WO2023158158A1 - 안지오텐신 전환효소 2를 포함하는 나노디스크 및 이의 항바이러스 용도 - Google Patents

안지오텐신 전환효소 2를 포함하는 나노디스크 및 이의 항바이러스 용도 Download PDF

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WO2023158158A1
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converting enzyme
angiotensin converting
protein
nanodisc
ace2
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PCT/KR2023/001965
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권대혁
황재현
김경원
윤정현
박원범
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엠브릭스 주식회사
성균관대학교산학협력단
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the present invention relates to a nanodisc comprising angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) and a membrane scaffold protein (MSP) and an antiviral use thereof.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • MSP membrane scaffold protein
  • Angiotensin converting enzyme 2 plays an important role in the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), which regulates body water and blood pressure.
  • angiotensinogen is converted to angiotensin I by renin, and angiotensin converting enzyme (ACE) converts angiotensin I to angiotensin II.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • Angiotensin II has a direct 'adverse effect' on the cardiovascular system, such as inflammatory response in blood vessels and promotion of atherosclerosis.
  • angiotensin II in the body is converted into angiotensin (1-7) by ACE2, and as a result, homeostasis can be maintained. Therefore, ACE2 can be said to be an important enzyme for maintaining homeostasis in the body.
  • ACE2 has a transmembrane site and uses it to exist in the body while being incorporated into the cell membrane. Due to the above characteristics, many studies have recently been reported on the potential as an antiviral agent, such as preventing viral infection or inhibiting the proliferation of infected viruses using water-soluble ACE2 (soluble ACE2, sACE2). ACE2 (recombinant soluble ACE2, rsACE2) is also being developed. Nevertheless, antiviral agents using water-soluble ACE2 are limited due to low in vivo antiviral efficacy.
  • nanodisc is a membrane scaffold, a protein derived from apolipoprotein A1 (Apo-A1), a major component of high-density lipoproteins (HDL) in the body.
  • Protein, MSP is a structure formed by wrapping a phospholipid bilayer in a disc shape. Nanodiscs are mainly used to study the structure of various cell membrane proteins. In addition, it also serves as a mobile body that mounts various physiologically functional substances inside and delivers them to the living body. As a material derived from living organisms, nanodiscs are stable in the body and do not cause harmful reactions, so they are safe.
  • An object of the present invention is to provide a composition for improving, preventing, or treating a viral infection having better antiviral efficacy than existing angiotensin converting enzyme 2 (ACE2)-based antiviral therapeutics.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • the present invention is a flat disk-shaped bilayer structure formed from phospholipids, wherein the hydrophilic group is oriented to the outside and the hydrophobic group is oriented to the inside of the lipid bilayer; Membrane scaffold protein (MSP) that surrounds the 'side of the lipid bilayer where the hydrophobic group is exposed to the outside' with hydrophobic bonds; And a spike protein capable of binding to ACE2, characterized in that it contains a nanodisc of the first form containing angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) hydrophobically bound to the inside of the lipid bilayer. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a coronavirus infection having.
  • MSP Membrane scaffold protein
  • the present invention is a bilayer structure in the form of a flat disk formed from phospholipids, a lipid bilayer in which the hydrophilic group is oriented to the outside and the hydrophobic group is oriented to the inside; Membrane scaffold protein (MSP) that surrounds the 'side of the lipid bilayer where the hydrophobic group is exposed to the outside' with hydrophobic bonds; And A spike protein capable of binding to ACE2, characterized in that it contains a nanodisc of the first form containing angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) hydrophobically bound to the inside of the lipid bilayer It provides a food composition for improving coronavirus infection having.
  • MSP Membrane scaffold protein
  • the present invention is a bilayer structure in the form of a flat disk formed from phospholipids, a lipid bilayer in which the hydrophilic group is oriented to the outside and the hydrophobic group is oriented to the inside; And a membrane scaffold protein (MSP) surrounding the 'side where the hydrophobic group is exposed to the outside' of the lipid bilayer;
  • MSP membrane scaffold protein
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a viral infection containing a second type of nanodisc characterized in that it is a membrane-structured protein to which angiotensin converting enzyme 2 is fused.
  • the present invention is a bilayer structure in the form of a flat disk formed from phospholipids, a lipid bilayer in which the hydrophilic group is oriented to the outside and the hydrophobic group is oriented to the inside; And a membrane scaffold protein (MSP) surrounding the 'side where the hydrophobic group is exposed to the outside' of the lipid bilayer;
  • MSP membrane scaffold protein
  • a food composition for improving viral infection containing a second type of nanodisc, characterized in that it is a membrane-structured protein to which angiotensin converting enzyme 2 is fused.
  • the phospholipids are preferably phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol and Preferably, it is at least one selected from phosphatidylinositol.
  • the phospholipid is preferably POPC (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) or DOPS (1,2 -dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) is preferred.
  • POPC l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPS 1,2 -dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine
  • the membrane-structured protein is preferably an amphiphilic protein having a helix structure.
  • the membrane-structured protein is preferably an apolipoprotein or one in which the 'helix structure and amphiphilic properties' of the apolipoprotein are maintained.
  • it is a fragment of apolipoprotein.
  • the angiotensin converting enzyme 2 is preferably a water-soluble angiotensin converting enzyme 2 from which the transmembrane domain is removed.
  • the 'membrane-structured protein to which angiotensin converting enzyme 2 is fused' is preferably converted to angiotensin in a gene encoding the membrane-structured protein. It is preferably prepared by combining the gene encoding enzyme 2 and then expressing it.
  • the nanodisc containing the angiotensin converting enzyme 2 of the present invention has excellent antiviral efficacy. Accordingly, the composition containing the nanodisc of the present invention is good for use in improving, preventing, or treating viral infections.
  • Figure 1 shows the structure of a general nanodisc (ND), angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) nanodisc (NDA) coupled to a lipid bilayer, and angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) nanodisc fused to a membrane structured protein (AND). shows schematically.
  • Figure 2 schematically shows the manufacturing process of nanodiscs (NDA) in which angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is bound to a lipid bilayer and nanodiscs (AND) in which angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is fused to a membrane-structured protein.
  • NDA nanodiscs
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • AND nanodiscs
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • Figure 3 shows size exclusion chromatography after preparing nanodiscs (NDA) in which angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is bound to a lipid bilayer and nanodiscs (sAND) in which recombinant angiotensin converting enzyme 2 (sACE2) is fused to a membrane-structured protein.
  • NDA nanodiscs
  • sAND nanodiscs
  • SEC purification through
  • FIG 4 shows SARS-CoV-2 pseudovirus recombinant angiotensin converting enzyme 2 (sACE2), nanodisc (NDA) in which angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is bound to a lipid bilayer, or recombinant angiotensin converting enzyme 2 (sACE2) is lipid
  • sACE2 SARS-CoV-2 pseudovirus recombinant angiotensin converting enzyme 2
  • NDA nanodisc
  • Figure 5 shows the results of testing the antiviral efficacy of nanodiscs (NDA) to which angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is bound to the lipid bilayer against various mutant viruses of SARS-CoV-2.
  • NDA nanodiscs
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • NDA nanodiscs
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • sAND nanodisc
  • sACE2 recombinant angiotensin converting enzyme 2
  • the present invention is a flat disk-shaped bilayer structure formed from phospholipids, wherein the hydrophilic group is oriented to the outside and the hydrophobic group is oriented to the inside of the lipid bilayer; Membrane scaffold protein (MSP) surrounding the 'side where the hydrophobic group is exposed to the outside' of the lipid bilayer; And angiotensin converting enzyme 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2) It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating viral infections, characterized in that it contains a nanodisc. In addition, the present invention provides a food composition for improving viral infection containing the nanodisc.
  • MSP Membrane scaffold protein
  • angiotensin converting enzyme 2 Angiotensin converting enzyme 2, ACE2
  • coronaviruses including SARS-CoV and SARS-CoV-2, are known to use angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) as a receptor to penetrate human cells.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • corona viruses including SARS-CoV and SARS-CoV-2, have the ability to bind to Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 Angiotensin converting enzyme 2
  • angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) was included in the nanodisc in the present invention (see FIG. 1), the antiviral efficacy of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) could be significantly improved. This means that the antiviral efficacy of an antiviral agent including angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) can be improved when the nanodisc of the present invention is used.
  • the lipid bilayer of the present invention is a flat disk-shaped bilayer structure formed from phospholipids, and is characterized in that the hydrophilic group is oriented to the outside and the hydrophobic group is oriented to the inside (see FIG. 1).
  • the lipid bilayer of the present invention is hydrophilic or hydrophobic in that it has a disk shape (see FIG. 1) having not only the hydrophilic portion of the amphiphatic lipid but also the hydrophobic portion exposed to the outside through the side surface. It is structurally different from liposomes in the form of spheres in which only one of the sites is selectively exposed to the outside.
  • the phospholipid may be, for example, at least one selected from the group consisting of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, and phosphatidylinositol. , but is not limited thereto.
  • the phosphatidylcholine is, for example, DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC (1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC (1,2-Dimyristoyl- sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), C13PC, DDPC (1 ,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC (1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC ( 1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3
  • the phosphatidylglycerol is, for example, DMPG (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3 [Phospho-rac-(1-glycerol)], DPPG (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3 [Phospho-rac -(1-glycerol)]), DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)), POPG(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[ Phospho-rac-(1-glycerol)]), DEPG(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DLPG(1,2-Dilauroyl-sn-glycero- 3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DOPG (1,2-D
  • the membrane scaffold protein serves to surround the side of the lipid bilayer, and for this purpose, it is preferably an amphiphilic protein having a helix structure.
  • An example of an amphiphilic membrane scaffold protein having a helix structure is apolipoprotein.
  • Apolipoprotein is a protein that exists specifically in plasma lipoproteins, stabilizes the structure of lipoproteins, activates enzymes involved in lipoprotein metabolism, and acts as a ligand for lipoprotein receptors on the cell surface. known to perform the function.
  • the apolipoprotein is an example, apolipoprotein A1 (ApoA-I), apolipoprotein A2 (ApoA-2), apolipoprotein B (ApoB), apolipoprotein C (ApoC) and apolipoprotein Protein E (ApoE), MSP1 (Membrane scaffold protein 1), MSP1D1, MSP1D2, MSP1E1, MSP1E2, MSP1E3, MSP1E3D1, MSP2, MSP2N1, MSP2N2, MSP2N3, and the like.
  • ApoA-I mentioned above as an example is known to be a component of high-density lipoprotein (HDL) that plays a direct role in removing cholesterol from surrounding tissues and transporting it to the liver or other lipoproteins.
  • Apo-A1 consists of a single polypeptide consisting of 243 amino acids with a molecular weight of 28 kDa. It is a protein having 8 repeating unit domains of 11 amino acids or 22 amino acids, and the ratio of alpha-helices in the secondary structure constituting HDL is 60 to 75%.
  • ApoE like ApoA1, is known to be involved in transporting cholesterol, and is a protein composed of a single polypeptide consisting of 299 amino acids of 33 kDa.
  • fragments of apolipoprotein in which the helical structure and amphipathic characteristics of apolipoprotein are maintained may be used. That is, within the range of not losing the 'helix structure and amphipathic characteristics' of the apolipoprotein, a part (fragment) of the apolipoprotein may be used instead of the entire apolipoprotein.
  • the nanodisc of the present invention is characterized by having excellent antiviral efficacy, including angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), which is a lipid It may be hydrophobically bonded with the bilayer.
  • Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) has a hydrophobic transmembrane domain at the C-terminus, and this site meets the hydrophobic site of the lipid bilayer to form a hydrophobic interaction ) may be combined through
  • the angiotensin converting enzyme 2 may be fused to a membrane structural protein.
  • the nanodisc of the present invention may be manufactured using a fusion protein prepared by combining a gene encoding angiotensin converting enzyme 2 with a gene encoding a membrane structural protein and then expressing the gene.
  • the manufacturing process is simpler and the manufacturing yield is higher than that of the nanodisc in which angiotensin converting enzyme 2 is bound to the hydrophobic site of the lipid bilayer.
  • angiotensin converting enzyme 2 it is preferable to use water-soluble angiotensin converting enzyme 2 from which the transmembrane domain of angiotensin converting enzyme 2 is removed.
  • Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) has a transmembrane domain, and is a receptor that exists in a cell membrane using this transmembrane domain.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • many studies have been reported on its potential as an antiviral agent, such as preventing viral infection or inhibiting the proliferation of infected viruses.
  • recombinant angiotensin converting enzyme 2 is being developed to further improve functionality.
  • water-soluble angiotensin converting enzyme 2 from which the transmembrane domain has been removed may be used.
  • the pharmaceutical composition or food composition of the present invention is a coronavirus family (Coronaviridae), a bunya virus family (Bunyaviridae), a filoviridae family (Filoviridae), a flavivirus family (Flaviviridae), a hepadnavirus family (Hepadnaviridae), herpes Any one selected from Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae, Retroviridae and Togaviridae It can be used for viruses with abnormalities, preferably for viruses having a spike protein capable of binding to angiotensin converting enzyme 2. Specific examples of viruses having the spike protein include SARS-CoV or SARS-CoV-2.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulation using pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. or it may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the dosage form may be prepared in various ways such as oral medicine and injection, and may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may be in the form of a dispersant or stabilizer. Additional topics may be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, such as intrathecal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intrasternal administration, intratumoral administration, intranasal administration, It may be administered by intracerebral administration, intracranial administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc., but is not limited thereto.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, disease condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, usually As a result, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage (pharmaceutically effective amount) for the desired treatment or prevention.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg.
  • the food composition of the present invention may include 0.001 to 99.9% by weight of the nanodisc of the present invention based on the total weight of the food composition.
  • the food composition of the present invention may be in the form of, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, functional beverages, health functional foods, etc., and additives commonly added during food preparation may be added.
  • Example 1 Preparation of the nanodisc of the present invention containing angiotensin converting enzyme 2]
  • the nanodisc of the present invention containing angiotensin converting enzyme 2 was prepared.
  • the nanodisc of the present invention can be prepared by using a membrane-structured protein to which angiotensin converting enzyme 2 is fused, or by a method of binding angiotensin converting enzyme 2 to the lipid bilayer of the nanodisc.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • HEK293 human embryonic kidney 293
  • the transfected cells were cultured in an incubator at 37° C., 120 rpm, and 8% CO 2 for 72 hours, and then centrifuged at 8000 g for 10 minutes to obtain a supernatant.
  • the supernatant is treated with Ni-NTA agarose beads and then treated with a buffer solution (25 mM tris, 150 mM Nacl, 20 mM Imidazole, pH 8.0) containing a low concentration of Imidazole to remove non-target substances that have not been bound to the beads.
  • membrane scaffold proteins and ACE2-fused proteins (ACE2-MSP1E3D1, SEQ ID NO: 2) were treated with a buffer containing high concentration of imidazole (25 mM tris, 150 mM Nacl, 500 mM Imidazole, pH 7.4). was purified.
  • POPC l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPS 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine
  • the total lipid concentration becomes 10 mM and the volume becomes 1 mL
  • the molar ratio of POPC:DOPS is 243 ⁇ L of the POPC solution and 65 ⁇ L of the DOPS solution were transferred to a glass tube so that the ratio was 8:2.
  • the mixture was left in a vacuum for at least 2 hours to completely remove the solvent to obtain a lipid film.
  • the obtained lipid film was mixed with 1 mL of the above buffer to hydrate it, and treated with ultrasonic wave at 55° C.
  • 'sACE2' water-soluble angiotensin converting enzyme 2
  • SEQ ID NO: 3 transmembrane domain
  • HEK293 human embryonic kidney 293
  • the plasmid containing the sACE2-MSP1E3D1 gene (SEQ ID NO: 4) and 750 ⁇ g of PEI (poly ethylenimine) were mixed in 20 mL of medium, and then mixed with 180 mL of the cell solution prepared above for transfection. Thereafter, the transfected cells were cultured in an incubator at 37° C., 120 rpm, and 8% CO 2 for 72 hours, and then centrifuged at 8000 g for 10 minutes to obtain a supernatant.
  • the supernatant is treated with Ni-NTA agarose beads and then treated with a buffer solution (25 mM tris, 150 mM Nacl, 20 mM Imidazole, pH 8.0) containing a low concentration of Imidazole to remove non-target substances that have not been bound to the beads. did Subsequently, membrane scaffold proteins and sACE2 fusion proteins (sACE2-MSP1E3D1, SEQ ID NO: 5) were treated with a buffer containing high concentration of imidazole (25 mM tris, 150 mM Nacl, 500 mM Imidazole, pH 7.4). was purified.
  • a buffer solution 25 mM tris, 150 mM Nacl, 20 mM Imidazole, pH 8.0
  • nanodisc of the present invention containing a membrane-structured protein fused with water-soluble angiotensin converting enzyme 2 (sACE2)
  • POPC l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPS 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine
  • the total lipid concentration becomes 10 mM and the volume becomes 1 mL
  • the molar ratio of POPC:DOPS is 243 ⁇ L of the POPC solution and 65 ⁇ L of the DOPS solution were transferred to a glass tube so that the ratio was 8:2.
  • the mixture was left in a vacuum for at least 2 hours to completely remove the solvent to obtain a lipid film.
  • the obtained lipid film was mixed with 1 mL of the above buffer to hydrate it, and treated with ultrasonic wave at 55° C.
  • HEK293 Human embryonic kidney 293 water-soluble floating cells were cultured at 37°C, 120 rpm, and 8% CO 2 to prepare 1.1 ⁇ 10 6 cells/mL, 180 mL.
  • the cells were resuspended using Tris buffer containing 1% DDM, and membrane proteins were separated using an ultra-high-speed centrifuge and then purified using Ni-NTA agarose beads. Substances not bound to the beads were then removed using a buffer solution containing 0.1% DDM and low concentration of imidazole, and ACE2 (SEQ ID NO: 7) was obtained using high concentration of imidazole.
  • sACE2 was transfected using a plasmid containing the sACE2 gene (SEQ ID NO: 8) in the above method, and after culturing the cells in an incubator at 37 ° C, 120 rpm, 8% CO 2 conditions for 72 hours, 8000 Cells were removed by centrifugation at ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was purified using Ni-NTA agarose beads. Thereafter, materials not bound to the beads were removed using a buffer solution containing low concentration of imidazole, and sACE2 (SEQ ID NO: 9) was obtained using high concentration of imidazole.
  • POPC l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DOPS 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine
  • the total lipid concentration becomes 10 mM and the volume becomes 1 mL
  • the molar ratio of POPC:DOPS is 243 ⁇ l of the POPC solution and 65 ⁇ l of the DOPS solution were transferred to a glass tube in a ratio of 8:2.
  • nitrogen gas was applied, and the solvent was removed by leaving the mixture in a vacuum for at least 4 hours, and then a lipid film was obtained.
  • the obtained lipid film was mixed with 1 mL of the buffer to hydrate the lipid film, and ultrasonic waves were treated at 55° C. for 30 minutes to obtain a suspension in which lipids were uniformly distributed.
  • ACE2 and MSP1E3D1 were added to the suspension so that the molar ratio of ACE2 (molecular weight: 94.2 kDa):MSP1E3D1 (molecular weight: 32.6 kDa):lipid was 0.5:1:120. Thereafter, the same amount of bio-beads as the total mixture was treated twice, once for 5 hours at room temperature and once for 16 hours at 4 ° C. A nanodisc (NDA) was prepared.
  • nanodiscs in which water-soluble angiotensin converting enzyme 2 (sACE2) is bound to the lipid bilayer
  • POPC, DOP, and 18:1 DGS-NTA (Ni) were mixed with nanodiscs (ND) buffer (40 mM Tris -Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4), the total lipid concentration is 10 mM and the volume is 1 mL
  • lipid film was hydrated using the NP buffer to which sodium cholate was added, and ultrasonic waves were treated at 55° C. for 15 minutes to obtain a lipid film-containing suspension in which the lipid film was pulverized. Thereafter, the suspension was treated with membrane scaffold proteins so that the molar ratio of MSP1E3D1:lipid with a molecular weight of 32.6 kDa was 1:120. Thereafter, nanodiscs were prepared through a self-assembly process by treating the same amount of bio-beads as the entire mixed solution (at room temperature for 5 hours).
  • nanodisc prepared in the above manner and sACE2 were mixed at 4° C. for 1 hour to prepare a nanodisc (ND-sACE2) in which water-soluble angiotensin converting enzyme 2 (sACE2) was bound to a lipid bilayer.
  • sACE2 water-soluble angiotensin converting enzyme 2
  • sACE2 is covalently linked to the C-terminal His-tag of 18:1 DGS-NTA (Ni) contained in the nanodisc.
  • nanodisc (sAND) of the present invention prepared in 4) above and the nanodisk (NDA) prepared in 6) above were purified through size exclusion chromatography (SEC). Through this, it was possible to purify nanodisks (NDA or sAND, molecular weight of about 400 kDa) containing ACE2 at an elution volume of 13 to 15 mL (FIG. 3).
  • the final production yield was calculated by dividing the amount of protein used in manufacturing the nanodisc by the amount of protein contained in the finally purified nanodisk, and converting the result into a percentage.
  • the yield was 47.0%
  • NDA nanodiscs
  • the antiviral efficacy of the nanodisc of the present invention prepared in Example 1 was confirmed to confirm whether it can be significantly and appropriately used for the improvement, prevention, or treatment of viral infection.
  • HEK293-ACE2 which is a cell expressing ACE2 in 293T cells grown in a medium containing 5% FBS in DMEM, or ACE2, TMPRSS2 (Transmembrane protease serine subtype 2, SEQ ID NO: 10, derived from human) was evaluated for virus inhibition by quantifying the degree of infection of SARS-CoV-2 pseudovirus (PV) in "HEK293-ACE2/TMPRSS2" cells simultaneously expressed.
  • PV SARS-CoV-2 pseudovirus
  • SARS-CoV-2 infects cells through two main routes.
  • the first is endocytosis, and the second is direct fusion.
  • the first occurs when the cell expresses only ACE2 on its surface, and the second case occurs when the cell simultaneously expresses ACE2 and TMPRSS2. Therefore, for the experiments in the above two cases, "HEK293-ACE2" in which ACE2 was expressed in HEK-293T cells and "HEK293-ACE2/TMPRSS2" in which ACE2 and TMPRSS2 were simultaneously expressed in HEK-293T cells were used.
  • Example 1 Water-soluble angiotensin converting enzyme 2 (sACE2) purified in 5) of Example 1 or ACE2 or sACE2 prepared in 6) and 7) of Example 1 is bound to a lipid bilayer nanodisc (NDA, ND-sACE2) and each reacted for 1 hour at 37 ° C. Thereafter, the culture medium was removed from the cells, and 100 ⁇ L of the mixture of the virus and the antiviral agent was dispensed into each well containing the cells and cultured in a 37° C. 5% CO 2 incubator for 72 hours. Then, the virus inhibitory ability of the antiviral agent was measured using a Luciferase assay kit (FIG. 4).
  • sACE2 Water-soluble angiotensin converting enzyme 2
  • antiviral activity was also measured for the Pre-cleavage experimental group (an experimental group treated with trypsin to increase the infectivity of the virus in infection through the direct fusion route).
  • the infection route of direct fusion HEK293-ACE2/TMPRSS2
  • Spike protein the protrusion protein of SARS-CoV-2
  • the nanodisc (NDA) in which ACE2 was bound to the lipid bilayer had excellent virus inhibitory activity in all experimental groups. This means that the ACE2-bound nanodisc (NDA) was more stable and strongly bound to the viral spike protein than sACE2, and exhibited superior antiviral efficacy.
  • nanodiscs (ND-sACE2) in which sACE2 was bound to the lipid bilayer showed antiviral efficacy similar to that of sACE2.
  • the nanodisc (sAND) in which sACE2 was fused to a membrane-structuring protein also exhibited antiviral efficacy similar to that of the nanodisc (NDA) in which ACE2 was bound to a lipid bilayer, and exhibited excellent antiviral efficacy.

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Abstract

본 발명은 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)및 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP)을 포함하는 나노디스크(nanodisc) 및 이의 항바이러스 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)를 나노디스크에 포함시키는 것으로, 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)의 항바이러스 효능을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

Description

안지오텐신 전환효소 2를 포함하는 나노디스크 및 이의 항바이러스 용도
본 발명은 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2) 및 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP)을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크(nanodisc) 및 이의 항바이러스 용도에 관한 것이다.
안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)는 체내 수분과 혈압을 조절하는 레닌-안지오텐신-알도스테론계(Renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)에서 중요한 역할을 담당한다.
레닌-안지오텐신-알도스테론계(RAAS)에서 레닌에 의해 안지오텐시노겐이 안지오텐신 I으로 되고, 안지오텐신 전환효소 (angiotensin converting enzyme, ACE)가 안지오텐신 I을 안지오텐신 II로 전환시킨다. 안지오텐신 II는 혈관 내 염증반응, 죽상동맹경화증 촉진 등 심혈관계에 직접적으로 '악영향'을 끼친다. 그런데, 체내의 안지오텐신 II는 상기 ACE2에 의해 안지오텐신(1-7)로 전환되며 그 결과 항상성을 유지할 수 있게 된다. 따라서, ACE2는 체내 항상성 유지에 중요한 효소라 할 수 있다.
ACE2는 막관통부위를 가지고 있으며 이를 이용하여 세포막에 함입된 채로 체내에 존재한다. 상기의 특성으로 인해 최근 수용성 ACE2 (soluble ACE2, sACE2)를 이용하여 바이러스의 감염을 예방하거나, 감염된 바이러스의 증식을 억제하는 등 항바이러스제로서의 가능성 대한 연구가 많이 보고되고 있으며, 다양한 유전자 재조합을 통한 수용성 ACE2 (recombinant soluble ACE2, rsACE2)도 개발되고 있다. 그럼에도 불구하고 수용성 ACE2를 이용한 항바이러스제는 낮은 in vivo 항바이러스 효능으로 인해 제약이 있는 상황이다.
한편, 나노디스크(nanodisc, ND)는 체내의 고밀도 지질단백질(high-density lipoproteins, HDL)의 주요성분인 아포리포단백질 A1 (apolipoprotein A1, Apo-A1)에서 유래한 단백질인 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP)이 인지질 이중막을 원반 형태로 감싸 형성된 구조이다. 나노디스크는 다양한 세포막 단백질의 구조 연구에 주로 쓰인다. 또한, 다양한 생리기능성 물질을 내부에 탑재하여 이를 생체 내로 전달하는 이동체로서 역할을 수행하기도 한다. 나노디스크는 생체 내 유래 물질로서 체내에서 안정적이며 유해한 반응을 유발하지 않아 안전한 장점이 있다.
본 발명은 기존 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2) 기반 항바이러스 치료제보다 항바이러스 효능이 우수한 바이러스 감염증 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP); 및 상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되어 있는 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 포함하는 제1형태의 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 것을 특징으로 하는 ACE2와 결합할 수 있는 스파이크 단백질을 갖는 코로나바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP); 및상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되어 있는 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 포함하는 제1형태의 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 것을 특징으로 하는 ACE2와 결합할 수 있는 스파이크 단백질을 갖는 코로나바이러스 감염증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP);을 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하되, 상기 막구조화 단백질은, '안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2)가 융합되어 있는 막구조화 단백질'인 것을 특징으로 하는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP);을 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하되, 상기 막구조화 단백질은, '안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2)가 융합되어 있는 막구조화 단백질'인 것을 특징으로 하는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 바이러스 감염증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명 제1형태 또는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 인지질은 바람직하게 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상인 것이 좋다.
한편, 본 발명 제1형태 또는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 인지질은 바람직하게 POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)인 것이 좋다.
한편, 본 발명 제1형태 또는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 막구조화 단백질은 바람직하게 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것이 좋다.
한편, 본 발명 제1형태 또는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 막구조화 단백질은 바람직하게 아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편인 것이 좋다.
한편, 본 발명 제1형태 또는 제2형태의 나노디스크를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 안지오텐신 전환효소 2는 바람직하게 트렌스 멤브레인 도메인 (transmembrane domain)이 제거된 수용성 안지오텐신 전환효소 2인 것이 좋다.
한편, 본 발명 제2형태의 나노디스크를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 '안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2)가 융합되어 있는 막구조화 단백질'은 바람직하게 막구조화 단백질을 암호화하는 유전자에 안지오텐신 전환효소 2를 암호화하는 유전자를 결합시킨 후, 이를 발현시켜 제조한 것이 좋다.
본 발명의 안지오텐신 전환효소 2를 포함하는 나노디스크(nanodisc)는 항바이러스 효능이 우수하다. 이에 본 발명의 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 조성물은 바이러스 감염증 개선, 예방 또는 치료에 사용하기 좋다.
도 1은 일반적인 나노디스크 (ND), 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA), 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (AND)의 구조를 개략적으로 보여준다.
도 2는 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)와 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (AND)의 제조과정을 개략적으로 보여준다.
도 3은 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)와 재조합 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND)를 제작한 후 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해 정제한 결과를 보여준다.
도 4는 SARS-CoV-2 슈도 바이러스를 재조합 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2), 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA), 또는 재조합 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (ND-sACE2)와 혼합시킨 후, 세포에 처리하여 항바이러스 효능을 실험한 결과를 보여준다.
도 5는 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)를 SARS-CoV-2의 다양한 변이 바이러스에 항바이러스 효능을 실험한 결과를 보여준다.
도 6은 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)와 재조합 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND)의 항바이러스 효능을 비교한 결과를 보여준다.
본 발명은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP); 및 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 나노디스크를 함유하는 바이러스 감염증 개선용 식품 조성물을 제공한다.
SARS-CoV와 SARS-CoV-2를 포함한 여러 코로나바이러스는 인체 세포로 침투하기 위해서 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 수용체로 이용하는 것으로 알려졌다. 즉, SARS-CoV와 SARS-CoV-2를 포함한 여러 코로나 바이러스가 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)와 결합능이 있는 것으로 알려졌다. 상기와 같은 점을 이용하여, 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)를 포함하는 항바이러스제 개발이 시도되고 있으나, 아직 우수한 항바이러스 효능을 보이는 경우는 없었다.
하지만, 본 발명에서 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)를 나노디스크(nanodisc)에 포함시켰더니 (도 1 참조), 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)의 항바이러스 효능을 현저히 향상시킬 수 있었다. 이는 본 발명의 나노디스크를 이용하는 경우, 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)를 포함하는 항바이러스제의 항바이러스 효능을 향상시킬 수 있음을 의미한다.
한편, 본 발명의 지질 이중층 (lipid bilayer)은 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 것에 특징이 있다 (도 1 참조).
본 발명의 지질 이중층 (lipid bilayer)은 양친매성 지질 (amphipahtic lipid)의 친수성 부위뿐만 아니라, 소수성 부위도 측면을 통해 외부에 노출된 부분을 갖는 원반 형태 (도 1 참조)라는 점에서, 친수성 또는 소수성 부위 중 선택적으로 하나만이 외부에 노출되는 구(sphere) 형태의 리포좀(liposome)과 구조상 차이가 있다.
한편, 본 발명에서 인지질은 예로서, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol)로 이루 어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)은 일 예로 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), C13PC, DDPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC(1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC(Egg phosphatidylcholine), MSPC( 1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PMPC(1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PSPC(1-Palmitoyl-2- stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SMPC(1-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 SPPC(1-Stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.
또한, 상기 포스파티딜글리세롤은 일 예로 DMPG(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)], DPPG(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)), POPG(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DEPG(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DLPG(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DOPG(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]) 또는 DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])일 수 있고, 상기 포스파티딜에탄올아민은, DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 POPE(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 상기 포스파티딜세린은, DOPS(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DLPS(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DMPS(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DPPS(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DSPS(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine) 또는 POPS, 상기 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol)은 포스파티딜이노시톨-4-인산, 포스파티딜이노시톨-4,5-비스인산, 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스인산일 수 있다.
한편, 본 발명에서 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP)은 지질 이중층의 측면을 둘러싸는 역할을 하는데, 이를 위해, 바람직하게 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것이 좋다. 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)의 예로는 아포리포단백질(apolipoprotein)이 있다. 아포리포단백질(apolipoprotein)은 혈장지방단백질에 특이적으로 존재하는 단백질로, 지방단백질의 구조를 안정시키고, 지방단백질대사에 관여하는 효소를 활성화하며, 세포표면에 존재하는 지방단백질 수용체에 대한 배위자로서 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 상기 아포리포단백질(apolipoprotein)은 일 예로서, 아포리포단백질 A1(ApoA-I), 아포리포단백질 A2(ApoA-2), 아포리포단백질 B(ApoB), 아포리포단백질 C(ApoC) 및 아포리포단백질 E(ApoE), MSP1(Membrane scaffold protein1), MSP1D1, MSP1D2, MSP1E1, MSP1E2, MSP1E3, MSP1E3D1, MSP2, MSP2N1, MSP2N2, MSP2N3, 등이 있다.
상기에서 일 예로 언급한 ApoA-I은 주로 주변조직으로부터 콜레스테롤을 제거하여 간 또는 다른 리포단백질로 운반하는 직접적인 역할을 수행하는 고밀도 리포단백질(HDL)의 구성요소인 것으로 알려져 있다. Apo-A1은 분자량 28kDa의 243개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성된다. 11개의 아미노산 혹은 22개의 아미노산으로 이루어진 8개의 반복 단위 도메인을 가지며, HDL을 이루는 2차 구조의 알파-헬릭스의 비율이 60 내지 75%인 단백질이다. 또한, ApoE는 ApoA1과 마찬가지로 콜레스테롤의 운반에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 33kDa의 299개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성된 단백질이다.
또한, 본 발명에서는 아포리포단백질의 헬릭스 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편을 사용할 수도 있다. 즉, 상기 아포리포단백질(apolipoprotein)의 '헬릭스 구조 및 양친매성 특성'을 소실하지 않는 범위 내에서, 아포리포단백질 전체가 아닌 그 일부(절편)를 사용할 수도 있는 것이다.
한편, 본 발명의 나노디스크는 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 포함하여 우수한 항바이러스 효능을 가지고 있음에 특징이 있는데, 상기 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)는 지질 이중층과 소수성 결합된 것일 수 있다. 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)는 C-말단에 소수성을 띄는 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain)을 가지고 있는데, 이 부위가 지질 이중층 (lipid bilayer)의 소수성 부위와 만나 소수성 결합 (hydrophobic interaction)을 통해 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)는 막 구조화 단백질에 융합된 것일 수 있다. 구체적으로, 막구조화 단백질을 암호화하는 유전자에 안지오텐신 전환효소 2를 암호화하는 유전자를 결합시킨 후, 이를 발현시켜 제조한 융합 단백질을 사용하여 본 발명의 나노디스크를 제조할 수도 있는 것이다. 한편, 하기 실시예에 따르면, 상기와 같이 제조된 융합 단백질을 사용하는 경우, 안지오텐신 전환효소 2가 지질 이중층의 소수성 부위에 결합된 나노디스크 보다, 제조 공정이 간단하고, 제작 수율이 더욱 높다.
한편, 상기 안지오텐신 전환효소 2는, 바람직하게 안지오텐신 전환효소 2의 트렌스 멤브레인 도메인 (transmembrane domain)이 제거된 수용성 안지오텐신 전환효소 2를 사용하는 것이 좋다.
안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)에는 트랜스멤브레인 도메인 (transmembrane domain)이 있으며, 이를 이용하여 세포막에 함입된 채로 존재하는 수용체(receptor)이다. 최근 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)의 바이러스와의 결합능이 보고됨에 따라, 이를 이용하여 바이러스의 감염을 예방하거나 감염된 바이러스의 증식을 억제하는 등의 항바이러스제로서의 가능성 대한 연구가 많이 보고되고 있으며, 활용성 및 기능성을 더욱 향상시키기 위해 재조합 안지오텐신 전환효소 2가 개발되고 있다. 본 발명에서 트렌스 멤브레인 도메인 (transmembrane domain)이 제거된 수용성 안지오텐신 전환효소 2를 사용할 수도 있는 것이다.
한편, 본 발명의 약학 조성물 또는 식품 조성물은 코로나바이러스 과 (Coronaviridae), 버니아바이러스 과 (Bunyaviridae), 필로바이러스 과 (Filoviridae), 플라비바이러스 과 (Flaviviridae), 헤파드나바이러스 과 (Hepadnaviridae), 헤르페스바이러스 과 (Herpesviridae), 오스소믹소바이러스 과 (Orthomyxoviridae), 폭스바이러스 과 (Poxviridae), 랍도바이러스 과 (Rhabdoviridae), 레트로바이러스 과 (Retroviridae) 및 토가바이러스 과 (Togaviridae)로 중 선택되는 어느 하나 이상인 바이러스에 사용할 수 있는데, 바람직하게 안지오텐신 전환효소 2와 결합할 수 있는 스파이크 단백질을 가지고 있는 바이러스에 사용하는 것이 좋다. 상기 스파이크 단백질을 가진 바이러스의 구체적인 예로는 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 등이 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 내복약, 주사제 등 다양하게 제조될 수 있고, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약학 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 본 발명의 나노디스크(nanodisc)를 0.001 내지 99.9 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 일 예로, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 음료, 건강기능식품 등의 형태일 수 있으며, 식품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 안지오텐신 전환효소 2를 포함하는 본 발명의 나노디스크 제조]
본 실시예에서는 안지오텐신 전환효소 2를 포함하는 본 발명의 나노디스크를 제조하였다.
한편, 본 발명의 나노디스크는 안지오텐신 전환효소 2가 융합된 막구조화 단백질을 사용하여 제조하거나, 안지오텐신 전환효소 2를 나노디스크의 지질이중층에 결합시키는 방법으로 제조할 수 있었다.
1) 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 융합된 막구조화 단백질 정제
안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2, 이하 'ACE2'로 기재)가 융합된 막구조화 단백질 (membrane scaffold proteins)을 정제하기 위해, Human embryonic kidney 293 (HEK293) 수용성 부유세포를 37℃, 120 rpm, 8% CO2의 조건하로 배양하여, 1.1×106cells/mL, 180mL의 세포액을 준비하였다. 이후 ACE2-MSP1E3D1 유전자 (서열번호 1) 함유 플라스미드 250 μg과 PEI(poly ethylenimine) 750 μg를 배지 20 mL에 혼합한 후, 상기 준비한 180 mL의 세포액과 혼합하여 형질주입(Transfection) 하였다. 이후, 형질주입된 세포를 37℃, 120 rpm, 8% CO2조건의 인큐베이터에서 72시간 배양한 후 8000 g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻어내었다. 상층액에 Ni-NTA 아가로스 비드를 처리한 다음, 저농도의 Imidazole이 포함된 완충액(25 mM tris, 150 mM Nacl, 20 mM Imidazole, pH 8.0)을 처리하여 비드에 결합하지 못한 비목적 물질들을 제거하였다. 이후 고농도의 Imidazole이 포함된 완충액(25 mM tris, 150 mM Nacl, 500 mM Imidazole, pH 7.4)을 처리하여 막구조화 단백질 (membrane scaffold proteins) 및 ACE2가 융합된 단백질 (ACE2-MSP1E3D1, 서열번호 2)을 정제하였다.
2) 안지오텐신 전환효소 2 (ACE2)가 융합된 막구조화 단백질을 포함하는 나노디스크 (AND) 제작
지질로서，POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)와 DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)을 클로로포름에 용해시켜 각 25 mg/ml, 10 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4)으로 녹였을 때 총 지질의 농도가 10 mM, 부피가 1 mL가 되며 동시에 POPC:DOPS의 몰비율이 8:2가 되도록 POPC 용액의 243 μL, DOPS 용액의 65 μL를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 이용하여 클로로포름을 증발시킨 후 진공 상태에서 최소 2시간 동안 방치하여 용매를 완전히 제거하여 리피드 필름을 수득하였다. 수득한 리피드 필름에 상기 완충액 1 mL를 혼합하여 수화시키고, 초음파를 55℃에서 30분간 처리하여, 지질이 일정하게 분배된 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액과 상기 3)에서 정제한 ACE2-MSP1E3D1을 혼합하되, ACE2-MSP1E3D1:지질의 몰 비율이 1:120이 되도록 혼합했다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 실온에서 5시간 동안 1회, 4℃에서 16시간 동안 1회, 총 2회 처리하여 자가조립과정을 통해, ACE2가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (AND)를 제작하였다.
3) 수용성 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 융합된 막구조화 단백질 정제
트렌스 멤브레인 도메인 (transmembrane domain, 서열번호 3)이 제거된 수용성 안지오텐신 전환효소 2 (이하 'sACE2'로 기재)가 융합된 막구조화 단백질 (membrane scaffold proteins)을 정제하기 위해, Human embryonic kidney 293 (HEK293) 수용성 부유세포를 37℃, 120 rpm, 8% CO2의 조건하로 배양하여, 1.1×106cells/mL, 180mL의 세포액을 준비하였다. 이후 sACE2-MSP1E3D1 유전자 (서열번호 4) 함유 플라스미드 250 μg과 PEI(poly ethylenimine) 750 μg를 배지 20 mL에 혼합한 후, 상기 준비한 180 mL의 세포액과 혼합하여 형질주입(Transfection) 하였다. 이후, 형질주입된 세포를 37℃, 120 rpm, 8% CO2조건의 인큐베이터에서 72시간 배양한 후 8000 g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻어내었다. 상층액에 Ni-NTA 아가로스 비드를 처리한 다음, 저농도의 Imidazole이 포함된 완충액(25 mM tris, 150 mM Nacl, 20 mM Imidazole, pH 8.0)을 처리하여 비드에 결합하지 못한 비목적 물질들을 제거하였다. 이후 고농도의 Imidazole이 포함된 완충액(25 mM tris, 150 mM Nacl, 500 mM Imidazole, pH 7.4)을 처리하여 막구조화 단백질 (membrane scaffold proteins) 및 sACE2이 융합된 단백질 (sACE2-MSP1E3D1, 서열번호 5)을 정제하였다.
4) 수용성 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 융합된 막구조화 단백질을 포함하는 본 발명의 나노디스크 (sAND) 제작
지질로서，POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)와 DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)을 클로로포름에 용해시켜 각 25 mg/ml, 10 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4)으로 녹였을 때 총 지질의 농도가 10 mM, 부피가 1 mL가 되며 동시에 POPC:DOPS의 몰비율이 8:2가 되도록 POPC 용액의 243 μL, DOPS 용액의 65 μL를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 이용하여 클로로포름을 증발시킨 후 진공 상태에서 최소 2시간 동안 방치하여 용매를 완전히 제거하여 리피드 필름을 수득하였다. 수득한 리피드 필름에 상기 완충액 1 mL를 혼합하여 수화시키고, 초음파를 55℃에서 30분간 처리하여, 지질이 일정하게 분배된 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액과 상기 3)에서 정제한 sACE2-MSP1E3D1을 혼합하되, sACE2-MSP1E3D1:지질의 몰 비율이 1:120이 되도록 혼합했다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 실온에서 5시간 동안 1회, 4℃에서 16시간 동안 1회, 총 2회 처리하여 자가조립과정을 통해, sACE2가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND)를 제작하였다.
5) 안지오텐신 전환효소 2의 정제
단백질의 정제를 위해 HEK293(Human embryonic kidney 293) 수용성 부유세포를 37℃, 120 rpm, 8% CO2의 조건하로 배양하여, 1.1×106 cells/mL, 180 mL를 준비하였다. ACE2 유전자 (서열번호 6) 함유 플라스미드 250 μg과 PEI(poly ethylenimine) 750 μg를 배지 20 mL에 혼합한 후, 상기 준비한 180 mL의 세포액과 혼합하여 형질주입(Transfection) 하였다. 이후 37℃, 120 rpm, 8% CO2 조건의 인큐베이터에서 세포를 72시간 배양한 후 8000 g에서 10분간 원심분리하여 배지를 제거하고 세포만 얻어내었다. 상기 세포에 1% DDM이 포함된 Tris 완충액을 사용하여 세포를 재부유시키고, 초고속 원심분리기를 이용해 막단백질을 분리 한 후, Ni-NTA 아가로스 비드를 이용해 정제하였다. 이후 0.1% DDM과 저농도의 이미다졸(imidazole)이 포함된 완충액을 이용하여 비드에 결합하지 못한 물질들을 제거하였고, 고농도의 이미다졸을 이용해 ACE2 (서열번호 7)를 얻어내었다.
한편, sACE2는 상기의 방법에서 sACE2 유전자 (서열번호 8) 함유 플라스미드를 이용하여 형질주입(Transfection)을 진행하였으며 37℃, 120 rpm, 8% CO2 조건의 인큐베이터에서 세포를 72시간 배양한 후 8000×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액을 Ni-NTA 아가로스 비드를 이용해 정제하였다. 이후 저농도의 이미다졸이 포함된 완충액을 이용하여 비드에 결합하지 못한 물질들을 제거하였고, 고농도의 이미다졸을 이용해 sACE2 (서열번호 9)를 얻어내었다.
6) 안지오텐신 전환효소 2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)의 제작
지질로서，POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)와 DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)을 클로로포름에 용해시켜 각 25 mg/ml, 10 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4)으로 녹였을 때 총 지질의 농도가 10 mM, 부피가 1 mL가 되며 동시에 POPC:DOPS의 몰비율이 8:2가 되도록 POPC 용액의 243 μl, DOPS 용액의 65 μl를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간 동안 방치하여 용매를 제거한 후, 리피드 필름을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 상기 완충액 1 mL를 혼합하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 30분간 처리하여, 지질이 일정하게 분배된 현탁액을 수득하였다.
이후 상기 현탁액에 ACE2(분자량 94.2 kda):MSP1E3D1(분자량 32.6 kDa):지질의 몰 비율이 0.5:1:120이 되도록 ACE2 및 MSP1E3D1을 첨가하였다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 실온에서 5시간 동안 1회, 4℃에서 16시간 동안 1회, 총 2회 처리하여, 자가조립과정을 통해 ACE2가 지질 이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)를 제조하였다.
7) 수용성 안지오텐신 전환효소 2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (ND-sACE2)의 제작
수용성 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (ND-sACE2)를 제작하기 위하여 POPC, DOP 및, 18:1 DGS-NTA(Ni)를 나노디스크(ND) 완충액(40 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaC, pH 7.4)으로 녹였을 때 총 지질의 농도가 10 mM, 부피가 1 mL가 되며 동시에 POPC: DOPS: 18:1 DGS-NTA(Ni)의 몰비율이 7:2:1이 되도록 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 최소 4시간 동안 방치하여 용매를 제거하여, 리피드 필름(lipid film)을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 소듐 콜레이트(sodium cholate)가 첨가된 상기 NP 완충액 이용하여 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 15분간 처리하여, 리피드 필름이 분쇄된 리피드 필름 함유 현탁액을 수득하였다. 이후 상기 현탁액에 막구조화 단백질(membrane scaffold proteins)로, 분자량 32.6 kDa의 MSP1E3D1:지질의 몰 비율이 1:120이 되도록 처리하였다. 이후 전체 혼합액과 동일한 양의 바이오비드(bio-beads)를 처리(실온에서 5시간)함으로써, 자가조립과정을 통해 나노디스크를 제조하였다. 상기 방법으로 제작된 나노디스크와 sACE2를 4℃에서 1시간 섞어주어, 수용성 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2)가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (ND-sACE2)를 제조하였다. 한편, sACE2는 나노디스크에 함유된 18:1 DGS-NTA(Ni)의 C말단의 His-tag에 공유결합으로 연결된다.
8) 본 발명의 나노디스크 정제
상기 4)에서 제조한 본 발명의 나노디스크 (sAND) 및 상기 6)에서 제조한 나노디스크 (NDA)를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하였다. 이를 통해, Elution volume 13~15 mL에서 ACE2가 포함된 나노디스크 (NDA 또는 sAND, 분자량 약 400 kDa)를 정제할 수 있었다 (도 3).
이후, 나노디스크 제조에 사용된 단백질 양에 최종적으로 정제한 나노디스크에 포함된 단백질 양으로 나누고, 백분율로 환산하여 최종 생산 수율을 계산하였다. 수용성 안지오텐신 전환효소 2가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND)의 경우 수율이 47.0%가 나왔고, 안지오텐신 전환효소 2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)의 경우 수율이 26.2%로 나타났다.
[실시예 2: 본 발명의 나노디스크의 항바이러스 효능 확인]
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명 나노디스크의 항바이러스 효능을 확인하여 바이러스 감염 개선, 예방 또는 치료에 유의 적절히 사용할 수 있는지 확인하고자 했다.
1) ACE2 또는 sACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA, ND-sACE2)의 항바이러스 효능 확인
DMEM에 5% FBS가 포함된 배지로 키운 293T 세포에 ACE2를 발현시킨 세포인 "HEK293-ACE2" 또는 DMEM에 5% FBS가 포함된 배지로 키운 293T 세포에 ACE2, TMPRSS2(Transmembrane protease serine subtype 2, 서열번호 10, 인간에서 유래)를 동시에 발현시킨 세포인 "HEK293-ACE2/TMPRSS2"에, SARS-CoV-2 슈도 바이러스 (PV)의 감염 정도를 정량하는 방법으로 바이러스 저해능을 평가하였다.
SARS-CoV-2는 세포를 감염할 때 크게 두가지 경로로 감염된다고 알려져 있다. 첫번째는 세포내이입(Endocytosis), 두번째는 Direct fusion이다. 첫번째는 세포가 표면에 ACE2만 발현하고 있는 경우에 발생하며, 두번째 경우는 세포가 ACE2와 TMPRSS2를 동시에 발현하고 있는 경우에 발생한다. 따라서 상기 두 경우에서의 실험을 위하여 HEK-293T세포에 ACE2를 발현시킨 "HEK293-ACE2", HEK-293T세포에 ACE2와 TMPRSS2를 동시에 발현시킨 "HEK293-ACE2/TMPRSS2"를 이용한 것이다.
구체적으로, 상기 두 세포를 각각 2 X 105 cell/mL의 농도로 100 μL씩 흰색 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고, 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 우선 SARS-CoV-2 슈도 바이러스를 50 TCID50의 농도로 준비하여,
상기 실시예 1의 5)에서 정제한 수용성 안지오텐신 전환효소 2 (sACE2) 또는 상기 실시예 1의 6) 및 7)에서 제조한 ACE2 또는 sACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA, ND-sACE2)와 각각 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 세포에서 배지를 걷어내고, 바이러스와 상기 항바이러스제 혼합액 100 μL를 세포가 들어있는 각 웰에 분주하고 72시간 동안 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이후 Luciferase assay kit를 이용하여 항바이러스제의 바이러스 저해능을 측정하였다 (도 4).
또한, 도 4에서는 Pre-cleavage 실험군 (Direct fusion 경로를 통한 감염에 있어서 바이러스의 감염력이 강해지도록 트립신(trypsin)을 처리한 실험군)에 대한, 항바이러스 활성도 측정하였다. Direct fusion (HEK293-ACE2/TMPRSS2)의 감염 경로인 경우, SARS-CoV-2의 돌기단백질인 Spike protein이 Pre-cleavage될 경우, cleavage 되지 않은 경우 (No cleavage 실험군)에 비해 세포감염능이 증가한다는 보고가 있다. 즉, 트립신 처리를 통해 바이러스를 Pre-cleavage 시키면, 바이러스 감염력이 세지게 되는 것이다. 본 실험에서는 이렇게 바이러스의 감염능을 증대시킨 실험군을 설정해서 이에 대한 항바이러스 활성을 측정한 것이다. 구체적으로, SARS-CoV-2 슈도 바이러스를 TPCK-Trypsin 5 μg/mL의 농도로 37℃에서 1시간 처리한 후, 5% FBS를 추가하여 반응을 멈추었다. 이후 상기 방법과 동일한 방법으로 항바이러스제의 바이러스 저해능을 측정하였다 (도 4).
실험 결과, 모든 실험군에서 ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)가 바이러스 저해능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 이는 ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)가 sACE2 보다 바이러스의 스파이크 단백질에 더욱 안정적이고, 강하게 결합하여, 더욱 우수한 항바이러스 효능을 나타냈음을 의미한다.
반면, sACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (ND-sACE2)의 경우 sACE2와 유사한 수준으로 항바이러스 효능을 보였다.
2) ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)의 변이 바이러스에 대한 항바이러스 효능 확인
상기 1)의 방법으로 실험하되, No cleavage 실험 방법으로, "HEK293-ACE2/TMPRSS2"에, SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2 Delta, Omicron BA.1, Omicron BA.2, Omicron BA.4, Omicron BA.5의 슈도 바이러스(PV)를 사용하여 실험을 진행하였다. 한편, 대조군으로는 코로나 바이러스에 효능을 보이는 항체인 P2B-2F6(Ju, B. et al. Human neutralizing antibodies elicited by SARS-CoV-2 infection. Nature 584, 115-119 (2020)), CR3002(Ter Meulen, J. et al. Human monoclonal antibody combination against SARS coronavirus: synergy and coverage of escape mutants. PLoS Med. 3, e237 (2006)), REGN10933(Hansen, J. et al. Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail. Science 369, 1010-1014 (2020))을 사용하여 실험하였다 (도 5).
실험 결과, 모든 실험군에서 항체(P2B-2F6, CR3022, ERGN10933) 보다, ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)를 사용하는 경우 바이러스 저해능이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 또한, ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)는 모든 코로나 변이 바이러스에도 우수한 효능을 보이는 것을 확인할 수 있는데, 항체(P2B-2F6, CR3022, ERGN10933)를 사용한 경우에는 일부분의 코로나 변이 바이러스에만 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 다른 종류의 약물과 비교하여 ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)를 포함하는 약물은 바이러스의 돌연변이에 상관없이 효과적으로 대응할 수 있음을 의미한다.
3) sACE2가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND)의 항바이러스 효능 확인
상기 1)의 방법으로 실험하되, sACE2, ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA), sACE2가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND)를 No cleavage 실험 방법으로, "HEK293-ACE2/TMPRSS2"에 SARS-CoV-2의 슈도 바이러스(PV)를 사용하여 실험을 진행하였다 (도 6)
실험결과, sACE2가 막구조화 단백질에 융합된 나노디스크 (sAND) 또한 ACE2가 지질이중층에 결합된 나노디스크 (NDA)에 준하는 항바이러스 효능을 보이며, 우수한 항바이러스 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer);
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP); 및
    상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되어 있는 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 것을 특징으로 하는 ACE2와 결합할 수 있는 스파이크 단백질을 갖는 코로나바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer);
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP); 및
    상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되어 있는 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 것을 특징으로 하는 ACE2와 결합할 수 있는 스파이크 단백질을 갖는 코로나바이러스 감염증 개선용 식품 조성물.
  3. 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP);을 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하되,
    상기 막구조화 단백질은,
    '안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2)가 융합되어 있는 막구조화 단백질'인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 인지질로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein, MSP);을 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하되,
    상기 막구조화 단백질은,
    '안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2)가 융합되어 있는 막구조화 단백질'인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 개선용 식품 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인지질은,
    포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜에탄올아민(phophatidylethalolamine), 포스파티딜글리세롤(phophatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phophatidylinositol) 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노디스크(nanodisc).
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인지질은,
    POPC(l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질은,
    헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질은,
    아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안지오텐신 전환효소 2는,
    트렌스 멤브레인 도메인 (transmembrane domain)이 제거된 수용성 안지오텐신 전환효소 2인 것을 특징으로 하는 나노디스크.
  10. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 '안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2)가 융합되어 있는 막구조화 단백질'은,
    막구조화 단백질을 암호화하는 유전자에 안지오텐신 전환효소 2를 암호화하는 유전자를 결합시킨 후, 이를 발현시켜 제조한 것을 특징으로 하는 조성물.
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