CN102066945A - Stat3信号传导的调节剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定调节STAT3和SP1间相互作用的化合物的方法。提供了能够与STAT3结合且干扰STAT3和SP1的相互作用的肽。本发明提供了用于鉴定能够与肽结合从而释放干扰STAT3和SP1间相互作用的化合物的方法,及用于鉴定STAT3和SP1相互作用的抑制剂和增强剂的方法。本发明方法所鉴定的化合物在抑制或刺激患者食欲方面是有用的,从而用于治疗瘦素抗性、肥胖症和厌食症。
Description
发明领域
本发明涉及STAT3和SP1间相互作用,且尽管不绝对,但特别涉及鉴定能够调节STAT3和SP1间相互作用的化合物的方法。
发明背景
瘦素(leptin),是脂肪组织分泌的激素,通过调节下丘脑神经元活性来调节食物摄入和能量消耗(1)。通过饱和转运机制,循环的瘦素穿过血脑屏障进入脑,作用于至少两类神经元:促进使食欲减退的阿片黑素促皮质激素原(POMC)产生的POMC神经元和下调促进食欲的神经肽Y(NPY)和刺鼠相关蛋白(AgRP)产生和分泌的NPY/AgRP神经元(2-4)。一旦它结合且激活长形式的瘦素受体(OBRb),但不是其他形式的瘦素受体(OBRa、Rc、Rd和Re),瘦素就通过复合信号传导途径发挥它的作用(5,6)。激活的OBRb启动Jak2-STAT3途径,包括STAT3磷酸化和易位至细胞核,STAT3与靶基因启动子/辅因子复合体结合,和其最终调节对靶基因启动子活性,例如POMC转录的激活(7)。
血浆和脑脊液(CSF)的瘦素水平经常在肥胖个体中更高,如同预期他们的脂肪体积与瘦人相比更高一样(8)。然而,由于瘦素信号传导途径的损伤,瘦素在这些动物中不能实现下游的生理学结果,这统称为瘦素抗性(9)。作为瘦素抗性基础的分子机制仍然不清楚。一种可能性是,SOCS3活性的增加抑制了STAT3磷酸化,随后阻止了STAT3易位至细胞核和作用于它的靶基因,这基于对高脂肪饮食喂养16周后DIO小鼠的分析(10)。最近利用高脂肪饮食4-5周后DIO小鼠的研究显示,瘦素刺激的STAT3磷酸化水平与普通饮食(chow diet)的消瘦小鼠的STAT3磷酸化水平是相当的(10,11)。高脂肪喂养4-5周后的小鼠表现出新陈代谢改变和瘦素水平增加,这表明它们可能处于瘦素抗性的早期(10)。STAT3磷酸化在瘦素抗性的早期没有改变但是在瘦素抗性的晚期受到抑制这一事实提示,瘦素抗性的早期和晚期间进行着不同的分子机制。对于瘦素抗性的早期,由于STAT3磷酸化水平没有改变,故损伤肯定位于STAT激活的下游,可能通过转录因子。
转录因子FoxO1是含有叉头框(forkheadbox)的蛋白O超家族的成员,而且是参与包括通过蛋白-DNA或蛋白-蛋白相互作用的生长和增殖及代谢调节的多方面作用的中心信号分子(14,15)。FoxO1蛋白在人类中为655个氨基酸而在小鼠中为个652个氨基酸(GenBank登录号Q12778(人类)和AJ252157(小鼠))。
POMC是瘦素所诱导的关键神经肽(16)。POMC表达在瘦素信号传导缺陷小鼠模型,如ob/ob和db/db小鼠中减少(17)。POMC表达在瘦素抗性DIO小鼠中也减少(18)。早先的研究已经表明,瘦素刺激的POMC表达经由STAT3介导(19)。
发明概述
本发明人已发现磷酸-STAT3通过需要POMC基因启动子中SP1结合位点的机制,响应瘦素,激活POMC启动子活性。本发明人还发现FoxO1(SEQ ID NO:2)与STAT3结合而且阻止STAT3与SP1/POMC启动子复合体相互作用,因此抑制STAT3介导的瘦素作用。本发明人已确定FoxO1和STAT3间这种相互作用需要FoxO1蛋白的44个氨基酸区域。
因此,本发明人已首次证明瘦素作用能够在STAT3激活并易位至细胞核的下游步骤受到抑制,并且提供瘦素抗性的潜在机制,其中FoxO1水平的增加拮抗STAT3介导的瘦素信号传导。
本发明还提供了SEQ ID NO:1的肽,其包含STAT3的FoxO1结合位点。包含与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的化合物和能够模拟FoxO1对SP1和STAT3间相互作用的干扰作用的化合物也是本发明的一部分。
包含与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的化合物能够用于抑制STAT3和SP1间相互作用,而且因此抑制参与食欲抑制的基因的表达。
相反,能结合与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的化合物能够用于通过干扰FoxO1和STAT3间相互作用释放STAT3/SP1/启动子复合体形成的FoxO1介导的抑制。此类化合物能够用于阻断FoxO1对需要STAT3和SP1间相互作用的基因表达的抑制作用(“STAT3 SP1可调型基因”)。通过维持STAT3 SP1可调型基因(例如编码POMC的基因)的表达,能够抑制食欲。
因此,通过鉴定对FoxO1和STAT3间相互作用所必需的氨基酸序列,本发明人已提供了用于鉴定能够刺激和抑制需要治疗的患者的食欲的化合物的方法。这些化合物和包含这些化合物的药物制剂的治疗用途是本发明的一部分。
本发明提供了用于鉴定能够调节STAT3和SP1间相互作用的化合物的方法、测定和筛选。在一些情况下,通过所述方法、测定和筛选所鉴定的化合物通过抑制STAT3和SP1的相互作用来调节相互作用。其他情况下,受试化合物可通过增强STAT3和SP1的相互作用来调节相互作用。
在本发明的方法中,在受试化合物存在的情况下,使STAT3多肽和SP1多肽接触并检测STAT3和SP1间的相互作用。在一些情况下,受试化合物是包含SEQ ID NO:1或包含与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的肽。可选地,受试化合物是SEQ ID NO:1的肽的模拟物。在其他情况下,受试化合物能够结合与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽。
在受试化合物能够结合包含SEQ ID NO:1或与其有序列同一性的肽的情况下,在FoxO1存在的情况下,评估STAT3和SP1间的相互作用。
在某些方法中,通过检测STAT3 SP1可调型基因的表达鉴定能够调节STAT3和SP1间的相互作用的化合物。此类方法可涉及检测报告基因的表达,该报告基因可操作地连接于STAT3 SP1可调型基因的启动子。
在本发明的第一方面,提供了用于鉴定STAT3和SP1的相互作用的调节剂的方法,所述的方法包括:
(a)提供STAT3多肽;
(b)提供SP1多肽;
(c)提供FoxO1多肽;
(d)在FoxO1多肽和受试化合物存在的情况下,使STAT3和SP1多肽接触;以及
(d)检测STAT3和SP1的结合;
其中受试化合物能够结合包含SEQ ID NO:1的肽的多肽或与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽。
在第二方面,提供了用于鉴定STAT3和SP1的相互作用的调节剂的方法,所述的方法包括:
(a)提供STAT3多肽;
(b)提供SP1多肽
(c)在受试化合物存在的情况下,使STAT3和SP1多肽接触;以及
(d)检测STAT3和SP1的结合;
其中受试化合物包含肽或其模拟物,所述肽与SEQ ID NO:1的肽有至少60%的序列同一性。
在第三方面,本发明提供了鉴定能够抑制食欲的化合物的方法,该方法包括筛选能结合包含SEQ ID NO:1的肽或结合与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的受试化合物。
在本发明的一些方面,STAT3和SP1的结合为复合体形成。
本发明的某些方法可涉及测试受试化合物是否介导STAT3 SP1介导的基因表达的步骤。
在第四方面,本发明提供了本发明的方法所鉴定的食欲抑制剂。
在第五方面,本发明提供了包含本发明的方法所鉴定的食欲抑制剂的药物。
在第六方面,本发明提供了鉴定STAT3和SP1间相互作用的调节剂的方法,所述的方法包括以下步骤:
(a)提供包含STAT3多肽、SP1多肽、FoxO1多肽和可操作地连接于报告基因的STAT3应答启动子的细胞;
(b)提供能够结合SEQ ID NO:1的肽的受试化合物;以及
(c)检测报告基因的表达。
本发明的方法可包括以下步骤:
(d)比较步骤(c)中的报告基因的表达和在受试化合物不存在的情况下的表达。
在第七方面,本发明的方法包括添加瘦素的步骤。
在第八方面,本发明提供了与SEQ ID NO:1有至少60%、至少75%或至少90%序列同一性的多肽。本发明的多肽可包含3-100个氨基酸或3-44个氨基酸。
在第九方面,本发明提供了SEQ ID NO:1的多肽的模拟物,该模拟多肽能够破坏STAT3和SP1间的相互作用。
在第十方面,本发明提供了用于制造抑制或刺激食欲的药物的多肽或模拟物。
筛选方法
本发明的方法可在体外或体内进行。当该方法在体外进行时,该方法可包括高通量筛选测定。
该方法所使用的受试化合物可从合成的组合肽文库获得或可为合成肽或肽模拟分子。
在本发明的方法中,STAT3和SP1可从哺乳动物提取物获得,从细菌、酵母或包括细胞系和昆虫细胞系在内的更高级哺乳动物真核细胞重组产生,或使用商购可获得的合成仪重新合成。在一方法中,STAT3和SP1为重组的。优选地,STAT3和SP1分子是人STAT3和SP1分子。
STAT3(signal transducer and activator of transcription,信号转导和转录激活因子)是52个氨基酸的转录因子,其响应细胞因子和生长因子而磷酸化(GenBank标识符(GenBank ID):AAK17196(人类);AAK17195(小鼠))。一旦磷酸化,STAT3二聚体化并易位至细胞核,在此处它充当转录因子。STAT3对包括瘦素和IL5在内的许多细胞因子、激素和其他的生长因子作出应答。本发明的方法利用STAT3多肽。本发明方法所用的STAT3多肽包括与SEQ ID NO:5有至少60%序列同一性的多肽,或包含SEQ ID NO:5多肽片段的多肽,或与SEQ ID NO:5片段有至少60%序列同一性的多肽。
SP1(specificity protein,特异性蛋白)是约785个氨基酸的转录因子,且包含锌指DNA结合结构域(GenBank标示符:AAC08527(小鼠);AAH43224(人类))。诸如POMC基因的某些基因的启动子含有SP1结合位点。本发明的方法所用的SP1多肽包括与SEQ ID NO:7有至少60%序列同一性的多肽,及包含SEQ ID NO:7多肽的片段的多肽,或其与SEQ ID NO:7的片段有至少60%的序列同一性。本发明方法的SP1多肽具有SP1 DNA结合活性。
优选地,在本发明方法中,STAT3多肽能够与SP1结合,且SP1多肽能够与STAT3结合。优选地,STAT3多肽能够与结合于诸如POMC启动子的启动子(SP1/启动子复合体)的SP1多肽结合。
本发明提供了鉴定能够调节STAT3和SP1相互作用的化合物的方法。调节相互作用指化合物能够减弱或增强STAT3和SP1的结合。
在本发明的方法中,提供了STAT3和SP1多肽,且添加受试化合物。在受试化合物存在的情况下检测STAT3和SP1多肽的结合。在一些情况下,检测结合包括检测结合的缺少。利用本发明方法,能够鉴定调节STAT3和SP1多肽相互作用和结合的受试化合物。
在所述的方法中,可以通过免疫学技术,包括免疫印迹、免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定结合。
在本发明的某些测定中,提供了包含(例如表达)STAT3和SP1多肽的细胞(如HEK293细胞)。在某些方法中,细胞还包含(例如表达)FoxO1多肽。将受试化合物添加至细胞,通过检测可操作地连接于STAT3 SP1可调型启动子的报告基因,如POMC,评估STAT3和SP1的相互作用。在一些实例中,报告基因是荧光素酶。在一些实例中,可操作地连接于STAT3 SP1可调型启动子的报告基因被稳定地或短暂地整合到细胞基因组中。在其他方法中,可操作地连接于STAT3 SP1可调型启动子的报告基因位于于载体中。
在本发明的某些方法中,提供了包含STAT3和/或SP1基因的载体。在一些方法中,提供了包含FoxO1基因的载体。载体可为可操作地连接有基因的表达载体。在某些方法中,将载体提供在细胞中。在其他的方法中,将STAT3和/或SP1和/或FoxO1基因稳定地整合到细胞基因组中。
在本说明书中,术语“可操作地连接”可包括这种情况:以使核苷酸序列的表达处于调节序列的影响或控制下的方式,共价连接所选择的核苷酸序列和调节核苷酸序列(例如启动子)。从而,如果调节序列能够实现形成部分或全部所选择的核苷酸序列的核苷酸序列的转录,则调节序列可操作地连接于所选择的核苷酸序列。如果合适,由此随后可将产生的转录物翻译成期望的蛋白或多肽。
在诸如高通量筛选的体外筛选中表现出活性的受试化合物可随后利用细胞在筛选测试,例如在暴露于候选调节剂的哺乳动物细胞中,并测试它们调节STAT3 SP1可调型基因表达的能力。
受试化合物
受试化合物可以许多方式中的一种调节或干扰STAT3和SP1的相互作用。在一方法中,化合物可通过结合一种分子直接调节相互作用,从而掩蔽相互作用位点。受试化合物优选包含与靶分子相互作用的肽或模拟该肽结构的有机化合物(模拟物)。
在一些情况下,受试化合物包含与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽。在一些实例中,所述肽与SEQ ID NO:1有超过65%、超过70%、超过75%、超过80%、超过85%、超过90%或超过95%的序列同一性。在一些情况下,受试化合物是SEQ ID NO:1肽的片段。
在其他情况下,受试化合物能够结合包含与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的多肽。能够通过本领域中已知的方法,包括免疫共沉淀或酵母双杂交筛选,鉴定能够结合多肽的受试化合物。此类受试化合物也能够结合FoxO1或结合与FoxO1有至少60%同源性的多肽。
任选地,本发明的受试化合物不是STAT3或SP1多肽或与STAT3或SP1多肽有高度序列同一性的肽。
通过测量其调节STAT3 SP1可调型基因表达的能力可测定受试化合物的调节作用。此类测定可包括(a)将候选物质给予受试细胞,优选哺乳动物细胞;和(b)测定受试化合物对STAT3 SP1可调型基因表达的作用。
结合亲和力
结合亲和力是两个组分相互作用程度的度量。利用Cheng和Prusoff方程式(Cheng,Y.,Prusoff,W.H.(1973)Biochem.Pharmacol.22,3099-3108)自IC50计算亲和结合力(Ki),
Ki=IC50÷{1+([放射性配体]/Kd)}
其中,通过对与X轴的log[所用蛋白的摩尔浓度]相比的X轴的特异性结合%作图来测定IC50(取代50%结合配体的抑制剂的浓度)值,且Kd为放射性配体与受体的结合亲和力。
本发明所提供的某些调节剂对SEQ ID NO:1肽具有高Ki。优选地,此类调节剂对包含SEQ ID NO:1的多肽具有的Kj比那些包含SEQ ID NO:1的多肽对STAT3具有的Kj更高。此类调节剂可用于治疗瘦素抗性和肥胖。
干扰
化合物通过相互作用的干扰涉及无论是部分地还是全部地,分子中断、破坏或阻止STAT3和SP1的正常相互作用的能力,而且可通过一种或多种正常相互作用的分子的活性水平的改变或通过测定正常相互作用的分子结合的存在、缺乏或部分存在或缺乏来测量。
调节
调节描述化合物改变相互作用的物质或分子间相互作用的结果的能力。因此,可通过活性水平,例如结合相互作用的伴侣分子的能力的变化(增加或减少)来检测调节。调节化合物对有关活性或结合可具有增强作用或抑制作用。
活性
给定物质或分子的活性可通过测定活性来测量,例如通过光子计数能够测量荧光素酶活性。活性可以是给定物质,例如包含SEQ ID NO:1的调节肽与另一分子的相互作用或结合的功能。
多肽
本发明的多肽包括与SEQ ID NO:1有至少60%同一性且包含FoxO1的STAT3结合位点的多肽。本发明的多肽可包含少于44个氨基酸(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43个氨基酸),但是保持结合STAT3的能力,且与SEQ ID NO:1多肽保持至少60%的序列同一性。合适的多肽的长度可高达250个氨基酸但是优选长度为200个氨基酸或更少,或更优选下列长度之一:3-15、15-30、30-50、50-75、75-100、100-125、125-150、150-175、175-200或200-225个氨基酸。
在本说明书中,调节多肽可以为具有氨基酸序列的任何肽、多肽或蛋白,该氨基酸序列与SEQ ID NO:1或能够与STAT3结合的这一序列的片段有指定程度的序列同一性。指定程度的序列同一性可以为至少60%至100%的序列同一性。更优选地,指定程度的序列同一性可以是至少65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性中的一个。
序列同一性
在某些方面,本发明涉及这样的化合物,该化合物为分离的肽/多肽,其包含与给定的序列有至少60%序列同一性的氨基酸序列。
序列同一性百分比(%)被定义为,在比对序列并且如果需要引入空位以实现最大序列同一性,且不将任何保守取代作为序列同一性的一部分后,候选序列中与给定序列(以SEQ ID No.表示)中残基相同的氨基酸残基的百分比。优选在各自序列的全长范围内计算序列同一性。
如果比对的序列的长度不同,那么较短的比较序列的序列同一性可以在较长的给定序列的全长范围内测定,或者如果比较序列比给定的序列长,那么比较序列的序列同一性可以在较短的给定序列的全长范围内来测定。
例如,如果给定的序列包含100个氨基酸而候选序列包含10个氨基酸的情况下,那么候选序列与给定的序列的全长只能有最大10%的同一性。在下列的实例中对此作了进一步说明。
(A)
给定的序列:XXXXXXXXXXXXXXX(15个氨基酸)
比较序列:XXXXXYYYYYYY(12个氨基酸)
给定的序列可以为,例如编码FoxO1结合位点的序列(例如SEQ ID NO:1)。
%序列同一性=比对后相同匹配的氨基酸残基的数量除以较长的给定的序列中氨基酸残基的总数量,即(5/15)×100=33.3%。
如果比较序列长于给定的序列,那么可以在给定的序列的全长范围内来测定序列同一性。例如:
(B)
给定的序列:XXXXXXXXXX(10个氨基酸)
比较序列:XXXXXYYYYYYZZYZZZZZZ(20个氨基酸)
再次,给定序列可以为,例如编码FoxO1结合位点的序列(例如SEQ ID NO:1)。
%序列同一性=比对后相同的氨基酸数量除以给定的序列中氨基酸残基的总数量,即(5/10)×100=50%。
用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对能够以本领域技术人员已知的各种方式实现,例如,利用公众可获得的计算机软件,如ClustalW 1.82.T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件。当使用此类软件时,优选使用例如空位罚分(gap penalty)或延伸罚分(extension penalty)的默认参数。ClustalW 1.82的默认参数为:蛋白空位开放罚分(Protein Gap Open Penalty)=10.0,蛋白空位延伸罚分(Protein Gap Extension Penalty)=0.2,蛋白矩阵=Gonnet,蛋白/DNA ENDGAP=-1,蛋白/DNA GAPDIST=4。
核酸序列的同一性可以以相似的方式进行测定,该方式包括比对序列,并且如果有必要,引入空位,以实现最大序列同一性,且在各自序列全长范围内计算序列同一性。如果比对的序列的长度不同,序列同一性可如上文所述和如实例(A)和(B)所示进行测定。
肽衍生物
本发明的肽包括SEQ ID NO:1所编码的FoxO1结合肽的片段和衍生物。同样,尽管本发明方法中所用的组分可以包含全长的蛋白序列,但这并不总是必需的。作为可选择方案,可以使用全长多肽的同源物、突变体、衍生物或片段。
衍生物包括给定的全长蛋白序列的变体,而且包括与该全长蛋白有实质氨基酸序列同一性的天然存在的等位基因变体和合成的变体。
蛋白片段的长度可高达5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基。最小的片段长度可为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或30个氨基酸或3-30间的氨基酸的数量。
突变体与相应的野生型多肽相比,可包含至少一个添加、取代、倒位和/或缺失。突变体可表现出改变的活性或特性,例如结合。
突变可发生在SEQ ID No:1中,而且含有此类片段的组分可满足调节突变体活性以完全或部分地恢复野生型多肽活性的目的。
衍生物也可以包含天然变异或多态性,其可存在于个体间或家族成员间。所有此类衍生物都包括在本发明的范围内。仅作为实例,可在此类多态性中发现的保守取代可存在于以下组内的氨基酸之间:
(i)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸
(ii)谷氨酸和天冬氨酸;
(iii)精氨酸和亮氨酸;
(iv)天冬酰胺和谷酰胺;
(v)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸;
(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
衍生物也可以是融合蛋白的形式,其中通过标准克隆技术使蛋白、片段、同源物或突变体与另一多肽融合,该多肽可包含DNA结合结构域、转录激活结构域或适用于亲和纯化的配体(例如谷胱甘肽-S-转移酶或六个连续的组氨酸残基)。
FoxO1的衍生物包括包含与SEQ ID NO:1有实质序列同一性的序列部分且能够结合STAT3的片段。
模拟物
已知的药学上有活性的化合物的模拟物的设计,是基于“先导”化合物研发药物的已知方法。如果活性化合物合成困难或昂贵或当它不适用于特定的给药方法,例如一些肽可能是口服组合物的不适宜的活性剂,因为它们倾向于被消化道中的蛋白酶迅速降解,该设计可能是令人期待的。模拟设计、合成和测试通常用于避免针对靶特性的大量分子的随机筛选。
自具有给定的靶特性的化合物设计模拟物,通常采用几个步骤。首先,确定在决定靶特性中关键和/或重要的化合物的特定部分。在肽的情况下,通过系统地改变肽中的氨基酸残基,例如通过依次取代每个残基能够完成这一步骤。这些构成化合物的活性区域的部分或残基称为它的“药效团”。
一旦发现药效团,就可以根据它的物理性质,例如立体化学、结合、大小和/或电荷,利用来自于一系列资源的数据,例如光谱学技术、X射线衍射数据和核磁共振(NMR),对其结构进行模拟。计算分析、相似性作图(它模拟药效团的电荷和/或体积,而不是原子间的结合)和其他的技术都能够用于这一模拟过程。
在这一方法的一个变体中,模拟配体的三维结构和它的结合伴侣。这在配体和/或结合伴侣改变结合构象的情况下尤其有用,从而允许该模型在模拟物设计中考虑到这一点。
然后选择模板分子,模拟药效团的化学基团可以移植于所述模板分子之上。能够便利地选择模板分子和移植到其上的化学基团,以便于模拟物易于合成,很可能是药学上可接受的,而且在体内不会降解,同时保留先导化合物的生物学活性。然后筛选通过这一方法发现的一种或多种模拟物,以观察它们是否具有靶特性,或它们将这一特性显示到什么程度。然后可进行进一步的最优化或修饰,以得到一种或多种用于体内或临床测试的最终模拟物。
关于本发明,已根据所述的方法鉴定了肽或肽模拟物,该方法还可包括修饰肽结构的步骤,随后任选地重复接触和测定步骤。如果需要,肽或肽模拟物的这一修饰过程可重复多次,直到鉴定出对结合亲和力具有理想的效应或效应水平的肽。
所采用的修饰步骤可包括截短肽或肽模拟物的长度(这可涉及合成长度较短的肽或肽模拟物),取代一个或多个氨基酸残基或化学基团,和/或化学性修饰肽或肽模拟物以增加稳定性、抗降解性、跨细胞膜转运和/或对从机体清除的抗性。
治疗应用
本发明的化合物或通过本发明的方法鉴定的化合物可用于刺激或抑制需要治疗的动物的食欲。优选地,经历治疗的动物为需要此类治疗的人类患者。更具体而言,所述化合物可用于刺激或抑制食欲。
STAT3和SP1间相互作用的增强剂可用于治疗肥胖和瘦素抗性,且通过增强STAT3与SP1/启动子复合体的相互作用,并因此增强瘦素可调型基因如POMC的表达,而用于食欲抑制。
STAT3 SP1相互作用的抑制剂可用于刺激食欲。抑制剂可用于治疗厌食症和其他进食病症。STAT3 SP1相互作用的抑制剂损害STAT3结合SP1/启动子复合体的能力,并因此阻止STAT3促进响应瘦素的基因,例如POMC的表达。
本发明的化合物可配制为临床用途的药物组合物用,而且可包含药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂。所述组合物针对可包括注射在内的局部、胃肠外、静脉内、肌肉内、鞘内、眼内、皮下、口服、吸入或透皮给药途径而配制。可注射的制剂可包含在无菌或等渗介质中的所选择的化合物。
配制药学上有用的组合物和药物
根据本发明的方法,也提供了药学上有用的组合物的生产,该生产基于如此鉴定的物质或受试化合物。除了本文所述方法的步骤外,此类生产方法还包括一个或多个选自以下的步骤:
(a)鉴定和/或表征所选择的物质或受试化合物的结构;
(b)获得所述物质或化合物;
(c)使所选择的物质或化合物与药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂混合。
例如,本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗瘦素抗性和肥胖的药物组合物的方法,根据本文所述的一种或多种方法,该方法包括鉴定促进或抑制STAT3和SP1相互作用的化合物或物质,还包括一个或多个以下步骤:
(i)鉴定所述化合物或物质;和/或
(ii)通过使所选择的物质或其前体药物与药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂混合来制备药物组合物。
通过此类方法配制的某些药物组合物可包含所选择的物质的前体药物,其中所述前体药物在人体内或动物体内可转化成期望的活性剂。在其他情况下,所述活性剂可存在于如此生产的药物组合物中,且可以以生理学上可接受的盐的形式存在。
附图简要说明
现将参考附图阐明本发明原理的实施方案和实验,其中:
图1.基于细胞系统中POMC启动子活性的STAT3介导的瘦素调节。
(A)图(上方图板)绘示在重组HEK293细胞中稳定表达的瘦素受体构建体。管状物(solenoid)代表质膜(PM)。OBRa和OBRb共享相同的细胞外序列,包括瘦素结合位点(靠近PM的阴影区)。“Y”表示涉及瘦素信号传导的酪氨酸残基,而且只存在于OBRb中。这两种构建体在它们的C末端是Myc标记的(黑色区域)。下方图板显示瘦素受体在293细胞系中的表达。通过使用瘦素偶联的CNBR-激活的琼脂糖凝胶珠(Sepharose beads)浓缩来源于293-OBRa、293-OBRb和对照的裂解产物并通过使用Myc抗体检查它们的表达。(B)125碘-瘦素与对照、293-OBRa或293-OBRb细胞混合,同时添加过量未标记的瘦素(白色柱)或不添加过量未标记的瘦素(灰色柱)。洗涤细胞并计算放射性。结果为平均值±SEM,而且代表三个独立的实验。*p<0.01。(C)用pXJ40-Flag-mSTAT3转染293-OBRa和293-OBRb。瘦素或模拟处理30分钟后,裂解细胞并进行8%SDSPAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。磷酸-STAT3和泛-STAT3抗体这两种抗体用于蛋白检测。注意只在瘦素处理的293-OBRb细胞中检测到磷酸-STAT3信号,而泛-STAT3信号在所有的样品中都是明显的。(D)用pXJ40-Flag-mSTAT3、pGL3-POMC和pCMV-Renilla转染293-OBRa或293-OBRb。瘦素处理20小时后,收获细胞且将其裂解,并测量裂解产物的萤火虫荧光素酶活性且将其标准化为海肾荧光素酶活性。结果为平均值±SEM,而且代表三个独立的实验。*p<0.01。
图2.FoxO1抑制瘦素诱导的POMC启动子活性。
(A)用相同数量的pXJ40-Flag-mSTAT3和pGL3-POMC,加上数量递增的pcDNA3-Flag-mFoxO1转染293-OBRb细胞,如POMC和STAT3的实心长条(solid bar)和FoxO1的实心阶梯(solid staircase)所指示的。代替pGL3-POMC转染启动子较少的pGL3基础(promoter-less pGL3-basic)作为阴性对照(泳道1和2)。瘦素处理20小时后,收获细胞利用抗磷酸-STAT3、泛-STAT3或FoxO1的抗体进行免疫印迹。将微管蛋白包括在内,用于指示所有样品间的同等加载。注意FoxO1的表达随着转染的pcDNA3-Flag-mFoxO1的量递增成比例地增加。(B)将如在(A)中同样处理的细胞在被动裂解缓冲液中裂解,而且测量它们的萤火虫荧光素酶活性且将其标准化为海肾荧光素酶活性。该测定以一式三份,重复3次。结果代表每一此类测定的平均值±SEM。
图3.高水平的FoxO1不干扰STAT3磷酸化或STAT3易位至细胞核。
(A)用相同数量的pXJ40-Flag-mSTAT3和pGL3-POMC,加上数量递增的pcDNA3-Flag-mFoxO1转染293-OBRb细胞,如POMC和STAT3的实心长条和FoxO1的实心阶梯所指示的。瘦素处理后30分钟,在低渗缓冲液中裂解细胞,并随后进行离心和高盐处理以分离细胞核部分和细胞质部分,如实验方法中所述。基于Bradford测量,加载等量的细胞核蛋白,并通过微管蛋白信号证明(下方图板)。免疫印迹显示用抗磷酸-STAT3的抗体(上方图板)或抗FoxO1的抗体(中间的图板)探测的核蛋白。(B)用pXJ40-Flag-mSTAT3单独转染293-OBRb细胞(a,c)或用pXJ40-Flag-mSTAT3和pcDNA-Myc-mFoxO1一起转染293-OBRb细胞(b,d)。瘦素(c,d)或模拟物(a,b)处理后,将细胞固定、渗透化并用抗STAT3(绿色)和FoxO1(红色)的抗体探测。在没有瘦素处理的情况下,STAT3信号大部分是细胞质的,但是在瘦素处理的样品中STAT3信号集中于细胞核。
图4.介导POMC转录活性瘦素调节的POMC启动子中的必需DNA
元件(-646至+65)。
(A)野生型(WT)POMC启动子和缺失突变体的图。所有突变体的细节描述在图8中。(B)用pXJ40-Flag-mSTAT3、pGL3-POMC和pCMV-Renilla转染293-OBRb细胞。瘦素处理后20小时,在被动裂解缓冲液中裂解细胞。测量萤火虫荧光素酶活性且将其标准化为海肾荧光素酶活性。结果表示为平均值±SEM,而且代表三份至少三个独立实验。
图5.SP1结合位点的突变消除POMC启动子活性的瘦素调节。
(A)pGL3-POMC构建体的图显示介导POMC转录活性的瘦素调节的必需DNA元件(-138至-88)的序列。如实验方法中所述,合成含有推断的SP1结合位点(探针1)或点突变(探针2)的EMSA探针。基础突变用红色高亮显示。(B)利用表达Flag-mSTAT3的293-OBRb的细胞核提取物,进行探针1或探针2的EMSA。核蛋白结合探针1(箭头,泳道1和2),但未结合探针2(泳道3和4)。蛋白结合被SP1抗体特异性抑制(泳道5和6)。加载来自于两个独立的实验的样品,以举例说明重复性。(C)WT POMC启动子和SP1结合位点突变体的图。突变体的细节描述在图8中。基础突变用红色高亮显示。(D)用pXJ40-Flag-mSTAT3和pCMV-Renilla,加上pGL3-POMC、突变体12或13转染293-OBRb细胞。瘦素处理后20小时,在被动裂解缓冲液中裂解细胞。测量萤火虫荧光素酶活性,并将其标准化为海肾荧光素酶活性。结果表示为平均值±SEM,而且代表三份至少三个独立实验。
图6.FoxO1通过结合STAT3抑制STAT3-SP1复合体形成。
(A)用pXJ40-Flag-mSTAT3转染293-OBRb细胞。瘦素或载体处理后,在裂解缓冲液中裂解细胞,用SP1抗体或对照IgG孵育细胞裂解产物。免疫共沉淀(co-IP)样品中所使用的5%的细胞裂解产物作为进料(input)加载。(B,C)用pXJ40-Flag-mSTAT3和pcDNA3-Myc-mFoxO1转染293-OBRb细胞。瘦素处理后,在裂解缓冲液中裂解细胞。用1μg的抗Flag(B)、抗Myc(C)或对照IgG孵育细胞裂解产物。利用或者抗Myc(B)或者抗Flag(C)的抗体的免疫印迹(IB)显示STAT3-FoxO1相互作用。(D)如实心长条(STAT3)和阶梯(FoxO1)所指示的用相同数量的pXJ40-Flag-mSTAT3和递增数量的pcDNA3-Myc-mFoxO1转染293-OBRb细胞。瘦素处理后30分钟,自这些细胞中分离核蛋白并利用Flag抗体进行IP(免疫沉淀)。抗-Myc的免疫印迹或抗-SP1的IB显示随着FoxO1数量的递增SP1数量减少。
图7.瘦素调节POMC启动子活性和其通过FoxO1抑制的潜在机制。
(A)一旦瘦素与OBRb结合,STAT3就磷酸化。激活的STAT3易位至细胞核并通过它与SP1-POMC启动子复合体的相互作用激活POMC启动子活性。(B)随着FoxO1表达数量的增加,FoxO1在细胞核中结合磷酸化的STAT3,而且阻止STAT3与SP1-POMC启动子复合体相互作用,因此抑制STAT3介导的POMC启动子的瘦素激活。
图8.DNA构建体
本研究中所用的DNA构建体,包括基于pGL3-POMC的截短和突变构建体。
图9.引物
图8中所描述的DNA构建体产生过程中所用的引物。
图10.产生以便鉴定FoxO1上的STAT3结合位点的FoxO1构建体
FoxO1是652个氨基酸的蛋白。制备一系列C末端缺失的构建体并通过免疫共沉淀测试它们与STAT3的相互作用(+或-指示免疫共沉淀中构建体是否与STAT3结合)。FoxO1(1-167)和其他更长的FoxO1突变体能结合STAT3,但FoxO1(1-123)不能与STAT3结合。这表明123-167间的区域对STAT3相互作用是重要的。FoxO1(1-123)-(168-652)是缺失构建体,其不含有在以前的C末端缺失构建体中所鉴定的区域。作为对照,我们还产生了不含有168-241间区域的FoxO1突变体,FoxO1(1-167)-(242-652)。使用以上两种缺失构建体的Co-IP实验证实了C末端缺失结果,即对应于氨基酸124-167的区域对于STAT3相互作用是必需的。
图11.序列
本申请所述的多肽的序列。
发明的详细描述
本发明一个或多个实施方案的细节通过实施例在下文所附描述中进行了阐明,包括发明人为实施本发明所考虑的本发明的最佳模式的具体细节。对本领域中技术人员所显而易见的是,本发明可不受这些具体细节的限制而实施。
实施例
实验方法
DNA构建体:POMC启动子-荧光素酶构建体(pGL3-POMC)由Domenico Accili博士(Columbia University,USA(美国哥伦比亚大学))惠赠,pcDNA3-Flag-mFoxO1由Fukamizu博士(日本)惠赠,pN3-SP1 FL-complete由Suske博士(德国)惠赠。早先已经描述了pXJ40-flag-STAT3(20)。表1和2描述了本研究所用的所有其他DNA构建体和引物,包括基于pGL3-POMC的截短和突变构建体。
细胞培养和荧光素酶测定:早先已描述了超表达OBRa(293-OBRa)或OBRb(293-OBRb)的Flp-InHEK293稳定细胞系(21)。在37℃下在具有5%CO2的培养箱中,将细胞培养于含有10%的胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏基本必需培养基(DMEM,Invitrogen)中。平板接种1天后,利用Fugene 6(Roche),用相关的DNA构建体转染细胞。16小时后,在用重组瘦素(Invitrogen)或媒介(vehicle)将它们处理20小时之前,将转染细胞血清饥饿5小时。然后用PBS洗涤细胞并且在包括在双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)中的200μl的1×被动性裂解缓冲液中裂解。在酶标仪(aluminometer,分子装置)上测量细胞提取物的荧光素酶活性。使萤火虫荧光素酶活性针对海肾荧光素酶活性标准化。
293稳定细胞系中OBRa和OBRb的检测:收获293-OBRa和293-OBRb细胞并用裂解缓冲液裂解,且用瘦素偶联的CNBR激活的琼脂糖凝胶珠(Sigma)孵育过夜。用裂解缓冲液重复洗涤后,将带有沉降蛋白的珠进行SDS-PAGE。通过使用Myc抗体检查瘦素受体表达。
瘦素与稳定的HEK293细胞结合:如早先所述,在6孔板中进行(21)该所述结合。简单地说,将293-OBRa或293-OBRb细胞培养到约90%融合,并用PBS洗涤。4℃下,在补充有1%(w/v)牛血清蛋白(BSA)的PBS(组分(fraction)V,Sigma)的1ml终末体积中,将细胞仅与约60000cpm的鼠重组125I-瘦素(Perkin-Elmer)或与带有过量未标记的瘦素的125I-瘦素(2μg/孔)一起孵育。孵育结束时,通过两遍PBS洗涤移除未结合的125I-瘦素。然后添加1ml的1N NaOH,并利用Wizard 1470自动γ计数器(Wizard 1470Automatic Gamma Counter,Perkin-Elmer)测量裂解产物中的放射性。
自293细胞制备细胞核提取物:将瘦素或媒介处理后的细胞洗涤两次并收集于冷PBS中。将细胞悬浮液以1300rpm离心5分钟。由此得到的粒状沉淀用低渗缓冲液(20mM HEPES pH 7.9、10mM KCl、1mM EDTA、1mM Na3VO4、10%丙三醇、0.2%NP-40、20mM NaF、1mM DTT和1×完全蛋白酶抑制剂(Roche))重悬浮,并且在4℃下摇动10分钟。然后将混合物以13000rpm的速度离心30秒,并添加高盐缓冲液(没有NP-40的低渗缓冲液中含20%丙三醇、420mM NaCl、1mM Na3VO4、1mM DTT和1×完全蛋白酶抑制剂),以重悬浮粒状沉淀。摇动40分钟后,在4℃下以13000rpm离心混合物。收集上清液作为细胞核提取物。Co-IP:1)对于STAT3-SP1相互作用,用pXJ40-Flag-mSTAT3转染293-OBR细胞,随后用瘦素处理。自细胞制备细胞核提取物并与SP1抗体一起孵育,以进行免疫沉淀(IP)。利用磷酸-STAT3抗体(Cell Signaling)进行免疫沉淀的免疫印迹。每一免疫共沉淀(coIP)样品中所用的5%的细胞裂解产物作为进料加载。2)对于STAT3-FoxO1相互作用,将用pXJ40-Flag-mSTAT3和pcDNA3-Myc-mFoxO1的表达载体转染的293-OBRb细胞进行血清饥饿,并用瘦素(50nM)处理30分钟,然后在裂解缓冲液(20mM Tris-Cl pH7.5、150mM NaCl、1%Triton-X-100、10mM NaF、1m MEDTA、1mM Na3VO4、1mM PMSF,补充有蛋白酶抑制剂)中裂解。分别用1μg Flag(Sigma)、Myc(Santa Cruz Biotechnology)抗体或对照IgG与约500μg的细胞裂解产物一起孵育2小时,随后用蛋白A+G琼脂糖凝胶珠(Sigma)进行1小时IP。将免疫沉淀物在裂解缓冲液中洗涤4次,并进行SDS-PAGE和用抗Flagor Myc抗体进行免疫印迹。每一coIP样品中所用的5%的细胞裂解产物作为进料加载。3)对于FoxO1对STAT3-SP1相互作用的作用,将pXJ40-Flag-mSTAT3和数量递增的pcDNA3-Myc-mFoxO1转染于293-OBRb细胞中。瘦素处理后收集细胞用于细胞核分级。通过Flag抗体的IP和Myc(针对STAT3)及SP1抗体的IB检查细胞核提取物中的STAT3与SP1的结合。
免疫印迹:在含有1mM PMSF的1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling)中裂解细胞。在冰上将裂解产物孵育20分钟,同时温和摇动,并在4℃下以20000×g离心10分钟。通过SDS-PAGE和利用以下抗体的免疫印迹分析等量的样品:抗磷酸-STAT3抗体(Cell Signaling Technology);抗泛-STAT3、FoxO1、SP1和Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology);抗Flag抗体(Sigma)和抗Myc抗体(polyclonal,Upstate)。EMSA:使两对寡核苷酸即野生型(GAG GCC CGC CGC CCC CCT和GAA GGGGGG CGG CGG GC)和SP1结合位点突变序列(GAG GCT TGT TGC CCC CCT和GAA GGG GAA CAA CGG GC)退火,且通过klenowexo-(NEB)将约100ng探针用50μCi的32P dCTP标记。标记后,通过使用G-50柱纯化探针,并用LS6500多功能闪烁计数器(LS6500 Multi-Purpose Scintillation Counter,Beckmam Coulter)测量放射性。室温下,将5μg核蛋白与20000cpm的探针在总体积为12μl的DNA-蛋白上样缓冲液(50mM NaCl、10mM TrisCl pH 7.5、0.5mM EDTA、1mM MgCl2、4% Ficoll、0.5mM DTT和1×完全蛋白酶抑制剂)中一起孵育15分钟。在0.5×TBE中通过4%PAGE凝胶溶解混合物,并在80℃下通过使用凝胶干燥仪(Bio-rad)干燥凝胶2小时。在-80℃下将X射线胶片(Kodak)暴光48小时,然后显影。
免疫细胞化学:将293-OBRb细胞接种在聚赖氨酸包被的盖玻片上1天后,用相关的质粒转染它们。瘦素或模拟物处理后,用PBS洗涤细胞,将其在含有4%多聚甲醛的PBS中固定10分钟,在含有0.5%triton X-100的PBS中渗透10分钟,并在室温下,在ICC缓冲液(PBS中含3%BSA、3%羊血清和0.15% triton X-100)中封闭1小时。然后通过使用STAT3和FoxO1抗体和荧光共轭二抗(Invitrogen)探测细胞。将盖玻片安装在载玻片上并密封,以通过共聚焦显微术进行观察。
统计分析:将数据表示为平均值±SEM。利用针对独立数据的双尾斯氏t检验(two-tailed Student′s t-test)进行数据的比较。显著性界限设置为p<0.05。
实施例1:经由STAT3激活的POMC启动子活性的瘦素调节
为理解STAT3信号传导是如何在其激活的下游受到抑制的,建立基于细胞的系统,以研究STAT3如何介导基因表达的瘦素调节。基于细胞的系统包括OBRb的稳定表达和萤火虫荧光素酶在POMC启动子下的短暂表达。
之所以选择POMC启动子来研究STAT3介导的瘦素调节,是因为:1.POMC是受瘦素和STAT3调节的关键的使食欲减退的神经肽(19)。2.在瘦素抗性的DIO小鼠中,POMC表达降低(18)。
基于细胞的系统的建立
瘦素主要通过其借助于结合并激活长形式而不是其他形式的瘦素受体OBRb的中心作用,调节体内能量平衡(5,6)。建立稳定表达OBRb的HEK293细胞系,作为研究POMC启动子活性的瘦素调节的体外系统。用超表达OBRa的HEK293细胞(293-OBRa)作为阴性对照。在这些细胞系中,只有带有C末端Myc标记的单拷贝基因构建体可整合于基因组中,以确保各自受体的表达水平一致。
因为稳定细胞系中受体的表达水平不足以用于通过蛋白印迹(Western blotting)从细胞裂解产物中直接检测,所以通过使用瘦素偶联的珠浓缩蛋白。只有在各自的稳定细胞系而不是对照中才能够检测到OBRa或OBRb(图1A,下方图板)。为进一步证实OBRa或OBRb的表达和验证它们在这些细胞系细胞表面上的正确定位和定向,在过量的未标记的瘦素存在或不存在的情况下,将该细胞与125I-标记的瘦素一起孵育。125I-标记的瘦素能够以相似的程度结合293-OBRa和293-OBRb这两者(图1B)。在对照细胞中或在过量未标记的瘦素存在的情况下检测不到125I-标记的瘦素的放射性,其指示瘦素结合(图1B)。
将包含荧光素酶基因由POMC启动子驱动的质粒通过短暂地转染引入到293-OBRb和293-OBRa对照中以测试293-OBRb细胞是否能够用作体外研究启动子活性的瘦素调节的系统。我们使用含有POMC基因的-646至+65的POMC启动子,因为完全的启动子活性仅需要转录起始位点上游的480bp DNA片段(13,22)。
瘦素处理仅在293-OBRb细胞中诱导STAT3磷酸化(图1C)。同样,瘦素刺激的荧光素酶活性仅在293-OBRb细胞中观察到,在293-OBRa细胞中观察不到(图1D),这与早先只有OBRb能够进行瘦素信号转导的发现是一致的(6)。总之,293-OBRb是合适的用于研究通过STAT3-介导的瘦素信号传导调节POMC启动子活性的系统。
实施例2:FoxO1抑制STAT3-介导的POMC活性
在瘦素抗性的早期,磷酸-STAT3的水平在高脂肪饮食的小鼠中与在正常饮食的小鼠中是相当的,这表明瘦素信号传导的损伤位于STAT3激活的下游(10)。为模拟瘦素抗性的早期,其中STAT3磷酸化未减少,用可导致最高水平的瘦素诱导的POMC启动子激活的数量的STAT3转染293-OBRb细胞(数据示出)。
在恒定的STAT3水平的背景上引入数量递增的FoxO1 cDNA(图2A),以测试FoxO1是否能够干扰瘦素诱导的POMC启动子活性。FoxO1表达水平与用于转染的cDNA数量的递增成比例的增加(图2A)。尽管瘦素诱导的STAT3磷酸化不受FoxO1表达递增的影响,但是POMC启动子活性的瘦素调节,如荧光素酶活性所指示,在高表达水平的FoxO1下被消除(图2B)。当引入数量递增的类似大小的对照蛋白时,POMC启动子活性的瘦素调节不受影响(数据未示)。这些数据证明,高水平的FoxO1能够干扰瘦素信号传导,且表明FoxO1在STAT3激活的下游步骤发挥作用。
实施例3:FoxO1抑制STAT3在细胞核中的作用。
为进一步描述递增的FoxO1在哪一个步骤影响瘦素信号传导,我们测试了瘦素激活后FoxO1是否抑制STAT3易位至细胞核。用在恒定的STAT3水平的背景上数量递增的FoxO1转染293-OBRb细胞,并通过分级分离细胞核和细胞质成分。正如预期的,FoxO1蛋白水平在细胞核部分中随着FoxO1 cDNA数量的递增而增加(图3A,第二图版);而同时不管FoxO1表达水平是多少,磷酸化的STAT3在细胞核中保持在同一水平上(图3A,第一图版)。为使FoxO1对瘦素诱导的STAT3激活和易位至细胞核的作用直接形象化,我们进行免疫细胞化学,且在只表达STAT3的或表达STAT3加上FoxO1的293-OBRb细胞上进行共聚焦显微术。在没有瘦素刺激的情况下,STAT3信号大部分是细胞质的(图3B,图板a和b),但是在瘦素处理的样品中STAT3信号集中在细胞核中(图3B,图板c和d)。细胞核中STAT3信号所指示的STAT3易位至细胞核的程度,在具有FoxO1的细胞和无FoxO1的细胞间是不能辨别的(图3B,图版c和d)。这些数据表明,FoxO1既不影响瘦素诱导的STAT3磷酸化,也不影响随后的STAT3易位至细胞核,而且表明FoxO1介导的抑制POMC启动子活性的瘦素调节发生在STAT3易位至细胞核的下游,即高水平的FoxO1阻止在细胞核中STAT3激活POMC启动子。
实施例4:用于瘦素诱导的POMC启动子活性的必需DNA片段
为理解FoxO1如何抑制STAT3介导的POMC启动子激活,研究STAT3和POMC启动子间相互作用的模式。在pGL3-POMC(WT,图4A)背景上制备一系列在POMC启动子区具有缺失的突变体(突变体#1-11,图4A),以确定STAT3介导的POMC启动子活性的瘦素激活所必需的序列。将突变构建体,连同pGL3-POMC一起,分别引入到293-OBRb细胞,并测定瘦素处理或瘦素未处理的各种POMC启动子构建体的荧光素酶活性。无-138和-88(#2,6和8)间DNA片段的缺失突变体导致POMC启动子活性的瘦素调节的损失,而所有含有这一片段的突变体仍维持瘦素调节,突变体其包括只含有这一DNA片段的突变体#11(-138至-88),所述片段直接与POMC启动子TATA盒上游融合(图4B),这表明对瘦素增强POMC启动子活性关键的DNA结合元件位于自转录起始位点上游的-138和-88bp间。
实施例5:SP1结合元件是POMC启动子活性所必需的
为鉴定负责正常瘦素应答的POMC启动子的DNA片段,研究了POMC启动子的结构。
序列分析显示-138和-88间的DNA元件含有SP1的共有序列结合序列(consensus binding sequence)(图5A),即存在于大多数细胞类型中的组成性转录因子(23)。为证实推断的SP1结合位点是否与SP1相互作用,合成对应于原始序列的探针1和含有推断的SP1结合位点中的突变的探针2(图5A),并对来自293-OBRb细胞的细胞核提取物进行EMSA。核蛋白特异性地与探针1但不结合探针2,而且与探针1的结合可被SP1抗体(图5B)抑制,而不被STAT3或FoxO1抗体特异性抑制(数据未示)。这些数据表明结合的核蛋白是SP1,且SP1和探针1形成特定复合体。为检查SP1结合位点在POMC启动子活性中的潜在功能,生成突变体#12和#13,其在SP1结合位点和相邻序列内含有点突变(突变体#12)或只在SP1结合位点内含有点突变(突变体#13)(图5C)。对这些293-OBRb细胞中的突变体的功能性分析显示,这两种突变体的启动子活性及它们通过瘦素的调节被消除(图5D),这表明瘦素介导的POMC启动子的转录激活依赖SP1。
实施例6:瘦素介导的POMC启动子活性需要STAT3和SP1的直接
相互作用。
STAT3结合共有序列在-138和-88间DNA元件中的缺少表明,POMC启动子活性的STAT3调节通过除了直接的STAT3-DNA相互作用之外的方式,即STAT3通过中间蛋白发挥介导瘦素作用的功能。因为瘦素诱导的POMC启动子激活依赖于SP1,我们假设STAT3通过它与SP1的相互作用调节POMC启动子。利用SP1抗体的Co-IP导致在来自瘦素处理的样品而不是在对照的293-OBRb细胞中产生丰富的磷酸-STAT3信号,而对照抗体未降低来自瘦素处理的细胞或对照细胞中的磷酸STAT3(图6A)。这些数据表明SPA1能够特异性结合磷酸STAT3,还表明STAT3可通过SP1作用,介导POMC启动子活性的瘦素调节。
讨论
早先的研究将两个推断的STAT3结合位点(-361至-353,和-76至-68)和一个FoxO1结合位点(-375至-370)与POMC表达连系在一起(13,22)。然而,在本研究中,这些STAT3结合位点(突变体1,4和9,图4)或FoxO1结合位点(突变体4,图4)的缺失对POMC启动子活性的瘦素调节影响很小。而且,SP1,而不是STAT3或FoxO1,能够与瘦素调节所必需的51bpDNA片段形成复合体,这表明磷酸化的STAT3通过需要SP1-POMC启动子复合体而不是直接的STAT3-POMC启动子相互作用的机制增强POMC启动子活性。SP1是组成性转录因子,而且据报道可作为STAT3调节基因表达的中间体发挥作用(30-32),例如STAT3通过SP1-DNA复合体相互作用介导IL-6诱导的VEGF启动子活性(30)。连同本研究一起,这些研究提示了在激素/细胞因子信号传导中已确立的直接的STAT3-DNA相互作用的可选机制,即STAT3可通过其与SP1-DNA复合体的相互作用调节基因表达(图7A)。
实施例7:FoxO1抑制STAT3-SP1相互作用。
通过FoxO1抑制STAT3介导的POMC启动子活性的瘦素调节,发生在STAT3易位至细胞核的下游步骤(图3),而且瘦素作用需要STAT3和SP1的直接相互作用。测试FoxO1是否能够干扰STAT3-SP1复合体的形成并从而阻止STAT3作用于POMC启动子。
为测试FoxO1是否能够结合STAT3,在来自293-OBRb细胞的样品中进行co-IP。FoxO1在抗Flag标记的STAT3抗体(抗-Flag)而不是对照抗体处理的样品中特异性免疫共沉淀(图6B)。相反,STAT3在用抗Myc标记的FoxO1抗体(抗-Myc)而不是对照抗体处理的样品中降低(图6C)。从而,该双向co-IP实验证实了FoxO1-STAT3的结合。
通过对用数量递增的FoxO1 cDNA转染的293-OBRb细胞进行co-IP,测试数量递增的FoxO1是否能够减少甚至消除与STAT3结合的SP1。STAT3抗体降低SP1的能力受FoxO1抑制,而且在高FoxO1表达水平上检测不到STAT3-SP1的结合(图6D)。总之,这些数据证明FoxO1能够通过与STAT3的结合阻止STAT3-SP1复合体的形成。
实施例8:STAT3相互作用所必需的关键FoxO1序列的鉴定
FoxO1是652个氨基酸的蛋白。为鉴定STAT3相互作用所必需的FoxO1序列,制备一系列C末端缺失构建体并通过免疫共沉淀测试它们与STAT3的相互作用:FoxO1(1-167)和其他更长的FoxO1突变体能够结合STAT3,而FoxO1(1-123)却不能结合STAT3,这表明氨基酸残基123-167间的区域对STAT3相互作用是重要的。
制备缺失构建体FoxO1(1-123)-(168-652),该构建体不含有在之前的C末端缺失构建体中所鉴定的区域。作为对照,制备不含有168-241间区域的FoxO1突变体,即FoxO1(1-167)-(242-652)。利用上述两种缺失突变体的co-IP实验证实了C末端缺失结果,即124-167氨基酸间的区域是STAT3相互作用所必需的,因为FoxO1(1-123)-(168-652)肽不能结合STAT3,但是FoxO1(1-167)-(242-652)却能结合STAT3。
讨论
总之,这些数据证明:1)磷酸STAT3通过需要POMC启动子中的SP1结合位点的机制,响应瘦素信号传导,激活POMC启动子;2)瘦素作用能够被FoxO1在STAT3磷酸化和易位至细胞核的下游步骤上抑制;3)FoxO1结合STAT3且阻止STAT3与SP1-POMC启动子复合体相互作用,并因此抑制STAT3介导的瘦素作用;4)与STAT3结合的FoxO1需要124-167区域内的残基。这些数据提供了瘦素抗性的潜在机制,其中,增加的FoxO1通过干扰STAT3 SP1靶基因启动子复合体的形成而拮抗STAT3介导的瘦素信号传导。
根据这些数据,本发明人提出FoxO1如何抑制POMC启动子的瘦素调节的潜在机制的模型:随着FoxO1表达数量的递增,FoxO1结合细胞核内的磷酸化的STAT3(经由124-167区域中的氨基酸残基),并阻止STAT3与SP1-POMC启动子复合体相互作用,并因此抑制STAT3介导的POMC启动子的瘦素激活(图7B)。
参考文献
1.Zhang,Y.,Proenca,R.,Maffei,M.,Barone,M.,Leopold,L.,and Friedman,J.M.(1994)Nature 372(6505),425-432
2.Banks,W.A.,Kastin,A.J.,Huang,W.,Jaspan,J.B.,and Maness,L.M.(1996)Peptides 17(2),305-311
3.Cowley,M.A.,Smart,J.L.,Rubinstein,M.,Cerdan,M.G.,Diano,S.,Horvath,T.L.,Cone,R.D.,and Low,M.J.(2001)Nature 411(6836),480-484
4.Gong,L.,Yao,F.,Hockman,K.,Heng,H.H.,Morton,G.J.,Takeda,K.,Akira,S.,Low,M.J.,Rubinstein,M.,and Mackenzie,R.G.(2008)Endocrinology
5.Vaisse,C.,Halaas,J.L.,Horvath,C.M.,Darnell,J.E.,Jr.,Stoffel,M.,and Friedman,J.M.(1996)Nat Genet 14(1),95-97
6.Friedman,J.M.,and Halaas,J.L.(1998)Nature 395(6704),763-770
7.Bates,S.H.,Stearns,W.H.,Dundon,T.A.,Schubert,M.,Tso,A.W.,Wang,Y.,Banks,A.S.,Lavery,H.J.,Haq,A.K.,Maratos-Flier,E.,Neel,B.G.,Schwartz,M.W.,and Myers,M.G.,Jr.(2003)Nature 421(6925),856-859
8.Schwartz,M.W.,Peskind,E.,Raskind,M.,Boyko,E.J.,and Porte,D.,Jr.(1996)Nat Med 2(5),589-593
9.Myers,M.G.,Cowley,M.A.,and Munzberg,H.(2008)Annu Rev Physiol 70,537-556
10.El-Haschimi,K.,Pierroz,D.D.,Hileman,S.M.,Bjorbaek,C.,and Flier,J.S.(2000)J Clin Invest 105(12),1827-1832
11.Martin,T.L.,Alquier,T.,Asakura,K.,Furukawa,N.,Preitner,F.,and Kahn,B.B.(2006)J Biol Chem 281(28),18933-18941
12.Kim,M.S.,Pak,Y.K.,Jang,P.G.,Namkoong,C.,Choi,Y.S.,Won,J.C.,Kim,K.S.,Kim,S.W.,Kim,H.S.,Park,J.Y.,Kim,Y.B.,and Lee,K.U.(2006)Nat Neurosci 9(7),901-906
13.Kitamura,T.,Feng,Y.,Kitamura,Y.I.,Chua,S.C.,Jr.,Xu,A.W.,Barsh,G.S.,Rossetti,L.,and Accili,D.(2006)Nat Med 12(5),534-540
14.Barthel,A.,Schmoll,D.,and Unterman,T.G.(2005)Trends Endocrinol Metab 16(4),183-189
15.Hirota,K.,Daitoku,H.,Matsuzaki,H.,Araya,N.,Yamagata,K.,Asada,S.,Sugaya,T.,and Fukamizu,A.(2003)J Biol Chem 278(15),13056-13060
16.Cone,R.D.(2005)Nat Neurosci 8(5),571-578
17.Mizuno,T.M.,Kleopoulos,S.P.,Bergen,H.T.,Roberts,J.L.,Priest,C.A.,and Mobbs,C.V.(1998)Diabetes 47(2),294-297
18.Huang,X.F.,Xin,X.,McLennan,P.,and Storlien,L.(2004)Diabetes Obes Metab 6(1),35-44
19.Munzberg,H.,Huo,L.,Nillni,E.A.,Hollenberg,A.N.,and Bjorbaek,C.(2003)Endocrinology 144(5),2121-2131
20.Zhang,T.,Kee,W.H.,Seow,K.T.,Fung,W.,and Cao,X.(2000)Mol Cell Biol 20(19),7132-7139
21.Ge,H.,Huang,L.,Pourbahrami,T.,and Li,C.(2002)J Biol Chem 277(48),45898-45903
22.Jeannotte,L.,Trifiro,M.A.,Plante,R.K.,Chamberland,M.,and Drouin,J.(1987)Mol Cell Biol7(11),4058-4064
23.Suske,G.(1999)Gene 238(2),291-300
24.Campfield,L.A.,Smith,F.J.,Guisez,Y.,Devos,R.,and Burn,P.(1995)Science 269(5223),546-549
25.Pelleymounter,M.A.,Cullen,M.J.,Baker,M.B.,Hecht,R.,Winters,D.,Boone,T.,and Collins,F.(1995)Science 269(5223),540-543
26.Enriori,P.J.,Evans,A.E.,Sinnayah,P.,Jobst,E.E.,Tonelli-Lemos,L.,Billes,S.K.,Glavas,M.M.,Grayson,B.E.,Perello,M.,Nillni,E.A.,Grove,K.L.,and Cowley,M.A.(2007)Cell Metab 5(3),181-194
27.Steppan,C.M.,Bailey,S.T.,Bhat,S.,Brown,E.J.,Banerjee,R.R.,Wright,C.M.,Patel,H.R.,Ahima,R.S.,and Lazar,M.A.(2001)Nature409(6818),307-312
28.Munzberg,H.,Flier,J.S.,and Bjorbaek,C.(2004)Endocrinology 145(11),4880-4889
29.Bjorbaek,C.,El-Haschimi,K.,Frantz,J.D.,and Flier,J.S.(1999)J Biol Chem 274(42),30059-30065
30.Loeffler,S.,Fayard,B.,Weis,J.,and Weissenberger,J.(2005)Int J Cancer 115(2),202-213
31.Lin,S.,Saxena,N.K.,Ding,X.,Stein,L.L.,and Anania,F.A.(2006)Mol Endocrinol 20(12),3376-3388
32.Li,H.,Liang,J.,Castrillon,D.H.,DePinho,R.A.,Olson,E.N.,and Liu,Z.P.(2007)Mol Cell Biol 27(7),2676-2686
33.Kortylewski,M.,Feld,F.,Kruger,K.D.,Bahrenberg,G.,Roth,R.A.,Joost,H.G.,Heinrich,P.C.,Behrmann,I.,and Barthel,A.(2003)J Biol Chem 278(7),5242-5249
Claims (20)
1.用于鉴定STAT3和SP1相互作用的调节剂的方法,所述的方法包括:
(a)提供STAT3多肽;
(b)提供SP1多肽;
(c)提供FoxO1多肽;
(d)在所述FoxO1多肽和受试化合物存在的情况下,使STAT3和SP1多肽接触;以及
(d)检测STAT3和SP1的结合;
其中所述受试化合物能够结合多肽,该多肽包含SEQ ID NO:1的肽或包含与SEQ ID NO:1有至少60%的序列同一性的肽。
2.用于鉴定STAT3和SP1相互作用的调节剂的方法,所述的方法包括:
(a)提供STAT3多肽;
(b)提供SP1多肽;
(c)在受试化合物存在的情况下,使STAT3和SP1多肽接触;以及
(d)检测STAT3和SP1的结合;
其中所述受试化合物包含肽或其模拟物,所述肽与SEQ ID NO:1的肽有至少60%的序列同一性。
3.鉴定能够抑制食欲的化合物的方法,所述的方法包括筛选能结合包含SEQ ID NO:1的肽或结合与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的肽的受试化合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述STAT3和SP1的结合为复合体形成。
5.如任何上述权利要求所述的方法,还包括:
(e)测试所述受试化合物是否介导STAT3 SP1介导的基因表达。
6.通过权利要求1-3中任一项所述的方法所鉴定的食欲抑制剂或增强剂。
7.包含权利要求6所述的食欲抑制剂或增强剂的药物。
8.鉴定STAT3和SP1间相互作用的调节剂的方法,包括:
(a)提供包含STAT3多肽、SP1多肽、FoxO1多肽和可操作地连接于报告基因的STAT3应答启动子的细胞;
(b)提供能够结合SEQ ID NO:1的肽的受试化合物;以及
(c)检测所述报告基因的表达。
9.如权利要求8所述的方法,还包括以下步骤:
(d)比较步骤(c)中的所述报告基因的表达和在所述受试化合物不存在的情况下的表达。
10.如权利要求8或9所述的方法,其中所述报告基因为荧光素酶。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法,还包括添加瘦素的步骤。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法,其中所述细胞超表达瘦素受体。
13.如权利要求8-12中任一项所述的方法,其中所述细胞为HEK293细胞。
14.与SEQ ID NO:1有至少60%序列同一性的多肽。
15.如权利要求14所述的多肽,其与SEQ ID NO:1有至少75%的序列同一性。
16.如权利要求15所述的多肽,其与SEQ ID NO:1有至少90%的序列同一性。
17.如权利要求14-16中任一项所述的多肽,其包含3-100个氨基酸。
18.如权利要求14-16中任一项所述的多肽,其包含3-44个氨基酸。
19.所述的SEQ ID NO:1的多肽模拟物,其能够破坏STAT3和SP1间的相互作用。
20.权利要求14-18中任一项所述的多肽或权利要求19所述的模拟物,在制造抑制或刺激食欲的药物中的用途。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998057177A1 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Assay systems for leptin-enhancing agents |
US6436703B1 (en) * | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
EP1733733A1 (en) * | 2004-03-04 | 2006-12-20 | Takashi Kadowaki | Regulator for adiponectin receptor expression |
WO2007025234A2 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
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---|---|---|---|---|
WO2006104586A2 (en) * | 2005-02-15 | 2006-10-05 | Joslin Diabetes Center | Methods of diagnosis and treatment of metabolic disorders |
-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998057177A1 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Assay systems for leptin-enhancing agents |
US6436703B1 (en) * | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
EP1733733A1 (en) * | 2004-03-04 | 2006-12-20 | Takashi Kadowaki | Regulator for adiponectin receptor expression |
WO2007025234A2 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J. NAKAE ET AL.: "Forkhead Transcription Factor FoxO1 in Adipose Tissue Regulates Energy Storage and Expenditure.", 《DIABETES》 * |
MARTIN G. MYERS ET AL.: "Mechanisms of Leptin Action and Leptin Resistance.", 《ANNUAL REVIEW OF PHYSIOLOGY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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