蛋白可包含C末端或N末端转位序列。此外，融合蛋白可包含额外的元件，例如用于蛋白质检测、纯化或其他用途的元件。有助于检测和纯化的结构域包括，例如，金属螯合肽例如多组氨酸束(polyhistidine tract)、组氨酸-色氨酸组件(module)或允许在固定的金属上进行纯化的其他结构域；允许在固定的免疫于蛋白上纯化的A蛋白结构域；或用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(Immunex Corp，Seattle Wash.)。

在转位结构域(为了有效的质膜表达)和余下的新翻译的多肽之间包含可切割的连接体序列例如因子Xa(参见例如，Ottavi，Biochimie，80：289-93(1998))、枯草杆菌蛋白酶识别基元(参见，例如，Polyak，Protein Eng.，10：615-19(1997))；肠激酶(Invitrogen，San Diego，Calif.)等可用于帮助纯化。例如，一个构建体可包含编码连接至六组氨酸残基，接着连接硫氧还蛋白(肠激酶切割位点)(参见，例如，Williams，Biochemistry，34：1787-97(1995))和C末端转位结构域的多肽的核酸序列。组氨酸残基帮助检测和纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白的剩余部分纯化希望的蛋白的方法。在科学和专利文献(参见，例如，Kroll，DNA Cell.Biol.，12：441-53(1993))中详细地描述了关于编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用的技术。

可将作为单个表达载体或作为表达载体文库的表达载体(所述表达载体包含编码配体结合区的序列)导入基因组或细胞的细胞质或细胞核中，然后使用科学和专利文献中详细描述的多种常规技术进行表达。参见，例如，Roberts，Nature，328：731(1987)；Berger同上，Schneider，Protein Expr.Purif.，6435：10(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。来自生物试剂和实验设备厂商的产品信息也提供了关于已知的生物学方法的信息。可从天然来源分离，从这样的来源如ATCC或GenBank文库获得所述载体，或通过合成或重组方法制备所述载体。

可在细胞中稳定或瞬时表达(例如，附加型表达系统)的表达盒、载体或病毒中表达核酸。可将选择标记整合入表达盒和载体中，从而为转化细胞和序列赋予可选择的表型。例如，选择标记可编码附加型维持和复制，从而使得不必进行至宿主基因组中的整合。例如，标记可编码抗生素抗性(例如，氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如，氯磺隆或Basta)以允许选择用希望的DNA序列转化的细胞(参见，例如，Blondelet-Rouault，Gene，190：315-17(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.，281：992-97(1997))。因为赋予对底物如新霉素或潮霉素的抗性的选择标记基因只可用于组织培养，所以也将化学抵抗性(chemoresistance)基因用作体外和体内的选择标记。

因为7-膜受体多肽具有相似的一级序列和二级和三级结构，所以嵌合核酸序列可编码任何7-膜多肽内的T2R配体结合区，可通过序列分析容易地鉴定结构结构域(例如，细胞外结构域、TM结构域、胞浆区等)。例如，同源性建模，傅里叶分析和螺旋周期性检测可鉴定和表征具有7-膜受体序列的7个结构域。快速傅里叶变换(Fast FourierTransform)(FFT)算法可用于估量表征被分析的序列的疏水性和可变性特征的主周期(dominant period)。可按照例如Donnelly，ProteinSci，2：55-70(1993)估量周期检测增强和α螺旋周期指数。其他比对和建模算法在本领域内是熟知的(参见，例如，Peitsch，ReceptorsChannels，4：161-64(1996)；Kyte & Doolittle，J.Md.Biol.，157：105-32(1982)；和Cronet，Protein Eng.，6：59-64(1993)。

同样，本发明不仅包括具有特定核酸和氨基酸序列的核酸分子和多肽，而且还包括其片段，特别是例如40、60、80、100、150、200或250或更多个核苷酸的片段，或和例如10、20、30、50、70、100或150或更多个氨基酸的多肽片段。任意地，核酸片段可编码能够结合针对T2R家族成员产生的抗体的抗原性多肽。此外，本发明的蛋白片段可任意地是能够结合针对T2R家族成员产生的抗体的抗原性片段。

也涉及嵌合蛋白，其包含至少一种偶联至代表另一种GPCR(优选7跨膜超家族的成员)的全部或部分的额外氨基酸的此处描述的T2R多肽的至少10、20、30、50、70、100或150或更多个氨基酸。可从本受体和另一种GPCR制备这些嵌合物，或可组合两种或更多种本受体来制备它们。在一个实施方案中，嵌合物的一个部分对应于，或来源于本发明的T2R多肽的跨膜结构域。在另一个实施方案中，嵌合物的一个部分对应于，或来源于此处描述的T2R多肽的一个或多个跨膜区，其余部分可来自另一种GPCR。嵌合受体在本领域内是熟知，用于产生它们以及选择和界定G蛋白偶联受体的结构域或片段以将其整合入其中的技术也是熟知的。因此，本领域技术人员的该知识可容易地用于此类嵌合抗体。此类嵌合受体的用途可提供例如此处明确公开的受体中的一种的味觉选择性特征，所述味觉选择性特征与另一种受体(例如用于现有技术测定系统的熟知的受体)的信号转导特征偶联。

例如，可常规地将区域例如配体结合区、细胞外结构域、跨膜结构域、胞浆区、N末端结构域、C末端结构或其任何组合连接至异源蛋白。例如，可将T2R跨膜区连接至异源GPCR跨膜结构域，或可将异源GPCR细胞外结构域连接至T2R跨膜区。选择的其他异源蛋白可包括例如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶多肽、谷氨酸受体和视紫红质多肽，例如视紫红质(例如牛视紫红质)的N末端片段。

使用不同的用于表达本发明的T2R、其片段或变体的细胞也在本发明的范围之内。为获得克隆的基因或核酸例如编码本发明的T2R、其片段或变体的cDNA的高表达水平，本领域技术人员通常将目的核酸序列亚克隆入表达载体，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和如果对于编码蛋白的核酸还有用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子在本领域内是熟知的并且描述于例如Sambrook等人中。优选地，使用真核表达系统表达受试者hT2R受体。

可使用任何熟知的用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞的方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺法(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和任何其他熟知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遗传物质导入宿主细胞的方法(参见，例如，Sambrook等人)。使用的特定基因工程方法能够成功地将至少一种核酸分子导入能够表达本发明的T2R、片段或变体的宿主细胞是必要的。

在将表达载体导入细胞后，在有利于本发明的受体、片段或变体表达的条件下培养转染的细胞，然后使用标准技术从培养物中回收所述细胞。该技术的实例在本领域内是熟知的。参见，例如，WO00/06593，其以与本公开内容一致的方式引用作为参考。

用于检测调节本发明的T2R的活性的化合物的测定法

下面描述用于确定受试化合物是否在体外和体内特异性结合本发明的T2R多肽的方法和组合物。可监测细胞生理学的许多方面以评估对天然发生或嵌合的T2R的配体结合的效应。可在完整的表达T2R多肽的细胞上、在经透化的细胞上或在由标准方法产生的膜部分上进行这些测定法。

味觉受体结合味觉引发化合物，然后起始化学刺激至电信号的转导。激活的或被抑制的G蛋白反过来将改变靶酶、通道和其他效应器蛋白的性质。一些实例是视觉系统中转导素对cGMP磷酸二酯酶的激活、激活型G蛋白对腺苷酸环化酶的激活、Gq和其他同源G蛋白对磷脂酶C的激活和Gi和其他G蛋白对不同通道的调节。也可检查下游结果例如由磷脂酶C导致的二酰甘油和IP3的产生和由此IP3对钙的动员。

测定的受试hT2R8、hT2R14和hT2R54蛋白或多肽通常选自具有SEQ ID NO：3、5和7中包含的序列的多肽或其片段或保守性修饰的变体。

备选地，测定的T2R蛋白或多肽可来源于真核宿主细胞，其可包含具有与SEQ ID NOS.：2、4或7同一的氨基酸序列的氨基酸序列或其经保守性修饰的变体。通常，氨基酸序列同一性至少为30％，优选30-40％，更优选50-60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。任意地，测定的T2R蛋白或多肽可包含T2R多肽的区域，例如细胞外结构域、跨膜区、胞浆区、配体结合结构域等。任意地，可将T2R多肽或其部分共价连接至异源蛋白以产生用于此处描述的测定法的嵌合蛋白。

可使用上述的T2R蛋白或多肽(重组的或天然发生的)检验T2R活性的调节剂。可分离重组的或天然发生的T2R蛋白或多肽，在细胞中表达其，在来源于细胞的膜中表达其，在组织或动物中表达其。例如，可使用舌的切片、来自舌的分离的细胞、转化细胞或膜。可使用此处描述的体外或体内测定法中的一种检验调节作用。

调节剂的检测

下面描述用于确定受试化合物是否在体外和体内特异性结合本发明的T2R多肽的组合物和方法。可监测细胞生理学的许多方面以评估对本发明的T2R多肽的配体结合的效应。可在表达化学感觉受体的完整细胞上、在经透化的细胞上或在由标准方法产生的膜部分上或体外使用从新合成的蛋白进行这些测定法。

在体内，味觉受体结合味觉调节化合物，然后起始化学刺激至电信号的转导。激活的或被抑制的G蛋白反过来将改变靶酶、通道和其他效应器蛋白的性质。一些实例是在视觉系统中转导素对cGMP磷酸二酯酶的激活、激活型G蛋白对腺苷酸环化酶的激活、Gq和其他同源G蛋白对磷脂酶C的激活和Gi和其他G蛋白对各种通道的调节。也可检查下游结果例如由磷脂酶C导致的二酰甘油和IP3的产生和由此IP3对钙的动员。

备选地，测定的T2R蛋白或多肽可来源于真核宿主细胞，其可包含具有与此处公开的T2R多肽同一的氨基酸序列的氨基酸序列或其片段或经保守性修饰的变体。通常，氨基酸序列同一性至少为35％-50％，或任意地为75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。任意地，测定的T2R蛋白或多肽可包含T2R蛋白的结构域，例如细胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞浆区、配体结合结构域等。此外，如上所述，可将T2R多肽或其结构域共价连接至异源蛋白以产生用于此处描述的测定法的嵌合蛋白。

如上所述，使用重组或天然发生的T2R蛋白或多肽检验T2R受体活性的调节剂。可分离重组的或天然发生的T2R蛋白或多肽，在细胞中表达其、在来源于细胞的膜中表达其，在组织或动物中表达其。例如，可使用舌的切片、来自舌的分离的细胞、转化细胞或膜。可使用此处描述的体外或体内测定法中的一种检验调节作用。

1.体外结合测定

也可在体外用溶性状态或固体状态的反应，使用本发明的T2R多肽来检查味觉转导。在特定的实施方案中，可在体外在溶性状态或固体状态的反应中使用T2R配体结合结构域测定配体结合。

可能可用N末端结构域与细胞外结构域的额外部分例如跨膜结构域的细胞外环一起形成配体结合结构域。

已对其他GPCR例如亲代谢性谷氨酸盐受体(参见，例如，Han和Hampson，J.Biol.Chem.274：10008-10013(1999))使用体外结合测定。这些测定可包括置换放射性标记或荧光标记的配体，测量内荧光的改变或蛋白水解易感性的改变等。

可在溶液中、在任意地附着至固相的双层膜中、在脂质单层中或在媒介物中检验对本发明的T2R多肽的配体结合。可使用，例如光谱特征(例如，荧光、吸光度、折光指数)、流体动力学(例如，形状)、色谱或稳定性特征的变化来检验调节的结合。

在本发明的优选实施方案中，使用^[35S]GTPγS结合测定法。如上所述，在GPCR激活后，G蛋白复合物的G_α亚基经激发将结合的GDP与GTP交换。可在生物化学测定法中，在假定的配体存在的情况下通过测量加入的放射性标记的^[35S]GTP γ S对G蛋白的结合来测量配体介导的G蛋白交换活性的刺激。通常，将包含目的化学感觉受体的膜与G蛋白混合。向测定物中加入潜在的抑制剂和/或激活物以及^[35S]GTP γS，测量^[35S]GTP γ S对G蛋白的结合。可通过液体闪烁计数或通过本领域内已知的任何其他方法包括闪烁迫近分析法(SPA)测量结合。在其他测定形式中，可使用荧光标记的GTP γ S。

2.荧光偏振测定法

在另一个实施方案中，可使用基于荧光偏振(“FP”)的测定法检测和监测配体的结合。荧光偏振是用于测量平衡结合、核酸杂交和酶活性的通用实验室技术。荧光偏振测定是均质性的，因为它们不需要分离步骤例如离心、过滤、层析、沉淀或电泳。这些测定法可在溶液中实时进行而不需要固定相。因为测量偏振非常快速并且不破坏样品，从而可重复地和在加入试剂后测量偏振值。通常，该技术可用于测量从较低的皮摩尔至微摩尔水平的荧光基团的偏振值。本部分描述了可以简单和定量的方法将荧光偏振用于测量配体对本发明的T2R多肽的结合的方法。

当用平面偏振光激发荧光标记的分子时，其发射具有与其分子旋转成反比的偏振度数的光。大的荧光标记的分子在激发状态下保持相对稳定(在萤光素的情况4纳秒)并且光的偏振在激发和发射之间保持相对恒定。小的荧光标记的分子在激发状态下快速旋转，偏振在激发和发射之间显著变化。因此，小分子具有较低的偏振值而大分子具有较高的偏振值。例如，单链萤光素标记的寡核苷酸具有相对较低的偏振值但当其与互补链杂交时，其具有更高的偏振值。当使用FP检测和监测味觉引发化合物结合(所述结合可激活或抑制本发明的化学感觉受体)时，可使用荧光标记的味觉引发化合物或自发荧光味觉引发化合物。

荧光偏振(P)定义为：

$P=\frac{[{\mathrm{Int}}_{\mathrm{par}}-{\mathrm{Int}}_{\mathrm{perp}}]}{[{\mathrm{Int}}_{\mathrm{par}}+{\mathrm{Int}}_{\mathrm{perp}}]}$

其中，Int_par是与激发光平面平行的发射光的强度，Int_perp是与激发光平面垂直的发射光的强度。P，光强度的比率，是无因次数。例如，Beacon^TM和Beacon 2000^TM。可将系统与这些测定结合使用。此类系统通常以毫偏振单位(1偏振单位＝1000mP单位)表示偏振。

用Perrin公式描述分子旋转和大小之间的关系，读数参考引用作为参考的Jolley，M.E.(1991)in Journal of AnalyticalToxicology，pp.236-240，所述文献给出了该公式的详尽解释。简而言之，Summarily，the Perrin公式说明偏振与旋转张弛时间(使分子旋转通过大约68.5°所花的时间)成正比。旋转松弛时间通过下列公式与粘度(eta.)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)产生相系：2(旋转松弛时间)＝3V RT

旋转松弛时间对于小分子(例如，萤光素)较短(约等于纳秒)，对于大分子较长(约等于100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，那么偏振与分子体积成正相关。分子体积的改变可归因于与其他分子的相互作用、分离、偏振、降解、杂交、或荧光标记的分子的构象变化相关。例如，已将荧光偏振用于测量蛋白酶、DNA酶和RNA酶对萤光素标记的聚合物的酶促切割。其也用于测量蛋白/蛋白相互作用、抗体/抗原结合和蛋白/DNA结合的平衡结合。

A.固体状态和溶性状态的高通量测定法

在另一个实施方案中，本发明提供了使用T2R多肽或表达T2R多肽的细胞或组织的溶性状态测定法。在另一个实施方案中，本发明提供了高通量形式的基于固相的体外测定法，其中将T2R多肽或表达T2R多肽的细胞或组织附着至固相基质或味觉刺激化合物并与T2R受体接触，然后使用合适的标记或针对T2R受体产生的抗体检测结合。

在本发明的高通量测定法中，可能在一天内筛选出高达数千种不同的调节剂或配体。特别地，可使用微量滴定板的各孔进行针对选择的潜在的调节剂的分离测定，或，如果要观察温度或温育时间效应，可在每5至10个孔中试验单种调节剂。因此，单个标准微量滴定板可测定大约100(例如，96)种调节剂。如果使用1536孔板，那么可在单个板中容易地测定大约1000至大约1500种不同的化合物。也可能在单个板孔中测定多种化合物。可能每天测定几块不同的板；使用本发明的整合的系统可能测定筛选多达大约6,000-20,000种不同的化合物。最近，已发展了用于试剂操作的微流方法。

可直接或间接，通过共价或非共价键例如通过标签(tag)将目的分子结合至固体状态的组分。所述标签可以是多种组分中的任一种。通常，将结合标签的分子(标签粘合剂)固定至支持物，将被标记的目的分子(例如，目的味觉转导分子)通过标签与标签粘合剂的相互作用附着至固体支持物。

基于文献中详细描述的已知的分子相互作用，可使用许多标签和标签粘合剂。例如，当标签具有天然粘合剂例如生物素、A蛋白或G蛋白时，可将其与合适的标签粘合剂(抗生物素蛋白、链霉抗生物素、neutravidin、免疫球蛋白的Fc区等)一起使用。抗具有天然粘合剂的分子例如生物素的抗体和合适的标签粘合剂也是可广泛商购获得的(参见，SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA，St.LouisMo.)。

类似地，可将任何半抗原或抗原性化合物与合适的抗体一起使用，从而形成标签/标签粘合剂对。数千种特定的抗体可商购获得，许多额外的抗体描述于文献中。例如，在一个通用构型中，标签是第一抗体而标签粘合剂是识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用之外，受体-配体相互作用也适合作为标签和标签-粘合剂对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体相互作用例如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整联蛋白家族、选择家族等；参见，例如，Pigott & Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。类似地，毒素和毒液(venom)、病毒表位、激素(例如，阿片制剂(o piate)、类固醇等)、细胞内受体(例如，介导各种小配体(包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D)的效应的细胞内受体；肽)、药物、外源凝集素、糖、核酸(线性的和环形的聚合物构型)、寡糖、蛋白、磷脂和抗体全部都可与各种细胞受体结合。

合成的聚合物，例如聚氨基甲酸乙酯、聚脂、聚碳酸酯、聚脲(polyurea)、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙烯(polyacetate)也可形成合适的标签或标签粘合剂。许多其他标签/标签粘合剂对也用于此处描述的测定系统，在回顾本公开内容后，这对于本领域技术人员来说是显然的。

通用连接体例如肽、聚酯等也可用作标签，其包括多肽序列，例如大约5至200个氨基酸的聚甘氨酸序列。这样的柔韧的连接体对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可从Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Ala商购获得聚(乙二醇)连接体。此类连接体任意地具有酰胺键、巯基键(sulfhydryl linkage)或杂功能键(heterofunctional linkage)。

使用目前可获得的多处方法中的任一种方法将标签粘合剂固定至固体基质。通常可通过将基质的全部或部分暴露于化学试剂中来衍生或功能化固体基质，所述化学试剂将化学基团固定至与标签粘合剂的部分反应的表面。例如，适合附着至更长链部分的基团包括胺基、羟基、巯基和羧基。氨基烷基甲硅烷(Aminoalkylsilane)和羟醛赖氨酸(hydroxyalkylsilane)可用于功能化各种表面例如玻璃表面。这样的固相生物聚合物阵列的构建详细地描述于文献中。参见，例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc，85：2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.，102：259-274(1987)(描述针上的固相组分的合成)；Frank & Doring，Tetrahedron，44：60316040(1988)(描述纤维素盘上的各种肽序列的合成)；Fodor等人，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等人，ClinicalChemistry，39(4)：718-719(1993)；和Kozal等人，Nature Medicine，2(7)：753759(1996)(全都描述固定至固体基质的生物聚合物的排列)。用于将标签粘合剂固定至底物的非化学方法包括其他通用方法，例如加热、使用UV照射的交联法等。

3.基于细胞的测定法

在一个优选实施方案中，T2R蛋白以未经修饰的形式或作为嵌合物、变体或截断的受体形式在真核细胞中表达，其具有或优选不具有帮助其成熟和通过分泌途径靶向的异源伴侣序列。这样的T2R多肽可以在任何真核细胞例如HEK-293细胞中表达。优选地，所述细胞包含功能性G蛋白，例如G._α 15或嵌合G._α 16、味导素或转导蛋白或嵌合G蛋白例如G16gust44或G_α 16trans44嵌合物，所述蛋白能够将嵌合物受体偶联至细胞内信号转导途径或偶联至信号转导蛋白例如磷脂酶C。可使用任何标准方法，例如通过检测细胞中FURA-2依赖性荧光来检测细胞内钙的变化来检测此类细胞中T2R受体的激活。这样的测定是本申请中展示的实验发现的基础。

激活的GPCR受体通常是磷酸化该受体的C末端尾部(和可能其他位点)的激酶的底物。因此，激活物将提高³²P从放射性标记的ATP至受体的转移，这可用闪烁计数来测定。C末端尾部的磷酸化将促进抑制蛋白样蛋白的结合以及将干扰G蛋白的结合。关于GPCR信号转导和测定信号转导的方法的一般综述，参见，例如，Methods inEnzymology，第237和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等人，Nature，10：349：117-27(1991)；Bourne等人，Nature，348：125-32(1990)；Pitcher等人，Annu.Rev.Biochem.，67：653-92(1998)。

可通过将用假定的T2R调节剂处理的T2R多肽的反应与未处理的对照样品或包含已知的“阳性”对照的样品的反应进行比较来测定T2R调节作用。该假定的T2R调节剂可包括抑制或激活T2R多肽活性的分子。在一个实施方案中，给用激活T2R的化合物处理的对照样品赋予100的相对T2R活性值。当相对于对照样品的T2R活性值是大约90％，任意地50％，任意地25-0％时获得对T2R多肽的抑制。当相对于对照样品的T2R活性值是大约110％，任意地150％，200-500％或1000-2000％时，获得对T2R多肽的激活。

可通过确定表达T2R多肽的细胞或膜的离子极化(即，电势)的变化来估量离子流的变化。确定细胞极化的变化的一个方法是通过用电位钳和膜片钳技术(参见，例如，“细胞附着的(cell-attached)”模型、“内-外(inside-out)”模型和“完整细胞”模型，例如，Ackerman等人，New Engl.J Med.，336：1575-1595(1997))测量电流的变化(从而测量极化的变化)。使用标准技术常规地确定完整细胞的电流。其他已知的测定法包括：放射性标记的离子流测定法和使用电压敏感染料的荧光测定法(参见，例如，Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.，88：67-75(1988)；Gonzales & Tsien，Chem.Biol.，4：269-277(1997)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等人，J.Membrane Biology，137：59-70(1994))。

可通过检查上述的任何参数来测量受试化合物对多肽功能的影响。影响GPCR活性的任何合适的生理改变可用于估量受试化合物对本发明的多肽的影响。当使用完整细胞或动物确定功能性效果时，也可测量各种效应例如递质释放、激素释放、对已知的和未表征的遗传标记的转录的改变(例如，northern印迹)、细胞代谢的变化例如细胞生长或pH的变化和细胞内第二信使例如Ca.sup.2+、IP3、cGMP或cAMP的变化。

用于GPCR的优选测定法包括装载离子或电压敏感染料以报告报告子活性的细胞。用于确定此类报告子活性的测定法也可使用其他G蛋白偶联受体的已知的激动剂和拮抗剂作为对照来估量受试化合物的活性。在用于鉴定调节化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定法中，分别使用离子敏感指示剂或膜电位荧光指示剂来监测细胞质中的离子水平或膜电位的变化。可使用的离子敏感指示剂和电压探针是Molecular Probes 1997 Catalog中公开的指示剂和探针。对于G蛋白偶联受体，混合的G蛋白例如G_α 15和G_α 16可用于选择的测定法(Wilkie等人，Proc.Nat′1 Acad.Sci.，88：10049-10053(1991))。备选地，可使用其他G蛋白例如味导素、转导蛋白和嵌合G蛋白例如G α 16gust44或G α 16trans44。

受体激活起始了随后的细胞内事件，例如，第二信使的增加。一些G蛋白偶联受体的激活通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇的水解刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge & Irvine，Nature，312：315-21(1984))。IP3又刺激细胞内钙离子库的释放。从而，细胞质钙离子水平的改变或第二信使例如IP3的水平的改变可用于估量G蛋白偶联受体的功能。作为钙从细胞内库释放和钙通过质膜离子通道进入的结果，表达此类G蛋白偶联受体的细胞可展示增加的细胞质钙水平。

在优选实施方案中，通过在异源细胞中表达T2R基因来测量T2R肽的活性，所述细胞具有将该受体连接至磷脂酶C信号转导途径的混合G蛋白(参见Offermanns & Simon，J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995))。优选地，所述细胞是HEK-293(其异常地表达T2R基因)，所述混合G蛋白是G_α 15(Offermanns & Simon，同上)或嵌合G蛋白例如G α 16gust44。通过测量细胞内Ca²⁺水平的变化来测定味觉转导的调控，所述Ca²⁺水平响应对T2R信号转导途径的调节(所述调节通过施用与T2R多肽结合的分子而产生)而发生变化。任意地使用荧光Ca²⁺指示剂染料和荧光成像术测量Ca²⁺水平的变化。

在另一个实施方案中，可按照美国专利5,436,128(此处引用作为参考)分析磷脂酰肌醇(PI)的水解。简而言之，所述测定包括用3H-肌醇标记细胞进行48或更多小时。用受试化合物标记处理标记的细胞，进行1小时。裂解经处理的细胞，然后在氯仿-甲醇-水中提取，之后通过离子交换层析分离磷酸肌醇，用闪烁计数进行定量。通过计算激动剂存在时的cpm对缓冲剂对照存在时的cpm的比率来确定刺激倍数。同样，通过计算拮抗剂存在时的cpm对缓冲剂对照(其可以包含或可以不包含激动剂)存在时的cpm的比率来确定抑制倍数。

其他受体测定包括确定细胞内环核苷酸例如cAMP或cGMP的水平。在其中受体的激活导致环核苷酸水平隆低的情况下，可在向测定中的细胞加入激活受体的化合物之前，优选地将细胞暴露于增加细胞内环核苷酸水平的试剂例如福斯高林(forskolin)。在一个实施方案中，可使用免疫测定法测量细胞内cAMP或cGMP的变化。可将Offermanns& Simon，J.Bio.Chem.，270：15175-15180(1995)中描述的方法用于确定cAMP的水平。此外，也可将Felley-Bosco等人，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11：159-164(1994)中描述的方法用于确定cGMP的水平。此外，美国专利4,115,538(此处引用作为参考)中描述了用于测量cAMP和/或cGMP的测定试剂盒。

在另一个实施方案中，可测量转录水平以估量受试化合物对信号转导的影响。将包含目的T2R多肽的宿主细胞与受试化合物接触足够的时间以产生任何相互作用，然后测量基因表达的水平。可通过经验确定，例如通过进行时间进程和测量作为时间的函数的转录水平来确定产生该相互作用的时间量。可通过使用本领域技术人员已知的适合的任何方法测量转录量。例如，可使用northern印迹法检测目的蛋白的mRNA表达或使用免疫测定法鉴定它们的多肽产物。备选地，可如美国专利5,436,128(此处引用作为参考)中所描述的，使用基于转录、使用报告基因的测定法。报告基因可以是例如氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，通过附着至第二报告子例如绿色荧光蛋白可将目的蛋白用作间接报告子(参见，例如，Mistili & Spector，Nature Biotechnology，15：961-964(1997))。

然后将转录的量与在受试化合物不存在的情况下在相同细胞中的转录量比较，或可将其与缺乏目的T2R多肽的、基本上相同的细胞中的转录量比较。基本上相同的细胞可由从其制备重组细胞但未通过导入异源DNA而被修饰的相同细胞衍生。转录量上的任何差异表明受试化合物以某种方式改变目的T2R多肽的活性。

4.表达化学感觉受体的转基因非人动物

表达本发明的一种或多种味觉受体序列的非人动物也可用于受体测定。可通过将非人动物(所述非人动物是用编码化学感觉受体或其配体结合区的核酸稳定或瞬时转染的非人动物)与受试化合物接触来这样的表达用于确定受试化合物是否在体内特异性结合哺乳动物味觉跨膜受体复合物，然后确定动物是否通过特异性结合所述受体多肽复合物而对受试化合物发生反应。

特别地将用本发明的载体转染或感染的动物用于鉴定和表征味觉刺激物的测定法，所述味觉刺激物可结合特定的或成组的受体。这样的载体感染的、表达人味觉受体序列的动物可于体内筛选味觉刺激物和它们对例如细胞生理(例如，对味觉神经元)、对CNS或行为的影响。

单个地或作为文库感染/表达核酸和载体的方法在本领域内是熟知的。可通过许多方法测量许多单个细胞、器官或完整动物的参数。本发明的T2R序列可通过感染剂例如腺病毒表达载体递送在例如动物味觉组织中表达。

内源味觉受体基因可保持功能并且野生型(天然)活性仍然可以存在。在希望所有味觉受体活性由导入的外源杂交受体提供的其他情况下，优选地使用基因敲除系。用于构建非人转基因动物特别是转基因小鼠和选择和制备用于产生转化细胞的重组构建体的方法在本领域内是熟知的。

“基因敲除”细胞和动物的构建基于前提，即可通过将新DNA序列导入基因组来减少或完全消除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平，所述新DNA序列用于打断被抑制的基因的DNA序列的某些部分。此外，可将“基因捕获插入”用于断裂宿主基因，和可使用小鼠胚胎干(ES)细胞产生基因敲除转基因动物(参见，例如，Holzschu，Transgenic Res 6：97-106(1997))。通常通过互补核酸序列之间的同源重组进行外源序列的插入。外源序列是被修饰的靶基因的某个部分，例如外显示子、内含子或转录调控序列，或能够影响靶基因表达的水平的任何基因组序列；或其组合。通过多能胚胎干细胞中的同源重组进行的基因靶向允许人们精确地改变目的基因组序列。任何技术可用于产生、筛选、繁殖基因敲除动物，例如，参见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.7：53-62(1998)；Meredith，J.Mol.Med.75：208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19：161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48：167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6：321-328(1997)；美国专利5,616,491、5,464,764、5,631,153、5,487,992、5,627,059、5,272,071；WO 91/09955、WO 93/09222、WO 96/29411、WO 95/31560、WO 91/12650。

本发明的核酸也可用作产生“基因敲除”的人细胞和其后代的试剂。同样，本发明的核酸也可用作在小鼠中产生“基因替换(knock-ins)”的试剂。人或大鼠T2R基因序列可替换小鼠基因组中的直系同源T2R。这样，产生了表达人或大鼠T2R的小鼠。然后将该小鼠用于分析人或大鼠T2R的功能和鉴定该T2R的配体。

调节剂

作为T2R家族成员的受试化合物可以是任何小化学化合物或生物实体，例如蛋白、糖、核酸或脂质。可选地，调节剂可以是T2R家族成员的经基因工程改变的形式。通常，受试化合物可以是小化学分子和肽。本质上任何化合物可在本发明的测定中用作潜在的调节剂或配体，尽管大部分常化合物可溶解在使用的水或有机(特别是基于DMSO的)溶液。可通过使测定步骤自动化和从任何方便的来源向测定提供化合物来设计筛选大规模化学文库的测定法，通常平行进行(例如，在自动化测定中以微量滴定板上的微量滴定形式)所述测定。存在许多化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)、Aldrich(St.Louis，Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、Fluka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs，Switzerland)等。

在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供包含大量潜在治疗化合物(潜在调节剂或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后如此处所描述的，在一个或多个测定中筛查“组合化学文库”或“配体文库”以鉴定展示希望的特征活性的文库成员(特定的化学物质种类或亚类)。所鉴定的化合物可用作常规的“前导化合物”或其自身可用作潜在的或实际的消费品。

组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过组合许多化学“建筑块”(building blocks)例如试剂产生的不同化合物的集合。例如，线性组合化学物质文库例如多肽文库是通过以每一种可能的方式就给定的化合物长度(即，多肽化合物中氨基酸的数目)组合成组的化学建筑块(氨基酸)形成的。可通过这样的化学建筑块的组合的混合合成数百万种化合物。

组合化学物质文库的制备和筛查对于本领域技术人员来说是熟知的。这样的组合化学文库包括但不限于肽文库(参见，例如，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-93(1991)和Houghton等人，Nature，354：84-88(1991))。也可使用用于产生化学物质多样性文库的其他化学物质。此类化学物质包括但不限于：类肽(例如，WO 91/19735)、编码的多肽(例如，WO 93/20242)、随机生物寡聚物(例如，WO92/00091)、苯二氮平类(benzodiazepines)(例如，美国专利5,288,514)、diversomer例如乙内酰脲类、苯二氮平类和二肽(Hobbs等人，PNAS.，90：6909-13(1993))、vinylogous多肽(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc，114：6568(1992))、具有葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc，114：9217-18(1992))、小化合物文库的类似的有机合成(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc，116：2661(1994))、寡氨基甲酸酯类(oligocarbamates)(Cho等人，Science，261：1303(1993))、肽基膦酸酯(peptidyl phosphonate)(Campbell等人，J.Org.Chem.，59：658(1994))、核酸文库(Ausubel，Berger，和Sambrook，所有同上)、肽核酸文库(美国专利5,539,083)、抗体文库(Vaughn等人，Nature Biotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)、糖类文库(Liang等人，Science，274：1520-22(1996)和美国专利5,593,853)、小有机分子文库(苯并二氮卓类，Baum，C&EN，Jan 18，page 33(1993)；噻唑烷酮和间噻嗪酮类，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓类，5,288,514等)。

用于制备组合文库的装置可商购获得(参见，例如，357 MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville Ky.)、Symphony(Rainin，Woburn，Mass.)、433A(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)、9050 Plus(Millipore，Bedford，Mass.))。此外，许多组合文库本身可商购获得(参见，例如，ComGenex，Princeton，N.J.；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；MartekBiosciences；Columbia，Md.；etc.)。

在本发明的一个方面，T2R调节剂可用于任何食品、糕饼、药物组合物或其成分，从而以希望的方式调节所述产品、组合物或成分的味道。例如，可加入增强苦味感觉的T2R调节剂以给产品或组合物提供苦味，可加入阻断苦味感觉的T2R调节剂以阻断产品或组合物的苦味。此外，本发明也提供了鉴定食物、饮料和药物中发现的苦味化合物和产生味道改善的、缺乏其或具有减少的其的量的食物、饮料和药物的方法。

本发明鉴定的化合物的用途

可将根据本发明鉴定的化合物加入食物、饮料或药物组合物以调节(优选阻断)苦味化合物(例如咖啡或其他食物和饮料中发现的绿原酸内酯和结构相关化合物例如其他绿原酸苦味化合物)对hT2R8、hT1R14和hT2R54的激活而引发的苦味。例如，为了阻断与绿原酸内酯或其他苦味化合物相关的苦味，可将阻断绿原酸内酯或相关化合物对hT2R8、hT2R14或hT2R54的激活的化合物用作咖啡饮料和咖啡风味的食物中的添加剂。例如，可将此类化合物以有效抑制苦味的量加入咖啡风味的食物和饮料中。

如之前所指出的，优选地，可在味觉试验例如人味觉试验中验证基于受试者T2R的测定中鉴定的化合物的味觉调节特性。

试剂盒

T2R基因和其同源物是用于鉴定味觉受体细胞，用于法庭论证和亲子关系确定以及用于检查味觉转导的有用工具。将对T2R核酸特异性杂交的T2R家族成员特异性试剂例如T2R探针和引物以及对T2R蛋白特异性结合的T2R特异性试剂例如T2R抗体用于检测味觉细胞的表达和味觉转导调控。

就样品中T2R家族成员的DNA和RNA的存在进行的核酸测定包括许多本领域技术人员已知的技术，例如southern分析、northern分析、点印迹法、RNA酶保护法、S1分析、扩增技术例如PCR和原位杂交。例如，在原位杂交中，将靶核酸以例如可获得用于在细胞内进行杂交的方式从其细胞环境中释放出来，同时保持细胞的形态学以进行随后的解释和分析。下列论文提供了关于原位杂交领域的概述：Singer等人，Biotechniques，4：230250(1986)；Haase等人，Methods in Virology，第VII卷189-226(1984)；和Names等人，编著，Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(1987)。此外，可使用上述的各种免疫测定技术检测T2R蛋白。通常将受试样品与正对照(例如，表达重组T2R蛋白的样品)和负对照进行比较。

本发明也提供了用于调节T2R家族成员的试剂盒。可容易地从可获得的材料和试剂制备这样的试剂盒。例如，该试剂盒可包含任一种或多种下列物质：T2R核酸或蛋白、反应试管和用于检测T2R活性的说明书。任意地，试剂盒包含功能性T2R多肽。可按照本发明，依赖于试剂盒的希望的用户和用户的特殊需要制备许多种试剂盒和组分。

现已在本发明中进行了一般描述，参考下列实施例将更容易地理解本发明，以举例说明的方式提供所述实施例而不希望将其作为限制。要理解可对此处公开的示例性实施方案进行各种修饰和改变而不背离本发明的精神和范围。

实施例

实施例1

在本实施例中，我们显示3CoQAL(苦味绿原酸内酯化合物)特异性激活具有本申请中包含的DNA序列的hT2R8、hT2R14和hT2R54人苦味受体。

在基于细胞的测定法中通过检测细胞内钙浓度的变化来测量3CoQAL对此类受体的激活。简而言之，将人胚胎肾细胞接种在48孔组织培养板中。24小时后，用包含hT2R8、hT2R14或hT2R54核酸序列的质粒和包含嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒瞬时转染细胞。再过24小时后，将所述细胞与对于钙是特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；分子探针)一起温育，所述染料提供了快速、简单和可靠的基于荧光的检测细胞内部钙浓度变化的方法。T2R的激活引发了导致PLC的活化和随后细胞内钙浓度的增加的信号级联反应。该钙离子浓度的增加改变了钙染料在细胞内的荧光特性。使用荧光显微镜和专门设计的软件(Imaging Workbench，Axon)监控这些变化。通过使用该方法，我们观察到绿原酸内酯3CQAL和4CQAL都特异性激活表达此类T2R的细胞(增加细胞内钙浓度)(参见图3)。(参见图2中所列的受试剂量)。

实施例2

在本实施例中，我们显示3CQAL和4CQAL(两种苦味绿原酸内酯化合物)特异性激活hT2R8、hT2R14和hT2R54，分别具有本申请中的SEQ ID NO：2、4和6中包含的DNA序列的人苦味受体。

在基于细胞的测定法中通过检测细胞内钙浓度的变化来测量3CQAL和4CQAL对该受体的激活。简而言之，将人胚胎肾细胞接种在48孔组织培养板中。24小时后，用包含hT2R8、hT2R14或hT2R54核酸序列的质粒和包含嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒瞬时转染细胞。再过24小时后，将所述细胞与对于钙是特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；分子探针)一起温育，所述染料提供了快速、简单和可靠的基于荧光的检测细胞内部钙浓度变化的方法。T2R的激活引发了导致PLC的活化和随后细胞内钙浓度的增加的信号级联反应。该钙离子浓度的增加改变了钙染料在细胞内的荧光特性。使用荧光显微镜和专门设计的软件(Imaging Workbench，Axon)监控这些变化。通过使用该方法，我们观察到绿原酸内酯3CQAL和4CQAL都特异性激活表达此类T2R的细胞(增加细胞内钙浓度)(参见图3)。

实施例3

在本实施例中，我们显示4FQAL(苦味绿原酸内酯化合物)特异性激活hT2R8、hT2R14和hT2R54，即分别具有本申请中的SEQ ID NO：2、4和6中包含的DNA序列的人苦味受体。

在基于细胞的测定法中通过检测细胞内钙浓度的变化来测量4FQAL对该受体的激活。简而言之，将人胚胎肾细胞接种在48孔组织培养板中。24小时后，用包含hT2R8、hT2R14或hT2R54核酸序列的质粒和包含嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒瞬时转染细胞。再过24小时后，将所述细胞与对于钙是特异性的荧光染料(Fluo-4或Fura-2；分子探针)一起温育，所述染料提供了快速、简单和可靠的基于荧光的检测细胞内部钙浓度变化的方法。T2R的激活引发了导致PLC的活化和随后细胞内钙浓度的增加的信号级联反应。该钙离子浓度的增加改变了钙染料在细胞内的荧光特性。使用荧光显微镜和专门设计的软件(Imaging Workbench，Axon)监控这些变化。通过使用该方法，我们观察到两种绿原酸内酯4FQAL都特异性激活表达此类T2R的细胞(增加细胞内钙浓度)(参见图4)。

此处例举的hT2R基因和多肽的序列

>hT2R8核苷酸(SEQ ID NO：2)

ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGA

TACATTGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAAT

TTAGTTATCGCCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTT

TATACAAAAAATAAACAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACC

ACCTGCCTTAATGTCTTCTATTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAA

ATTGATATGGTGGTGCACTGGATCCTGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATA

GTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCAATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGT

AAAATACCATACTTTGAACCCTTGACTCTCTTTAACCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCA

TTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGCAAATAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCC

AGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTTATCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCT

TCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGTGGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATT

CTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGCAGACATTTGTCAGAATGCTG

ACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA

>hT2R8蛋白(SEQ ID NO：3)

MFSPADNIFIILITGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYILTN

LVIARICLISVMVVNGIVIVLNPDVYTKNKQQIVIFTFWTFANYLNMWIT

TCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMVVHWILLGCFAISLLVSLIAAI

VLSCDYRFHAIAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPLTLFNLFAIVPFIVSLIS

FFLLVRSLWRHTKQIKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSFIFFFFLYYIS

SILMTFSYLMTKYKLAVEFGEIAAILYPLGHSLILIVLNNKLRQTFVRML

TCRKIACMI

>hT2R14核苷酸(SEQ ID NO：4)

ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCGTTTTAATTGTGGAATTTATAATTGGAAATTTAGGAAATAGT

TTCATAGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGATCGGATCCTCACTGCT

TTGGCAATCTCTCGAATTAGCCTGGTTTGGTTAATATTCGGAAGCTGGTGTGTGTCTGTGTTTTTCCCAGCTTTA

TTTGCCACTGAAAAAATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAGTGTCTGGTTAGCT

ACAGGCCTCGGTACTTTTTATTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAAGTGGAGG

GTTAAAAAGGTGGTTTTGGTGCTGCTTCTTGTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATATTGCACTGATAAACATC

CATATAAATGCCAGTATCAATGGATACAGAAGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTT

TCCAGTCTTATTGTATTAACCAGCACTGTGTTCATTTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCTTCTC

CTCATCTTCTCCATGTGGAAACATCGCAAGAAGATGCAGCACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAA

GCCCACAGAGGAGTTAAAAGTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTATGCCATTTTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCA

GTTTGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGAAAATCTAATTATTCTTTCCCAGGTGATGGGAATGGCTTATCCTTCATGT

CACTCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGAAGCTGAGACAGGCCTCTCTGTCAGTGCTACTGTGGCTGAGGTAC

ATGTTCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGAATTTAGAGAATCATCTTGA

>hT2R14蛋白(SEQ ID NO：5)

MGGVIKSIFTFVLIVEFIIGNLGNSFIALVNCIDWVKGRKISSVDRILTA

LAISRISLVWLIFGSWCVSVFFPALFATEKMFRMLTNIWTVINHFSVWLA

TGLGTFYFLKIANFSNSIFLYLKWRVKKVVLVLLLVTSVFLFLNIALINI

HINASINGYRRNKTCSSDSSNFTRFSSLIVLTSTVFIFIPFTLSLAMFLL

LIFSMWKHRKKMQHTVKISGDASTKAHRGVKSVITFFLLYAIFSLSFFIS

VWTSERLEENLIILSQVMGMAYPSCHSCVLILGNKKLRQASLSVLLWLRY

MFKDGEPSGHKEFRESS

>hT2R54核苷酸(SEQ ID NO：6)

ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTT

GCTGAATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAG

GCAGTTTCCACAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCFCATGATGTTA

GAAATTACCATCAGCTCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTT

ATATTCTTAAATTTTTGTAGCCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTC

TCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGAGGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTT

ATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATCAACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCC

TCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGATCAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATT

GTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATG

GGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCACATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTT

CTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAACATGTTTGACATCAACAGTCTGTGG

AATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTACTGATTCAAGATAACCCTGGG

CTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACTCTGTGA

>hT2R54蛋白(SEQ ID NO：7)

MTKLCDPAESELSPFLITLILAVLLAEYLIGIIANGFIMAIHAAEWVQNK

AVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKISF

IFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVF

ISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGI

VTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAIKAISYF

LILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQIIMAAYPASHSILLIQDNPG

LRRAWKRLQLRLHLYPKEWTL

尽管前面的详细描述已描述了本发明的几个实施方案，但要理解上面的描述只是举例说明的而不限制公开的发明。本发明只受下面的权利要求的限定。

Claims (128)

1.用于鉴定化合物的测定法，所述化合物调节对绿原酸内酯发生特异性响应的人T2R苦味受体，所述hT2R选自hT2R8、hT2R14和hT2R54，该方法包括：

i.就其对绿原酸内酯化合物诱导hT2R8、hT2R14、hT2R54或其片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物的激活的影响筛选化合物，所述片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物被绿原酸内酯或结构相关性化合物激活，和

ii.基于其对所述绿原酸内酯或结构相关性化合物对所述受体的激活的影响确定所述化合物是否调节hT2R8、hT2R14和/或hT2R54相关性苦味。

2.权利要求1的测定法，其中所述hT2R8选自

i.SEQ ID NO：3中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：2中包含的序列杂交的核酸序列编码，或

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

3.权利要求1的测定法，其中所述hT2R14选自

i.SEQ ID NO：5中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：6中包含的序列杂交的核酸序列编码，或

iii.具有与SEQ ID NO：5中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1的测定法，其中所述hT2R54选自

i.SEQ ID NO：7中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：6中包含的序列杂交的核酸序列编码，或

iii.具有与SEQ ID NO：7中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

5.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体在细胞膜上表达。

6.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体在分离的细胞膜上表达。

7.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体在完整的细胞上表达。

8.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体在真核细胞上表达。

9.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体由两栖类动物、哺乳类动物或昆虫的细胞表达。

10.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体在选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞上表达。

11.权利要求1的测定法，其为荧光测定法。

12.权利要求1的测定法，其为结合测定法。

13.权利要求1的测定法，其通过测定它对细胞内离子浓度的影响来检测所述化合物的影响。

14.权利要求1中测定法，其检测所述化合物对细胞内钠或钙的影响。

15.权利要求1的测定法，其检测所述化合物对细胞膜电位的影响。

16.权利要求1的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体的转录的影响。

17.权利要求1的测定法，其中基于它阻断所述味觉受体与雷尼替丁的相互作用的能力选择所述化合物。

18.权利要求1的测定法，其检测所述化合物对细胞内cAMP、cGMP或IP3的影响。

19.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体包含所述味觉受体的细胞外结构域或跨膜区。

20.权利要求1的测定法，其中所述测定法使用钙特异性荧光染料检测钙的变化。

21.权利要求1的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测细胞内钙的变化。

22.权利要求1的测定法，其中所述味觉受体存在于溶液中。

23.权利要求1的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的变化的结合测定法。

24.权利要求1的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与G蛋白的复合的影响。

25.权利要求1的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、导味素、G_α15、G_α16或其嵌合物的G蛋白的复合的影响。

26.权利要求1的测定法，其是荧光偏振测定法。

27.权利要求1的测定法，其中将所述味觉受体附着至固相基质。

28.权利要求1的测定法，其是高通量测定法。

29.权利要求1的测定法，其中由HEK293细胞表达味觉受体。

30.用于鉴定调节苦味受体的化合物的测定法，所述苦味受体对绿原酸内酯3CoQAL发生特异性反应，其中所述味觉受体选自hT2R8、hT2R14和hT2R54，该方法包括：

i.就其对3CoQAL结构相关性化合物诱导hT2R8、hT2R14或hT2R54或其片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物的激活的影响筛选化合物，所述片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物被3CoQAL或结构相关性化合物激活；和

ii.基于其对3CoQAL或结构相关性化合物对所述受体的激活的影响确定所述化合物是否调节hT2R8、hT2R14或hT2R54。

31.权利要求30的测定法，其中所述hT2R8选自：

i.SEQ ID NO：3中包含的多肽，

ii.由与SEQ ID NO：2中包含的核酸序列特异性杂交的核酸序列编码的多肽；和

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽。

32.权利要求30的测定法，其中所述hT2R14选自：

i.SEQ ID NO：3中包含的多肽，

ii.由与SEQ ID NO：2中包含的核酸序列特异性杂交的核酸序列编码的多肽；和

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽。

33.权利要求30的测定法，其中所述hT2R54选自：

i.SEQ ID NO：3中包含的多肽，

ii.由对SEQ ID NO：2中包含的核酸序列特异性杂交的核酸序列编码的多肽；和

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽。

34.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体在分离的细胞膜上表达。

35.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体在完整的细胞上表达。

36.权利要求30、31的测定法，其中所述味觉受体在真核细胞上表达。

37.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体在两栖类动物、哺乳动物或昆虫的细胞上表达。

38.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体在选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CH0和爪蟾卵母细胞的细胞上表达。

39.权利要求30的测定法，其为荧光测定法。

40.权利要求30的测定法，其为结合测定法。

41.权利要求30的测定法，其通过测定它对细胞内离子浓度的影响来检测所述化合物的影响。

42.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对细胞内钠或钙的影响。

43.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对细胞膜电位的影响。

44.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体的转录的影响。

45.权利要求30的测定法，其中基于它阻断所述味觉受体与绿原酸内酯化合物的相互作用的能力选择所述化合物。

46.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对细胞内cAMP、cGMP或IP3的影响。

47.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体包含所述味觉受体的细胞外结构域或跨膜区。

48.权利要求30的测定法，其中所述测定法使用钙特异性荧光染料检测钙的变化。

49.权利要求30的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测细胞内钙的变化。

50.权利要求30的测定法，其中所述味觉受体存在于溶液中。

51.权利要求30的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的变化的结合测定法。

52.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与G蛋白的复合的影响。

53.权利要求30的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、导味素、G_α15或G_α16和其嵌合物的G蛋白的复合的影响。

54.权利要求30的测定法，其是荧光偏振测定法。

55.权利要求30的测定法，其中将所述味觉受体附着至固相基质。

56.权利要求30的测定法，其是高通量测定法。

57.权利要求30的测定法，其中由HEK293细胞表达味觉受体。

58.用于鉴定调节苦味T2R味觉受体的化合物的测定法，所述T2R味觉受体对绿原酸内酯3CQAL和4CQAL中的任一种或两者发生特异性反应，所述T2R选自hT2R8、hT1R14和hT2R54，该方法包括：

i.就其对苯甲酸地那铵或结构相关性化合物诱导hT2R8、hT1R14和/或hT2R54或其片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物的激活的影响筛选化合物，所述片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物被3CQAL和4CQAL中的任一种或两者或者结构相关性化合物激活，和

ii.基于其对3CQAL和4CQAL中的任一种或两者或者结构相关性化合物对所述受体的激活的影响确定所述化合物是否调节hT2R8、hT2R14和/或hT2R54。

59.权利要求58的测定法，其中所述hT2R8选自

i.SEQ ID NO：3中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：2中包含的序列杂交的核酸序列编码；和

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

60.权利要求58的测定法，其中所述hT2R14选自

i.SEQ ID NO：5中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：4中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：5中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

61.权利要求58的测定法，其中所述hT2R54选自

i.SEQ ID NO：7中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：6中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：7中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

62.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体在细胞膜上表达。

63.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体在分离的细胞膜上表达。

64.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体在完整的细胞上表达。

65.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体在真核细胞上表达。

66.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体由两栖类动物、哺乳动物或昆虫细胞表达。

67.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体由选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CH0和爪蟾卵母细胞的细胞表达。

68.权利要求58的测定法，其为荧光测定法。

69.权利要求58的测定法，其为结合测定法。

70.权利要求58的测定法，其通过测定其对细胞内离子浓度的影响来检测所述化合物的影响。

71.权利要求58的测定法，其检测所述化合物对细胞内钠或钙的影响。

72.权利要求58的测定法，其检测所述化合物对细胞膜电位的影响。

73.权利要求58的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体的转录的影响。

74.权利要求58的测定法，其中基于其阻断所述味觉受体与denatonium的相互作用的能力选择所述化合物。

75.权利要求58的测定法，其检测所述化合物对细胞内cAMP、cGMP或IP3的影响。

76.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体包含所述味觉受体的细胞外结构域或跨膜区。

77.权利要求58的测定法，其中所述测定法使用钙特异性荧光染料检测钙的变化。

78.权利要求58的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测细胞内钙的变化。

79.权利要求58的测定法，其中所述味觉受体存在于溶液中。

80.权利要求58的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的变化的结合测定法。

81.权利要求58的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与G蛋白的复合的影响。

82.权利要求58的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、导味素、G_α15和G_α16和其嵌合物的G蛋白的复合的影响。

83.权利要求58的测定法，其是荧光偏振测定法。

84.权利要求58的测定法，其中将所述味觉受体附着至固相基质。

85.权利要求58的测定法，其是高通量测定法。

86.权利要求58的测定法，其中由HEK293细胞表达味觉受体。

87.用于鉴定调节人味觉受体的化合物的测定法，所述人味觉受体对绿原酸内酯4FQAL发生特异性响应，该受体选自hT2R8和hT2R54，该方法包括：

i.就其对4FQAL或结构相关性化合物诱导hT2R8和/或hT2R54或其片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物的激活的影响筛选化合物，所述片段、变体、直系同源物、突变体或嵌合物被士的宁或结构相关性化合物激活，和

ii.基于其对绿原酸内酯4FQAL或结构相关性化合物对所述受体的激活的影响确定所述化合物是否调节hT2R8和/或hT2R54相关性苦味。

88.权利要求87的测定法，其中所述hT2R8选自

i.SEQ ID NO：3中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：2中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：3中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

89.权利要求87的测定法，其中所述hT2R14选自

i.SEQ ID NO：5中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：4中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：5中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

90.权利要求1的测定法，其中所述hT2R54选自

i.SEQ ID NO：7中包含的氨基酸序列，

ii.由在严紧杂交条件下与SEQ ID NO：6中包含的序列杂交的核酸序列编码；或

iii.具有与SEQ ID NO：7中包含的多肽具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

91.权利要求87的测定法，其中所述味觉受体在细胞膜上表达。

92.权利要求87的测定法，其中所述味觉受体在分离的细胞膜上表达。

93.权利要求87的测定法，其中所述味觉受体在完整的细胞上表达。

94.权利要求87的测定法，其中所述味觉受体在真核细胞上表达。

95.权利要求87的测定法，其中所述味觉受体在两栖类动物、哺乳动物或昆虫细胞上表达。

96.权利要求87的测定法，其中所述味觉受体由选自HEK293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞表达。

97.权利要求87的测定法，其为荧光测定法。

98.权利要求87的测定法，其为结合测定法。

99.权利要求87的测定法，其通过测定其对细胞内离子浓度的影响来检测对所述化合物的影响。

100.权利要求87的测定法，其检测所述化合物对细胞内钠或钙的影响。

权利要求87的测定法，其检测所述化合物对细胞膜电位的影响。

权利要求87的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体的转录的影响。

权利要求87的测定法，其中基于其阻断所述味觉受体与雷尼替丁的相互作用的能力选择所述化合物。

权利要求87的测定法，其检测所述化合物对细胞内cAMP、cGMP或IP3的影响。

权利要求87的测定法，其中所述味觉受体包含所述味觉受体的细胞外结构域或跨膜区。

权利要求87的测定法，其中所述测定法使用钙特异性荧光染料检测钙的变化。

权利要求87的测定法，其中所述测定法使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测细胞内钙的变化。

权利要求87的测定法，其中所述味觉受体存在于溶液中。

权利要求87的测定法，其是检测光谱特征、流体动力学特征或溶解度的变化的结合测定法。

110.权利要求87的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与G蛋白的复合的影响。

111.权利要求87的测定法，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、导味素、G_α15和G_α16和其嵌合物的G蛋白的复合的影响。

112.权利要求87的测定法，其是荧光偏振测定法。

113.权利要求87的测定法，其中将所述味觉受体附着至固相基质。

114.权利要求87的测定法，其是高通量测定法。

115.权利要求87的测定法，其中由HEK293细胞表达味觉受体。

116.减轻食物、饮料或药物中的苦味的方法，其包括向其中加入抑制苦味的量的使用权利要求1的任何测定法鉴定的化合物。

117.减轻食物、饮料或药物中的苦味的方法，其包括向其中加入抑制苦味的量的使用权利要求30的测定法鉴定的化合物。

118.减轻食物、饮料或药物中的苦味的方法，其包括向其中加入抑制苦味的量的使用权利要求58的测定法鉴定的化合物。

119.减轻食物、饮料或药物中的苦味的方法，其包括向其中加入抑制苦味的量的使用权利要求87的测定法鉴定的化合物。

120.权利要求116的方法，其中所述食物、饮料或药物包含至少一种促成其苦味的绿原酸内酯。

121.权利要求120的方法，其中所述食物、饮料或药物是咖啡饮料或咖啡风味的食物或药剂。

122.权利要求120的方法，其中所述绿原酸内酯选自3CoQAL、4CQAL、4CQAL和4FQAL。

123.减轻食物、饮料或药物中的苦味的方法，其包括从其中除去在权利要求1的任一种测定法中鉴定的至少一种化合物，所述化合物诱导或增强绿原酸内酯化合物对hT2R8、hT2R14和/或hT2R54的激活。

124.权利要求123的方法，其中所述化合物是绿原酸内酯。

125.权利要求124的方法，其中所述绿原酸内酯选自3CoQAL、3CQAL、4CQAL和4FQAL。

126.权利要求123的方法，其中所述除去是从咖啡饮料或咖啡风味的食物或药物中除去。

127.权利要求126的方法，其包括在减少至少一种促成苦味的绿原酸内酯的量的条件下烘焙或加工咖啡材料。

128.鉴定分别与其他食物、饮料或药物相比具有减少的苦味的食物、饮料或药物的方法，其包括

a.从成组的食物、饮料或药物制备提取物；

b.使用权利要求1中所述的测定法接触来自提取物的等分试样；

c.记录使用各种不同等分试样的测定法的应答；

d.将不同提取物的应答分级；和

e.选择具有最低激活活性的食物、饮料或药物样品。

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