WO2024085693A1 - 인지질인 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 나노디스크 - Google Patents

인지질인 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 나노디스크 Download PDF

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WO2024085693A1
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nanodisc
pharmaceutical composition
viral infections
preventing
phosphatidylethanolamine
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PCT/KR2023/016286
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English (en)
French (fr)
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권대혁
김미수
황재현
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엠브릭스 주식회사
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    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
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    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the present invention relates to a nanodisk characterized by containing 'membrane scaffold protein or amphipathic polymer' and phosphatidylethanolamine, a phospholipid, and its antiviral use.
  • Influenza virus is an RNA virus belonging to the Orthomyxoviridae family and is divided into three serotypes: type A, type B, and type C. Among them, types B and C have been confirmed to infect only humans, while type A has been confirmed to infect humans, horses, pigs, other mammals, and various types of poultry and wild birds.
  • the serotypes of influenza A virus are classified according to the types of two proteins on the surface of the virus, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). There are currently 144 types (16 types of HA proteins). and 9 types of NA proteins) are known. HA plays a role in allowing the virus to attach to body cells, and NA allows the virus to penetrate into cells.
  • Treatments for viral infections that have been developed so far include amantadine or rimantadine-type M2 ion channel inhibitors and oseltamivir (brand name Tamiflu) or zanamivir (brand name Relenza). ) series of neuraminidase inhibitors are known, but these treatments have a problem in that their effectiveness is limited.
  • oseltamivir brand name Tamiflu
  • zanamivir brand name Relenza
  • neuraminidase inhibitors are known, but these treatments have a problem in that their effectiveness is limited.
  • resistant mutant viruses are quickly generated, the H5N1 type influenza virus detected in some regions shows resistance to amantadine or rimantadine series compounds, and influenza B virus is amantadine-based. It is known to be insensitive to derivatives.
  • the number of resistant viruses against oseltamivir or zanamivir derivative compounds is increasing, and such resistant viruses are frequently occurring in children.
  • Coronavirus is an RNA virus belonging to the Coronavirinae family of the Coronaviridae family, which causes respiratory and digestive system infections in humans and animals. It is mainly transmitted through mucous membrane infection and droplet transmission, and generally causes mild respiratory infections in humans, but can also cause fatal infections. It can also cause diarrhea in cattle and pigs, and respiratory disease in chickens. Coronavirus is a representative virus that causes fatal infectious diseases in modern civilization.
  • Severe Acute Respiratory Syndrome also known as SARS, broke out in the People's Republic of China, killing many people with a mortality rate of 9.6%.
  • Middle East Respiratory Syndrome also known as MERS, spread from the Middle East to the world, causing many deaths with a mortality rate of about 36%.
  • viruses have something in common: they have an outer envelope composed of a lipid double membrane.
  • Many animal viruses including those mentioned above (e.g., HIV, hepatitis virus, MERS, herpes virus, Ebola virus, etc.), have membrane proteins and a lipid bilayer envelope.
  • Membrane proteins or surface antigens exist on the outer shell of viruses and have the characteristic of binding to receptors on host cells, leading the virus to penetrate into cells.
  • the envelope not only plays a very important role in the virus' infection path, but also protects itself from the body's immune system. Therefore, as described above, viral infection can be suppressed by interfering with the binding between the viral membrane protein and the receptor or by damaging the envelope.
  • oseltamivir is known as a representative drug, but in the case of such antiviral drugs, the effect is temporary, recurs, or has weak efficacy. Since its mode of action is to inhibit the proliferation of the virus, if the concentration of the drug is lowered, the virus may proliferate again. In addition, if proliferation and cessation are repeated according to changes in drug concentration, the virus may naturally develop resistant viruses as a result of “adaptive evolution.” Resistant viruses to oseltamivir (Tamiflu) are also increasingly being reported. Even in the case of neutralizing antibodies, it is not easy to develop them as treatments because simply inhibiting the viral infection cycle is not enough.
  • virucides Drugs that reduce the infectivity of enveloped viruses are referred to as virucides, and in everyday life, soap and disinfectants are used as representative virucide agents.
  • soap and disinfectants are used as representative virucide agents.
  • virucidal agents are not safe, their use as a treatment is limited.
  • a virucidal agent that damages the viral envelope is advantageous, and in addition, a virucidal agent that is safe and can be applied to a wide range of enveloped viruses is needed.
  • a nanodisk structure that has the property of digging into and damaging the virus envelope, and attempted to develop a method to further improve the antiviral efficacy of the nanodisk structure.
  • the present invention is a flat disk-shaped bilayer structure formed using phosphatidylethanolamine, a phospholipid, and includes a lipid bilayer in which the hydrophilic group is oriented on the outside and the hydrophobic group is oriented on the inside; and a nanodisc containing a 'membrane scaffold protein or amphipathic polymer' that surrounds the 'side where the hydrophobic group is exposed to the outside' of the lipid bilayer with a hydrophobic bond.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating viral infections.
  • the phosphatidylethanolamine is preferably 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1-palmitoyl- 2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE) is preferred.
  • the membrane scaffold protein is preferably an amphipathic protein having a helix structure, an apolipoprotein, or a 'helix' of an apolipoprotein. It may be a fragment of an apolipoprotein that maintains its (helix) structure and amphipathic properties.
  • the amphipathic polymer is preferably styrene-maleic acid (SMA) or di-isobutylene-maleic acid (Di-IsoButylene).
  • SMA styrene-maleic acid
  • DIBMA di-isobutylene-maleic acid
  • PMA polymethyl methacrylate
  • the nanodisc preferably further includes a 'virus receptor' that is hydrophobically bound to the inside of the lipid bilayer.
  • the viral receptor may be angiotensin converting enzyme 2 or a 'compound with sialic acid bound to the end'.
  • the nanodisc of the present invention is characterized by containing phosphatidylethanolamine phospholipid as a lipid, and has superior antiviral efficacy than nanodisc containing other types of phospholipids.
  • Figure 1 schematically shows the structure of the nanodisk of the present invention.
  • Figure 2 shows differences in cytotoxicity depending on the type of phospholipid contained in the nanodisc.
  • Figure 3 shows the difference in antiviral efficacy depending on the type of phospholipid contained in the nanodisk. Meanwhile, looking at Figure 3, it can be seen that nanodiscs containing phosphatidylethanolamine among phospholipids have better antiviral efficacy.
  • Figure 4 shows the difference in antiviral efficacy depending on the type of phospholipid contained in the nanodisk. Meanwhile, looking at Figure 4, among phosphatidylethanolamines, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, It can be seen that the antiviral efficacy of nanodiscs containing POPE) is more excellent.
  • the present invention is a flat disk-shaped bilayer structure formed using phosphatidylethanolamine, a phospholipid, and includes a lipid bilayer in which the hydrophilic group is oriented on the outside and the hydrophobic group is oriented on the inside; And a nanodisk ( nanodisc).
  • the present inventor confirmed through Korean Patent Nos. 10-2181991 and 10-2438720 that nanodiscs function as cell membrane mimics and exhibit excellent antiviral efficacy. Later, while developing technology to further improve the antiviral efficacy, it was confirmed that the antiviral efficacy of nanodiscs varies depending on the type of phospholipid contained in the nanodisc, and the use of phosphatidylethanolamine among the phospholipids was confirmed. It was confirmed that the antiviral efficacy was particularly excellent in this case.
  • the nanodisc of the present invention is characterized by containing phosphatidylethanolamine, a phospholipid.
  • the phosphatidylethanolamine is, for example, DMPE (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE (1 ,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE( 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) or POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). According to the examples below, among them, POPE (1- Nanodisc using palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine).
  • the lipid bilayer of the present invention is a flat disk-shaped bilayer structure formed from phosphatidylethanolamine, a type of 'amphiphilic lipid molecule with a hydrophilic portion and a hydrophobic portion', and the hydrophilic group is oriented to the outside.
  • the characteristic feature is that the hydrophobic group is oriented inward. That is, the lipid bilayer of the present invention is hydrophilic in that it is in the form of a disk (see Figure 1) with not only the hydrophilic portion of the amphipathic lipid, but also the hydrophobic portion exposed to the outside through the side. Alternatively, it is structurally different from a sphere-shaped liposome in which only one of the hydrophobic regions is selectively exposed to the outside.
  • the nanodisk of the present invention includes 'membrane scaffold protein or amphipathic polymer', and in the present invention, 'membrane scaffold protein or amphipathic polymer' 'plays the role of surrounding the 'side where the hydrophobic group is exposed to the outside' of the lipid bilayer of the present invention, allowing the nanodisk of the present invention to be maintained in a stable form.
  • the membrane structured protein is preferably an amphipathic protein having a helix structure.
  • An example of an amphipathic membrane scaffold protein with a helix structure is apolipoprotein.
  • Apolipoprotein is a protein that exists specifically in plasma lipoproteins. It stabilizes the structure of lipoproteins, activates enzymes involved in lipoprotein metabolism, and acts as a ligand for lipoprotein receptors present on the cell surface. It is known to perform its function.
  • the apolipoprotein is an example, apolipoprotein A1 (ApoA-I), apolipoprotein A2 (ApoA-2), apolipoprotein B (ApoB), apolipoprotein C (ApoC) and apolipoprotein Protein E (ApoE), MSP1 (Membrane scaffold protein 1), MSP1D1, MSP1D2, MSP1E1, MSP1E2, MSP1E3, MSP1E3D1, MSP2, MSP2N1, MSP2N2, MSP2N3, etc.
  • ApoA-I is known to be a component of high-density lipoprotein (HDL), which plays a direct role in removing cholesterol from surrounding tissues and transporting it to the liver or other lipoproteins.
  • Apo-A1 consists of a single polypeptide consisting of 243 amino acids with a molecular weight of 28 kDa. It is a protein that has 8 repeating unit domains consisting of 11 amino acids or 22 amino acids, and the ratio of alpha-helices in the secondary structure that makes up HDL is 60 to 75%.
  • ApoE like ApoA1, is known to be involved in the transport of cholesterol, and is a protein composed of a single polypeptide of 33 kDa and 299 amino acids.
  • a fragment of an apolipoprotein that maintains the helix structure and amphipathic characteristics of the apolipoprotein may be used.
  • a part (fragment) of the apolipoprotein may be used instead of the entire apolipoprotein.
  • the amphiphilic polymer has amphiphilic properties and thus serves to prevent the hydrophobic tail (acyl tail) from being directly exposed to water.
  • this amphiphilic polymer is present in a certain ratio, the phospholipid forms a lipid bilayer.
  • the polymer surrounds the middle layer (two-layer hydrophobic acyl tail).
  • the disk-shaped lipid bilayer shape is stabilized in aqueous solution.
  • the size of the lipid bilayer disk is determined depending on the phospholipid:polymer ratio.
  • the amphiphilic polymer is preferably styrene-maleic acid (SMA), di-Isobutylene-maleic acid (DIBMA), styrene-maleimide, It is recommended to use at least one of SMI) and polymethyl methacrylate (PMA). In the following examples, styrene-maleic acid (SMA) was used.
  • the nanodisk of the present invention may have a diameter of 2 to 50 nm, but is not limited thereto.
  • the nanodisc of the present invention preferably further includes a 'virus receptor' that is hydrophobically bound to the inside of the lipid bilayer.
  • a virus receptor refers to a receptor on the cell membrane that a virus uses when it penetrates into a cell, and the nanodisk plays a role in further improving the adhesion ability to the virus.
  • the 'viral receptor' is preferably angiotensin converting enzyme 2 or a 'compound containing sialic acid at one end'.
  • coronaviruses including SARS-CoV and SARS-CoV-2
  • Angiotensin converting enzyme 2 ACE2
  • the adhesion ability to coronaviruses can be improved, thereby improving antiviral efficacy.
  • the 'compound containing sialic acid at one end' refers to a compound or sialic acid complex that contains sialic acid at one end and has the ability to attach to a virus.
  • sialyllactose and ganglioside include sialyllactose and ganglioside. It is known that sialyllactose and ganglioside contain sialic acid at one end and have the ability to adhere to influenza viruses.
  • the nanodisc of the present invention may contain an antibody against a viral surface antigen, another cell membrane binding protein to which the surface antigen can bind, a compound to which the surface antigen can bind, etc.
  • an antibody against a viral surface antigen instead of the virus receptor, materials that can further improve the virus attachment ability of the nanodisk can be loaded.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating viral infections, comprising the nanodisc of the present invention.
  • “viral infection” includes, for example, renal syndrome hemorrhagic fever (epidemic hemorrhagic fever) caused by infection with a virus of the Verniaviridae family; Respiratory diseases such as nasal colds or coronavirus infections caused by infection with viruses of the Coronaviridae family; Hepatitis C caused by infection with viruses of the Flaviviridae family; Hepatitis B caused by infection with viruses of the Hepadnaviridae family; Shingles caused by infection with viruses of the Herpesviridae family; Flu or influenza virus infection caused by infection with a virus of the Orthomyxoviridae family; Smallpox caused by infection with viruses of the poxviridae family; rabies or vesicular stomatitis caused by infection with viruses of the rhabdoviridae family; It can be an acquired immunodeficiency syndrome caused by infection with a virus of the retroviridae family, and as another example, it can be a
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the composition as an active ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, and calcium silicate. , microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, etc. no.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, for example, intrathecal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intrasternal administration, intratumoral administration, intranasal administration, It can be administered by intracerebral administration, intracranial administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration, but is not limited thereto.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and is usually A skilled doctor can easily determine and prescribe an effective dosage (pharmaceutically effective amount) for desired treatment or prevention.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg.
  • pharmaceutically effective amount of the present invention means an amount sufficient to prevent or treat the above-mentioned disease.
  • the term “prophylaxis” refers to the prevention or protective treatment of a disease or disease state.
  • treatment means reducing, suppressing, alleviating or eradicating a disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. It can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the dosage form can be manufactured in a variety of ways, such as oral medicine or injection, and can be in the form of a solution, suspension or emulsion in oil or aqueous medium, or in the form of extract, powder, suppository, powder, granule, tablet or capsule, and may be in the form of a dispersant or stabilizer. Additional topics may be included.
  • MSP1E3D1 molecular weight 32.6 kDa
  • MSP membrane scaffold protein
  • POPC 1-palmitoyl-2-
  • oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine was used.
  • the manufacturing method of the MSP nanodisk is specifically as follows.
  • POPC 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • chloroform a lipid solution with a concentration of 25 mg/ml.
  • 152.02 ⁇ l of the 25 mg/ml POPC lipid solution was transferred to a glass tube so that the lipid concentration was 10 mM when dissolved in PBS containing 0.5 ml of sodium cholate.
  • nitrogen gas was added and left in a vacuum for 4 hours to remove the solvent and obtain a lipid film.
  • the lipid film was hydrated and treated with ultrasound at 55°C for 15 minutes to produce a suspension containing the lipid film in which the lipid film was pulverized. Obtained.
  • 160 ⁇ l of MSP1E3D1 (molecular weight 32.6 kDa) at a concentration of 250 ⁇ M was added as a membrane structured protein, and the same amount of bio-beads (660 ⁇ l) as the entire mixture was treated (4°C, 12 hours). By doing so, it was possible to manufacture MPS nanodiscs through a self-assembly process.
  • Styrene:Maleic acid of SMA (Styrene-Maleic Acid) was polymerized at a molar ratio of 2:1 or 3:1, and the polymer and lipid were used at a molar ratio of 1:2. It was used at a weight ratio of .
  • SMA Styrene-Maleic Acid
  • the constituent lipids are POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, hereinafter abbreviated), DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, hereinafter abbreviated).
  • POPG 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3 [Phospho-rac-(1-glycerol)], hereinafter abbreviated
  • POPE 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3 It was prepared using -phosphoethanolamine (abbreviated below) (Table 1).
  • Styrene Maleic acid ratio (mol/mol) lipid SMA (2:1)-ND (POPC) 2:1 POPC SMA (2:1)-ND (POPE) 2:1 POPE SMA (3:1)-ND (POPC) 3:1 POPC SMA (3:1)-ND (POPE) 3:1 POPE SMA (3:1)-ND (DPPE) 3:1 DPPE SMA (3:1)-ND (POPG) 3:1 POPG
  • the manufacturing method of the polymer nanodisk is specifically as follows.
  • lipids in the form of solid powder were dissolved in an organic solvent, the lipids were mixed in a glass tube, and the organic solvent was completely vaporized using nitrogen gas and a vacuum tube, leaving only the lipids in the form of a film.
  • hydration buffer (10mM HEPES, 150mM NaCl; pH 7.4)
  • freeze and thaw processes were performed more than 5 times using liquid nitrogen and water at 50°C to generate liposomes. did.
  • the polymer was added in an amount of 0.5-2% (w/v), and freezing and sonication processes were performed more than 5 times using liquid nitrogen and a sonicator at 50°C.
  • the lipid concentration of the polymer nanodisc concentrate was measured using a lipid quantification assay kit, and the lipid concentration thus obtained was used in the following experiments.
  • Example 2 Comparative experiment on the cytotoxicity of nanodiscs according to changes in phospholipid type
  • Cytotoxicity could be confirmed using the CCK-8 kit, which can quantify cell viability (Cell viability assay). Specifically, samples of various concentrations were prepared by diluting samples with a maximum concentration of 20 ⁇ M for polymers and 200 ⁇ M for phospholipids. The day before, MDCK cells were seeded at 2x10 cells/100 ⁇ l in a 96-well plate at 90% confluency and treated with polymer nanodisks composed of pure polymer or various phospholipids at 100 ⁇ l/well. After 24 hours, the CCK-8 solution was treated at 10 ⁇ l/well and reacted for 1 hour at 37°C for 4 hours. Afterwards, cell viability was quantified by measuring absorbance at a wavelength of 540 nm, and cytotoxicity was confirmed through this ( Figure 2).
  • the antiviral efficacy of nanodiscs is expressed through the attachment of lipids or substances attached to the lipids to viruses.
  • the membrane structural protein plays a role in holding the lipid composition in the nanodiscs in a disk shape (see Figure 1), and the membrane and the above. This is because even if the structural protein is replaced with a polymer component, the lipid or the substance attached to the lipid is not disturbed unless there are special circumstances.
  • Nanodisc The antiviral efficacy of Nanodisc was derived by performing a microneutralization assay at a temperature of 37°C. Specifically, the polymer nanodisc concentrate was diluted from the highest concentration of 30 ⁇ M based on phospholipids and treated with influenza virus (A/Puerto Rico/8/34) at various concentrations for 1 hour. MDCK (Madin-Darby canine kidney cells) cells at 90% confluency were seeded at 2x104 cells/100 ⁇ l in a 96-well plate and treated with 'treatment material + virus mixture' reacted for 1 hour.
  • MDCK Medin-Darby canine kidney cells
  • 4-MUNANA (4-Methylumbelliferyl-N-acetyl- ⁇ -D-Neuraminic Acid) was treated at a concentration of 0.5 ⁇ M and reacted at 37°C for 1 hour. Afterwards, the fluorescence value at 355/460 nm was measured to quantitatively analyze the NA (neuramidase) activity of the virus to derive antiviral efficacy.
  • the EC50 (maximum concentration of the drug that represents about half of the maximum effect that the drug can exhibit) was approximately 4 at 15 ⁇ M compared to the experimental group using POPC. It decreased to ⁇ M, and in the case of the SMA 3:1-based nanodisk, it was confirmed that the EC50 decreased 20-fold from approximately 10 ⁇ M to 0.5 ⁇ M. In other words, it was confirmed that the antiviral efficacy of the experimental group of nanodiscs containing PE (phosphatidylethanolamine) was superior to that of POPC nanodiscs, which are neutral phospholipids, regardless of the change in the composition of the polymer component.
  • PE phosphatidylethanolamine
  • the EC50 for the POPC experimental group was approximately 5 ⁇ M, while for the POPE experimental group it was 0.02 ⁇ M (a 250-fold decrease compared to POPC), and for DPPE it was approximately 0.1 ⁇ M (a 50-fold decrease compared to POPC). .
  • the POPE and DPPE experimental groups containing PE showed superior antiviral efficacy compared to the POPC experimental group, which is a neutral phospholipid.
  • PE phosphatidylethanolamine

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Abstract

본 발명은 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)' 및 인지질인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크 및 이의 항바이러스 용도에 관한 것이다. 본 발명의 나노디스크는 인지질 중에서도 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 인지질을 포함하여 항바이러스 효능이 우수하다.

Description

인지질인 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 나노디스크
본 발명은 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)' 및 인지질인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크 및 이의 항바이러스 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다제(Neuraminidase, NA)의 종류에 따라 구분되는데, 지금까지 144종류(HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)가 알려져있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다.
지금까지 개발된 바이러스 감염증 치료제로는 아만타딘(amantadine) 또는 리만타딘(rimantadine)계열의 M2 이온채널 억제제(M2 ion channel inhibitor)와 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명 타미플루) 또는 자나미비르(zanamivir, 상품명 리렌자) 계열의 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 억제제가 알려져 있으나, 이들 치료제는 그의 효과가 제한된다는 문제점이 있었다. 즉, 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 유도체 화합물은 이에 대한 저항성 변종바이러스가 빠르게 생성되고, 일부 지역에서 검출된 H5N1 타입의 인플루엔자 바이러스는 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 화합물에 대하여 내성을 나타내며, 인플루엔자 B 바이러스는 아만타딘 유도체에 민감하지 않다고 알려져 있다. 또한, 오셀타미비르 또는 자나미비르 계열의 유도체 화합물 역시 이에 대한 저항성 바이러스가 증가하고, 이러한 저항성 바이러스는 어린이에게서 빈번히 발생하고 있다고 알려져 있다.
한편, 2020년부터 현재 진행형인 코로나 바이러스에 의한 COVID-19 등 바이러스에 의한 질병의 유행이 근래 다수 발생하고 있다.
코로나바이러스는　코로나바이러스과(Coronaviridae)의　코로나바이러스아과(Coronavirinae)에 속하는　RNA 바이러스로,　사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다. 주로 점막전염, 비말전파로 쉽게 감염되며, 사람에게는 일반적으로 경미한　호흡기 감염을 일으키지만 치명적인 감염을 유발하기도 하며, 소와 돼지는 설사, 닭은 호흡기 질환이 발생하기도 한다. 코로나바이러스는 현대 문명에서 치명적인 감염병을 일으키는 대표적인 바이러스다.　2003년　4월에는　중화인민공화국발　중증급성호흡기증후군,　일명 사스가 유행해 사망률 9.6%를 기록하며 많은 사람이 사망했다.　2015년에는　중동호흡기증후군, 일명 메르스가　중동에서 전 세계로 퍼지면서 사망률 약 36%로써 사망자가 다수 발생하였다. 또한　2019년　12월부터 중국 우한발　신종 코로나바이러스 감염증(코로나19,COVID-19)이 전 세계로 확진되면서 감염자가 늘어나고 있으며, 치사율은 2020년 2월까지 집계된 자료에 따르면 2.6%로 그나마 낮은 편이지만 전세계에서 확진자가 폭증하는 중이며 예방 또는 치료 목적으로 승인된 백신이나 항바이러스제는 없었다.　현재, 카모스타트, 렘데시비르, 하이도록시클로로퀸 등의 타 질환치료제로 이용되던 약물들이 코로나바이러스 치료제로의 가능성에 대해서 검토되고, 부작용과 미미한 효능으로 인하여 임상이 실패하거나 정지되어 있다.
상기한 바이러스들은 모두 지질이중막으로 구성된 외피를 가지고 있다는 공통점이 있다. 상기를 포함한 많은 동물 바이러스들(예, HIV, 간염 바이러스, MERS, 헤르페스 바이러스, 에볼라 바이러스 등)이 막단백질과 지질이중막 외피를 가지고 있다. 막단백질 혹은 표면 항원은 바이러스의 외피에 존재하며, 숙주세포의 수용체에 결합하는 특징을 갖고 있어 바이러스가 세포 내로 침투하는 것을 유도한다. 또한 외피는 바이러스의 감염 경로에서 매우 중요한 역할을 수행할 뿐만 아니라 스스로를 인체의 면역 체계로부터 보호하는 역할을 수행한다. 따라서 위와 같이 바이러스의 막단백질과 수용체 간의 결합을 방해하거나 외피를 손상시킴으로써 바이러스의 감염을 억제할 수 있다. 바이러스의 막단백질을 방해하여 바이러스 증식을 억제(virustatic)하는 약물 중 대표적으로 오셀타미비르(oseltamivir)가 알려져 있으나 이와 같은 항바이러스제의 경우 효과가 일시적이거나, 재발한다거나, 약효가 약하다거나 하는 것은 그 약의 작용양식이 바이러스의 증식을 억제하는 방식이기 때문에 그 약물의 농도가 낮아지면 다시 바이러스가 증식할 수 있다. 또한, 약물의 농도의 변화에 따라서 증식과 중지가 반복되면 당연히 바이러스는 "adaptive evolution"에 의한 결과로서 내성바이러스가 발생할 수 있다. 오셀타미비르(타미플루) 또한 내성바이러스들이 점점 많이 보고되고 있다. 중화 항체의 경우에도 단순히 바이러스 감염 사이클을 저해하는 것만으로는 충분하지 않기 때문에 치료제로 개발하기가 여의치 않은 상황이다. 외피 바이러스의 감염력을 감소시키는 약물은 살바이러스제(virucide)로 표현을 하며, 일상 생활에서는 비누와 소독제 같은 것들이 대표적인 살바이러스제로 사용되고 있다. 하지만, 상기와 같은 살바이러스제는 안전하지 않기 때문에 치료제로 사용하기에 제한적이다.
따라서 강한 약효를 기대하기 위해서는 바이러스 외피를 손상시키는 살바이러스제의 작용 방식이 유리하며, 이에 더하여 안전하고 광범위한 외피바이러스에 대한 적용이 가능한 살바이러스제가 필요하다. 이를 위하여 바이러스 외피를 파고들어 손상시키는 특성을 가진 나노디스크 구조체를 만들었는데, 상기 나노디스크 구조체의 항바이러스 효능을 더욱 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 했다.
본 발명에서는 나노디스크의 항바이러스 효능을 더욱 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 했다.
본 발명은 인지질인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 사용하여 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)은 바람직하게 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE)인 것이 좋다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein)은 바람직하게 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질이거나 아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스(helix) 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편일 수 있다.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)는 바람직하게 스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA), 디-이소부틸렌-말레산(Di-IsoButylene-Maleic Acid, DIBMA), 스티렌-말레이미드(Styrene-Maleimide, SMI), 폴리메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate, PMA) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
본 발명의 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 나노디스크(nanodisc)는 바람직하게 상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 더욱 포함하는 것이 좋다. 이때, 상기 바이러스 리셉터는 안지오텐진 전환효소 2 또는 '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'일 수 있다.
본 발명의 나노디스크는 지질로써, 포스파티딜에탄올아민 인지질을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 다른 종류의 인지질을 포함하는 나노디스크 보다 항바이러스 효능이 우수하다.
도 1은 본 발명 나노디스크의 구조를 개략적으로 보여준다.
도 2는 나노디스크에 포함된 인지질 종류에 따른 세포독성 차이를 보여준다.
도 3은 나노디스크에 포함된 인지질 종류에 따른 항바이러스 효능 차이를 보여준다. 한편, 도 3을 보면, 인지질 중 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 나노디스크가 항바이러스 효능이 더욱 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 4는 나노디스크에 포함된 인지질 종류에 따른 항바이러스 효능 차이를 보여준다. 한편, 도 4를 보면, 포스파티딜에탄올아민 중에서도, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE)을 포함하는 나노디스크의 항바이러스 효능이 더욱 우수한 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 인지질인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 사용하여 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및 상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)'를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노디스크(nanodisc)를 제공한다.
본 발명자는 대한민국 등록특허 제10-2181991호, 제10-2438720호 등을 통해 나노디스크가 세포막모사체 역할을 수행하며, 우수한 항바이러스 효능을 나타냄을 확인하였다. 이후, 상기 항바이러스 효능을 더욱 향상시킬 수 있는 기술을 개발하던 중, 나노디스크에 포함되는 인지질의 종류에 따라 나노디스크의 항바이러스 효능이 달라지는 것을 확인하였고, 인지질 중 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 사용한 경우가 항바이러스 효능이 특히 우수한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 나노디스크는 인지질인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)은 일예로, DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 POPE(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)을 들 수 있는데, 하기 실시예에 따르면, 그 중에서도 POPE(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)를 사용한 나노디스크의 항바이러스 효능이 가장 우수하였다.
한편, 본 발명의 지질 이중층 (lipid bilayer)은 '친수성 부위와 소수성 부위를 갖는 양친매성 지질 분자'의 일종인, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)으로부터 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 것에 특징이 있다. 즉, 본 발명의 지질 이중층 (lipid bilayer)은 양친매성 지질 (amphipahtic lipid)의 친수성 부위뿐만 아니라, 소수성 부위도 측면을 통해 외부에 노출된 부분을 갖는 원반 형태 (도 1 참조)라는 점에서, 친수성 또는 소수성 부위 중 선택적으로 하나만이 외부에 노출되는 구(sphere) 형태의 리포좀(liposome)과 구조상 차이가 있다.
한편, 본 발명의 나노디스크는 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)'을 포함하는데, 본 발명에서 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)'는 본 발명 지질 이중층의 '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 둘러싸는 역할을 수행하여, 본 발명 나노디스크가 안정한 형태로 유지될 수 있게 한다.
한편, 본 발명에서 상기 막구조화 단백질은 바람직하게 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것이 좋다. 헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 막구조화 단백질(membrane scaffold protein)의 예로는 아포리포단백질(apolipoprotein)이 있다. 아포리포단백질(apolipoprotein)은 혈장지방단백질에 특이적으로 존재하는 단백질로, 지방단백질의 구조를 안정시키고, 지방단백질대사에 관여하는 효소를 활성화하며, 세포표면에 존재하는 지방단백질 수용체에 대한 배위자로서 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 상기 아포리포단백질(apolipoprotein)은 일 예로서, 아포리포단백질 A1(ApoA-I), 아포리포단백질 A2(ApoA-2), 아포리포단백질 B(ApoB), 아포리포단백질 C(ApoC) 및 아포리포단백질 E(ApoE), MSP1(Membrane scaffold protein1), MSP1D1, MSP1D2, MSP1E1, MSP1E2, MSP1E3, MSP1E3D1, MSP2, MSP2N1, MSP2N2, MSP2N3, 등이 있다.
상기에서 일 예로 언급한 ApoA-I은 주로 주변조직으로부터 콜레스테롤을 제거하여 간 또는 다른 리포단백질로 운반하는 직접적인 역할을 수행하는 고밀도 리포단백질(HDL)의 구성요소인 것으로 알려져 있다. Apo-A1은 분자량 28kDa의 243개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성된다. 11개의 아미노산 혹은 22개의 아미노산으로 이루어진 8개의 반복 단위 도메인을 가지며, HDL을 이루는 2차 구조의 알파-헬릭스의 비율이 60 내지 75%인 단백질이다. 또한, ApoE는 ApoA1과 마찬가지로 콜레스테롤의 운반에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 33kDa의 299개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩타이드로 구성된 단백질이다.
또한, 본 발명에서는 아포리포단백질의 헬릭스 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편을 사용할 수도 있다. 즉, 상기 아포리포단백질(apolipoprotein)의 '헬릭스 구조 및 양친매성 특성'을 소실하지 않는 범위 내에서, 아포리포단백질 전체가 아닌 그 일부(절편)를 사용할 수도 있는 것이다.
한편, 본 발명에서 양친매성 폴리머는 양친매성을 가지고 있어서 소수성 꼬리 (acyl tail)가 물에 직접 노출되는 것을 방지하는 역할을 하는데, 이 양친매성 폴리머가 일정 비율로 존재하게 되면 지질이중막을 형성한 인지질의 중간층(2겹의 소수성 아실 꼬리(acyl tail))을 폴리머가 감싸게 된다. 결과적으로 디스크 형태의 지질이중막 모양이 수용액상에서 안정화된다. 이때, 인지질:폴리머 비율에 따라서 지질이중막 디스크의 크기가 결정된다.
본 발명에서 양친매성 폴리머는 바람직하게 스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA), 디-이소부틸렌-말레산(Di-IsoButylene-Maleic Acid, DIBMA), 스티렌-말레이미드(Styrene-Maleimide, SMI), 폴리메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate, PMA) 중 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 좋다. 하기 실시예에서는 스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA)를 사용하였다.
한편, 본 발명의 나노디스크는 직경이 2 내지 50 nm에 해당하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 나노디스크는 바람직하게 상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 더욱 포함하는 것이 좋다. 본 발명에서 바이러스 리셉터란, 바이러스가 세포 내부로 침투할 시 이용하는 세포막의 수용체를 의미하는데, 나노디스크가 바이러스와의 부착능을 더욱 향상시켜주는 역할을 한다.
한편, 하기 실시예에서는 '바이러스 리셉터'가 없는 나노디스크만을 사용해 항바이러스 실험을 진행해 하였다. 다만, 본 발명의 나노디스크에 '바이러스 리셉터'를 포함함으로써, 바이러스와의 부착능을 더욱 향상시킬 수 있는데, 이에 나노디스크의 항바이러스 효능이 향상되는 것은 자명하다 할 것이다.
한편, 본 발명에서 '바이러스 리셉터'는 바람직하게 안지오텐진 전환효소 2 또는 '일측단에 시알산(sialic acid)을 포함하는 화합물'인 것이 좋다.
상기 안지오텐진 전환효소 2는 SARS-CoV와 SARS-CoV-2를 포함한 여러 코로나바이러스는 인체 세포로 침투하기 위해서 안지오텐신 전환효소 2 (Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)를 수용체로 이용하는 것으로 알려졌다. 즉, 안지오텐진 전환효소 2를 포함시킴으로써 SARS-CoV와 SARS-CoV-2 등을 포함한 코로나바이러스와의 부착능을 향상시켜, 항바이러스 효능을 향상시킬 수 있는 것이다.
상기 '일측단에 시알산(sialic acid)을 포함하는 화합물'은 일측단에 시알산(sialic acid)을 포함하여 바이러스와의 부착능이 있는 화합물 또는 시알산(sialic acid) 복합체를 말하는데, 일예로, 시알릴락토오스(sialyllactose), 강글리오시드(ganglioside) 등이 있다. 시알릴락토오스(sialyllactose) 및 강글리오시드(ganglioside)는 일측단에 시알산(sialic acid)을 포함하여 인플루엔자 바이러스와의 부착능이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 본 발명의 나노디스크는 바이러스 표면 항원에 대한 항체, 상기 표면 항원이 결합할 수 있는 다른 세포막 결합 단백질, 상기 표면 항원이 결합할 수 있는 화합물 등을 포함할 수도 있다. 즉, 상기 바이러스 리셉터를 대신하여, 나노디스크의 바이러스 부착능을 더욱 향상시켜줄 수 있는 물질들이 탑재될 수 있는 것이다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명의 나노디스크(nanodisc)를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "바이러스 감염증"이란, 일 예로서, 버니아비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 신증후근성출혈열(유행성출혈열); 코로나비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 코감기 등 호흡기 질환 또는 코로나바이러스 감염증; 플라비비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 C형 간염; 헤파드나비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 B형 간염; 헤르페스비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 대상포진; 오르소믹소비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 독감 또는 인플루엔자 바이러스 감염증; 폭스비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 천연두; 랍도비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 광견병 또는 수포성 구내염; 레트로비리데과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 후천성 면역결핍증 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 오르소믹소비리데과에 속하는 인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 독감 또는 인플루엔자 바이러스 감염증이 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분인 상기 조성물 외에 약학으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약학 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 용어 "약학 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 발명의 용어 "치료"는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 내복약, 주사제 등 다양하게 제조될 수 있고, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 나노디스크의 제조]
1-1) MSP 나노디스크 제조
MSP 나노디스크를 제작하기 위해 막구조화 단백질(MSP, membrane scaffold protein)의 일종으로 N말단에 his-tag가 삽입된 MSP1E3D1(분자량 32.6 kDa)를 사용하고, 지질로는 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 사용하였다.
MSP 나노 디스크의 제조방법은 구체적으로 다음과 같다.
POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)를 클로로포름에 용해시켜 25 mg/ml 농도의 지질 용액을 준비하였다. 이후 0.5 ml의 소듐 콜레이트가 첨가된 PBS로 녹였을 때 지질의 농도가 10 mM이 되도록 25 mg/ml POPC 지질 용액의 152.02 μl를 유리 튜브에 옮겼다. 이후 질소가스를 가하고, 진공 상태에서 4시간동안 방치하여 용매를 제거하고, 리피드 필름 (lipid film)을 수득하였다. 상기 수득한 리피드 필름에 소듐 콜레이트(sodium cholate)가 첨가된 PBS의 0.5 ml을 이용하여, 상기 리피드 필름을 수화시키고, 초음파를 55℃에서 15 분간 처리하여, 리피드 필름이 분쇄된 리피드 필름 함유 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 현탁액에 막구조화 단백질로 MSP1E3D1(분자량 32.6 kDa)을 250μM 농도로 160 μl를 가하고, 전체 혼합액과 동일한 양(660 μl)의 바이오비드(bio-beads)를 처리(4℃, 12시간)함으로써, 자가조립과정을 통해 MPS 나노디스크를 제조할 수 있었다.
1-2) 폴리머 나노디스크의 제조
폴리머 나노디스크를 제작하기 위해 폴리머로써 SMA(Styrene-Maleic Acid) 중 Styrene : Maleic acid가 2:1 또는 3:1의 몰비율로 중합된 두 종류의 폴리머를 사용하였고, 폴리머와 지질은 1:2의 중량비율로 사용하였다.
한편, 구성 지질은 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 이하 약어로 기재), DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 이하 약어로 기재), POPG(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)], 이하 약어로 기재), 또는 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 이하 약어로 기재)을 사용하여 제조하였다 (표 1).
명칭 Styrene : Maleic acid ratio(mol/mol) lipid
SMA (2:1)-ND (POPC) 2:1 POPC
SMA (2:1)-ND (POPE) 2:1 POPE
SMA (3:1)-ND (POPC) 3:1 POPC
SMA (3:1)-ND (POPE) 3:1 POPE
SMA (3:1)-ND (DPPE) 3:1 DPPE
SMA (3:1)-ND (POPG) 3:1 POPG
폴리머 나노 디스크의 제조방법은 구체적으로 다음과 같다.
먼저 고체 가루 형태의 지질을 유기용매에 녹인 후, 지질을 유리관에서 혼합한 뒤 질소 가스와 진공관을 이용해 유기용매를 완전히 기화시켜 필름 형태의 지질만 남겼다. 수화 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl; pH 7.4)를 이용해 필름 형태의 지질을 5분 이상 충분히 녹인 후, 액체 질소와 50℃의 물을 이용해 동결과 융해과정을 5회 이상 수행하여 리포좀을 생성하였다. 이후 폴리머를 0.5-2%(w/v)의 양으로 첨가한 뒤 액체 질소와 50℃의 소니케이터를 이용해 동결 및 음파처리 과정을 5회 이상 수행하였다. 이를 통해 폴리머가 리포좀을 파고들면서 물 분자가 끼어들어 지질층 사이에 구멍(pore)을 형성하게 되고 최종적으로 나노디스크 구조가 형성되었다. 나노디스크를 형성하지 못한 폴리머와 직경이 큰 리포좀을 제거하기 위해 초고속 원심분리 여과(Ultracentrifugal filtration)를 수행하여 폴리머 나노디스크 농축액을 얻을 수 있었다.
한편, 폴리머 나노디스크 농축액의 지질 농도를 lipid quantification assay kit를 이용하여 측정하였고, 이렇게 얻은 지질 농도를 이하 실험에 활용하였다.
[실시예 2: 인지질 종류 변화에 따른 나노디스크의 세포독성 비교 실험]
본 실시예에서는 나노디스크에 포함된 인지질 종류 변화에 따라 세포독성이 나타나는지 확인하고자 했다.
세포독성은 세포 생존도 (Cell viability assay)를 정량화 할 수 있는 CCK-8 kit를 이용해 확인할 수 있었다. 구체적으로, 폴리머 기준 최고 농도 20 μM, 인지질 기준 200 μM 농도의 샘플을 희석하며 다양한 농도의 샘플을 준비하였다. 전날 96-웰 플레이트에 2x104 cells/100 μl로 시딩하여 90% 밀집도(confluency) 상태인 MDCK 세포에 순수 폴리머 또는 각종 인지질로 구성된 폴리머 나노디스크를 100 μl/well로 처리하였다. 24 시간 후 CCK-8 용액을 10 μl/well 로 처리하여 4시간 동안 37 ℃ 온도 조건에서 1시간동안 반응시켰다. 이후, 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존도를 정량화하고, 이를 통해 세포독성을 확인할 수 있었다 (도 2).
이를 통해, 폴리머 기준 20 μM, 인지질 기준 200 μM 농도에서 순수 폴리머와 인지질 POPG 구성의 나노디스크 실험군에서 세포 생존도가 대략 50%로 하락하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 인지질 POPC와 POPE 실험군의 경우 해당 최고 농도에서도 세포 생존도에 감소를 보이지 않고 100% 이상을 유지하며 무독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3: 인지질 종류 변화에 따른 나노디스크의 항바이러스 효능 비교 실험]
본 실시예에서는 어떤 종류의 지질을 포함하는 나노디스크가 더욱 우수한 항바이러스 효능을 가지지 확인하고자 했다.
이를 위해 상기 실시예 1에서 제조한 나노디스크를 사용하여 항바이러스 효능 검증 실험을 진행하였다.
한편, 실험은 폴리머 나노디스크를 사용하여 실험을 진행하였는데, 폴리머 나노디스크는 일반적으로 알려진 막구조화 단백질(MSP, membrane scaffold protein)을 사용한 나노디스크의 막구조화 단백질을 양친매성 폴리머 성분으로 대체함으로써 나노디스크의 구조 안정성 향상, 항바이러스 활성 향상, 제조공정 개선 등을 위해 개발한 것으로, 양친매성 폴리머 성분을 사용한 나노디스크에서 나타나는 항바이러스 특징은 막구조화 단백질(MSP)을 사용한 나노디스크에서도 동일하게 적용할 수 있다.
나노디스크의 항바이러스 효능은 지질 또는 상기 지질에 부착된 물질이 바이러스와 부착하는 것을 통해 나타내는데, 막구조화 단백질은 나노디스크에서 지질 조성을 원반형태로 붙잡아주는 역할을 하고 (도 1 참조), 상기와 막구조화 단백질을 폴리머 성분으로 대체하여도, 별다른 사정이 없는 이상 지질 또는 상기 지질에 부착된 물질을 방해하지 않기 때문이다.
3-1) 나노디스크의 항바이러스 효능 도출 실험 방법
나노디스크의 항바이러스 효능은 37℃ 온도 조건에서 Microneutralization assay를 수행하여 도출하였다. 구체적으로, 폴리머 나노디스크 농축액을 인지질 기준 최고 농도 30 μM부터 희석하여 다양한 농도로 인플루엔자 바이러스(A/Puerto Rico/8/34)와 1시간 동안 처리하였다. 96웰 플레이트에 2x104 cells/100 μl로 시딩하여 90% 밀집도(confluency) 상태인 MDCK(Madin-Darby canine kidney cells) 세포에, 1시간 동안 반응시킨 '처리 물질 + 바이러스 혼합액'을 처리하였다. 24시간 후, 0.5 μM의 농도로 4-MUNANA(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-Neuraminic Acid)를 처리하고 37℃ 온도 조건에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 355/460 nm의 형광 값을 측정하여 바이러스의 NA(neuraminidase) 활성을 정량 분석해 항바이러스 효능을 도출하였다.
3-2) 인지질 종류 변화에 따른 나노디스크의 항바이러스 효능 비교
상기 실시예 1에서 제조한 SMA (2:1)-ND (POPC), SMA (2:1)-ND (POPE), SMA (3:1)-ND (POPC), SMA (3:1)-ND (POPE)의 항바이러스 효능을 비교하였다 (도 3).
이를 통해, SMA 2:1 기반 나노디스크의 경우 POPE를 사용한 경우, POPC를 사용한 실험군과 비교하여 EC50(해당 약물이 나타낼 수 있는 최대 효과의 절반 정도를 나타내는 약물의 최대 농도)이 대략 15 μM에서 4 μM로 감소하였고, SMA 3:1 기반 나노디스크의 경우, EC50이 대략 10 μM에서 0.5 μM로 20배 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 폴리머 성분의 조성변화에 상관없이 중성 인지질인 POPC 나노디스크에 비해 PE(phosphatidylethanolamine)가 포함된 나노디스크 실험군의 항바이러스 효능이 더욱 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 SMA (3:1)-ND (POPE), SMA (3:1)-ND (DPPE), SMA (3:1)-ND (POPC)의 항바이러스 효능을 비교하였다 (도 4).
이를 통해, POPC 실험군의 경우 EC50이 대략 5 μM인데 반해, POPE 실험군의 경우 0.02 μM (POPC에 비해 250배 감소), DPPE의 경우 대략 0.1 μM (POPC에 비해50배 감소)가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 중성 인지질인 POPC 실험군에 비해 PE(phosphatidylethanolamine)가 포함된 POPE와 DPPE 실험군에서 우수한 항바이러스 효능이 나타냄을 확인할 수 있었고, 특히, PE(phosphatidylethanolamine) 인지질 중에서도 특히, POPE를 사용한 나노디스크가 더욱 우수한 항바이러스 효능이 나타냄을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 인지질인 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 사용하여 형성된 납작한 원반 형태의 이중층 구조로서, 친수성기는 외부로 배향되고, 소수성기는 내부로 배향되어 있는 지질 이중층 (lipid bilayer); 및
    상기 지질 이중층의, '소수성기가 외부로 노출되어 있는 측면'을 소수성 결합으로 둘러싸는 '막구조화 단백질 (membrane scaffold protein) 또는 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)'를 포함하는 나노디스크(nanodisc)를 함유하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)은,
    1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE)인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein)은,
    헬릭스(helix) 구조를 갖는 양친매성 단백질인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 막구조화 단백질 (membrane scaffold protein)은,
    아포리포단백질(apolipoprotein) 또는 아포리포단백질의 '헬릭스(helix) 구조 및 양친매성 특성'이 유지된 아포리포단백질의 절편인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 양친매성 폴리머 (amphipathic polymer)는,
    스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA), 디-이소부틸렌-말레산(Di-IsoButylene-Maleic Acid, DIBMA), 스티렌-말레이미드(Styrene-Maleimide, SMI), 폴리메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate, PMA) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노디스크(nanodisc)는,
    상기 지질 이중층 내부와 소수성 결합되는 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 '바이러스 리셉터 (virus receptor)'는,
    안지오텐진 전환효소 2 또는 '시알산(sialic acid)이 말단에 결합된 화합물'인 것을 특징으로 하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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