ES2658859T3 - Receptores del sabor dulce-umami y umami-dulce humanos quiméricos - Google Patents

Abstract

Una línea celular que expresa un polipéptido receptor del sabor quimérico que comprende el dominio extracelular de T1R2 y la región transmembranaria de T1R1 según están contenidos en SEQ ID Nº: 2, línea celular que expresa además una proteína G quimérica derivada de Galfal6 y bien gustducina o bien transducina.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

15

25

35

45

55

65

como un promotor, o una serie de sitios de unión a factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Según se usa en la presente, "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o manipulado de otro modo in vitro (p. ej., "polinucleótido recombinante"), a métodos de uso de polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. "Medios recombinantes" también abarca la ligación de ácidos nucleicos que tienen diversas regiones o dominios codificantes o secuencias promotoras procedentes de diferentes fuentes en un casete de expresión o vector para la expresión de, p. ej., la expresión inducible o constitutiva de una proteína de fusión que comprende un dominio de translocación como el descrito en la presente y una secuencia de ácido nucleico amplificada usando la primera descrita en la presente.

La expresión "se hibrida selectivamente (o específicamente) a" se refiere a la unión, el doblamiento o la hibridación de una molécula a una secuencia nucleotídica particular bajo condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (p. ej., ADN o ARN celular total o de biblioteca).

La expresión "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancies. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas superiores. Una guía exhaustiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5-10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y un pH de fuerza iónica definido. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, un pH y una concentración de ácido nucleico definidos) a la que 50% de las sondas complementarias a la diana se hibrida a la secuencia diana en el equilibrio (como las secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, 50% de las sondas está ocupado en el equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,0 M de ion sodio, típicamente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de ion sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (p. ej., más de 50 nucleótidos). También se pueden alcanzar concentraciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para una hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación de fondo. Condiciones de hibridación rigurosas ejemplares pueden ser como sigue: 50% de formamida, 5xSSC, y 1% de SDS, incubación a 42°C, o 5xSSC, 1% de SDS, incubación a 65°C, con lavado en 0,2xSSC y 0,1% de SDS a 65°C. Estas hibridaciones y etapas de lavado se pueden llevar a cabo durante, p. ej., 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 o más minutos.

Ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas están sin embargo sustancialmente relacionados si los polipéptidos que codifican están sustancialmente relacionados. Esto ocurre, por ejemplo, cunado una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. En estos casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente bajo condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. "Condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" ejemplares incluyen una hibridación en un tampón de 40% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 1xSSC a 45°C. Estas hibridaciones y etapas de lavado se pueden llevar a cabo durante, p. ej., 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60 o más minutos. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Los expertos normales identificarán fácilmente que se pueden utilizar condiciones de hibridación y lavado alternativas para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.

"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de soporte procedente de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de la misma que se une a y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los múltiples genes de regiones variables inmunoglobulínicas. Las cadenas ligeras se clasifican bien como kappa o bien como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural inmunoglobulínica (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia de modo que el sitio de unión antigénica (región variable) esté conectado a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula totalmente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, p. ej., una enzima, una toxina, una hormona, un

9

imagen8

imagen9

5

15

25

35

45

55

Según se menciona, se mostró que '807 y '336 interactuaban con el dominio transmembranario C-terminal de hT1R1. Además de activar el receptor quimérico del dulce-umami, también se observó que 807 y 336 potencian las actividades del receptor del sabor dulce-umami quimérico a concentraciones inferiores.

Según se apunta anteriormente, también se efectuaron experimentos usando líneas celulares HEK-293 que expresaban el receptor hT1R1-2 quimérico, una proteína G16gust44 quimérica y una secuencia de T1R3 de rata, lo que revelaba que este receptor del sabor quimérico respondía a compuestos con sabor umami y que la actividad del mismo se potencia mediante IMP y GMP.

Por lo tanto, basándose en lo precedente, se pueden usar un receptor quimérico del dulce-umami quimérico o receptores del sabor umami-dulce quiméricos como los descritos en la presente y líneas celulares estables o transitorias que expresan este receptor del sabor quimérico para identificar potenciadores del sabor dulce, potenciadores del sabor umami, edulcorantes y moléculas con sabor umami. Además, estos receptores del sabor quiméricos y líneas celulares que expresan estos receptores del sabor quiméricos se pueden usar en estudios cartográficos y funcionales para determinar en qué residuos los ligandos dulces y umami interactúan con sus respectivos receptores del sabor. Además, estas moléculas se pueden usar para elucidar el mecanismo de la activación de receptores del dulce y el umami y la potenciación de la activación.

Según se analiza con más detalle posteriormente, estos receptores híbridos se pueden usar en cualquiera de los ensayos de cribado divulgados en las solicitudes relacionadas con T1R previas del solicitante, incluyendo los documentos US Nº de Serie 09/897.427 presentado el 3 de julio de 2001 y US Nº de Serie 10/179.373 presentado el 26 de junio de 2002. Adicionalmente, según se analiza posteriormente, estos receptores híbridos se pueden expresar usando cualquiera de los vectores de expresión y las células divulgados en la presente. Sin embargo, células preferidas para la expresión incluyen células usadas típicamente en ensayos de GPCR tales como HEK-293, CHO, COS, MDK, BHK, L de mono y ovocitos (de rana).

En ensayos basados en células funcionales tales como los analizados posteriormente, el receptor quimérico preferiblemente se expresará en asociación con una proteína G adecuada tal como una proteína G promiscua tal como Galfa15, Galfa16, transducina, gustducina, una proteína Gq, una proteína Gi o una proteína G quimérica tal como una proteína quimérica derivada de Galfa16 y gustducina. Se ejemplifican en la presente proteínas G quiméricas derivadas de G16 y transducina o gustducina.

Además, se debe entender que aunque la solicitud ejemplifica secuencias de ácido nucleico y proteína dulcesumami y umami-dulces quiméricas específicas, la invención contempla además variantes de las mismas, p. ej., secuencias de ácido nucleico y polipéptidos que poseen al menos 80% de identidad de secuencia con las mismas, más preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia con las mismas y más típicamente de 95, 96, 97, 98,

o 99% de identidad de secuencia con las mismas. De forma similar, estas secuencias quiméricas se pueden expresar en asociación con secuencias de T1R3 silvestres o variantes, es decir, variantes que poseen al menos 80% de identidad de secuencia con T1R3 humano o de roedor, más típicamente al menos 90% de identidad de secuencia con las mismas, y aún más típicamente al menos 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia con las mismas.

El efecto modulador del sabor de ligandos umami y dulces y potenciadores identificados usando los presentes receptores del sabor quiméricos se confirmará preferiblemente en pruebas de sabor en seres humanos o animales. Por ejemplo, se confirmará que modulan el sabor dulce o umami solos o en asociación con otros compuestos (compuesto dulce o compuesto con sabor umami). Estos compuestos se pueden usar como aditivos aromáticos en diversas composiciones incluyendo alimentos, bebidas, medicamentos y cosméticos.

Preferiblemente, estos ensayos utilizarán una célula de prueba que expresa un ADN que codifica un hTIR que tiene una de las secuencias de aminoácidos identificadas anteriormente. Sin embargo, se anticipa que también serán útiles en estos ensayos fragmentos, ortólogos, variantes o quimeras de estos polipéptidos receptores que retienen las propiedades funcionales de estos receptores del sabor dulce-umami o umami-dulce quiméricos, es decir, responden a algunos compuestos dulces o umami o potenciadores de los mismos compuestos. Ejemplos de estas variantes incluyen variantes de empalme, polimorfismos de un solo nucleótido, variantes alélica y mutaciones producidas por medios recombinantes o químicos, o presentes en la naturaleza. Se indican posteriormente medios para el aislamiento y la expresión de T1Rs, que se usan en los ensayos de la presente invención y ensayos que son contemplados para el uso en la presente invención para identificar compuestos que inhiben la activación de estos receptores.

Aislamiento y expresión de T1Rs

El aislamiento y la expresión de los T1Rs, o fragmentos o variantes de los mismos, de la invención se pueden efectuar mediante procedimientos de clonación bien establecidos usando sondas o cebadores construidos basándose en las secuencias de ácidos nucleicos de T1R divulgadas en la solicitud. También se pueden identificar secuencias de T1R relacionadas a partir de bases de datos genómicas se ser humano u otra especie usando las

12

imagen10

imagen11

imagen12

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

También se contemplan proteínas quiméricas, que comprenden al menos 10, 20, 30, 50, 70, 100 o 150 aminoácidos

o más, de uno de al menos uno de los polipéptidos de T1R descritos en la presente, acopladas a aminoácidos adicionales que representan la totalidad o parte de otro GPCR, preferiblemente un miembro de la superfamilia 7transmembranaria. Estas quimeras se pueden elaborar a partir de los presentes receptores y otro GPCR, o se pueden elaborar al combinar dos o más de los presentes receptores. En un ejemplo, una porción de la quimera corresponde a o se deriva del dominio transmembranario de un polipéptido de T1R de la invención. En otro ejemplo, una porción de la quimera corresponde a o se deriva de la una o más de las regiones transmembranarias de un polipéptido de T1R descrito en la presente, y la porción o las porciones restantes pueden provenir de otro GPCR. Los receptores quiméricos son muy conocidos en la técnica y también son muy conocidas las técnicas para crearlos y la selección y los límites de los dominios o fragmentos de los receptores acoplados a proteína G para la incorporación en los mismos. Así, este conocimiento de los expertos en la técnica se puede usar fácilmente para crear estos receptores quiméricos. El uso de estos receptores quiméricos puede proporcionar, por ejemplo, una característica de sensibilidad al sabor de uno de los receptores divulgados específicamente en la presente, acoplada con las características de transducción de señales de otro receptor, tal como un receptor muy conocido usado en sistemas de ensayo de la técnica anterior.

Por ejemplo, una región tal como una región de unión a ligando, un dominio extracelular, un dominio transmembranario, un dominio transmembranario, un dominio citoplásmico, un dominio N-terminal, un dominio Cterminal, o cualquier combinación de los mismos, se puede conectar covalentemente a una proteína heteróloga. A modo de ejemplo, una región transmembranaria de T1R se puede conectar a un dominio transmembranario de GPCR heterólogo, o un dominio extracelular de GPCR heterólogo se puede conectar a una región transmembranaria de T1R. Otras proteínas heterólogas de elección pueden incluir, p. ej., proteína fluorescente verde, polipéptidos de beta-galactosidasa, receptor de glutamato y los polipéptidos de rodopsina, p. ej., fragmentos N-terminales de rodopsina, p. ej., rodopsina bovina.

También está dentro del alcance de la invención el uso de diferentes células hospedadoras para expresar los T1Rs según las reivindicaciones. Para obtener altos niveles de expresión de un gen o ácido nucleico clonado, tales como ADNcs que codifican los T1Rs, fragmentos o variantes descritos en la presente, un experto típicamente subclona la secuencia de ácido nucleico de interés en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para la transcripción directa, un terminador de la transcripción/traducción y, si es para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción. Promotores bacterianos adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen, p. ej., en Sambrook y cols. Preferiblemente, se usan sistemas de expresión eucarióticos para expresar el presente receptor hT1R.

Se puede usar cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias nucleotídicas extrañas en células hospedadoras. Estos incluyen el uso de transfección de fosfato cálcico, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores plasmáticos, vectores virales y cualquiera de los otros métodos muy conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula hospedadora (véase, p. ej., Sambrook y cols.). Solo es necesario que el procedimiento de manipulación genética particular usado sea capaz de introducir satisfactoriamente al menos una molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora capaz de expresar el fragmento de T1R o la variante de interés.

Después de que el vector de expresión se introduzca en las células, las células transfectadas se cultivan bajo condiciones que favorecen la expresión del receptor, el fragmento o la variante de interés, que a continuación se recupera del cultivo usando técnica estándar. Ejemplos de estas técnicas son muy conocidos en la especialidad. Véase, p. ej., el documento WO 00/06593.

Ensayos para la detección de compuestos que modulan la actividad de un T1R según la invención

Se describen ahora métodos y composiciones para determinar si un compuesto de prueba se une específicamente a un polipéptido de T1R según se describe en la presente, tanto in vitro como in vivo. Se pueden controlar muchos aspectos de la fisiología celular para evaluar el efecto de la unión al ligando de un T1R presente en la naturaleza o quimérico. Estos ensayos se pueden realizar sobre células intactas que expresan un polipéptido de T1R, sobre células permeabilizadas o sobre fracciones de membrana producidas mediante métodos estándar.

Los receptores del sabor se unen a compuestos que producen sabor e inician la transducción de estímulos químicos en señales eléctricas. Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de las enzimas diana, los canales y otras proteínas efectoras. Algunos ejemplos son la activación de cGMP fosfodiesterasa por transducina en el sistema visual, adenilato ciclasa por la proteína G estimulante, fosfolipasa C por Gq y otras proteínas G cognadas, y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. También se pueden examinar consecuencias aguas abajo tales como la generación de diacilglicerol e IP3 por fosfolipasa C y, a su vez, para la movilización de calcio por IP3.

16 5

15

25

35

45

55

Los presentes polipéptidos de T1R quiméricos del ensayo se seleccionarán típicamente de un polipéptido que tiene una secuencia contenida en las SEQ ID Nº: 2 y 4 o fragmentos o variantes modificadas conservativamente del mismo.

Alternativamente, las proteínas o los polipéptidos de T1R quiméricos del ensayo se pueden derivar de una célula hospedadora eucariótica, y pueden incluir una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID Nº: 2 o 4 o variantes modificadas conservativamente de la misma. Generalmente, la identidad de secuencia de aminoácidos será al menos 30% preferiblemente 30-40%, más específicamente 50-60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Opcionalmente, las proteínas o los polipéptidos de T1R de los ensayos pueden comprender una región de un polipéptido de T1R, tal como un dominio extracelular, una región transmembranaria, un dominio citoplásmico, un dominio de unión a ligando, y similares. Opcionalmente, el polipéptido de T1R, o una porción del mismo, puede estar conectado covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica usada en los ensayos descritos en la presente.

Se pueden probar moduladores de la actividad de T1R usando proteínas o polipéptidos de T1R como los descritos anteriormente, bien recombinantes o bien presentes en la naturaleza. Las proteínas o los polipéptidos de T1R se pueden aislar, expresar en una célula, expresar en una membrana derivada de una célula, expresar en tejido o en un animal, bien recombinante o bien presente en la naturaleza. Por ejemplo, se pueden usar rodajas de lengua, células disociadas de una lengua, células transformadas o membranas. La modulación también se puede probar usando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos en la presente.

Detección de moduladores

Se describen posteriormente composiciones y métodos para determinar si un compuesto de prueba se une específicamente a un receptor T1R según se describe en la presente, tanto in vitro como in vivo. Se pueden controlar muchos aspectos de la fisiología celular para evaluar el efecto de la unión de un ligando a un polipéptido de T1R según se describe en la presente. Estos ensayos se pueden realizar sobre células intactas que expresan un receptor quimiosensorial, sobre células permeabilizadas o sobre fracciones de membrana producidas mediante métodos estándar o in vitro usando proteína sintetizadas de novo.

In vivo, los receptores del sabor se unen a compuestos moduladores del sabor e inician la transducción de estímulos químicos en señales eléctricas. Una proteína G activada o inhibida alterará a su vez las propiedades de enzimas diana, canales y otras proteínas efectoras. Algunos ejemplos son la activación de cGMP fosfodiesterasa por transducina en el sistema visual, adenilato ciclasa por la proteína G estimulante, fosfolipasa C por Gq y otras proteínas G cognadas, y la modulación de diversos canales por Gi y otras proteínas G. También se pueden examinar consecuencias aguas abajo tales como la generación de diacilglicerol e IP3 por fosfolipasa C y, a su vez, para la movilización de calcio por IP3.

Alternativamente, las proteínas o los polipéptidos de T1R quiméricos del ensayo se pueden derivar de una célula hospedadora eucariótica y pueden incluir una subsecuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de aminoácidos con los polipéptidos de T1R divulgados en la presente, o fragmentos o variantes modificadas conservativamente de la misma. Generalmente, la identidad de secuencia de aminoácidos será al menos 35 a 50%, u opcionalmente 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Opcionalmente, las proteínas o los polipéptidos de T1R de los ensayos pueden comprender un dominio de una proteína de T1R, tal como un dominio extracelular, una región transmembranaria, un dominio transmembranario, un dominio citoplásmico, un dominio de unión a ligando, y similares. Además, según se describe anteriormente, la proteína de T1R o un dominio de la misma se puede conectar covalentemente a una proteína heteróloga para crear una proteína quimérica usada en los ensayos descritos en la presente.

Se prueban moduladores de la actividad del receptor T1R usando proteínas o polipéptidos de T1R como los descritos anteriormente, bien recombinantes o bien presentes en la naturaleza. Las proteínas o los polipéptidos de T1R se pueden aislar, expresar en una célula, expresar en una membrana derivada de una célula, expresar en tejido

o en un animal, bien recombinante o bien presente en la naturaleza. Por ejemplo, se pueden usar rodajas de lengua, células disociadas de una lengua, células transformadas o membranas. La modulación también se puede probar usando uno de los ensayos in vitro o in vivo descritos en la presente.

1. Ensayos de unión in vitro

La transducción del sabor también se puede examinar in vitro con reacciones en estado sólido o soluble, usando los polipéptidos de T1R descritos en la presente. En un ejemplo particular, se pueden usar dominios de unión a ligando de T1R in vitro en reacciones en estado soluble o sólido para ensayar con respecto a la unión al ligando.

Es posible que el dominio de unión a ligando pueda estar formado por el dominio N-terminal junto con porciones adicionales del dominio extracelular, tales como los bucles extracelulares del dominio transmembranario.

17

imagen13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

68,5°. El tiempo de relajación rotacional se relaciona con la viscosidad (η), la temperatura absoluta (T), el volumen molecular (V) y la constante de los gases (R) mediante la siguiente ecuación: 2(tiempo de relajación rotacional) = 3 V RT.

El tiempo de relajación rotacional es pequeño (≃ nanosegundo) para moléculas pequeñas (p. ej. fluoresceína) y grande (≃100 nanosegundos) para moléculas grandes (p. ej. inmunoglobulinas). Si la viscosidad y la temperatura se mantienen constantes, el tiempo de relajación rotacional, y por lo tanto la polarización, se relaciona directamente con el volumen molecular. Los cambios en el volumen molecular se pueden deber a interacciones con otras moléculas, disociación, polimerización, degradación, hibridación o cambios de conformación de la molécula marcada fluorescentemente. Por ejemplo, se ha usado polarización fluorescente para medir la escisión enzimática de polímeros grandes marcados con fluoresceína por proteasas, ADNasas y ARNasas. También se ha usado para medir la unión en equilibrio para interacciones proteína/proteína, la unión anticuerpo/antígeno y la unión proteína/ADN.

A. Ensayos de alto rendimiento en estado sólido y solubles

En otro ejemplo más, se describen en la presente ensayos solubles que usan un polipéptido de T1R; o una célula o un tejido que expresa un polipéptido de T1R. En otro ejemplo, se describen en la presente ensayos in vitro basados en fase sólida en un formato de alto rendimiento, en los que el polipéptido de T1R, o la célula o el tejido que expresa el polipéptido de T1R, está ligado a un sustrato en fase sólida o un compuesto estimulante del sabor y se pone en contacto con un receptor T1R, y la unión se detecta usando una etiqueta apropiada o un anticuerpo producido contra el receptor T1R.

En los ensayos de alto rendimiento descritos, es posible cribar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo día. En particular, cada pocillo de una placa de microvaloración se puede usar para realizar un ensayo separado contra un modulador potencial seleccionado o, si se van a observan efectos de la concentración o el tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos pueden probar un único modulador. Así una sola placa de microvaloración estándar puede ensayar aproximadamente 100 (p. ej., 96) moduladores. Si se usan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede ensayar fácilmente de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1500 compuestos diferentes. También es posible ensayar múltiples compuestos en cada pocillo de la placa. Es posible ensayar varias placas diferentes al día; cribados de ensayo para hasta aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes son posibles usando los sistemas integrados descritos en la presente. Más recientemente, se han desarrollados enfoques microfluídicos para manipulación de reactivos.

La molécula de interés se puede unir al componente en estado sólido, directamente o indirectamente, a través de conexión covalente o no covalente, p. ej., a través de una etiqueta. La etiqueta puede ser cualquiera de una variedad de componentes. En general, una molécula que se une a la etiqueta (ligador de la etiqueta) se fija a un soporte sólido y la molécula de interés (p. ej., la molécula de transducción del sabor de interés) etiquetada se liga al soporte sólido mediante la interacción de la etiqueta y el ligador de la etiqueta.

Se puede usar un número de etiquetas y ligadores de etiquetas, basándose en interacciones moleculares conocidas descritas a fondo en la bibliografía. Por ejemplo, cuando la etiqueta tiene un ligador natural, por ejemplo, biotina, proteína A o proteína G, se puede usar junto con ligadores de etiquetas apropiados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.). Anticuerpos para moléculas con ligadores naturales tales como biotina también son ligadores de etiquetas ampliamente disponibles y apropiados (véase SIGMA Immunochemicals catálogo SIGMA de 1998, St. Louis Mo.).

De forma similar, cualquier compuesto hapténico o antigénico se puede usar en combinación con un anticuerpo apropiado para formar un par etiqueta/ligador de etiqueta. Miles de anticuerpos específicos están disponibles comercialmente y muchos anticuerpos adicionales se describen en la bibliografía. Por ejemplo, en una configuración común, la etiqueta es un primer anticuerpo y el ligador de etiqueta es un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, las interacciones receptor-ligando también son apropiadas como pares de etiqueta y ligador de etiqueta. Por ejemplo, agonistas y antagonistas de receptores de la membrana celular (p. ej., interacciones receptor celular-ligando tal como transferrina, c-kit, ligandos de receptores virales, receptores de citocinas, receptores quimiocinas, receptores de interleucinas, receptores de inmunoglobulinas, y anticuerpos, la familia de cadhereínas, la familia de integrinas, la familia de selectinas, y similares; véase, p. ej., Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)). De forma similar, toxinas y venenos, epítopos virales, hormonas (p. ej., opiáceos, esteroides, etc.), receptores intracelulares (p. ej., que median en los efectos de diversos ligandos pequeños, incluyendo esteroides, hormona tiroidea, retinoides y vitamina D; péptidos), fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (configuraciones poliméricas tanto lineales como cíclicas), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interactuar todos con diversos receptores celulares.

Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, poli(sulfuros de arileno), polisiloxanos, poliimidas y poliacetatos, también pueden formar una etiqueta o ligador de

19

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

Claims (1)

1. imagen1