CN107109466A - 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测 - Google Patents

使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测 Download PDF

Info

Publication number
CN107109466A
CN107109466A CN201580072789.4A CN201580072789A CN107109466A CN 107109466 A CN107109466 A CN 107109466A CN 201580072789 A CN201580072789 A CN 201580072789A CN 107109466 A CN107109466 A CN 107109466A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
thio
dntp
nucleotide analog
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580072789.4A
Other languages
English (en)
Inventor
P·G·柯林斯
G·A·韦斯
崔龙起
T·奥尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Priority to CN201811305798.5A priority Critical patent/CN109517878A/zh
Publication of CN107109466A publication Critical patent/CN107109466A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4146—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS involving nanosized elements, e.g. nanotubes, nanowires
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)
    • G01N2333/9126—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供用于检测核酸聚合酶构象中的变化的方法和组合物，所述方法涉及将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第一核苷酸或第一核苷酸类似物及模板接触；以及通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的第一电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。所述方法适用于多核苷酸的测序。

Description

使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测
相关申请的交叉引用
此申请要求2014年12月18日提交的美国临时申请号62/093,671的权益，所述申请的内容据此以引用的方式整体并且出于所有目的并入本文。
关于在联邦资助研究和开发下作出发明权利的声明
本发明是受政府支持完成，由国立卫生研究院提供的1 RO1 CA133592-01号基金资助及由国家科学基金会提供的ECCS-1231910号基金资助。政府对本发明享有某些权利。
对表格形式或以ASCII码文件提交的计算机程序列表附件形式的“序列表”的引用
写入文件48538-526001WO_ST25.TXT中的序列表据此以引用的方式整体并且出于所有目的并入本文，该文件创建于2015年12月13日，2,828个字节，机器格式IBM-PC,MS-Windows操作系统。
背景
在DNA测序产业内，合成(非天然)分子的使用是用于区分构成DNA的四个核苷酸碱基(A、C、T及G)的主要策略。此策略被成功地应用于Sanger测序的古老方法，该方法是用于最初的人类基因组研究。
存在用于DNA测序的技术，但对于可提高速度、减小错误率并降低复杂性、成本及试剂需要的新技术有商业需要。对可使用电子电路进行DNA测序的技术有极大关注，因为固态电子学可在速度、成本及复杂性方面提供许多益处。
近年来，已产生电子构造，其是通过使DNA穿过纳米孔并且监测穿过同一孔隙的离子电流或者通过使DNA穿过纳米孔但使用相邻的电隧道结转导转运来操作。两个平台都依赖DNA穿过纳米孔，因此它们共有在纳米孔下操作的特征性困难，如不稳定性、脆性及精确的流体处理需要。此外，DNA穿过纳米孔具有有限的信噪比，以使得实际上必须使用荧光法独立地证实任何测序信息。另外，高错误率及“滑动”穿过纳米孔限制了应用，如为具有短串联重复的高度重复序列测序，这是人类鉴别应用需要的。
生物传感器是掺入生物识别元件的分析装置，该生物识别元件在空间上直接与转导元件接触。此整合确保生物事件向可检测信号的快速及适当转化。在不同的电生物感测构造中，基于场效应晶体管(FET)的装置已经吸引了极大的关注，因为它们是一种类型的生物传感器，这种生物传感器可将靶分子(例如生物分子)与晶体管表面的相互作用直接转化为可读的电信号。在标准场效应晶体管中，电流沿着连接到两个电极(源电极和漏电极)上的导电路径(沟道)流动。源电极与漏电极之间的沟道电导是由第三(栅)电极接通并且断开，该第三电极通过薄介电层进行电容性耦合。场效应晶体管检测靶化学品并且测量化学浓度以用于广泛的商业应用，包括例如工业过程控制、泄露检查、排出流监测以及医学诊断。
例如，在美国专利申请号13/626,760中公开了一种电子装置，其对在单分子水平下的检测足够敏感。使用其上连接有单个敏化分子的导电沟道实现本发明的方面。因此，其中公开的装置监测单分子反应的动态，并且可用于重要的单分子生物化学测定，如在单分子测序反应中的检测器。
因此，在本领域中存在对下一代DNA测序技术的需要，该技术比现有技术更高效并且有更多信息。本文提供了对本领域中的这些及其他问题的解决方案。
概述
本文尤其提供了具有天然和非天然核苷酸碱基的混合物以测定DNA样品的基因序列的电路。描述了使用电路来测定DNA链的遗传密码的专项技术和具体实施。
所述电路使得能够为DNA测序并且通过延伸，对RNA及碳水化合物进行测序。本发明提供了一种低成本、高速、高保真度的DNA测序方法，其可成功地与更传统的测序方法竞争。
本文所提供的方法和组合物可依据酶促加工期间单分子的活性。合成的底物、核苷酸及荧光团可用于由DNA链产生独特的和可区分的信号。
附图简述
图1A-1C.用化学修饰的dNTP电监测KF活性。图1A：单KF纳米电路及测试其通过KF掺入的化学修饰的dNTP。(a)单壁碳纳米管场效应晶体管(SWCNT-FET)经由被引入“指状物”子域中的单半胱氨酸非共价地生物缀合至DNA聚合酶I(KF)的单分子上的示意图。芘-马来酰亚胺接头(黄色)经由π-π堆叠粘附到SWCNT-FET上并且共价地连接到单半胱氨酸上以固定KF。SWCNT-FET在SiO2上生长，连接到源极和漏极金属电极上，并用聚合物(PMMA，红色)钝化。图IB：原子力显微镜显示具有单KF连接(7nm，箭头)的1-2nm直径的SWNT FET。图1C：本文所公开的类似dNTP的化学结构。突出显示了来自天然dNTP的化学修饰。
图2A-2F.天然和类似dNTP掺入期间的电流变化。图2A：在此电流测量中，在聚(dC)42模板及其互补天然dGTP存在下，ΔI(t)偏移在每个碱基掺入期间发生。高和低电流状态分别对应于酶的开放和闭合构象。图2B-2F：对应于图2A(时间窗1.5至2.5s)的数据的时间放大倍数示出了对应于dGTP(图2B)、α-硫代-dGTP(图2C)、6-氯-2APTP(图2D)及2-硫代-dCTP(图2E-2F)的碱基掺入的切换事件的减少。在图2B-2F各自的右边，放大视图描绘了每个所示碱基的单个ΔI(t)偏移，突出显示了单碱基分辨率，其中条棒表示1ms时间间隔。
图3A-3B.在来自>50s数据组的所示dNTP掺入期间的开放τ开放和闭合τ闭合状态持续时间的概率分布的直接比较。Y轴是以对数概率％绘制。对于τ闭合(图3A)和τ开放(图3B)两者，均聚物聚(dC)42提供模板。在图3A-3B中，每个核苷酸的单指数拟合显示为实线。
图4A-4B.在聚(dA)42的加工中产生的电子信号。图4A：当KF在天然的核苷酸三磷酸脱氧胸苷(dTTP)存在下加工聚(dA)42时，各碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<0。图4B：当dTTP被非天然核苷酸2-硫代-2’-脱氧胸苷-5’-三磷酸(2-硫代-dTTP)取代时，碱基掺入产生正电流尖峰ΔI>0。
图5A-5C.在异质性底物的加工中产生的电子信号。图5A：当KF在所有四种天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，每个碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<O。个别尖峰可如所示列举，但一般说来，它们不能将一种类型的碱基与另一种相区分。图5B：图5B显示用被2-硫代-dTTP取代的dTTP对相同数据集的模拟。在硫醇化脱氧胸苷下，正尖峰现表示(#2、6、7)掺入T核苷酸时的位置。图5C显示当KF在与某些类似物混合的天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，所得图案含有可用于鉴别所选的碱基的正和负电流尖峰。此实施例示出了使用与6-Cl-2APTP混合的三种天然核苷酸(dATP、dTTP、dCTP)作为用于G掺入的类似物获得的数据。将此信息用于寡核苷酸的纳米管测序方法中。
图6.附图描绘了在过表达和纯化之后KF的代表性15％SDS-PAGE凝胶。将KF纯化至>95％同质性并且在约68kDa的预期质量下迁移。
图7.附图描绘了基于荧光的活性测定，其展示了在稳态条件下的KF(L790C)(黑色圆形)和野生型KF(灰色圆形)活性。引物延伸反应在dATP、dTTP、dCTP及dGTP存在下发生。用背景减去原始数据，背景测量了在dNTP不存在下的活性。
图8A-8B.附图描绘了显示用本文所述的模板掺入dNTP类似物的整体测定。将具有dNTP类似物和A/T掺入模板(图8A)或G/C掺入模板(图8B)的聚合产物在5％高分辨率的琼脂糖凝胶上电泳。仅与3种dNTP的阴性对照反应省去dTTP(1)、dATP(2)、dCTP(8)及dGTP(9)，不含dsDNA。与所有四种dNTP的阳性对照反应示出了用A/T掺入模板(3)和G/C掺入模板(10)向dsDNA的转化。与dNTP类似物(4-7和11-14)的反应省去其天然dNTP对应物并含有其余三种天然dNTP。在A/T掺入模板的相对位置处，α-硫代-dTTP(4)和2-硫代-dTTP(5)在模板碱基A相对位置上掺入，并且α-硫代-dATP(6)和6-Cl-2APTP(7)在模板碱基T相对位置上掺入。在G/C掺入模板的相对位置处，α-硫代-dCTP(11)和2-硫代-dCTP(12)在模板碱基G相对位置上掺入，并且α-硫代-dGTP(13)和6-Cl-2APTP(14)在模板碱基C相对位置上掺入。目测之后，反转图像颜色，然后转换为黑色和白色。
发明详述
本文尤其提供了一种检测核酸聚合酶构象中的变化的方法；一种对核酸聚合酶测序的方法，其中检测了核酸聚合酶的构象变化。在实施方案中，所述方法包括用核酸类似物检测核酸聚合酶的构象变化。
定义
为了理解本发明主题并且构思所附专利权限纳入以下定义。本文所用的缩写具有在化学和生物领域内的惯用含义。
除非另外定义，本文所用的技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。参见，例如Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY 1989)。与本文所述相似或等效的任何方法、装置和材料可在本公开的实践中使用。提供以下定义以便于理解本文中常用的某些术语并且不意图限制本公开的范围。
术语“核酸”是指呈单链、双链或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物、或其互补序列。术语“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文所预期的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)、以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂交分子。核酸可为线性或支化的。举例来说，核酸可为直链核苷酸或者核酸可为支化的，例如以便核酸包含一个或多个核苷酸臂或分支。任选地，支化核酸经反复支化以形成更高阶结构，如树枝状分子等。
核酸(包括具有硫代磷酸酯主链的核酸)可包括一个或多个反应性部分。如本文所用，术语反应性部分包括能够经由共价、非共价或其他相互作用与另一分子(例如核酸或多肽)反应的任何基团。举例来说，核酸可包括经由共价、非共价或其他相互作用与蛋白质或多肽上的氨基酸反应的氨基酸反应性部分。
该术语还包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，具有与参照核酸类似的结合性质，并且以类似于参照核苷酸的方式代谢。这种类似物的实例包括但不限于磷酸二酯衍生物，包括例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)(又称为硫代磷酸酯(phosphothioate))、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰乙酸、膦酰甲酸、膦酸甲酯、硼膦酸酯或O-甲基亚磷酰胺键联(参见，Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach,Oxford University Press)；以及肽核酸主链和键联。其他类似物核酸包括具有阳性主链；非离子主链、修饰的糖及非核糖主链(例如，二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物或锁核酸(LNA))，包括美国专利号5,235,033和5,034,506及第6和7章,ASC Symposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research,Sanghui&Cook,eds中所描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义内。可由于多种原因进行核糖磷酸主链的修饰，以便例如增加这种分子在生理环境中或作为生物芯片上的探针的稳定性和半衰期。可制得天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可制得不同核酸类似物的混合物以及天然存在的核酸和类似物的混合物。在实施方案中，DNA中的核苷酸间键联为磷酸二酯、磷酸二酯衍生物或两者的组合。
词语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A互补。互补性可为部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或者可为完全的，其中所有核酸根据碱基配对匹配。
术语“杂交”等在通常和惯用的含义中是指形成双链(即双链体)核酸，包括例如DNA/DNA杂交体、DNA/RNA杂交体及RNA/RNA杂交体。应当理解，双链体核酸的形成可经由沃森-克里克碱基配对完成。短语“选择性地(或特异性地)与…杂交”是指核酸与特定的核苷酸序列在例如更严格的条件下以比其他核苷酸序列(例如，总细胞或文库DNA或RNA)更高的亲和力结合、双链化或杂交。
如本文所用，使用单壁碳纳米管场效应晶体管(SWCNT-FET)检测核酸聚合酶的构象变化。举例来说，Klenow片段(KF)纳米电路包括经由被引入“指状物”子域中的单个半胱氨酸非共价地生物缀合至DNA聚合酶I(KF)的单分子上的SWCNT-FET。通过由KF纳米电路产生的ΔI(t)信号测量构象变化。所述装置产生负ΔI(t)偏移的不间断序列，各自表明形成一个碱基对，并且反转振幅反映了不同的KF构象(图2C，图2F)。
如本文所用，在实施方案中，第一核苷酸或第一核苷酸类似物可分别与第二核苷酸或第二核苷酸类似物相同。在实施方案中，第一核苷酸或第一核苷酸类似物可分别与第二核苷酸或第二核苷酸类似物不同。
短语“严格杂交条件”是指通常在核酸的复杂混合物中探针将与其靶序列杂交而不会与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。较长序列尤其是在较高温度下杂交。核酸杂交的广泛指导见于Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”(1993)中。一般来说，对于在限定的离子强度pH下的特定序列，严格杂交条件被选为比热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm是50％与靶标互补的探针在平衡下(因为靶序列在Tm下过量存在，50％的探针在平衡下被占用)与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH、及核酸浓度下)。严格杂交条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号至少两倍于背景，优选地10倍于背景杂交。示例性严格杂交条件可如下：50％甲酰胺、5x SSC及1％SDS，在42℃下孵育；或者5x SSC、1％SDS，在65℃下孵育，并且在65℃下在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。示例性“中等严格的杂交条件”包括在37℃下在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，并且在45℃下在1X SSC中洗涤。阳性杂交至少两倍于背景。本领域技术人员将容易认识到可使用替代杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件。用于确定杂交参数的另外的准则提供于许多参考文献中，例如Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel等人编著,John Wiley&Sons。
在实施方案中，单分子传感装置10可采用晶体管形式，即场效应晶体管(FET)，其上连接的生物分子充当电路的“栅极(gate)”。在此实施方案中，单个敏化分子用于装置的单分子栅极。晶体管实施方案可包括两个或三个端子晶体管。导电沟道还可由金属、金属氧化物、半导体或纳米级导体如纳米线、石墨烯或单壁碳纳米管(SWNT)形成。在一个实施方案中，导电沟道是单个SWNT。
方法
本文提供了一种检测核酸聚合酶构象中的变化的方法。所述方法包括使非共价地连接到单壁碳纳米管(SWNT)上的核酸聚合酶与核苷酸或核苷酸类似物(例如，第一核苷酸或核苷酸类似物)及模板核酸序列(例如，有义链寡核苷酸或多核苷酸)接触，由此形成结合至核苷酸或核苷酸类似物及模板核酸序列上的构象上变化的核酸聚合酶。通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间SWNT的电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。术语“接触”等在通常和惯用的含义中是指使两种或更多种物质充分紧密的接触，以便相互作用可发生在物质之间，例如，结合、化学反应等。术语“电导变化”等在通常和惯用的含义中是指可通过本领域中已知且本文所公开的方法测量的电导变化。术语“构象上变化的核酸聚合酶”等在通常和惯用的含义中是指如本领域中已知的二级、三级和/或四级结构或核酸的变化。
如本文所公开，电导变化可为形成核酸聚合酶的一部分的敏化分子相对于核酸聚合酶及构象上变化的核酸聚合酶的位置中的变化结果。电流波动可由方边图案的简单增加和减少组成。或者，波动可包含任何小波，包括为三角形、正弦曲线的形状或具有任意数目的傅里叶分量。这些小波的振幅、持续时间及形状都编码靶标特异性组分的活性且因此可使用计算机进行分析以揭示结合的动力学及其他机械和电子自由度。这些参数的统计分析提供了对靶结合及未结合过程的动力学可变性、转换及中间化学状态的认识。电流信号中的自由度在全部结合至同一位点的多个相似靶分子之间区别，例如，结合位点的靶分子与抑制剂分子之间。这些自由度还可区分弱相互作用，如在真正的结合之前发生的分子识别。
检测核酸聚合酶构象中的变化的方法可用作核酸(例如DNA或RNA)测序方法的一部分。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括：在检测结合至第一核苷酸或核苷酸类似物的构象上变化的核酸聚合酶之后，通过允许所述构象上变化的核酸聚合酶释放第一核苷酸或核苷酸类似物由此改造核酸聚合酶来检测所述核酸聚合酶构象中的第二变化。所述方法还包括使非共价地连接到单壁碳纳米管(SWNT)上的核酸聚合酶与第二核苷酸或核苷酸类似物接触，由此形成结合至第二核苷酸或核苷酸类似物上的构象上变化的核酸聚合酶。通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间SWNT的电导变化来检测结合至第二核苷酸或核苷酸类似物的构象上变化的核酸聚合酶。
在实施方案中，第一和/或第二核苷酸或核苷酸类似物产生被检测的独特的电导信号。将独特的电导信号用于鉴别所述第一和/或第二核苷酸或核苷酸类似物，由此鉴别模板核酸的序列。术语“电导信号”、“第一电导信号”、“独特的电导信号”等在通常和惯用的含义中是指如通过本领域中已知的方法(包括本文所公开的方法)测量的物质的电导。
适用于本文所提供的方法中的是碳纳米管电路，其与更传统的测序技术相比可更快地、以低成本并且在潜在低得多的错误率下操作。本文所提供的组合物和方法提供对两种基于纳米孔的电子构造的显著改进。首先，碳纳米管电路产生具有极佳噪声特性的电子信号，该特性不需要单独确认。第二，纳米管电路耐受广泛多种环境和粗暴处理，由此在流体处理和整个系统复杂性上的说明与纳米孔构造相比可明显放宽。第三，纳米管电路在概念上是简明的并且容易适应在多种不同模式下操作。第四，该手段可采用高保真度酶以提供碱基对辨别；对于18x10-6的酶，估计错误率可低至理论最大值。这类低错误率表示对目前可用的商用仪器的大约10,000倍改进。因此，本文提供了显著降低成本、复杂性、错误率及彻底再测序的额外负担的方法和组合物。纳米管电路的一般说明提供于附录A及美国专利申请号13/626,760中。
本发明一般提供一种足够敏感以在单分子水平下检测的电子装置。使用其上连接有单个敏化分子的导电沟道实现本发明的方面。因此，本发明的装置监测单分子反应的动态，并且可用于重要的单分子生物化学测定，如在单分子测序反应中的检测器。
本发明可使用一般见于场效应晶体管中的任何类型的传导沟道。示例性导电沟道是由金属、金属氧化物、半导体或纳米级导体如纳米线、石墨烯或单壁碳纳米管(SWNT)形成。在实施方案中，导电沟道为单SWNT。
作为一类材料，SWNT为具有可在1电子伏至有效的零之间变化的电子带隙的半导体。此变化使得碳SWNT被归类为金属或半金属材料，且其他被归类为半导电的。借助于连接电极、静电栅极及其他控制电路，半导电SWNT可被配置为传感器FET、RF放大器或低温单电子晶体管。所述装置和方法不排除这类添加，因为在实施方案中，所述装置仅由双端SWNT导体构成。SWNT为导电沟道，其中单分子传感装置可由任何类型的SWNT线制造，有或没有栅电极，并且在玻璃、塑料或硅衬底上。在此描述的单分子传感装置可为FET内的一个组件或任意数目的更复杂的电子或光电装置和电路。
本公开的一方面是仅一种活性敏化分子在各装置中的可靠成果。一般说来，敏化分子将以由制备中使用的浓度和孵育期确定的平均间距包覆SWNT。一旦已凭经验为一组具体条件确定了平均间距，SWNT导体便可由光刻法限定以具有相等长度。实际上，当敏化分子直接连接到SWNT导体上时，此长度通常为1至100nm，即难以使用光刻技术控制的范围。
在实施方案中，接头分子充当连接中间体，其改善对敏化分子的平均间距的控制。本领域中已知的任何方法都可用于将单个敏化分子连接到导体上。在实施方案中，接头分子被用于连接单个敏化分子。在实施方案中，接头分子包含至少第一和第二官能团。一般说来，第一官能团与导电沟道(例如，单壁碳纳米管)相互作用，而第二官能团与敏化分子相互作用。示例性第一官能团包括芘、苯、环己烷及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。示例性第二官能团为马来酰亚胺。在其中导电沟道为SWNT的某些实施方案中，接头分子经由π-π堆叠与SWNT的侧壁相互作用。
使用接头，敏化分子之间的长度可显著地增至1微米或更大。敏化分子间隔1微米时，使用标准光刻掩模技术来限定装满导体的晶片将变得可能，每个长度大约1微米。或者，鉴于如由掩模设计所设定的所需装置间距，敏化分子的浓度和孵育持续时间可以变化以实现每装置一个分子的相同结果。单分子传感装置可在10次制造尝试的至少8次中产生，全部都没有破坏SWNT导体的sp2特性。
本领域中已知的任何敏化分子都可与本发明装置一起使用，并且所选敏化分子将取决于有待检测的分子或有待监测的反应。示例性敏化分子包括酶、蛋白质、核酸、核酶、适体及多糖。在某些实施方案中，所述酶为溶菌酶、蛋白激酶A或DNA聚合酶I。
在其他方面中，一种以上敏化分子在每个装置中可为必需的以实现单分子动态感测。例如，在所需操作温度或pH下，特定类型的敏化分子可仅具有25％为化学活性的概率。在这些条件下，适宜的是将额外的敏化分子(例如四个)连接到每个导体上以便产生其中一个敏化分子可能具有活性的装置。使用如上所述的方案容易实现此较高密度的连接，通过将装置长度增至适当倍数的分子间平均间隔距离，抑或通过经由改变连接条件减小相同间距而实现。
在实施方案中，单分子传感装置包括多个平行导体(例如SWNT导体)。将单个活性敏化分子连接到导体中的一个上，并且这促成了动态电子信号，该电子信号可从未修改的导体的平行但静态电导中分离。此实施方案提供了在导体合成或放置设计中的额外灵活性，以及使用具有极低连接概率的敏化分子的单分子传感装置的成功制造。
在实施方案中，使用相同类型的敏化分子平行制造多个单分子传感装置，其中每个装置连接一个敏化分子。在另一实施方案中，制备多个导体，然后将其暴露于不同的敏化分子，以便实现针对不同靶标敏化的多个单分子传感装置。在另一实施方案中，单分子传感装置通过具有一定特异性的敏化分子响应于多个靶标。
在实施方案中，单分子传感装置包括第一电极和第二电极。将单壁碳纳米管分别连接到第一电极和第二电极。所述装置包括至少一种具有第一和第二官能团的接头分子，所述至少一种接头分子具有用单壁碳纳米管的侧壁非共价地官能化的第一官能团。单个敏化分子具有至少一个官能团，单个敏化分子的所述至少一个官能团被至少一种接头分子的第二官能团官能化。
在实施方案中，制造单分子传感装置的方法包括在连接到第一电极和第二电极的衬底上形成至少一个单壁碳纳米管；用至少一种含有多个官能团的接头分子的至少一个官能团非共价地官能化所述装置的单壁碳纳米管侧壁；以及用单个敏化分子的一个或多个官能团官能化至少一种接头分子中的至少一个官能团。
在实施方案中，公开了一种使用具有单壁碳纳米管(SWNT)的单分子传感装置的方法。SWNT被设置在衬底上并连接到第一电极和第二电极，使用以SWNT非共价官能化的接头分子将具有单个敏化分子的传感装置固定到SWNT上。施加电压于SWNT上。使敏化分子暴露于化学环境。监测流过SWNT的电流波动。
在实施方案中，公开了使用单分子传感装置进行核酸测序的方法。传感装置包括导电沟道。导电沟道可包括在衬底上的单壁碳纳米管(SWNT)，所述衬底连接到第一电极和第二电极。传感装置具有单个敏化酶，使用以沟道(例如SWNT)非共价官能化的接头分子将所述酶固定到沟道上。所述方法包括将装置暴露于至少一种类型核苷酸；在沟道上施加电压电位；监测流过SWNT的电流波动；以及至少部分基于监测到的电流波动鉴别通过酶掺入核酸模板中的核苷酸。所述酶可为聚合酶或逆转录酶。所述核苷酸可为核苷酸类似物。在某些实施方案中，将装置一次暴露于多于一种类型的核苷酸。
传感装置还可用于测定蛋白质或酶的加工动力学。传感装置的另一应用是测定遗传突变的影响。使用具有遗传突变的敏化分子或靶标的装置可与从不具有突变的敏化分子或靶标的类似装置处获得的性能比较。在另一应用中，传感装置可用于测量药物或其他小分子对蛋白质的影响，使得蛋白质变得有活性或无活性。
制造本发明装置的方法可涉及生物化学缀合方案，接着是受控制的冲洗。这样的过程产生具有一个敏化分子并且没有干扰分子的非特异性结合的本发明装置。在某些实施方案中，敏化分子经由非共价相互作用直接连接到导体。在其他实施方案中，敏化分子被连接到具有至少两个官能团的中间接头分子，一个为非共价连接而设计，而另一个为与敏化分子的通用生物缀合而设计。使用中间接头的一个方案提供用于由一大类敏化分子构建本发明装置的化学上通用的平台。
在实施方案中，用于制造单分子传感装置的方法包括在连接到第一电极和第二电极的衬底上形成至少一个单壁碳纳米管；用至少一种含有多个官能团的接头分子的至少一个官能团非共价地官能化所述装置的单壁碳纳米管侧壁；以及用单个敏化分子的一个或多个官能团官能化至少一种接头分子中的至少一个官能团。
在实施方案中，单分子传感装置可采用晶体管形式，即场效应晶体管(FET)，其上连接的生物分子充当电路的“栅极”。在此实施方案中，单个敏化分子用于装置的单分子栅极。晶体管实施方案可包括两个或三个端子晶体管。导电沟道还可由金属、金属氧化物、半导体或纳米级导体如纳米线、石墨烯或单壁碳纳米管(SWNT)形成。在一个实施方案中，导电沟道是单个SWNT。
一般说来，SWNT的长度可在约0.1至约10微米之间变化。选择SWNT的具体长度以使得统计上大部分所制造的装置10仅具有与SWNT相连的单个敏化分子。甚至更优选地，选择暴露于外部化学环境的SWNT的长度以使得超过75％所制造的装置仅包括与SWNT相连的单个敏化分子。在一些情况下，此距离为第一电极与第二电极之间的距离。
第一电极和第二电极可任选地用覆盖物覆盖。所述覆盖物可包括窗、凹槽、狭缝或其他开放区段，其提供从外部环境进入到SWNT的入口。就此而言，SWNT可暴露于化学环境。例如，可在制造过程期间在覆盖物中界定暴露的窗。保护性覆盖物确保包括第一和第二电极的大部分表面被保护免于受环境的影响。此外，在一个优选实施方案中，窗的长度被调整以实现正确的装置长度。窗的长度可变化以实现SWNT上的所需活性区域。举例来说，第一和第二电极可连接到SWNT上并且由2μm的距离分隔。然而，所述窗可小于电极间距离。使保护性覆盖物内的暴露窗暴露于SWNT并且使连接的敏化分子暴露于化学环境。保护性覆盖物可为由一个或多个层构成的任何电绝缘薄膜。薄膜材料包括聚合物、氧化铝、二氧化铪、二氧化硅或氮化硅。使用光刻技术在保护性覆盖物内界定所述窗。光刻技术是本领域中公知的并且包括使用光暴露、电子束方法及正性或负性抗蚀剂的任何可接受的组合。
在实施方案中，装置制造包括将装置以正电子束抗蚀剂如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的保护性覆盖物涂覆；用电子束书写光刻图案；然后显影已写入区域以暴露长度为0.5至1.0μm的活性SWNT沟道。在另一实施方案中，装置制造包括以氧化铝保护性覆盖物涂覆装置；进一步以光致抗蚀剂薄膜涂覆装置；将所需的窗暴露于光；显影已写入区域以使氧化铝窄窗暴露；蚀刻氧化铝以进一步暴露长度为0.5至1.0μm的下层SWNT沟道。在保护涂层中两层或更多层材料的组合提供具有不同化学特性的涂层。
所述装置被耦合到电子电路。电子电路被用于在第一电极与第二电极之间施加偏压(例如，50-100mV)并且还被配置来测量随时间而变的流过SWNT的电流。电子电路可耦合到其中具有一个或多个处理器的计算机24，处理器被用于控制通过装置的电压和电流的应用并且还获取、储存并分析由装置生成的数据。在装置操作期间，电压(例如，恒定DC电压或AC与DC电压的组合)被施加到第一电极与第二电极之间。接着使用电子电路测量通过SWNT的电流，所述电子电路可包括具有一个或多个放大器的电流计。
第一电极、第二电极及SWNT可设置在衬底顶上。所述衬底可包括任意数目的衬底材料，如玻璃、塑料或硅。本发明的一个替代实施方案涉及在光学透明的衬底如玻璃或石英上制造装置。不同于传感器FET及大部分有关感测的现有技术，所述装置不需要栅电极或导电支撑衬底。因此，所述装置可在广泛多种表面(包括透明表面)上制造。石英是如上所述的CVD制造工艺所优选的，因为它与高温相容。如果合成SWNT并且通过其他手段如从溶液中旋涂沉积到衬底上的话，或者如果在晶片上制造装置，然后转移到玻璃用于支撑的话，也可使用玻璃晶片。在任何情况下，石英、玻璃、蓝宝石或其他透明衬底的使用都能实现装置的光学监测。监测来自连接分子的荧光信号是本领域中公知的，并且最好通过透明衬底完成。在石英衬底上形成的装置10允许使用本文所述的电学技术并且通过包括单分子荧光和smFRET的光学技术独立监测分子动力学。
在实施方案中，在不同时期或同时获得来自同一单分子的电和光信号。位于透明衬底(例如石英)上的单分子传感装置提供在现有技术中未发现的独特机会以用独立的单分子技术补充smFRET。在此实施方案中，使用照射源通过透明衬底照射SWNT。发出的荧光可使用物镜来收集，该物镜使用油或水以接触透明衬底。可使用例如光束分离器将荧光导向光子计数器。
这种双重模式监测可校准通过一种手段进行的测量，如在整体水平下进行的荧光周转测量下的电子监测。通过两种独立手段对一个分子的同时询问提供研究同一分子的两个不同部分的机会，例如，以便比较移动的部分、接受电荷转移的部分、含有催化位点的部分或吸收或发射光子的部分。两个这种部分的同步监测可确定两个事件的相对时间和因果关系，如活性位点的移动与调节位点的构象变化有关。此外，透明衬底允许催化位点官能团的光诱发的活化或光驱动的电荷转移以用于所生成的构象变化的检查。在一个实施方案中，SWNT可整合到流动池等中以使得流体可流过SWNT以便于测量。或者，流体可选择性地沉积在装置的顶上。
所述装置可包括一个接头分子，其含有一个或多个非共价地连接到SWNT的外侧壁上的官能团。官能团可包括芘、苯、环己烷及2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。非共价地连接到SWNT的外部侧壁的官能团是本领域中公知的并且针对此官能团的特殊设计可包括适用于本发明的任何设计。此外，接头分子含有一个或多个用另一官能团官能化的官能团，所述另一官能团以一定方式连接到或已连接到敏化分子上以便保持敏化分子的一些或全部功能性。官能团对可包括叠氮化物和炔烃、NHS酯和胺、硫醇和炔烃、以及硫醇和马来酰亚胺。用其他官能团官能化的官能团是本领域中公知的并且针对此官能团的特殊设计可包括适用于本发明的任何设计。
所述装置可包括含有一个或多个官能团的单个敏化分子，所述一个或多个官能团以一定方式被其中一个接头分子的一个或多个官能团官能化以保留敏化分子的功能性。本发明的敏化分子包括任何分子。优选的敏化分子包括在其与其他分子的相互作用中化学特异性的分子。更优选地，敏化分子可包括聚合物、蛋白质、DNA、RNA、核酶和/或适体、多糖或其他生物分子。敏化分子30是本领域中公知的并且可包括适用于本发明的任何敏化分子。
在实施方案中，接头分子可包括非共价地粘附到SWNT的壁上的第一官能团及被设计连接到敏化分子的第二官能团。接头分子的使用避免了在敏化分子与SWNT之间设计有效的直接连接的困难。在此实施方案中，接头分子和敏化分子实际上是单个实体。在实践中，实现和控制所需表面密度常常要求接头分子和敏化分子以两种单独的溶液来制备，它们之间的最终键联在SWNT上的适当位置进行。敏化分子可包括第一官能团和第二官能团，所述官能团可包括靶标选择性官能团。敏化分子的第一官能团结合至接头分子的第二官能团。所述结合可为本领域中已知的任何化学相互作用，例如共价或非共价结合。在实施方案中，结合是经由共价键。第二官能团被设计以通过任何结合相互作用结合至一个靶分子或多个靶分子。敏化分子还包括导电性调节组分，其理想地位于靠近SWNT连接的位点处。导电性调节组分不必紧密接近于第二官能团，但这两者将通过机械、变构或电子手段通信，以使得敏化分子与化学靶标的相互作用诱发同一敏化分子的导电性调节组分的动态变化，从而影响SWNT中的电子变化。
在实施方案中，芘官能团可经由π-π堆叠非共价地连接到SWNT表面。单个敏化分子可与SWNT相连。完成的装置的典型电特性可用与半导电SWNT的侧壁直接接触的含水电解质测量。
在实施方案中，所有三种组分都被合并到单个敏化分子中。举例来说，蛋白质的一个氨基酸可为用于结合至SWNT的有效位点，另一氨基酸可具有能够调节SWNT导电性的净表面电荷，且第三氨基酸可充当蛋白质结合配偶体(即，有待检测的靶分子)的识别或结合位点。或者，共价或非共价复合物可经设计并且合成以使所有三种组分在一起作为单个敏化剂。
在实施方案中，敏化分子的不同功能组分被分到两个或更多个分子中，所有都共价或非共价地装配在SWNT导体上。在此替代实施方案中，导电性调节组分可为连接至接头分子的一个官能团上的分子，且靶标选择性化学组分可为连接至同一接头的不同官能团上的第二分子。或者，靶标选择性化学组分可具有直接结合至含有导电性调节组分的分子的官能团。此结合可通过共价键或通过非共价识别或对许多生物分子通用的对接(docking)。在每个情况下，将在组分之间实现某种形式的机械、空间或电通信，使得靶标特异性化学组分的动态导致整个敏化复合物的导电性调节组分的变化。
一个实施方案，所述单分子传感装置可包括具有一个或多个SWNT的导体；一种或多种含有两个或更多个官能团的接头分子，其中一个或多个官能团非共价地结合至SWNT的表面；以及含有至少一个官能团的单个敏化分子，所述官能团被官能化到接头分子的至少一个官能团。
在实施方案中，单分子传感装置包括含有羧酸酯基团的接头分子和含有胺的敏化分子。接头分子的羧酸酯官能团可被活化为反应性酯并且使用本领域中公知的技术来酰胺化。然后，反应性酯可被共价偶联到敏化分子的胺基上以形成本领域中公知的稳定酰胺键。
在实施方案中，单分子传感装置包括为芘马来酰亚胺的接头分子及含有反应性硫醇基的敏化分子。接头分子的马来酰亚胺官能团可与敏化分子的硫醇基共价偶联以形成本领域中公知的稳定硫酯键。
在实施方案中，非共价单分子传感装置包括为芘马来酰亚胺的接头分子及为蛋白质的敏化分子。其他实施方案包括其中蛋白质为酶的那些实施方案。在实施方案中，酶为DNA聚合酶或逆转录酶。利用这些酶中的每一种的单分子传感装置的相似产率已通过调整酶连接期间使用的溶液pH、浸泡持续时间及冲洗条件实现。
在实施方案中，敏化分子为核酸(例如DNA、RNA)、核酶、适体、多糖或其他生物分子。一旦与底物或配体结合或作用于底物或配体便经历构象动态变化的任何敏化分子均适用于本发明中。在实施方案中，接头分子包括含有以下的接头分子：在本领域中已知非共价地官能化到SWNT的表面的至少一个官能团；和为在本领域中已知与另一官能团形成键的官能团的至少一个官能团。
一个实施方案为使用DNA或RNA聚合酶或逆转录酶作为非共价地连接到SWNT上的单个敏化分子以允许DNA、cDNA或RNA分子的非光学测序。已知催化dNTP的模板依赖性掺入的酶经历了充分表征的构象变化，其可用于根据本文所述的方法和装置监测天然或类似dNTP或NTP的核苷酸特异性掺入且由此提供模板分子序列。此无标记测序方法就以下特点来说比目前实施的非光学测序方法具有优点，因为所述方法允许将核苷酸特异性掺入事件与四种天然或类似dNTP或NTP的均匀混合物区别开，尽管本发明适合出于序列测定目的使个别dNTP或类似dNTP或NTP以连续和循环方式流动的操作。逆转录酶作为非共价结合的敏化分子30的使用使得能够在无需中间cDNA转化步骤的情况下实现RNA分子的直接测序。
由于正确核苷酸掺入的精确度在DNA、RNA或cDNA测序中具有相当的重要性，所以提高对正确dNTP或NTP的特定掺入的检测的替代方法将使用类似dNTP或NTP，其增强了正确核苷酸掺入的构象动力学，由此确保精确的测序。可用于提高正确核苷酸掺入的动力学或动态鉴别的非标记类似dNTP或NTP是本领域技术人员公知的并且包括但不限于嘌呤和嘧啶碱基的修饰(即，在C-4和C-7位置处)、核苷酸的脱氧核糖或核糖部分、以及dNTP或NTP的α、β及γ磷酸酯，包括使用四磷酸酯或五磷酸酯，有或没有额外的磷酸酯修饰。
可使用序列精确度提高的其他方法，该方法与本领域技术人员已知的本发明相容，包括但不限于读取同一模板分子多次。其他可能性涉及使用读取两次格式，其中焦磷酸解被用于再次读取同一模板分子。
在实施方案中，提供了一种用于检测单分子传感装置的动态和动力学的方法。用于测量SWNT的电导变化的任何方法都可用于监测单分子传感装置。在实施方案中，在SWNT上施加100mV的偏压差，并且使用电路测量随时间变化的流过导体的电流。在敏化分子的靶标特异性组分处的化学结合或识别造成敏化分子的导电性调节组分的变化，从而导致测量电流的增大和减小。平均后包含靶标特异性组分的化学动力学的多个结合和未结合事件产生多个电流波动，所述电流波动可使用本领域中已知的信号处理技术对多电流波动进行定时、计数、鉴别、分析或存储。电流波动可由方边图案的简单增加和减少组成。或者，波动可包含任何小波，包括三角形、正弦曲线的形状或具有任意数目的傅里叶分量。这些小波的振幅、持续时间及形状都编码靶标特异性组分的活性且因此可使用计算机24进行分析以揭示结合的动力学及其他机械和电子自由度。这些参数的统计分析提供了对靶结合及未结合过程的动力学可变性、转换及中间化学状态的认识。电流信号中的自由度在全部结合至同一位点的多个相似靶分子之间区别，例如，结合位点的靶分子与抑制剂分子之间。这些自由度还可区分弱相互作用，如在真正的结合之前发生的分子识别。
在实施方案中，提供了区分并监测抑制剂分子的共价或非共价结合的能力。蛋白质功能的抑制剂作为药剂在商业上很重要，包括抗病毒剂、抗癌剂及抗细菌治疗剂。有效抑制剂的测试是一个耗时和昂贵的过程。所述装置提供以单分子分辨率直接监测蛋白质功能，而同时用任意数目的不同候选抑制剂探测蛋白质。使用本领域中公知的自动流体递送系统如流动池，候选抑制剂溶液可一个接一个地递送到装置中以鉴别具有所需动力学性质的抑制剂。或者，候选抑制剂可在混合物中，如所合成抑或通过化学结构或功能或任何其他特征有目的分类的，以便快速地分析整批候选分子。
因此，可见本公开方法能够检测单个敏化分子的动态和动力学。当敏化分子为酶时，动力学和动态包括酶促周转率或构象运动率。本发明的技术优势是在于可检测单个敏化分子的动态和动力学，克服了当多个敏化分子存在于SWNT上时出现的整体测量问题。此外，本发明所公开的方法克服了与制造单分子装置的先前方法有关的问题，该先前方法在SWNT上形成了缺陷位点，SWNT则官能化单个敏化分子。
实施方案包括一种制造单分子传感装置的方法。所述方法包括在具有其第一和第二末端的衬底26上形成至少一个单壁碳纳米管，该第一和第二末端分别连接到第一电极和第二电极上。随后用至少一种含有多个官能团的接头分子的至少一个官能团非共价官能化装置的单壁碳纳米管侧壁。用至少一种接头分子的至少一个官能团(例如，未用SWNT非共价官能化的官能团)官能化单个敏化分子。
在实施方案中，制造SWCNT-FET并且用缺乏核酸外切酶的KF(D355A/E357A/L790C/C907S)的单半胱氨酸变体来官能化。KF纯化至>95％是由其同质性确保(图6)。基于荧光的测定证实连接之前本体酶的活性(图7)。KF与SWCNT-FET的连接是通过以下步骤实现：将装置浸泡在N-(1-芘基)马来酰亚胺(1mM在乙醇中，30min)的溶液中，接着与KF(300nM KF，在20mM Tris、50mM NaCl、10mM MgCl2、100μM TCEP pH 8.0的标准KF活性缓冲液中)一起孵育。数据收集之后的原子力显微术证实单个KF分子与每个装置的连接(图1B)。这类装置简称为KF纳米电路。
在实施方案中，将与互补dNTP类似物混合的均聚物模板聚(dA)42、聚(dT)42、聚(dG)42或聚(dC)42用于检测聚合酶(例如DNA聚合酶)的构象变化。在实施方案中，将每个模板融合至M13引发位点并且以1:1化学计量比与M13正向引物混合；对于杂交，将混合物在热循环仪中加热至95℃持续5至10min，接着冷却至65℃，然后以每五分钟5℃的梯度进一步冷却直到达到室温。在实施方案中，将KF纳米电路以100nM浓度浸没在具有退火模板-引物的活性缓冲液中。将天然或类似dNTP过量添加到缓冲液中，从而确保用于KF催化的Vmax条件。为了弥补dNTP类似物的可能降低的亲和力，实验采用比天然dNTP(例如，10μM)更高浓度的类似物(图1C，例如100μM)。
在实施方案中，测量是由通过SWCNT-FET监测源-漏电流I(t)组成，而连接的KF分子与其周围环境相互作用。在实施方案中，漏电极被偏压在100mV，并且充当栅电极的电解质保持在0V上或附近。装置与任何模板-引物及其互补dNTP的孵育转导波动ΔI(t)，而这些波动在非互补dNTP下或在遗失模板-引物或KF连接的控制测量中可能是不存在的。在实施方案中，I(t)波动被放大，在100kHz下数字化，并且存储为不间断的，600s。测量之间，可用活性缓冲液冲洗KF纳米电路两次，在缓冲液中孵育5min，随后在引入另一核苷酸和模板-引物之前用缓冲液冲洗两次。每个KF分子可用多个类似物、其相应的天然dNTP及无核苷酸的缓冲液监测以便收集直接可比较的数据集，从而证实典型的KF活性并且产生ΔI(t)偏移。
图2A和2B示出了由在dGTP存在下加工聚(dC)42模板的KF纳米电路产生的代表性ΔI(t)信号。在实施方案中，所述装置产生负ΔI(t)偏移的不间断序列，在三个不同放大倍数下示出。每个ΔI(t)偏移表示形成一个碱基对，并且来源于ΔI(t)数据集的动力学参数与KF运动的已知单分子分析及整体KF掺入率一致。在实施方案中，G·C或C·G碱基对形成可彼此相同；A·T/T·A碱基对形成也可提供彼此极类似的聚合动力学、动态及ΔI(t)值。用天然dNTP的测量可提供用于与dNTP类似物比较的基线值。
在实施方案中，在整体和单分子测定两者中将可商购获得的dNTP类似物经由KF聚合掺入DNA中(图8A-8B)。在实施方案中，用α-硫代-dNTP或dNTPαS类似物的测量产生ΔI(t)数据集，其可类似于天然dNTP出现，但具有不同的掺入率(图2C)。在实施方案中，当用KF纳米电路测量时，6-氯-2-氨基嘌呤-drTP或6-Cl-2-APTP的掺入与聚(dC)42和聚(dT)42模板两者相反，造成具有反转振幅的ΔI(t)信号，反映了不同的KF构象(图2D)。此类似物更缓慢地掺入；例如，与聚(dC)42相反，6-Cl-2APTP在80％的dGTP比率下产生ΔI(t)偏移。在2-硫代-dNTP类似物下的ΔI(t)记录产生混合行为，其中KF活性在一分钟期间产生负ΔI(t)偏移，在另一分钟期间产生正ΔI(t)偏移，且更少见地，两种行为沿着单模板链的混合物(图2E-2F)。
对于天然dNTP，实验基线电流τ开放的时间常数也可称为τ高。表示天然dNTP掺入事件的时间常数可在较低电流下出现，并且被称为τ低。本文公开了正、负或正和负ΔI(t)偏移的混合物，并且任一方向的偏移的时间常数被称为τ闭合。τ开放和τ闭合的分布来源于聚合数据的每个记录。
图3A-3B示出了dGTP底物掺入到聚(dC)42模板中的示例性分布。来自天然和类似dGTPτ闭合事件的分布几乎不能区分，例外的是在尾部中的稀有事件，对此有最少的统计资料(图3A)。为了绘出天然与类似dNTP之间的比较，专注于这些分布的主要Poissonian分量的平均时间常数<τ>。<τ闭合>的所有平均值非常一致地为约0.3±0.1ms。通过比较，<τ开放>的分布与平均值明显不同。举例来说，KF当加工α-硫代-dGTP时在其开放构象上耗费了63.6±2.8ms，这比对于天然dGTP观察到的40.8±0.6ms要长56％(图3B)。
动力学参数<τ闭合>、<τ开放>及平均掺入率k是针对具有天然和类似dNTP的四个均聚模板来分析(表1)。正如如上所述的情况一样，每个组合产生相同的τ闭合分布，其中<τ闭合>值在0.3±0.1ms范围内。虽然先前对于四种天然dNTP观察到类似效应，33但此结果向具有不同核碱基大小、电子性质、氢键合或在α-磷酸二酯处的取代的dNTP类似物的扩展是出乎意料的。
另一方面，τ开放对dNTP特性更敏感。<τ开放>的平均持续时间在23ms(对于天然dCTP)至145ms(对于α-硫代-dATP)范围内。在四种天然dNTP中，<τ开放>对于dTTP或dATP掺入比对于dGTP或dCTP掺入要更长。此分级在针对所有四种α-硫代-dNTP所测量的更长的<τ开放>持续时间内保留。α-硫代取代在dGTP和dCTP的情况下使<τ开放>增加了50％，而对于dTTP和dATP增加超过100％。
dNTP掺入的平均KF加工速率经计算为k＝(<τ开放>+<τ闭合>)-1。τ开放在很大程度上决定了k，因为它比τ闭合长至少60倍。在其最快时，KF以超过30s-1掺入2-硫代-dCTP。上文针对α-硫代-dNTP所述的的τ开放增加使k对于α-硫代-dCTP和α-硫代-dGTP降至15s-1并且对于α-硫代-dATP和α-硫代-dTTP降至7s-1。6-Cl-2APTP掺入的速率最有利地与针对天然dGTP掺入观察到的缓慢速率相比。相反，2-硫代-dTTP和2-硫代-dCTP掺入比其天然对应物的掺入稍微更快地出现。
使用一打不同的KF分子再现相似结果。每个KF连接至不同的SWCNT-FET并且独立地测量。对于比较，用dNTP类似物测量的非均聚模板产生相似的动力学(数据未示出)。如先前提及，实验应用100μM的dNTP类似物以确保稳态条件；对于比较，用聚(dT)42模板的10μMα-硫代-dATP不影响DNA聚合。由于静态失调，一些KF分子比整体平均更快地或更慢地加工，但对于类似物与天然dNTP的相对比较没有任何显著变化。
在此项研究中进行的单分子实验对DNA聚合酶像KF的充分理解的可塑性作了说明和新的阐述。此类酶可适应、甚至显著修饰引入的dNTP。然而，直接观察到由酶所需的构象运动当面对某些改变的dNTP时保持保真度。反映了对这种适应的限制，已知DNA聚合酶展现对dNTP大小与形状中的微小变化的强敏感性。分析受益于在许多持续掺入事件期间单分子数据与天然和dNTP的比较。此分析从催化期间两个观察到的酶构象的动力学开始，其是由τ开放和T闭合捕获。
在τ开放期间发生的事件包括dNTP识别的限速步骤，其对核碱基和主链修饰都敏感。合适的核苷酸的成功识别和结合触发KF活化和闭合。相关T7DNA聚合酶的先前基于FRET的实验已鉴别了由错配识别引起的“充分开放”构象状态。然而，使用L790C连接位点，SWCNT-FET没有记录KF运动并且在错配的dNTP存在下没有信号。中间状态的不存在或错配相关运动表明连接位点对此初始保真度检查点不敏感。因此，ΔI(t)偏移是由催化定向的构象引起，并且并不仅局限于酶开放和闭合的全局运动。
dNTP类似物因其通过DNA聚合酶掺入DNA模板中的能力以及在大小、结构及反应性上的变化而被选择。检查在α-磷酸酯或核碱基处的取代。第一类型的类似物(例如α-硫代-dNTP)用硫取代非桥接的α-磷酰基氧原子以引入新的立体中心并且改变此关键位点处的反应性。第二类别的dNTP类似物在核碱基上的取代(例如卤素或硫取代)改变碱基对的大小和电子结构；一些类似物还改变可用于碱基配对的氢键。例如，6-Cl-2-APTP(图1C)具有两个氢键分布，允许其在T和C碱基的相对位置处掺入。与dATP相比，6-Cl-2-APTP用氯置换6-氨基，但引入2-氨基官能团；此构型最终提供与dATP相同数目的与T互补的沃森-克里克氢键。当用作dGTP类似物时，6-Cl-2-APTP具有不同的互变异构化，这N-1从氢键供体改变为受体。在此情况下，用氯置换氧显著降低氢键的强度。41像6-Cl-2APTP一样，硫取代的类似物2-硫代-dTTP和2-硫代-dCTP由于硫代羰基的键长增加还形成更大的碱基对。
在实施方案中，dNTP或NTP类似物在三磷酸酯部分包括化学修饰。在实施方案中，在三磷酸酯部分的化学修饰在α-位处具有S对O的取代。在实施方案中，任何dNTP或NTP类似物的三磷酸酯部分具有式(I)的结构，其中X-1为S或O。在实施方案中，dNTP类似物为α-硫代-dATP、α-硫代-dGTP、α-硫代-dCTP或α-硫代-dTTP。在实施方案中，NTP类似物为α-硫代-ATP、α-硫代-GTP、α-硫代-CTP或α-硫代-TTP。在实施方案中，dNTP或NTP类似物包括在如式(I)中列出的三磷酸酯部分的α位处的取代、以及一个或多个如本文所公开并在本领域中已知的核碱基处的取代。
在实施方案中，dNTP或NTP类似物在核碱基处被取代。在实施方案中，嘌呤如式(IIa)中所示被取代：其中X1为氢、卤素或-NH2，且X2为氢或-NH2。在实施方案中，X1为-NH2，且X2为氢，提供dATP或ATP。在实施方案中，X1不为-NH2，且X2为-NH2，提供6-取代的2-APTP或其取代的类似物。在实施方案中，该类似物为6-Cl-2-APTP，也称为6-Cl-dGTP。
在实施方案中，dNTP或NTP类似物包括核碱基，其是8-氧代鸟嘌呤、2,6-二氨基-4-氧代-5-甲酰胺基嘧啶、N6-甲基-腺苷、O6-甲基鸟苷、N2-甲基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、吲哚基、5-甲基吲哚基、5-烷基-吲哚基(例如5-乙基-吲哚基)、5-亚乙基-吲哚基、5-硝基-吲哚基、4-硝基-吲哚基、5-苯基-吲哚基、5-卤基-吲哚基(例如5-F-吲哚基)、5-氨基-吲哚基或6-硝基-吲哚基。
在实施方案中，dNTP或NTP包括具有式(IIb)结构的核碱基：其中X3为O或S。在实施方案中，X3为O，提供胞嘧啶核碱基。在实施方案中，X3为S，提供2-硫代核碱基。在实施方案中，核碱基为2-硫代-dCTP或2-硫代-CTP。
在实施方案中，dNTP或NTP包括具有式(IIc)结构的核碱基：其中X4为O或S。在实施方案中，X4为O，提供胸腺嘧啶核碱基。在实施方案中，X4为S，提供2-硫代核碱基。在实施方案中，核碱基为2-硫代-dTTP或2-硫代-TTP。
在实施方案中，dNTP或NTP包括具有式(IId)结构的核碱基：其中X5为O或S。在实施方案中，X5为O，提供6-氮杂-胸腺嘧啶核碱基。在实施方案中，X5为S，提供6-氮杂-2-硫代核碱基。在实施方案中，核碱基为6-氮杂-2-硫代-dTTP或6-氮杂-2-硫代-TTP。
在实施方案中，类似物为α-硫代dATP、dTTP、dCTP及dGTP、2-硫代dATP、dTTP、dCTP及dGTP、2-氨基-6-Cl-嘌呤-2'-脱氧核糖核苷-三磷酸(称为6-Cl dGTP或6-Cl-2APTP)、4-硫代dTTP、2-氮杂dTTP、5-氟代dTTP或γ-ANS dTTP。
在实施方案中，τ开放中观察到的差异很大程度上反映了识别和结合非天然dNTP的机制。与天然dGTP相比α-硫代-dGTP和6-Cl-2APTP的分布中的长尾可已经造成<τ开放>增加(图3B)。所述尾可以200ms的时间常数拟合第二指数，比天然dGTP的<τ开放>长约五倍。可在本文所公开的所有dNTP类似物下观察到类似的长尾，说明了当掺入非天然底物时酶所面临的挑战。除识别外的步骤在本文所报道的τ开放期间潜在地进行；共价键形成是一个可能的实例，其发生过于快速以致于因为速率限制而不可检测，甚至在α-硫代-dNTP的缓慢反应性下也如此。在2-硫代类似物下观察到的较快掺入速率可由更稳定的碱基对形成引起，从而有效地缩短了<τ开放>值。在与模板G碱基的氢键合界面处的2-硫代-dCTP硫原子的较大尺寸似乎不会影响2-硫代-dCTP有效地碱基配对的能力。在实施方案中，检测核酸聚合酶构象的方法检测到与dTTP掺入相比2-硫代-dTTP和4-硫代-dTTP的聚合效率的提高。
6-Cl-2APTP类似物与dGTP相比具有弱得多的氢键合及后续不够理想的碱基配对，其例示了KF催化的DNA聚合期间碱基配对识别的挑战。6-Cl-2APTP对比dGTP相对于聚(dC)42模板的掺入的较长<τ开放>值说明了DNA聚合酶部分地通过延长分配给识别的时间而接受非天然dNTP的可能性。在相对于聚(dC)的6-Cl-2APTP聚合期间观察到的<τ开放>值及由此的掺入速率降至介于天然dGTP与dATP相对于互补均聚模板的掺入所测量的值之间。因此，尽管当与dGTP相比时其更改的互变异构化及后续至少一个碱基配对氢键的损失，6-Cl-2APTP仍可比天然dATP更快地掺入。在实施方案中，检测核酸聚合酶构象的方法检测到当6-Cl-2APTP被视为dGTP类似物时在小沟中的碱基配对氢键保持不变并且可控制针对dGTP、dCTP及6-Cl-2APTP相对于聚(dC)模板所观察到的相对较快速率。
在实施方案中，参见，例如图5A，KF在所有四种天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物，每个碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<O。个别尖峰可如图5A所示列举，但它们一般不能将一种类型的碱基与另一种相区分。
在实施方案中，参见，例如图5B，使用2-硫代-dTTP类似物。在硫醇化脱氧胸苷下，正尖峰表示(#2、6、7)掺入T核苷酸时的位置。此观察结果可通过用RNA聚合酶取代KF而扩展至RNA测序。图5B中描绘的过程鉴别了在特定的DNA底物中的所有T核苷酸掺入。所述过程可通过用四种不同的硫醇化核苷酸的每一种测量底物而扩展至所有四种碱基。
在实施方案中，参见，例如图5C，当KF在与某些类似物混合的天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，所得图案含有可用于鉴别所选碱基的正和负电流尖峰。在实施方案中，使用与6-Cl-2APTP混合的三种天然核苷酸(dATP、dTTP、dCTP)作为用于G掺入的类似物。将在此实施方案中的电流尖峰编号以列举15个碱基掺入事件。大多数事件(#1、4、7、9、10、13、14、15)可由单个负电流尖峰组成，该尖峰鉴别了天然核苷酸的掺入。在实施方案中，其中五个事件(例如，#2、3、6、8、11；在图5C中用箭头突出显示)是正电流尖峰，其鉴别了6-Cl-2APTP核苷酸掺入。在实施方案中，当6-Cl-2APTP被用作天然dGTP核苷酸的类似物时，事件(例如，#2、3、6、8、11；在图5C中用箭头突出显示)鉴别了在DNA序列中的G核苷酸。
在实施方案中，图5C中示出的两个事件(#5、12)含有一对紧密间隔的电流尖峰。这些尖峰对可表示一个天然和一个6-Cl-2APTP核苷酸快速连续的掺入。或者，一对尖峰可为由充当dATP的假类似物的6-Cl-dAPTP引起的独特信号。
在实施方案中，检测聚合酶中的构象变化的方法被用于为寡核苷酸测序。获得的信息(例如，图5A-5C)传达寡核苷酸的序列，因为尖峰指出哪种核苷酸或类似物在聚合酶沿着其底物移动时被掺入。
除了识别和结合之外，α-硫代-dNTP掺入的延长的<τ开放>值也可由新合成的DNA的降低的稳定性引起。均聚模板的KF催化加工可产生扭曲的dsDNA。此外，α-硫代-dNTP尤其倾向于在不利的DNA主链相互作用下形成稳定性较小的二元复合物，其逐渐减慢KF的催化速率。在α-硫代-dATP/α-硫代-dTTP对比α-硫代-dGTP/α-硫代-dCTP掺入期间观察到与用相应的天然dNTP的实验相比对此步骤更明显的作用。在实施方案中，检测核酸聚合酶构象的方法表现出序列依赖性DNA不稳定性，当使用均聚模板时其突显了警告。或者，此差异可提示α-硫代取代进一步干扰致使对于天然A·T/T·A碱基对的<τ开放>更长的机制。与α-硫代-dNTP掺入有关的τ开放中的一些变化可由弱抑制性Rp立体异构体(Ki≈30μM)引起，在此类似物的商业合成中以与Sp立体异构体大约1:1的比率存在。此抑制比天然dNTP的Km弱约一个数量级，10且因此预期可仅适度地影响<τ开放>值。
在τ闭合期间，KF经历对应于引入的核苷酸与新生dsDNA之间的一个磷酸二酯键形成的不同构象变化。在底物受限的实验中，ΔI(t)偏移的数量匹配悬垂模板碱基的数量；因此，τ闭合期间的构象变化必须在每次成功的持续核苷酸掺入时发生。早先，天然dNTP的<τ闭合>的短且相等持续时间支持其中τ闭合由共价键形成步骤自身引起的模型。33在实施方案中，检测核酸聚合酶构象的方法使用在dNTP类似物下的三个观察结果。首先，ΔI(t)偏移的方向对于一些dNTP类似物是逆向的。其次，2-硫代-dNTP类似物的掺入产生正和负ΔI(t)偏移的混合物。再者，如表1所示，<τ闭合>的不变性扩展至所有测试的类似物，尽管在亲电子α-磷酸处有取代或适应核碱基上的取代所需的可能替代构象。
在此项电子技术中，下层SWCNT-FET通过连接位点1nm内的蛋白质带电表面残基而对静电门控非常敏感。同一酶的不同变体根据SWCNT相邻残基的电荷及其运动方向可展现正或负ΔI(t)偏移。在实施方案中，在检测核酸聚合酶构象的方法期间，KF及其静电门控SWCNT-FET的带电残基可保持不变。可变的ΔI(t)偏移可指示邻近于KF连接位点的残基响应于有催化能力的循环期间的某些dNTP类似物采用不同的运动。这类运动可经由变构性从KF活性位点传出，但其不是共价键形成的运动。在实施方案中，共价步骤不能用相同机制和以相同<τ闭合>持续时间进行，但是以两个相对运动。相反，造成τ闭合的相关残基运动可不依赖于初始分子识别及KF催化的化学步骤。
在实施方案中，在检测核酸聚合酶构象的方法中，KF经由“指状物”子域中的蛋白质L790C侧链连接至SWCNT-FET，从而将相关带电残基的静电门控运动与τ闭合期间的催化定向运动联系起来。每个τ闭合事件可由活性位点O-螺旋本身或在成功的核苷酸掺入的观察阶段期间在两个可能方向上扭转的特定O-螺旋残基引起。此提出的扭转是由于考虑到核苷酸掺入的已知阶段期间的活性位点残基运动及其对带电残基相对于SWCNT-FET的理论邻近性的作用而推断。举例来说，用KF的smFRET实验揭示了活性位点O-螺旋介于开放与闭合状态之间的中间构象；在KF同系物Bst Pol I的晶体结构中观察到潜在相似的“半开”构象。BstPol I O-螺旋的C末端在通向闭合的途径上扭结以使得KF Y766等效物的大移位伴随有KFF762等效物的细微旋转。KF F762等效物的旋转继续直到酶闭合。
通过比较KF与Bst Pol I的晶体结构，鉴别出邻近于SWCNT-FET的带电残基，其可响应于KF活性位点中的Y766和F762的旋转而移动。在实施方案中，在检测核酸聚合酶构象的方法中，ΔI(t)偏移的来源是酶闭合及碱基掺入之后Y766和/或F762的额外运动，该运动继续传播到接近SWCNT-FET的带电残基。通过smFRET在成功的核苷酸掺入之后已经观察到当新生碱基对移到KF插入后位点时的额外KF构象变化，并且可能是通过τ闭合测量的运动。由芳族活性位点残基赋予的显著相互作用可包括新形成的碱基对的π-π堆叠。这类运动可评估碱基对的电子构型并且询问键形成步骤的保真度而无需亲水性相互作用，这是通过dNTP类似物的取代而改变。
DNA聚合酶(包括所公开的)非常易于诱变以调整其性质，包括用于DNA测序应用。在实施方案中，本公开的方法涉及引入DNA聚合酶中的突变以用于酶与碳纳米管的生物缀合。在实施方案中，这类突变改变DNA聚合酶的性质以便于非天然碱基的更高效掺入并且改变酶的持续合成能力(processivity)。在实施方案中，这类诱变用于改善电读出和酶的性质。例如，在实施方案中，突变被引入酶活性位点中以适应具有与对酶活性位点作出的突变互补的形状或官能团的特定dNTP类似物。在实施方案中，DNA聚合酶经突变以增强由DNA聚合期间掺入的每个碱基引起的电响应；举例来说，接近碳纳米管的酶的带电残基的取代提供酶运动期间的可合理化反应。
KF纳米电路展现了对于碱基对的A·T/T·A组比G·C/C·G组更大的ΔI(t)偏移。结构结果已表明A和T模板碱基大多数深埋于DNA聚合酶活性位点中且因此，O-螺旋的旋转可最大化。KF E710和Y766及其他同源活性位点谷氨酸和酪氨酸残基已与用于A·T/T·A碱基对超过G·C/C·G碱基对的稳定化的机制有关。在实施方案中，核苷酸掺入之前在KFE710与KF Y766之间的氢键合相互作用可影响活性位点的大小和形状并且可在dNTP类似物识别的τ闭合步骤中起重要作用。
在实施方案中，在2-硫代-dTTP和2-硫代-dCTP掺入期间的相似结果说明观察到碱基对电子结构的KF优先识别。虽然硫取代仅影响2-硫代-dCTP类似物中的沃森-克里克氢键受体，但两种2-硫代-dNTP类似物都产生正和负ΔI(t)偏移的混合物且因此都造成掺入期间的类似KF运动。2-硫代-dNTP类似物的硫取代与引入6-Cl-2APTP中的更显著电子变化相比较小，但酶以类似但非排他性方式作出响应。所观察到的负和正ΔI(t)偏移的混合物提示KF在2-硫代取代的dNTP的掺入期间分别进入天然和替代运动。明显的记忆效应将酶锁定在一个运动或另一运动持续几十秒，暗示额外的构象变化，该变化在2-硫代-dNTP的特殊情况下在能量上是双稳态的。
在实施方案中，检测核酸聚合酶构象的方法包括使新生DNA穿梭到无活性的核酸外切酶(外)结构域作为正ΔI(t)偏移的可能来源。不稳定的引物末端一旦由于不够理想的碱基配对而解链，DNA便穿梭往返于无活性的外结构域并且KF经历不同的构象变化。然而，这类转变远离连接位点出现并且此时观察到的正ΔI(t)偏移不改变<τ闭合>的持续时间。因此，向外结构域的穿梭似乎与正ΔI(t)偏移的观察结果不一致。类似于已知在错配的dNTP识别期间出现的构象步骤，向外结构域的穿梭必须在τ开放期间进行。本公开的ΔI(t)偏移可在定向催化循环期间出现，并且可表示与旋转O-螺旋一致的可适应的KF运动，由此测试新形成的DNA碱基对的电子完整性。
在实施方案中，检测核酸聚合酶构象的方法，dNTP类似物挑战通过DNA聚合酶进行核苷酸掺入的限制，包括在亲电子磷酸处的立体化学、引入的碱基的氢键合能力以及保真度检查的机制。因为大多数dNTP类似物增加平均<τ开放>及其动力学分布的宽度，所以速率决定的dNTP识别步骤似乎对底物结构中的甚至较小变化也高度敏感。然而，在键形成的反应性位点处的显著取代未能影响<τ闭合>的持续时间。另一方面，ΔI(t)偏移的方向在碱基修饰的dNTP类似物下切换为正信号或负信号与正信号的混合物。因为这些dNTP类似物在与天然底物相同的键形成中心处具有官能团，所以ΔI(t)方向的显著改变可由在开放以加工下一底物之前通过KF的保真度检查引起。这类事件可容易区分于天然dNTP掺入事件并且通过逆转其动态错误检查的方向提供对适应非天然dNTP的酶的直接观察。
实施例
实施例1.通过单分子DNA聚合酶I(Klenow片段)纳米电路掺入脱氧核苷三磷酸类似物
引言.为了确保所有已知生命形式的存活，DNA聚合酶必须准确地识别引入的脱氧核苷三磷酸(dNTP)底物并且成功地催化它们向新DNA链中的掺入。所有DNA聚合酶的所需保真度部分地依赖于与单链DNA模板杂交的引入的dNTP的沃森-克里克碱基对互补性。[1,2]然而，不能与天然互补碱基进行氢键合的非天然dNTP也通过DNA聚合酶成功地掺入。这种类似物可形成具有类似于规范的A·T和G·C碱基对的形状的稳定碱基对。[3-5]dNTP类似物的研究揭示了对核苷酸掺入期间的立体化学、几何结构、电子效应及疏水性相互作用的需要。[6-9]
来自dNTP类似物掺入实验的结果阐明了通过DNA聚合酶的核苷酸选择标准，包括对进一步链延伸和高效催化的需要。例如，来自与硫代磷酸酯类似物的聚合的催化速率决定了对通过将3’-OH引发到dNTP的亲电子α-磷酸酯上的亲核攻击的立体化学优选。[6]核碱基的小修饰，包括在氢键合位置中的硫代和卤取代，造成掺入率改变并且显示对在DNA聚合酶活性位点中的紧密空间配合的需要。[8,10]]掺入非天然碱基所需的沃森-克里克样几何结构是通过聚合酶活性位点与出现的碱基对之间的若干相互作用诱导。[5]
除了单个碱基对之外的非天然dNTP聚合的详细评估可提供关于此非天然聚合酶活性的准确的动力学信息。此外，碱基识别期间相关的小构象变化向可靠的测量的转换可展现空间排列和电子学在DNA聚合中的作用的新方面。如在此所报道，这种信息可通过单分子技术被阐明。
酶的本体或整体群体的常规研究不能观察反应机制中的中间步骤和过渡状态。然而，个别分子的实验允许观察这种状态，否则其将在整体群体中被平均。[11-13]采用单分子共振能量传递(smFRET)的DNA聚合实验已揭示了构象灵活性以及对DNA聚合酶IKlenow片段(在下文中称为KF)的保真度机制的认识。[14-16]尽管smFRET有捕捉有关酶动态的新信息的能力，但它需要荧光标记的蛋白质和/或底物。光漂白及荧光团之间的光子通量分别限制了smFRET实验的持续时间和时间分辨率。
近来，描述了一种单分子酶学的新方法并且将其应用于三种酶。在此项技术中，个别蛋白质被生物缀合至单壁碳纳米管场效应晶体管(SWCNT-FET；图1A)。该方法揭示了对T4溶菌酶(一种已研究了100余年的酶)的步骤数量、动力学参数及持续加工能力的新认识。[17,18]多核苷酸激酶A(PKA)的极大动态速率揭示了酶作为高度可调节的分子开关的作用。[19]在检查缀合至SWCNT-FET的KF时，A·T/T·A与G·C/C·G碱基配对之间的显著差异提示酶的闭合构象取决于引入的dNTP的特性。[20]对此差异的敏感性是惊人的，因为沃森-克里克碱基对具有相似的大小，并且这指出SWCNT-FET技术还可能响应于独特的动力学及与dNTP类似物有关的构象。
在此，SWCNT-FET技术被用于区分在通过KF掺入期间的天然dNTP与dNTP类似物之间的差异。使用硫代和卤取代的dNTP类似物，监测DNA聚合，然后进行统计分析以揭示一些而非所有dNTP类似物的掺入动力学中的差异。此外，每种类似物花费在酶开放和闭合构象上的时间揭示了限速步骤所需的时间变化。结果提供了在催化期间酶锚定的形象及分子识别中的挑战。
实验.制造SWCNT FET[17]并且用核酸外切酶缺乏的KF的单半胱氨酸变体来官能化。KF纯化至>95％确保了其同质性。基于荧光的测定证实了连接之前本体酶的活性。[20,21]从每个装置收集数据之后，原子力显微术证实了个别KF分子的连接(图1B)。
对于每次测量，选择dNTP以与均聚模板聚(dA)42、聚(dT)42、聚(dG)42及聚(dC)42互补。将每个模板融合至M13引发位点并且与M13正向引物以1:1化学计量比混合；对于杂交，将混合物加热至95℃持续5至10分钟，接着冷却至室温。将SWCNT FET与模板-引物杂交物一起以100nM浓度浸没在标准DNA Pol I活性缓冲液(20mM Tris、50mM NaCl、10mM MgCl2、100μM TCEP pH 8.0)中。将天然或类似dNTP过量添加到缓冲液中，从而确保对KF的Vmax条件。为了弥补dNTP类似物的较慢掺入，实验采用比天然dNTP(10μM，Fisher)更高浓度的类似物(图1C，100μM，Trilink Biotechnologies)。
测量由在连接的KF分子与其周围环境相互作用时监测SWCNTFET的源-漏电流I(t)组成。FET被偏压在100mV，并且充当栅电极的电解质保持在0V。装置与任何核苷酸及其互补模板-引物的孵育转导用电流前置放大器(Keithley 428)测量的波动ΔI(t)，在100kHz下数字化，并且存储用于后续分析。测量之间，用分析缓冲液冲洗KF纳米电路两次，在缓冲液中孵育5分钟，随后在引入另一核苷酸之前用缓冲液再次冲洗两次。在多个类似物、相应的天然dNTP及无核苷酸的缓冲液下监测每个KF分子以便收集直接可比的数据集，从而证实典型的KF活性并且再现先前报道的ΔI(t)类型。[20]
结果.纳米电路与天然dNTP及其互补模板-引物的孵育导致电流的负变化ΔI(t)(图2A)。如先前所报道，快速电流波动仅在KF、dNTP及模板-引物存在下出现。每个ΔI(t)偏移与KF酶的闭合有关。因此，来源于在天然dNTP下的这种电流偏移测量的动力学参数与先前的酶运动分析一致(例如，图2A)。[20]这些测量提供基线值以供与dNTP类似物比较(表1)。
表1：通过KF的天然和类似dNTP掺入的动力学a
a平均值±标准偏差
b对于向上或向下切换事件观察到相似的值。
dNTP类似物检查在α-磷酸处的取代或核碱基的改变。在第一类别中，硫对磷酰基氧原子的取代将新的立体中心引入dNTP中以形成α-硫代-dNTP，也称为dNTPαS。商业上合成而不对立体化学进行控制，在此α-磷处的非对映异构体比率可能为1:1。在第二类别的dNTP类似物中，在核碱基上的卤素或硫取代可引入具有改变的互变异构化的较大碱基且因此不同的氢键合。例如，类似物6-氯-dGTP(也称为6-Cl-2-APTP)具有与dGTP不同的互变异构化，这将N-1从氢键供体改变为受体。而且，用氯化物置换氧降低氢键的强度。修饰的核碱基的其他实例2-硫代-dTTP和2-硫代-dCTP用硫取代氧以增加这些碱基的大小。由这些类似物掺入引起的动力学改变预期产生区别性的电子信号，或许减慢引入的dNTP的酶识别。
将硫代磷酸酯类似物(α-硫代-dNTP)、6-Cl-dGTP、2-硫代-dTTP及2-硫代-dCTP与互补模板-引物一起孵育。如在天然dNTP下观察到的，负电流波动在α-硫代-dNTP掺入期间发生(图2B)。相反，6-Cl-dGTP掺入造成正电流波动(图2C)。含有2-硫代取代的类似物造成负和正电流波动的混合物。α-硫代-dGTP和6-Cl-dGTP类似物两者都产生ΔI(t)偏移两次至三次，与dGTP相比不那么频繁。
τ开放和τ闭合的分布来源于dGTP及其两种类似物的大于50s的聚合数据(图3A-3B)。数据拟合具有单<τ>时间常数的简单泊松分布。天然和类似dGTPτ闭合事件的分布的拟合仅稍微彼此偏离，特别是在尾部处。大多数事件与高概率重叠(-50％)。在dGTP、α-硫代-dGTP或6-Cl-dGTP存在下闭合复合物的平均持续时间相差很小(0.2-0.4ms)。对于天然dGTP，对数据的单指数拟合涵盖>90％的τ开放事件。然而，对于α-硫代-dGTP或6-CldGTP数据的相似拟合仅可涵盖≈75％的τ开放事件。在KF开放构象中，仅20-30％的类似物事件与天然dGTP所需的精确时间常数重叠。dGTP类似物掺入的动力学明显与天然偏离，并且它们的平均时间常数可容易区分。
动力学参数τ闭合、τ开放及掺入速率(k)的分析扩展到其他天然和类似底物(表1)。如对于α-硫代-dGTP和6-Cl-dGTP所述，KF闭合期间磷酸二酯键的形成(通过τ闭合量化)对于所检查的所有dNTP(包括天然和类似物)来说持续0.2与0.4ms。对于所有α-硫代dNTP来说，KF开放构象τ开放的平均持续时间比其天然dNTP长2至3倍。举例来说，与天然dGTP(24±1ms)相比，当加工α-硫代-dGTP(63±3ms)时KF在开放构象τ开放上花费大约2.5倍更久。如对于天然dNTP所报告，[20]α-硫代-dCTP和α-硫代-dGTP与α-硫代-dATP和α-硫代-dTTP相比更快地掺入到新生链中。τ开放占优势的A·T/T·A碱基对形成比G·C/C·G碱基对的τ开放长2至3倍。
τ开放和τ闭合值揭示dNTP掺入的完整循环所需的时间。平均KF加工速率计算为k＝1/(<τ开放>+<τ闭合>)。考虑到在开放构象中花费的多得多的时间(>98％)，τ开放的持续时间很大程度上决定了酶促催化的速率。平均KF加工速率对于α-硫代-dNTP和6-Cl-dGTP类似物来说低2至3倍，因为τ开放要长2至3倍。举例来说，当加工6-Cl-dGTP(<τ开放>＝50±1ms)时花费在KF开放构象上的时间是dGTP加工时的约两倍(<τ开放>＝24±1ms)，分别产生20S-1对比41S-1的速率。2-硫代-dTTP(<k>＝16S-1)和2-硫代-dCTP(<k>＝36S-1)的速率与其天然对应物大致相同。
讨论.磷酸二酯键形成似乎与类似物取代无关，甚至在α-磷酸酯被修饰时。α-硫代-dNTP的硫取代关键的亲电子官能团中的非桥连氧原子。尽管磷酸酯的亲电性较弱且硫代磷酸二酯与磷酸二酯相比后续反应性降低，但键交换步骤仍是快速而非限速的。[22,23]
大约25％的α-硫代-dGTP和6-Cl-dGTPτ开放事件偏离数据的单指数拟合，这与当酶努力在非天然dNTP周围闭合时发生的更大外离事件一致。τ开放的较慢时间常数证实修饰碱基所固有的限速的引入dNTP识别步骤所需的时间更久。然而，天然与类似dGTP的分布之间的相当大的重叠防止每个事件的KF构象的瞬时分配(instantaneous assignment)。
先前的研究确定了α-硫代dNTP的Sp非对映异构体作为DNA PolI掺入的唯一优选底物。6观察到的α-硫代-dNTP加工速率可归因于通过Rp非对映异构体的DNA聚合酶的假底物抑制。α-硫代-dTTP的Rp非对映异构体较弱地结合至KF活性位点，并且以Ki≈30μM抑制其催化。此抑制常数比天然dNTP的Km弱大约一个数量级。6虽然非立体化学控制的α-硫代取代有效地除去一半可利用的底物，但大量过量的α-硫代-dGTP确保这种作用不可能是花费在酶开放构象上的时间明显延长的原因。另外，α-硫代-dNTP的非对映异构体混合物还可影响所合成链的DNA主链的稳定性。[24,25]然而，在酶闭合构象期间发生的由τ闭合量化的磷酸二酯主链的形成保持不变。因此，在减缓α-硫代-dNTP的动力学中最可能的原因是引入的碱基识别步骤期间通过Rp立体异构体的抑制。因此，KF发现具有正确立体化学构型的dNTP，排除了竞争结合并抑制酶的不正确底物。
先前的研究显示通过DNA聚合酶α高效催化的6-Cl-dGTP以碱基配对掺入聚(dC)模板中。[26]]尽管6-Cl-dGTP可通过T4DNA聚合酶在碱基T的相对位置掺入，[27,28]但迄今为止此能力未在KF官能化的纳米电路中被探究。本文所述的6-Cl-dGTP的实验说明DNA聚合酶能够以不正确的沃森-克里克碱基配对接受非天然dNTP。为了成功地掺入这些非天然碱基，DNA聚合酶必须采用核苷酸选择的常规氢键合识别标准的替代。动力学结果与同dNTP识别期间的氢键合有关的速率限制步骤的调整一致。
推测在鉴别较大尺寸的碱基6-Cl-dGTP、2-硫代-dTTP及2-硫代-dCTP之后的构象变化可诱导在对敏感SWCNT-FET的电荷门控中的差异。令人高兴的是，当KF纳米电路与6-Cl-dGTP及聚(dC)42一起孵育时观察到独特信号。正ΔI(t)偏移或“向上切换”可能表示酶闭合的不同模式(图2D)。这些信号与天然dGTP掺入的结果相反。20如在T4溶菌酶的电荷突变体的实验中所示，29在6-Cl-dGTP掺入期间带负电的氨基酸官能团必须移动更靠近纳米管抑或带正电的官能团必须移动远离。对于2-硫代取代的dNTP，观察到向上和向下切换事件的复杂混合物。与KF闭合有关的向上和向下切换的随机分布表明酶采用一种以上构象来保持高效催化。
尽管在天然与类似dGTP掺入的动力学中有大的重叠，但KF在2-硫代dCTP、2-硫代dTTP及6-Cl-dGTP的催化期间明显获取不同的构象。这些独特的向上切换信号可由在往返于核酸外切酶结构域分配期间通过KF J-螺旋调节的构象变化所引起，因为KF识别不那么完美的互补碱基的掺入。[14,30-32]然而，这种穿梭需要以极快速率进行，因为与天然dNTP相比，对于6-Cl-dGTP、2-硫代-dTTP及2-硫代-dCTP没有观察到酶闭合时间τ闭合之间的差异。为了在DNA测序中的可能应用，允许引入的dNTP鉴别的这些不同信号的潜能值得进一步研究。
结论.总之，dNTP类似物挑战通过DNA聚合酶掺入核苷酸的限制，包括亲电子磷酸处的立体化学、引入的碱基的氢键合能力以及酶闭合的程度。因为大多数所检查的类似物减小τ开放及相应的酶速率，所以速率决定的dNTP识别步骤似乎对底物结构中的较小变化也高度敏感。相反，在键形成的反应性位点处的甚至显著取代也未能影响KF闭合时间。在此所述的结果表明在使用KF纳米电路进行dNTP类似物掺入的每个步骤期间两种可能的策略是针对KF构象分配。首先，修饰可靶向dNTP识别和活化期间开放KF的构象。然而，迄今为止，包括6-Cl-dGTP和α-硫代-dNTP的修饰的dNTP只能减缓酶的平均速率。值得额外研究的另一策略影响KF的闭合构象。修饰的碱基如6-Cl-dGTP、2-硫代dCTP及2-硫代-dTTP可改变掺入期间酶的构象，从而显著影响增加通过SWCNT的电流时观察到的电子信号。这种向上切换可容易区分于天然dNTP的掺入并且提供对容易适应非天然dNTP的酶的直接观察。总之，即使是充分研究的酶的构象敏感的电子测量也可揭示酶运动和动态的新的且出乎意料的方面。
参考(实施例1).[1]Echols,H.；Goodman,M.F.Annu.Rev.Biochem.1991,60,477；[2]Kunkel,T.A.J.Biol.Chem.2004,279,16895；[3]Goodman,M.F.Proc.Natl.Acad.Sci.1997,94,10493；[4]Kool,E.T.Annu.Rev.Biochem.2002,71,191；[5]Betz,K.；Malyshev,D.A.；Lavergne,T.；Welte,W.；Diederichs,K.；Dwyer,T.J.；Ordoukhanian,P.；Romesberg,F.E.；Marx,A；Nat.Chem.Biol.2012,8,612；[6]Burgers,P.M.；Eckstein,F.J.Biol.Chem.1979,254,6889；[7]Chiaramonte,M.；Moore,C.L.；Kincaid,K.；Kuchta,R.D；Biochemistry 2003,42,10472；[8]Kim,T.W.；Delaney,J.C.；Essigmann,J.M.；Kool,E.T.Proc；Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,15803；[9]Kincaid,K.；Beckman,J.；Zivkovic,A.；Halcomb,R.L.；Engels,J.W.；Kuchta,R.D.Nucleic AcidsRes.2005,33,2620；[10]Sintim,H.O.；Kool,E.T.J.Am.Chem.Soc.2006,128,396；[11]Deniz,A.A.；Mukhopadhyay,S.；Lemke,E.A.J.R.Soc；Interface 2008,5,15；[12]Lu,H.P.Chem.Soc.Rev.2014,43,1118；[13]Min,W.；English,B.P.；Luo,G.；Cherayil,B.J.；Kou,S.C.；Xie,X.S.Acc.Chem.Res.2005,38,923；[14]Christian,T.D.；Romano,L.J.；Rueda,D.Proc.Natl.Acad.Sci；U.S.A.2009,106,21109；[15]Santoso,Y.；Joyce,C.M.；Potapova,O.；Le Reste,L.；Hohlbein,J.；Torella,J.P.；Grindley,N.D.F.；Kapanidis,A.N.Proc；Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,715；[16]Berezhna,S.Y.；Gill,J.P.；Lamichhane,R.；Millar,D.P.J.Am；Chem.Soc.2012,134,11261；[17]Choi,Y.；Moody,I.S.；Sims,P.C.；Hunt,S.R.；Corso,B.L.；Perez,I.；Weiss,G.A.；Collins,P.G.Science 2012,335,319；[18]Choi,Y.；Moody,I.S.；Sims,P.C.；Hunt,S.R.；Corso,B.L.；Seitz,D.E.；Blaszczak,L.C.；Blaszcazk,L.C.；Collins,P.G.；Weiss,G.A.J.Am.Chem.Soc.2012,134,2032；[19]Sims,P.C.；Moody,I.S.；Choi,Y.；Dong,C.；Iftikhar,M.；Corso,B.L.；Gul,O.T.；Collins,P.G.；Weiss,G.A.2013；[20]Olsen,T.J.；Choi,Y.；Sims,P.C.；Gul,O.T.；Corso,B.L.；Dong,C.；Brown,W.A.；Collins,P.G.；Weiss,G.A.J.Am；Chem.Soc.2013,135,7855；[21]Frey,M.W.；Sowers,L.C.；Millar,D.P.；Benkovic,S.J；Biochemistry 1995,34,9185；[22]Knowles,J.R.Annu.Rev.Biochem.1980,49,877；[23]Bryant,F.R.；Johnson,K.A.；Benkovic,S.J.Biochemistry 1983,22,3537；[24]Eckstein,F.；Jovin,T.M.Biochemistry 1983,22,4546；[25]Mizrahi,V.；Henrie,R.N.；Marlier,J.F.；Johnson,K.A.；Benkovic,S.J.Biochemistry 1985,24,4010；[26]Patro,J.N.；Urban,M.；Kuchta,R.D.Biochemistry 2009,48,180；[27]Devadoss,B.；Lee,I.；Berdis,A.J.Biochemistry 2007,46,13752；[28]Zhang,X.；Motea,E.；Lee,I.；Berdis,A.J.Biochemistry2010,49,3009；[29]Choi,Y.；Olsen,T.J.；Sims,P.C.；Moody,I.S.；Corso,B.L.；Dang,M.N.；Weiss,G.A.；Collins,P.G.Nano Lett.2013,13,625；[30]Mizrahi,V.；Benkovic,P.；Benkovic,S.J.Proc.Natl.Acad.Sci；U.S.A.1986,83,5769；[31]Joyce,C.J.Biol.Chem.1989,264,10858；[32]Tuske,S.；Singh,K；Kaushik,N.；Modak,M.J.J.Biol.Chem；2000,275,23759；
实施例2.通过单分子DNA聚合酶I(Klenow片段)纳米电路-2掺入的脱氧核苷三磷酸类似物。
说明.将DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)的单个拷贝连接到单壁碳纳米管装置并且在不同的化学辅因子存在下进行电学测量。制造的所有方面都按照由Olsen等人所述的方案进行。
结果.图4A-4B显示当KF在天然的核苷酸三磷酸脱氧胸苷(dTTP存在下加工聚(dA)42时，各碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<0。当dTTP被非天然核苷酸2-硫代-2’-脱氧胸苷-5’-三磷酸(2-硫代-dTTP)取代时，碱基掺入产生正电流尖峰ΔI>0。
图5A显示当KF在所有四种天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，每个碱基对掺入产生负电流尖峰ΔI<O。个别尖峰可如所示列举，但一般说来，它们不能将一种类型的碱基与另一种相区分。
如图5B中所示，用被2-硫代-dTTP取代的dTTP模拟相同的数据集。在硫醇化脱氧胸苷下，正尖峰现表示(#2、6、7)掺入T核苷酸时的位置。此观察结果可通过用RNA聚合酶取代KF而扩展至RNA测序。图5B中描绘的过程鉴别了在特定的DNA底物中的所有T核苷酸掺入。所述过程可通过用四种不同的硫醇化核苷酸的每一种测量底物而扩展至所有四种碱基。
图5C显示当KF在与某些类似物混合的天然核苷酸(dNTP)存在下加工异质性底物时，所得图案含有可用于鉴别所选的碱基的正和负电流尖峰。此实施例示出了使用与6-Cl-2APTP混合的三种天然核苷酸(dATP、dTTP、dCTP)作为用于G掺入的类似物获得的数据。将在此数据的电流尖峰编号以列举15个碱基掺入事件。大多数事件(#1、4、7、9、10、13、14、15)由单个负电流尖峰组成，该尖峰鉴别了天然核苷酸的掺入。五个事件(#2、3、6、8、11)用箭头突出显示，因为它们是鉴别6-Cl-2APTP核苷酸掺入的正电流尖峰。因为6-Cl-2APTP在此被用作天然dGTP核苷酸的类似物，所以这五个事件鉴别了DNA序列中的G核苷酸。
图5C中示出的两个事件(#5、12)含有一对紧密间隔的电流尖峰。这些尖峰对可表示一个天然和一个6-Cl-2APTP核苷酸快速连续的掺入。或者，一对尖峰可为由充当dATP的假类似物的6-Cl-dAPTP引起的独特信号。
参考(实施例2和背景).[1]T.J.Olsen,Y.Choi,P.C.Sims,0.T.Gul,B.L.Corso,C.Dong,...G.A.Weiss,Electronic Measurements of Single-Molecule Processing byDNA polymerase I(Klenow fragment),I Am.Chem.Soc.135,7855(2013)；[2]Y.Choi,1.S.Moody,P.C.Sims,S.R.Hunt,B.L.Corso,G.A.Weiss,and P.G.Collins,Single-Molecule Lysozyme Dynamics Monitored by an Electronic Circuit,Science 335,319(2012)；[3],Y.Choi,1.5.Moody,P.C.Sims,S.R.Hunt,B.L.Corso,D.E.Seitz,...G.A.Weiss,Single Molecule Dynamics of Lysozyme Processing DistinguishesLinear and Cross-linked Peptidoglycan Substrates,.1.Am.Chem.Soc.134,2032(2012)；[4],Y.Choi,T.J.Olsen,P.C.Sims,1.S.Moody,B.L.Corso,M.N.Dang,.P.G.Collins,Dissecting Single-Molecule Signal Transduction in CarbonNanotube Circuits with Protein Engineering,Nano Lett.13,625(2013)；[5],P.C.Sims,I.S.Moody,Y.Choi,C.Dong,M.Iftikhar,B.L.Corso,...G.A.Weiss,ElectronicMeasurements of Single-Molecule Processing by protein kinase A,IAni.Chem.Soc.135,7861(2013；[6],L.T.C.Franca,E.Carrilho,and T.B.L.Kist,Areview of DNA sequencing techniques,Quarterly Reviews of Biophysics 35,169(2002)；[7],5.E.Jacutin,Unnatural Nucleotides for DNA Sequencing.(Texas A&MUniversity,College Station,TX,1997).[8],T.D.Harris,P.R.Buzby,H.Babcock,E.Beer,J.Bowers,I.Braslavsky,.Z.Xie,Single-Molecule DNA Sequencing of a ViralGenome Science 320 106(2008)；[9],D.Stoddart,A.J.Heron,E.Mikhailova,G.Maglia,and H.Bayley,Single-nucleotide discrimination in immobilized DNAoligonucleotides with a biological nanopore,Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.106,7702(2009)；[10],S.Sorgenfrei,C.-y.Chiu,R.L.Gonzalez,Y.-J.Yu,P.Kim,C.Nuckolls,andK.L.Shepard,Label-free single-molecule detection of DNA-hybridizationkinetics with a carbon nanotube field-effect transistor,Nat.Nanotechnol.6,126(2011)；[11],T.C.Glenn,Field guide to next-generation DNA sequencers,MolecularEcology Resources 11,759(2011).
实施例3：KF的表达和纯化
商购获得的试剂包括抗生素(Fisher Scientific)、Ni-IMAC树脂(Bio-RadLaboratories)、细胞系(Stratagene)、脱氧核苷三磷酸(Fisher Scientific)、脱氧核苷三磷酸类似物(Trilink Biotechnologies)、酶(New England Biolabs或Fermentas)、寡核苷酸(Fisher)、高分辨率琼脂糖(The Nest Group)以及96孔荧光板(Nunc)。所有其他化学品都是由Acros Organics,EMD,Fisher Scientific或Sigma Aldrich商购获得。所有试剂都直接使用。
含有编码KF(D355A/E357A/C907S/L790C)1,2的基因(在下文称为KF)的pET28c质粒被用于通过热休克转化CaCl2感受态BL21(DE3)大肠杆菌细胞。在固体培养基上生长过夜之后，单个集落被用于接种25mL补充有40μg/mL卡那霉素的LB培养基用于在37℃下伴随振荡在液体培养基中生长过夜。用10mL过夜培养物接种补充有40μg/mL卡那霉素的LB(1L)并且在37℃下伴随振荡孵育几小时。一旦细胞达到对数晚期(OD600＝0.9)，便通过添加1mM IPTG诱导KF表达。在37℃下伴随振荡表达蛋白质3-4h之后，通过离心(6000rpm，20min，4℃)采集细胞并且再悬浮于溶解缓冲液(20mM Tris、50mM NaCl、10mM BME，pH 8.0)中。通过超声处理溶解细胞并且通过离心(15,000rpm，45min，4℃)收集细胞碎片。经由0.45μm孔隙过滤器过滤之后，允许溶解产物上清液在4℃下结合至Ni-IMAC树脂过夜。将KF在具有250mM咪唑的溶解缓冲液中洗脱，浓缩，然后用TEV蛋白酶在4℃下处理两天。将混合物离心，然后经由0.45μm过滤器过滤，之后在Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC上在TBS(20mM Tris、50mMNaCl、100μM TCEP pH 7.9)中进行尺寸排阻色谱法。通过SDS-PAGE评价KF纯度(图6)。
KF及dNTP类似物掺入的整体活性
用于测试活性的寡核苷酸
表2列出了用于测试KF活性、dNTP类似物掺入及用于纳米电路测量的寡核苷酸。一旦接收到，便将HPLC纯化的寡核苷酸在水中溶解至100μM。粗体区表示M13引发位点。斜体区表示限制位点。[2AmPur]表示2-氨基嘌呤。
表2.用于活性及电子测量的寡核苷酸
KF活性的整体测定
为了证实变体KF(L790C)对比野生型KF的活性，先前所述的测定如下进行改编。1,3将含有2-氨基嘌呤(表S1中的ActAssay模板)和M13引发位点(加下划线)的随机化DNA模板通过加热混合物至65℃并缓慢冷却至室温持续1h来与M13F引物退火。在与引物-模板混合物(25μM)和dNTP(250μM)孵育后，对于KF(L790C)和野生型KF(都是1μM)观察到荧光的可比较的减少。通过减去背景校正原始荧光数据，其是在dNTP不存在下测量。在此实验中使用的激发和发射波长分别为305和365nm。
dNTP类似物掺入的整体测定
为了证实dNTP类似物的掺入，在与M13F引物杂交之后通过KF聚合随机化DNA模板(表S1)。阳性对照反应含有KF(1μM)、dNTP或dNTP类似物(100μM)以及在10mM Tris、50mMNaCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.9中的A/T或G/C掺入模板-引物(5μM)。测试dNTP类似物掺入的反应含有100μM类似物代替其天然dNTP，且阴性对照反应省去类似物或其天然dNTP。将反应保持在25℃下在热循环仪中2h，之后在5％高分辨率琼脂糖凝胶上电泳(图8B)。
本公开的实施方案：
一种检测核酸聚合酶构象中的变化的方法，所述方法包括：
(i)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第一核苷酸或第一核苷酸类似物及模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；
(ii)通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的第一电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。
所述方法，其中所述核酸聚合酶与第一核苷酸类似物接触。
所述方法，其还包括(iii)基于由所述第一电导变化产生的第一信号鉴别所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物。
所述方法，其还包括：(iv)允许所述构象上变化的核酸聚合酶释放所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物，由此改造所述核酸聚合酶。
所述方法还包括
(v)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第二核苷酸或第二核苷酸类似物及所述模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第二核苷酸或第二核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；以及
(vi)通过测量所述核酸聚合酶与结合至第二核苷酸或第二核苷酸类似物及模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的电导变化来检测所述构象上变化的核酸聚合酶。
如权利要求5所述的方法，其中所述核酸聚合酶与第二核苷酸类似物接触。
所述方法，其还包括(vii)基于由所述第二电导变化产生的第二信号鉴别所述第二核苷酸或第二核苷酸类似物；以及鉴别模板核酸内的序列。
所述方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物以非沃森-克里克碱基配对与所述模板核酸序列杂交。
所述方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物为2-硫代dCTP、2-硫代dTTP或6-Cl-dGTP、6-氮杂-dTTP、α-硫代-dATP或α-硫代-dTTP。
所述方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物在三磷酸酯部分被修饰。
所述方法，其中所述三磷酸酯部分包含α-硫代取代。
所述方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物为α-硫代-dATP、α-硫代-dGTP、α-硫代-dCTP或α-硫代-dTTP。
所述方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物还在核碱基处包含取代。
所述方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物为α-硫代-2-硫代-dTTP、α-硫代-2-硫代-dCTP、α-硫代-6-Cl-20APTP或6-Cl-2APTP。
序列表
<110> The Regents of the University of California
Collins, Philip G.
Weiss, Gregory A.
Choi, Yongki
Olsen, Tivoli
<120> 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测
<130> 48538-526001WO
<150> US 62/093,671
<151> 2014-12-18
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2-氨基嘌呤
<400> 2
tcgagctatc tctaaagcag ctaactatcg agctatcgcg aaactggccg tcgttttaca 60
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
cctaacgcag atagacgttg tttagagccc gggtcggcca tactggccgt cgttttaca 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
cctaacgcag atagacgttg tttagagatt taaattcggc cactggccgt cgttttaca 59
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaactggccg tcgttttaca 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttactggccg tcgttttaca 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggactggccg tcgttttaca 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccactggccg tcgttttaca 60
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tt 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gg 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cc 42

Claims (14)

1.一种检测核酸聚合酶构象中的变化的方法，所述方法包括：
(i)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第一核苷酸或第一核苷酸类似物及模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第一核苷酸或所述第一核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；
(ii)通过测量核酸聚合酶与构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的第一电导变化来检测构象上变化的核酸聚合酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶与第一核苷酸类似物接触。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括(iii)基于由所述第一电导变化产生的第一信号鉴别所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物。
4.如权利要求3所述的方法，其还包括：(iv)允许所述构象上变化的核酸聚合酶释放所述第一核苷酸或第一核苷酸类似物，由此改造所述核酸聚合酶。
5.如权利要求4所述的方法，其还包括
(v)将非共价地连接至单壁碳纳米管(SWNT)的核酸聚合酶与第二核苷酸或第二核苷酸类似物及所述模板核酸序列接触，由此形成结合至所述第二核苷酸或第二核苷酸类似物及所述模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶；以及
(vi)通过测量所述核酸聚合酶与结合至第二核苷酸或第二核苷酸类似物及模板核酸序列的构象上变化的核酸聚合酶之间在SWNT中的电导变化来检测所述构象上变化的核酸聚合酶。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸聚合酶与第二核苷酸类似物接触。
7.如权利要求5或6所述的方法，其还包括(vii)基于由所述第二电导变化产生的第二信号鉴别所述第二核苷酸或第二核苷酸类似物；以及鉴别模板核酸内的序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物以非沃森-克里克碱基配对与所述模板核酸序列杂交。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物为2-硫代dCTP、2-硫代dTTP或6-Cl-dGTP、6-氮杂-dTTP、α-硫代-dATP或α-硫代-dTTP。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物在三磷酸酯部分被修饰。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述三磷酸酯部分包含α-硫代取代。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物为α-硫代-dATP、α-硫代-dGTP、α-硫代-dCTP或α-硫代-dTTP。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物还在核碱基处包含取代。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述第一核苷酸类似物或所述第二核苷酸类似物为α-硫代-2-硫代-dTTP、α-硫代-2-硫代-dCTP、α-硫代-6-Cl-20APTP或6-Cl-2APTP。
CN201580072789.4A 2014-12-18 2015-12-17 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测 Pending CN107109466A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811305798.5A CN109517878A (zh) 2014-12-18 2015-12-17 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462093671P 2014-12-18 2014-12-18
US62/093,671 2014-12-18
PCT/US2015/066321 WO2016100635A1 (en) 2014-12-18 2015-12-17 Detection of nucleic acid polymerase conformational changes using a nanotube

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811305798.5A Division CN109517878A (zh) 2014-12-18 2015-12-17 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107109466A true CN107109466A (zh) 2017-08-29

Family

ID=56127582

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811305798.5A Pending CN109517878A (zh) 2014-12-18 2015-12-17 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测
CN201580072789.4A Pending CN107109466A (zh) 2014-12-18 2015-12-17 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811305798.5A Pending CN109517878A (zh) 2014-12-18 2015-12-17 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20180051316A1 (zh)
EP (1) EP3234178A4 (zh)
JP (1) JP2018500905A (zh)
KR (1) KR20170091158A (zh)
CN (2) CN109517878A (zh)
AU (1) AU2015364602B2 (zh)
CA (1) CA2971268A1 (zh)
RU (1) RU2721965C2 (zh)
SG (1) SG11201704862UA (zh)
WO (2) WO2016100637A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114641578A (zh) * 2019-03-01 2022-06-17 通用测序技术公司 用于生物聚合物鉴定的装置和方法

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11624725B2 (en) 2016-01-28 2023-04-11 Roswell Blotechnologies, Inc. Methods and apparatus for measuring analytes using polymerase in large scale molecular electronics sensor arrays
CN109328301B (zh) 2016-01-28 2021-03-12 罗斯韦尔生物技术股份有限公司 大规模并行dna测序装置
KR20180104159A (ko) 2016-02-09 2018-09-19 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 전자 비표지 dna 및 게놈 시퀀싱
US10597767B2 (en) 2016-02-22 2020-03-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Nanoparticle fabrication
US9829456B1 (en) 2016-07-26 2017-11-28 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices
CN106244712B (zh) * 2016-08-31 2019-11-19 北京大学 Dna测序方法
US20190376925A1 (en) * 2016-11-22 2019-12-12 Roswell Biotechnologies, Inc. Nucleic acid sequencing device containing graphene
WO2018132457A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Roswell Biotechnologies, Inc. Methods and systems for dna data storage
CA3052140A1 (en) 2017-01-19 2018-07-26 Roswell Biotechnologies, Inc. Solid state sequencing devices comprising two dimensional layer materials
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
EP3615685A4 (en) * 2017-04-25 2021-01-20 Roswell Biotechnologies, Inc ENZYMATIC CIRCUITS FOR MOLECULAR SENSORS
EP3622086A4 (en) 2017-05-09 2021-04-21 Roswell Biotechnologies, Inc LINK PROBE CIRCUITS FOR MOLECULAR SENSORS
CN111373049A (zh) 2017-08-30 2020-07-03 罗斯威尔生命技术公司 用于dna数据存储的进行性酶分子电子传感器
EP3682020A4 (en) * 2017-09-15 2021-06-02 Illumina, Inc. SEQUENCE DETECTION SYSTEM
CA3067230A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Illumina, Inc. Tuning and calibration features of a sequence-detection system
WO2019075100A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Roswell Biotechnologies, Inc. METHODS, APPARATUS AND SYSTEMS FOR STORING DNA DATA WITHOUT AMPLIFICATION
ES2955045T3 (es) 2017-10-13 2023-11-28 Novo Nordisk Healthcare Ag Métodos y composiciones para inhibir la expresión de ldha
CN112384296B (zh) * 2018-05-17 2023-06-27 识别分析股份有限公司 用于直接电测量酶活性的装置、系统和方法
WO2020101795A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
CN211311438U (zh) 2018-12-04 2020-08-21 欧姆尼欧美公司 流动池
US11499189B2 (en) 2019-02-14 2022-11-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
CN114555832A (zh) * 2019-05-27 2022-05-27 通用测序技术公司 鉴定核酸序列中组分的方法
WO2021050681A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Omniome, Inc. Reversible modification of nucleotides
DE202019106694U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
EP4100161A1 (en) 2020-02-04 2022-12-14 Pacific Biosciences of California, Inc. Flow cells and methods for their manufacture and use
AU2021228647A1 (en) * 2020-02-28 2022-09-22 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods for sequencing biopolymers
WO2021252800A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Nautilus Biotechnology, Inc. Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities
US11692217B2 (en) 2020-11-11 2023-07-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Affinity reagents having enhanced binding and detection characteristics
EP4281775A1 (en) 2021-01-21 2023-11-29 Nautilus Subsidiary, Inc. Systems and methods for biomolecule preparation
KR20230169143A (ko) 2021-03-11 2023-12-15 노틸러스 서브시디어리, 인크. 생체분자 보유를 위한 시스템 및 방법
AU2022341171A1 (en) 2021-09-09 2024-02-22 Nautilus Subsidiary, Inc. Characterization and localization of protein modifications
CA3227592A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Gregory KAPP Methods and systems for determining polypeptide interactions
US20230149883A1 (en) 2021-11-03 2023-05-18 Nautilus Biotechnology, Inc. Systems and methods for surface structuring
WO2023192917A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
WO2023250364A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Nautilus Subsidiary, Inc. Method for detecting analytes at sites of optically non-resolvable distances
WO2024073599A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Nautilus Subsidiary, Inc. Preparation of array surfaces for single-analyte processes
WO2024124073A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Nautilus Subsidiary, Inc. A method comprising performing on a single-analyte array at least 50 cycles of a process

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130078622A1 (en) * 2011-09-26 2013-03-28 The Regents Of The University Of California Electronic device for monitoring single molecule dynamics

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8911972B2 (en) * 2009-12-16 2014-12-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Sequencing methods using enzyme conformation
US20110287432A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-24 454 Life Science Corporation System and method for tailoring nucleotide concentration to enzymatic efficiencies in dna sequencing technologies
GB2481283B (en) * 2010-06-03 2013-07-17 Element Six Ltd A method of increasing the toughness and/or wear resistance of diamond tool pieces and diamond tool pieces fabricated by said method
CN103620403B (zh) * 2011-01-11 2016-08-10 纽约市哥伦比亚大学理事会 使用纳米管监测单分子的系统和方法
US9279154B2 (en) * 2011-12-21 2016-03-08 Illumina, Inc. Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences
CA2880869A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-27 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130078622A1 (en) * 2011-09-26 2013-03-28 The Regents Of The University Of California Electronic device for monitoring single molecule dynamics

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAITLIN M. PUGLIESE, ET AL.: "Processive Incorporation of Deoxynucleoside Triphosphate Analogs by Single-Molecule DNA Polymerase I (Klenow Fragment) Nanocircuits", 《J AM CHEM SOC.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114641578A (zh) * 2019-03-01 2022-06-17 通用测序技术公司 用于生物聚合物鉴定的装置和方法

Also Published As

Publication number Publication date
RU2721965C2 (ru) 2020-05-25
EP3234178A1 (en) 2017-10-25
JP2018500905A (ja) 2018-01-18
CN109517878A (zh) 2019-03-26
WO2016100635A1 (en) 2016-06-23
CA2971268A1 (en) 2016-06-23
WO2016100637A1 (en) 2016-06-23
AU2015364602A1 (en) 2017-07-06
KR20170091158A (ko) 2017-08-08
US20180051316A1 (en) 2018-02-22
RU2017125417A (ru) 2019-01-23
EP3234178A4 (en) 2018-07-11
RU2017125417A3 (zh) 2019-05-27
SG11201704862UA (en) 2017-07-28
AU2015364602B2 (en) 2021-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107109466A (zh) 使用纳米管的核酸聚合酶构象变化的检测
US11879155B2 (en) Compositions and methods for polynucleotide sequencing
US20220373495A1 (en) Active-electrode integrated biosensor array and methods for use thereof
Branton et al. The potential and challenges of nanopore sequencing
JP6818995B2 (ja) 電極及び化学物質の分析のための方法
CN104011866B (zh) 用于生物分子表征的纳米孔传感器
CN109312401A (zh) 连接的核酸的纳米孔测序方法
RU2679494C1 (ru) Способ безметочного одномолекулярного секвенирования ДНК и устройство для его реализации
CN109196116A (zh) 方法
CN106353504A (zh) 包含信号放大器的检测
CN108130273A (zh) 检测基板及其制作方法、检测核酸的方法
RU2780050C1 (ru) Способ безметочного одномолекулярного секвенирования днк и устройство для его реализации на основе зарядочувствительного сенсора
US20240011086A1 (en) Electronic detection of nucleic acid structure
Choi et al. Single molecule sensing with carbon nanotube devices

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170829