KR20220012920A - 핵산 서열 내의 구성요소를 확인하는 방법 - Google Patents

핵산 서열 내의 구성요소를 확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리머라아제 합성에 기반한 단일 분자 레벨에서 DNA 또는 RNA 분자를 전자적으로 확인 또는 서열결정하기 위한 방법을 제공한다.

Description

핵산 서열 내의 구성요소를 확인하는 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 27일에 출원된 미국 가출원 일련번호 62/853,119 및 2019년 6월 14일 출원인 미국 가출원 일련번호 62/861,675에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 전체 개시 내용은 본 출원에 참고로 인용된다.
분야
본 발명의 실시양태는 효소를 사용하여 핵산 서열 내의 개별적인 뉴클레오타이드를 판독하는 전자 서열결정 디바이스를 위한 방법 및 생화학적 물질에 관한 것이다.
본 출원을 통해, 본 발명과 관련된 다양한 간행물, 특허, 및 특허출원이 참고로 인용된다. 이들 간행물의 전체의 개시 내용은 당해 기술분야의 상태를 기술한다. 또한, 본 출원에서, 본 발명은 주로 DNA 및 DNA 폴리머라아제 합성을 이용하여 예시된다. 동일한 메커니즘, 원리, 및 특징은 단지 약간의 변형, 예를 들어 뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP)에 의한 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTP)의 대체, 리보오스에 의한 데옥시리보오스의 대체 등을 통해 RNA 및 RNA 폴리머라아제 합성에도 적용된다.
종래 기술(US 9,862,998 및 10,233,493)은 형광 염료로 표지된 DNA 폴리머라아제의 형태 변화를 모니터링함으로써 DNA 내로의 뉴클레오타이드 혼입을 검출하기 위한 방법을 개시한다. 효소 및 염료에 따라, 자연 발생하는 것들 및 변형된 것들을 포함하는 상이한 뉴클레오타이드는 형광 방출에 대해 상이한 진폭 및 지속기간을 생성하였다. 상기 방법은 핵산 분자의 앙상블로부터 뉴클레오타이드 서열을 결정한다.
다른 종래기술은 탄소 나노튜브 전하 센서(도 1)가 단일 DNA 프라이머 내로 개별적인 자연 발생하는 뉴클레오타이드를 혼입하는 단일 DNA 폴리머라아제의 과정을 전자적으로 실시간 모니터링할 수 있어1, 그러한 전자 디바이스는 핵산 폴리머의 서열결정에 잠재적으로 사용될 수 있음을 입증하였다. 그러나, 전기 신호(스파이크로 나타남)는 개별적으로 혼입된 뉴클레오타이드를 확인하기 위해 효과적으로 적용될 수 없다. 하기 표(참고문헌 1에서 인용함)에서 확인할 수 있는 바와 같이, DNA 폴리머라아제 혼입의 전기 신호로부터 유도된 특징적인 파라미터는 자연 발생하는 뉴클레오타이드 사이에서 상응하게 중첩된다. 따라서, τlo, τhi, H 값 모두 임의의 신뢰도로 특정 dNTP의 혼입을 확인하기에는 충분하지 않다.
Figure pct00001
종래기술의 출원(WO 2016/183218)은 하나 이상의 천연 뉴클레오타이드 트리포스페이트가 서열결정 동안 주형 스트랜드에서 그의 동족 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 형성할 수 있는 비천연 모이어티를 보유하는 유사체의 능력에 영향을 미치지 않으면서 식별 가능한 방식으로 신호 극성을 변경하는 상기 유사체로 대체된 혼합물을 청구한다. 한 예로서, α-티오-dATP는 신호 극성에서 네거티브 변화를 초래하고, 2-티오-dTTP는 신호 극성에서 포지티프 변화를 초래하여, 이들은 상기 디바이스 전하 센서(이들의 구조는 도 2 참조)에 의해 주형에서 T와 A를 구별하는데 사용될 수 있다. 그러나, Weiss와 공동 연구자들은 2-티오피리미딘-5'-트리포스페이트(2-티오-dNTP) 유사체가 DNA 폴리머라아제 I 클레나우 단편(KF) 활성이 1분 동안 네거티브 편위(excursion)를 생성하고 다른 1분 동안 포지티브 편위를 생성하는 혼합 거동을 나타냄을 보고하였다.2 이는 핵염기의 왓슨-크릭 염기 쌍 형성 에지(Watson-Crick base pairing edge)에 대한 변형이 전자 신호의 불확실성을 유발하고, 결국 핵산 서열결정을 위한 뉴클레오타이드 혼입의 결정에 불확실성을 초래함을 나타낸다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, DNA 스트랜드에 대한 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 효소적 혼입은 미스매칭된 및 매칭된 dNTP 사이3 뿐만 아니라 상이한 DNA 폴리머라아제 사이4에서 유사한 카이네틱 경로를 보유한다. 일반적으로, DNA 폴리머라아제에 의해 촉매된 DNA 중합은 반응속도론적으로 제어된 과정이다. 상기 과정에는 몇몇 주요 단계가 존재한다: (1) 형태 폐쇄(closing), (2) DNA의 3' 단부에 대한 트리포스페이트 커플링, 및 (3) DNA 전위 및 형태 재개방(reopening), 이때 커플링 반응은 율속 단계이다. 도 4는 미스매치 염기 쌍이 DNA 폴리머라아제의 폐쇄 및 재개방에 현저하게 영향을 미치지 않지만, 효소 촉매된 전이 상태(transition state, TS)에 영향을 미치는 것을 시사한다. 따라서, 천연 발생하는 뉴클레오사이드의 비염기 쌍 형성 섹션의 변형은 그들의 동력학적 파라미터를 조정할 수 있어 전자 센서에 의해 그들을 식별할 수 있도록 하여야 한다.
그 전체 내용이 본 출원에 포함된 가특허 출원 US 62/794,096, US 62/812,736, US 62/833,870, 및 US62/803,100에 개시된 바와 같이, 본 발명은 핵산 서열결정을 위한 전자 센서로서 DNA 폴리머라아제와 커플링하는 바이오폴리머 나노구조체를 포함한다(DNA 나노구조체는 도 3a 참조 및 펩타이드 나노구조체는 도 3b 참조). 도 3에 나타낸 DNA 나노구조체 및 펩타이드 나노구조체 둘 다는 특정 조건 하에서 터널링(tunneling) 및 호핑(hopping)을 통한 전자 전하의 도체이다. DNA 폴리머라아제는 각각 짧은 가요성 링커를 통해 미리규정된 위치에서 나노구조체에 부착된다. 서열결정을 위해, DNA 폴리머라아제는 먼저 "개방" 형태로 존재하고, 타겟-프라이머 이중체와 이원 복합체를 형성하고, 결국 왓슨-크릭 염기 쌍 형성을 통해 올바른 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 삼원 복합체를 형성할 수 있다. 금속 이온의 존재 하에서, 삼원 복합체는 DNA 폴리머라아제를 "폐쇄된" 형태로 만들고, 이는 신장 반응을 용이하게 한다. 새로운 포스포다이에스테르 결합이 형성되는 경우, 이중체 단부에서 신생 염기 쌍은 과신장되고, 이는 가장 가까운 이웃 염기 쌍과의 중첩 상호작용(stacking interaction)을 촉발한다. 이러한 과정은 반대 방향으로 DNA 및 DNA 폴리머라아제를 이동시키고, 따라서 다음 라운드의 혼입을 위한 개방 형태를 형성한다.5 형태 변화 및 DNA 전위를 포함하는 이들 모든 기계적 이동은 하부 나노구조체에 힘을 인가하고, 그의 염기 쌍 형성 및 중첩을 방해하여 결과적으로 뉴클레오타이드 혼입의 서명으로서 전하 수송에 변동을 초래한다.
본 발명은 바이오폴리머, 특히 DNA 및 RNA를 구성하는 개별 구성요소(또는 유닛 또는 염기)를 확인하기 위한 방법 및 화학물질을 제공한다. 예를 들어, 타겟 DNA 분자를 서열결정하기 위해, 본 발명자들은 이를 상기 나노구조체 서열결정 디바이스 상에서 DNA 합성을 위한 주형으로서 사용하는데, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 기질은 왓슨-크릭 염기 쌍 형성 규칙에 따라 성장하는 DNA 스트랜드 내에 혼입된다. DNA 서열은 뉴클레오타이드 혼입을 판독함으로써 결정된다. 최근 연구는 제3의 2가 금속 이온이 DNA 합성 중에 존재할 수 있음에도 불구하고7, DNA 합성은 두 개의 Mg2+ 이온 조력된 단계별 결합 SN2 반응임을 확인하였다.6 더구나, SN2 반응으로부터 방출된 파이로포스페이트(PPi) 기는 DNA 폴리머라아제에 의해 촉매된 DNA 합성 중에 포스페이트로 가수분해된다. DNA 중합의 일반적인 메커니즘은 도 5에 나타낸다. 성장하는 스트랜드의 말단 3' 산소는 진입하는 NTP의 α-인 원자를 공격하는 친핵체로서 작용하여 P-O 공유 결합을 형성하는데, 결국 포스페이트로 가수분해되는 파이로포스페이트의 방출이 동반된다. 반응 메커니즘에 기초하여, 본 발명은 변형된 뉴클레오타이드 기질을 제공하는데, 이는 자연 발생하는 뉴클레오타이드와는 상이한 방식으로 폴리머라아제 효소 반응의 반응속도론에 영향을 미치고, 타겟 DNA 주형 내의 개별적인 뉴클레오타이드를 구별하는데 사용할 수 있는 나노구조체에서 구별 가능한 전기 신호를 생성하여 타겟 DNA는 서열결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 DNA 폴리머라아제는 구조적 상동성에 의해 A, B, C, D, X, Y, 및 RT 패밀리로 분류된 것들을 포함한다. 예를 들어, 패밀리 A의 것들은 T7 DNA 폴리머라아제 및 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) Pol I을 포함하고; 패밀리 B의 것들은 T4 DNA 폴리머라아제, 파이29 DNA 폴리머라아제, 및 RB69를 포함하고; 패밀리 C의 것들은 이. 콜라이(E. coli) DNA 폴리머라아제 III를 포함한다. DNA 폴리머라아제의 RT(역전사효소) 패밀리는 예를 들어 레트로바이러스 역전사효소 및 진핵 텔로머라아제를 포함한다.
도 1: 실시간으로 효소 활성을 모니터링하기 위해 두 개의 전극(소스 및 드레인)에 부착된 탄소 나노튜브로 구성되고 DNA 폴리머라아제로 작용화된 종래기술의 디바이스.
도 2: 변형된 뉴클레오타이드 α-티오-dATP 및 2-티오-dTTP의 화학 구조.
도 3: 두 개의 전극에 부착된 나노구조체 상에 폴리머라아제를 보유하는 단일 분자 DNA 서열결정 디바이스의 모식도, (a) DNA 나노구조체, (b) 펩타이드 나노구조체.
도 4: (a) 상이한 DNA 폴리머라아제 Pol β WT, R258A 돌연변이체, KF, 및 Pol X에 의한 단일 뉴클레오타이드 혼입에 대한 자유 에너지 프로파일; (b) Pol β 대 I260Q 돌연변이체에 의한 매칭된 및 미스매칭된 dNTP 혼입의 정성적인 자유 에너지 프로파일.
도 5: DNA 사슬에 뉴클레오타이드 기질을 혼입시키는 반응.
도 6: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 화학 구조.
도 7: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 γ-치환된 트리포스페이트의 화학 구조.
도 8: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 β,γ-X 유사체의 화학 구조.
도 9: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 α-티오-트리포스페이트(α-티오-dNTP)의 화학 구조.
도 10: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 α-보라노-트리포스페이트(α-보라노-dNTP)의 화학 구조.
도 11: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 α-보라노-α-티오-트리포스페이트(α-보라노-α-티오-dNTP)의 화학 구조.
도 12: 자연 발생하는 뉴클레오사이드 α-셀레노-트리포스페이트(α-셀레노-dNTP)의 화학 구조.
도 13: 자연 발생하는 데옥시리보뉴클레오사이드 α-R-포스포닐-β,γ-디포스페이트의 화학 구조.
도 14: 변형된 산소 브리지 둘 다를 보유하는 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트(β,γ-X-α-Z-dNTP)의 화학 구조.
도 15: 다른 원자 또는 유기 기에 의해 대체된 γ- 및 α-인의 산소 중 하나를 보유하는 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 화학 구조.
도 16: 다른 원자에 의해 대체된 그들의 당 고리 산소를 보유하는 뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 17: 대표적인 제노 핵산(XNA) 뉴클레오사이드의 화학 구조.
도 18: 본 발명에서 왓슨-크릭 염기 쌍 및 변형 위치의 다이어그램.
도 19: 변형된 피리미딘 핵염기의 화학 구조.
도 20: 변형된 퓨린 핵염기의 화학 구조.
몇몇 실시양태에서, 폴리머라아제는 나노구조체에 부착되고, DNA 프라이머 및 서열결정하려는 타겟으로 구성된 이중체와 함께 공급되고, 이어서 뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 dNTP의 혼합물이 공급된다. 금속 이온의 존재 하에서, DNA 폴리머라아제는 왓슨-크릭 쌍 형성 규칙에 따라 DNA 프라이머 내에 dNTP를 혼입하고, 각각의 혼입 단계는 센서에 의해 기록되는 전기 스파이크를 발생한다.
상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물은 다음을 포함한다:
· 0-4개의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트(도 6).
· 0-4개의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 γ-치환된 트리포스페이트(도 7). 치환체는 DNA 폴리머라아제의 활성에 영향을 미치고 또한 파이로포스페이트의 포스페이트로의 가수분해에 영향을 미칠 수 있어 변경된 반응 속도를 초래하고, 결국 전기 신호를 유발하는 전자 공여기 또는 전자 끄는기이다8.
· 0-4개의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 β,γ-X 유사체(도 8). 유사체에서, X 모이어티는 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 β,γ-브리징 O를 대체하는데, 이는 염기 쌍 형성에 영향을 미치지 않으면서 비스포스포네이트(BP) 이탈기의 입체전자 특성에 영향을 미친다. 결과적으로, 이들 트리포스페이트 유사체는 DNA 폴리머라아제의 혼입 속도를 조절하고, 이는 이탈기에 의해 영향을 받는다.9-11 혼입은 반응속도론적으로 제어된 과정이기 때문에, 상응하는 전기 신호도 따라서 조절될 수 있다.
· 0-4개의 α-티오-dNTP(도 9). 이들 변형된 트리포스페이트는 DNA 폴리머라아제에 의해 DNA 프라이머 내에 혼입된다. 데옥시리보뉴클레오사이드 및 리보뉴클레오사이드 5'-O-(1-티오-트리포스페이트)의 S p-부분입체 이성질체는 자연 발생하는 뉴클레오타이드의 유사체이고, DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 핵산 내로 용이하게 혼입된다.12, 13
· 0-4개의 α-보라노-dNTP(도 10). α-보라노-dNTP 및 α-보라노-NTP는 DNA 및 RNA 폴리머라아제를 위한 좋은 내지 탁월한 기질이고, DNA 및 RNA의 용이한 효소적 합성을 가능하게 한다.14, 15
· 0-4개의 α-보라노-α-티오-dNTP(도 11).16
· 0-4개의 α-셀레노-dNTP(도 12). 이들 변형된 dNTP는 DNA 내로 혼입될 수 있다. 그러나, α-셀레노-dNTP를 이용하는 DNA 중합은 천연 dNTP를 이용하는 경우보다 더 느리다. α-셀레노-dNTP는 DNA 주형의 결핍 시 프라이머 자가 연장을 억제한다.17
· 0-4개의 데옥시리보뉴클레오사이드 α-R-포스포닐-β,γ-디포스페이트(도 13). 이들 기질은 하전되지 않은 핵산 백본을 생성하는데18, 이는 상이한 기질의 혼입으로부터 생성된 전기 신호 사이의 추가적인 구별을 용이하게 한다.
· 0-4개의 β,γ-X-α-Z-dNTP 유사체(도 14), 이는 상이한 기질의 혼입으로부터 생성된 전기 신호 사이의 추가적인 구별을 용이하게 한다.
· 0-4개의 γ-R-α-Z-dNTP 유사체(도 15), 이는 상이한 기질의 혼입으로부터 생성된 전기 신호 사이의 추가적인 구별을 용이하게 한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 변형된 당을 포함한다. 도 16은 한 형태의 변형을 나타내는데, 이때 당 고리 내의 산소는 다른 원자에 의해 대체된다. 이들 원자들은 상이한 전기음성도를 보유하고, 이는 이웃하는 3'-OH의 pKa에 영향을 미치고, 결국 그의 친핵성에 영향을 미친다. 예를 들어, 변형되지 않은 트리포스페이트를 보유하는 X = S이고, R = H이고, 염기 = A, C, G, T인 2'-데옥시-4'-티오리보뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트(dSNTP)는 DNA 폴리머라아제의 기질로서 사용될 수 있다.19 dSNTP는 상응하는 천연 dNTP와는 상이한 반응 속도 및 효율을 나타냈다.
몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 리보오스 당(도 16, R = OH)을 포함한다. RNA 의존성 RNA 폴리머라아제(RdRP)는 RNA 서열결정을 위해 DNA 나노구조체에 부착된다. 상기 효소는 폴리오 바이러스 RdRP 및 다른 효소이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 인공적인 유전 폴리머 제노 핵산(XNA)을 포함하는 뉴클레오사이드 유닛, 자연에서 확인된 것들과는 구별되는 그들의 백본 구조를 보유하는 한 세트의 핵산 폴리머를 보유하는데, 이는 DNA 핵염기와의 특이적으로 염기 쌍을 형성할 수 있다(도 17). XNA의 일부는 그들의 당 유닛을 가요성 또는 강성 형태로 만들고, 나머지는 그들의 자연 발생하는 카운터파트와는 상이한 배치 및 구조를 보유한다. 이들은 그들 자연 발생하는 카운터파트와는 상이하게 효소 내에서 타겟에 대한 그들의 결합을 가능하도록 한다. 또한, 일부 XNA는 자연 발생하는 카운터파트와 비교하여 그의 이웃하는 OH를 다소 친핵성으로 만드는 전자 공여기 또는 전자 끄는기를 보유한다. 예를 들어, TNA는 고세균 초호열성 종 써모코커스 코다카렌신시(Thermococcus kodakarensis)(Kod)로부터 단리된 복제성 B 패밀리 폴리머라아제로부터 유도되는 실험실에서 진화된 폴리머라아제에 의해 DNA 프라이머 내로 혼입될 수 있다.20, 21 이들 XNA 기질은 DNA 타겟 내의 그들의 나머지와 특정 DNA 뉴클레오타이드를 구별하기 위해 유용하다.
몇몇 실시양태에서, RNA 서열결정을 위해 바이오폴리머 나노구조체에 부착된 RNA 폴리머라아제는 바이러스 RNA 폴리머라아제, 예를 들어 T7 RNA 폴리머라아제; 진핵 RNA 폴리머라아제, 예를 들어 RNA 폴리머라아제 I, RNA 폴리머라아제 II, RNA 폴리머라아제 III, RNA 폴리머라아제 IV, 및 RNA 폴리머라아제 V; 및 고세균 RNA 폴리머라아제를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 센서에 부착된 RNA 폴리머라아제는 RNA 서열을 판독하기 위한 전통적인 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 혼합물과 함께 공급된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 혼합물은 다음을 함유한다:
· 0-4개의 전통적인 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트.
· 0-4개의 그들의 변형된 트리포스페이트를 보유하는 리보뉴클레오타이드(도 16, R = OH).
· 0-4개의 도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이 R = OH인 일반화된 구조를 보유하는 변형된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트.
· 0-4개의 XNA 트리포스페이트(도 17).
본 발명은 추가로 그들의 활성을 위해 DNA 및 RNA 폴리머라아제 둘 다를 추가로 조정하기 위한 변형된 염기를 추가로 제공한다. 폴리머라아제의 신뢰성을 유지하기 위해, 본 발명자들은 도 18에서 확인할 수 있는 바와 같이, 변형된 염기를 위해 변경되지 않은 WC 에지를 유지한다. 이들 화합물은 왓슨-크릭 염기 쌍 형성 규칙에 따라 주형과 상호작용하는 올바른 진입하는 뉴클레오타이드를 삽입하기 위한 보존된 왓슨-크릭 수소 결합 에지 및 마이너 그루브로부터의 염기 쌍과 상호작용하는 폴리머라아제를 위한 수소 결합 수용체 부위의 통상적인 특징을 보유한다.22, 23 따라서, 변형은 효소의 신뢰성을 방해하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 다양한 작용기가 부착되는 일련의 전자 끄는기, 전자 공여기뿐만 아니라 에틸, 에틸렌, 및 아세틸렌으로 변형된 그들의 5-위치를 보유하는 피리미딘 염기로 구성된다(도 19). 이들 변형은 본 발명자들이 효소 반응의 전이 상태를 조정하는 것을 가능하게 한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 다양한 작용기가 부착되는 일련의 전자 끄는기, 전자 공여기뿐만 아니라 에틸, 에틸렌, 및 아세틸렌으로 변형된 그들의 7-위치를 보유하는 퓨린 염기로 구성된다(도 20). 이들 변형은 본 발명자들이 효소 반응의 전이 상태를 조정하는 것을 가능하게 한다.
몇몇 실시양태에서, 뉴클레오사이드 트리포스페이트는 상기 변형된 염기, 변형된 당 또는 당 유사체, 및 변형된 트리포스페이트 또는 트리포스페이트 유사체로 구성된다.
몇몇 실시양태에서, 복수의 나노구조체 센서는 핵산 서열을 병렬적으로 판독하기 위해 사용된다. 복수의 나노구조체 센서는 고체 표면 상에서 또는 웰 내에서 10 내지 109개, 바람직하게는 103 내지 107개 또는 더 바람직하게는 104 내지 106개의 나노구조체 센서의 수를 보유하는 어레이 포맷으로 제작될 수 있다.
상기 어레이 내의 모든 나노구조체 센서는 한 타입의 핵산 폴리머라아제 또는 상이한 타입의 핵산 폴리머라아제로 구성된다.
타겟 샘플은 이중 또는 단일 스트랜드, 선형, 또는 원형 DNA이다. 또한, 타겟 샘플은 이중 또는 단일 스트랜드, 선형, 또는 원형 RNA이다. 서열결정을 위한 프라이머는 DNA, RNA, DNA 및 RNA의 컨쥬게이트, 또는 변형된 뉴클레오사이드를 함유하는 DNA이다.
폴리머라아제는 이전의 가특허 출원(US 62/794,096, US 62/812,736, US 62/833,870, 및 US62/803,100 참조)에 제공된 부착 화학을 이용하는 미리규정된 위치 또는 위치들에서 바이오폴리머 나노구조체 센서에 부착될 수 있다. 많은 실시양태에서, DNA 나노구조체는 미리규정된 DNA 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드들에서 유기 작용기를 이용하여 작용화된다. 반면에, DNA 폴리머라아제는 클릭 반응을 위해 DNA 나노구조체 내의 것들에 대해 기능을 보유하는 비천연 아미노산을 함유하도록 바이오엔지니어링된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 모든 설명에서 바이오폴리머 나노구조체는 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 텅스텐(W), 금(Au), 구리(Cu), 티타늄(Ti), 탄탈륨(Ta), 크롬(Cr), TiN, TiNx, TaN, TaNx, 은(Ag), 알루미늄(Al), 및 다른 금속, 바람직하게는 Pt, Pd, Au, Ti, 및 TiN으로 구성되는 군으로부터 선택된 물질로 제조된 고체 나노와이어에 의해 대체된다. 나노와이어는 길이가 3 nm 내지 10 μm, 바람직하게는 20 nm 내지 1 μm이고; 폭이 5 nm 내지 50 nm, 바람직하게는 5 nm 내지 20 nm이고; 두께가 3 nm 내지 50 nm, 바람직하게는 4 nm 내지 10 nm이다. 모든 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 디자인, 변형, 변경, 천연 또는 비천연의, 폴리머라아제와 그들의 상호작용, 그들의 사용 방법, 및 개별적인 뉴클레오타이드를 구별하는 원리는 폴리머라아제-나노와이어 커플링된 DNA/RNA 서열결정 시스템에 적용된다. 몇몇 다른 실시양태에서, 나노와이어는 나노와이어와 유사한 치수를 보유하는 단일층 또는 다중층의 탄소 나노튜브 또는 그래핀 시트이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 모든 설명에서 나노구조체는 분자 와이어, 예를 들어 특허 출원 WO2018208505, US20180305727A1, 및 WO2018136148A1에 개시된 것들에 의해 대체된다. 모든 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 디자인, 변형, 변경, 천연 또는 비천연의, 폴리머라아제와 그들의 상호작용, 그들의 사용 방법, 및 개별적인 뉴클레오타이드를 구별하는 원리는 폴리머라아제-나노와이어 커플링된 DNA/RNA 서열결정 시스템에 적용된다.
몇몇 실시양태에서, DNA 폴리머라아제는 두 개의 전극에 직접 부착되고, 두 개의 전극 사이의 나노갭을 브리징하여 전자 또는 전류의 통과를 가능하게 하는데, 예를 들어 특허 출원 WO2018208505, US20180305727A1 및 WO2018136148A1에 개시된 것들이다. DNA/RNA 서열결정이라는 목적을 위해, 상기 언급된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 디자인, 변형, 변경, 천연 또는 비천연의, 폴리머라아제와 그들의 상호작용, 그들의 사용 방법, 및 개별적인 뉴클레오타이드를 구별하는 원리는 폴리머라아제-나노와이어 커플링된 DNA/RNA 서열결정 시스템에 적용된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 언급된 모든 나노갭 브리징 배치, 예를 들어 바이오폴리머 나노구조체, 분자 와이어, 나노와이어 및 나노갭 전극에 직접 접촉하는 폴리머라아제는 가특허 출원 US62/833,870에 개시된 것들과 같은 FET 타입 폴리머라아제 서열결정 시스템을 형성하기 위해 게이트 전극과 조합될 수 있다. 나노갭을 통과하는 전기 신호에 영향을 미치는 폴리머라아제 형태 변화의 메커니즘은 다소 상이함에도 불구하고, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 디자인, 변형, 변경, 천연 또는 비천연의, 폴리머라아제와 그들의 상호작용, 그들의 사용 방법, 및 개별적인 뉴클레오타이드를 구별하는 원리는 FET 타입 폴리머라아제-나노와이어 커플링된 DNA/RNA 서열결정 시스템에 적용된다.
일반 사항:
본 출원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 다른 문서는 그 전체 내용이 참고로 인용된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명이 다양한 실시양태의 설명에 의해 설명되었고 이러한 실시양태가 상당히 상세하게 기재되었지만, 출원의 범위를 한정하거나 어떤 식으로든 제한하려는 것은 출원인의 의도가 아니다. 추가적인 이점 및 수정은 당해 분야 기술자에게 용이하게 나타날 것이다. 따라서 본 발명은 더 넓은 측면에서 특정 세부 사항, 대표적인 기기, 장치 및 방법, 그리고 도시되고 기재된 예시적인 실시예로 제한되지 않는다. 따라서, 출원인의 일반적인 발명적 사상을 벗어나지 않으면서 이러한 세부사항에서 벗어날 수 있다.
참고문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004

Claims (24)

  1. 바이오폴리머의 확인, 특성규명, 또는 서열결정을 위한 시스템으로서, 상기 시스템은
    (a) 비전도성 기판;
    (b) 비전도성 기판 상에 서로 인접하게 배치된 제1 전극 및 제2 전극에 의해 형성된 나노갭;
    (c) 나노갭에 상응하는 치수를 보유하고 화학 결합을 통해 하나의 말단을 제1 전극에 그리고 또 다른 말단을 제2 전극에 부착함으로써 나노갭을 브리징하도록 구성된 나노구조체;
    (d) 나노구조체에 부착되고 바이오폴리머 합성 반응을 수행하도록 구성된 DNA 또는 RNA 폴리머라아제;
    (e) 바이오폴리머 합성 반응을 촉진하는 반응 혼합물;
    (f) 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가된 바이어스 전압;
    (g) 나노구조체에 부착된 폴리머라아제에 의해 개시된 형태 변화에 의해 유발된 나노구조체 내의 왜곡으로 발생되는 나노구조체를 통한 전류 변동을 기록하는 디바이스; 및
    (h) 바이오폴리머 또는 바이오폴리머의 서브유닛을 확인하는 데이터 분석을 위한 소프트웨어
    를 포함하고,
    바이오폴리머는 이중 또는 단일 스트랜드의, 선형 또는 원형의, 천연, 변형된 또는 합성된 및 이들의 조합인 DNA 분자, RNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합인 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 비전도성 기판은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 실리콘 니트라이드, 유리, 하프늄 다이옥사이드, 다른 금속 옥사이드, 임의의 비전도성 폴리머 필름, 실리콘 옥사이드 또는 실리콘 니트라이드 또는 다른 비전도성 코팅을 보유하는 실리콘, 실리콘 니트라이드 코팅을 보유하는 유리, 다른 비전도성 유기 물질, 및/또는 임의의 비전도성 무기 물질을 포함하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 나노구조체는
    (a) 천연, 변형된 또는 합성된 데옥시리보핵산으로 제조된 DNA 나노구조체;
    (b) 천연, 변형된 또는 합성된 리보핵산으로 제조된 RNA 나노구조체;
    (c) 천연, 변형된 또는 합성된 아미노산으로 제조된 펩타이드 나노구조체; 및
    (d) 천연, 변형된 또는 합성된 임의의 전도성 바이오폴리머 또는 바이오폴리머들로 제조된 분자 와이어
    중 하나 또는 이들의 조합인 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 나노구조체는 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 텅스텐(W), 금(Au), 구리(Cu), 티타늄(Ti), 탄탈륨(Ta), 크롬(Cr), TiN, TiNx, TaN, TaNx, 은(Ag), 알루미늄(Al), 및 다른 금속, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 금속 물질로 제조된 고체 나노와이어를 포함하는 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 나노구조체는 단일층 또는 다중층 또는 이들의 조합인 탄소 나노튜브 또는 그래핀 시트를 포함하는 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 나노구조체는 폴리머라아제이고, 폴리머라아제는 두 전극에 직접 부착되고, 나노갭을 브리징하여 전류의 통과를 가능하게 하는 시스템.
  7. 제1항에 있어서, DNA 폴리머라아제는 천연, 돌연변이된, 발현된, 또는 합성된 및 이들의 조합인, T7 DNA 폴리머라아제, 파이29 DNA 폴리머라아제, Taq 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 Y, DNA 폴리머라아제 Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV 및 Pol V, Pol α(알파), Pol β(베타), Pol σ(시그마), Pol λ(람다), Pol δ(델타), Pol ε(엡실론), Pol μ(뮤), Pol Ι(아이오타), Pol κ(카파), pol η(에타), 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제, 텔로머라아제를 포함하는 DNA 폴리머라아제 패밀리 A, B, C, D, X, Y, 및 RT로 구성되는 군으로부터 선택되는 시스템.
  8. 제1항에 있어서, RNA 폴리머라아제는 천연, 돌연변이된, 발현된, 또는 합성된 및 이들의 조합인, T7 RNA 폴리머라아제를 포함하는 바이러스 RNA 폴리머라아제; 및 RNA 폴리머라아제 I, RNA 폴리머라아제 II, RNA 폴리머라아제 III, RNA 폴리머라아제 IV, 및 RNA 폴리머라아제 V를 포함하는 진핵 RNA 폴리머라아제; 및 고세균 RNA 폴리머라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 게이트 전극으로 작용하도록 구성된 제3 전극을 추가로 포함하고, 제1 및 제2 전극과 함께 이들은 FET 타입 나노갭 디바이스를 형성하는 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 반응 혼합물은
    (a) 적어도 하나의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    (b) 전자 공여기 또는 전자 끄는기를 포함하는 적어도 하나의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 γ-치환된 트리포스페이트;
    (c) 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 β,γ-브리징 O를 대체하는 X 모이어티를 보유하는 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 적어도 하나의 β,γ-X 유사체;
    (d) 적어도 하나의 α-티오-dNTP 또는 α-티오-NTP;
    (e) 적어도 하나의 α-보라노-dNTP 또는 α-보라노-NTP;
    (f) 적어도 하나의 α-보라노-α-티오-dNTP 또는 α-보라노-α-티오-dNTP;
    (g) 적어도 하나의 α-셀레노-dNTP 또는 α-셀레노-NTP;
    (h) 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오사이드 α-R-포스포닐-β,γ-디포스페이트;
    (i) 적어도 하나의 β,γ-X-α-Z-dNTP 유사체 또는 β,γ-X-α-Z-NTP 유사체; 및
    (j) 적어도 하나의 γ-R-α-Z-dNTP 유사체 또는 γ-R-α-Z-NTP 유사체
    의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함하고,
    dNTP는 DNA 합성을 위해 구성되고, NTP는 RNA 합성을 위해 구성되는 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 반응 혼합물은
    (a) 변형된 당을 포함하는 dNTP 또는 NTP로서, 당 고리 내의 산소는 상이한 전기음성도를 보유하는 원자에 의해 대체되는 dNTP 또는 NTP;
    (b) 인공적인 유전 폴리머 제노 핵산(XNA)을 포함하는 뉴클레오사이드 유닛을 포함하는 dNTP 또는 NTP;
    (c) 작용기가 부착되는 전자 끄는기, 전자 공여기, 에틸기, 에틸렌기, 아세틸렌기, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 분자로 변형된 5-위치를 보유하는 피리미딘 염기를 포함하는 dNTP 또는 NTP; 및
    (d) 작용기가 부착되는 전자 끄는기, 전자 공여기, 에틸기, 에틸렌기, 아세틸렌기, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 분자로 변형된 7-위치를 보유하는 퓨린 염기를 포함하는 dNTP 또는 NTP
    중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함하고,
    dNTP는 DNA 합성을 위해 구성되고, NTP는 RNA 합성을 위해 구성되는 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 복수의 나노갭 센서를 포함하고, 각각의 나노갭 센서는 한 쌍의 전극, 나노구조체, 폴리머라아제, 반응 혼합물, 및 단일 나노갭과 관련된 임의의 피쳐를 포함하는 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 복수의 나노갭 센서는 약 10개 내지 약 10억개의 나노갭, 바람직하게는 약 10,000개 내지 약 1백만개의 나노갭의 어레이를 포함하는 시스템.
  14. 바이오폴리머의 확인, 특성규명, 또는 서열결정을 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 비전도성 기판을 제공하는 단계;
    (b) 비전도성 기판 상에 나노갭을 형성하기 위해 제1 전극 및 제2 전극을 제공하고 서로 인접하게 배치하는 단계;
    (c) 나노갭에 상응하는 치수를 보유하고 화학 결합을 통해 하나의 말단을 제1 전극에 그리고 또 다른 말단을 제2 전극에 부착함으로써 나노갭을 브리징하도록 구성된 나노구조체를 제공하는 단계;
    (d) 나노구조체에 부착되고 바이오폴리머 합성 반응을 수행하도록 구성된 DNA 또는 RNA 폴리머라아제를 제공하는 단계;
    (e) 바이오폴리머 합성 반응을 촉진하는 반응 혼합물을 제공하는 단계;
    (f) 제1 전극과 제2 전극 사이에 바이어스 전압을 인가하는 단계;
    (g) 나노구조체에 부착된 폴리머라아제에 의해 개시된 형태 변화에 의해 유발된 나노구조체 내의 왜곡으로 발생되는 나노구조체를 통한 전류 변동을 기록하는 단계; 및
    (h) 바이오폴리머 또는 바이오폴리머의 서브유닛을 확인하는 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 제공하는 단계
    를 포함하고,
    바이오폴리머는 이중 또는 단일 스트랜드의, 선형 또는 원형의, 천연, 변형된 또는 합성된 및 이들의 조합인 DNA 분자, RNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 비전도성 기판은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 실리콘 니트라이드, 유리, 하프늄 다이옥사이드, 다른 금속 옥사이드, 임의의 비전도성 폴리머 필름, 실리콘 옥사이드 또는 실리콘 니트라이드 또는 다른 비전도성 코팅을 보유하는 실리콘, 실리콘 니트라이드 코팅을 보유하는 유리, 다른 비전도성 유기 물질, 및/또는 임의의 비전도성 무기 물질을 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 나노구조체는
    (a) 천연, 변형된 또는 합성된 데옥시리보핵산으로 제조된 DNA 나노구조체;
    (b) 천연, 변형된 또는 합성된 리보핵산으로 제조된 RNA 나노구조체;
    (c) 천연, 변형된 또는 합성된 아미노산으로 제조된 펩타이드 나노구조체; 및
    (d) 천연, 변형된 또는 합성된 임의의 전도성 바이오폴리머 또는 바이오폴리머들로 제조된 분자 와이어
    중 하나 또는 이들의 조합인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 나노구조체는 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 텅스텐(W), 금(Au), 구리(Cu), 티타늄(Ti), 탄탈륨(Ta), 크롬(Cr), TiN, TiNx, TaN, TaNx, 은(Ag), 알루미늄(Al), 및 다른 금속, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 금속 물질로 제조된 고체 나노와이어를 포함하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 나노구조체는 단일층 또는 다중층 또는 이들의 조합인 탄소 나노튜브 또는 그래핀 시트를 포함하는 방법.
  19. 제14항에 있어서, 나노구조체는 폴리머라아제이고, 폴리머라아제는 두 전극에 직접 부착되고, 나노갭을 브리징하여 전류의 통과를 가능하게 하는 방법.
  20. 제14항에 있어서, DNA 폴리머라아제는 천연, 돌연변이된, 발현된, 또는 합성된 및 이들의 조합인, T7 DNA 폴리머라아제, 파이29 DNA 폴리머라아제, Taq 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 Y, DNA 폴리머라아제 Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV 및 Pol V, Pol α(알파), Pol β(베타), Pol σ(시그마), Pol λ(람다), Pol δ(델타), Pol ε(엡실론), Pol μ(뮤), Pol Ι(아이오타), Pol κ(카파), pol η(에타), 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제, 텔로머라아제를 포함하는 DNA 폴리머라아제 패밀리 A, B, C, D, X, Y, 및 RT로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제14항에 있어서, RNA 폴리머라아제는 천연, 돌연변이된, 발현된, 또는 합성된 및 이들의 조합인, T7 RNA 폴리머라아제를 포함하는 바이러스 RNA 폴리머라아제; 및 RNA 폴리머라아제 I, RNA 폴리머라아제 II, RNA 폴리머라아제 III, RNA 폴리머라아제 IV, 및 RNA 폴리머라아제 V를 포함하는 진핵 RNA 폴리머라아제; 및 고세균 RNA 폴리머라아제로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제14항에 있어서, 게이트 전극으로 작용하도록 구성된 제3 전극을 추가로 포함하고, 제1 및 제2 전극과 함께 이들은 FET 타입 나노갭 디바이스를 형성하는 방법.
  23. 제14항에 있어서, 반응 혼합물은
    (a) 적어도 하나의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트;
    (b) 전자 공여기 또는 전자 끄는기를 포함하는 적어도 하나의 자연 발생하는 뉴클레오사이드 γ-치환된 트리포스페이트;
    (c) 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 β,γ-브리징 O를 대체하는 X 모이어티를 보유하는 자연 발생하는 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 적어도 하나의 β,γ-X 유사체;
    (d) 적어도 하나의 α-티오-dNTP 또는 α-티오-NTP;
    (e) 적어도 하나의 α-보라노-dNTP 또는 α-보라노-NTP;
    (f) 적어도 하나의 α-보라노-α-티오-dNTP 또는 α-보라노-α-티오-dNTP;
    (g) 적어도 하나의 α-셀레노-dNTP 또는 α-셀레노-NTP;
    (h) 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오사이드 α-R-포스포닐-β,γ-디포스페이트;
    (i) 적어도 하나의 β,γ-X-α-Z-dNTP 유사체 또는 β,γ-X-α-Z-NTP 유사체; 및
    (j) 적어도 하나의 γ-R-α-Z-dNTP 유사체 또는 γ-R-α-Z-NTP 유사체
    의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물 중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함하고,
    dNTP는 DNA 합성을 위해 구성되고, NTP는 RNA 합성을 위해 구성되는 방법.
  24. 제14항에 있어서, 반응 혼합물은
    (a) 변형된 당을 포함하는 dNTP 또는 NTP로서, 당 고리 내의 산소는 상이한 전기음성도를 보유하는 원자에 의해 대체되는 dNTP 또는 NTP;
    (b) 인공적인 유전 폴리머 제노 핵산(XNA)을 포함하는 뉴클레오사이드 유닛을 포함하는 dNTP 또는 NTP;
    (c) 작용기가 부착되는 전자 끄는기, 전자 공여기, 에틸기, 에틸렌기, 아세틸렌기, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 분자로 변형된 5-위치를 보유하는 피리미딘 염기를 포함하는 dNTP 또는 NTP; 및
    (d) 작용기가 부착되는 전자 끄는기, 전자 공여기, 에틸기, 에틸렌기, 아세틸렌기, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 분자로 변형된 7-위치를 보유하는 퓨린 염기를 포함하는 dNTP 또는 NTP
    중 적어도 하나 또는 이들의 조합을 포함하고,
    dNTP는 DNA 합성을 위해 구성되고, NTP는 RNA 합성을 위해 구성되는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022537381A (ja) * 2019-06-20 2022-08-25 アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティー 核酸配列の直接電気的読み出し
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Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602005020011D1 (de) * 2004-06-10 2010-04-29 Ge Healthcare Bio Sciences Verfahren zur nukleinsäureanalyse
US9238836B2 (en) * 2012-03-30 2016-01-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for sequencing modified nucleic acids
GB2517875A (en) * 2012-06-08 2015-03-04 Pacific Biosciences California Modified base detection with nanopore sequencing
US20160108002A1 (en) * 2013-05-30 2016-04-21 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Universal reader molecule for recognition tunneling
US9618474B2 (en) * 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
RU2721965C2 (ru) * 2014-12-18 2020-05-25 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Обнаружение изменений конформации полимеразы нуклеиновых кислот с помощью нанотрубки
JP6692831B2 (ja) * 2015-05-12 2020-05-13 イラミーナ インコーポレーテッド 核酸をシーケンシングするための電界効果装置および方法
WO2017024049A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single-molecule nanofet sequencing systems and methods
KR20180112783A (ko) * 2016-01-14 2018-10-12 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 분자 센서들 및 관련 방법들
KR20180105699A (ko) * 2016-01-28 2018-09-28 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 대규모 분자 전자소자 센서 어레이들을 이용하여 분석물들을 측정하는 방법들 및 장치
JP2019515317A (ja) * 2016-04-27 2019-06-06 クオンタムバイオシステムズ株式会社 バイオ分子の測定およびシーケンシングのためのシステムおよび方法
KR20200002897A (ko) * 2017-04-25 2020-01-08 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 분자 센서들을 위한 효소 회로들

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