KR20220147602A - 생체고분자를 시퀀싱하는 방법 - Google Patents

생체고분자를 시퀀싱하는 방법 Download PDF

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아리조나 보드 오브 리젠츠 온 비하프 오브 아리조나 스테이트 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 생체고분자의 시퀀싱과 관련된 디바이스, 시스템 및 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 관심 효소의 활성에 상응하는 전류 변동을 기초로 하여 생체전자 시그니처를 획득하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 생체전자 시그니처의 특정 양태는 생체고분자의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다.

Description

생체고분자를 시퀀싱하는 방법
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 허가 번호 R21 HG010522에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
관련 출원
본 출원은 2020년 2월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/983,417호에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
본 출원과 동시에 제출되고 하기와 같이 확인된 컴퓨터-판독 가능 뉴클레오타이드/아미노산 서열 목록은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다: 2021년 2월 24일에 생성되고 "2021-02-24_38882-601_SQL_ST25.txt"로 명명된 하나의 825 바이트 ASCII(텍스트) 파일.
기술분야
본 개시내용은 생체고분자의 시퀀싱과 관련된 디바이스, 시스템, 및 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 관심 효소의 활성에 상응하는 전류 변동을 기초로 하여 생체전자 시그니처(bioelectronic signature)를 획득하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 생체전자 시그니처의 특정 양태는 생체고분자의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다.
단백질이 다양한 기능을 수행함에 따라, 이러한 기능의 기초가 되는 움직임이 생성된다. 활성 단백질에 의해 생성된 변동에 해당하는 전기적 특징을 측정하는 디바이스, 시스템 및 방법을 개발하는 능력은 단백질 기능의 무표지 검출 및 분석의 기초가 될 수 있다. 예를 들어, 활성 효소의 기능적 변동을 모니터링하는 것은 효소의 기능에 영향을 미치는 후보 약물 분자를 스크리닝하는 빠르고 간단한 방법을 제공할 수 있다. 다른 경우에, 생체고분자(예를 들어, 탄수화물, 폴리펩타이드, 핵산 등)를 처리하는 단백질의 변동을 모니터링하는 능력은 구조적 변화와 이러한 변화가 기능과 어떻게 연결되는지에 대한 새로운 정보를 드러낼 수 있다. 추가적으로, 진단 및 분석 디바이스를 개발하여 활성 단백질이 생성하는 전기적 특징을 이용하여, 실제 사용을 위해 생체 역학적 특성을 활용하는 새로운 방법을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 실시형태는 생체전자 디바이스(bioelectronic device)를 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 주형 폴리뉴클레오타이드를 생체전자 디바이스에 도입하는 단계; dNTP 단량체를 포함하는 용액을 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 디바이스에 도입하는 단계로서, 각각의 dNTP는 용액에 사전 규정된 농도로 존재하는, 상기 용액을 도입하는 단계; 및 각각의 상보적인 dNTP 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입됨에 따른 전류 변동을 기초로 하여 중합효소 활성의 생체전자 시그니처를 획득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처의 적어도 하나의 특성은 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입된 상보적인 dNTP들 각각을 식별한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 제1 전극 및 제2 전극 둘 다에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 개방 상태(open state)에 있는 것에 해당하는 개방 기간(open period)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개방 기간의 지속기간은 특정 dNTP 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입되었는지의 여부를 식별하도록 각각의 dNTP 단량체에 대해 구별된다.
일부 실시형태에서, 용액은 4개의 dNTP 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제2 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제2 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제1 dNTP 및 제3 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제2 dNTP 및 제4 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제4 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제3 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 주형의 서열은 각각의 개방 기간의 지속기간으로부터 정확하게 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 서열은 각각의 개방 기간의 지속기간 및/또는 폐쇄 기간의 하나 이상의 특성으로부터 정확하게 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 dNTP에 대한 개방 기간의 지속기간은 복수의 개방 지속기간 기간들의 분포를 기초로 하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 포화 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 중첩 정도는 1% 이하이다.
일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 폐쇄 상태에 있는 것에 해당하는 폐쇄 기간을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성은 이전에 도입된 뉴클레오타이드를 기초로 하여 변한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성은 기계 학습을 포함하는 방법을 사용하여 식별된다. 일부 실시형태에서, 기계 학습 방법은 은닉-마르코프 모델링 또는 베이지안 비모수적 분석을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성과 개방 기간의 적어도 하나의 특성의 조합은 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입된 상보적인 dNTP들 각각을 식별하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 주형은 DNA이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 주형은 RNA이다. 일부 실시형태에서, dNTP 단량체는 이의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함하는 아데닌(dATP), 시토신(dCTP), 구아닌(dGTP), 티민(dTTP) 및/또는 우리딘(dUTP)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 비활성화된다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 티오-스트렙타비딘을 포함하는 링커를 사용하여 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된다. 일부 실시형태에서, 링커는 불활성인 중합효소의 영역에 부착된다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 전극과 제2 전극 사이에 100㎷ 이하인 전압 바이어스를 인가하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 실시형태는 또한 생체전자 디바이스를 보정하는 방법을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 주형 폴리뉴클레오타이드를 생체전자 디바이스에 도입하는 단계; dNTP 단량체를 포함하는 용액을 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 디바이스에 도입하는 단계로서, 각각의 dNTP는 용액에 포화 농도로 존재하는, 상기 용액을 도입하는 단계; 각각의 상보적인 dNTP 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입됨에 따른 전류 변동을 기초로 하여 중합효소 활성의 생체전자 시그니처를 획득하는 단계로서, 상기 생체전자 시그니처는 중합효소가 개방 상태에 있는 것에 해당하는 개방 기간을 포함하는, 상기 생체전자 시그니처를 획득하는 단계; 및 각각의 dNTP에 대한 개방 기간들의 고유 분포를 측정 또는 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 개방 기간들의 분포를 기초로 하여 보정된다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 제1 전극 및 제2 전극 둘 다에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 폐쇄 상태에 있는 것에 해당하는 폐쇄 기간을 포함하며, 생체전자 디바이스는 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성을 기초로 하여 보정된다.
도 1: 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 전류 변동을 기초로 한 효소 활성의 생체전자 시그니처를 도시한 대표적인 그래프.
도 2: 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 도 1의 생체전자 시그니처의 확장된 부분의 대표적인 그래프. 이는 효소가 개방 상태(201)에서 폐쇄 상태(202)로 전이될 때 새로운 단량체(예를 들어, dNTP)가 생체고분자에 도입되는 시간의 부분을 포함함.
도 3: 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 관심 효소(예를 들어, 중합효소)가 개방 상태 또는 입체형태로 존재하여, 단량체(예를 들어, dNTP)의 도달을 기다리는 분포 시간의 대표적인 그래프.
도 4: 본 개시내용의 일 실시형태에 따른, 관심 효소(예를 들어, 중합효소)가 개방 상태 또는 입체형태로 존재하여, 단량체(예를 들어, dNTP)의 도달을 기다리는 분포 시간의 대표적인 그래프. 각각의 단량체는 사전 규정된 농도로 용액에 존재함.
도 5: 도 1의 생체전자 시그니처의 확장된 부분의 대표적인 그래프. 이는 효소가 개방 상태(201)에서 폐쇄 상태(202)로 전이될 때 새로운 단량체(예를 들어, dNTP)가 생체고분자에 도입되는 시간의 부분을 포함하며, 생체전자 시그니처의 특정 특성은 은닉 마르코프 모델링 및/또는 베이지안 비모수적 모델링을 사용하여 추출될 수 있으며(예를 들어, 폐쇄 상태에서 전류 변동), 이러한 모델링은 생체고분자의 서열을 결정하기 위한 기초를 형성할 수 있다.
이 섹션 및 본 명세서의 전체 개시내용에서 사용되는 바와 같은 섹션 표제는 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 문서가 우선할 것이다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 전문이 참조에 의해 원용된다. 본 명세서에 개시된 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이며 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 개시된 실시형태는 단지 예시의 목적으로만 제시되었으며 제한적이지 않다. 다른 실시형태가 가능하고 본 개시내용에 의해 포괄되며, 이는 본 명세서에 포함된 교시내용으로부터 명백할 것이다. 따라서, 본 개시내용의 범위 및 범주는 상기 기재한 실시형태 중 임의의 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 본 개시내용 및 이의 균등물에 의해 뒷받침되는 청구범위에 따라서만 한정되어야 한다. 더욱이, 본 주제 개시내용의 실시형태는 단백질 활성 검출에 상응하는 임의의 및 모든 요소를 포함하는 임의의 다른 개시된 방법, 조성물, 시스템, 및 디바이스로부터 임의의 및 모든 요소를 추가로 포함할 수 있는 방법, 조성물, 시스템 및 장치/디바이스를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 하나 또는 다른 개시된 실시형태로부터의 요소는 다른 개시된 실시형태로부터의 요소와 호환 가능할 수 있다. 더욱이, 일부 추가 실시형태는 본 명세서에 개시된 하나 및/또는 다른 특징부를 참조에 의해 원용된 자료에 개시된 방법, 조성물, 시스템 및 디바이스, 및 이들의 하나 이상의 특징부와 조합함으로써 실현될 수 있다. 추가적으로, 개시된 실시형태의 하나 이상의 특징부/요소가 제거될 수 있고 여전히 특허 가능한 주제가 될 수 있다(따라서, 본 개시내용의 훨씬 더 많은 실시형태를 초래함). 또한, 일부 실시형태는 선행 기술의 교시 내용과 비교하여 하나 및/또는 다른 요소, 구조, 및/또는 단계(적용 가능한 경우)가 구체적으로 결여되어 있어 특허 가능한 주제를 나타내는 방법, 조성물, 시스템 및 디바이스에 해당하며, 선행 기술과 구별 가능하다(즉, 이와 같은 실시형태에 대한 청구항은 선행 기술 교시 내용에서 하나 이상의 특징부의 결여를 언급하기 위해 부정적인 제한을 포함할 수 있다).
본 명세서에서 정의되고 사용되는 바와 같은 모든 정의는 사전 정의, 참조에 의해 원용된 문서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단수표현은 반대로 명백하게 지시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 분리적으로 존재하는 요소의 "하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"을 이용하여 열거된 다수의 요소는 동일한 방식으로, 즉, 요소 중 "하나 이상"이 그렇게 결합되어 있는 것으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 관련이 없는지 여부와 관계없이, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 일 실시형태에서 A만을 지칭할 수 있고(선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 실시형태에서, B만을 지칭할 수 있으며(선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A 및 B 둘 다를 지칭할 수 있는(선택적으로 다른 요소를 포함함) 등이다.
본 명세서 및 청구범위에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "또는"은 상기에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉, 적어도 하나를 포함하지만, 또한 다수의 요소 또는 요소의 목록 중 하나 초과도 포함하고, 선택적으로 추가적인 목록에 없는 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같이 반대로 명확하게 지시되는 용어만, 또는 청구항에서 사용될 때, "~로 이루어진"은 다수의 요소 또는 요소의 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "또는"은 "둘 중 어느 하나", "~ 중 하나", "~ 중 단지 하나", 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 독점성 용어가 뒤에 오는 경우에만 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 하나 그러나 둘 다는 아님")을 지시하는 것으로 해석되어야만 한다. 청구항에서 사용될 때 "본질적으로 ~로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는 요소 목록의 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 요소 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함할 필요는 없으며 요소 목록의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 관련이 없는지 여부와 관계없이, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서, B가 존재하지 않고(그리고 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함) 선택적으로 하나 초과의 A를 포함하는 적어도 하나를 지칭할 수 있고; 다른 실시형태에서, A가 존재하지 않고(그리고 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함) 선택적으로 하나 초과의 B를 포함하는 적어도 하나를 지칭할 수 있으며; 또 다른 실시형태에서, 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B(그리고 선택적으로 다른 요소를 포함함)를 지칭할 수 있는 등이다.
청구범위뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 이행 어구, 예컨대, "포함하는", "비롯하는", "지니는", "가지는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "~로 구성된" 등은 개방형인 것으로, 즉, 포함하지만 이에 제한되지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, 이행 어구 "~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어진"만이 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 이행 어구일 것이다.
2. 생체전자 디바이스 및 시스템
본 개시내용의 실시형태는 생체고분자의 시퀀싱과 관련된 디바이스, 시스템, 및 방법을 포함한다. 특히, 본 개시내용은 관심 효소의 활성에 상응하는 전류 변동을 기초로 하여 생체전자 시그니처를 획득하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이, 관심 효소의 생체전자 시그니처의 특정 양태는 생체고분자의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다.
이러한 실시형태에 따르면, 관심 효소는 중합효소일 수 있으며, 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 뉴클레오타이드 단량체를 첨가할 때 중합효소의 생체전자 시그니처의 다양한 양태는 그러한 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 활성의 생체전자 시그니처는 각각의 상보적인 뉴클레오타이드 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입될 때 전류 변동을 기초로 할 수 있으며, 시그니처는 적어도 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함하는 생체전자 디바이스를 사용하여 획득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 제1 전극 및 제2 전극 둘 다에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다. 용어 "뉴클레오타이드"는 일반적으로 염기-당-포스페이트 조합을 지칭하고, 리보뉴클레오사이드 트라이포스페이트 ATP, UTP, CTG, GTP 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트라이포스페이트, 예컨대, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 중합효소 분자의 전도도는 분자가 개방 상태(유입 dNTP 단량체를 수용할 준비가 되어 있음) 및 폐쇄 상태(유입 dNTP를 도입시키고 중합효소 내에서 새로운 이중 나선을 번역함)로부터 전이될 때 배가된다. 이러한 과정 동안 얻어진 통상적인 전기 신호의 대표적인 예시는 도 1에 도시되어 있다. 불활성 상태에서, 중합효소를 통한 전류는 낮은 기준선 수준(101)에 있다. dNTP가 첨가되면, 전류는 폐쇄 상태(103)와 관련된 새로운 더 높은 전도도(102)까지 급증한다. 각각의 새로운 뉴클레오타이드가 도입된 후, 전류는 하강하며(104), 이는 다음 개방 상태로의 전이를 나타낸다. 도 1에 도시된 트레이스(trace)에서, 전류의 하향 스위프(downward sweep)는 전자 기기의 응답 시간에 의해 제한된다. 즉, 더 느린 개방은 전류의 배경 수준(101)까지 내려간다. 이러한 특정 예시적인 데이터세트에서, 중합효소는 새로운 주형을 포획하지 않았으며(105), 전류는 기준선 수준(101)까지 다시 떨어진다.
중합효소 활성의 생체전자 시그니처는 일시적인 개방 상태 및 그 사이의 폐쇄 영역 둘 다에서 정보를 함유한다. 예를 들어, 도 2는 도 1의 생체전자 시그니처의 확장된 부분을 포함하며, 이는 효소가 개방 상태(201)에서 폐쇄 상태(202)로 전이될 때 새로운 단량체(예컨대, dNTP)가 생체고분자에 도입된 시간의 부분을 포함한다. 도 2에서 2개의 일시적인 개방(201)은 트라이포스페이트를 절단하고, 새로운 뉴클레오타이드를 도입하고, DNA를 번역하는 반응을 위한 시간(τC)(폐쇄 간격, 또는 202)으로 구분한다. 개방 상태의 폭은 화살표 사이에 τO로 표시된다. 제1 개방(204)과 후속 재개방 사이의 전류(203)는 제1 개방(204)에서 포획된 뉴클레오타이드의 도입을 반영하는 특징 또는 특성(203)을 함유한다.
본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이, 활성 중합효소의 생체전자 시그니처의 다양한 특징 또는 특성은 폴리뉴클레오타이드 주형의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 개시내용을 기초로 하여 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 본 명세서에 기술된 생체전자 시그니처를 획득하고 다양한 특성을 추출하는 방법은 중합효소, 뉴클레아제, 프로테아좀, 글리코펩티다제, 글리코시다제, 키나제 및 엔도뉴클레아제를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 임의의 생체고분자 및 임의의 상응하는 관심 효소의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다.
도 3에 추가로 제공된 바와 같이, 상보적인 dNTP의 선택은 개방 상태(201) 동안 발생하고, τO 값의 분포는 dNTP 용액의 조성(예를 들어, 농도)에 민감하다. 도 3은 상보적인 dNTP, 즉, dTTP의 1mM 용액에서 10 A 염기로 구성된 동종중합체 주형에 대한 제공된 τO의 값의 측정된 확률(301-점)을 도시한다. 피팅된 분포 곡선(302)은 0.16㎳에서 피크 및 0.3㎳의 폭을 갖는 날카로운 가우시안이다.
대조적으로, 중합효소가 상보적인 dNTP를 찾아야 할 때, 개방 시간들의 분포는 사각형(303)으로 도시된 바와 같이 훨씬 더 넓다. 이러한 예에서, 주형은 4개 모두의 dNTP의 mM 용액에서 서열 ATC의 5-배 반복부를 포함하였다. 이제 분포는 3㎳만큼 긴 개방 시간을 갖는 지수(304)에 의해 피팅된다(박스(305)로 표시된 바와 같이, 모든 값의 1% 미만이 약 2㎳를 초과함).
이러한 시간은 이러한 mM 농도에서 유입 dNTP들 사이의 시간을 고려함으로써 알 수 있는 바와 같이, 중합효소의 고유 반응을 반영한다.
분자 확산 상수 D 및 농도 [C] 입자/㎥에 대한 반경 Rp(이는 중합효소의 반경, 약 3㎚를 의미함)의 s 구체로의 분자의 플럭스 I는 하기와 같다:
Figure pct00001
dNTP의 확산 상수는 아인슈타인-스몰루쇼프스키(Einstein-Smoluchowski) 관계 및 스토크의 법칙(Stoke's law)에 의해 하기와 같이 제공된다:
Figure pct00002
여기서, RN은 dNTP의 반경이며, η는 물의 점도(300 K에서 10-3 Pa.s)이다.
따라서,
Figure pct00003
여기서, I는 입자/㎥인, [C]의 벌크 농도에 대해 초당 중합효소에 들어가는 입자의 수이다. 이는 몰 농도(M)×1000×NA(NA는 아보가드로 수임)로 하기와 같이 표현될 수 있다.
Figure pct00004
300 K에서, kT는 4.14×10-21 J이며, 물에 대한 η는 10-3 Pa.s이므로,
Figure pct00005
Rp/Rn이 약 3인 경우, 이는 1mM dNTP에서 약 5×106의 플럭스(또는 약 0.2㎲의 도달 사이의 시간)를 제공한다. 따라서, dNTP는 가장 빠른 개방 이벤트(opening event)당 100개 초과의 속도로 중합효소에 도달하고 있다. 따라서, 도 3에 도시된 T 시간은 중합효소의 고유 반응 시간을 나타낸다. 정확한 dNTP가 항상 존재하는 경우(301), 이는 일관되게 약 0.16㎳이다. 중합효소가 4개의 가능한 dNTP 중에서 정확한 상보적 뉴클레오타이드를 찾기 위해 개방되어 있어야 하는 경우, 시간의 분포는 훨씬 더 광범위하다(303). 거의 모든 검색 이벤트(search event)는 dNTP의 mM 단위의 농도에서 약 3㎳에서 종료된다.
수학식 1은 감소된 농도에서 dNTP의 도달률을 예측하는 데 사용될 수 있다. 중요하게는, 이러한 도달률은 푸아송 분포에 따라 분포될 것이다:
Figure pct00006
이는 도달 사이의 평균 간격 μ가 또한 분포의 분산이라는 특별한 특성을 갖는다.
도 4는 기점(401)에 가까운 지수로서 mM dNTP에서 중합효소에 대한 개방 시간들의 고유 분포를 도시한다. 인접 분포(402)는 μ= 17㎳를 갖는 수학식 2를 사용하여 계산된다. 수학식 1은 하기를 부여한다:
Figure pct00007
이러한 예시적인 데이터에 도시된 바와 같이, 17㎳ 간격은 (402)에 의해 도시된 도달 시간들의 분포를 제공하기 위한 I=58.8 또는 11nM 용액에 상응한다. 이러한 경우, 도달들 사이의 간격은 중합효소의 고유 반응보다 훨씬 더 길며, 이에 따라, 이는 개방 상태 수명을 지배한다. 따라서, 제1 dNTP가 mM 농도로 존재하고, 제2 dNTP가 11nM로 존재하는 경우, 개방 시간 분포들의 중첩은 곡선(401 및 402) 사이의 중첩에 의해 제공될 것이다(이러한 곡선은 모두 총 확률 = 1이도록 정규화됨). 이러한 중첩(405)은 약 0.001 또는 약 1/10%이다. 3.8nM로의 제3 dNTP의 추가 희석은 μ = 50㎳를 초래하여 (403)으로 표지된 곡선을 제공할 것이다. 1.9nM으로의 제4 dNTP의 희석은 μ=100㎳를 제공하며, 생성된 분포는 (404)로 표지된 곡선으로 플롯팅된다. 곡선(403)으로 표시되는 dNTP의 경우, 곡선(402)과의 중첩은 0.004(406)이며, 곡선(404)과의 중첩은 또한 0.004(407)이다. 따라서, 개방 이벤트 후에 도입되는 뉴클레오타이드는 개방 이벤트의 지속기간에 의해 1% 초과로 식별될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 용액에 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM, 또는 약 1mM 내지 약 2mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 용액에 약 2mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 10mM, 또는 약 8mM 내지 약 10mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 용액에 약 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 또는 10mM의 농도로 존재할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제2 dNTP는 용액에 약 5nM 내지 약 15nM, 약 10nM 내지 약 15nM, 약 12nM 내지 약 15nM, 약 5nM 내지 약 12nM, 약 5nM 내지 약 10nM, 약 5nM 내지 약 8nM, 약 7nM 내지 약 12nM, 또는 약 8nM 내지 약 10nM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 dNTP는 용액에 약 5nM, 6nM, 7nM, 8nM, 9nM, 10nM, 11nM, 12nM, 13nM, 14nM, 또는 15nM의 농도로 존재할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제3 dNTP는 용액에 약 1nM 내지 약 10nM, 약 1nM 내지 약 8nM, 약 1nM 내지 약 6nM, 약 1nM 내지 약 5nM, 약 2nM 내지 약 10nM, 약 3nM 내지 약 10nM, 약 2nM 내지 약 8nM, 또는 약 2nM 내지 약 6nM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 dNTP는 용액에 약 1nM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM, 6nM, 7nM, 8nM, 9nM, 또는 10nM의 농도로 존재할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제4 dNTP는 용액에 약 0.1nM 내지 약 5nM, 약 0.1nM 내지 약 2.5nM, 약 0.1nM 내지 약 1nM, 약 0.5nM 내지 약 5nM, 약 0.5nM 내지 약 2.5nM, 약 1nM 내지 약 5nM, 약 1nM 내지 약 4nM, 또는 약 1nM 내지 약 2.5nM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제4 dNTP는 용액에 약 1.5nM, 1.6nM, 1.7nM, 1.8nM, 1.9nM, 2nM, 2.1nM, 2.2nM, 2.3nM, 2.4nM 또는 2.5nM의 농도로 존재할 수 있다. 본 개시내용을 기초로 하여 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이러한 dNTP의 농도는 제한하려는 것이 아니고, 본 명세서에 기술된 방법의 다양한 양태(예를 들어, 주형 서열 및 구조)를 기초로 하여 조정될 수 있다.
표 1 및 표 2(하기)에 제시된 바와 같이, 개방 시간 및 폐쇄 시간의 분포는 서열 및 주형 구조에 따라 다양하다. 이러한 데이터는 하기 서열에 대한 측정된 시간 분포를 보여준다: (1) AAAAAAAAAA(서열번호 1) - 단일 가닥 올리고머(A10), 중합 완충제에서만 dTTP; (2) ATCATCATCATCATC(서열번호 2) - 단일 가닥 올리고머(ATC5), 4개의 dNTP 모두가 존재함; 및 (3) catctactacgcttagcttgctatcatctatgcttagcatga(서열번호 3) - 원형 주형, 4개의 dNTP 모두가 존재함.
Figure pct00008
Figure pct00009
동종중합체 A10은 단지 하나의 개방 상태 및 하나의 폐쇄 상태를 특징으로 한다. 이종중합체 ATC5는 2개의 개방 시간을 특징으로 하며, A10의 경우만큼 빠른 하나는 이벤트의 약 3/4이고 1/4은 훨씬 더 느리다(표 1). 마찬가지로, 폐쇄 상태의 대부분(약 3/4)은 동종중합체에 대한 지속기간만큼 짧으며, 나머지 1/4은 훨씬 더 느리다(표 2). 이종중합체 서열을 갖는 원형 주형은 또한 이의 개방 상태 및 폐쇄 상태 둘 다에서 2개의 상태를 나타내지만, 둘 다의 이벤트는 선형 폴리머에서의 이벤트보다 더 빠르다.
종합하면, 이러한 데이터는 개방 시간이 완충제의 뉴클레오타이드 조성에 민감하다는 것을 보여준다. dTTP만이 존재하는 A10의 경우, 단 하나의 (빠른) 개방 시간이 존재한다. 4개의 뉴클레오타이드 모두가 존재할 때, 2개의 개방 상태가 존재한다. 짧은 개방 상태는 첫 번째 시도에서 정확한 뉴클레오타이드의 포획에 상응할 것인 반면, 더 긴 개방 시간은 비-상보적 뉴클레오타이드의 거부가 뒤따르는 포획에 상응할 것이다. 데이터는 또한 폐쇄 시간(사이클의 촉매 부분에 상응함)이 또한 서열에 의존하는 방식을 보여준다. 동종중합체 A10의 경우, 단 하나의 빠른 폐쇄 시간이 존재한다. 두 이종중합체 모두는 2개의 별개의 폐쇄 시간을 가지며, 하나는 빠르며 다른 하나는 거의 10배 더 길며, 이는 일부 뉴클레오타이드 도입이 어떻게 더 오래 걸리는지를 예시한다.
도 5에 제시된 데이터를 참조하면, 특정 뉴클레오타이드의 도입과 제공된 폐쇄 이벤트(202)를 연관시키는 능력은 특정 뉴클레오타이드와 관련된 신호 특징 또는 특성의 추가 식별을 가능하게 한다. 추가적으로, 특정의 이전에 도입된 뉴클레오타이드의 상부에 특정 뉴클레오타이드의 도입은 또한 특정 뉴클레오타이드와 관련된 신호 특징 또는 특성의 추가 식별을 가능하게 하여, 폐쇄 간격의 신호 특징이 16의 이러한 조합을 반영하도록 한다("염기 스태킹(base stacking)"). 개방 상태가 폐쇄 상태에 비해 전류의 큰 변화를 나타내지만, 폐쇄 상태의 전류 변화는 확률적이고, 노이즈에 영향을 받는다. 그러나, 기본 수준은, 예를 들어, 베이지안 비모수적 방법과 함께 무한 은닉 마르코프 모델을 사용하여 모델-독립적인 방식으로 추출될 수 있다. 결과적으로, 특성 수준은 도 5의 "숨겨진" 기본 상태(501)에 의해 도시된 바와 같이, 모델 없는 방식으로 위치될 수 있다.
본 명세서에 기술된 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 생체전자 디바이스를 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 주형 폴리뉴클레오타이드를 생체전자 디바이스에 도입하는 단계, 및 dNTP 단량체를 포함하는 용액을 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 디바이스에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 dNTP는 사전 규정된 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 방법은 각각의 상보적인 dNTP 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입됨에 따른 전류 변동을 기초로 하여 중합효소 활성의 생체전자 시그니처를 획득하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처의 적어도 하나의 특성은 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입된 상보적인 dNTP 각각을 식별한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 제1 전극 및 제2 전극 둘 다에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 개방 상태에 있는 것에 해당하는 개방 기간을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개방 기간의 지속기간은 특정 dNTP 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입되었는지의 여부를 식별하도록 각각의 dNTP 단량체에 대해 구별된다. 일부 실시형태에서, 용액은 4개의 dNTP 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제2 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제2 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제1 dNTP 및 제3 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제3 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제2 dNTP 및 제4 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제4 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제3 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재한다. 이러한 실시형태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 주형의 서열은 각각의 개방 기간의 지속기간으로부터 정확하게 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 서열은 각각의 개방 기간의 지속기간 및/또는 폐쇄 기간의 하나 이상의 특성으로부터 정확하게 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 dNTP에 대한 개방 기간의 지속기간은 복수의 개방 지속기간 기간들의 분포를 기초로 하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 제1 dNTP는 포화 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 중첩 정도는 1% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 1% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.9% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.8% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.7% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.6% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.5% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.4% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.3% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.2% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.1% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.075% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.050% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.025% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.010% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.005% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.001% 이하이다. 일부 실시형태에서, 분포가 최소로 중첩되는 정도는 0.0001% 이하이다.
일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 폐쇄 상태에 있는 것에 해당하는 폐쇄 기간을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성은 이전에 도입된 뉴클레오타이드를 기초로 하여 변한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성은 기계 학습을 포함하는 방법을 사용하여 식별된다. 일부 실시형태에서, 기계 학습 방법은 은닉-마르코프 모델링 또는 베이지안 비모수적 분석을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성과 개방 기간의 적어도 하나의 특성의 조합은 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입된 상보적인 dNTP들 각각을 식별하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 주형은 DNA이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 주형은 RNA이다. 일부 실시형태에서, dNTP 단량체는 이의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함하는, 아데닌(dATP), 시토신(dCTP), 구아닌(dGTP), 티민(dTTP) 및/또는 우리딘(dUTP)을 포함한다.
당업자가 본 개시내용의 교시로부터 이익을 얻은 후 용이하게 인지하고 이해할 수 있는 바와 같이, 본 명세서에 기술된 방법은 효소(예를 들어, 중합효소)의 개방 상태 및 폐쇄 상태의 지속기간을 감지하는 임의의 생체전자 디바이스와 함께 이용될 수 있다. 예시적인 디바이스는 미국 특허 제10,422,787호 및 PCT 출원 PCT/US2019/032707호에 개시된 생체전자 디바이스 및 시스템을 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 이러한 문헌 둘 다는 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 추가적으로, 전술된 실시형태는 dNTP에 대한 rNTP의 치환 및 RNA 중합효소의 사용에 의해 RNA를 시퀀싱하는 데 동등하게 적용한다는(및 이를 포함한다는) 것이 당업자에 의해 용이하게 인식되고 이해될 것이다.
이러한 실시형태에 따르면, 중합효소는 티오-스트렙타비딘을 포함하는 링커를 사용하여 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 비오티닐화된다. 일부 실시형태에서, 링커는 불활성인 중합효소의 영역에 부착된다. 일부 실시형태에서, 중합효소 및 제1 전극 및 제2 전극은 비오티닐화되며, 링커는 적어도 2개의 비오틴 결합 부위를 포함하는 스트렙타비딘 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 비활성화된다. 일부 실시형태에서, 갭은 약 1.0㎚ 내지 약 20.0㎚의 폭을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 유전체 층에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 방법은 제1 전극과 제2 전극 사이에 100㎷ 이하인 전압 바이어스를 인가하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 실시형태는 또한 중합효소 활성의 직접적인 전기적 측정을 위한 시스템을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 시스템은 본 명세서에 기술된 임의의 생체전자 디바이스, 중합효소와 상호작용할 수 있는 dNTP를 도입하기 위한 수단, 제1 전극과 제2 전극 사이에 100㎷ 이하인 전압 바이어스를 인가하기 위한 수단, 및 dNTP가 중합효소에 의해 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입될 때 발생하는 변동을 모니터링하기 위한 수단을 포함한다.
본 개시내용의 실시형태는 또한 생체전자 디바이스를 보정하는 방법을 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 주형 폴리뉴클레오타이드를 생체전자 디바이스에 도입하는 단계; dNTP 단량체를 포함하는 용액을 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 디바이스에 도입하는 단계로서, 각각의 dNTP는 용액에 포화 농도로 존재하는, 상기 용액을 도입하는 단계; 각각의 상보적인 dNTP 단량체가 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입됨에 따른 전류 변동을 기초로 한 중합효소 활성의 생체전자 시그니처를 획득하는 단계로서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 개방 상태에 있는 것에 해당하는 개방 기간을 포함하는, 상기 생체전자 시그니처를 획득하는 단계; 및 각각의 dNTP에 대한 개방 기간의 고유 분포를 측정 또는 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 개방 기간들의 분포를 기초로 하여 보정된다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 디바이스는 제1 전극 및 제2 전극 둘 다에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생체전자 시그니처는 중합효소가 폐쇄 상태에 있는 것에 해당하는 폐쇄 기간을 포함하며, 생체전자 디바이스는 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성을 기초로 하여 보정된다.
본 개시내용의 실시형태는 또한 접합부에 걸쳐 있는 중합효소 단백질로부터 전기 신호의 염기를 호출하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 포화 농도의 dNTP에서 기능하는 중합효소에 대한 개방 시간의 고유 분포를 측정하는 단계; 개방 상태의 상응하는 증가된 시간에 의해 도입이 식별될 수 있도록 적어도 하나의 dNTP가 희석된 용액에서 측정을 반복하는 단계; 도입되는 뉴클레오타이드 및 이전에 도입된 뉴클레오타이드와 관련하여 개방 상태 및 다음 폐쇄 상태 둘 다의 신호 특징을 특성화하는 단계로서, 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기술된 희석 방법을 사용하여 먼저 식별되는, 상기 신호 특징을 특성화하는 단계; 및 요망되는 시퀀싱 정확도가 가장 빠른 판독 속도로 획득되도록 각각의 뉴클레오타이드의 희석액 및 신호 파라미터의 사용을 최적화하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 DNA 주형을 포함하는 제1 용액을 디바이스에 도입함으로써 중합효소의 개방 상태를 측정 또는 결정하는 단계로서, 디바이스는 갭에 의해 분리된 제1 전극 및 제2 전극, 및 제1 전극 및 제2 전극에 부착된 중합효소를 포함하는, 상기 개방 상태를 측정 또는 결정하는 단계; 4개의 dNTP를 포함하는 제2 용액을, DNA 주형에 상보적인 dNTP의 도입을 허용하는 조건 하에 이전 단계의 생성물에 도입하는 단계로서, dNTP는 용액에 포화 농도로 존재하는 단계; 및 중합효소에 대한 개방 시간의 고유 분포를 측정하는, 상기 제2 용액을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 갭에 의해 분리된 제1 전극 및 제2 전극, 및 제1 전극 및 제2 전극에 부착된 중합효소를 포함하는 시퀀싱 디바이스를 보정하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 DNA 주형을 포함하는 제1 용액을 디바이스에 도입하는 단계로서, 디바이스는 갭에 의해 분리된 제1 전극 및 제2 전극, 및 제1 전극 및 제2 전극에 부착된 중합효소를 포함하는, 상기 제1 용액을 도입하는 단계; 4개의 dNTP를 포함하는 제2 용액을, DNA 주형에 상보적인 dNTP의 도입을 허용하는 조건 하에 이전 단계의 생성물에 도입하는 단계로서, dNTP는 포화 농도로 용액에 존재하는, 상기 제2 용액을 도입하는 단계; 및 중합효소에 대한 개방 시간의 고유 분포를 측정하는 단계로서, 시퀀싱 디바이스는 측정된 개방 시간의 고유 분포로부터 보정되는, 상기 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 DNA의 가닥에 도입된 염기를 식별하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 DNA 주형을 포함하는 제1 용액을 디바이스에 도입하는 단계로서, 디바이스는 갭에 의해 분리된 제1 전극 및 제2 전극, 및 제1 전극 및 제2 전극에 부착된 중합효소를 포함하며, 디바이스는 상기 기술된 방법에 따라 보정된, 상기 제1 용액을 도입하는 단계; 4개의 dNTP를 포함하는 제2 용액을, DNA 주형에 상보적인 dNTP의 도입을 허용하게 하는 조건 하에 이전 단계의 생성물에 도입하는 단계로서, 제1 dNTP는 이의 도달 시간들의 분포가 제2 dNTP의 포화 농도의 중합효소 개방 시간들의 분포와 최소로 중첩하게 하는 농도로 용액에 존재하며, 제2 dNTP는 이의 도달 시간의 분포가 제1 dNTP의 도달 시간들의 분포와 최소로 중첩하게 하는 농도로 용액에 존재하며, 제3 dNTP는 이의 도달 시간의 분포가 제2 dNTP의 도달 시간들의 분포와 최소로 중첩하게 하는 농도로 용액에 존재하며, 제4 dNTP는 이의 도달 시간의 분포가 제3 dNTP의 도달 시간들의 분포와 최소로 중첩하게 하는 농도로 용액에 존재하는, 상기 제2 용액을 도입하는 단계; 및 시간 경과에 따른 전류를 측정하는 단계로서, 염기는 뉴클레오타이드의 제공된 농도 세트에서 중합효소의 공지된 분포 개방 시간으로부터(또는 이를 기초로 하여) 식별되는, 상기 전류를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 DNA를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 DNA 주형을 포함하는 제1 용액을 디바이스에 도입하는 단계로서, 디바이스는 갭에 의해 분리된 제1 전극 및 제2 전극, 및 제1 전극 및 제2 전극에 부착된 중합효소를 포함하며, 디바이스는 상기 기술된 방법에 따라 보정된, 상기 제1 용액을 도입하는 단계; 4개의 dNTP를 포함하는 제2 용액을, DNA 주형에 상보적인 dNTP의 도입을 허용하는 조건 하에 이전 단계의 생성물에 도입하는 단계로서, 제1 dNTP는 포화 농도로 용액에 존재하며, 제2 dNTP는 이의 도달 시간들의 분포가 제1 dNTP의 도달 시간들의 분포와 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재하며, 제3 dNTP는 이의 도달 시간들의 분포가 제2 dNTP의 도달 시간들의 분포와 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재하며, 제4 dNTP는 이의 도달 시간들의 분포가 제3 dNTP의 도달 시간들의 분포와 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재하는, 상기 제2 용액을 도입하는 단계; 및 시간 경과에 따른 전류를 측정하는 단계로서, DNA는 제공된 농도의 제1 dNTP, 제2 dNTP, 제3 dNTP 및 제4 dNTP에서 중합효소의 공지된 분포 개방 시간으로부터(또는 이에 기초하여) 시퀀싱되는, 상기 전류를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 생체고분자 시퀀싱 시스템 및 방법(예를 들어, DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱, 또는 다른 생체고분자 시퀀싱)의 정확성을 개선하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에 따르면, 방법은 상기 기술된 방법에 따라 시간 경과에 따른 전류의 기록을 수집하는 단계, 및 개방 상태 신호들 사이의 폐쇄 상태로부터 전류 신호의 부분들을 수집하는 단계 및 이러한 것들을, 제공된 개방 이벤트에서 도입된 뉴클레오타이드 및 이전 이벤트에서 도입된 뉴클레오타이드와 관련하여 분류하여 복수의 폐쇄 상태 신호 세트(예를 들어, 16개 세트)의 집합을 수득하는 단계로서, 이러한 것들 중 각각은 2개의 순차적 도입 이벤트들에서 제공된 쌍의 뉴클레오타이드의 도입과 관련된, 상기 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 기계 학습 방법을 적용하여 2개의 순차적인 도입 이벤트에서 제공된 쌍의 뉴클레오타이드와 관련된 폐쇄 상태 전류에서 신호 특징을 위치시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기계 학습 방법은, 예를 들어, 은닉-마르코프 모델링 또는 베이지안 비모수적 분석을 포함할 수 있다.
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Claims (20)

  1. 생체전자 디바이스(bioelectronic device)를 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 방법으로서,
    (a) 주형 폴리뉴클레오타이드를 상기 생체전자 디바이스에 도입하는 단계로서, 상기 생체전자 디바이스는 제1 전극 및 제2 전극 중 적어도 하나에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함하는, 상기 주형 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
    (b) dNTP 단량체를 포함하는 용액을 상기 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 상기 디바이스에 도입하는 단계로서, 각각의 dNTP는 상기 용액에 사전 규정된 농도로 존재하는, 상기 용액을 도입하는 단계; 및
    (c) 각각의 상보적인 dNTP 단량체가 상기 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입됨에 따른 전류 변동을 기초로 하여 중합효소 활성의 생체전자 시그니처(bioelectronic signature)를 획득하는 단계
    를 포함하되, 상기 생체전자 시그니처의 적어도 하나의 특성은 상기 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입된 상보적 dNTP들 각각을 식별하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체전자 시그니처가, 상기 중합효소가 개방 상태(open state)에 있는 것에 해당하는 개방 기간(open period)을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개방 기간의 지속기간이, 특정 dNTP 단량체가 상기 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입되었는지의 여부를 식별하도록 각각의 dNTP 단량체에 대해 구별되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 4개의 dNTP 단량체를 포함하되, 제1 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 제2 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 상기 용액에 존재하며; 상기 제2 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 상기 제1 dNTP 및 제3 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재하며; 상기 제3 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 상기 제2 dNTP 및 제4 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재하며; 상기 제4 dNTP는 개방 기간의 지속기간이 상기 제3 dNTP의 개방 기간의 지속기간과 최소로 중첩되는 농도로 용액에 존재하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 dNTP에 대한 개방 기간의 지속기간이 복수의 개방 지속기간 기간(open duration period)의 분포를 기초로 하여 결정되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 dNTP가 포화 농도로 존재하는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중첩 정도가 1% 이하인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 생체전자 시그니처가, 상기 중합효소가 폐쇄 상태(closed state)에 있는 것에 해당하는 폐쇄 기간(closed period)을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성이 이전에 도입된 상기 뉴클레오타이드를 기초로 하여 변하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성이 기계 학습(machine learning)을 포함하는 방법을 사용하여 식별되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 기계 학습 방법이 은닉-마르코프 모델링(Hidden-markov modeling) 또는 베이지안 비모수적 분석(bayesean non-parametric analysis)을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성과 상기 개방 기간의 적어도 하나의 특성의 조합이 상기 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입된 상보적 dNTP들 각각을 식별하기 위해 사용되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 주형이 DNA인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 비활성화되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소가 티오-스트렙타비딘을 포함하는 링커를 사용하여 상기 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 링커가 불활성인 상기 중합효소의 영역에 부착되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 전극과 상기 제2 전극 사이에 100㎷ 이하인 전압 바이어스(voltage bias)를 인가하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dNTP 단량체가 아데닌(dATP), 시토신(dCTP), 구아닌(dGTP) 및 티민(dTTP)을 포함하는, 방법.
  19. 생체전자 디바이스를 보정하는 방법으로서,
    (a) 주형 폴리뉴클레오타이드를 상기 생체전자 디바이스에 도입하는 단계로서, 상기 생체전자 디바이스는 적어도 제1 전극 및 제2 전극에 기능적으로 커플링된 중합효소를 포함하는, 상기 주형 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
    (b) dNTP 단량체를 포함하는 용액을 상기 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 디바이스에 도입하는 단계로서, 각각의 dNTP는 상기 용액에 포화 농도로 존재하는, 상기 용액을 도입하는 단계;
    (c) 각각의 상보적인 dNTP 단량체가 상기 주형 폴리뉴클레오타이드에 도입됨에 따른 전류 변동을 기초로 하여 중합효소 활성의 생체전자 시그니처를 획득하는 단계로서, 상기 생체전자 시그니처는 상기 중합효소가 개방 상태에 있는 것에 해당하는 개방 기간을 포함하는, 상기 생체전자 시그니처를 획득하는 단계; 및
    (d) 각각의 dNTP에 대한 상기 개방 기간의 고유 분포를 측정 또는 결정하는 단계로서, 상기 생체전자 디바이스는 상기 개방 기간의 분포를 기초로 하여 보정되는, 상기 고유 분포를 측정 또는 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 생체전자 시그니처가, 상기 중합효소가 폐쇄 상태에 있는 것에 해당하는 폐쇄 기간을 포함하며, 상기 생체전자 디바이스가 상기 폐쇄 기간의 적어도 하나의 특성을 기초로 하여 보정되는, 방법.
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