KR20190050586A - 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법과 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크 - Google Patents

후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법과 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크 Download PDF

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Abstract

본 발명은 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대장균을 이용한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법과 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크에 관한 것이다.
본 발명에 의한 에 따르면, T13NDs에 이용되는 수용체를 대장균으로부터 생산하여 나노디스크(T13NDs)를 제조함으로써 원래의 수용체 구조를 모방하여 수중 및 대기 환경에서도 안정할 수 있으며, 이를 통하여 수용체의 선택도, 정확도 및 재현성을 개선할 뿐만 아니라 이러한 개선된 수행능력을 통해 부패한 음식으로부터 검출된다고 알려진 카다베린을 선택적으로 검출할 수 있었다.

Description

후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법과 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크{Manufacturing method of nanodisc comprising an olfactory receptor protein and nanodisc comprising an olfactory receptor protein manufactured by the same}
본 발명은 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법과 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대장균을 이용한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크에 관한 것이다.
G 단백질 연결 수용체(G protein-coupled receptors, GPCR)는 인체의 세포 반응에 중요한 역할을 한다. 그렇기 때문에, G 단백질 연결 수용체는 많은 사람의 질병에 상당히 많이 관여되어 있어 대략적으로 모든 현대의약품의 40%가 GPCR을 타겟으로 하고 있다. GPCR로 분류되는 미량 아민 관련 수용체(Trace amine-associated receptor, TAARs)는 종래의 생체 아민과 구조적으로 관련된 내생의 화합물에 결합하는 보통의 아민 수용체이다. 미량아민관련수용체 13c(TAAR13c)는 제프라피쉬(zebrafish (Danio rerio))에서 후각 수용체의 역할을 한다고 알려졌으며, 또한, 부패와 연관된 냄새의 성분인 카다베린에 대해 특이적인 효과가 있다고 알려져 있다. 라이신의 세균성 탈카르복실화 반응에 의해 발생하는 카다베린은 사람에게 극도로 역겨운 냄새를 풍기는 다양한 생체아민 중 하나이다. 게다가, 라이신을 포함하는 음식물들의 종류가 다양하기 때문에 카다베린은 부패한 음식을 검출하기 위한 중요한 마커 중 하나이다. 그러므로, TAAR13c는 카다베린을 검출하기 위한 산업적 응용 및 과학적 탐구와 같은 다양한 분야에 지원될 수 있을 것이라고 생각된다.
많은 수용체의 재구성(reconstitution) 기술 중에서, 나노디스크(ND)는 GPCR 재구성을 위해 가장 적합한 도구로 고려되고 있다. 나노디스크는 수용체, 지질 이중막 및 막 지지체 단백질(MSP)로 구성되며, 수용체로서 GPCR 을 포함하는 나노디스트는 수용체인 GPCR는 지질 이중막의 가장자리에 타이트하게 감싸져 있다. 그렇기 때문에, 나노디스크는 수중 및 대기 환경에서도 안정할 수 있으며, 세포에서 수용체의 원래 구조를 모방할 수 있다. 종래, Sf9 삽입 세포를 이용한 나노디스크를 기초로 한 바이오센서 또한 잘 알려져 있다.
재조합 단백질의 생산을 위해, 원핵생물인 대장균은 생산성 및 간편성과 같은 장점 때문에 숙주세포로 널리 이용되어 왔다. 그러나, 대장균에서 GPCR을 생산하는 경우 원핵세포인 대장균 내에서 GPCR 발현이 어려우며, 강한 소수성, 전하 분포의 차이 및 상이한 막삽입 메커니즘 때문에 풀어야 할 과제가 여전히 존재한다. 후각 수용체를 포함하는 GPCR(G protein-coupled receptor)의 경우, 진핵세포의 막단백질이기에 이를 발현하기 위하여 일반적으로 동물세포 및 곤충세포를 이용하여 세포막상으로 발현시킨다. 그러나 이와 같은 경우, 생산성 및 경제성(세포유지 및 발현비용)이 떨어진다는 단점이 있다. 대장균을 이용하여 생산하는 경우 생산성 및 경제성면에서 동물세포 및 곤충세포를 이용하는 것보다 우수하지만, 대장균은 원핵 세포이므로 진핵세포인 GPCR의 막발현이 매우 어려우며, 막에 GPCR을 무리하게 발현할 경우 대장균 세포가 죽는 현상이 발생하는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 후각 수용체를 대장균으로부터 생산하여 나노디스크(T13NDs)를 제조함으로써, 원래의 수용체 구조를 모방하여 수중 및 대기 환경에서도 안정한 새로운 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크를 제조하는 방법을 개발함으로써 수용체 단백질의 생산성 및 안정성을 확보하고, 생체환경과 매우 유사한 환경을 구현하여 수용체의 2차구조를 최적화 시켜 막수용체 고유의 구조를 구현하였고, 선택도, 정확도 및 재현성을 개선할 뿐만 아니라, 이러한 개선된 수행능력을 통해 부패한 음식으로부터 카다베린을 선택적으로 감지함으로써 음식의 부패한 정도를 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-2012-0083987 A
본 발명은 대장균으로부터 생산한 후각 수용체 단백질을 포함함으로써 원래의 수용체 구조를 모방하여 수중 및 대기 환경에서도 안정할 수 있는 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노디스크의 제조방법을 이용하여 제조한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크를 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은
i) 대장균 세포에서 후각 수용체 단백질을 생산 및 정제하는 단계;
ii) 대장균 세포에서 막 지지체 단백질을 생산 및 정제하는 단계;
iii) 상기 대장균 세포에서 생산 및 정제 된 후각 수용체 단백질, 및 지질을 혼합하고 정치시키는 단계;
iv) 상기 정치시킨 혼합물에 상기 대장균 세포에서 생산 및 정제된 막 지지체 단백질을 혼합하고, 교반하여 나노디스크를 조립하는 단계; 및
v) 상기 iv) 의 혼합물에서 계면활성제 및 결합하지 않은 단백질를 제거하는 단계; 로 구성되는 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, 상기 i) 대장균 세포에서 후각 수용체 단백질을 생산 및 정제하는 단계는
i-1)후각 수용체 단백질로 형질전환된 대장균을 배양하는 단계;
i-2)후각 수용체 단백질을 과발현 시키는 단계;
i-3)상기 대장균을 용혈시켜서 후각 수용체 단백질을 세포 외부로 배출시키는 단계; 및
i-4)후각 수용체 단백질을 용해시킨후, 분리 정제시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 후각 수용체 단백질로 형질전환된 대장균 세포를 먼저 일정 농도 이상으로 배양시키고, 배양된 대장균 세포 내에서 후각 수용체 단백질을 과발현 시킨 후, 대장균을 용혈시켜서 입자 형태로 과발현된 후각 수용체 단백질을 세포 외부로 배출시킨다. 이후 배출된 후각 수용체 단백질을 계면활성제 등을 이용하여 용해시킨 후, 이를 분리 정제하고, 막 지지체 단백질 및 지질과 혼합하여 나노디스크로 재구성함으로써 원래의 수용체 구조를 모방하여 수중 및 대기 환경에서도 안정할 수 있도록 하였다.
본 발명에 있어서, 상기 후각 수용체 단백질은 대장균 세포 내에서 봉입체(inclusion body) 형태로 발현한 후, 대장균을 용혈(lysis)시켜서 발현된 봉입체 형태의 단백질을 세포 외로 배출시킨 후, 계면활성제 등을 혼합하여 봉입체 형태의 단백질을 해리시키고, 이를 정제한 다음, 다시 후각 수용체 단백질의 형태로 재구성하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명자들은 대장균을 이용하여 후각 수용체 단백질을 inclusion body (봉입체) 형태로 대장균 세포 안에서 대량 발현시켜 생산한 후에, 대장균을 용혈시킴으로써 대장균 내부에서 과발현된 후각 수용체 단백질을 세포 외부로 배출시키고, inclusion body (봉입체) 를 해리시킨후 정제 및 나노디스크로의 구조를 재구성하는 과정을 통해 대장균 세포를 이용하여 후각 수용체 단백질을 생산하였다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, 상기 후각 수용체 단백질은 호르몬, 후각, 미각, 신경전달물질과 관련된 수용체가 제한없이 포함되며, 더욱 바람직하게는 카다베린(Cadaverine)에 특이적으로 반응하는 TAAR13c(Trace amine-associated receptor 13c) 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, 상기 카다베린(Cadaverine)은 육류나 기타 단백질의 부패 작용에 의하여 생기는 ptomaine의 성분으로서, 부패한 냄새를 가진 성분이지만 유독 하지는 않다. 또한, 라이신(lysin)의 분해물로서 ptomaine 단백질의 부패로 푸트레신(putrescine)과 함께 생긴다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, 상기 막 지지체 단백질은 지질-수용체 복합체를 감싸기 위하여 첨가되는 어떠한 단백질도 이용할 수 있으며, 바람직하게는 ApoA-I(apolipoprotein A-I) 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, iii) 상기 대장균 세포에서 생산된 후각 수용체 단백질, 및 지질을 혼합하고 정치시키는 단계에서는 0℃ 내지 10℃에서 10 분 내지 1시간 동안 교반되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, 상기 iii) 대장균 세포에서 생산된 후각 수용체 단백질, 및 지질을 혼합하고 정치시키는 단계; 에서는 막 환경과 유사한 환경으로 만들기 위해 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)는 1:1의 분자 비율로 혼합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법에 있어서, 상기 iv) 정제된 막 지지체 단백질을 이에 추가로 넣어 혼합하고, 교반하여 나노디스크를 조립하는 단계에서는 1시간 내지 2시간 동안 교반하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조되고 평균 지름이 15nm 이상, 더욱 바람직하게는 평균 지름이 15nm 내지 25nm 인 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크를 제공한다.
본 발명에 의하여 제조되는 나노디스크의 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조되는 나노디스크는 대장균 세포에서 후각 수용체 단백질을 막지지체 단백질이 둘러쌓음으로써 나노 디스크 구조를 형성하게 된다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, DLS 및 FE-SEM를 이용하여 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 크기를 측정한 결과, 입자 크기는 10 내지 50 nm 이며, 나노디스크의 입자 크기가 일정 범위로 자가조립 되었다는 것을 확인할 수 있다
또한 본 발명의 우수성을 확인하기 위해, 카다베린과 선택적으로 감지하는 후각수용체에 대해 세포기반 및 나노 디스크기반의 기능분석을 통하여 나노디스크에서 수용체의 기능이 올바르게 유지되는 것을 확인하였다.
본 발명에 의한 대장균을 이용한 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법은 후각 수용체 단백질로 형질 전환된 대장균의 세포 내에서 후각 수용체 단백질을 생산하고 대장균을 용혈시켜서 세포 외부로 배출시킨후, 막단백질과 혼합하여 나노 디스크 형태로 재조립함으로써, 대장균을 이용하여 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노 디스크를 안정적으로 효율적으로 생산할 수 있다.
또한, 상기 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크가 검출 물질과의 바인딩 사이트를 구현하여 선택도, 정확도 및 재현성을 개선하는 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명에 의한 나노디스크의 구조를 나타낸다.
도 2는 정제된 ApoA-I의 겔 염색(gel staining) 및 웨스턴 블럿 분석에 대한 결과이다.
도 3은 정제된 TAAR13c의 겔 염색(gel staining) 및 웨스턴 블럿 분석에 대한 결과이다.
도 4는 HEK-293 세포에서 발현된 TAAR13c의 웨스턴 블럿팅 분석에 대한 결과이다.
도 5는 CV의 농도별 처리에 대한 TAAR13c 반응의 세포기반의 분석 결과이다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
도 6는 TAAR13c 의 CV에 대한 선택도 확인을 위한 세포기반의 분석 결과이다. (HA, hydroxylamine; EA, ethanolamine; PT, putrescine; CV, cadaverine; DD, diaminodecane; TMA, trimethylamine; TEA, trimethylamine; ThiA, thiamine; TryA, tryptamine; Glu, glutamine)
도 7은 T13NDs을 형성하기 위한 최적화 조건을 확인한 결과이다.
도 8는 최적화된 T13NDs의 크기를 DLS를 이용하여 측정한 결과이다.
도 9은 T13NDs의 이미지를 FE-SEM를 통해 촬영한 이미지이다.
도 10은 생산한 T13NDs 를 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 로 분리 정제한 결과이다.
도 11 CV의 농도 증가에 따른 T13ND의 트립토판 발광을 실시간으로 측정한 결과이다.
도 12는 CV에 대한 T13ND의 선택적 반응에 대한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: ApoA-I 및 TAAR13c의 유전자 클로닝
대장균으로부터 ApoA-I 및 TAAR13c 단백질을 발현시키기 위하여, 먼저 ApoA-I 및 TAAR13c의 유전자를 클로닝 하였다.
구체적으로, ApoA-I 유전자는 6xHis 및 정지 코돈 유전자를 포함하도록 디자인 되었으며, 인간 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 통해 증폭시켰다(primer 서열: 5' CAC CAG GAG ATA TAC ATA TGA AAG CTG CGG TGC TGA CC 3', 5' CTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTG GGT GTT GAG CTT CTT AGT GTA 3').
TAAR13c 유전자는 zebrafish cDNA를 이용하여 PCR을 통해 증폭시켰다(primer 서열: 5'-CAC CAG GAG ATA TAC ATA TGA TGC CCT TTT GCC ACA AT 3', 5' TGA ACT CAA TTC CAA AAA TAA TTT ACA C-3'). 증폭된 PCR 산물은 게이트웨이(gateway) 클로닝 시스템(Invitrogen, USA)을 이용하여 pET-DEST42 벡터(Invitrogen, USA)로 삽입하였다.
TAAR13c 유전자는 또한 증폭된 PCR 산물(primer; 5' ATG AAT TCA TGG ATT TAT CAT CAC AAG AAT 3', 5' ATC TCG AGT CAA ACC GTA AAT AAA TTG ATA 3')을 이용하여 pcDNA3 포유류의 발현 벡터에 복제하였다.
실시예 2: 대장균 내에서의 ApoA-I의 발현 및 정제
pET-DEST42/ApoA-I 구조를 갖는 BL21(DE3) 대장균 세포를 37°C에서 1L의 Luria-Bertani (LB) 배지(+50μg/mL ampicillin)에 배양한 다음, 세포의 OD600 값이 0.5에 도달할 때까지 성장시켰다. 또한, 1nM의 최종 농도로 isopropyl thiogalactoside(IPTG)를 첨가하여 ApoA-I의 과발현을 유도하였다.
3시간 후에, 세포를 원심분리를 하고(7000 g, 20 min, 4 °C), 용해버퍼(20 mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)로 재부유시킨 다음, 음파처리(sonication)(5 s on/off, 5 min)하여 세포를 파괴하였다.
파괴한 세포 용해물은 4 °C에서 30동안 12,000 g으로 원심분리 한 다음, 상층액에 있는 ApoA-I을 수집하고 FPLC(GE Healthcare)를 통해 HisTrap HP column (GE Healthcare, Sweden)에 로딩하였다.
그 다음, 컬럼을 세척버퍼(20 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole, 0.5 M NaCl, pH 8.0)에 세척하고, ApoA-I는 분리버퍼(20 mM Tris-HCl, 400 mM imidazole, 0.5 M NaCl, pH 8.0)를 이용하여 분리한 후, HiTrap HP desalting column (GE Healthcare, Sweden)을 이용하여 HEPES buffer I (20 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, 20 mM cholate, 1mM EDTA, pH 8.0)에 투석하였다. 투석한 단백질은 사용할 때까지 4 °C 에서 보관한다.
실시예 3: TAAR13c의 발현 및 정제
pET-DEST42/TAAR13c vector로 형질전환된 BL21 (DE3) 세포는 세포의 OD600 값이 0.5에 도달할 때까지 37°C에서 LB 배지(+50 μg/mL ampicillin)에 배양시킨다. TAAR13c의 발현은 1mM IPTG을 첨가하여 유도하였으며, 세포는 4시간 동안 배양한다.
배양 후, 세포를 원심분리하고(7000 g, 20 min, 4 °C), 원심분리를 통해 얻은 펠렛은 2 mM EDTA를 포함하는 PBS에 재부유시켰다. 그 다음, 세포를 음파처리(sonication) (5 s on/off, 5 min)하여 세포를 용혈시키고, 다시 원심분리 하였다(12000 g, 4 °C, 20 min).
음파처리 및 원심분리를 반복한 후, 샘플의 펠렛은 25°C에서 용해버퍼 (0.1 M Tris-HCl, 20 mM sodium dodecyl sulfate (SDS), 100 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EDTA, pH 8.0)로 용해한다. 용해된 단백질은 10K MWCO dialysis cassette (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 10mM SDS 가 포함된 완충용액 0.1 M sodium phosphate로 투석 시킨다.
그 다음, 0.2μm bottle top filter(Thermo Scientific, USA)를 이용하여 필터한 후, 10mM SDS를 포함하는 0.1 M sodium phosphate (pH 8.0)에서 평형화된 HisTrap HP column에 적용시킨다. 컬럼은 세척버퍼(0.1 M sodium phosphate, 10 mM SDS)를 이용하여 pH 8.0 에서 pH 7.0까지 도달할 때까지 연속적으로 세척한다. 그 다음, TAAR13c는 pH 6.0의 동일한 버퍼로 녹여서 분리하였다.
녹아서 분리된 단백질은 HEPES buffer II (20 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, 25 mM cholate, 1mM EDTA, pH 8.0)로 투석하였다. 투석하여 정제된 TAAR13c은 SDS-PAGE 및 western blot analysis를 이용하여 분석하였다.
실험예 1: 웨스턴 블럿 분석 및 총 단백질 분석
상기 실시예 2 및 실시예 3에서 수득한 ApoA-I 및 TAAR13c 의 단백질 샘플(20μL)은 단백질전기영동(SDS-PAGE) 및 웨스턴 블럿팅을 이용하여 분석하였다.
웨스턴 블럿 분석은 1차 항체로서 anti-FLAG rabbit Ab (Cell Signaling Technology, USA), anti-His-probe mouse Ab (Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 anti-V5 epitope mouse Ab (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 수행하였다. HRP-conjugated anti-rabbit Ab (Millipore, USA) and HRP-conjugated anti-mouse Ab (Milipore, USA)는 2차 항체로 사용하였으며, Luminata Forte western HRP substrate(Millipore, USA)도 사용하였다. 단백질 농도는 BCA assay kit (Pierce, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, SDS-PAGE 방법을 이용하여 단백질을 전기영동 시킨 후, tans-blot을 이용하여 단백질을 nitrocellulose blotting membrane 에 transfer 시킨다. 그 다음, 단백질이 transfer 된 membrane 을 membrane blocking 한 다음, 1차항체 처리하여 세척하고, 다시 2차항체 처리한 후 세척하는 과정을 순서대로 진행한 후 HRP substrate 를 이용하여 검출한다.
그 결과, 단백질 전기영동을 통한 겔 염색 결과인 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, ApoA-I의 밴드가 뚜렷하게 확인되었으며, His-Probe 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 분석에서도 ApoA-I의 밴드가 뚜렷하게 확인되었다. 이는, 상기 본 발명의 실시예 2에서 분리한 ApoA-I가 고순도로 정제되었다는 것을 의미한다.
또한, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 전기영동을 통한 겔 염색에서 TAAR13c의 밴드가 뚜렷하게 확인되었으며, V5 epitope 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 분석에서도 TAAR13c의 밴드가 뚜렷하게 확인되었다. 이는, 실시예 3에서 분리한 TAAR13c가 고순도로 정제되었다는 것을 의미한다.
실시예 4: HEK-293 세포에서 TAAR13c의 발현 확인
Human embryonic kidney (HEK)-293 세포는 1% penicillin, 1% streptomycin (Gibco, USA) 및 10% Fetal Bovine Serum (FBS)(Gibco, USA)가 포함된 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) (HyClone, USA)에서 37 °C, 5% CO2 의 조건 하에 배양하였다.
형질주입(transfection)은 다음과 같은 방법을 통해 Lipofectamine3000을 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 세포는 TAAR13c, pCRE-Luc, pSV40-RL, Gαolf 및 RTP1S(Receptor-transporting protein 1 short)을 포함하는 DNA 혼합물을 Lipofectamine3000 를 이용하여 형질주입한다.
그 다음, 형질전환된 세포는 phosphate-buffed saline을 이용하여 수거한 다음, 음파처리(sonication)(2s on/off, 2 min) (Sonics Vibracell, USA)를 통해 세포를 파괴한다.
이와 같이 HEK-293 세포에서 발현된 TAAR13c을 웨스턴 블럿팅 분석으로 검출하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
실험예 2: 카다베린에 대한 TAAR13c의 특성 확인
상기 실시예 4에서 생산한 TAAR13c를 이용하여 카다베린에 대한 특성을 dual-glo luciferase assay system을 이용하여 확인하였다.
구체적으로는, 형질전환된 세포의 배지를 50μL DMEM 사용하여 30분 배양한 후, Odorant를 원하는 농도에 맞게 디자인하여 25μL 넣어주고 4시간 배양하였다. 그 다음, 20μL의 Dual-Glo Luciferase Reagent를 넣어주고 10분 상온에서 배양한 후 firefly luciferase luminescence를 luminescence plate reader 이용하여 측정하였다. 이후 측정한 샘플에 20μL의 Dual-Glo Stop-n-Glo Reagent를 넣어주고 10분 상온에서 배양한 후 Renilla luciferase luminescence 를 측정하였다. 상기 측정한 데이터를 다음 공식을 이용하여 분석하였다. 아민이 없는 용액은 음성대조군으로, 10μM forskolin (FSK)은 양성 대조군으로 사용하였다.
[CRE/Renilla(N) - CRE/Renilla(0)]/[CRE/Renilla(FSK) - CRE/Renilla(0)].
그 결과, 도 5에 나타나는 바와 같이, TAAR13c 발현 세포는 CV에 대한 의미있는 반응을 나타냈으며, 비교예인 임의의 벡터(MocK)로 형질전환된 세포는 의미있는 반응을 나타내지 못하였다. 이러한 결과는 TAAR13c가 HEK-293 세포에서 성공적으로 발현되는 것을 의미한다.
또한, 도 6에서 나타나는 바와 같이, TAAR13c는 이한 아민 잔기 및 구조를 갖는 다양한 아민 분자들 중, CV에 대해서만 반응을 나타냈으며, 이러한 결과는, TAAR13c가 다양한 아민들 중 CV에 선택적으로 반응한다는 것을 보여준다.
실시예 5: T13NDs(TAAR13c-embedded nanodiscs)의 조립
T13NDs를 조립하기 전에 T13NDs의 조립을 위한 최적의 조건을 확인하기 위하여, 지질 음파 처리 시간(10-60분), 단백질 농도(0.5-2μM)에 따른 T13NDs의 크기를 확인하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이, T13NDs 크기를 최소화하기 위한 최적의 조건은 지질 음파 처리 시간은 30분, 및 단백질 농도는 1μM로 확인되었으며, 이러한 최적의 조건을 통해 T13NDs를 조립하였다.
구체적으로, 음성을 띄는 막의 환경과 유사하게 하기 위하여 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)는 1:1의 분자 비율로 혼합하여 사용하였다.
지질은 클로로폼(chloroform) 용액으로부터 질소 가스를 이용하여 건조시키고(Lipids were dried using nitrogen gas from a chloroform solution), 잔여의 클로로폼을 제거하기 위하여 1시간 동안 진공상태로 두었다.
그 다음, 건조된 지질을 HEPES buffer II로 용해한 다음, 여기에 상기 실시예 3에서 제조된 정제된 TAAR13c 단백질을 추가하여 얼음상에서 10분 동안 정치시켰다.
정치시킨 후, 상기 혼합물에 ApoA-I을 추가하여 혼합하여 2시간 동안 4°C에서 교반하면서 정치시켰다. 혼합물의 최종 농도는 TAAR13c는 1μM, ApoA-I은 100μM, 지질은 8mM 및 계면활성제는 25mM이다.
그 다음, 계면활성제를 제거하기 위하여 상기 혼합물에 바이오 비드(Bio-Rad, USA)를 첨가하여 밤새 교반하였다.
마지막으로, 상기 혼합물에서 결합하지 않은 단백질을 제거하기 위하여 크기 배제 크로마토그레피(size exclusion chromatography, (SEC) (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare, USA))를 진행하였다. 컬럼은 HEPES buffer III (20 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0)로 평형화하였고, 500μL의 샘플은 FPLC를 이용하여 0.5mL/min의 속도에서 injecting loops에 로딩하였다. 피크 구획을 수집한 다음, 정제된 T13ND는 특성화 스텝 전에 4°C에서 보관하였다.
상기 제조된 T13NDs 용액을 SEC(size exclusion chromatography) 분석을 이용하여 T13NDs 조립을 확인하였으며, 그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 나노디스크 T13NDs가 성공적으로 제조되었음을 확인하였다.
실험예 3: T13NDs의 분석
실시예 5에서 제조한 나노디스크(T13NDs)의 사이즈는 동적빛산란(dynamic light scattering spectrophotometer, DLS) (DLS-7000, Japan) 및 SUPRA 55VP field-emission scanning electron microscope (FE-SEM) (Carl Zeiss, Germany)를 이용하여 확인하였다.
T13NDs의 고유 형광(intrinsic fluorescence)은 LS 55 luminescence spectrometer (Perkin Elmer, USA) (excitation 290 nm; emission 340 nm)를 이용하여 실시간으로 측정하였다. TAAR13c의 고유 형광(intrinsic fluorescence)의 실시간 측정은 1-10 mM 의 다양한 아민 농도로 측정하였다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, DLS를 이용하여 측정한 T13NDs의 크기는 20nm로 측정되었다.
도 9은 FE-SEM를 이용하여 측정한 이미지에서 측정된 지름을 나타내며, 상기 도 5에서 측정한 지름의 크기와 유사한 것을 확인하였다.
도 10은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 생산된 후각수용체 나노디스크의 성공적인 분리정제과정을 나타낸다.
또한, 도 11은 CV의 농도 증가에 따른 T13ND의 실시간 트립토판 형광성 (tryptophan fluorescence) 을 측정한 결과로서, 대조군(buffer)에서는 트립토판 형광성이 측정되지 않았으나, CV를 다양한 농도로 처리하였을 때는 트립토판 형광성이 측정되었으며, 이는 T13ND가 CV에 대한 친화성이 있음을 나타낸다.
또한, 도 12는 실시간 트립토판 형광성을 이용하여 측정한 CV에 대한 T13ND의 선택적 반응의 결과로서, 상기한 아민 잔기 및 구조를 갖는 다양한 아민 종(HA(hydroxylamine), EA(ethanolamine), TMA(trimethylamine), CA(cadaverine))들과 비교하였을 때, T13NDs의 고유한 트립토판 형광성은 오직 CV 자극에 의해서만 나타났다. 이러한 결과는, TAAR13c가 나노디스크로 효과적으로 재구성된다는 것을 보여준다.

Claims (9)

  1. i) 대장균 세포에서 후각 수용체 단백질을 생산 및 정제하는 단계;
    ii) 대장균 세포에서 막 지지체 단백질을 생산 및 정제하는 단계;
    iii) 상기 대장균 세포에서 생산 및 정제 된 후각 수용체 단백질, 및 지질을 혼합하고 정치시키는 단계; 및
    iv) 상기 정치시킨 혼합물에 상기 대장균 세포에서 생산 및 정제된 막 지지체 단백질을 혼합하고, 교반하여 나노디스크를 조립하는 단계; 로 구성되는
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 i) 대장균 세포에서 후각 수용체 단백질을 생산하는 단계는
    i-1) 후각 수용체 단백질로 형질전환된 대장균을 배양하는 단계;
    i-2) 후각 수용체 단백질을 과발현 시키는 단계;
    i-3) 상기 대장균을 용혈시켜서 후각 수용체 단백질을 세포 외부로 배출시키는 단계; 및
    i-4) 후각 수용체 단백질을 용해시키고, 분리 정제시키는 단계; 를 포함하는 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    v) 상기 iv) 의 혼합물에서 계면활성제 및 결합하지 않은 단백질을 제거하는 단계;를 더 포함하는 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 대장균 세포에서 생산되는 후각 수용체 단백질은 TAAR13c(Trace amine-associated receptor 13c) 인 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 막 지지체 단백질은 지질-수용체 복합체를 감싸기 위하여 첨가되는 ApoA-I(apolipoprotein A-I) 단백질인 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 iii) 대장균 세포에서 생산된 후각 수용체 단백질, 및 지질을 혼합하고 정치시키는 단계; 에서는 0℃ 내지 10℃에서 10 분 내지 1시간 동안 교반되는 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 iii) 대장균 세포에서 생산된 후각 수용체 단백질, 및 지질을 혼합하고 정치시키는 단계; 에서는 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)는 1:1의 분자 비율로 혼합하는 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 iv) 상기 정치시킨 혼합물에 상기 대장균 세포에서 생산 및 정제된 막 지지체 단백질을 혼합하고, 교반하여 나노디스크를 조립하는 단계; 에서는 1시간 내지 2시간 동안 교반하는 것인
    후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 의하여 제조되고, 평균 지름이 15nm 내지 25nm 인 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크.
KR1020170146128A 2017-11-03 2017-11-03 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크의 제조방법과 이에 의하여 제조된 후각 수용체 단백질을 포함하는 나노디스크 KR101994279B1 (ko)

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