CN101583717A - 特异性活化人t2r受体的苦味配体的鉴别和用于鉴别人苦味调节剂的相关测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及T2R味觉受体家族中特定的人味觉受体响应特定的苦味化合物的发现。本发明还涉及特定的hT2R9等位基因和它们在用相同苦味配体的功能测定中完全不同的活性的发现。本发明进一步涉及这些T2R受体在用于鉴别配体的测定中的用途，所述配体通过特定的苦味配体和相关的化合物调节这些味觉受体的活化。这些化合物可用作添加剂和/或从食品、饮料、化妆品和药物中除去以改良(阻断)T2R相关的苦味。T2R配体还可用作治疗和调节T2R相关的胃肠和代谢功能以及治疗胃肠和代谢疾病的治疗剂，所述疾病如进食障碍、食物感受、食物吸收、肥胖、糖尿病、克罗恩病、乳糜泻等。

Description

特异性活化人T2R受体的苦味配体的鉴别和用于鉴别人苦味调节剂的相关测定

相关申请

本申请要求2006年11月1日提交的美国序列号11/555,617的优先权，并且是该案的部分连续申请，而美国序列号11/555,617是2002年7月10日提交的美国序列号10/191,058的部分连续申请，并且也是2003年12月1日提交的美国序列号10/742,209的部分连续申请，其是2001年4月5日提交的美国序列号09/825,882(目前的美国专利第7,105,650号)的分案申请，所有的申请以其全部内容通过引用并入本文。这些申请涉及hT2R的鉴别和它们在用于鉴别活化特定的T2R的配体的测定中的用途。这些配体用于调节味觉感知(tasteperception)，特别是苦味。

发明领域

本发明涉及活化T2R家族中涉及苦味感知的许多先前报道的人G蛋白偶联受体(GPCR)的苦味化合物的阐明。具体地，本发明涉及特异性结合并活化hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76的苦味配体的发现。因此，以上鉴别的人T2R可用于鉴别调节(优选阻断)与这些和其他配体相关的苦味的化合物。

更具体地，本发现表明主题人味觉受体、其片段、或变体或嵌合体，包括其直向同源物、剪接变体、单核苷酸多态性(SNP)和遗传工程改造的突变体，可用于鉴别调节(优选阻断)苦味配体的苦味的化合物以及活化这些受体的结构上相关的化合物和其他化合物的测定，优选地基于细胞的高通量测定。使用这些测定鉴别的化合物可用作食品、饮料或药品中的添加剂以改善其味道。此外，本发明涉及改良的食品、饮料和药物，所述改良的食品、饮料和药物经处理和配制以减少或消除活化主题T2R的苦味化合物。

本发明还涉及主题T2R基因和相应的多肽以及表达它们的细胞在治疗剂筛选中的用途，例如用于鉴别化合物，所述化合物可用于调节胃肠功能例如食物感受(food sensing)、吸收、胃肠激素和肽的分泌、运输和吸收的调控、对舌和胃肠系统中毒素的响应、胃肠和代谢病症(例如进食障碍(eating disorders)、糖尿病、肥胖等)的治疗。

相关领域描述

人类可识别的基本味觉形式之一是苦味。直到最近，对苦味的生理学仍然知之甚少。最近的研究已经开始阐明味觉生物学(Lindemann，Nature(2001))。目前已知许多苦味化合物通过与细胞表面受体相互作用产生苦味。这些受体属于与胞内G蛋白相互作用的七跨膜结构域受体家族。已经在人和啮齿动物中鉴别了称为T2R的GPCR的新家族(Adler等人，Cell 100(6)：693-702(2000)；Chandrashekar等人，Cell 100(6)：703-711(2000)；Matsunami H，Montmayeur J P，BuckL B.Nature 404(6778)：601-4(2000))。本发明前的几项证据表明T2R介导对苦味化合物的响应。第一，T2R基因在舌和腭上皮细胞的味觉受体细胞的亚群中特异性表达。第二，人T2R之一的基因(hT2R1)位于与人对苦味化合物6-正丙基-2-硫尿嘧啶的敏感性有关的染色体位点(Adler等人，Id.)(2000))。第三，小鼠T2R之一(mT2R5)位于与小鼠对苦味化合物环己酰亚胺的敏感性有关的染色体位点。还表明mT2R5可以活化味转导素，味转导素是特异性表达于味觉细胞并与苦味刺激转导有关的G蛋白(Wong等人，Nature 381：796-800(1996))。mT2R5对味转导素的活化仅出现于对环己酰亚胺的响应(Chandrashekar等人，(Id.)(2000)。因此，已提议mT2R家族介导小鼠的苦味响应，而hT2R家族介导人的苦味响应。仅一种人T2R表明具有经鉴别的苦味配体——hT2R4，显示被地那铵活化(Chandrashekar等人，Id.)2000)。然而，该研究使用的有效地那铵的浓度(1.5mM)非同寻常地高，即比报道的人对地那铵的苦味阀值高10⁵倍(Saroli，Naturwissenschaften 71：428-429(1984))。因此，没有特定的苦味配体有说服力地匹配于任何hT2R。还已表明每种hT2R能够结合多种苦味配体。这一假设是基于hT2R家族仅由24个鉴别的成员组成，而人类可以识别数百种不同的苦味化合物的事实。先前已经报道了hT2R的序列并且公开于Zuker等人(WO 01/18050 A2，(2001))和Adler等人(WO 01/77676 A1(2001))的公布的PCT申请，两者以其全部内容通过引用并入本文。

研究T2R功能的困难之一是这些受体不易于在培养的哺乳动物细胞系中表达。为了提高T2R的表达，将来自良好表达的GPCR(视紫红质)的N末端序列连接到T2R序列(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。由于有可用的抗体，这一N末端标签还允许容易地监测蛋白质的表达。此外，SSTR3标签(Bufe等人，Nat.Genet.32：397-400(2002))，一种不同的N末端标签已经用于提高T2R的表达。尽管视紫红质标签的掺入提高了一些T2R在哺乳动物细胞系中的表达，但是它们中的许多仍然没有被十分充分地表达以用于功能研究。在一个不同的方法中，mT2R5在昆虫Sf9细胞中成功地表达并且用于使用生物化学GTPγS结合测定的功能研究(Chandrashekar等人，(Id.)2000)。

在申请人以前的专利申请现在已获得专利权的美国序列号09/825,882中，申请人鉴别并提供了许多当时新的人味觉受体包括hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R63、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71和hT2R75的核酸序列和多肽序列。此外在美国序列号10/628,464中，申请人提供了另一种鉴别的新人味觉受体(在其中称为hT2R76)的多肽和DNA序列。

另外，在美国序列号10/191,058(其以其全部内容通过引用并入本文)中，申请人发现了特异性活化三种不同人T2R的配体。此外，申请人最近提交了美国序列号11/455,693，其进一步鉴别了特异性结合其他人T2R的苦味配体并且提供了相关的测定。

另外，关于本发明的实际应用，已报道T2R和T1R味觉受体均在胃肠系统中表达。例如，Wu等人，Proc，Natl.Acad.Sci，USA99(4)：2392-7(2002)报道T2R与味转导素和转导蛋白的亚基在肠内分泌细胞(enterendocrine cell)(STC1细胞)中表达，并且这些细胞在胃肠道中可能响应苦味配体。另外，Chen等人，AM J.Physiol.Cell Physiol.291(4)：C 726-39(2006)报道苦味刺激在肠内分泌STC-1细胞中诱导Ca++信号和缩胆囊素(CCK)释放。另外，Rozengurt，A J Physiol Gastrointes Liver Physiol 291(2)：G171-7(2006)报道肠中的味觉受体可能在传递消化功能和激素和/或神经途径的控制的分子中起作用，并且它们可以在有害药物和生存响应的检测中起作用。此外，Sternini Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.292(2)：G457-61(2007)报道肠中的味觉受体可参与胃肠功能(例如分子感受、营养吸收、防御有害物质)并且进一步表明这些机理的理解可能与疾病的状态和情况(例如喂食障碍(feeding disorders)以及炎症)有关。此外，Mace等人，J Physiol.2007[Epub}最近表明T2R和T1R活化磷脂酶Cβ2(PLCβ2)，并且在肠中可能有与存在于舌细胞中的分子感受系统相似的分子肠感受系统，并且表达味觉受体的胃肠细胞(例如刷细胞或孤立化学感受细胞(solitary chemosensorycells))可引起GLUT2的增加并在营养感受，以及肥胖和糖尿病治疗的营养学中起作用。另外，Cui等人，Curr Pharm Des.12(35)：4591-600(2006)表明在肠中表达的T1R可用于对治疗肥胖和糖尿病中的化合物以及人工增甜剂的测定。

然而，尽管已经报道并且了解T2R成员调节苦味和它们在胃肠功能中的可能作用，但是仍然存在鉴别活化人苦味T2R味觉受体的特定的配体的需要。更深入地了解不同T2R(特别是人T2R)的结合特性将十分有益，因为这将更有力地促进其在选择具有期望的味觉调节特性(即阻断或抑制特定的苦味化合物的味道)的化合物中的应用。另外，将提供用于治疗和调节胃肠功能和相关疾病(例如肥胖、糖尿病、食物吸收(food absorption)、食物感受、进食障碍)以及调控诸如GLUT2、缩胆囊素等的相关激素和肽的化合物的鉴别。

发明概述

为此，本发明涉及特异性结合和/或活化T2R家族中全部23个人味觉受体(特别是hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76)的配体的发现。

这些发现是使用基于细胞的测定获得的，所述测定使用表达特定T2R的细胞在存在和不存在特定的苦味配体的条件下下测量T2R活性。特别地，如下文更详细的描述，在其表面表达上述鉴别的特定的T2R并且进一步表达功能上偶联至所述T2R的嵌合G蛋白的HEK细胞系用于检测细胞内钙浓度变化的基于细胞的测定，并且发现所述HEK细胞系被特定的苦味化合物特异性活化而其他hT2R在相似条件下没有被活化。

因此，本发明涵盖这些人味觉受体在鉴别化合物的测定(优选高通量测定)中的用途，所述化合物调节(优选阻断)这些和其他苦味化合物活化这些受体。

另外，本发明涉及使用这些受体鉴别引起苦味的化合物。

此外，本发明涉及主题T2R和相应的多肽以及表达它们的细胞在治疗剂筛选测定中的用途，例如用于鉴别调控或调节胃肠功能例如食物和营养感受、食物吸收、消化激素和肽的调控、对毒素的响应的化合物，和用于治疗胃肠或代谢疾病，如肥胖、糖尿病和炎性或自身免疫胃肠疾病，例如IBD、乳糜泻、克罗恩病等。

本发明还涵盖包括附加步骤的测定，所述附加步骤评估鉴别的调节化合物在人或其他味觉测试中的效应，并且评估鉴别的化合物对苦味味觉和/或在进一步的体外或体内临床测试中的效应，以评估鉴别的化合物对特定的胃肠、消化或代谢功能或疾病的效应。另外，本发明涵盖鉴别的化合物在食品、饮料和药物中作为风味或味觉调节剂，即抑制苦味，例如与特定的饮料和食品或药物有关的苦味的用途。此外，本发明涵盖已经被处理以去除特异性活化苦味受体的化合物的食品、饮料和药物的生产，例如已被加工以除去或减少其中含有的苦味化合物的量的食品和饮料。更进一步，本发明涵盖含有鉴别的化合物的适于治疗或预防涉及T2R的代谢病症、消化功能和胃肠疾病的药物。特别地，本发明预期了用于治疗或调节以下病况的药物，例如克罗恩病、乳糜泻、肥胖、糖尿病、食物感受、食物吸收、消化激素或肽的分泌等。

发明目的

本发明的一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节至少一种选自hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76的hT2R或其片段、变体、直向同源物或嵌合体被苦味配体的活化，所述苦味配体包括本文公开的被发现特异性结合和活化这些人苦味受体的特定的苦味配体。

本发明的一个特定的目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R1或其片段、变体或嵌合体被至少一种以下物质的活化和/或结合：氯霉素、氯喹、环辛酮、地塞米松、盐酸地尔硫卓、银杏苦内酯A、洛美沙星、N-甲基硫脲、硝基糖精(nitrosaccharin)、甲基强的松、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁(oxybutynin chloride)、奥芬溴铵(oxyphenomium HBr)、肽-LPFNQL、肽-LPFSQL、肽-YQEPVLGPVRGVRGPFPIIV、肽PVLGPVRGFPIIV、肽PVRGPFPIIV、肽RGPFPIIV、苦味酸、强的松、奎宁、磺胺甲噁唑、N-硫代乙酰苯胺、对称二苯硫脲和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个特定的目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R3或其片段、直向同源物、变体或嵌合体被至少一种以下的物质的活化和/或结合：2’乙酰吡嗪、氯喹或洛美沙星或其他结构上相关的和苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R4被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：4-苄基哌啶、氯喹、盐酸地尔硫卓、二异丁胺、2，6-二甲基哌啶、多塞平(doxepin)、盐酸拉贝洛尔、(-)羽扇豆宁、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、二盐酸哌仑西平、普鲁卡因胺、奎宁、雷尼替丁、马钱子碱、可可碱、苯甲唑啉(tolazoline)、三甲氧苄二氨嘧啶和L-色氨酸和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R5被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：二甲双胍、1-甲基-2-喹啉酮、橄榄苦苷和2-甲基吡啶和其他结构上相关的和苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R7被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、氯喹、乙基吡嗪、1-甲基-2-喹啉酮、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、2-甲基吡啶、二盐酸哌仑西平、奎宁、马钱子碱、三甲氧苄二氨嘧啶和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R8被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：乙酰舒泛K、2-乙酰吡嗪、芦荟素、穿心莲内酯、阿托品、氯霉素、环己酰亚胺、环辛酮、苯甲酸地那铵、地塞米松、盐酸地尔硫卓、马来酸依那普利、(-)红霉素、乙基吡嗪、法莫替丁、加巴喷丁、银杏苦内酯A、甲状腺肿素(goitrin)、愈创木酚甘油醚(guaiacolglyceryl ether)、洛美沙星、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、硝基萘(nitrophthalene)、硝基糖精、橄榄苦苷、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、N′-乙基-N′-苯脲、苦味酸、二盐酸哌仑西平、强的松、奎纳克林、雷尼替丁、糖精、八乙酸蔗糖酯、马钱子碱、甲苯基脲和三甲氧苄二氨嘧啶和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R9被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：乙基吡嗪、氧氟沙星和雷尼替丁和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个特定的目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R10被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、穿心莲内酯、阿托品、番木鳖碱(brucine)、4-苄基哌啶、咖啡因、氯霉素、氯喹、辛可宁、克拉霉素、克林霉素、环己酰亚胺、环辛酮、苯甲酸地那铵、地塞米松、盐酸地尔硫卓、二异丁胺、2，6-二甲基哌啶、多塞平、腾喜龙(edrophonium)、(-)-红霉素、乙基吡嗪、法莫替丁、加巴喷丁、银杏苦内酯A、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、(-)-羽扇豆宁、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、普鲁卡因胺、强的松、苦木素、奎纳克林、奎宁、雷尼替丁、五水合硫酸司巴丁(sparteinsulfate pentahydrate)、八乙酸蔗糖酯、马钱子碱、苯甲唑啉、甲苯基脲、曲匹地尔和三甲氧苄二氨嘧啶、氯化物和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R13被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、阿托品、克拉霉素、苯甲酸地那铵、多塞平、乙基吡嗪、橄榄苦苷、奥芬溴铵和奎纳克林和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R14被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、马兜铃酸(arisolochic acid)、环辛酮、地塞米松、盐酸地尔硫卓、2，6-二甲基哌啶、红霉素、乙基吡嗪、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、硝基萘、硝基糖精、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、N′-乙基-N′-苯脲、2-甲基吡啶、苦味酸、奎宁、马钱子碱、可可碱、甲苯基脲和曲匹地尔和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R16被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、苦杏仁苷(amygadalin)、熊果苷、亚麻苦苷和D-(-)-水杨苷和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R44被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R50被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪或乙基吡嗪或其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R54被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：对乙酰氨基酚、氯喹、克拉霉素、苯甲酸地那铵、(-)-表儿茶素、(-)-红霉素、盐酸拉贝洛尔、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、二盐酸哌仑西平、普鲁卡因胺、雷尼替丁、马钱子碱、三甲氧苄二氨嘧啶和L-色氨酸和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R55被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：多塞平、亚麻苦苷、氯化羟丁宁、奎宁、马钱子碱和三甲氧苄二氨嘧啶和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R61被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：乙酰舒泛K、芦荟素、马兜铃酸、咖啡因、氯霉素、氯喹、苯甲酸地那铵、氯化硝基羟丁宁(nitrooxybutinin chloride)、奥芬铵(oxyphenonium)、肽-LPFNQL、肽-LPFSQL、苦味酸、糖精和马钱子碱和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R64被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：乙酰舒泛K、氨基-2-降莰烷-羧酸、马兜铃酸、2，6-二甲基哌啶、奎宁、雷尼替丁、糖精、马钱子碱和L-色氨酸和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R65被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、乙基吡嗪和1-甲基-2-喹啉酮和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物阻断或调节hT2R67被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：2-乙酰吡嗪、穿心莲内酯、乙基吡嗪和氯化羟丁宁和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R71被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：硝基糖精和苦味酸和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R75被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：穿心莲内酯、阿托品、番木鳖碱、4-苄基哌啶、咖啡因、氯霉素、氯喹、辛可宁、环丙沙星、苯甲酸地那铵、地塞米松、多塞平、马来酸依那普利、依诺沙星、强的松、普鲁卡因胺、苦木素、奎宁、雷尼替丁、五水合硫酸司巴丁、马钱子碱、磺胺甲噁唑、曲匹地尔和三甲氧苄二氨嘧啶和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的另一个目的是提供鉴别化合物的测定，所述化合物活化或者阻断或调节hT2R76被选自以下的至少一种化合物的活化和/或结合：番木鳖碱和其他结构上相关的或苦味的化合物。

本发明的一个特定的目的是在测定中使用含有或表达(稳定地或瞬时地)hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76中的至少一种或其片段、变体、直向同源物、突变体或嵌合体的细胞或细胞膜以鉴别化合物，所述化合物活化或者阻断或调节至少一种所述受体被以上鉴别的苦味的化合物之一或其他结构上相关的或苦味的化合物的活化。

本发明的一个更加特定的目的是将表达偶联至其的G蛋白(例如G_α15、G₁₆、味转导素或其嵌合体，例如G_α16味转导素或转导蛋白嵌合G蛋白)的细胞(优选哺乳动物、两栖动物或昆虫细胞，例如HEK293T细胞)用于基于细胞的测定，所述测定检测细胞内钙的变化以(orderto)检测化合物，所述化合物活化或调节(优选阻断或抑制)以上提及的人味觉受体之一被以上提及的苦味化合物之一或其他结构上相关的或苦味的化合物的活化。

本发明的另一个目的是确认鉴别的化合物在人或动物味觉测试(优选人味觉测试)中调节(优选抑制或阻断)苦味，例如由以上鉴别的苦味化合物或其他结构上相关的苦味化合物引起的苦味。

本发明的另一个目的是将在本文描述的测定中鉴别的化合物用作组合物中的添加剂或风味调节剂，从而抑制或阻断由特异性活化这些味觉受体的化合物引起的苦味。本发明的一个优选目的是使用抑制至少一种以上鉴别的人T2R受体的活化的化合物以阻断存在于一些食品、饮料、化妆品和药物中的化合物的苦味。

附图详述

图1含有比较不同的组使用的人苦味受体(hT2R)的命名的表。

图2含有列出钙成像实验(calcium imaging experiments)结果的表，所述实验鉴别结合和特异性活化其中鉴别的hT2R的特定的苦味配体。

图3含有归纳了钙成像测定中检验的特定苦味配体以及使用的浓度的表，钙成像测定结果归纳于图2。

图4使用苦味配体氧氟沙星在HEK-293细胞中比较了2个不同的hT2R9等位基因(hT2R9A和hT2R9V)的功能活性。

图5使用包含SSTR标记和瞬时转染的细胞的不同表达系统比较了相同的2个hT2R9等位基因的功能活性，并且使用FLIPR和不同的苦味配体(雷尼替丁)检测hT2R9的活性。

发明详述

具体描述本发明前，提供以下定义。

术语“T2R”家族包括多态变体、等位基因、突变体和同源物，其：(1)与下文和Zuker(Id)(2001)和Adler(Id.)(2001)申请(通过引用并入本文)中公开的T2R在约25个氨基酸(最佳地50-100个氨基酸)的窗口上具有约30-40％的氨基酸序列同一性，更特别地约40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的氨基酸序列同一性；(2)特异性结合于产生的抗免疫原的抗体，所述免疫原含有选自由下文公开的T2R序列和其保守修饰变体组成的组的氨基酸序列；(3)在严格杂交条件下特异性杂交(具有至少约100个，任选地至少约500-1000个核苷酸的大小)于选自由下文公开的T2R DNA序列和其保守修饰变体组成的组的序列；(4)含有与选自由下文公开的T2R氨基酸序列组成的组的氨基酸序列具有至少约40％同一性的序列或(5)通过在严格杂交条件下特异性杂交于描述的T2R序列的引物扩增。

特别地，这些“T2R”包括具有本申请提供的核酸序列和氨基酸序列的在本文中被称为hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9A、hT2R9V、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76的味觉受体GPCR和其特异性结合于本文鉴别的苦味配体和其他结构上相关的化合物和苦味化合物的变体、等位基因、突变体、直向同源物和嵌合体。

如图1的表所示，本文的hT2R在文献中也被称为其他名字。本文中当申请人提及T2R序列，意为Senomyx命名。

尽管T2R基因在蛋白质和DNA两种水平上显示出相当的序列分歧，但是已发现至今分离的所有T2R在特定的区域中含有某些共有序列，所述共有序列是同一的或与之前在Adler等人(WO 01/77676 A1(2001)和Zuker等人WO 01/18050 A2(两者以其全部内容通过引用并入本文)中鉴别的T2R共有序列具有至少70-75％的序列同一性。

从拓扑学上说，某些化学感受GPCR具有“N末端结构域”、“胞外结构域”、含有七个跨膜区的“跨膜结构域”和相应的胞质和胞外环，“胞质区”和“C末端区”(参见例如Hoon等人，Cell，96：541-51(1999)；Buck & Axel，Cell，65：175-87(1991))。使用本领域技术人员所知的方法可在结构上鉴别这些区域，所述方法如鉴别疏水和亲水结构域的序列分析程序(参见例如Stryer，Biochemistry(生物化学)(第三版1988)；还参见许多基于互联网的序列分析程序中的任何一个，例如发现于dot.imgen.bcm.tmc.edu的序列分析程序)。这些区域可用于制备嵌合蛋白并可用于本发明的体外测定，例如配体结合测定。例如，嵌合T2R可通过组合一个T2R的胞外区和相同或不同种类的另一个T2R的跨膜区来制备。

因此，“胞外结构域”指从细胞膜突出并且暴露于细胞的胞外面的T2R多肽结构域。此类区域将包括暴露于细胞的胞外面的“N末端结构域”，以及暴露于细胞的胞外面的跨膜结构域的胞外环，即跨膜区2和3之间、跨膜区4和5之间和跨膜区6和7之间的胞外环。“N末端结构域”起始于N末端并延伸至接近跨膜区起始点的区域。这些胞外区用于可溶相和固相的体外配体结合测定。此外，以下描述的跨膜区还可以与胞外区组合地或单独地参与配体结合，并因此也用于体外配体结合测定。

本文的“T2R表达细胞”包括表达依据本发明的人T2R序列的重组细胞和表达内源T2R的细胞。此类细胞包含于舌和胃肠系统，并且包括口腔中的细胞(例如舌上表达的味蕾)以及胃肠系统和相关器官的细胞，例如胃肠道中的刷细胞、肠内分泌细胞(例如STC-1细胞)。这些细胞还可表达G蛋白，例如味转导素、转导蛋白、Gα15或Gα16。表达特定的T2R的细胞可通过已知方法鉴别并分离，例如通过磁珠细胞分离技术的FACS细胞分离。

包括七个跨膜“区”的“跨膜结构域”指存在于质膜内的T2R多肽的结构域，并且还可包括相应的胞质(细胞内)和胞外环，也称为跨膜“区”。使用标准方法可鉴别所述七个跨膜区以及胞外和胞质环，参见Kyte & Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-32(1982))，或Stryer，见上。

“胞质结构域”指面对细胞内部的T2R蛋白质的结构域，例如“C末端结构域”和跨膜结构域的胞内环，例如跨膜区1和2之间、跨膜区3和4之间和跨膜区5和6之间的胞内环。“C末端结构域”指从最后的跨膜区的末端跨越至蛋白质的C末端的区域，并且其通常位于胞质内。

术语“7跨膜受体”指属于具有跨越所述质膜七次的七个区域(因此，所述七个区域称为“跨膜”或“TM”结构域TM I至TM VII)的跨膜蛋白质超家族的多肽。嗅觉和某些味觉受体的家族各自属于这一超家族。如以下进一步详述，7跨膜受体多肽具有相似的和特征性的一级、二级和三级结构。

术语“配体结合区”指源自基本掺入跨膜结构域II至VII(TM II至VII)的化学感受或味觉受体的序列。所述区域能够结合配体，并且更特别地结合引起味觉的化合物。

术语“质膜易位结构域(plasma membrane translocationdomain)”或简单地“易位结构域”指当掺入多肽编码序列的氨基末端时，能够十分有效地将杂种(“融合”)蛋白“伴随(chaperone)”或“易位”至细胞质膜的多肽结构域。例如，可以使用最初源自人视紫红质受体多肽(一种7跨膜受体)的氨基末端的特定“易位结构域”。另一种易位结构域源自牛视紫红质序列并且也用于促进易位。源自视紫红质的序列在7跨膜融合蛋白向质膜的易位中特别有效。

“功能等效性(Functional equivalency)”指在相似条件下，结构域将新翻译的蛋白质易位至质膜的能力和效率与示例的易位结构域(例如源自视紫红质的易位结构域)一样有效；如本文所述，可测量(以量化形式)和比较相对效率。属于本发明范围的结构域可通过以下的常规筛选确定：它们将新合成的多肽易位至细胞(哺乳动物、爪蟾(Xenopus)等)质膜的效率与二十个氨基酸长的易位结构域SEQ ID NO：1相同。

在用于检测调节T2R家族成员介导的味觉转导的化合物的测定的环境中，短语“功能效应”，包括确定间接或直接受受体影响的任何参数，例如功能、物理和化学效应。其包括体外、体内和离体(ex vivo)的配体结合、离子流的变化、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、信号转导、受体-配体相互作用、第二信使浓度(例如cAMP、cGMP、IP3或胞内Ca²⁺)，还包括其他生理学效应，例如神经递质或激素释放的增加或减少。

“确定功能效应”指针对增加或减少间接或直接受T2R家族成员影响的参数，例如功能、物理和化学效应的化合物的测定。此类功能效应可通过本领域技术人员所知的任何方法测量，例如光谱特征(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解特性的变化、膜片钳术、电压敏感染料、全细胞电流、放射性同位素流出、诱导型标记、卵母细胞T2R基因的表达；组织培养细胞T2R的表达；T2R基因的转录激活；配体结合测定；电压、膜电位和电导的变化；离子流测定；胞内第二信使(例如cAMP、cGMP和肌醇三磷酸(IP3))的变化；胞内钙水平的变化；神经递质释放等。

可互换使用T2R蛋白质受体的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”以指使用体外和体内味觉转导测定鉴别的抑制、活化或调节分子，例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源物和模拟物。抑制剂是例如结合以部分或完全阻断刺激，降低、防止、延迟活化，灭活、脱敏或下调味觉转导的化合物，例如拮抗剂。活化剂是例如结合以刺激、增加、打开、活化、促进、增强活化作用，敏化或上调味觉转导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如改变受体与以下物质的相互作用的化合物：结合活化剂或抑制剂的细胞外蛋白质(例如ebnerin和疏水载体家族的其他成员)；G蛋白；激酶(例如参与受体的钝化和脱敏的视紫红质激酶和β肾上腺素能受体激酶的同源物)；以及也钝化和脱敏受体的抑制蛋白(arrestin)。调节剂包括例如具有改变的活性的T2R家族成员的遗传修饰形式以及天然存在的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。

抑制剂和活化剂的此类测定包括，例如在细胞或细胞膜中表达T2R家族成员，在存在或不存在调节的化合物例如苦味化合物下应用假定的调节剂化合物，然后确定对味觉转导的功能效应，如上文所述。将含有用潜在的活化剂、抑制剂或调节剂处理的T2R家族成员的样品或测定与没有所述抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品比较，从而检测调节的程度。对照样品(未用调节剂处理)的相对T2R活性值被指定为100％。当相对于对照的T2R活性值为约80％，任选地50％或25-0％时，实现对T2R的抑制。当相对于对照的T2R活性值为110％、任选地150％、任选地200-500％或1000-3000％更高时，实现T2R的活化。

如本文所用，术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”指没有其他的不同化合物的状态，在自然状态下本发明的化合物通常与所述不同化合物联合(associate)。优选地，“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”指组合物含有按重量计至少0.5％、1％、5％、10％或20％，以及最优选地至少50％或75％的给定样品的质量(mass)。在一个优选的实施方案中，这些术语指本发明的化合物含有按重量计至少95％的给定样品的质量。如本文所用，当指核酸或蛋白质时，术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”的核酸或蛋白质还指不同于天然存在于哺乳动物(特别是人)体内的纯化或浓缩的状态。超过天然存在于哺乳动物(特别是人)体内的任何程度的纯化或浓缩，包括(1)从其他联合的结构或化合物纯化或(2)与它在哺乳动物(特别是人)体内通常不联合的结构或化合物联合，均属于“分离的”的含义。根据本领域技术人员所知的多种方法和技术，本文描述的核酸或蛋白质或者所述类别的核酸或蛋白质可被分离，或另外与它们在天然状态下通常不联合的结构或化合物联合。

如本文所用，当指核酸或多肽时，术语“分离的”指不同于天然存在于哺乳动物(特别是人)体内的纯化或浓缩的状态。超过天然存在于体内的任何程度的纯化或浓缩，包括(1)从其他天然存在的联合的结构或化合物纯化或(2)与它在体内通常不联合的结构或化合物联合，均属于本文所用的“分离的”的含义。根据本领域技术人员所知的多种方法和技术，本文描述的核酸或多肽可被分离，或另外与它们在天然状态下通常不联合的结构或化合物联合。

如本文所用，术语“扩增的”和“扩增”指使用任何合适的扩增方法，产生或检测重组或天然表达的核酸，如在下文中所详细描述。例如，本发明提供了体内或体外扩增(例如通过聚合酶链式反应，PCR)本发明的天然表达(例如基因组或mRNA)的或重组(例如cDNA)的核酸(例如本发明的味觉引起化合物的结合序列)的方法和试剂(例如特异性寡核苷酸引物对)。

术语“表达载体”指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中、体外或体内组成型地或诱导型地表达本发明的核酸序列目的的任何重组表达系统。所述术语包括线性或环形表达系统。所述术语包括保持游离或整合入宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有自我复制的能力或者没有该能力，即在细胞中仅驱动瞬时表达。所述术语包括仅含有重组核酸转录所需的最少元件的重组表达盒。

术语“文库”指其为不同核酸或多肽分子的混合物的制品，例如通过用简并引物对扩增核酸产生的重组产生的感觉(特别是味觉)受体配体结合区的文库，或整合了扩增的配体结合区的载体的分离的集合(collection)，或各自用编码味觉受体的至少一种载体随机转染的细胞的混合物。

术语“核酸”或“核酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。所述术语还包括具有合成主链的核酸样结构。

除非另外指出，特定核酸序列还暗示包括其保守修饰变体(例如简并密码子置换)和互补序列以及明确表示的序列。具体地，简并密码子置换可通过产生例如其中一个或多个选择的密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人，NucleicAcid Res.，19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，260：2605-08(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。

本文中可互换使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”以指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

本文描述的“易位结构域”、“配体结合区”和嵌合受体组合物还包括具有与示例序列基本相当的结构和活性的“类似物”或“保守变体”和“模拟物”(“肽模拟物”)。因此，术语“保守变体”或“类似物”或“模拟物”指具有修饰的氨基酸序列的多肽，且所述变化基本没有改变多肽的(保守变体的)结构和/或活性，如本文所定义。这些包括氨基酸序列的保守修饰变化，即对蛋白质活性并非至关重要的那些残基的氨基酸置换、添加或缺失，或者用具有相似性质(例如酸性、碱性、带正或负电荷、极性或非极性等)的残基置换氨基酸，以使即使置换重要的氨基酸也基本不改变结构和/或活性。

更特别地，“保守修饰变体”用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰变体指编码同一的或基本同一的氨基酸序列的那些核酸，或如果核酸不编码氨基酸序列，指基本同一的序列。由于遗传密码的简并性，因此大量功能同一的核酸编码任何给定的蛋白质。

例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码氨基酸丙氨酸。因此，在被密码子确定为丙氨酸的每个位置，所述密码子可改变为所述的任何相应的密码子而不改变编码的多肽。

此类核酸变化是“沉默变化”，其是保守修饰变化的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了所述核酸的各种可能的沉默变化。技术人员应理解，可以修饰核酸中的各密码子(除了ATG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能同一的分子。因此，编码多肽的核酸的各种沉默变化暗含于每个描述的序列中。

提供功能相似的氨基酸的保守置换表为本领域所熟知。例如，选择保守置换物的一个示例性指导原则包括(原始残基在前，示例性置换在后)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。一个可选的示例性指导原则使用以下六组，每组含有彼此为保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(还参见例如Creighton，Proteins(蛋白质)，W.H.Freeman and Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure(蛋白质结构原理)，Springer-Verlag(1979))。本领域技术人员应理解，以上提到的置换不是唯一可能的保守置换。例如出于一些目的，技术人员可以把所有的带电氨基酸看作彼此的保守置换物，不论它们是正电还是负电。此外，在编码序列中改变、添加或缺失单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别置换、缺失或添加也可被认为是“保守修饰变化”。

术语“模拟物”和“肽模拟物”指具有与多肽基本相同的结构和/或功能特征的合成化合物，例如本发明的易位结构域、配体结合区或嵌合受体。所述模拟物可以完全地由氨基酸的合成的非天然类似物组成，或可以是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。所述模拟物还可以整合任何量的天然氨基酸保守置换，只要所述置换也基本没有改变所述模拟物的结构和/或活性。

对于其是保守变体的本发明的多肽，常规实验将确定模拟物是否属于本发明的范围，即其结构和/或功能基本没有改变。多肽模拟物组合物可包含非天然结构组分的任何组合，其通常来自三种结构组：a)除了天然酰胺键(″肽键″)连接以外的残基连接组；b)非天然残基取代天然存在的氨基酸残基；或c)诱导二级结构模拟的残基，即诱导或稳定二级结构，例如β转角、γ转角、β片层、α螺旋构象等。当多肽的所有或一些残基通过除了天然肽键外的化学方式连接时，所述多肽即可被表征为模拟物。个别肽模拟物残基可通过肽键、其他化学键或偶联方式连接，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可代替常规酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，例如酮亚甲基(例如--C(.＝O)--CH₂替代--C(.＝O)--NH--)、氨基亚甲基(CH₂NH)、亚乙基、烯烃(olefin)(CH.dbd.CH)、醚(CH₂O)、硫醚(CH₂--S)、四唑(CN₄)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见例如Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，第7卷，267-357，Marcell Dekker，Peptide BackboneModifications，NY(1983))。含有所有或一些非天然残基置换天然存在的氨基酸残基的多肽也可被表征为模拟物；非天然残基在科学和专利文献中已有详尽的描述。

“标记”或“可检测部分”是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法可检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如ELISA中通常使用的)、生物素、地高辛配基或半抗原以及可通过例如向所述肽掺入放射性标记变得可检测的或可用于检测与所述肽特异性反应的抗体的蛋白质。

“标记的核酸探针或寡核苷酸”是通过连接体或化学键共价地或通过离子键、范德华键、静电键或氢键非共价地结合于标记，从而可通过检测结合于所述探针的标记的存在来检测所述探针的存在的核酸探针或寡核苷酸。

如本文所用，将“核酸探针或寡核苷酸”定义为能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对，通常通过氢键形成结合至互补序列的靶核酸的核酸。如本文所用，探针可包括天然(即A、G、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。此外，探针的碱基可通过除磷酸二酯键以外的键来连接，只要其不干扰杂交。因此，例如探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键来连接。本领域技术人员应理解，取决于杂交条件的严格性，探针可结合与所述探针序列缺乏完全互补性的靶序列。所述探针任选地诸如用同位素、发色团、发光团、色原直接标记，或诸如用生物素(链霉亲和素复合物稍后可与其结合)间接标记。通过测定是否存在所述探针，技术人员可检测是否存在所述选择的序列或子序列。

当用于指核酸的部分时，术语“异源的”表示所述核酸含有两个或多个子序列，所述子序列在天然状态下未发现彼此位于相同的关系。例如，所述核酸通常是重组制备的，使来自不相关的基因的两个或多个序列排列起来以产生新的功能性核酸，例如启动子来自一个来源并且编码区来自另一个来源。类似地，异源蛋白质表示所述蛋白质含有两个或多个子序列，所述子序列在天然状态下未发现彼此位于相同的关系(例如融合蛋白)。

“启动子”定义为指导核酸转录的一串核酸序列。如本文所用，启动子包括接近转录起始位点的必要核酸序列，例如就聚合酶II型启动子来说的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，其可位于距转录起始位点多达数千碱基对的远处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育的条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育的调控下具有活性的启动子。术语“可操作地连接”指核酸表达控制序列(例如启动子或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述第二序列的核酸的转录。

如本文所用，“重组”指合成的或另外地在体外操作的多核苷酸(例如“重组多核苷酸”)，指使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统中产生基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组方法”还包括将具有来自不同来源的多种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接入表达盒或载体，所述表达盒或载体用于表达，例如诱导型或组成型表达含有本发明的易位结构域的融合蛋白和使用本发明的引物扩增的核酸序列。

短语“选择性(或特异性)杂交于”指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与所述核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。

短语“严格杂交条件”指这样的条件，在该条件下探针与通常在核酸的复杂混合物中的其靶子序列杂交而不与其他序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境中将是不同的。较长的序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导参见Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes，″Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid assays″(1993)。通常，严格条件选择为比所述特异性序列在指定的离子强度pH下的热解链温度(Tm)低约5-10℃。所述Tm是在该温度下平衡时50％的与所述靶互补的探针杂交于所述靶序列的温度(在确定的离子强度、pH和核浓度)(由于靶序列过量存在，在Tm下平衡时50％的探针被占据)。严格条件将是以下的条件：其中盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH 7.0至8.3，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，并且对于长探针(例如超过50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件还可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为至少两倍的背景，任选地10倍的背景杂交。示例性的严格杂交条件可如下：50％甲酰胺，5xSSC和1％SDS，在42℃下温育或5xSSC，1％SDS，在65℃下温育，用0.2xSSC和0.1％SDS在65℃洗涤。此类杂交和洗涤步骤可执行例如，1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。

在严格条件下彼此不杂交的核酸，如果它们编码的多肽是大体相关的，则它们仍是大体相关的。这发生于例如当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性制备核酸副本时。在此类情况下，所述核酸通常在中度严格杂交条件下杂交。示例的“中度严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下杂交，并且用1xSSC在45℃下洗涤。此类杂交和洗涤步骤可执行例如，1、2、5、10、15、30、60或更多分钟。阳性杂交为至少两倍的背景。普通技术人员将易于理解，可选择的杂交和洗涤条件可用于提供相似严格性的条件。

“抗体”指含有来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及大量的免疫球蛋白可变区基因。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其转而分别定义免疫球蛋白的类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

示例的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”(约50-70kDa)链。每条链的N末端确定一个主要负责抗原识别的约100至110或更多的氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、取代或交换，以便将抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变的类型、效应子功能和/或种类的恒定区或赋予嵌合抗体新的性质的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换。

“抗T2R”抗体是特异性结合由T2R基因、其cDNA或子序列编码的多肽的抗体或抗体片段。

术语“免疫测定”是使用抗体以特异性结合抗原的测定。免疫测定的特征在于使用特定抗体的特异性结合性质分离、靶向和/或定量抗原。

当指蛋白质或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”于抗体或“与...特异性(或选择性)免疫反应”指确定所述蛋白质在蛋白质和其他生物产品的异源群体中的存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，所述指定的抗体与特定蛋白质的结合为背景的至少两倍，并且其基本不以显著的量结合于所述样品中存在的其他蛋白质。在此类条件下对抗体的特异性结合可能需要就其对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。

例如，可选择针对来自特定的物种(例如大鼠、小鼠或人)的T2R家族成员产生的多克隆抗体以获得仅与所述T2R多肽或其免疫原性部分特异性免疫反应而不与其他蛋白质(所述T2R多肽的直向同源物或多态变体和等位基因除外)免疫反应的那些多克隆抗体。此选择可通过除去与来自其他物种的T2R分子或其他T2R分子交叉反应的抗体实现。还可选择只识别T2R GPCR家族成员但不识别来自其他家族的GPCR的抗体。可使用多种免疫测定形式选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(对于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的说明，参见例如Harlow & Lane，Antibodies，A LaboratoryManual，(1988))。典型地，特异性或选择性反应将为至少两倍的背景信号或噪声，并且更加典型地多于10至100倍背景。

短语“与...选择性联合”指核酸与另一个核酸“选择性杂交”(如上文所定义)的能力，或抗体与蛋白质“选择性(或特异性)结合”(如上文所定义)的能力。

术语“表达载体”指用于在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中，体外或体内、组成型地或诱导型地表达本发明的核酸序列目的的任何重组表达系统。所述术语包括线性或环形表达系统。所述术语包括保持游离或整合入宿主细胞基因组的表达系统。所述表达系统可具有自我复制的能力或者没有该能力，即在细胞中仅驱动瞬时的表达。所述术语包括仅含有重组核酸转录所需的最少元件的重组表达盒。

“宿主细胞”指含有表达载体并且支持所述表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母，昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞，例如CHO、HeLa、HEK-293等，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。

基于上文，本发明提供鉴别化合物的测定，所述化合物调节(优选阻断)先前鉴别的人苦味受体被苦味化合物(例如图2和3鉴别的苦味化合物和结构上相关的和其他的苦味化合物)的特异性活化。特别地，本发明提供鉴别化合物的基于细胞的测定，所述化合物调节(例如阻断)hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75、hT2R76被图2中鉴别的显示活化这些特异性味觉受体的苦味配体之一或其他结构上相关的或另外的苦味化合物的活化。这些化合物将在人受试者中调节与这些味觉受体相关的苦味。这将在味觉测试中确认。

以上味觉受体特异性响应图2包含的至少一种苦味配体是通过使用HEK-293表达系统和钙成像方法来基本确定的，所述HEK-293表达系统和钙成像方法报道于其他出版物和本代理人提交的专利申请，例如美国序列号10/191,058和09/825,882，两者以其全部内容通过引用并入本文。更特别地，本发明人用视紫红质35氨基酸标签(SEQ IDNO：1)标记的特定hT2R和嵌合G蛋白(G16gust44)一起转染HEK-293细胞，其中所述嵌合G蛋白含有通过用味转导素的相应残基取代其羧基-44氨基酸残基进行修饰的G_α16 G蛋白序列，并且通过钙成像方法记录这些细胞对特定的苦味配体的响应。

具体地，本发明人使用基于哺乳动物细胞的测定监测hT2R活性。对于钙成像测定，将细胞接种于48孔组织培养板。24小时后，所述细胞用含有hT2R核酸序列的表达质粒(pEAK10)和含有嵌合G蛋白(G16gust44)的质粒(pEAK10)瞬时转染。另外24小时后，所述细胞用钙特异性荧光染料(Fluo-4；Molecular Probes)温育。使所述装载的细胞暴露于不同的苦味分子，并且hT2R的活化导致G16gust44的活化，其转而导致钙在细胞内部的转移。钙浓度的这一增加改变了细胞内部钙染料的荧光性质。这些变化使用荧光显微术监测。

本发明人还使用自动化荧光测定瞄准系统(automatedfluorimetric aiming system)FLIPR，方案略有不同。稳定表达G16gust44的HEK-293细胞系用hT2R表达质粒转染，24小时后装载细胞并在FLIPR上对其进行分析。

鉴别特定hT2R的配体后，制备稳定表达hT2R和G16gust44二者的HEK-293细胞系以促进将来鉴别其他配体的筛选测定，所述其他配体活化所述特定的hT2R或调节(阻断或增强)此hT2R被另一个苦味配体(诸如图2中鉴别的化合物)的活化。这避免了对瞬时转染的需求。

如附图所示，此类实验鉴别23个不同hT2R的配体-受体对。发现大多数测试的苦味分子活化超过1种hT2R，并且还发现大多数hT2R被广泛地“调整”以响应结构多样的苦味分子。如所提到的，图3包含所有鉴别的苦味配体和它们在钙成像测定中测试的浓度。此外，图4和5表明不同的T2R等位基因可不同地响应苦味配体并且所述等位基因变体可影响不同个体中的苦味和/或其它T2R相关的活性(取决于个体所表达的T2R等位基因)。

这些结果表明功能性表达任何一种鉴别的hT2R味觉受体的细胞可用于鉴别配体的测定，所述配体调节与至少一种所述的特定hT2R相关的苦味。

优选地，这些测定将利用表达编码hT2R的DNA的测试细胞，所述hT2R具有下文鉴别的氨基酸序列之一。然而预期，保留这些苦味受体的功能性质(即响应一些苦味化合物)的这些受体多肽的片段、直向同源物、变体或嵌合体也可用于这些测定。此类变体的实例包括通过重组或化学方法产生的或天然存在的剪接变体、单核苷酸多态性、等位基因变体和突变。以下列出分离和表达T2R的方法，所述方法用于本发明的测定和预期用于本发明的鉴别抑制这些受体活化的化合物的测定。

T2R的分离和表达

本发明的T2R或其片段或变体的分离和表达可通过成熟的克隆程序，使用基于本申请公开的T2R核酸序列构建的探针或引物来实现。相关的T2R序列也可以使用本文公开的序列和已知的基于计算机的搜索技术(例如BLAST序列搜索)从人或其他物种的基因组数据库中鉴别。在一个特定的实施方案中，本文公开的假基因可用于鉴别功能等位基因或相关的基因。

然后表达载体可用于感染或转染宿主细胞以功能性表达这些序列。这些基因和载体可在体外或体内制备并表达。技术人员应理解，改变并控制核酸表达的期望的表型可通过调节本发明的载体中所述基因和核酸(例如启动子、增强子以及类似核酸)的表达或活性来获得。可使用用于增加或降低表达或活性的任何已知方法。本发明可与本领域已知的任何方法或方案一起实施，所述方法或方案在科学和专利文献中详细描述。

可选择地，这些核酸可通过熟知的化学合成技术在体外合成，参见例如Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-18(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.，105：661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.25：3440-3444(1997)；Frenkel，Free Radic.Biol.Med.19：373-380(1995)；Blommers，Biochemistry33：7886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.68：90(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68：109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.22：1859(1981)；美国专利第4,458,066号。然后，双链DNA片段可通过合成互补链并在合适条件下将所述链退火到一起来获得，或可通过使用DNA聚合酶和合适的引物序列添加互补链来获得。

用于操作核酸(诸如，例如用于产生序列的突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交等)的技术在科学和专利文献中已详细描述。参见例如Sambrook编，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Ausubel编，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；Tijssen编，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology：Hybridization With NucleicAcid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Elsevier，N.Y.(1993)。

核酸、载体、衣壳(capsids)、多肽等可通过本领域技术人员熟知的许多一般方法中的任何一种来分析和定量。这些包括例如分析生物化学方法，例如NMR、分光光度法、射线照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)和超扩散色谱法(hyperdiffusion chromatography)，多种免疫学方法，例如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、Southern分析、Northern分析、点渍法分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信号的扩增方法，放射性标记、闪烁计数和亲和色谱。

寡核苷酸引物可用于扩增编码T2R配体结合区的核酸。本文描述的核酸还可使用扩增技术进行克隆或定量测量。扩增方法也为本领域所熟知，并且包括例如聚合酶链式反应(PCR)(Innis编，PCRProtocols，a Guide to Methods and Applications，Academic Press，N.Y.(1990)；Innis编，PCR Strategies，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995))；连接酶链式反应(LCR)(Wu，Genomics，4：560(1989)；Landegren，Science，241：1077(1988)；Barringer，Gene，89：117(1990))；转录扩增(Kwoh，PNAS，86：1173(1989))；自主序列复制(Guatelli，PNAS，87：1874(1990))；Q-β复制酶扩增(Smith，J.Clin.Microbiol.，35：1477-91(1997))；自动Q-β复制酶扩增测定(Burg，Mol.Cell.Probes，10：257-71(1996))；和其他RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)。还参见Berger，Methods Enzymol.，152：307-16(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利第4,683,195和4,683,202号；Sooknanan，Biotechnology，13：563-64(1995)。

扩增后，当需要时，可根据本领域已知的方法，使用常规的分子生物学方法将所述核酸单独地或作为文库克隆入多种载体中的任何一种；体外克隆扩增的核酸的方法参见例如美国专利第5,426,039号。为了促进扩增序列的克隆，可将限制性酶切位点“构建入”PCR引物对。例如，本发明的示例引物对设计了Pst I和Bsp E1位点。这些特定限制性位点具有当连接时，对于它们所剪接的7-膜受体“供体”编码序列是“符合读框的(in-frame)”序列(配体结合区编码序列位于7-膜多肽的内部，因此如果需要在限制性酶剪接位点的下游翻译构建体，应该避免不符合读框(out of frame)的结果；如果插入的配体结合区包含几乎大部分的跨膜VII区，这就可以不是必须的)。所述引物可设计为保留所述“供体”7-膜受体的原始序列。可选择地，所述引物可编码保守置换(例如疏水残基置换疏水残基，参见上文讨论)的或功能良性置换(例如不阻止质膜插入、引起肽酶的切割、引起受体的异常折叠等)的氨基酸残基。

所述引物对可设计为选择性地扩增T2R蛋白质的配体结合区。这些结合区可根据不同的配体变化；因此，一个配体的最小结合区可能对第二种潜在的配体是远远不够的。因此可扩增含有不同结构域结构的不同大小的结合区；例如7-跨膜T2R的跨膜(TM)结构域II至VII、III至VII、III至VI或II至VI，或其变体(例如，仅特定结构域的子序列，混合结构域的顺序等)。

由于已知许多7-膜T2R蛋白质的结构域结构和序列，熟练的技术人员可容易地选择结构域侧翼序列和内部结构域序列作为模式序列以设计简并扩增引物对。例如，编码结构域区II至VII的核酸序列可通过使用引物对PCR扩增产生。为了扩增含有跨膜结构域I(TM I)序列的核酸，可以从编码上文描述的T2R家族共有序列1的氨基酸序列的核酸设计简并引物。此简并引物可用于产生包括TM I至TM III、TM I至TM IV、TM I至TM V、TM I至TM VI或TM I至TM VII的结合区。其他简并引物可根据本文提供的其他T2R家族共有序列设计。此简并引物可用于产生包括TM III至TM IV、TM III至TM V、TM III至TMVI或TM III至TM VII的结合区。

设计简并引物对的范例为本领域所熟知。例如，共有-简并杂种寡核苷酸引物(COnsensus-DEgenerate Hybrid OligonucleotidePrimer，CODEHOP)策略计算机程序可从http://blocks.fhcrc.org/codehop.html访问，并且直接链接于用于从一组相关蛋白质序列(如已知的味觉受体配体结合区)开始预测杂种引物的BlockMaker多序列比对的网址(参见例如Rose，NucleicAcids Res.，26：1628-35(1998)；Singh，Biotechniques，24：318-19(1998))。

合成寡核苷酸引物对的方法为本领域所熟知。可使用“天然的”碱基对或合成的碱基对。例如，人工核苷碱基(nucleobase)的使用提供了一种通用的方法来操作引物序列并产生扩增产物的更加复杂的混合物。多个家族的人工核苷碱基能够通过内部键旋转而假设多种氢键键合方向(hydrogen bonding orientations)从而提供用于简并分子识别的方法。这些类似物向PCR引物的单一位置的掺入允许产生复杂的扩增产物文库。参见例如Hoops，Nucleic Acids Res.，25：4866-71(1997)。非极性分子也可用于模拟天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键键合形状模拟物可针对胸腺嘧啶的非极性形状模拟物有效地并选择性地复制(参见例如Morales，Nat.Struct.Biol.，5：950-54(1998))。例如，两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤碱基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(参见例如Hill，PNAS，95：4258-63(1998))。本发明的示例简并引物掺有核苷碱基类似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷，3′-[(2-氰乙基)--(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(所述序列中的术语“P”，参见上文)。这一嘧啶类似物氢键结合于嘌呤，包括A和G残基。

基本与本文公开的味觉受体同一的多态变体、等位基因和种间同源物可使用上文描述的核酸探针分离。可选择地，表达文库可用于克隆T2R多肽和其多态变体、等位基因和种间同源物，这是通过用针对T2R多肽制备的抗血清或纯化抗体(其还识别并选择性结合所述T2R同源物)免疫学检测表达的同源物实现的。

编码味觉受体的配体结合区的核酸可通过使用合适的(完全或简并)引物对扩增(例如PCR)合适的核酸序列产生。扩增的核酸可以是来自任何细胞或组织的基因组DNA或源自味觉受体表达细胞的mRNA或cDNA。

在一个实施方案中，可以构建含有编码T2R的核酸的杂种蛋白质编码序列，所述T2R融合于易位序列。还提供杂种T2R，其含有易位基序和其他家族的化学感受受体(特别是味觉受体)的味觉引起化合物结合区。这些核酸序列可以可操作地连接到转录或翻译控制元件，例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子，转录和翻译终止子、多聚腺苷酸化序列以及用于将DNA转录成RNA的其他序列。在重组表达盒、载体和转基因生物的构建中，可使用启动子片段在所有期望的细胞或组织中指导期望的核酸的表达。

在另一个实施方案中，融合蛋白可包括C末端或N末端易位序列。此外，融合蛋白可包含另外的元件，例如用于蛋白质检测、纯化或其他应用。促进检测和纯化的结构域包括，例如金属螯合肽，例如聚组氨酸段、组氨酸-色氨酸模块或允许在固定的金属上纯化的其他结构域；麦芽糖结合蛋白；允许在固定的免疫球蛋白上纯化的A蛋白结构域；或用于FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seattle Wash.)的结构域。

将可切割连接体序列，例如因子Xa(参见例如Ottavi，Biochimie，80：289-93(1998))、枯草溶菌素蛋白酶识别基序(参见例如Polyak，Protein Eng.，10：615-19(1997))；肠激酶(Invitrogen，San Diego，Calif.)等，包含于易位结构域(用于有效的质膜表达)和新翻译的多肽的其余部分之间，可用于促进纯化。例如一个构建体可包括多肽编码核酸序列，其连接至六个组氨酸残基，随后是硫氧还蛋白、肠激酶切割位点(参见例如Williams，Biochemistry，34：1787-97(1995))和C末端易位结构域。所述组氨酸残基促进检测和纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白的剩余部分纯化期望的蛋白质的方法。关于编码融合蛋白的载体和融合蛋白的应用的技术在科学和专利文献中已详细描述(参见例如Kroll，DNA Cell.Biol.，.12：441-53(1993))。

包含配体结合区编码序列的表达载体(作为单独的表达载体或表达载体的文库)可引入细胞的基因组或引入细胞的胞质或细胞核并且通过多种常规技术表达，所述技术详细描述于科学和专利文献。参见例如Roberts，Nature，328：731(1987)；Berger见上；Schneider，Protein Exper.Purif.，6435：10(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。来自生物试剂和实验仪器的生产商的产品信息也提供了相关已知生物学方法的信息。所述载体可以从天然来源分离，从诸如ATCC或GenBank文库的来源获得，或通过合成或重组方法制备。

核酸可在表达盒、载体或病毒中表达，所述表达盒、载体或病毒在细胞中稳定地或瞬时地表达(例如游离表达系统)。选择标记可掺入表达盒和载体以赋予转化的细胞和序列可选择的表型。例如，选择标记可编码游离型维持和复制，从而不需要整合入所述宿主基因组。例如所述标记可编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如氯磺隆(chlorosulfurone)或草丁膦(Basta))，以允许选择那些用期望的DNA序列转化的细胞(参见例如Blondelet-Rouault，Gene，190：315-17(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.，281：992-97(1997))。因为赋予底物(如新霉素或潮霉素)抗性的选择标记基因仅可用于组织培养，所以化学抗性基因也用作体外和体内选择标记。

嵌合核酸序列可编码任何7-跨膜多肽中的T2R配体结合区。因为7-跨膜受体多肽具有相似的一级序列以及二级和三级结构，结构结构域(例如胞外结构域、TM结构域、胞质结构域等)可通过序列分析容易地鉴别。例如同源建模、傅立叶分析和螺旋周期检测可以鉴别并表征具有7-跨膜受体序列的七个结构域。快速傅里叶变换(FFT)算法可用于评估表征所分析的序列的疏水性和可变性特征的主周期(dominantperiod)。周期检测加强和α螺旋周期指数，可按照例如Donnelly，Protein Sci.，2：55-70(1993)所述的进行。其他的比对和建模算法为本领域所熟知(参见例如Peitsch，Receptors Channels，4：161-64(1996)；Kyte & Doolittle，J.Md.Biol.，157：105-32(1982)；和Cronet，Protein Eng.，6：59-64(1993)。

本发明不仅还包括具有指定的核酸和氨基酸序列的核酸分子和多肽，还包括其片段，特别是例如40、60、80、100、150、200或250个核苷酸或更多的片段，以及例如10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多的多肽片段。任选地，所述核酸片段可编码抗原性多肽，所述多肽能够结合针对T2R家族成员产生的抗体。此外，本发明的蛋白质片段可任选地为抗原性片段，其能够结合针对T2R家族成员产生的抗体。

还预期了含有本文描述的至少一种T2R多肽之一的至少10、20、30、50、70、100或150个氨基酸或更多，偶联于代表另一个GPCR(优选7跨膜超家族的成员)的所有或部分的另外的氨基酸的嵌合蛋白。这些嵌合体可由所述受体和另一个GPCR制备，或它们可通过组合本发明的两种或多种受体制备。在一个实施方案中，所述嵌合体的一部分相应于或源自本发明的T2R多肽的跨膜结构域。在另一个实施方案中，所述嵌合体的一部分相应于或源自本文描述的T2R多肽的一个或多个跨膜区，并且剩余的一个或多个部分可来自另一个GPCR。嵌合受体为本领域所熟知，并且创建它们的技术以及选择和界定掺入其中的G蛋白偶联受体的结构域或片段也是熟知的。因此，本领域技术人员的这一知识可容易地用于创建此类嵌合受体。使用此类嵌合受体可提供例如本文具体公开的受体之一的味觉选择性特征，所述味觉选择性特征偶联于另一个受体(例如用于现有技术的测定系统的熟知受体)的信号转导特征。

例如，诸如配体结合区、胞外结构域、跨膜结构域、跨膜结构域、胞质结构域、N末端结构域、C末端结构域或其任何组合的区域可共价连接于异源蛋白质。例如，T2R跨膜区可连接于异源GPCR跨膜结构域，或者异源GPCR胞外结构域可连接于T2R跨膜区。可选择的其他异源蛋白质可包括，例如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶多肽、谷氨酸受体和视紫红质多肽，例如视紫红质(如牛视紫红质)的N末端片段。

使用不同的宿主细胞表达本发明的T2R、片段或变体也属于本发明的范围。为了高水平表达克隆的基因或核酸，例如编码本发明的T2R、片段或变体的cDNA，技术人员通常将所关注的核酸序列亚克隆入表达载体，所述表达载体含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和如果是编码蛋白质的核酸，用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域所熟知并且参见例如Sambrook等人。优选地，真核表达系统用于表达主题hT2R受体。

可以使用用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞的任何熟知技术。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、原生质载体(plasma vector)、病毒载体和用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遗传材料导入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如Sambrook等人)。仅需要所使用的特定的遗传工程程序能够将至少一个核酸分子成功地导入能够表达关注的T2R、片段或变体的宿主细胞。

所述表达载体导入所述细胞后，所转染的细胞在有利于表达关注的受体、片段或变体的条件下培养，然后使用标准技术从培养物回收所述受体、片段或变体。这些技术的实例为本领域熟知。参见例如WO00/06593，其以符合本公开内容的方式通过引用并入。

用于检测调节依据本发明的hT2R活性的化合物的测定

用于确定测试的化合物是否在体外和体内特异性结合于本发明的T2R多肽的方法和组合物描述如下。可监测细胞生理学的许多方面以评估对天然存在的或嵌合的T2R的配体结合的效应。这些测定可在表达T2R多肽的完整细胞、在透过性(permeabilized)细胞或由标准方法产生的膜组分上进行。

味觉受体结合味觉引起化合物，并且起始化学刺激向电信号的转导。活化的或抑制的G蛋白将转而改变靶酶、通道和其他效应蛋白质的性质。一些实例为在视觉系统中转导蛋白活化cGMP磷酸二酯酶、刺激性G蛋白(stimulatory G protein)活化腺苷酸环化酶、Gq和其他同族(cognate)G蛋白活化磷脂酶C以及Gi和其他的G蛋白调节多种通道。还可检查下游结果，例如由磷脂酶C产生二酰基甘油和IP3，并且IP3转而用于钙转移。

所述测定的主题hT2R蛋白质或多肽将通常选自具有本文权利要求书前的序列表中所含的序列的多肽或其片段或保守修饰变体。

可选择地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可源自真核宿主细胞，并可包含与这些hT2R多肽或其保守修饰变体具有一定百分比的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。一般来说，所述氨基酸序列同一性将为至少30％，优选地30-40％，更具体地，50-60、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。任选地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可包含T2R多肽的区域，例如胞外结构域、跨膜区、胞质结构域、配体结合结构域等。任选地，如本文所示例，T2R多肽或其部分可共价连接至异源蛋白质以创建在本文描述的测定中使用的嵌合蛋白。

使用上文描述的T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)可测试T2R活性的调节剂。所述T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)可以是分离的、在细胞中表达，在源自细胞的膜中表达，在组织或动物中表达。例如，可使用舌切片(tongue slice)、来自舌的解离细胞(dissociated cells)、转化的细胞，或膜。使用本文描述的体外或体内测定之一可测试调节。

调节剂的检测

用于确定测试的化合物是否在体外和体内特异性结合于本发明的T2R受体的方法和组合物描述如下。可监测细胞生理学的许多方面以评估对本发明的T2R多肽的配体结合的效应。这些测定可在表达化学感受受体的完整细胞、在透过性细胞或由标准方法产生的膜组分上或在体外使用从头合成的蛋白质进行。

在体内，味觉受体结合味觉调节化合物，并且起始化学刺激向电信号的转导。活化的或抑制的G蛋白将转而改变靶酶、通道和其他效应蛋白质的性质。一些实例为在视觉系统中转导蛋白活化cGMP磷酸二酯酶、刺激性G蛋白活化腺苷酸环化酶、Gq和其他同族G蛋白活化磷脂酶C以及Gi和其他的G蛋白调节多种通道。还可检查下游结果，例如由磷脂酶C产生二酰基甘油和IP3，并且IP3转而用于钙转移。

可选择地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可源自真核宿主细胞，并可包含与本文公开的T2R多肽或其片段或保守修饰变体具有氨基酸序列同一性的氨基酸序列。一般来说，所述氨基酸序列同一性将为至少35％至50％，或任选地75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。任选地，所述测定的T2R蛋白质或多肽可包含T2R蛋白质的结构域，例如胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞质结构域、配体结合结构域等。此外，如上所述，T2R蛋白质或其结构域可共价连接至异源蛋白质以创建在本文描述的测定中使用的嵌合蛋白。

使用上文描述的T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)测试T2R受体活性的调节剂。所述T2R蛋白质或多肽(重组的或天然存在的)可以是分离的、在细胞中表达，在源自细胞的膜中表达，在组织或动物中表达。例如，可使用舌切片、来自舌的解离细胞、转化的细胞，或膜。使用本文描述的体外或体内测定之一可测试调节。

1.体外结合测定

也可以用可溶或固态反应，使用本发明的T2R多肽体外检查味觉转导。在一个特定的实施方案中，T2R配体结合结构域可用于体外可溶或固态反应以测定配体结合。

N末端结构域与胞外结构域的其他部分(例如跨膜结构域的胞外环)一起可形成所述配体结合结构域是可能的。

体外结合测定已经用于其他GPCR，例如代谢型谷氨酸受体(参见例如Han和Hampson，J.Biol.Chem.274：10008-10013(1999))。这些测定可包括置换放射性或荧光标记的配体、测量内在荧光的变化或蛋白水解易感性的变化等。

可以在溶液、双分子膜(任选地连接于固相)、脂单层或小泡中测试配体与依据本发明的T2R多肽的结合。可使用例如光谱特征(例如荧光、吸光度、折射率)、流体动力学(例如形状)、色谱或溶解性的变化测试调节剂的结合。

在本发明的一个优选实施方案中，使用^[35S]GTPγS结合测定。如上所述，当GPCR活化时，刺激G蛋白复合体的Gα亚基将结合的GDP交换为GTP。配体介导的G蛋白交换活性的刺激可在生物化学测定中测量，所述生物化学测定测量在假定配体存在下，添加的放射性标记的^[35S]GTPγS与G蛋白的结合。通常，将含有关注的化学感受受体的膜与G蛋白混合。将潜在的抑制剂和/或活化剂以及^[35S]GTPγS加入所述测定物，并且测量^[35S]GTPγS与G蛋白的结合。可通过液体闪烁计数或通过本领域已知的任何其他方法，包括闪烁亲近测定法(scintillation proximity assay，SPA)测量结合。在其他的测定形式中，可应用荧光标记的GTPγS。

2.荧光偏振测定

在另一个实施方案中，基于荧光偏振(″FP″)的测定可用于检测和监测配体结合。荧光偏振是用于测量平衡结合、核酸杂交和酶促活性的通用实验技术。荧光偏振测定的相同之处在于它们不需要分离步骤，如离心、过滤、色谱、沉淀或电泳。这些测定直接在溶液中实时进行并且不需要固定相。可重复地并且在添加试剂后测量偏振值，因为测量偏振是快速的并且不破坏样品。一般来说，这一技术可用于测量低皮摩尔至微摩尔水平的荧光团的偏振值。本部分描述荧光偏振如何可以以简单和定量的方式用于测量配体与本发明的T2R多肽的结合。

当荧光标记的分子用平面偏振光激发时，其发射偏振度反比于其分子旋转的光。大的荧光标记分子在激发态期间(就荧光素而言为4纳秒)保持相对静止，并且光的偏振在激发和发射之间保持相对恒定。小的荧光标记分子在激发态期间快速旋转并且偏振在激发和发射之间显著变化。因此，小分子具有低偏振值而大分子具有高偏振值。例如，单链的荧光素标记的寡核苷酸具有相对低的偏振值，但是当它与互补链杂交时，其具有较高的偏振值。当使用FP检测和监测味觉引起化合物结合(其可活化或抑制本发明的化学感受受体)时，可使用荧光标记的味觉引起化合物或自体荧光味觉引起化合物。

荧光偏振(P)定义为

其中Int_平行是平行于激发光平面的发射光强度并且Int_垂直是垂直于激发光平面的发射光强度。P是光强度的比，为无量纲数。例如Beacon^TM和Beacon 2000^TM系统可与这些测定一起使用。此类系统通常以毫偏振单位(1偏振单位＝1000mP单位)表示偏振。

分子旋转和大小之间的关系由Perrin方程描述，并且读者可参阅Jolley，M.E.(1991)Journal of Analytical Toxicology，第236-240页，其通过引用并入本文，所述文献提供这一方程的全面解释。概要而言，Perrin方程陈述了偏振与旋转弛豫时间直接成比例，所述时间为分子旋转约68.5°角所花费的时间。旋转弛豫时间与黏度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)和气体常数(R)通过以下等式相关：2(旋转弛豫时间)＝3 V RT。

旋转弛豫时间对小分子(例如荧光素)而言短(～纳秒)并且对大分子(例如免疫球蛋白)而言长(～100纳秒)。如果保持黏度和温度恒定，旋转弛豫时间以及因此偏振与分子体积直接相关。分子体积的变化可能是由于荧光标记分子与其他分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或构象变化。例如，荧光偏振已经用于测量蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶对大型荧光素标记的聚合物的酶促切割。其还用于测量蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合和蛋白质/DNA结合的平衡结合。

A.固态和可溶高通量测定

在另一个实施方案中，本发明提供使用T2R多肽或表达T2R多肽的细胞或组织的可溶测定。在另一个实施方案中，本发明提供高通量形式的基于固相的体外测定，其中T2R多肽或表达所述T2R多肽的细胞或组织连接于固相基质或味觉刺激化合物并且与T2R受体接触，并且使用合适的标签或针对T2R受体产生的抗体检测结合。

在本发明的高通量测定中，可在一天内筛选多达数千种的不同调节剂或配体。特别地，微量滴定板的每个孔可用于进行针对一种选择的潜在调节剂的单独测定，或者如果观察浓度或温育时间效应，每5-10个孔可以测试一个调节剂。因此，一个标准微量滴定板可测定约100(例如96)个调节剂。如果使用1536孔的板，那么一个板可容易地测定约1000至约1500个不同的化合物。在每个板孔中测定多个化合物也是可能的。每天可测定数个不同的板；使用本发明的集成系统，筛选多达约6,000-20,000个不同化合物的测定是可能的。最近，已经开发试剂操作的微流体方法。

关注的分子可经共价或非共价键(例如经标签)直接地或间接地结合至固态组分。所述标签是多种组分中的任何一种。一般来说，将结合标签的分子(标签结合物)固定于固体支持物，并且关注的带标签分子(例如关注的味觉转导分子)通过所述标签和所述标签结合物的相互作用连接于所述固体支持物。

基于文献中详细描述的已知的分子相互作用，可以使用许多标签和标签结合物。例如，如果标签(例如生物素、A蛋白或G蛋白)具有天然结合物，其可与合适的标签结合物(抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、免疫球蛋白的Fc区等)一起使用。具有天然结合物的分子(例如生物素)的抗体也是广泛可用的和合适的标签结合物(参见SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA，St.LouisMo.)。

类似地，任何半抗原性或抗原性化合物可与合适的抗体组合使用以形成标签/标签结合物对。数千个特异性抗体是商业可获得的并且许多其它抗体描述于文献中。例如在一个普通配置中，所述标签是一抗并且所述标签结合物是识别所述一抗的二抗。除了抗体-抗原相互作用，受体-配体相互作用也适合作为标签和标签结合物对。例如细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用，如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白家族等；参见例如Pigott & Power，The Adhesion Molecule Facts BookI(1993))。类似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片类、类固醇等)、细胞内受体(例如介导多种小配体，包括类固醇、甲状腺激素、类视黄醇和维生素D；肽的效应的受体)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环形聚合物结构)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可与多种细胞受体相互作用。

合成的聚合物，例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫醚(polyarylene sulfides)、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚乙酸酯(polyacetates)，也可形成合适的标签或标签结合物。许多其它的标签/标签结合物对也用于本文描述的测定系统中，这对参阅本公开内容的技术人员而言是明显的。

普通连接体诸如肽、聚醚等也可作为标签，并且包括多肽序列，例如约5和200个氨基酸之间的聚甘氨酸序列。此类柔性的连接体为本领域技术人员所知。例如聚(乙二醇)连接体可从ShearwaterPolymers，Inc.Huntsville，Ala获得。这些连接体任选地具有酰胺键、巯基键或杂官能键(heterofunctional linkages)。

使用当前可行的多种方法中的任何一种将标签结合物固定于固体基质。固体基质通常通过将全部或部分的所述基质暴露于化学试剂来进行衍生或官能化，所述化学试剂将化学基团固定于与标签结合物的部分反应的表面。例如，适于连接至长链部分的基团将包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷可用于使多种表面(例如玻璃表面)功能化。此类固相生物聚合物阵列的构建详细描述于文献中。参见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.，102：259-274(1987)(描述在针上合成固相组分)；Frank & Doring，Tetrahedron，44：60316040(1988)(描述在纤维素盘上合成多种肽序列)；Fodor等人，Science，251：767-777(1991)；Sheldon等人，ClinicalChemistry，39(4)：718-719(1993)；和Kozal等人，Nature Medicine，2(7)：753759(1996)(全部描述固定于固体基质的生物聚合物阵列)。用于将标签结合物固定于基质的非化学方法包括其他普通的方法，例如加热、通过UV辐射交联等。

3.基于细胞的测定

在一个优选的实施方案中，T2R蛋白质以未修饰的形式或作为嵌合受体、变体受体或截短的受体在真核细胞中表达，其中所述嵌合受体、变体受体或截短的受体具有或优选没有通过分泌途径促进其成熟和靶向的异源伴侣序列。此类T2R多肽可表达于任何真核细胞，例如HEK-293细胞。优选地，所述细胞包含功能性G蛋白，例如G_α15或嵌合G_α16、味转导素或转导蛋白或嵌合G蛋白，例如能够将嵌合受体偶联于细胞内信号传导途径或诸如磷脂酶C的信号传导蛋白的G16gust44。此类细胞中T2R受体的活化可使用任何标准方法检测，例如通过检测所述细胞中FURA-2依赖性荧光进而检测细胞内钙的变化来检测。此类测定是本申请中提出的实验发现的基础。

活化的GPCR受体通常是磷酸化受体C-末端尾(C-terminaltail)(以及可能的其他位点)的激酶的底物。因此，活化剂将促进³²P从放射性标记的ATP转移至所述受体，其可用闪烁计数器测定。所述C-末端尾的磷酸化将促进抑制蛋白样蛋白质的结合并将干扰G蛋白的结合。有关GPCR信号转导和测定信号转导的方法的一般综述参见例如Methods in Enzymology，第237和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等人，Nature，10：349：117-27(1991)；Bourne等人，Nature，348：125-32(1990)；Pitcher等人，Ann.Rev.Biochem.，67：653-92(1998)。

通过比较用假定的T2R调节剂处理的T2R多肽的响应和未处理的对照样品或含有已知“阳性”对照的样品的响应，可测定T2R调节。此类假定的T2R调节剂可包括抑制或活化T2R多肽活性的分子。在一个实施方案中，用活化所述T2R的化合物处理的对照样品的相对T2R活性值被指定为100。当相对于所述对照样品的T2R活性值为约90％，任选50％，任选25-0％时，实现对T2R多肽的抑制。当相对于所述对照的T2R活性值为110％，任选150％，200-500％或1000-2000％时，实现对T2R多肽的活化。

通过确定表达T2R多肽的细胞或膜的离子极化(即电位)的变化，可评估离子流的变化。确定细胞极化的变化的一种方法是通过用电压钳和膜片钳技术测量电流的变化(从而测量极化的变化)(参见例如“细胞粘附”模式、“内翻外(inside-out)”模式和“全细胞”模式，例如Ackerman等人，New Engl.J Med.，336：1575-1595(1997))。使用所述标准方便地确定全细胞电流。其他已知测定包括：放射性标记离子流测定和使用电压敏感染料的荧光测定(参见例如Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.，88：67-75(1988)；Gonzales & Tsien，Chem.Biol.，4：269-277(1997)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.，25：185-193(1991)；Holevinsky等人，J.Membrane Biology，137：59-70(1994))。

测试化合物对所述多肽功能的效应可以通过检测上文描述的任何参数测量。影响GPCR活性的任何合适的生理学变化可用于评估测试的化合物对本发明的多肽的影响。当使用完整的细胞或动物确定功能结果时，技术人员还可测量多种效应，例如递质释放、激素释放、已知的和未表征的遗传标记的转录变化(例如RNA印迹)、细胞代谢的变化(例如细胞生长或pH变化)以及细胞内第二信使(例如Ca²⁺、IP3、cGMP或cAMP)的变化。

GPCR的优选测定包含用离子或电压敏感染料装载以报道受体活性的细胞。用于确定此类受体的活性的测定还可使用其他G蛋白偶联受体的已知激动剂和拮抗剂作为对照以评估测试化合物的活性。在鉴别调节化合物(例如激动剂、拮抗剂)的测定中，将分别使用离子敏感的或膜电压荧光的指示剂监测胞质中离子水平或膜电压的变化。可使用的离子敏感指示剂和电压探针包括公开于Molecular Probes 1997Catalog的那些。对于G蛋白偶联受体，泛主(promiscuous)G蛋白(例如G_α15和G_α16)可用于选择的测定(Wilkie等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.，88：10049-10053(1991))。可选择地，可使用其他G蛋白，例如味转导素、转导蛋白和嵌合G蛋白，如Gα16gust44或Gα16t25。

受体活化起始后续的细胞内事件，例如第二信使的增加。一些G蛋白偶联受体的活化通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇的水解刺激肌醇三磷酸(IP3)的形成(Berridge & Irvine，Nature，312：315-21(1984))。IP3转而刺激细胞内钙离子贮备的释放。因此，胞质钙离子水平的变化或诸如IP3的第二信使水平的变化可用于评估G蛋白偶联受体的功能。表达此类G蛋白偶联受体的细胞可表现出增加的胞质钙水平，这是由于钙从细胞内贮备释放以及细胞外的钙经由质膜的离子通道进入两方面的贡献。

在一个优选的实施方案中，通过在具有泛主G蛋白的异源细胞中表达T2R基因测量T2R多肽的活性，所述泛主G蛋白将所述受体连接于磷脂酶C信号转导途径(参见Offermanns & Simon，J.Biol.Chem.，270：15175-15180(1995))。优选地，所述细胞系是HEK-293(其正常地不表达T2R基因)并且所述泛主G蛋白是G_α15(Offermanns & Simon，见上)或嵌合G蛋白，例如Gα16gust44。通过测量细胞内Ca²⁺水平的变化测定味觉转导的调节，所述Ca²⁺水平响应通过施用与T2R多肽联合的分子对T2R信号转导途径的调节而变化。任选地使用荧光Ca²⁺指示剂染料和荧光测定成像测量Ca²⁺水平的变化。

在另一个实施方案中，磷脂酰肌醇(PI)水解可根据美国专利第5,436,128号进行分析，所述专利通过引用并入本文。简单地说，所述测定包括用3H-肌醇标记细胞48小时或更长。所述标记的细胞用测试化合物处理一小时。在氯仿-甲醇-水中裂解并提取处理的细胞，之后通过离子交换色谱分离肌醇磷酸并通过闪烁计数定量。通过计算存在激动剂的cpm与存在缓冲液对照的cpm的比值确定刺激倍数。类似地，通过计算存在拮抗剂的cpm与存在缓冲液对照(其可含或不含激动剂)的cpm的比值确定抑制倍数。

其他的受体测定可包括确定细胞内环核苷酸(例如cAMP或cGMP)的水平。在所述受体的活化引起环核苷酸水平下降的情况下，可优选在测定中在将受体活化化合物添加到所述细胞前，使所述细胞暴露于增加细胞内环核苷酸水平的试剂，例如毛喉素。在一个实施方案中，细胞内cAMP或cGMP的变化可使用免疫测定测量。Offermanns & Simon，J.Bio.Chem.，270：15175-15180(1995)中描述的方法可用于确定cAMP的水平。另外Felley-Bosco等人，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11：159-164(1994)中描述的方法可用于确定cGMP的水平。此外，用于测量cAMP和/或cGMP的测定试剂盒描述于美国专利第4,115,538号，其通过引用并入本文。

在另一个实施方案中，可测量转录的水平以评估测试化合物对信号转导的效应。使含有关注的T2R多肽的宿主细胞与测试化合物接触足够的时间以实现任何的相互作用，然后测量基因表达的水平。实现所述相互作用的时间量可根据经验确定，例如通过运行一个时间过程并测量作为时间函数的转录的水平。可通过使用本领域的技术人员所知的任何合适的方法测量转录的量。例如，可使用RNA印迹检测关注的蛋白质的mRNA表达，或可使用免疫测定鉴别它们的多肽产物。可选择地，基于转录的测定(其使用报告基因)可按照美国专利第5,436,128号中所述使用，所述专利通过引用并入本文。所述报告基因可以是，例如氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，关注的蛋白质可经连接于第二种报告基因(例如绿色荧光蛋白)而用作间接报告基因(参见例如Mistili &Spector，Nature Biotechnology，15：961-964(1997))。

然后将所述转录的量和在缺少测试化合物的相同细胞中的转录的量比较，或者其可与在缺少关注的T2R多肽的基本同一的细胞中的转录的量比较。基本同一的细胞可源自用来制备重组细胞，但是没有通过引入异源DNA进行修饰的相同细胞。转录的量的任何差异表明测试化合物以某种方式改变关注的T2R多肽的活性。

4.表达化学感受受体的转基因非人动物

表达本发明的一种或多种味觉受体序列的非人动物也可用于受体测定。此类表达可用于确定测试化合物是否体内特异性结合于哺乳动物味觉跨膜受体复合体，其通过使非人动物接触测试化合物并且确定所述动物是否通过特异性结合所述受体多肽复合体与测试化合物反应进行确定，所述非人动物用编码化学感受受体或其配体结合区的核酸稳定地或瞬时地转染。

用本发明的载体转染或感染的动物在鉴别和表征可结合于特异或系列受体的味觉刺激物的测定中特别有用。此类表达人味觉受体序列的载体感染的动物可用于体内筛选味觉刺激物和它们对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、对CNS或行为的效应。

感染/表达所述核酸和载体(单独地或作为文库)的方法为本领域所熟知。多种个体细胞、器官或全动物参数可通过多种方法测量。本发明的T2R序列可例如通过用感染试剂(例如腺病毒表达载体)递送而表达于动物味觉组织。

内源性味觉受体基因可保持功能并且野生型(天然的)活性可仍然存在。在其他的情况下，如果需要所有味觉受体活性来自引入的外源杂种受体，优选使用敲除系。构建非人转基因动物(特别是转基因小鼠)以及选择和制备用于产生转化细胞的重组构建体的方法为本领域所熟知。

“敲除”细胞和动物的构建是基于以下前提：通过向基因组引入新的DNA序列，可降低或完全清除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平，所述新的DNA序列用于干扰待抑制基因的DNA序列的某个部分。此外，“基因捕获插入(gene trap insertion)”可用于破坏宿主基因，并且小鼠胚胎干(ES)细胞可用于产生敲除转基因动物(参见例如Holzschu，Transgenic Res.6：97-106(1997))。所述外源物的插入通常是通过互补核酸序列之间的同源重组。所述外源序列是待修饰的靶基因的某个部分，例如外显子、内含子或转录调节序列或能够影响靶基因表达水平的任何基因组序列；或其组合。在多能胚胎干细胞中，经由同源重组的基因打靶允许技术人员精确地修饰关注的基因组序列。任何技术可用于产生、筛选、繁殖敲除动物，例如参见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.7：53-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75：208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19：161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48：167-184(1995)；Longo，TransgenicRes.6：321-328(1997)；美国专利第5,616,491、5,464,764、5,631,153、5,487,992、5,627,059、5,272,071号；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。

本发明的核酸还可用作产生“敲除”人细胞和它们的子代的试剂。类似地，本发明的核酸还可用作在小鼠中产生“敲入”的试剂。人或大鼠T2R基因序列可置换小鼠基因组中的T2R直向同源物。这样就产生了表达人或大鼠T2R的小鼠。然后所述小鼠可用于分析人或大鼠T2R的功能并鉴别此类T2R的配体。

调节剂

测试为T2R家族成员调节剂的化合物可以是任何小化合物或生物实体(biological entity)，例如蛋白质、糖、核酸或脂质。可选择地，调节剂可以是T2R家族成员的遗传改变形式。通常，测试的化合物可以是小化学分子和肽。基本上任何化合物都可用作本发明的测定中的潜在调节剂或配体，尽管最经常使用可溶于水溶液或有机(特别是基于DMSO的)溶液的化合物。通过使所述测定步骤自动化和从任何方便的来源向测定提供化合物，可将所述测定设计为筛选大型化学文库(其通常平行进行(例如在自动测定中在微量滴定板上以微量滴定的形式))。应理解，有许多化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)、Aldrich(St.Louis，Mo.)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)、FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。

在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在的治疗化合物(潜在的调节剂或配体化合物)的组合化学或肽的文库。然后，如本文所述，可以在一个或多个测定中筛选此类“组合化学文库(combinatorial chemical libraries)”或“配体文库”，从而鉴别表现出期望的特征活性的那些文库成员(特别的化学种类或亚类)。由此鉴别的化合物可用作常规“先导化合物”或其自身可用作潜在的或实际的消费产品。

组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过组合许多化学“结构单元(building blocks)”，例如试剂而产生的不同化合物的集合(collection)。例如，线性组合化学文库(例如多肽文库)通过以给定化合物长度(即多肽化合物中氨基酸的数量)的每个可能方式组合一组化学结构单元(氨基酸)来形成。通过化学结构单元的此类组合混合，可合成数百万种化合物。

组合化学文库的制备和筛选为本领域技术人员所熟知。所述组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利第5,010,175号，Furka，Int.J.Pept.Proto Res.，37：487-93(1991)和Houghton等人，Nature，354：84-88(1991))。还可使用产生化学多样性文库的其他化学。所述化学包括但不限于：类肽(例如WO 91/19735)、编码的肽(例如WO 93/20242)、随机生物寡聚物(例如WO 92/00091)、苯并二氮类(例如美国专利第5,288,514号)、多样体(diversomers)例如乙内酰脲类、苯并二氮类和二肽类(Hobbs等人，PNAS.，90：6909-13(1993))、插烯多肽类(vinylogous polypeptides)(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.，114：6568(1992))、具有葡萄糖骨架(glucosescaffolding)的非肽肽模拟物(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.，114：9217-18(1992))、小化合物文库的类似有机合成(analogous organic syntheses)(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.，116：2661(1994))、寡氨基甲酸酯(Cho等人，Science，261：1303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.，59：658(1994))、核酸文库(Ausubel，Berger和Sambrook，均见上)、肽核酸文库(美国专利第5,539,083号)、抗体文库(Vaughn等人，NatureBiotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)、糖文库(Liang等人，Science，274：1520-22(1996)和美国专利第5,593,853号)、小有机分子文库(苯并二氮类，Baum，C&EN，1月18日，第33页(1993)；噻唑烷二酮类(thiazolidinones)和间噻嗪酮类(metathiazanones)，美国专利第5,549,974号；吡咯烷类(pynrolidines)，美国专利第5,525,735和5,519,134号；吗啉化合物，美国专利第5,506,337号；苯并二氮类，5,288,514等)。

用于制备组合文库的设备是商业可获得的(参见例如357MPS、390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville Ky.)、Symphony(Rainin，Woburn，Mass.)、433A(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)、9050 Plus(Millipore，Bedford，Mass.))。此外，许多组合文库自身是商业可获得的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；MartekBiosciences；Columbia，Md.；等)。

在本发明的一个方面中，所述T2R调节剂可用于任何食品、糖果、药物组合物或其成分，从而以期望的方式调节所述产品、组合物或成分的味道。例如，可添加增强苦味感知的T2R调节剂以向产品或组合物提供苦味，也可添加阻断苦味感知的T2R调节剂以阻断产品或组合物的苦味。此外，本发明提供鉴别存在于食品、饮料和药物中的苦味化合物和产生味道改良的食品、饮料和药物的方法，所述改良的食品、饮料和药物缺乏或具有减少的量的所鉴别的苦味化合物。

本发明鉴别的化合物的用途

根据本发明鉴别的化合物可添加于食品、饮料、化妆品或药物组合物以调节(优选阻断)苦味，所述苦味由至少一种图2所含的苦味化合物或结构相关的化合物或其他苦味化合物(例如存在于食品和饮料或药物或化妆品中的引起苦味感知的化合物)活化hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9A、hT2R9V、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R44、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76之一和hT2R54中的至少一种而引发。

如前所示，优选地，在主题T2R的基于细胞的测定中鉴别的化合物的味觉调节性质(优选苦味阻断性质)将在人或动物味觉测试(优选人味觉测试)中确认。

试剂盒

T2R基因和它们的同源物是用于鉴别味觉受体细胞、用于取证(forensics)和亲子确定以及用于检查味觉转导的有用工具。特异性杂交于T2R核酸(例如T2R探针和引物)的T2R家族成员特异性试剂和特异性结合于T2R蛋白质的T2R特异性试剂(例如T2R抗体)用于检查味觉细胞表达和味觉转导调控。

用于测定样品中T2R家族成员的DNA和RNA的存在的核酸测定包括本领域技术人员所知的许多技术，例如southern分析、northern分析、点渍法、核糖核酸酶保护、S1分析、诸如PCR的扩增技术和原位杂交。例如在原位杂交中，靶核酸从其细胞环境中释放，从而可以在细胞内杂交并保持细胞形态学以用于后续解释和分析。以下文献提供原位杂交领域的综述：Singer等人，Biotechniques，4：230250(1986)；Haase等人，Methods in Virology第VII卷，189-226(1984)；和Names等人编，Nucleic Acid Hybridization：A PracticalApproach(1987)。此外，可用以上描述的多种免疫测定技术检测T2R蛋白质。测试样品通常与阳性对照(例如表达重组T2R蛋白质的样品)和阴性对照进行比较。

本发明还提供用于筛选T2R家族成员的调节剂的试剂盒。此类试剂盒可从容易获得的材料和试剂制备。例如，此类试剂盒可包括任何一种或多种以下材料：T2R核酸或蛋白质、反应管和测试T2R活性的说明书。任选地，所述试剂盒含有功能性T2R多肽。取决于所述试剂盒的预期使用者和所述使用者的特别需要，可根据本发明制备多种试剂盒和组分。

现在已经基本描述了本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明，所述实施例以例证方式提供，并非意在限制。应理解，可对本文公开的示例性实施方案进行多种改良和变化，而不背离本发明的精神和范围。

实施例

实施例1

在这一实施例中，制备稳定或瞬时地表达hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76之一以及与之偶联的嵌合G蛋白(这些hT2R和嵌合G蛋白的序列包含于权利要求书前的序列表中)的HEK-293细胞，并且针对不同的苦味配体筛选这些细胞以鉴别特异性活化每种这些苦味受体的化合物。

更具体地，不同苦味配体对这些受体的活化在基于细胞的测定中测量，所述测定检测细胞内钙浓度的变化。简单地说，将人胚胎肾细胞接种于48孔组织培养板。24小时后，这些接种的HEK-293细胞用含有编码嵌合G蛋白(G16gust44)(SEQ ID NO：2)的序列的表达质粒(pEAK10)瞬时转染，并且还通过磷酸钙或基于脂质的系统用含有特定hT2R核酸序列的pEAK10表达质粒瞬时转染。此外，pEAK10质粒中包含的hT2R序列被各自进行工程改造以在hT2R序列上游含有Rho-35标签或SSTR-3标签并且因此表达视紫红质蛋白质(SEQ ID NO：1)的35个氨基酸或SSTR-3蛋白质的45个氨基酸的N末端标签。

另外24小时后，将所述瞬时转染的细胞与钙特异性荧光染料(Fluo-4；Molecular Probes)温育。然后使这些装载的细胞暴露于不同的苦味分子。苦味配体对hT2R的活化引起G16gust44的活化，其导致钙转移至细胞内。于是细胞内钙的这一变化使得荧光染料发射可检测的荧光变化，所述荧光变化使用荧光显微术监测。特别地，钙浓度的这一增加改变了细胞内部钙染料的荧光性质，并且这些变化使用荧光显微术和特别设计的软件(Imaging Workbench，Axon)监测。

另外，可用自动化荧光测定成像系统(FLIPR)，使用略为不同的方案进行所述测定。在这一方案中，稳定表达G16gust44的HEK-293细胞系用hT2R表达质粒转染，并且24小时后用染料装载所述细胞并在FLIPR上进行分析。

此外，一旦使用这一方法鉴别特定hT2R的配体，即可由此产生稳定表达所述特定hT2R和嵌合G蛋白G16gust44的HEK-293细胞系。

针对以上鉴别的hT2R，测定大量的苦味配体(以其中所述的浓度)。每种hT2R的这些测定的结果归纳于图2。可以观察到，每种测试的hT2R被至少一种苦味配体特异性活化。如从表中的结果所观察到的，通常，特定的hT2R响应具有不同结构的多种不同的苦味配体。图2中的结果还表明所述苦味配体中有许多特异性活化超过一种hT2R。图3含有用于这些苦味配体的浓度。

实施例2：hT2R9等位基因变体和测定

hT2R9和其他人T2R的脱孤报道于先前的实施例中。本实施例具体涉及本文权利要求书前的序列表中的序列中含有的hT2R9序列。此外，Kim等人(Hum Mutat.2005年9月；26：199-204)已经报道hT2R9有2种单体型。序列表中的SEQ ID NO：13-16含有两种T2R9单体型(hT2R9A和hT2R9V)的蛋白质和DNA序列。我们称为hT2R9V的那一个表现为所测试的苦味配体的无功能等位基因，而另一个等位基因hT2R9A是所测试的苦味配体的功能等位基因。2个等位基因在氨基酸位置187上具有一个氨基酸残基差异，hT2R9A含有Ala残基，而hT2R9V含有Val残基。根据Kim等人(Hum Mutat.2005年9月；26：199-204)，那2种单体型代表约91％的人类群体(hT2R9V 55.5％和hT2R9A 35.5％)。

如以上实施例所述，23个不同的人味觉受体(包括hT2R9)成功地脱孤。本文中hT2R9的2种主要单体型称为hT2R9V和hT2R9A。其相应的核酸和氨基酸序列包含于权利要求书前的序列表中。

最初克隆了hT2R9V序列。此后，克隆了hT2R9A序列并且使用带Rho标签的表达载体表达两者，并且相同的基于HEK-293细胞的测定用于鉴别T2R9配体。在这些测定中，使用相同的配体评估这两种hT2R9序列。观察到当接触氧氟沙星时，hT2R9A表现出活性，而在相同的测定条件下hT2R9V或模拟转染的HEK-293细胞却没有(参见图4)。

此外，使用含有SSTR-3标签的不同表达构建体测定相同的T2R9序列(Bufe等人，Nat.Genet.32：397-400(2002))。这些结果产生了包含于图5的剂量依赖性曲线，其使用瞬时转染的细胞和FLIPR。这些结果与先前的实验相符，并且表明hT2R9A具有功能，即它响应特定的苦味配体而hT2R9V不响应相同的苦味配体。如上所述，已知T2R和T1R均在胃肠细胞中表达并且认为它们可能在消化和代谢功能和疾病中起作用。因此，这两个T2R9等位基因的任一个或全部可用于治疗筛选测定。另外，hT2R序列(包括hT2R9)的此类等位基因变化可能参与一些个体中对苦味配体的不同响应，例如在携带hT2R9A的一组人和hT2R9V等位基因纯合的一组人之间。

(a)嵌合G蛋白和hT2R基因和多肽的序列

视紫红质标签的蛋白质序列：(SEQ ID NO：1)

MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPW

G16gust44的蛋白质序列：(SEQ ID NO：2)

MARSLTWRCCPWCLTEDEKAAARVDQEINRILLEQKKQDRGELKLLLLGPGESGKSTFIKQMRIIHGAGYSEEERKGFRPLVYQNI

FVSMRAMIEAMERLQIPFSRPESKHHASLVMSQDPYKVTTFEKRYAAAMQWLWRDAGIRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITE

EGYVPTAQDVLRSRMPTTGINEYCFSVQKTNLRIVDVGGQKSERKKWIHCFENVIALIYLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALF

GTILELPWFKSTSVILFLNKTDILEEKIPTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGSNLKKEDKEIYSHMT

CATDTQNVKFVFDAVTDIIIKENLKDCGLF

hT2R1序列

DNA-(SEQ ID NO：3)

ATGCTAGAGTCTCACCTCATTATCTATTTTCTTCTTGCAGTGATACAATTTCTTCTTGGGATTTTCACAAATGGCATCAT

TGTGGTGGTGAATGGCATTGACTTGATCAAGCACAGAAAAATGGCTCCGCTGGATCTCCTTCTTTCTTGTCTGGCAGTTT

CTAGAATTTTTCTGCAGTTGTTCATCTTCTACGTTAATGTGATTGTTATCTTCTTCATAGAATTCATCATGTGTTCTGCG

AATTGTGCAATTCTCTTATTTATcAATGAATTGGAACTTTGGCTTGCCACATGGCTCGGCGTTTTCTATTGTGCCAAGGT

TGCCAGCGTCCGTCACCCACTCTTCATCTGGTTGAAGATGAGGATATCCAAGCTGGTCCCATGGATGATCCTGGGGTCTC

TGCTATATGTATCTATGATTTGTGTTTTCCATAGCAAATATGCAGGGTTTATGGTCCCATACTTCCTAAGGAAATTTTTC

TCCCAAAATGCCACAATTCAAAAAGAAGATACACTGGCTATACAGATTTTCTCTTTTGTTGCTGAGTTCTCAGTGCCATT

GCTTATCTTCCTTTTTGCTGTTTTGCTCTTGATTTTCTCTCTGGGGAGGCACACCCGGCAAATGAGAAACACAGTGGCCG

GCAGCAGGGTTCCTGGCAGGGGTGCACCCATCAGCGCGTTGCTGTCTATCCTGTCCTTCCTGATCCTCTACTTCTCCCAC

TGCATGATAAAAGTTTTTCTCTCTTCTCTAAAGTTTCACATCAGAAGGTTCATCTTTCTGTTCTTCATCCTTGTGATTGG

TATATACCCTTCTGGACACTCTCTCATCTTAATTTTAGGAAATCCTAAATTGAAACAAAATGCAAAAAAGTTCCTCCTCC

ACAGTAAGTGCTGTCAGTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：4)

MLESHLIIYFLLAVIQFLLGIFTNGIIVVVNGIDLIKHRKMAPLDLLLSCLAVSRIFLQLFIFYVNVIVIFFIEFIMCSA

NCAILLFINELELWLATWLGVFYCAKVASVRHPLFIWLKMRISKLVPWMILGSLLYVSMICVFHSKYAGFMVPYFLRKFF

SQNATIQKEDTLAIQIFSFVAEFSVPLLIFLFAVLLLIFSLGRHTRQMRNTVAGSRVPGRGAPISALLSILSFLILYFSH

CMIKVFLSSLKFHIRRFIFLFFILVIGIYPSGHSLILILGNPKLKQNAKKFLLHSKCCQ

hT2R3序列

DNA-(SEQ ID NO：5)

ATGATGGGACTCACCGAGGGGGTGTTCCTGATTCTGTCTGGCACTCAGTTCACACTGGGAATTCTGGTCAATTGTTTCAT

TGAGTTGGTCAATGGTAGCAGCTGGTTCAAGACCAAGAGAATGTCTTTGTCTGACTTCATCATCACCACCCTGGCACTCT

TGAGGATCATTCTGCTGTGTATTATCTTGACTGATAGTTTTTTAATAGAATTCTCTCCCAACACACATGATTCAGGGATA

ATAATGCAAATTATTGATGTTTCCTGGACATTTACAAACCATCTGAGCATTTGGCTTGCCACCTGTCTTGGTGTCCTCTA

CTGCCTGAAAATCGCCAGTTTCTCTCACCCCACATTCCTCTGGCTCAAGTGGAGAGTTTCTAGGGTGATGGTATGGATGC

TGTTGGGTGCACTGCTCTTATCCTGTGGTAGTACCGCATCTCTGATCAATGAGTTTAAGCTCTATTCTGTCTTTAGGGGA

ATTGAGGCCACCAGGAATGTGACTGAACACTTCAGAAAGAAGAGGAGTGAGTATTATCTGATCCATGTTCTTGGGACTCT

GTGGTACCTGCCTCCCTTAATTGTGTCCCTGGCCTCCTACTCTTTGCTCATCTTCTCCCTGGGGAGGCACACACGGCAGA

TGCTGCAAAATGGGACAAGCTCCAGAGATCCAACCACTGAGGCCCACAAGAGGGCCATCAGAATCATCCTTTCCTTCTTC

TTTCTCTTCTTACTTTACTTTCTTGCTTTCTTAATTGCATCATTTGGTAATTTCCTACCAAAAACCAAGATGGCTAAGAT

GATTGGCGAAGTAATGACAATGTTTTATCCTGCTGGCCACTCATTTATTCTCATTCTGGGGAACAGTAAGCTGAAGCAGA

CATTTGTAGTGATGCTCCGGTGTGAGTCTGGTCATCTGAAGCCTGGATCCAAGGGACCCATTTTCTCTTAG

蛋白质

MMGLTEGVFLILSGTQFTLGILVNCFIELVNGSSWFKTKRMSLSDFIITTLALLRIILLCIILTDSFLIEFSPNTHDSGI

IMQIIDVSWTFTNHLSIWLATCLGVLYCLKIASFSHPTFLWLKWRVSRVMVWMLLGALLLSCGSTASLINEFKLYSVFRG

IEATRNVTEHFRKKRSEYYLIHVLGTLWYLPPLIVSLASYSLLIFSLGRHTRQMLQNGTSSRDPTTEAHKRAIRIILSFF

FLFLLYFLAFLIASFGNFLPKTKMAKMIGEVMTMFYPAGHSFILILGNSKLKQTFVVMLRCESGHLKPGSKGPIFS

hT2R4序列

DNA-(SEQ ID NO：5)

ATGCTTCGGTTATTCTATTTCTCTGCTATTATTGCCTCAGTTATTTTAAATTTTGTAGGAATCATTATGAATCTGTTTAT

TACAGTGGTCAATTGCAAAACTTGGGTCAAAAGCCATAGAATCTCCTCTTCTGATAGGATTCTGTTCAGCCTGGGCATCA

CCAGGTTTCTTATGCTGGGACTATTTCTGGTGAACACCATCTACTTCGTCTCTTCAAATACGGAAAGGTCAGTCTACCTG

TCTGCTTTTTTTGTGTTGTGTTTCATGTTTTTGGACTCGAGCAGTGTCTGGTTTGTGACCCTGCTCAATATCTTGTACTG

TGTGAAGATTACTAACTTCCAACACTCAGTGTTTCTCCTGCTGAAGCGGAATATCTCCCCAAAGATCCCCAGGCTGCTGC

TGGCCTGTGTGCTGATTTCTGCTTTCACCACTTGCCTGTACATCACGCTTAGCCAGGCATCACCTTTTCCTGAACTTGTG

ACTACGAGAAATAACACATCATTTAATATCAGTGAGGGCATCTTGTCTTTAGTGGTTTCTTTGGTCTTGAGCTCATCTCT

CCAGTTCATCATTAATGTGACTTCTGCTTCCTTGCTAATACACTCCTTGAGGAGACATATACAGAAGATGCAGAAAAATG

CCACTGGTTTCTGGAATCCCCAGACGGAAGCTCATGTAGGTGCTATGAAGCTGATGGTCTATTTCCTCATCCTCTACATT

CCATATTCAGTTGCTACCCTGGTCCAGTATCTCCCCTTTTATGCAGGGATGGATATGGGGACCAAATCCATTTGTCTGAT

TTTTGCCACCCTTTACTCTCCAGGACATTCTGTTCTCATTATTATCACACATCCTAAACTGAAAACAACAGCAAAGAAGA

TTCTTTGTTTCAAAAAATAG

蛋白质-(SEQ ID NO：6)

MLRLFYFSAIIASVILNFVGIIMNLFITVVNCKTWVKSHRISSSDRILFSLGITRFLMLGLFLVNTIYFVSSNTERSVYL

SAFFVLCFMFLDSSSVWFVTLLNILYCVKITNFQHSVFLLLKRNISPKIPRLLLACVLISAFTTCLYITLSQASPFPELV

TTRNNTSFNISEGILSLVVSLVLSSSLQFIINVTSASLLIHSLRRHIQKMQKNATGFWNPQTEAHVGAMKLMVYFLILYI

PYSVATLVQYLPFYAGMDMGTKSICLIFATLYSPGHSVLIIITHPKLKTTAKKILCFKK

hT2R5序列

DNA-(SEQ ID NO：7)

ATGCTGAGCGCTGGCCTAGGACTGCTGATGCTGGTGGCAGTGGTTGAATTTCTCATCGGTTTAATTGGAAATGGAATCCT

GGTGGTCTGGAGTTTTAGAGAATGGATCAGAAAATTCAACTGGTCCTCATATAACCTCATTATCCTGGGCCTGGCTGGCT

GCCGATTTCTCCTGCAGTGGCTGATCATTTTGGACTTAAGCTTGTTTCCACTTTTCCAGAGCAGCCGTTGGCTTCGCTAT

CTTAGTATCTTCTGGGTCCTGGTAAGCCAGGCCAGCTTATGGTTTGCCACCTTCCTCAGTGTCTTCTATTGCAAGAAGAT

CACGACCTTCGATCGCCCGGCCTACTTGTGGCTGAAGCAGAGGGCCTATAACCTGAGTCTCTGGTGCCTTCTGGGCTACT

TTATAATCAATTTGTTACTTACAGTCCAAATTGGCTTAACATTCTATCATCCTCCCCAAGGAAACAGCAGCATTCGGTAT

CCCTTTGAAAGCTGGCAGTACCTGTATGCATTTCAGCTCAATTCAGGAAGTTATTTGCCTTTAGTGGTGTTTCTTGTTTC

CTCTGGGATGCTGATTGTCTCTTTGTATACACACCACAAGAAGATGAAGGTCCATTCAGCTGGTAGGAGGGATGTCCGGG

CCAAGGCTCACATCACTGCGCTGAAGTCCTTGGGCTGCTTCCTCTTACTTCACCTGGTTTATATCATGGCCAGCCCCTTC

TCCATCACCTCCAAGACTTATCCTCCTGATCTCACCAGTGTCTTCATCTGGGAGACACTCATGGCAGCCTATCCTTCTCT

TCATTCTCTCATATTGATCATGGGGATTCCTAGGGTGAAGCAGACTTGTCAGAAGATCCTGTGGAAGACAGTGTGTGCTC

GGAGATGCTGGGGCCCATGA

蛋白质-(SEQ ID NO：8)

MLSAGLGLLMLVAVVEFLIGLIGNGILVVWSFREWIRKFNWSSYNLIILGLAGCRFLLQWLIILDLSLFPLFQSSRWLRY

LSIFWVLVSQASLWFATFLSVFYCKKITTFDRPAYLWLKQRAYNLSLWCLLGYFIINLLLTVQIGLTFYHPPQGNSSIRY

PFESWQYLYAFQLNSGSYLPLVVFLVSSGMLIVSLYTHHKKMKVHSAGRRDVRAKAHITALKSLGCFLLLHLVYIMASPF

SITSKTYPPDLTSVFIWETLMAAYPSLHSLILIMGIPRVKQTCQKILWKTVCARRCWGP

hT2R7序列：

DNA-(SEQ ID NO：9)

ATGGCAGATAAAGTGCAGACTACTTTATTGTTCTTAGCAGTTGGAGAGTTTTCAGTGGGGATCTTAGGGAATGCATTCAT

TGGATTGGTAAACTGCATGGACTGGGTCAAGAAGAGGAAAATTGCCTCCATTGATTTAATCCTCACAAGTCTGGCCATAT

CCAGAATTTGTCTATTGTGCGTAATACTATTAGATTGTTTTATATTGGTGCTATATCCAGATGTCTATGCCACTGGTAAA

GAAATGAGAATCATTGACTTCTTCTGGACACTAACCAATCATTTAAGTATCTGGTTTGCAACCTGCCTCAGCATTTACTA

TTTCTTCAAGATAGGTAATTTCTTTCACCCACTTTTCCTCTGGATGAAGTGGAGAATTGACAGGGTGATTTCCTGGATTC

TACTGGGGTGCGTGGTTCTCTCTGTGTTTATTAGCCTTCCAGCCACTGAGAATTTGAACGCTGATTTCAGGTTTTGTGTG

AAGGCAAAGAGGAAAACAAACTTAACTTGGAGTTGCAGAGTAAATAAAACTCAACATGCTTCTACCAAGTTATTTCTCAA

CCTGGCAACGCTGCTCCCCTTTTGTGTGTGCCTAATGTCCTTTTTCCTCTTGATCCTCTCCCTGCGGAGACATATCAGGC

GAATGCAGCTCAGTGCCACAGGGTGCAGAGACCCCAGCACAGAAGCCCATGTGAGAGCCCTGAAAGCTGTCATTTCCTTC

CTTCTCCTCTTTATTGCCTACTATTTGTCCTTTCTCATTGCCACCTCCAGCTACTTTATGCCAGAGACGGAATTAGCTGT

GATTTTTGGTGAGTCCATAGCTCTAATCTACCCCTCAAGTCATTCATTTATCCTAATACTGGGGAACAATAAATTAAGAC

ATGCATCTCTAAAGGTGATTTGGAAAGTAATGTCTATTCTAAAAGGAAGAAAATTCCAACAACATAAACAAATCTGA

蛋白质-(SEQID NO：10)

MADKVQTTLLFLAVGEFSVGILGNAFIGLVNCMDWVKKRKIASIDLILTSLAISRICLLCVILLDCFILVLYPDVYATGK

EMRIIDFFWTLTNHLSIWFATCLSIYYFFKIGNFFHPLFLWMKWRIDRVISWILLGCVVLSVFISLPATENLNADFRFCV

KAKRKTNLTWSCRVNKTQHASTKLFLNLATLLPFCVCLMSFFLLILSLRRHIRRMQLSATGCRDPSTEAHVRALKAVISF

LLLFIAYYLSFLIATSSYFMPETELAVIFGESIALIYPSSHSFILILGNNKLRHASLKVIWKVMSILKGRKFQQHKQI

hT2R8序列：

DNA-(SEQ ID NO：11)

ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACTAGGAATATTGGGGAATGGATACAT

TGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGACTACATCCTTACCAATTTAGTTATCG

CCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAACCCAGATGTTTATACAAAAAATAAA

CAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGATTACCACCTGCCTTAATGTCTTCTA

TTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAAATTGATATGGTGGTGCACTGGATCC

TGCTGGGATGCTTTGCCATTTCCTTGTTGGTCAGCCTTATAGCAGCAATAGTACTGAGTTGTGATTATAGGTTTCATGCA

ATTGCCAAACATAAAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGTAAAATACCATACTTTGAACCCTTaACTCTCTTTAA

CCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCATTTTTCCTTTTAGTAAGATCTTTATGGAGACATACCAAGC

AAATAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCCAGCACAGAAGTTCATGTGAGAGCCATTAAAACTATGACTTCATTT

ATCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCTTCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTATGACAAAATACAAGTTAGCTGT

GGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATTCTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAATTGTTTTAAATAATAAACTGAGGC

AGACATTTGTCAGAATGCTGACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA

蛋白质-(SEQ ID NO：12)

MFSPADNIFIILITGEFILGILGNGYIALVNWIDWIKKKKISTVDYILTNLVIARICLISVMVVNGIVIVLNPDVYTKNK

QQIVIFTFWTFANYLNMWITTCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMVVHWILLGCFAISLLVSLIAAIVLSCDYRFHA

IAKHKRNITEMFHVSKIPYFEPLTLFNLFAIVPFIVSLISFFLLVRSLWRHTKQIKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSF

IFFFFLYYISSILMTFSYLMTKYKLAVEFGEIAAILYPLGHSLILIVLNNKLRQTFVRMLTCRKIACMI

hT2R9序列：

hT2R9V

cDNA-(SEQ ID NO：13)

ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGATTCAT

TGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGCTTGGCCATCT

CCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACATATGGCAATAGCGTG

CTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACTTCTTGCCTCAGTATCTTCTA

TTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAGATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTC

TTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGATGATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGT

CATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCAGGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGT

GATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTGTTACTTTTCTCCCTAGTTAGACACACCAAGCAGATTCGAC

TGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAGGCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTC

CTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTTATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGG

TGACATAGTAACTGTCATTTTCCCATCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTC

TGAAGATGTTAAGATTTGTGAAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG

蛋白质(SEQ ID NO：14)

MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILISLAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSV

LVSIVNVVWTFANNSSLWFTSCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKNDDMWYHLFKVS

HEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMVPFILCLISFFLLLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAIKAVIIFLLL

LIVYYPVFLVMTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFVKCFLRRRKPFVP

hT2R9A

cDNA-(SEQ ID NO：15)

ATGCCAAGTGCAATAGAGGCAATATATATTATTTTAATTGCTGGTGAATTGACCATAGGGATTTGGGGAAATGGATTCAT

TGTACTAGTTAACTGCATTGACTGGCTCAAAAGAAGAGATATTTCCTTGATTGACATCATCCTGATCAGCTTGGCCATCT

CCAGAATCTGTCTGCTGTGTGTAATATCATTAGATGGCTTCTTTATGCTGCTCTTTCCAGGTACATATGGCAATAGCGTG

CTAGTAAGCATTGTGAATGTTGTCTGGACATTTGCCAATAATTCAAGTCTCTGGTTTACTTCTTGCCTCAGTATCTTCTA

TTTACTCAAGATAGCCAATATATCGCACCCATTTTTCTTCTGGCTGAAGCTAAAGATCAACAAGGTCATGCTTGCGATTC

TTCTGGGGTCCTTTCTTATCTCTTTAATTATTAGTGTTCCAAAGAATGATGATATGTGGTATCACCTTTTCAAAGTCAGT

CATGAAGAAAACATTACTTGGAAATTCAAAGTGAGTAAAATTCCAGGTACTTTCAAACAGTTAACCCTGAACCTGGGGGC

GATGGTTCCCTTTATCCTTTGCCTGATCTCATTTTTCTTGTTACTTTTCTCCCTAGTTAGACACACCAAGCAGATTCGAC

TGCATGCTACAGGGTTCAGAGACCCCAGTACAGAGGCCCACATGAGGGCCATAAAGGCAGTGATCATCTTTCTGCTCCTC

CTCATCGTGTACTACCCAGTCTTTCTTGTTATGACCTCTAGCGCTCTGATTCCTCAGGGAAAATTAGTGTTGATGATTGG

TGACATAGTAACTGTCATTTTCCCATCAAGCCATTCATTCATTCTAATTATGGGAAATAGCAAGTTGAGGGAAGCTTTTC

TGAAGATGTTAAGATTTGTGAAGTGTTTCCTTAGAAGAAGAAAGCCTTTTGTTCCATAG

蛋白质-(SEQ ID NO：16)

MPSAIEAIYIILIAGELTIGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIILISLAISRICLLCVISLDGFFMLLFPGTYGNSV

LVSIVNVVWTFANNSSLWFTSCLSIFYLLKIANISHPFFFWLKLKINKVMLAILLGSFLISLIISVPKNDDMWYHLFKVS

HEENITWKFKVSKIPGTFKQLTLNLGVMAPFILCLISFFLLLFSLVRHTKQIRLHATGFRDPSTEAHMRAIKAVIIFLLL

LIVYYPVFLVMTSSALIPQGKLVLMIGDIVTVIFPSSHSFILIMGNSKLREAFLKMLRFVKCFLRRRKPFVP

hT2R10序列：

DNA-(SEQ ID NO：17)

ATGCTACGTGTAGTGGAAGGCATCTTCATTTTTGTTGTAGTTAGTGAGTCAGTGTTTGGGGTTTTGGGGAATGGATTTAT

TGGACTTGTAAACTGCATTGACTGTGCCAAGAATAAGTTATCTACGATTGGCTTTATTCTCACCGGCTTAGCTATTTCAA

GAATTTTTCTGATATGGATAATAATTACAGATGGATTTATACAGATATTCTCTCCAAATATATATGCCTCCGGTAACCTA

ATTGAATATATTAGTTACTTTTGGGTAATTGGTAATCAATCAAGTATGTGGTTTGCCACCAGCCTCAGCATCTTCTATTT

CCTGAAGATAGCAAATTTTTCCAACTACATATTTCTCTGGTTGAAGAGCAGAACAAATATGGTTCTTCCCTTCATGATAG

TATTCTTACTTATTTCATCGTTACTTAATTTTGCATACATTGCGAAGATTCTTAATGATTATAAAACGAAGAATGACACA

GTCTGGGATCTCAACATGTATAAAAGTGAATACTTTATcAAgCAGATTTTGCTAAATCTGGGAGTCATTTTCTTCTTTAC

ACTATCCCTAATTACATGTATTTTTTTAATCATTTCCCTTTGGAGACACAACAGGCAGATGCAATCGAATGTGACAGGAT

TGAGAGACTCCAACACAGAAGCTCATGTGAAGGCAATGAAAGTTTTGATATCTTTCATCATCCTCTTTATCTTGTATTTT

ATAGGCATGGCCATAGAAATATCATGTTTTACTGTGCGAGAAAACAAACTGCTGCTTATGTTTGGAATGACAACCACAGC

CATCTATCCCTGGGGTCACTCATTTATCTTAATTCTAGGAAACAGCAAGCTAAAGCAAGCCTCTTTGAGGGTACTGCAGC

AATTGAAGTGCTGTGAGAAAAGGAAAAATCTCAGAGTCACATAG

蛋白质-(SEQ ID NO：18)

MLRVVEGIFIFVVVSESVFGVLGNGFIGLVNCIDCAKNKLSTIGFILTGLAISRIFLIWIIITDGFIQIFSPNIYASGNL

IEYISYFWVIGNQSSMWFATSLSIFYFLKIANFSNYIFLWLKSRTNMVLPFMIVFLLISSLLNFAYIAKILNDYKTKNDT

VWDLNMYKSEYFIKQILLNLGVIFFFTLSLITCIFLIISLWRHNRQMQSNVTGLRDSNTEAHVKAMKVLISFIILFILYF

IGMAIEISCFTVRENKLLLMFGMTTTAIYPWGHSFILIIGNSKLKQASLRVLQQLKCCEKRKNLRVT

hT2R13序列：

DNA-(SEQ ID NO：19)

ATGGAAAGTGCCCTGCCGAGTATCTTCACTCTTGTAATAATTGCAGAATTCATAATTGGGAATTTGAGCAATGGATTTAT

AGTACTGATCAACTGCATTGACTGGGTCAGTAAAAGAGAGCTGTCCTCAGTCGATAAACTCCTCATTATCTTGGCAATCT

CCAGAATTGGGCTGATCTGGGAAATATTAGTAAGTTGGTTTTTAGCTCTGCATTATCTAGCCATATTTGTGTCTGGAACA

GGATTAAGAATTATGATTTTTAGCTGGATAGTTTCTAATCACTTCAATCTCTGGCTTGCTACAATCTTCAGCATCTTTTA

TTTGCTCAAAATAGCGAGTTTCTCTAGCCCTGCTTTTCTCTATTTGAAGTGGAGAGTAAACAAAGTGATTCTGATGATAC

TGCTAGGAACCTTGGTCTTCTTATTTTTAAATCTGATACAAATAAACATGCATATAAAAGACTGGCTGGACCGATATGAA

AGAAACACAACTTGGAATTTCAGTATGAGTGACTTTGAAACATTTTCAGTGTCGGTCAAATTCACTATGACTATGTTCAG

TCTAACACCATTTACTGTGGCCTTCATCTCTTTTCTCCTGTTAATTTTCTCCCTGCAaAAACATCTCCAGAAAATGCAAC

TCAATTACAAAGGACACAGAGACCCCAGGACCAAGGTCCATACAAATGCCTTGAAAATTGTGATCTCATTCCTTTTATTC

TATGCTAGTTTCTTTCTATGTGTTCTCATATCATGGATTTCTGAGCTGTATCAGAGCACAGTGATCTACATGCTTTGTGA

GACGATTGGAGTCTTCTCTCCTTCAAGCCACTCCTTTCTTCTGATTCTAGGAAACGCTAAGTTAAGACAGGCCTTTCTTT

TGGTGGCAGCTAAGGTATGGGCTAAACGATGA

蛋白质-(SEQ ID NO：20)

MESALPSIFTLVIIAEFIIGNLSNGFIVLINCIDWVSKRELSSVDKLLIILAISRIGLIWEILVSWFLALHYLAIFVSGT

GLRIMIFSWIVSNHFNLWLATIFSIFYLLKIASFSSPAFLYLKWRVNKVILMILLGTLVFLFLNLIQINMHIKDWLDRYE

RNTTWNFSMSDFETFSVSVKFTMTMFSLTPFTVAFISFLLLIFSLQKHLQKMQLNYKGHRDPRTKVHTNALKIVISFLLF

YASFFLCVLISWISELYQSTVIYMLCETIGVFSPSSHSFLLILGNAKLRQAFLLVAAKVWAKR

hT2R14序列：

DNA-(SEQ ID NO：21)

ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCGTTTTAATTGTGGAATTTATAATTGGAAATTTAGGAAATAGTTTCAT

AGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGATCGGATCCTCACTGCTTTGGCAATCT

CTCGAATTAGCCTGGTTTGGTTAATATTCGGAAGCTGGTGTGTGTCTGTGTTTTTCCCAGCTTTATTTGCCACTGAAAAA

ATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAGTGTCTGGTTAGCTACAGGCCTCGGTACTTTTTA

TTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAAGTGGAGaGTTAAAAAGGTGGTTTTGGTGCTGC

TTCTTGTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATATTGCACTGATAAACATCCATATAAATGCCAGTATCAATGGATACAGA

AGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTTTCCAGTCTTATTGTATTAACCAGCACTGTGTTCAT

TTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCTTCTCCTCATCTTCTCCATGTGGAAACATCGCAAGAAGATGCAGC

ACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAAGCCCACAGAGGAGTTAAAAGTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTAT

GCCATTTTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCAGTTTGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGAAAATCTAATTATTCTTTCCCAGGT

GATGGGAATGGCTTATCCTTCATGTCACTCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGAAGCTGAGACAGGCCTCTCTGTCAG

TGCTACTGTGGCTGAGGTACATGTTCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGAATTTAGAGAATCATCTTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：22)

MGGVIKSIFTFVLIVEFIIGNLGNSFIALVNCIDWVKGRKISSVDRILTALAISRISLVWLIFGSWCVSVFFPALFATEK

MFRMLTNIWTVINHFSVWLATGIGTFYFLKIANFSNSIFLYLKWRVKKVVLVLLLVTSVFLFLNIALINIHINASINGYR

RNKTCSSDSSNFTRFSSLIVLTSTVFIFIPFTLSLAMFLLLIFSMWKHRKKMQHTVKISGDASTKAHRGVKSVITFFLLY

AIFSLSFFISVWTSERLEENLIILSQVMGMAYPSCHSCVLILGNKKLRQASLSVLLWLRYMFKDGEPSGHKEFRESS

hT2R16序列：

DNA-(SEQ ID NO：23)

ATGATACCCATCCAACTCACTGTCTTCTTCATGATCATCTATGTGCTTGAGTCCTTGACAATTATTGTGCAGAGCAGCCT

AATTGTTGCAGTGCTGGGCAGAGAATGGCTGCAAGTCAGAAGGCTGATGCCTGTGGACATGATTCTCATCAGCCTGGGCA

TCTCTCGCTTCTGTCTACAGTGGGCATCAATGCTGAACAATTTTTGCTCCTATTTTAATTTGAATTATGTACTTTGCAAC

TTAACAATCACCTGGGAATTTTTTAATATCCTTACATTCTGGTTAAACAGCTTGCTTACCGTGTTCTACTGCATCAAGGT

CTCTTCTTTCACCCATCACATCTTTCTCTGGCTGAGGTGGAGAATTTTGAGGTTGTTTCCCTGGATATTACTGGGTTCTC

TGATGATTACTTGTGTAACAATCATCCCTTCAGCTATTGGGAATTACATTCAAATTCAGTTACTCACCATGGAGCATCTA

CCAAGAAACAGCACTGTAACTGACAAACTTGAAAATTTTCATCAGTATCAGTTCCAGGCTCATACAGTTGCATTGGTTAT

TCCTTTCATCCTGTTCCTGGCCTCCACCATCTTTCTCATGGCATCACTGACCAAGCAGATACAACATCATAGCACTGGTC

ACTGCAATCCAAGCATGAAAGCGCaCTTCACTGCCCTGAGGTCCCTTGCCGTCTTATTTATTGTGTTTACCTCTTACTTT

CTAACCATACTCATCACCATTATAGGTACTCTATTTGATAAGAGATGTTGGTTATGGGTCTGGGAAGCTTTTGTCTATGC

TTTCATCTTAATGCATTCCACTTCACTGATGCTGAGCAGCCCTACGTTGAAAAGGATTCTAAAGGGAAAGTGCTAG

蛋白质-(SEQ ID NO：24)

MIPIQLTVFFMIIYVLESLTIIVQSSLIVAVLGREWLQVRRLMPVDMILISLGISRFCLQWASMLNNFCSYFNLNYVLCN

LTITWEFFNILTFWLNSLLTVFYCIKVSSFTHHIFLWLRWRILRLFPWILLGSLMITCVTIIPSAIGNYIQIQLLTMEHL

PRNSTVTDKLENFHQYQFQAHTVALVIPFILFLASTIFLMASLTKQIQHHSTGHCNPSMKAHFTALRSLAVLFIVFTSYF

LTILITIIGTLFDKRCWLWVWEAFVYAFILMHSTSLMLSSPTLKRILKGKC

hT2R44序列：

DNA-(SEQ ID NO：25)

ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTATATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCAT

AGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGTTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCT

CCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTGTTATTACTACATTGGTATGCAACTCAGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTA

AGAATTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCAACCATTTCAGCAGCTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATGTTTTATTT

GCTCAGGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCGCATAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGT

TGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGGATGAGACTGTATGGACAAAAGAATATGAAGGA

AACGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAATGTACCATTCAAATATGACTCTAACCATGCTAGCAAACTTTGTACC

CCTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAaCTCCATGGCA

AAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTTCTTCTGTTATGTGCCATT

TACTTTCTGTCCATGATCATATCAGTTTGTAATTTGGGGAGGCTGGAAAAGCAACCTGTCTTCATGTTCTGCCAAGCTAT

TATATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTTGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGATTTTTCTTTCAGTTT

TGCGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGACAGAAGCCTTCGTCTCCATAGATTCACAAGAGGGGCATTGTGTGTCTTCTAG

蛋白质-(SEQ ID NO：26)

MITFLPIIFSILIVVIFVIGNFANGFIALVNSIEWVKRQKISFVDQILTALAVSRVGLLWVLLLHWYATQLNPAFYSVEV

RITAYNVWAVTNHFSSWLATSLSMFYLLRIANFSNLIFLRIKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMDETVWTKEYEG

NVTWKIKLRSAMYHSNMTLTMLANFVPLTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKALQTVTSFLLLCAI

YFLSMIISVCNLGRLEKQPVFMFCQAIIFSYPSTHPFILILGNKKLKQIFLSVLRHVRYWVKDRSLRLHRFTRGALCVF

hT2R50序列：

DNA-(SEQ ID NO：27)

ATGATAACTTTTCTGCCCATCATATTTTCCATTCTAGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCAT

AGCGTTGGTgAATTCCACCGAGTGGGTGAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTGTCACTGCTCTGGCGGTCT

CCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTGTTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAgTTA

AGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCCTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTT

GCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCGCTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGGTGCTGT

TGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGGTAAACATGAATCAGATTGTATGGACAAAAGAATATGAAGGA

AACATGACTTGGAAGATCAAATTGAGGCGTGCAATGTACCTTTCAGATACGACTGTAACCATGCTAGCAAACTTAGTACC

CTTTACTGTAACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAGTCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGCA

AAGGATCTCAAGATCCCAGTACCAAGGTCCACATAAAAGTTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCTTCTTGTTATGTGCCATT

TACTTTGTGTCTGTAATAATATCAGTTTGGAGTTTTAAGAATCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCCAAGCTAT

TGGATTCAGCTGTTCTTCAGCCCACCCGTTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTATCTTTCAGTTT

TGTGGCAAATGAGGTACTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：28)

MITFLPIIFSILVVVTFVIGNFANGFIALVNSTEWVKRQKISFADQIVTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFYSVEL

RTTAYNIWAVTGHFSNWPATSLSIFYLLKIANFSNLIFLRLKRRVKSVILVVLLGPLLFLACHLFVVNMNQIVWTKEYEG

NMTWKIKLRRAMYLSDTTVTMLANLVPFTVTLISFLLLVCSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKVLQTVISFFLLCAI

YFVSVIISVWS FKNLENKPVFMFCQAIGFSCSSAHPFILIWGNKKLKQTYLSVLWQMRY

hT2R51序列：

DNA-(SEQ ID NO：29)

ATGTTGACTCTAACTCGCATCCGCACTGTGTCCTATGAAGTCAGGAGTACATTTCTGTTCATTTCAGTCCTGGAGTTTGC

AGTGGGGTTTCTGACCAATGCCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGCCACTGAGCAACAGTG

ATTGTGTGCTGCTGTGTCTCAGCATCAGCCGGCTTTTCCTGCATGGACTGCTGTTCCTGAGTGCTATCCAGCTTACCCAC

TTCCAGAAGTTGAGTGAACCACTGAACCACAGCTACCAAGCCATCATCATGCTATGGATGATTGCAAACCAAGCCAACCT

CTGGCTTGCTGCCTGCCTCAGCCTGCTTTACTGCTCCAAGCTCATCCGTTTCTCTCACACCTTCCTGATCTGCTTGGCAA

GCTGGGTCTCCAGGAAGATCTCCCAGATGCTCCTGGGTATTATTCTTTGCTCCTGCATCTGCACTGTCCTCTGTGTTTGG

TGCTTTTTTAGCAGACCTCACTTCACAGTCACAACTGTGCTATTCATGAATAACAATACAAGGCTCAACTGGCAGATTAA

AGATCTCAATTTATTTTATTCCTTTCTCTTCTGCTATCTGTGGTCTGTGCCTCCTTTCCTATTGTTTCTGGTTTCTTCTG

GGATGCTGACTGTCTCCCTGGGAAGGCACATGAGGACAATGAAGGTCTATACCAGAAACTCTCGTGACCCCAGCCTGGAG

GCCCACATTAAAGCCCTCAAGTCTCTTGTCTCCTTTTTCTGCTTCTTTGTGATATCATCCTGTGcTGCCTTCATCTCTGT

GCCCCTACTGATTCTGTGGCGCGACAAAATAGGGGTGATGGTTTGTGTTGGGATAATGGCAGCTTGTCCCTCTGGGCATG

CAGCCgTCCTGATCTCAGGCAATGCCAAGTTGAGGAGAGCTGTGATGACCATTCTGCTCTGGGCTCAGAGCAGCCTGAAG

GTAAGAGCCGACCACAAGGCAGATTCCCGGACACTGTGCTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：30)

MLTLTRIRTVSYEVRSTFLFISVLEFAVGFLTNAFVFLVNFWDVVKRQPLSNSDCVLLCLSISRLFLHGLLFLSAIQLTH

FQKLSEPLNHSYQAIIMLWMIANQANLWLAACLSLLYCSKLIRFSHTFLICLASWVSRKISQMLLGIILCSCICTVLCVW

CFFSRPHFTVTTVLFMNNNTRLNWQIKDLNLFYSFLFCYLWSVPPFLLFLVSSGMLTVSLGRHMRTMKVYTRNSRDPSLE

AHIKALKSLVSFFCFFVISSCAAFISVPLLILWRDKIGVMVCVGIMAACPSGHAAVLISGNAKLRRAVMTILLWAQSSLK

VRADHKADSRTLC

hT2R54序列：

DNA-(SEQ ID NO：31)

ATGACTAAACTCTGCGATCCTGCAGAAAGTGAATTGTCGCCATTTCTCATCACCTTAATTTTAGCAGTTTTACTTGCTGA

ATACCTCATTGGTATCATTGCAAATGGTTTCATCATGGCTATACATGCAGCTGAATGGGTTCAAAATAAGGCAGTTTCCA

CAAGTGGCAGGATCCTGGTTTTCCTGAGTGTATCCAGAATAGCTCTCCAAAGCCTCATGATGTTAGAAATTACCATCAGC

TCAACCTCCCTAAGTTTTTATTCTGAAGACGCTGTATATTATGCATTCAAAATAAGTTTTATATTCTTAAATTTTTGTAG

CCTGTGGTTTGCTGCCTGGCTCAGTTTCTTCTACTTTGTGAAGATTGCCAATTTCTCCTACCCCCTTTTCCTCAAACTGA

GGTGGAGAATTACTGGATTGATACCCTGGCTTCTGTGGCTGTCCGTGTTTATTTCCTTCAGTCACAGCATGTTCTGCATC

AACATCTGCACTGTGTATTGTAACAATTCTTTCCCTATCCACTCCTCCAACTCCACTAAGAAAACATACTTGTCTGAGAT

CAATGTGGTCGGTCTGGCTTTTTTCTTTAACCTGGGGATTGTGACTCCTCTGATCATGTTCATCCTGACAGCCACCCTGC

TGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAACGACCCCAGCATGGAGGCTCAC

ATGGGGGCCATCAAAGCTATCAGCTACTTTCTCATTCTCTACATTTTCAATGCAGTTGCTCTGTTTATCTACCTGTCCAA

CATGTTTGACATCAACAGTCTGTGGAATAATTTGTGCCAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCAGCCACTCAATTCTAC

TGATTCAAGATAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGCTTCAGCTTCGACTTCATCTTTACCCAAAAGAGTGGACT

CTGTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：32)

MTKLCDPAESELSPFLITLILAVLLAEYLIGIIANGFIMAIHAAEWVQNKAVSTSGRILVFLSVSRIALQSLMMLEITIS

STSLSFYSEDAVYYAFKISFIFLNFCSLWFAAWLSFFYFVKIANFSYPLFLKLRWRITGLIPWLLWLSVFISFSHSMFCI

NICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTYLSEINVVGLAFFFNLGIVTPLIMFILTATLLILSLKRHTLHMGSNATGSNDPSMEAH

MGAIKAISYFLILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQIIMAAYPASHSILLIQDNPGLRRAWKRLQLRLHLYPKEWT

L

hT2R55序列：

DNA-(SEQ ID NO：33)

ATGGCAACGGTGAACACAGATGCCACAGATAAAGACATATCCAAGTTCAAGGTCACCTTCACTTTGGTGGTCTCCGGAAT

AGAGTGCATCACTGGCATCCTTGGGAGTGGCTTCATCACGGCCATCTATGGGGCTGAGTGGGCCAGGGGCAAAACACTCC

CCACTGGTGACCGCATTATGTTGATGCTGAGCTTTTCCAGGCTCTTGCTACAGATTTGGATGATGCTGGAGAACATTTTC

AGTCTGCTATTCCGAATTGTTTATAACCAAAACTCAGTGTATATCCTCTTCAAAGTCATCACTGTCTTTCTGAACCATTC

CAATCTCTGGTTTGCTGCCTGGCTCAAAGTCTTCTATTGTCTTAGAATTGCAAACTTCAATCATCCTTTGTTCTTCCTGA

TGAAGAGGAAAATCATAGTGCTGATGCCTTGGCTTCTCAGGCTGTCAGTGTTGGTTTCCTTAAGCTTCAGCTTTCCTCTC

TCGAGAGATGTCTTCAATGTGTATGTGAATAGCTCCATTCCTATCCCCTCCTCCAACTCCACGGAGAAGAAGTACTTCTC

TGAGACCAATATGGTCAACCTGGTATTTTTCTATAACATGGGGATCTTCGTTCCTCTGATCATGTTCATCCTGGCAGCCA

CCCTGCTGATCCTCTCTCTCAAGAGACACACCCTACACATGGGAAGCAATGCCACAGGGTCCAGGGACCCCAGCATGAAG

GCTCACATAGGGGCCATCAAAGCCACCAGCTACTTTCTCATCCTCTACATTTTCAATGCAATTGCTCTATTTCTTTCCAC

GTCCAACATCTTTGACACTTACAGTTCCTGGAATATTTTGTGCAAGATCATCATGGCTGCCTACCCTGCCGGCCACTCAG

TACAACTGATCTTGGGCAACCCTGGGCTGAGAAGAGCCTGGAAGCGGTTTCAGCACCAAGTTCCTCTTTACCTAAAAGGG

CAGACTCTGTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：34)

MATVNTDATDKDISKFKVTFTLVVSGIECITGILGSGFITAIYGAEWARGKTLPTGDRIMLMLSFSRLLLQIWMMLENIF

SLLFRIVYNQNSVYILFKVITVFLNHSNLWFAAWLKVFYCLRIANFNHPLFFLMKRKIIVLMPWLLRLSVLVSLSFSFPL

SRDVFNVYVNSSIPIPSSNSTEKKYFSETNMVNLVFFYNMGIFVPLIMFILAATLLILSLKRHTLHMGSNATGSRDPSMK

AHIGAIKATSYFLILYIFNAIALFLSTSNIFDTYSSWNILCKIIMAAYPAGHSVQLILGNPGLRRAWKRFQHQVPLYLKG

QTL

hT2R61序列：

DNA-(SEQ ID NO：35)

ATGATAACTTTTCTACCCATCATTTTTTCCAGTCTGGTAGTGGTTACATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCAT

AGCACTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCCTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCT

CCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAACTGGTATTCAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTAATAGTGTAGAAGTA

AGAACTACTGCTTATAATATCTGGGCAGTGATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTACCCTCAGCATATTTTATTT

GCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACTTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGTTGT

TGGGGCCTTTGCTATTTTTGGCTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATGAGATTGTGCGGACAAAAGAATTTGAAGGA

AACATGACTTGGAAGATCAAATTGAAGAGTGCAATGTACTTTTCAAATATGACTGTAACCATGGTAGCAAACTTAGTACC

CTTCACTCTGACCCTACTATCTTTTATGCTGTTAATCTGTTCTTTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTA

AAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATT

TACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGAAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTAT

TAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTT

TTTGGCAAATGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG

蛋白质-(SEQ ID NO：36)

MITFLPIIFSSLVVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVLNPAFNSVEV

RTTAYNIWAVINHFSNWLATTLSIFYLLKIANFSNFIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACHLFVINMNEIVRTKEFEG

NMTWKIKLKSAMYFSNMTVTMVANLVPFTLTLLSFMLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKALQTVISFLLLCAI

YFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVFWQMRYWVKGEKTSSP

hT2R64序列：

DNA-(SEQ ID NO：37)

ATGACAACTTTTATACCCATCATTTTTTCCAGTGTGGTAGTGGTTCTATTTGTTATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCAT

AGCATTGGTAAATTCCATTGAGCGGGTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAGATTCTCACTGCTCTGGCGGTCT

CCAGAGTTGGTTTGCTCTGGGTATTATTATTAAATTGGTATTCAACTGTGTTTAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAAGTA

AGAACTACTGCTTATAATGTCTGGGCAGTAACCGGCCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTT

GCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTCATTCTGGTGATGCTGT

TGGGGCCTTTACTATTTTTGGCTTGTCAACTTTTTGTGATAAACATGAAAGAGATTGTACGGACAAAAGAATATGAAGGA

AACTTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAGTGCAGTGTACCTTTCAGATGCGACTGTAACCACGCTAGGAAACTTAGTGCC

CTTCACTCTGACCCTGCTATGTTTTTTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGTA

AAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGATCTTTTTCCTCTTGTTATGTGCCGTT

TACTTTCTGTCCATAATGATATCAGTTTGGAGTTTTGGGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCAAAGCTAT

TAGATTCAGCTATCCTTCAATCCACCCATTCATCCTGATTTGGGGAAACAAGAAGCTAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTT

TGCGGCAAGTGAGGTACTGGGTGAAGGGAGAGAAGCCTTCATCTCCATAG

蛋白质-(SEQ ID NO：38)

MTTFIPIIFSSVVVVLFVIGNFANGFIALVNSIEWVKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLLLNWYSTVFNPAFYSVEV

RTTAYNVWAVTGHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVILVMLLGPLLFLACQLFVINMKEIVRTKEYEG

NMTWKIKLRSAVYLSDATVTTLGNLVPFTLTLLCFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSTKVHIKVLQTVIFFLLLCAI

YFLSIMISVWSFGSLENKPVFMFCKAIRFSYPSIHPFILIWGNKKLKQTFLSVLRQVRYWVKGEKPSSP

hT2R65序列：

DNA-(SEQ ID NO：39)

ATGATGTGTTTTCTGCTCATCATTTCATCAATTCTGGTAGTGTTTGCATTTGTTCTTGGAAATGTTGCCAATGGCTTCAT

AGCCCTAGTAAATGTCATTGACTGGGTTAACACACGAAAGATCTCCTCAGCTGAGCAAATTCTCACTGCTCTGGTGGTCT

CCAGgATTGGTTTACTCTGGGTCATGTTATTCCTTTGGTATGCAACTGTGTTTAATTCTGCTTTATATGGTTTAGAAGTA

AGAATTGTTGCTTCTAATGCCTGGGCTGTAACGAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAGCCTCAGCATATTTTGTTT

GCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTCTCTCCACCTAAAGAAGAGAATTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTGT

TGGGGCCCTTGGTATTTCTGATTTGTAATCTTGCTGTGATAACCATGGATGAGAGAGTGTGGACAAAAGAATATGAAGGA

AATGTGACTTGGAAGATCAAATTGAGGAATGCAATACACCTTTCAAGCTTGACTGTAACTACTCTAGCAAACCTCATACC

CTTTACTCTGAGCCTAATATGTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTTTGTAAACATCTCAAGAAGATGCGGCTCCATAGCA

AAGGATCTCAAGATCCCAGCACCAAGGTCCATATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCATGTTATTTGCCATT

TACTTTCTGTGTATAATCACATCAACTTGGAATCTTAGGACACAGCAGAGCAAACTTGTACTCCTGCTTTGCCAAACTGT

TGCAATCATGTATCCTTCATTCCACTCATTCATCCTGATTATGGGAAGTAGGAAGCTAAAACAGACCTTTCTTTCAGTTT

TGTGGCAGATGACACGCTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：40)

MMCFLLIISSILVVFAFVLGNVANGFIALVNVIDWVNTRKISSAEQILTALVVSRIGLLWVMLFLWYATVFNSALYGLEV

RIVASNAWAVTNHFSMWLAASLSIFCLLKIANFSNLISLHLKKRIKSVVLVILLGPLVFLICNLAVITMDERVWTKEYEG

NVTWKIKLRNAIHLSSLTVTTLANLIPFTLSLICFLLLICSLCKHLKKMRLHSKGSQDPSTKVHIKALQTVTSFLMLFAI

YFLCIITSTWNLRTQQSKLVLLLCQTVAIMYPSFHSFILIMGSRKLKQTFLSVLWQMTR

hT2R67序列：

DNA-(SEQ ID NO：41)

ATGATAACTTTTCTATACATTTTTTTTTCAATTCTAATAATGGTTTTATTTGTTCTCGGAAACTTTGCCAATGGCTTCAT

AGCACTGGTAAATTTCATTGACTGGGTGAAGAGAAAAAAGATCTCCTCAGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCGGTCT

CCAGAATTGGTTTGCTCTGGGCATTATTATTAAATTGGTATTTAACTGTGTTGAATCCAGCTTTTTATAGTGTAGAATTA

AGAATTACTTCTTATAATGCCTGGGTTGTAACCAACCATTTCAGCATGTGGCTTGCTGCTAACCTCAGCATATTTTATTT

GCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTCTTTTTCTTCATTTAAAGAGGAGAGTTAGGAGTGTCATTCTGGTGATACTGT

TGGGGACTTTGATATTTTTGGTTTGTCATCTTCTTGTGGCAAACATGGATGAGAGTATGTGGGCAGAAGAATATGAAGGA

AACATGACTGGGAAGATGAAATTGAGGAATACAGTACATCTTTCATATTTGACTGTAACTACCCTATGGAGCTTCATACC

CTTTACTCTGTCCCTGATATCTTTTCTGATGCTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAGAAGATGCAGCTCCATGGAG

AAGGATCGCAAGATCTCAGCACCAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTCTGATCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATT

TTCTTTCTATTCCTAATCGTTTCGGTTTGGAGTCCTAGGAGGCTGCGGAATGACCCGGTTGTCATGGTTAGCAAGGCTGT

TGGAAACATATATCTTGCATTCGACTCATTCATCCTAATTTGGAGAACCAAGAAGCTAAAACACACCTTTCTTTTGATTT

TGTGTCAGATTAGGTGCTGA

蛋白质-(SEQ ID NO：42)

MITFLYIFFSILIMVLFVLGNFANGFIALVNFIDWVKRKKISSADQILTALAVSRIGLLWALLLNWYLTVLNPAFYSVEL

RITSYNAWVVTNHFSMWLAANLSIFYLLKIANFSNLLFLHLKRRVRSVILVILLGTLIFLVCHLLVANMDESMWAEEYEG

NMTGKMKLRNTVHLSYLTVTTLWSFIPFTLSLISFLMLICSLCKHLKKMQLHGEGSQDLSTKVHIKALQTLISFLLLCAI

FFLFLIVSVWSPRRLRNDPVVMVSKAVGNIYLAFDSFILIWRTKKLKHTFLLILCQIRC

hT2R71序列：

DNA-(SEQ ID NO ：43)

ATGCAAGCAGCACTGACGGCCTTCTTCGTGTTGCTCTTTAGCCTGCTGAGTCTTCTGGGGATTGCAGCGAATGGCTTCAT

TGTGCTGGTGCTGGGCAGGGAGTGGCTGCGATATGGCAGGTTGCTGCCCTTGGATATGATCCTCATTAGCTTGGGTGCCT

CCCGCTTCTGCCTGCAGTTGGTTGGGACGGTGCACAACTTCTACTACTCTGCCCAGAAGGTCGAGTACTCTGGGGGTCTC

GGCCGACAGTTCTTCCATCTACACTGGCACTTCCTGAACTCAGCCACCTTCTGGTTTTGCAGCTGGCTCAGTGTCCTGTT

CTGTGTGAAGATTGCTAACATCACACACTCCACCTTCCTGTGGCTGAAGTGGAGGTTCCCAGGGTGGGTGCCCTGGCTCC

TGTTGGGCTCTGTCCTGATCTCCTTCATCATAACCCTGCTGTTTTTTTGGGTGAACTACCCTGTATATCAAGAATTTTTA

ATTAGAAAATTTTCTGGGAACATGACCTACAAGTGGAATACAAGGATAGAAACATACTATTTCCCATCCCTGAAACTGGT

CATCTGGTCAATTCCTTTTTCTGTTTTTCTGGTCTCAATTATGCTGTTAATTAATTCTCTGAGGAGGCATACTCAGAGAA

TGCAGCACAACGGGCACAGCCTGCAGGACCCCAGCACCCAGGCTCACACCAGAGCTCTGAAGTCCCTCATCTCCTTCCTC

ATTCTTTATGCTCTGTCCTTTCTGTCCCTGATCATTGATGCCGCAAAATTTATCTCCATGCAGAACGACTTTTACTGGCC

ATGGCAAATTGCAGTCTACCTGTGCATATCTGTCCATCCCTTCATCCTCATCTTCAGCAACCTCAAGCTTCGAAGCGTGT

TCTCGCAGCTCCTGTTGTTGGCAAGGGGCTTCTGGGTGGCCTAG

蛋白质-(SEQ ID NO：44)

MQAALTAFFVLLFSLLSLLGIAANGFIVLVLGREWLRYGRLLPLDMILISLGASRFCLQLVGTVHNFYYSAQKVEYSGGL

GRQFFHLHWHFLNSATFWFCSWLSVLFCVKIANITHSTFLWLKWRFPGWVPWLLLGSVLISFIITLLFFWVNYPVYQEFL

IRKFSGNMTYKWNTRIETYYFPSLKLVIWSIPFSVFLVSIMLLINSLRRHTQRMQHNGHSLQDPSTQAHTRALKSLISFL

ILYALSFLSLIIDAAKFISMQNDFYWPWQIAVYLCISVHPFILIFSNLKLRSVFSQLLLLARGFWVA

hT2R75序列：

DNA-(SEQ ID NO：45)

ATGATAACTTTTCTGCCCATCATTTTTTCCATTCTAATAGTGGTTACATTTGTGATTGGAAATTTTGCTAATGGCTTCAT

AGCATTGGTAAATTCCATTGAGTGGTTCAAGAGACAAAAGATCTCTTTTGCTGACCAAATTCTCACTGCTCTGGCAGTCT

CCAGAGTTGGTTTACTCTGGGTATTAGTATTAAATTGGTATGCAACTGAGTTGAATCCAGCTTTTAACAGTATAGAAGTA

AGAATTACTGCTTACAATGTCTGGGCAGTAATCAACCATTTCAGCAACTGGCTTGCTACTAGCCTCAGCATATTTTATTT

GCTCAAGATTGCCAATTTCTCCAACCTTATTTTTCTTCACTTAAAGAGGAGAGTTAAGAGTGTTGTTCTGGTGATACTAT

TGGGGCCTTTGCTATTTTTGGTTTGTCATCTTTTTGTGATAAACATGAATCAGATTATATGGACAAAAGAATATGAAGGA

AACATGACTTGGAAGATCAAACTGAGGAGTGCAATGTACCTTTCAAATACAACGGTAACCATCCTAGCAAACTTAGTTCC

CTTCACTCTGACCCTGATATCTTTTCTGCTGTTAATCTGTTCTCTGTGTAAACATCTCAAAAAGATGCAGCTCCATGGCA

AAGGATCTCAAGATCCCAGCATGAAGGTCCACATAAAAGCTTTGCAAACTGTGACCTCCTTCCTCTTGTTATGTGCCATT

TACTTTCTGTCCATAATCATGTCAGTTTGGAGTTTTGAGAGTCTGGAAAACAAACCTGTCTTCATGTTCTGCGAAGCTAT

TGCATTCAGCTATCCTTCAACCCACCCATTCATCCTGATTTGGGAAACAAGAAGCTAAAAGCAGACTTTTCTTTCAGTTT

TGTGGCATGTGAGGTACTGGGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG

蛋白质-(SEQ ID NO：46)

MITFLPIIFSILIVVTFVIGNFANGFIALVNSIEWFKRQKISFADQILTALAVSRVGLLWVLVLNWYATELNPAFNSIEV

RITAYNVWAVINHFSNWLATSLSIFYLLKIANFSNLIFLHLKRRVKSVVLVILLGPLLFLVCHLFVINMNQIIWTKEYEG

NMTWKIKLRSAMYLSNTTVTILANLVPFTLTLISFLLLICSLCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHIKALQTVTSFLLLCAI

YFLSIIMSVWSFESLENKPVFHFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKLKQTFLSVLWHVRYWVKGEKPSSS

hT2R76序列：

DNA-(SEQ ID NO：47)

ATGAATGGAGACCACATGGTTCTAGGATCTTCGGTGACTGACAAGAAGGCCATCATCTTGGTTACCATTTTACTCCTTTT

ACGCCTGGTAGCAATAGCAGGCAATGGCTTCATCACTGCTGCTCTGGGCGTGGAGTGGGTGCTACGGAGAATGTTGTTGC

CTTGTGATAAGTTATTGGTTAGCCTAGGGGCCTCTCGCTTCTGTCTGCAGTCAGTGGTAATGGGTAAGACCATTTATGTT

TTCTTGCATCCGATGGCCTTCCCATACAACCCTGTACTGCAGTTTCTAGCTTTCCAGTGGGACTTCCTGAATGCTGCCAC

CTTATGGTCCTCTACCTGGCTCAGTGTCTTCTATTGTGTGAAAATTGCTACCTTCACCCACCCTGTCTTCTTCTGGCTAA

AGCACAAGTTGTCTGGGTGGCTACCATGGATGCTCTTCAGCTCTGTAGGGCTCTCCAGCTTCACCACCATTCTATTTTTC

ATAGGCAACCACAGAATGTATCAGAACTATTTAAGGAACCATCTACAACCTTGGAATGTCACTGGCGATAGCATACGGAG

CTACTGTGAGAAATTCTATCTCTTCCCTCTAAAAATGATTACTTGGACAATGCCCACTGCTGTCTTTTTCATTTGCATGA

TTTTGCTCATCACATCTCTGGGAAGACACAGGAAGAAGGCTCTCCTTACAACCTCAGGATTCCGAGAGCCCAGTGTGCAG

GCACACATAAAGGCTCTGCTGGCTCTCCTCTCTTTTGCCATGCTCTTCATCTCATATTTCCTGTCACTGGTGTTCAGTGC

TGCAGGTATTTTTCCACCTCTGGACTTTAAATTCTGGGTGTGGGAGTCAGTGATTTATCTGTGTGCAGCAGTTCACCCCA

TCATTCTGCTCTTCAGCAACTGCAGGCTGAGAGCTGTGCTGAAGAGTCGcCGTTCCTCAAGGTGTGGGACACCTTGA

蛋白质-(SEQID NO：48)

MNGDHMVLGSSVTDKKAIILVTILLLLRLVAIAGNGFITAALGVEWVLRRMLLPCDKLLVSLGASRFCLQSVVMGKTIYV

FLHPMAFPYNPVLQFLAFQWDFLNAATLWSSTWLSVFYCVKIATFTHPVFFWLKHKLSGWLPWMLFSSVGLSSFTTILFF

IGNHRMYQNYLRNHLQPWNVTGDSIRSYCEKFYLFPLKMITWTMPTAVFFICMILLITSLGRHRKKALLTTSGFREPSVQ

AHIKALLALLSFAMLFISYFLSLVFSAAGIFPPLDFKFWVWESVIYLCAAVHPIILLFSNCRLRAVLKSRRSSRCGTP

以上的详细说明已经描述了本发明的几种实施方案，应理解以上的说明仅是例证性的并且不限制所公开的发明。本发明仅受以下的权利要求的限制。

Claims (80)

1.一种用于鉴别调节选自hT2R1、hT2R3、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R44、hT2R50、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76的人T2R苦味受体的化合物的测定，其中所述苦味受体特异性响应选自乙酰舒泛K、对乙酰氨基酚、2-乙酰吡嗪、芦荟素、氨基-2-降莰烷-羧酸、苦杏仁苷、穿心莲内酯、熊果苷、马兜铃酸、阿托品、番木鳖碱、4-苄基哌啶、咖啡因、氯霉素、氯喹、辛可宁、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、环己酰亚胺、环辛酮、苯甲酸地那铵、地塞米松、盐酸地尔硫卓、二异丁胺、二甲双胍、2，6-二甲基哌啶、多塞平、马来酸依那普利、腾喜龙、依诺沙星、(-)-表儿茶素、(-)-红霉素、乙基吡嗪、法莫替丁、加巴喷丁、银杏苦内酯A、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、盐酸拉贝洛尔、亚麻苦苷、洛美沙星、(-)-羽扇豆宁、N-甲基硫脲、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、硝基萘、硝基糖精、氧氟沙星、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、肽-LPFNQL、肽-LPFSQL、肽-YQEPVLGPVRGPFPIIV、肽-PVLGPVRGPFPIIV、肽-PVRGPFPIIV、肽-RGPFPIIV、N-乙基-N′-苯脲、2-甲基吡啶、苦味酸、二盐酸哌仑西平、苯硫脲、强的松、普鲁卡因胺、6-正丙基-2-硫尿嘧啶、苦木素、奎纳克林、奎宁、雷尼替丁、糖精、D-(-)-水杨苷、五水合硫酸司巴丁、八乙酸蔗糖酯、马钱子碱、磺胺甲噁唑、可可碱、N-硫代乙酰苯胺、对称二苯硫脲、苯甲唑啉、甲苯基脲、曲匹地尔、三甲氧苄二氨嘧啶和L-色氨酸的至少一种苦味配体或结构上相关的化合物，所述测定包括：

i.就其对至少一种所述苦味化合物诱导hT2R1、hT2R4、hT2R5、hT2R7、hT2R8、hT2R9、hT2R10、hT2R13、hT2R14、hT2R16、hT2R44、hT2R50、hT2R51、hT2R54、hT2R55、hT2R61、hT2R64、hT2R65、hT2R67、hT2R71、hT2R75和hT2R76多肽中的至少一种的活化的效应筛选化合物，其中所述hT2R多肽分别地(1)具有包含在SEQ ID NO：4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48中的多肽序列，和/或(2)由包含在SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47中的核酸序列分别地编码，和/或(3)由在严格杂交条件下与(2)中的序列杂交的核酸序列编码，和/或(4)具有与(1)中的序列具有至少90％序列同一性的多肽序列，或被至少一种所述苦味配体或结构上相关的化合物活化的(1)、(2)、(3)或(4)中任何一种的片段或嵌合体，和

ii.根据所述化合物对所述受体被至少一种所述苦味化合物或结构上相关的化合物活化的效应，确定所述化合物是否调节苦味；和

iii.如果所述化合物调节所述人苦味受体被至少一种所述苦味化合物的活化，则鉴别其为潜在的苦味调节剂。

2.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R1多肽。

3.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R4多肽。

4.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R5多肽。

5.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R7多肽。

6.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R8多肽。

7.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R9多肽。

8.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R10多肽。

9.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R13多肽。

10.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R14多肽。

11.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R16多肽。

12.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R44多肽。

13.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R50多肽。

14.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R51多肽。

15.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R54多肽。

16.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R54多肽。

17.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R55。

18.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R61。

19.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R64多肽。

20.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R65多肽。

21.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R67多肽。

22.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R71。

23.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R75多肽。

24.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R76多肽。

25.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体在细胞膜上表达。

26.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体在分离的细胞膜上表达。

27.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体在完整的细胞上表达。

28.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体在真核细胞上表达。

29.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体由两栖动物、哺乳动物或昆虫细胞表达。

30.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体在选自HEK-293、BHK、COS、HEK293T、CHO和爪蟾卵母细胞的细胞上表达。

31.如权利要求1所述的测定，其为荧光测定。

32.如权利要求1所述的测定，其为结合测定。

33.如权利要求1所述的测定，其通过测定所述化合物对细胞内离子浓度的效应来检测所述化合物的效应。

34.如权利要求1所述的测定，其检测所述化合物对细胞内的钠或钙的效应。

35.如权利要求1所述的测定，其检测所述化合物对细胞膜电位的效应。

36.如权利要求1所述的测定，其检测所述化合物对所述味觉受体的转录的效应。

37.如权利要求1所述的测定，其中所述化合物是根据其阻断所述味觉受体与所述苦味配体之一的相互作用的能力而选择的。

38.如权利要求1所述的测定，其检测所述化合物对细胞内cAMP、cGMP或IP3的效应。

39.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体包含所述味觉受体的细胞外结构域或跨膜区。

40.如权利要求1所述的测定，其中所述测定使用钙特异性荧光染料检测钙的变化。

41.如权利要求1所述的测定，其中所述测定使用选自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料检测细胞内钙的变化。

42.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体在溶液中。

43.如权利要求1所述的测定，其为检测光谱特征、流体动力学特征或溶解性的变化的结合测定。

44.如权利要求1所述的测定，其检测所述化合物对所述味觉受体与G蛋白复合的效应。

45.如权利要求1所述的测定，其检测所述化合物对所述味觉受体与选自转导蛋白、味转导素、G_α15、G_α16或其嵌合体的G蛋白复合的效应。

46.如权利要求1所述的测定，其为荧光偏振测定。

47.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体连接于固相基质。

48.如权利要求1所述的测定，其为高通量测定。

49.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体由HEK-293细胞表达。

50.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体是hT2R1并且所述测定筛选抑制或阻断hT2R1与苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自氯霉素、氯喹、环辛酮、地塞米松、盐酸地尔硫卓、强的松、奎宁、磺胺甲噁唑、N-硫代乙酰苯胺、对称二苯硫脲、银杏苦内酯A、洛美沙星、N-甲基硫脲、甲基强的松龙、硝基糖精、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、肽-LPFNQL、肽-LPFSQL、肽-YQEPVLGPVRGPFPIIV、肽-PVLGPVRGPFPIIV、肽-RGPFPIIV和苦味酸和结构上相关的化合物。

51.如权利要求1所述的测定，其中所述味觉受体是hT2R4并且所述测定筛选抑制或阻断hT2R4与苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自4-苄基哌啶、氯喹、盐酸地尔硫卓、二异丁胺、2，6-二甲基哌啶、多塞平、马来酸依那普利、法莫替丁、加巴喷丁、愈创木酚甘油醚、盐酸拉贝洛尔、(-)-羽扇豆宁、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、二盐酸哌仑西平、普鲁卡因胺、奎宁、雷尼替丁、马钱子碱、可可碱、苯甲唑啉和三甲氧苄二氨嘧啶和结构上相关的化合物。

52.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R5并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R5与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自二甲双胍、1-甲基-2-喹啉酮、氯化羟丁宁、奥芬溴铵和2-甲基吡啶和结构上相关的化合物。

53.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R7并且所述测定筛选抑制或阻断hT2R7与苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、氯喹、乙基吡嗪、1-甲基-2-喹啉酮、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、2-甲基吡啶、二盐酸哌仑西平、奎宁、马钱子碱和三甲氧苄二氨嘧啶和结构上相关的化合物。

54.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R8并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R8与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自乙酰舒泛K、2-乙酰吡嗪、芦荟素、穿心莲内酯、阿托品、氯霉素、环己酰亚胺、环辛酮、苯甲酸地那铵、地塞米松、盐酸地尔硫卓、马来酸依那普利、(-)红霉素、乙基吡嗪、法莫替丁、加巴喷丁、银杏苦内酯A、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、洛美沙星、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、硝基萘、硝基糖精、橄榄苦苷、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、N’-乙基-N’-苯脲、2-甲基吡啶、苦味酸、二盐酸哌仑西平、普鲁卡因胺、苦木素、雷尼替丁、糖精、八乙酸蔗糖酯、马钱子碱、曲匹地尔和三甲氧苄二氨嘧啶和结构上相关的化合物。

55.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R9并且所述测定筛选阻断或抑制所述hT2R9与苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自乙基吡嗪、氧氟沙星和结构上相关的化合物。

56.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R10并且所述测定筛选阻断或抑制所述hT2R10与苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、穿心莲内酯、阿托品、番木鳖碱、4-苄基哌啶、咖啡因、氯霉素、氯喹、辛可宁、克拉霉素、克林霉素、环己酰亚胺、环辛酮、苯甲酸地那铵、地塞米松、盐酸地尔硫卓、二异丁胺、2，6-二甲基哌啶、多塞平、腾喜龙、红霉素、乙基吡嗪、法莫替丁、加巴喷丁、银杏苦内酯A、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、羽扇豆宁、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、强的松、普鲁卡因胺、苦木素、奎纳克林、奎宁、雷尼替丁、五水合硫酸司巴丁、八乙酸蔗糖酯、马钱子碱、苯甲唑啉、甲苯基脲、曲匹地尔和三甲氧苄二氨嘧啶和结构上相关的化合物。

57.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R13并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R13与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、阿托品、克拉霉素、苯甲酸地那铵、多塞平、乙基吡嗪、橄榄苦苷、奥芬溴铵和奎纳克林和结构上相关的化合物。

58.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R14并且所述测定筛选阻断或抑制所述hT2R14与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、马兜铃酸、环辛酮、地塞米松、盐酸地尔硫卓、2，6-二甲基哌啶、红霉素、乙基吡嗪、甲状腺肿素、愈创木酚甘油醚、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、硝基萘、硝基糖精、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、N’-乙基-N’-苯脲、2-甲基吡啶、苦味酸、奎宁、马钱子碱、可可碱、甲苯基脲和曲匹地尔和结构上相关的化合物。

59.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R16并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R16与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、苦杏仁苷、熊果苷、亚麻苦苷和D-(-)-水杨苷和结构上相关的化合物。

60.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R44并且所述测定筛选阻断或抑制所述hT2R44与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自乙基吡嗪和2-乙酰吡嗪和结构上相关的化合物。

61.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R50并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R50与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪和乙基吡嗪和结构上相关的化合物。

62.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R51并且所述测定筛选阻断或抑制所述hT2R51与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自克拉霉素、乙基吡嗪、甲状腺肿素、N-甲基硫脲、氯化羟丁宁、N’-乙基-N’-苯脲、2-甲基吡啶、苯硫脲和6-正丙基-2-硫尿嘧啶、N-硫代乙酰苯胺、三甲氧苄二氨嘧啶和结构上相关的化合物。

63.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R54并且所述测定筛选抑制或阻断hT2R54与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自对乙酰氨基酚、氯喹、克拉霉素、苯甲酸地那铵、表儿茶素、红霉素、盐酸拉贝洛尔、1-甲基-2-喹啉酮、橄榄苦苷、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、二盐酸哌仑西平、普鲁卡因胺、雷尼替丁、马钱子碱、三甲氧苄二氨嘧啶和L-色氨酸和结构上相关的化合物。

64.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R55并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R55与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自多塞平、亚麻苦苷、氯化羟丁宁、奎宁、和马钱子碱和结构上相关的化合物。

65.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R61并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R61与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自乙酰舒泛K、芦荟素、马兜铃酸、咖啡因、氯霉素、氯喹、苯甲酸地那铵、硝基糖精、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、肽-LPFNQL、肽-LPFSQL、苦味酸、糖精、马钱子碱和结构上相关的化合物。

66.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R64并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R64与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自乙酰舒泛K、氨基-2-降莰烷-羧酸、马兜铃酸、加巴喷丁、亚麻苦苷、洛美沙星、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、奎宁、雷尼替丁、糖精、马钱子碱和L-色氨酸和结构上相关的化合物。

67.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R65并且所述测定筛选抑制或阻断hT2R65与苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、乙基吡嗪、1-甲基-2-喹啉酮和结构上相关的化合物。

68.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R67并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R67与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自2-乙酰吡嗪、穿心莲内酯、乙基吡嗪和氯化羟丁宁和结构上相关的化合物。

69.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R71并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R71与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自硝基糖精、苦味酸和结构上相关的化合物。

70.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R75并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R75与至少一种苦味配体的相互作用的化合物，所述苦味配体选自穿心莲内酯、阿托品、番木鳖碱、4-苄基哌啶、咖啡因、氯霉素、氯喹、辛可宁、环丙沙星、苯甲酸地那铵、地塞米松、多塞平、马来酸依那普利、依诺沙星、红霉素、乙基吡嗪、银杏苦内酯A、甲状腺肿素、盐酸拉贝洛尔、洛美沙星、(-)-羽扇豆宁、1-甲基-2-喹啉酮、甲基强的松龙、氧氟沙星、奥美拉唑、氯化羟丁宁、奥芬溴铵、二盐酸哌仑西平、强的松、普鲁卡因胺、苦木素、奎宁、雷尼替丁、五水合硫酸司巴丁、马钱子碱、磺胺甲噁唑、苯甲唑啉、曲匹地尔和三甲氧苄二氨嘧啶和结构上相关的化合物。

71.如权利要求1所述的测定，其中所述hT2R是hT2R76并且所述测定筛选阻断或抑制hT2R76与选自番木鳖碱和结构上相关的化合物的苦味配体的相互作用的化合物。

72.一种分离的味觉或胃肠细胞，其表达T2R多肽，其具有在严格杂交条件下与包含在SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47的任何一个中的DNA序列特异性杂交的核酸序列；或具有包含在SEQ IDNO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48的任何一个中的多肽序列。

73.如权利要求72所述的分离的味觉或胃肠细胞，其中所述细胞含有包含在SEQ ID NO：13或15中的hT2R9V或hT2R9A DNA序列。

74.一种鉴别调节人T2R的化合物的方法，其包括用潜在的T2R调节化合物接触如权利要求72或73所述的味觉或胃肠细胞，并且检测所述化合物是否特异性结合和/或调节其中表达的T2R的活性，和/或影响另一种化合物对所述人T2R的特异性结合或活化。

75.一种筛选具有T2R9A或T2R9V表型的个体的方法，其包括对个体进行遗传测试并且确定所述个体是否含有包含在SEQ ID NO：15中的hT2R9A序列或包含在SEQ ID NO：13中的hT2R9V序列。

76.一种筛选测定，其包括用假定的T2R9A或T2R9V调节化合物接触表达如SEQ ID NO：15或13所示的T2R9A或T2R9V序列的细胞，并且检测调节所述T2R9A或T2R9V活性的化合物。

77.一种检测与T2R9单体型的表达相关的差异的方法，其包括鉴别特异性结合于和/或活化hT2R9A但是不特异性结合于和/或活化hT2R9V或与此相反的化合物。

78.一种T2R配体筛选测定，其包括接触表达hT2R9A或hT2R9V的细胞，并且鉴别特异性活化任一所述hT2R9序列的化合物并确定其体内效应。

79.如权利要求78所述的测定，其进一步包括测试所述配体对味觉和/或胃肠或消化功能的效应，包括舌或胃肠系统中的细胞显示的T2R的效应。

80.如权利要求79所述的测定，其中所述细胞是肠内分泌细胞。

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