KR20180112783A - 분자 센서들 및 관련 방법들 - Google Patents
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Abstract
단일 분자들을 검출하도록 구성된 전자 센서들 및 그것을 이용 및 제조하는 방법들이 개시된다. 센서는, 센서 갭에 의해 이격된 소스 및 드레인 전극들; 게이트 전극으로서, 소스, 드레인 및 게이트 전극들은 협동하여 전극 회로를 형성하는, 상기 게이트 전극; 및, 센서 갭을 가로질러 브릿징하여 소스 및 드레인 전극들을 연결하는 브릿지 분자; 및, 브릿지 분자에 결합된 프로브를 포함할 수도 있고, 프로브의 핵산과의 상호작용은 전극 회로의 파라미터를 모니터링함으로써 검출가능하다. 다양한 예들에서, 핵산은 DNA 또는 RNA 를 포함한다.
Description
관련 출원들에 대한 상호-참조
이 출원은, "MANUFACTURE OF MOLECULAR BRIDGES FOR NANOSCALE DEVICES" 라는 제목으로 2016년 1월 14일 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/278,889 호; "METHODS FOR MANUFACTURE OF BEADS ON A SUBSTRATE FOR NANOSCALE DEVICES" 라는 제목으로 2016년 1월 14일 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/278,900 호; 및, "METHODS OF NUCLEIC ACID ANALYSIS USING MOLECULAR ELECTRONICS SENSORS" 라는 제목으로 2016년 1월 14일 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/278,907 호에 대해 우선권을 주장하고, 그것들의 개시들은 참조에 의해 본원에 통합된다.
기술 분야
본 개시물은 전자 센서 디바이스들에 관한 것이다. 특히, 본 개시물은 측정 회로에서 하나 이상의 바이오분자 컴포넌트들을 포함하고 핵산 시퀀싱을 위해 사용될 수 있는 전자 센서 디바이스들에 관한 것이다.
분자 스케일에서의 측정 성질들은 요구된 감도, 및 노이즈의 많은 잠재적인 소스들의 존재로 인해 수많은 도전들을 제시한다. 이 목적을 위한 센서들을 설명할 시에, 그러므로, 측정 에러의 모든 소스들에 대하여 명확한 것이 도움이 된다. 일반적으로, 측정될 수도 있는 임의의 시스템 또는 객체에 대하여, 측정된 상태, m 은 오직 실제적인 시스템 상태, a 의 근사치일 것이다. 이것은 센서의 동작, 판독 프로세스, 또는 신호 해석으로 인한 에러를 반영하는 불완전한 신호 해석과 같은 다수의 인자들 중의 임의의 것으로 기인할 수도 있고, 또한, 일부 경우들에 있어서 센서를 시스템에 컨택하는 것이 시스템의 상태를 교란시킬 수도 있기 때문이다. 측정된 상태 m 이 실제적인 상태 a 와 상이하다는 것은 조합된 센서, 판독, 및 해석의 측정 에러를 반영한다. 이상적으로는, 센서 시스템이 이 측정 에러를 가능한 한 작게 하도록 구성될 것이다.
DNA 분자를 시퀀싱 (sequencing) 하는 경우와 같은, 분자 스케일에서 상태들을 측정하기 위하여, 센서 디바이스가 바람직하게는 단일-분자 스케일로 관심 있는 분자들과 컨택하는 "프로브 (probe)" 를 가지는 한편, 센서 디바이스의 다른 피처들은 센서 디바이스들을 제조하거나 그것들을 신호 전달 시스템 내로 통합하는 목적들을 위하여 더 큰 나노- 또는 마이크로-스케일들로 되어 있는 센서 시스템들을 만드는 것에 대해 다양한 노력들이 지향되었다.
특히, 바이오센서는 DNA, RNA, 또는 단백질 (protein) 들과 같은 생물학적으로 관련된 분자들의 성질들을 측정하기 위하여, 생물학적 인식 컴포넌트를 신호 변환 시스템 (signal transduction system) 으로 기능적으로 통합하는 분석 디바이스이다. 그 통합은 검출가능한 전기적 신호들로의 생물학적 이벤트들의 신속하고 편리한 변환을 제공한다. 고안되었던 다양한 전기적 바이오감지 아키텍처들 중에서, 전계-효과 트랜지스터 (field-effect transistor; FET) 들에 기초한 시스템들은 그것들이 타겟 분자들 (예컨대, 생물학적 분자들) 과 FET 표면 사이의 상호작용들을 검출가능한 전기적 신호들로 직접적으로 변환할 수 있으므로 전도 유망한 것으로 보인다. 전형적인 FET 디바이스에서, 전류는 2 개의 전극들 (또한, 소스 및 드레인으로서 지칭됨) 에 접속되는 채널을 따라 흐른다. 소스와 드레인 사이의 채널 전도도 (channel conductance) 는 얇은 유전체 절연 층을 통해 채널에 결합되는 제 3 전극 (또한, 게이트로서 지칭됨) 에 의해 조절될 수 있다. FET 들은 넓은 범위의 상업적 애플리케이션들에 대하여 타겟 화학물질들을 검출하고 화학적 농도들을 측정하기 위하여 이용될 수 있다. 고전적이고 폭넓게 이용된 예는 수소 이온 농도를 측정하기 위하여 이용된 FET-기반 pH 센서이다. 이것은 1970 년 대에 Bergveld 에 의해 도입되었고, 솔리드-스테이트 (solid-state) pH 센서들에서 이용된다. 이온-감지 FET (ion-sensitive FET; ISFET) 디바이스들의 일반적인 분야는 다른 화학적 농도 측정들을 위하여 그 개념을 확장시킨다.
현재의 FET-타입 바이오센서 시스템들의 한계는 그 감도이다. 현재의 바이오센서 시스템들은 단일 분자 검출 및 식별을 수행할 수 없다. 마찬가지로, 그것들은 단일 분자 반응 동역학 (single molecule reaction dynamics) 을 모니터링할 수 없다. FET-타입 바이오센서들의 이 감도 한계들은 단일 분자 시퀀싱 반응들에서와 같은, 중요한 생화학적 어세이 (assay) 들에서의 검출기들로서의 그 이용을 방지한다.
FET 바이오센서 감도를 개선시키기 위한 일부 노력들은 전극들 사이에서 채널을 형성하기 위하여, 탄소 나노튜브 (carbon nanotube) 들과 같은 탄소 나노구조체들의 이용에 초점을 맞추었다. 그러나, 탄소 나노구조체들은 바이오센서 기능화에 대한 다양한 장애들을 제기한다. 특히, 기능적 또는 증감 (sensitizing) 프로브 분자들을 부착할 목적을 위하여, 특정 희망하는 원자 로케이션들에서의 부착들 사이트들에서 조작 (engineer) 하기 위한 방법이 없다. 추가적으로, 탄소 나노구조체들의 합성의 정밀도, 제어, 및 스케일에 관한 본 제한들은 개별적인 센서들의 감도 및 신뢰성 있는 생산, 센서들의 고밀도의 스케일링가능한 어레이들의 확립, 및 센서 제조의 상업적인 실행가능성에 대하여 추가의 도전들을 제기한다. 현재의 탄소 나노튜브 합성 방법들은 전형적으로, 길이에 있어서 약 100 nm 또는 더 긴 스케일, 멀티-센서 플랫폼 상에서의 감도 뿐만 아니라 밀도에 대한 제한들을 제기할 가능성이 있는 스케일로 구조체들을 생산한다.
이에 따라, 증가된 감도 및 정밀도, 신뢰성 있는 조작과 양립가능하고, 멀티-센서 플랫폼 상에서 증가된 센서 밀도를 달성하기 위한 효율적이고 상업적으로-실행가능한 제조 방법들과 추가로 양립가능한 아키텍처들을 갖는 분자-스케일 전자 바이오센서 디바이스들이 바람직하다. 마찬가지로, 이러한 센서 디바이스들을 제조하는 개선된 방법들이 또한 바람직하다.
본 개시물은 일반적으로, 센서들, 센서들을 포함하는 시스템들, 및 센서들 및 시스템들을 형성하고 이용하는 방법들에 관한 것이다. 예시적인 센서들은 예를 들어, DNA, RNA, 또는 다른 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 들과 같은 분자들을 시퀀싱하기 위하여 이용될 수 있다. 본 개시의 다양한 실시형태들이 종래 기술의 센서들의 단점들을 해결하는 방법들은 이하에서 더 상세하게 논의되지만, 일반적으로, 본 개시는 제조하기가 상대적으로 용이하고 저렴한 센서들을 제공한다.
본 개시의 다양한 실시형태들에서, 센서는: 소스 전극; 센서 갭에 의해 소스 전극으로부터 이격된 드레인 전극; 게이트 전극으로서, 소스, 드레인 및 게이트 전극은 협동 (cooperate) 하여 전극 회로를 형성하는, 상기 게이트 전극; 및, 센서 갭을 가로질러 브릿징하여 소스 및 드레인 전극들을 연결하는 브릿지 분자 (bridge molecule); 및, 브릿지 분자에 결합된 프로브를 포함하고, 프로브의 핵산과의 상호작용 (interaction) 은 전극 회로의 적어도 하나의 파라미터를 모니터링함으로써 검출가능하다. 다양한 예들에서, 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 그것의 변종들을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 센서의 프로브는 예를 들어 DNA 폴리메라제, 역전사 효소, 엑소뉴클레아제, 또는 헬리카제와 같은 효소를 포함한다. 일부 경우들에서, 프로브는 예를 들어 Phi29, PolI, 또는 그것의 변이종 (mutant) 과 같은 DNA 폴리메라제를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 항체 (antibody), 이중-가닥형 (double-stranded) DNA 또는 단백질 알파-나선 (protein alpha-helix) 을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 항체는 소스 또는 드레인 전극 상의 적어도 하나의 컨택 (contact) 포인트를 인식하는 또는 소스 및 드레인 전극들 상의 컨택 포인트들을 인식하는 IgG 항체와 같은 IgG 항체를 포함할 수도 있다. 다른 브릿지 분자들은, 예를 들어, DNA 듀플렉스 (duplex), DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 (hybrid duplex), DNA-PNA 하이브리드 듀플렉스, PNA-PNA 듀플렉스, 또는 DNA-LNA 하이브리드 듀플렉스와 같은 핵산 듀플렉스를 포함할 수도 있다.
개시물의 다양한 실시형태들에 따르면, 센서는 제 1 전극에 결합된 제 1 컨택, 제 2 전극에 결합된 제 2 컨택, 제 1 컨택 및 제 1 전극 중의 하나와 제 2 컨택 및 제 2 전극 중의 하나 사이에서 정의된 센서 갭 (sensor gap), 및 제 1 단부 및 제 2 단부를 포함하는 브릿지 분자를 포함하고, 브릿지 분자는 제 1 단부에서 제 1 컨택에 결합되고, 제 2 단부에서 제 2 컨택에 결합된다. 이 실시형태들의 다양한 양태들에 따르면, 브릿지 분자는 바이오폴리머 (biopolymer) 이거나, 브릿지 분자는 화학적으로 합성된다. 추가적인 양태들에 따르면, 센서는 제 3 의 또는 게이트 전극을 포함한다. 이 경우들에는, 게이트 전극이 센서 디바이스를 튜닝 (tune) 및/또는 활성화하기 위하여 이용될 수 있다. 추가의 양태들에 따르면, 센서 갭은 약 5 nm 내지 약 30 nm 사이의 센서 갭 치수를 가진다. 추가적인 양태들에 따르면, 제 1 단부 또는 브릿지 분자는 제 1 자기-조립 앵커 (self-assembling anchor) 를 포함하고; 추가의 양태들에 따르면, 제 2 단부는 제 2 자기-조립 앵커를 포함한다. 예시적인 브릿지 분자들은 다음의 속성들 중의 하나 이상을 포함할 수 있다: 브릿지 분자가 선형일 수 있다는 것 (예컨대, 선형 바이오폴리머), 브릿지 분자가 브릿지 분자의 지속 길이 (persistence length) 보다 더 작은 단부-대-단부 (end-to-end) 길이를 가지는 것, 및 브릿지 분자가 센서 갭의 치수를 근사화하도록 구성된 단부-대-단부 길이를 포함하는 것. 예시적인 브릿지 분자들은, 예를 들어, DNA 듀플렉스, DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스, DNA-PNA 하이브리드 듀플렉스, PNA-PNA 듀플렉스, 또는 DNA-LNA 하이브리드 듀플렉스와 같은 핵산 듀플렉스를 포함한다. 예시적인 센서들은 브릿지 분자에 부착된 프로브를 포함한다. 프로브는 단일 타겟 분자와 계합 (engage) 하도록 구성될 수 있다. 예시적인 프로브들은 용액 (solution) 에서의 반응 동안에 타겟 분자와 계합하도록 구성된 효소 (enzyme) 를 포함할 수 있거나 이러한 효소일 수 있다.
개시물의 추가적인 실시형태들에 따르면, 센서는 기판 표면 위에 놓이는 제 1 전극, 기판 표면 위에 놓이는 제 2 전극, 제 1 전극과 제 2 전극 사이 (또는 전극들에 부착된 컨택들 사이) 에서 정의된 센서 갭, 및 제 1 단부 및 제 2 단부를 포함하는 브릿지 분자를 포함하고, 브릿지 분자는 제 1 단부에서 제 1 컨택에 결합되고, 제 2 단부에서 제 2 컨택에 결합된다. 센서 갭은 약 5 nm 내지 약 30 nm 사이의 센서 갭 치수를 포함할 수 있다. 이 실시형태들의 다양한 양태들에 따르면, 브릿지 분자는 바이오폴리머이거나, 브릿지 분자는 화학적으로 합성된다. 추가적인 양태들에 따르면, 센서는 제 3 의 또는 게이트 전극을 포함한다. 이 경우들에는, 게이트 전극이 센서 디바이스를 튜닝 및/또는 활성화하기 위하여 이용될 수 있다. 추가적인 양태들에 따르면, 제 1 단부 또는 브릿지 분자는 제 1 자기-조립 앵커를 포함하고; 추가의 양태들에 따르면, 제 2 단부는 제 2 자기-조립 앵커를 포함한다. 예시적인 브릿지 분자들은 본원에서 언급된 하나 이상의 속성들을 포함할 수 있다. 예시적인 브릿지 분자들은, 예를 들어, DNA 듀플렉스, DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스, DNA-PNA 하이브리드 듀플렉스, PNA-PNA 듀플렉스, 또는 DNA-LNA 하이브리드 듀플렉스와 같은 핵산 듀플렉스를 포함한다. 예시적인 센서들은 브릿지 분자에 부착된 프로브를 포함한다. 예시적인 센서들은 브릿지 분자에 부착된 프로브를 포함한다. 프로브는 단일 타겟 분자와 계합하도록 구성될 수 있다. 예시적인 프로브들은 용액에서의 반응 동안에 타겟 분자와 계합하도록 구성된 효소를 포함할 수 있거나 이러한 효소일 수 있다.
추가적인 예시적인 실시형태들에 따르면, 시스템은 본원에서 설명된 바와 같은 센서를 포함한다. 시스템은 추가적으로, 센서를 형성하기 위하여 이용되거나 센서가 그 상에서 존재하는 기판을 이용하여 형성된 회로와 같은 하나 이상의 회로들을 추가적으로 포함할 수 있다. 시스템들은 추가적으로 또는 대안적으로, 예를 들어, 신호로부터 노이즈를 제거하고 및/또는 신호의 해석을 보조하기 위하여 추가적인 회로들 및/또는 디바이스들을 포함할 수 있다.
개시물의 또한 추가적인 실시형태들에 따르면, 방법은 본원에서 설명된 센서와 같은 센서를 제공하는 단계; 핵산 템플릿 (nucleic acid template) 을 폴리메라제 (polymerase) 와 컨택하는 단계로서, 폴리메라제는 센서의 부분을 포함하는 브릿지 분자에 결합되는, 상기 핵산 템플릿을 폴리메라제와 컨택하는 단계; 뉴클레오티드 염기 믹스 (nucleotide base mix) 를 제공하는 단계; 폴리메라제에 의해, 뉴클레오티드 염기 믹스로부터 합성된 핵산으로의 뉴클레오티드의 통합을 포함하는 통합 이벤트를 수행하는 단계; 및 통합 이벤트에 의해 생선된 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 이 실시형태들의 다양한 양태들에 따르면, 방법은 추가적으로, 예컨대, 센서를 튜닝하거나 활성화하기 위하여, 전기적 전위를 센서에 인가하는 단계를 포함할 수 있다. 추가의 양태들에 따르면, 노이즈는 신호로부터 제거될 수 있다.
또한 추가적인 실시형태들에 따르면, 바이오분자 감지 디바이스를 제조하는 방법은 기판 표면 상에서 제 1 전극 및 제 2 전극을 형성하는 단계로서, 제 1 전극 및 제 2 전극은 전극 갭에 의해 분리되는, 상기 제 1 전극 및 제 2 전극을 형성하는 단계; 제 1 전극 상에서 제 1 컨택을, 그리고 제 2 전극 상에서 제 2 컨택을 배치하는 단계로서, 제 1 컨택 및 제 2 컨택은 컨택 갭에 의해 분리되는, 상기 배치하는 단계; 및 브릿지 분자를 제 1 컨택 및 제 2 컨택에 부착하는 단계를 포함한다. 예시적인 방법들은 프로브를 브릿지 분자에 결합하기 위하여 브릿지 분자를 프로브와 컨택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
그리고, 본 개시의 추가의 실시형태들에 따르면, 올리고뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 센서들을 이용하는 것을 포함한다.
본 개시물의 발명 요지는 명세서의 결론 부분에서 특히 지적되고 명백하게 청구된다. 그러나, 본 개시물의 더 완전한 이해는 도면의 도면들과 관련하여 고려될 때에 상세한 설명 및 청구항들을 참조함으로써 최상으로 획득될 수도 있다.
도 1 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서의 개략적인 표현을 나타낸다
도 2a 및 도 2b 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서 디바이스의 도면들을 나타낸다
도 3 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서의 부분의 측면도 (profile view) 를 나타낸다
도 4 는 다양한 실시형태들에 따라, 바이오폴리머 브릿지 분자를 포함하는 센서를 나타낸다
도 5 는 다양한 실시형태들에 따라, 바이오폴리머 브릿지 분자를 포함하는 센서를 나타낸다
도 6a 및 도 6b 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서 디바이스의 도면들을 나타낸다
도 7 은 다양한 실시형태들에 따라, 노이즈 제거 전 및 후의 신호 트레이스 (signal trace) 를 나타낸다
도 8 은 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들을 이용하여 전극들을 제조하는 방법을 위한 프로세스 흐름을 나타낸다
도 9 는 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들을 이용하여 컨택들을 제조하는 방법을 위한 프로세스 흐름을 나타낸다
도 10 은 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들 및 사전형성된 컨택 입자들의 디포지션 (deposition) 을 이용하여 컨택들을 제조하는 방법을 위한 프로세스 흐름을 나타낸다
도 11a 내지 도 11c 는 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들을 이용하여 제조된 센서 디바이스의 도면들을 나타낸다
도 12 는 다양한 실시형태들에 따라, 바이오폴리머 브릿지 자기-조립 (self-assembly) 을 따르는 컨택 어레이의 주사 전자 마이크로그래프 (scanning electron micrograph) 를 나타낸다
도 13 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서를 위한 바이오폴리머 브릿지 자기-조립 이벤트 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 14 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서의 바이오폴리머 브릿지로의 프로브 바인딩 (probe binding) 의 프로세스 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 15 는 다양한 실시형태들에 따라, 프로브로의 템플릿 바인딩 (template binding) 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 16 은 다양한 실시형태들에 따라, 프로브에 의한 템플릿-종속적 염기 통합 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 17 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서에 의한 단일 템플릿-종속적 염기 통합 이벤트에 의해 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 18 은 다양한 실험적 조건들 하에서 다양한 실시형태들에 따라, 센서에 의해 생성된 신호 트레이스들을 나타낸다
도 19 는 비변형된 및 5-메틸시토신 (5-methylcytosine) 변형된 뉴클레오티드들을 포함하는 타겟에 응답하여, 다양한 조건들 하에서 다양한 실시형태들에 따른 센서에 의해 생성된 신호 트레이스들을 나타낸다
도 20 은 다양한 실험적 조건들 하에서 긴 템플릿 시퀀스에 응답하여, 다양한 실시형태들에 따른 센서에 의해 생성된 신호 트레이스들을 나타낸다
도 21 은 다양한 실시형태들에 따라 화학적으로 합성된 브릿지 분자를 나타낸다.
도 22 는 일반적인 자기-조립 프로세스를 나타내고, 여기서, 바이오폴리머와 같은 분자 회로 엘리먼트는 회로에서의 타겟 로케이션들에서 포지티브 및 네거티브 전극들 양자에 결합하여 그것들을 브릿징하여 조립된 분자 회로를 형성한다.
도 23 은 회로 자기-조립에서 재료 컨택 포인트의 이용을 나타낸다. "A" 로 도시된 컨택 포인트는 정확한 자기-조립을 안내할 수 있는 공간적으로 국지화된, 정확하게 위치된 재료 엘리먼트이고, 전기적 또는 기계적 접속을 제공한다. 컨택 포인트를 추가하고 분자 엘리먼트를 부착하는 기본적인 단계들은 좌측에 도시된다. 이것이 어떻게 소망되는 회로를 발생시킬 수 있는지는 우측에 표시된다. 그룹 (group) "B" 는 컨택 포인트에 선택적으로 결합할 수 있는 브릿징 분자 상에서의 접합 기이다.
도 24 는, 일련의 조립 단계들에서, 프라이머리 브릿지 분자에 대한 공액 바인딩 사이트 "E" 를 갖는, 타원으로서 표현된 추가적인 분자 컴포넌트들 "D" 에서 특정적으로 결합하기 위한 추가적인 컨택 그룹 "C" 의 이용을 나타낸다.
도 25 는 전류에서의 스파이크들이 센서 디바이스의 자기-조립에서의 각 단계들에 어떻게 관련되는지를 나타낸다.
도 26 은 브릿징된 컨택들 (녹색 박스) 및 브릿징되지 않은 컨택들 (적색 박스) 의 이상적인 이미지들의 도식적 표현이다.
도 27 은 브릿징 반응들 및 라벨링 반응들 후의 기판의 전자 현미경 (electron microscope) 이미지이다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지를 갖는 컨택들을 강조한다.
도 28 은 금 컨택 포인트들의 어레이에 대한 보다 높은 효율성의 20nm 이중-가닥 DNA 브릿지-결합의 이미지이다. 브릿지들은 촬상 목적들을 위해 작은 금 도트로 라벨링된다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지들의 예들을 강조한다. 고 염 완충재 용액에서의 디포지션으로 인한, 금 컨택 포인트들에 대한 보다 높은 레벨들의 결합, 및 브릿지 (브릿지 반응 조건들: 5X TBS 완충재에서 1 시간 동안 바인딩 어레이로 배양된 1 μM 브릿지 농도).
도 29 는 금 도트 컨택 포인트들의 테스트 어레이에 대한 알파-나선 펩티드 브릿지 결합의 이미지이다.
도 30 은 IgG 항체 브릿지 바인딩의 이미지이다.
도 31 은 브릿지 분자들 상에서의 전기적 측정들을 위한 테스트 셋-업의 개략도를 나타낸다.
도 32 는 브릿지 전극 바인딩 이벤트들을 나타내는 3 개의 스파이크들을 나타내는 전류 대 시간의 플롯을 나타낸다.
도 33 은 라벨링된 브릿지들의 EM 이미지이다.
도 34 는 금 전극들의 dSDNA 브릿징의 EM 이미지이다.
도 35 는 원하는 로케이션에서 작은 비드를 제조하기 위해 이용되는 프로세스 (1) 의 단계들을 나타낸다. 도면에서 상부 좌측에서부터 시작하여, 레지스트 (회색) 의 레이어가 기판 (청색) 상에 패터닝되고, 직경 D 의 오픈 디스크를 갖는다. 그 다음에, 접착제의 레이어 (녹색) 가 디스크 내에 디포짓팅된다. 그 다음에, 표준 수단에 의해 제조된, 사전에 만들어진 비드들의 용액이 이에 대해 노출되고, 비드들은 입체 장애 (steric hindrance) 가 접착 디스크 당 오직 하나의 비드만을 허용하도록 직경 d 를 갖는다. 레지스트의 제거 후에, 남는 것은, 접착 디스크의 중앙 부근에 위치된, 하지만 디스크 직경 D 보다 더 작은 사이즈의, 직경 d 의 비드이다.
도 36 은 3D 투시 및 오버헤드 뷰들로 도시된, 도 35 로부터 작은 비드를 확립하기 위한 프로세스 (1) 의 단계들을 나타낸다. 기판으로부터 시작하여, 직경 D 의 재료의 접착 디스크를 레지스트 코팅 (회색) 에서 렌더링된 패턴 내로 디포짓팅하기 위해 표준 패터닝 및 디포지션 방법들이 사용된다. 비드들에의 노출 및 레지스트의 제거는 접착 패치에 부착된 비드를 초래하고, 입체 장애는 접착 디스크 당 오직 하나의 비드만을 허용한다. 따라서, 이 프로세스는 패터닝 프로세스에 의해 좌우되는 것보다 더 작은 직경으로, 원하는 로케이션에서 비드를 확립하였다. 특히, 이것은 패터닝 방법의 것을 초과하는 분해능으로 컨택 포인트들의 제조를 허용한다.
도 37 은 프로세스 (2) 실시형태 (a) 의 단계를 나타낸다: 상부 좌측에서부터 시작하여, 적합한 기판 (청색) 상에 폭 W 의 비드 재료 (금) 의 직사각형의 디포지션, 이는 어닐링 (annealing) 시에 그리고 표면 장력의 작용 하에, 비드들의 라인으로 쪼개진다. 그 다음에, 제거가능한 레지스트 (적색) 의 보호 층이 패터닝되고 디포짓팅되어, 단일 비드를 포함할 보호 영역이 된다. 나머지 비드들은 제거되고, 그 다음에, 레지스트가 제거되어, 재료의 원래 직사각형의 선호되는 단부 부근에 단일 비드를 남긴다.
도 38 은 프로세스 (2) 의 대안적 실시형태 (b) 를 나타내고, 여기서, 도 37 에서 도시된 것과는 상반되게, 최종 디포짓팅된 층 (적색) 은 원치않는 비드들을 커버하기 위해 사용되고, 보다 큰 나노 디바이스에서의 사용을 위해 이용가능한 노출된 선호되는 단부에서의 비드만을 남겨둔다.
도 39a 는 프로세스 (2) 의 하나의 선호되는 실시형태의 일 예를 나타내고, 여기서, 사용되는 패터닝 방법은 전자-빔 리소그래피이고, 목표는 2 개의 전극 스트립들의 근접 단부들에서 비드들을 만드는 것이다. 이 예시는 직사각형 레이어들을 비드들로 쪼개는 시점을 통한 그리고 각 직사각형의 선호되는 단부에서 단일 비드를 달성하기 위한 최종 단계들 이전의 프로세스를 나타낸다.
도 39b 는 상승된 그리고 하강된 기판 릿지들로 이루어지는 기판 상의 실제로 실행된 도 39a 의 프로세스를 나타내는 전자 현미경 이미지이고, 그 기판 상으로 금 층이 디포짓팅되고, 비드들로 쪼개지도록 허용된다. 이미지는, 비드들이 직사각형 스트립들의 기저 폭보다 직경이 실질적으로 더 작고, 좁은 (함몰된) 스트립들은 단일 라인의 비드들이 형성될만큼 충분히 작다.
도 40 은 비드 형성 프로세스 (3) 를 나타내고, 여기서, 최상부 좌측 구성을 확립하는 것으로, 직사각형 패턴이 생성되고, 접착 재료 1 (청색) 의 디포지션 다음에, 재료 2 (금) 의 디포지션 다음에, 진공 파괴에 의해 도입되는 산화와 같은, 계면 층 (회색) 이 이어진다. 그 다음에 (화살표) 재료 3 이 2 와 동일한 재료일 수도 있는 (다시 금으로서 도시된) 얇은 층으로 디포짓팅되고, 그 다음에 (화살표) 보호 층 (적색) 이 실리콘 산화물과 같이 패터닝되고 디포짓팅되며, 선호되는 단부의 작은 영역을 노출된 채로 남겨둔다. 그 다음에 (화살표) 어닐링이 수행되고, 이는 보호 층 및 계면 층에 의해 경계지어지는 재료 3 의 작은 패치가 쪼개지고 비드로 형성되게 하여, 직사각형 영역의 단부에 위치된, 프라이머리 패터닝 치수들보다 더 작은 직경의 그리고 프라이머리 패터닝 치수들의 재료 3 의 비드를 형성하게 한다.
도 41 은 프로세스들 (1) 또는 (2) 를 이용하여 생성된 비드들의 어레이를 나타낸다. 프로세스 (1) 의 경우에, 초기 패터닝 및 재료 디포지션 프로세스들이 기판들 상에 접착 재료 디스크들의 어레이를 형성하기 위해 사용될 수 있다 (점선의 원들에 의해 표시된 원래의 풋프린트들). 프로세스는 그 다음에, 도시된 수행된 비드들을 디포짓팅할 것이다. 대안적으로, 방법 (2) 이 사용되는 경우에, 비드들의 전체 열들은 디포짓팅된 초기 재료 직사각형들의 어레이에 기초하여 단일 보호 단계로 확립될 수 있다.
도 42 는 분자 전자 디바이스들의 어레이를 위한 나노-컨택 포인트들을 생성하기 위한 비드-업 프로세스의 이용을 나타낸다. 비드들의 어레이는, 전극들의 각 쌍이 전극들의 단부들 근처에 위치된, 컨택 포인트들로서 비드들의 쌍을 수용하도록 위치된다.
도 43 은 접착 표면 상에 디포짓팅된 금 비드들의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 비드들은 직경이 대략적으로 5nm 내지 10nm 인 금 나노입자들이다.
도 44 는 비유도성 실리콘 표면에 부착되는 금 비드들을 포함하는 제어 샘플의 전자 현미경 이미지들을 도시한다.
도 45 는 유도성 접착 표면들 상에 디포짓팅된 금 비드들의 원자간력 현미경 (Atomic Force Microscope; AFM) 이미지들을 도시한다. 비드들은 직경이 대략적으로 5nm 내지 10nm 인 금 나노입자들이다.
도 46a 는 행들에서 나타낸 다양한 희석제들에서, 완충재, 친화성 항체들, 나이브 혈청, 및 제어 비-특정적 쥐 IgG 의 삼중 열들 반복들로, 웰들 (wells) 내로 디포짓팅된 금 나노입자들의 다양한 농도들을 전개하는 플레이트 맵을 도시한다.
도 46b 는 ELISA 플레이트로부터의 최종 판독치들의 컬러 코딩된 강도이다.
도 46c 는 수치적 ELISA 판독치들의 대응하는 테이블이다.
도 46d 는, 표면 상에 디포짓팅된 비드 농도들의 전체 범위에 걸쳐, 특정 친화도를 갖는 항체가 다양한 제어들보다 표면 비드들보다 더 큰 바인딩을 갖는 것을 보여주는, 그래픽 형태로 요약된 최종 데이터 결과들을 나타낸다.
도 47 은 DNA 시퀀스를 측정하기 위한 분자 전자 회로의 하나의 선호되는 형태를 나타낸다. 효소가 소스 및 드레인 전극들 사이에 결합되어, 인가된 소스-드레인 및 게이트 전압들 하에서의 전류와 같은 전기적 특성, 또는 (일정한 인가된 전류에서의 전압과 같은) 유사한 시스템 특성들을 측정하기 위한 걔측기를 포함하는 회로를 형성한다. 시간 트레이스로서의 측정된 특성 S(t) 는, DNA 상의 효소의 진행성 작용, 및 이 프로세싱 동안의 전기적 컴포넌트로서 그것의 가변적 특성들로 인해, DNA 의 기저 시퀀스를 반영한다.
도 48 은 핵산 염기들의 흔히 발생하는 메틸화된 형태들을 전개한다. 이들이 DNA 에서 존재할 때, 이것은 생물학적 관련성을 가질 수도 있으므로, 시퀀스에서 그들의 존재를 판독할 수 있는 것이 역시 바람직하다.
도 49 는 도 1 을 보다 표준의 소스-드레인-게이트 기하구조들에서 나타낸다.
도 50 은 DNA 시퀀스를 측정하기 위한 분자 전자 회로의 다른 선호되는 형태의 개략도를 나타낸다. 효소는, 그 효소가 게이팅 기능 및 전도를 제공할 수도 있는 회로를 형성하기 위해, 소스 및 드레인 전극들 사이에서 프라이머리 전도성 엘리먼트에 세컨더리 엘리먼트로서 결합된다. 이 회로는 인가되는 소스-드레인 및 게이트 전압들 하의 전류, 또는 (일정한 인가되는 전류에서의 전압과 같은) 유사한 시스템 특성들과 같은 전기적 특성들을 측정하기 위한 계측기를 포함한다. 시간 트레이스로서 측정된 특성 S(t) 은 DNA 상에서의 효소의 진행성 작용, 및 이 프로세싱 동안 전기적 컴포넌트로서의 그것의 가변적 특성들로 인해, DNA 의 기저 시퀀스를 반영한다.
도 51 은 반도체 디바이스들로부터의 소스-드레인-게이트 기하구조, 및 프라이머리 전도 엘리먼트로서 전극들 사이의 분자 브릿지, 및 근접성 및 잠재적으로 전기적 접속을 보장하는 하나의 수단으로서 효소를 브릿지에 결합하는 결합 포인트 또는 접합 기를 갖는 보다 설명적인 선호되는 실시형태로 도 2 의 개략도를 나타낸다.
도 52 는, dNTP 들을 포함하는 적합한 완충재가 존재한다고 가정하고, 프라이밍된 단일 가닥 DNA 템플릿을 연장하고 있는 폴리메라제를 효소가 포함하는 선호되는 실시형태를 나타낸다. 통합 프로세스 (도시된 A 뉴클레오티드의 통합) 는 측정된 전류 트레이스에서 대응하는 식별가능한 피처 (feature) 를 생성하고 이에 의해 시퀀스를 결정한다.
도 53 은 전류 i 와 같은 측정된 회로 파라미터에서의 신호 스파이크로서 표시된, 통합의 검출가능한 신호가 존재하는 경우의 시퀀싱의 일 실시형태를 나타낸다. 단일 뉴클레오티드 타입들 (A, C, G, T) 의 시험적 플로우들이 수행되고, 워시 (wash) 단계들에 의해 분리되며 (뉴클레오티드 플로우들 및 워시들의 타이밍은 시간 축 상의 문자들 및 밑줄들에 의해 표시됨), 결과적인 관찰된 신호 스파이크들은 표시된 바와 같이 시퀀스를 결정한다. "TT" 와 같은 호모폴리머 시퀀스 시리즈는 대응하는 시험적 플로우 동안의 다수의 통합 스파이크들로서 표시된다. 도시된 것은, A 가 통합되고 단일 스파이크를 생성하는 상황에서 A 염기를 플로잉한 결과, 및 결과적인 DNA 시퀀스의 다음 염기이다.
도 54 는 검출가능한 신호들을 생성하기 위한 변형된 뉴클레오티드들의 사용을 나타낸다. 나타낸 것은, 각 dNTP 가 통합 프로세스에서 전류에 대해 검출가능한 영향을 갖는 (적색 볼들로서 표시된) 변형 기를 운반하는 경우이다. 이러한 변형은 쪼갤 수 있는 감마 포스페이트 상에서의 것일 수 있고, 따라서, 폴리메라제에 의해 제거될 수 있을 것이며, 또는 감지 반응 후에 수행되는 별개의 분할 반응에서 쪼개질 수 있을 것이다. 도시된 것은 변형된 A 염기가 통합되는 경우이다. 개념이 예시되고, 여기서, 4 개의 상이한 변형 기들은 4 개의 상이한 수들의 부착된 볼들 (G:1, A:2, T:3, C:4) 로서 표현되고, 각 뉴클레오티드에 대한 트레이스 내의 동일한 수의 작은 스파이크들을 가지도록 트레이스들을 강화하는 결과를 초래한다.
도 55 는 시험적 플로우 방법에서 사용되는 통합의 검출가능한 신호가 존재하는 경우의 시퀀싱의 실시형태에서 통합 신호를 강화하기 위해 변형된 뉴클레오티드의 사용을 나타낸다. 나타낸 것은, 각 dNTP 가, 통합 프로세스에서 전류에 대해 검출가능한 영향을 갖는 (적색 볼로서 표시된) 변형 기를 운반하는 경우이다. 이러한 변형은 쪼갤 수 있는 감마 포스페이트 상에서의 것일 수 있고, 따라서, 폴리메라제에 의해 제거될 수 있을 것이며, 또는 감지 반응 후에 수행되는 별개의 분할 반응에서 쪼개질 수 있을 것이다. 도시된 것은 시험적 플로우 프로세스의 A 단계이고, 여기서, A 는 통합을 위한 맞는 염기이다.
도 56 은 시퀀스 정보의 키네틱 인코딩을 나타낸다. 통합 스파이크들 사이의 시간은 통합되고 있는 염기로서 표시되고, 여기서, dNTP 농도들에서의 차이로 인해: A 는 최저 농도에 있고, 따라서, 스파이크들 사이의 긴 시간은 A 통합을 위해 예상되는 대기 시간을 나타내는 한편, G 는 최고 농도에 있어서, 스파이크들 사이의 최단 시간은 G 통합 (제 1 간격) 을 나타낸다.
도 57 은 브릿지의 선호되는 실시형태를 나타내고, 이 브릿지는, 티올 링키지 (DNA 단부들에서의 티올화된 뉴클레오티드들, 또는 알파 나선 말단들에 위치된 시스테인) 를 통해 금 컨택들에 결합된 나선형 폴리머 (dsDNA 또는 단백질 알파 나선) 이고, 효소에 접합된 스트렙타비딘에의 결합을 위한, 특정적으로 합성된 내부 바이오틴을 갖는다.
도 58 은, 태생의 또는 조작된 접합 사이트들을 이용하여, 관심대상의 단백질이 IgG 에 직접적으로 접합될 수 있거나, 관심대상의 단백질에 접합되는 (안티-IgG 항체, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은) IgG 특정 바인딩 단백질들을 통한 결합으로, 전극 상의 컨택 포인트들에 대한 특정 친화도 (프라이머리 컨택 포인트 재료, 또는 표면의 항원 유도에 대한 친화도) 를 갖는 (태생의 또는 조작된) IgG 단백질로서, 브릿지의 다른 선호되는 실시형태를 나타낸다.
도 59 는, 완전한 정보를 달성하기 위해, 기술된 방법들의 상이한 실시형태들을 이용하여 동일한 (또는 복제된) DNA 템플릿들의 복제 시퀀싱으로부터의 부분적 시퀀스 정보의 조합을 나타낸다. 청색 트레이스들은, (단일 시퀀싱 런 (run) 에서 직접적으로 관찰가능하지 않은) 조합된 정보의 회색 트레이스에 대해 상대적인, 각각의 별개의 경우로부터의 부분적 정보를 나타낸다. 여기서 나타낸 것은, (오직 A 염기들만이 검출될 수 있는 것으로 도시된) 부분적 정보를 생성하기 위해 (좌측 실시형태), 그리고 다시, 완전한 시퀀스를 획득하기 위해 결합되는 (G, T, C 가 검출되는 것으로 도시된) 상보적 또는 보조적 시퀀싱 정보를 생성하기 위해 (우측 실시형태, 브릿지 및 효소에 대한 변화를 나타냄), 템플릿이 시퀀싱되는 것이다. 2 개의 시퀀싱 실시형태들은 복제 템플릿들을 이용하여 물리적으로 또는 시간적으로 분리되고 독립적일 수 있고, 또는, - 아마도 완충재 변화, 온도 변화 또는 게이트 전압과 같은 인가된 전압들에서의 변화에 의해 생성되는 - 상이한 시간들에서의 동일한 센서 시스템의 상이한 상태들, 동일한 템플릿의 재-판독일 수 있을 것이다. 임의의 수의 이러한 상보적 실시형태들은 최종 시퀀스 결정을 향상시키기 위해 결합된 그들의 정보를 가질 수 있을 것이다.
도 60 은 효소가 엑소뉴클레아제인 일 실시형태를 나타낸다. 신호들은 회로 파라미터들에 대한 효소 입체구조, DNA 입체구조, 및 자유 뉴클레오티드들의 효과에 의해 생성된다.
도 61 은 진행성 효소 (processive enzyme) 가 이중 가닥 DNA 템플릿을 푸는 DNA 헬리카제인 일 실시형태를 나타낸다.
도 62 는 효소가 DNA 전치 능력을 갖는 단백질 나노포어 및 운동 단백질 효소로 형성된 복합체인 일 실시형태를 나타낸다.
도 63 은 통합된 칩 센서 어레이 디바이스를 나타낸다. 이 포맷은, 단일 DNAS 프래그먼트의 복제들에 대한 시퀀스 데이터의 강건한 평균화 또는 데이터 통합을 위해, 동시에 많은 시퀀스들로부터의 시퀀스의 대량 병렬 감지를 수행하기 위한 방식, 및 각 사이트에서의 다양한 또는 동일한 센서 구성들을 전개하는 옵션을 제공한다.
도 64a 는 완결부 (terminator) 시퀀싱 프로세스에서의 시험적 런을 나타낸다. dNTP 들 (청색) 및 디데옥시 완결부들의 혼합물, ddNTP 들 (보라색) 의 존재 하에, 완결부가 랜덤하게 통합될 때까지, 중합 및 감지가 진행되고, 표시된 바와 같이 (도시된 포지션 8 까지) 염기 포지션을 카운트하기 위해 사용되는 통합 스파이크들을 생성한다. 반응의 종단부에서, 완결부 염기 (이 경우에 A) 를 식별하기 위해 감지 측정이 발생한다. 따라서, 기저 시퀀스는 포지션 8 에서 A 를 갖는다. 이 템플릿, 또는 복제 템플릿들에 대해 이러한 측정들을 반복하고, 정보를 조합함으로써, 템플릿을 따른 모든 로케이션들에서의 염기들의 완전한 시퀀스가 결정될 수 있다.
도 64b 는 완결부 시퀀싱의 대안적인 실시형태를 나타내고, 여기서, 오직 단일 염기 완결부, 도시된 경우에, A 디데옥시 완결 (ddATP, 보라색) 이 주어진 반응에서 사용된다. 이 모드에서, 반응이 종결될 때, 문제의 염기가 A, 완결부라는 것이 암시되고, 통합 스파이크들의 수의 카운트는 템플릿에서의 이 A 의 포지션을 제공한다. 복제 템플릿들로 A 에 대한 많은 런들을 반복하면 템플릿에서의 모든 A 로케이션들을 랜덤하게 결정할 것이고, 다른 완결부 염기들 C, G, T 에 대해 유사한 일련의 런들을 수행하는 것은 템플릿에서의 모든 이들 염기들의 각각의 로케이션들을 결정하고 이에 의해 전체 시퀀스를 결정할 것이다.
도 64c 는 완결부 시퀀싱의 일 실시형태를 나타내고, 여기서, 관심대상의 복제된 템플릿이 표시된 각각의 칩 상으로 로딩되고, 모든 A 완결 데이터는 최상부 시리즈에서 표시된, 병렬적 센서 어레이 상에서의 하나의 런으로부터 축적되고, C-, G-, 및 T-완결 반응들에 대해 유사하게 진행되며, 각각으로부터의 단일 염기 결과들은 의문의 템플릿의 전체 시퀀스를 결정하기 위해 축적된다 (적색 화살표).
도 65 는 부착된 효소 대신에 분자 센서에서의 DNA 혼성화 (hybridization) 프로브의 사용, 및 전류와 같은 회로 파라미터를 모니터링하는 것에 의한 혼성화의 검출을 나타낸다. 혼성화는 상이한 전류 레벨에 의해 표시된다. 하나의 선호되는 실시형태는 프로브에 위치된 바이오틴부착된 염기를 통해 스트렙타비딘 (주황색 그룹) 에 DNA 혼성화 프로브를 결합할 것이다. 이 형태의 프로브 및 검출 측정은, 복제된 템플릿 분자들에 반해, 정보성 프로브들의 셋트를 이용하여 많은 이러한 측정치들을 모으는 것에 기초하는, 혼성화에 의한 시퀀싱을 지원한다.
도 66 은 혼성화 프로브를 센서 내로 통합하는 대안적인 실시형태들을 나타내고, 여기서, 프로브는 브릿지 분자의 전부 또는 일부를 형성한다. 선호되는 실시형태에서, 프로브를 포함하는 DNA 는 DNA 에서 금 컨택 포인트들 및 티올이 부착된 뉴클레오티드들을 갖는 금-티올 링키지를 이용하여 컨택 포인트들에 결합될 것이다. 도면은 이러한 혼성화 프로브가 DNA 브릿지 분자의 전부 또는 일부로서 구성될 수 있는 3 가지 상이한 방식들을 나타낸다. 아래의 경우에서, 프로브는 기저 DNA 에 더 부분적으로 혼성화하여 추가된 엄격함을 위해 타겟과 경쟁적 혼성화를 셋업할 수 있을 것이다.
도 67 은 신호를 강화하기 위해 아마도 검출가능한 그룹들 (보라색) 을 포함하는 하나 이상의 염기들을 통합하기 위해 효소적 확장 (청색 화살표에 의해 표시된 프로브의 3' 확장가능한 단부) 을 이용함으로써 프라이머리 혼성화 신호를 강화하는 하나의 예를 나타낸다. 이러한 효소적 확장은 양자 모두, 전류 플롯에서의 3 개의 레벨들 (혼성화 없음, 혼성화, 확장 산물 존재) 에 의해 표시된 바와 같이, 전자적 센서 신호를 강화하는 수단, 및 적절한 페어링을 위한 엄격성 / 체크들을 부가한다. 단일 염기 확장의 경우에, 염기 아이덴터티가 (4 개의 dNTP 들로부터, 또는 일련의 개별 dNTP 확장 시도들을 통해서) 검출가능한 경우에, 시퀀스 정보의 하나 더 많은 염기를 또한 추가할 수 있고, 방법의 시퀀싱 능력을 강화할 수 있다.
도 68 은 대량의 / 거시적 프로세스에서 밀봉 및 개봉될 수 있는 마이크로웰들 또는 나노웰들에 봉입된 센서를 나타낸다. 이것은 다른 모드들의 검출을 용이하게 하기 위해 반응물들 및 반응 산물들을 국지화한다. 이것은 또한, 웰 당 다수의 센서 타입들, 또는 센서 당 다수의 프로브 분자들로부터 혜택을 받을 수도 있어서, 반응 산물을 검출하기 위한 프로브와 함께 진행성 효소가 존재할 수 있다.
도 69 는 실험적 작업을 위해 통상적으로 사용되는 브릿지 및 프로브 분자 구조의 상세들을 나타낸다. 이 경우에서의 브릿지는 도시된 20 nm 길이의 이중 가닥 DNA 분자 (60 염기들) 이고, 금속 전극 상의 금 컨택들에 대한 결합을 위해 양 5' 단부들에서 티올기들을 갖는다.
도 70 은 분자 센서들 상의 전기적 측정들을 위한 테스트 셋업의 개략도를 나타낸다. 도 70 의 상부 부분에서, 전기-기판 구조의 횡단면 및 브릿지 분자를 통해 전압들을 인가하고 전류들을 측정하기 위한 분석기에의 부착이 도시된다. 도 70 의 하부 부분에서, 회로들을 브릿징하기 위한 전극 어레이의 투시도가 도시된다.
도 71a 는 브릿지 바인딩을 위한 금 금속 도트 컨택들을 갖는 티타늄 전극들의 어레이의 전자 현미경 이미지이다. 전극들은 실리콘 기판 상에 있고, 전자-빔 리소그래피에 의해 생성되었다.
도 71b 는 도 71a 에서의 전극 갭들 중 하나의 전자 현미경 확대 이미지이고, 7 nm 의 전극 갭 및 15 nm 의 금-대-금 간격이 금 도트 컨택 갭을 나타낸다.
도 71c 는 도 71b 로부터의 단일 전극 갭의 전자 현미경 확대 이미지이고, 2 개의 전극들의 팁들에서 대략적으로 10 nm 직경 금 도트들을 나타낸다.
도 72 는 전극 테스트 칩 아키텍처를 나타낸다. 이 경우에, 전극 어레이는 전자-빔 리소그래피를 이용하여 1 cm 실리콘 기판 상에 형성되었다. 도 72 에서의 일련의 3 개의 SEM 이미지들은 10 nm 스케일의 전극 갭까지 증가하는 분해능으로 20 개의 전극 쌍들을 보여주고 있다.
도 73 은 실리콘 산화물 패시베이션 층이 용액으로부터 전극들을 보호하기 위해 사용되는 센서 디바이스의 일 실시형태를 나타낸다. 패시베이션에서의 오프닝들은 nm 스케일로 전극 영역을 그리고 10 미크론 스케일로 전기적 컨택 패드들을 노출시킨다.
도 74 는 센서 칩 표면에 대한 액체 용액들의 제어된 노출을 지원하기 위한 플로우 셀의 일 실시형태를 나타낸다. 플로우 셀은 몰딩된 PDMS 폴리머이다.
도 75 는 전기적 측정들을 위해 칩 캐리어에 탑재된 칩을 나타낸다.
도 76 은, 공기, 물 및 희석 염 완충재에서 개방 회로 전극들의 제어들과 함께, 습식 (희석 염 완충재) 및 건식 (공기) 에서의 DNA 브릿지 분자들 및 완전한 센서 복합체들 (폴리메라제와의 브릿지) 의 측정된 전류-대-전압 (I-V) 특성들을 보여주는, 조립된 센서 복합체의 전도도를 나타낸다. 도면은 브릿지 및 센서 복합체가 인가된 소스-드레인 전압의 1 Volt 에서 100 mpico-Amp 전류들의 정도로 전도되는 것을 보여준다. 측정들은 SMU 를 통해 반도체 파라미터 분석기에서 행해졌다.
도 77 은 금-도트 컨택 전극들 상으로의 분자 센서 자기-조립의 전자적 모니터링을 나타낸다. 브릿지 및 분자 센서 복합체의 조립을 모니터링하기 위해 전류 대 시간 측정치들이 사용된다. 상부 좌측: 페이즈 1: 이중 가닥형 DNA 브릿지는 전류에서의 점프에 의해 나타내어지는 바와 같이, 5' 단부들 상에서 티올기들과 조립되고 금 컨택 포인트 상으로 조립된다. 상부 우측: 페이즈 2: 폴리메라제-스트렙타비딘 복합체는 전류에서의 점프에 의해 나타내어지는 바와 같이, dsDNA 브릿지 상에서 바이오틴부착된 사이트에 바인딩된다. 하부 우측: 페이즈 3: 프라이밍된 단일-가닥형 DNA 템플릿은 전류 대 시간에서의 스파이크에 의해 나타내어지는 바와 같이 폴리메라제에 바인딩되어 복합체를 완성한다.
도 78 은 2 레벨들의 확대로 최종 조립 구조의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 확대 이미지에서, 브릿지-복합체는 임의의 라벨링 없이 가시적이고, (녹색 화살표에 의해 포인팅된) 전극들을 연결하는 흐릿한 고 콘트래스트 영역으로서 보인다.
도 79 는 센서로 통합 신호들을 측정하는 4 개의 플롯들이고, 센서로 통합 신호들을 측정하는 것을 나타내고, 통합 및 중합을 위해 다양한 프라이밍된, 단일 가닥형 DNA 시퀀싱 템플릿들 및 dNTP 들이 센서에 공급되는 것으로부터 발생하는 전류 신호들을 보여준다. 각각의 경우에, 주요 신호 스파이크들은 별개의 통합 이벤트들로부터의 신호들을 표현하고, 여기서, 폴리메라제 효소는 연장 가닥에 또 다른 염기를 추가한다. 상부 좌측: 템플릿은 20 T 염기들이다; 상부 우측, 템플릿은 20 G 염기들이다; 하부 좌측, 템플릿은 20 A 염기들이다; 하부 우측, 템플릿은 20 C 염기들이다. 관찰되는 통합의 근사 레이트는 초 당 10-20 염기들이고, 레이트 제한 인자들 (예컨대, 보다 낮은 dNTP 농도) 로 인해 초 당 ~1 염기의 보다 낮은 레이트를 제외하고는, 표준 효소 키네틱스 (kinetics) 와 일치한다.
도 80 은 단일 염기 통합 이벤트로부터 생성된 신호의 확대를 나타낸다. 신호는 이중-피크 구조이고, 이는 통합 이벤트를 검출하는 것에 추가하여, 염기의 아이덴터티를 특성화하는데 도움을 주기 위해 잠재적으로 사용될 수 있을 것이다.
도 81 은 메틸화된 염기들을 감지하는 것의 일 실시형태를 나타낸다. 이 도면은 템플릿에서 메틸화 상태 또는 개별 메틸화된 염기들을 감지하기 위한 센서의 잠재적인 사용을 보여준다. 도면은 템플릿의 메틸화되지 않은 대 메틸화된 부분으로부터 초래되는 상이한 신호들을 도시한다. 보다 높은 신호들은 메틸화된 부분보다는 메틸화되지 않은 부분으로부터 발생한다. 나타낸 실험은 표시된 템플릿 시퀀스에 대해, 표시된 바와 같이 센서 칩 상으로 일련의 상이한 용액 추가들에 대한 트레이스들을 측정하는 것으로 이루어진다. dCTP 플로우는 단일 염기 통합 스파이크를 생성하였고, dGTP 의 추가는 그러면 템플릿의 CG 트랙트 (tract) 를 가로질러 통합이 진행하는 것을 가능하게 하였고, 메틸화된 대 메틸화되지 않은 템플릿으로부터의 신호에서의 차이를 강조하였다.
도 82 는 센서의 긴 판독 능력들을 나타낸다. 이 도면은 긴 DNA 프래그먼트들을 판독 또는 분석하기 위한 잠재성을 보여주고, 이는 전체 게놈 시퀀스들의 데노보 조립과 같은 데이터의 장 범위 연속성이 중요한 애플리케이션들에 대해 중요하다. DNA 템플릿은 5.4kb PhiX 바이러스의 게놈이다. 좌측에서: 템플릿 (dNTP 믹스) 의 저-시간-분해능 판독으로부터의 차분 신호들, 대 중합 없이 제어 상의 수반 (완결부 ddNTP 믹스, 폴리메라제 활동 차단됨). 우측에서: 긴 템플릿 DNA 가 가시적인 전극들의 SEM 이미지.
도 83a 는 펩티드 알파-나선 브릿지 분자를 포함하는 센서의 일 실시형태를 나타낸다. 실제로 실행된 하나의 특정 선호되는 실시형태에서의 브릿지 분자는 66 아미노산 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함한다.
도 83b 는 알려진 바이오틴-뉴트라비딘 바인딩 반응을 통해 뉴트라비딘 분자에 커플링된 알파-나선 브릿지, 및 또한 알려진 말레이미드-시스테인 공유 결합 반응을 통해 폴리메라제 상에 표면 시스테인에 접합된 추가적인 바이오틴-말레이미드 링커를 통해 부착된 폴리메라제를 포함하는 완전히 조립된 센서의 일 실시형태를 나타낸다.
도 84a 는 폴리메라제 통합들로부터의 신호들을 강화하기 위해 (도 84b 에서 묘사된 dCP4-Cy7 와의 혼합물로서) 예 9 에서 사용된 변형된 C 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 84b 는 폴리메라제 통합들로부터의 신호들을 강화하기 위해 (도 84a 에서 묘사된 dCP4-락토오스와의 혼합물로서) 예 9 에서 사용된 변형된 C 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 85a 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 플롯은, 브릿지를 금 컨택들에 부착하기 위해, 1μM 펩티드 농도에서, BPS 완충재에서 1 시간 동안 펩티드 브릿지 분자로 배양된 테스트 칩 상에서의 전극들에 대한 전류-대-전압 트레이스들이다. 2 볼트 인가된 소스-드레인에서 3 나노-암페어 전류를 달성하는 최고 전류 트레이스는 브릿지 분자를 제자리에 갖는 전극을 나타낸다.
도 85b 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 브릿지된 센서가 2 볼트의 인가된 소스-드레인 전압으로 뉴트라비딘 용액에 노출될 때, 대략적으로 10 초 내지 50 초의 시간에서 브릿지에 대한 후속하는 뉴트라비딘 바인딩의 시그니처를 나타내는 전류-대-시간 트레이스이다.
도 85c 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 뉴트라비딘-브릿지 복합체가 폴리메라제-말레이미드-바이오틴의 용액에 노출될 때, 10-20 초의 시간에서, 뉴트라비딘-브릿지 복합체를 바인딩하는 폴리메라제-말레이미드-바이오틴의 시그니처를 나타내는 전류-대-시간 트레이스이다.
도 85d 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 조립된 센서에 템플릿 DNA 를 포함하는 용액이 제공될 때 결과적인 시퀀싱 신호들을 전개하고, 시퀀스는 일련의 GT 반복들: (10xGT) TTT (10x GT) AAA (10x GT) CCC (10x GT) 을 갖는다. 도면은 이들 신호들의 하나의 가능한 해석으로 주해되고, 여기서, 템플릿의 GT 반복 트랙트들에 대응하는 주요 스파이크들, 및 전체 3 개의 상이한 템플릿 DNA 분자들은 나타낸 45 초 동안 센서와 계합된다.
도 1 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서의 개략적인 표현을 나타낸다
도 2a 및 도 2b 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서 디바이스의 도면들을 나타낸다
도 3 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서의 부분의 측면도 (profile view) 를 나타낸다
도 4 는 다양한 실시형태들에 따라, 바이오폴리머 브릿지 분자를 포함하는 센서를 나타낸다
도 5 는 다양한 실시형태들에 따라, 바이오폴리머 브릿지 분자를 포함하는 센서를 나타낸다
도 6a 및 도 6b 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서 디바이스의 도면들을 나타낸다
도 7 은 다양한 실시형태들에 따라, 노이즈 제거 전 및 후의 신호 트레이스 (signal trace) 를 나타낸다
도 8 은 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들을 이용하여 전극들을 제조하는 방법을 위한 프로세스 흐름을 나타낸다
도 9 는 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들을 이용하여 컨택들을 제조하는 방법을 위한 프로세스 흐름을 나타낸다
도 10 은 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들 및 사전형성된 컨택 입자들의 디포지션 (deposition) 을 이용하여 컨택들을 제조하는 방법을 위한 프로세스 흐름을 나타낸다
도 11a 내지 도 11c 는 다양한 실시형태들에 따라, CMOS 기법들을 이용하여 제조된 센서 디바이스의 도면들을 나타낸다
도 12 는 다양한 실시형태들에 따라, 바이오폴리머 브릿지 자기-조립 (self-assembly) 을 따르는 컨택 어레이의 주사 전자 마이크로그래프 (scanning electron micrograph) 를 나타낸다
도 13 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서를 위한 바이오폴리머 브릿지 자기-조립 이벤트 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 14 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서의 바이오폴리머 브릿지로의 프로브 바인딩 (probe binding) 의 프로세스 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 15 는 다양한 실시형태들에 따라, 프로브로의 템플릿 바인딩 (template binding) 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 16 은 다양한 실시형태들에 따라, 프로브에 의한 템플릿-종속적 염기 통합 동안에 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 17 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서에 의한 단일 템플릿-종속적 염기 통합 이벤트에 의해 생성된 신호 트레이스를 나타낸다
도 18 은 다양한 실험적 조건들 하에서 다양한 실시형태들에 따라, 센서에 의해 생성된 신호 트레이스들을 나타낸다
도 19 는 비변형된 및 5-메틸시토신 (5-methylcytosine) 변형된 뉴클레오티드들을 포함하는 타겟에 응답하여, 다양한 조건들 하에서 다양한 실시형태들에 따른 센서에 의해 생성된 신호 트레이스들을 나타낸다
도 20 은 다양한 실험적 조건들 하에서 긴 템플릿 시퀀스에 응답하여, 다양한 실시형태들에 따른 센서에 의해 생성된 신호 트레이스들을 나타낸다
도 21 은 다양한 실시형태들에 따라 화학적으로 합성된 브릿지 분자를 나타낸다.
도 22 는 일반적인 자기-조립 프로세스를 나타내고, 여기서, 바이오폴리머와 같은 분자 회로 엘리먼트는 회로에서의 타겟 로케이션들에서 포지티브 및 네거티브 전극들 양자에 결합하여 그것들을 브릿징하여 조립된 분자 회로를 형성한다.
도 23 은 회로 자기-조립에서 재료 컨택 포인트의 이용을 나타낸다. "A" 로 도시된 컨택 포인트는 정확한 자기-조립을 안내할 수 있는 공간적으로 국지화된, 정확하게 위치된 재료 엘리먼트이고, 전기적 또는 기계적 접속을 제공한다. 컨택 포인트를 추가하고 분자 엘리먼트를 부착하는 기본적인 단계들은 좌측에 도시된다. 이것이 어떻게 소망되는 회로를 발생시킬 수 있는지는 우측에 표시된다. 그룹 (group) "B" 는 컨택 포인트에 선택적으로 결합할 수 있는 브릿징 분자 상에서의 접합 기이다.
도 24 는, 일련의 조립 단계들에서, 프라이머리 브릿지 분자에 대한 공액 바인딩 사이트 "E" 를 갖는, 타원으로서 표현된 추가적인 분자 컴포넌트들 "D" 에서 특정적으로 결합하기 위한 추가적인 컨택 그룹 "C" 의 이용을 나타낸다.
도 25 는 전류에서의 스파이크들이 센서 디바이스의 자기-조립에서의 각 단계들에 어떻게 관련되는지를 나타낸다.
도 26 은 브릿징된 컨택들 (녹색 박스) 및 브릿징되지 않은 컨택들 (적색 박스) 의 이상적인 이미지들의 도식적 표현이다.
도 27 은 브릿징 반응들 및 라벨링 반응들 후의 기판의 전자 현미경 (electron microscope) 이미지이다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지를 갖는 컨택들을 강조한다.
도 28 은 금 컨택 포인트들의 어레이에 대한 보다 높은 효율성의 20nm 이중-가닥 DNA 브릿지-결합의 이미지이다. 브릿지들은 촬상 목적들을 위해 작은 금 도트로 라벨링된다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지들의 예들을 강조한다. 고 염 완충재 용액에서의 디포지션으로 인한, 금 컨택 포인트들에 대한 보다 높은 레벨들의 결합, 및 브릿지 (브릿지 반응 조건들: 5X TBS 완충재에서 1 시간 동안 바인딩 어레이로 배양된 1 μM 브릿지 농도).
도 29 는 금 도트 컨택 포인트들의 테스트 어레이에 대한 알파-나선 펩티드 브릿지 결합의 이미지이다.
도 30 은 IgG 항체 브릿지 바인딩의 이미지이다.
도 31 은 브릿지 분자들 상에서의 전기적 측정들을 위한 테스트 셋-업의 개략도를 나타낸다.
도 32 는 브릿지 전극 바인딩 이벤트들을 나타내는 3 개의 스파이크들을 나타내는 전류 대 시간의 플롯을 나타낸다.
도 33 은 라벨링된 브릿지들의 EM 이미지이다.
도 34 는 금 전극들의 dSDNA 브릿징의 EM 이미지이다.
도 35 는 원하는 로케이션에서 작은 비드를 제조하기 위해 이용되는 프로세스 (1) 의 단계들을 나타낸다. 도면에서 상부 좌측에서부터 시작하여, 레지스트 (회색) 의 레이어가 기판 (청색) 상에 패터닝되고, 직경 D 의 오픈 디스크를 갖는다. 그 다음에, 접착제의 레이어 (녹색) 가 디스크 내에 디포짓팅된다. 그 다음에, 표준 수단에 의해 제조된, 사전에 만들어진 비드들의 용액이 이에 대해 노출되고, 비드들은 입체 장애 (steric hindrance) 가 접착 디스크 당 오직 하나의 비드만을 허용하도록 직경 d 를 갖는다. 레지스트의 제거 후에, 남는 것은, 접착 디스크의 중앙 부근에 위치된, 하지만 디스크 직경 D 보다 더 작은 사이즈의, 직경 d 의 비드이다.
도 36 은 3D 투시 및 오버헤드 뷰들로 도시된, 도 35 로부터 작은 비드를 확립하기 위한 프로세스 (1) 의 단계들을 나타낸다. 기판으로부터 시작하여, 직경 D 의 재료의 접착 디스크를 레지스트 코팅 (회색) 에서 렌더링된 패턴 내로 디포짓팅하기 위해 표준 패터닝 및 디포지션 방법들이 사용된다. 비드들에의 노출 및 레지스트의 제거는 접착 패치에 부착된 비드를 초래하고, 입체 장애는 접착 디스크 당 오직 하나의 비드만을 허용한다. 따라서, 이 프로세스는 패터닝 프로세스에 의해 좌우되는 것보다 더 작은 직경으로, 원하는 로케이션에서 비드를 확립하였다. 특히, 이것은 패터닝 방법의 것을 초과하는 분해능으로 컨택 포인트들의 제조를 허용한다.
도 37 은 프로세스 (2) 실시형태 (a) 의 단계를 나타낸다: 상부 좌측에서부터 시작하여, 적합한 기판 (청색) 상에 폭 W 의 비드 재료 (금) 의 직사각형의 디포지션, 이는 어닐링 (annealing) 시에 그리고 표면 장력의 작용 하에, 비드들의 라인으로 쪼개진다. 그 다음에, 제거가능한 레지스트 (적색) 의 보호 층이 패터닝되고 디포짓팅되어, 단일 비드를 포함할 보호 영역이 된다. 나머지 비드들은 제거되고, 그 다음에, 레지스트가 제거되어, 재료의 원래 직사각형의 선호되는 단부 부근에 단일 비드를 남긴다.
도 38 은 프로세스 (2) 의 대안적 실시형태 (b) 를 나타내고, 여기서, 도 37 에서 도시된 것과는 상반되게, 최종 디포짓팅된 층 (적색) 은 원치않는 비드들을 커버하기 위해 사용되고, 보다 큰 나노 디바이스에서의 사용을 위해 이용가능한 노출된 선호되는 단부에서의 비드만을 남겨둔다.
도 39a 는 프로세스 (2) 의 하나의 선호되는 실시형태의 일 예를 나타내고, 여기서, 사용되는 패터닝 방법은 전자-빔 리소그래피이고, 목표는 2 개의 전극 스트립들의 근접 단부들에서 비드들을 만드는 것이다. 이 예시는 직사각형 레이어들을 비드들로 쪼개는 시점을 통한 그리고 각 직사각형의 선호되는 단부에서 단일 비드를 달성하기 위한 최종 단계들 이전의 프로세스를 나타낸다.
도 39b 는 상승된 그리고 하강된 기판 릿지들로 이루어지는 기판 상의 실제로 실행된 도 39a 의 프로세스를 나타내는 전자 현미경 이미지이고, 그 기판 상으로 금 층이 디포짓팅되고, 비드들로 쪼개지도록 허용된다. 이미지는, 비드들이 직사각형 스트립들의 기저 폭보다 직경이 실질적으로 더 작고, 좁은 (함몰된) 스트립들은 단일 라인의 비드들이 형성될만큼 충분히 작다.
도 40 은 비드 형성 프로세스 (3) 를 나타내고, 여기서, 최상부 좌측 구성을 확립하는 것으로, 직사각형 패턴이 생성되고, 접착 재료 1 (청색) 의 디포지션 다음에, 재료 2 (금) 의 디포지션 다음에, 진공 파괴에 의해 도입되는 산화와 같은, 계면 층 (회색) 이 이어진다. 그 다음에 (화살표) 재료 3 이 2 와 동일한 재료일 수도 있는 (다시 금으로서 도시된) 얇은 층으로 디포짓팅되고, 그 다음에 (화살표) 보호 층 (적색) 이 실리콘 산화물과 같이 패터닝되고 디포짓팅되며, 선호되는 단부의 작은 영역을 노출된 채로 남겨둔다. 그 다음에 (화살표) 어닐링이 수행되고, 이는 보호 층 및 계면 층에 의해 경계지어지는 재료 3 의 작은 패치가 쪼개지고 비드로 형성되게 하여, 직사각형 영역의 단부에 위치된, 프라이머리 패터닝 치수들보다 더 작은 직경의 그리고 프라이머리 패터닝 치수들의 재료 3 의 비드를 형성하게 한다.
도 41 은 프로세스들 (1) 또는 (2) 를 이용하여 생성된 비드들의 어레이를 나타낸다. 프로세스 (1) 의 경우에, 초기 패터닝 및 재료 디포지션 프로세스들이 기판들 상에 접착 재료 디스크들의 어레이를 형성하기 위해 사용될 수 있다 (점선의 원들에 의해 표시된 원래의 풋프린트들). 프로세스는 그 다음에, 도시된 수행된 비드들을 디포짓팅할 것이다. 대안적으로, 방법 (2) 이 사용되는 경우에, 비드들의 전체 열들은 디포짓팅된 초기 재료 직사각형들의 어레이에 기초하여 단일 보호 단계로 확립될 수 있다.
도 42 는 분자 전자 디바이스들의 어레이를 위한 나노-컨택 포인트들을 생성하기 위한 비드-업 프로세스의 이용을 나타낸다. 비드들의 어레이는, 전극들의 각 쌍이 전극들의 단부들 근처에 위치된, 컨택 포인트들로서 비드들의 쌍을 수용하도록 위치된다.
도 43 은 접착 표면 상에 디포짓팅된 금 비드들의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 비드들은 직경이 대략적으로 5nm 내지 10nm 인 금 나노입자들이다.
도 44 는 비유도성 실리콘 표면에 부착되는 금 비드들을 포함하는 제어 샘플의 전자 현미경 이미지들을 도시한다.
도 45 는 유도성 접착 표면들 상에 디포짓팅된 금 비드들의 원자간력 현미경 (Atomic Force Microscope; AFM) 이미지들을 도시한다. 비드들은 직경이 대략적으로 5nm 내지 10nm 인 금 나노입자들이다.
도 46a 는 행들에서 나타낸 다양한 희석제들에서, 완충재, 친화성 항체들, 나이브 혈청, 및 제어 비-특정적 쥐 IgG 의 삼중 열들 반복들로, 웰들 (wells) 내로 디포짓팅된 금 나노입자들의 다양한 농도들을 전개하는 플레이트 맵을 도시한다.
도 46b 는 ELISA 플레이트로부터의 최종 판독치들의 컬러 코딩된 강도이다.
도 46c 는 수치적 ELISA 판독치들의 대응하는 테이블이다.
도 46d 는, 표면 상에 디포짓팅된 비드 농도들의 전체 범위에 걸쳐, 특정 친화도를 갖는 항체가 다양한 제어들보다 표면 비드들보다 더 큰 바인딩을 갖는 것을 보여주는, 그래픽 형태로 요약된 최종 데이터 결과들을 나타낸다.
도 47 은 DNA 시퀀스를 측정하기 위한 분자 전자 회로의 하나의 선호되는 형태를 나타낸다. 효소가 소스 및 드레인 전극들 사이에 결합되어, 인가된 소스-드레인 및 게이트 전압들 하에서의 전류와 같은 전기적 특성, 또는 (일정한 인가된 전류에서의 전압과 같은) 유사한 시스템 특성들을 측정하기 위한 걔측기를 포함하는 회로를 형성한다. 시간 트레이스로서의 측정된 특성 S(t) 는, DNA 상의 효소의 진행성 작용, 및 이 프로세싱 동안의 전기적 컴포넌트로서 그것의 가변적 특성들로 인해, DNA 의 기저 시퀀스를 반영한다.
도 48 은 핵산 염기들의 흔히 발생하는 메틸화된 형태들을 전개한다. 이들이 DNA 에서 존재할 때, 이것은 생물학적 관련성을 가질 수도 있으므로, 시퀀스에서 그들의 존재를 판독할 수 있는 것이 역시 바람직하다.
도 49 는 도 1 을 보다 표준의 소스-드레인-게이트 기하구조들에서 나타낸다.
도 50 은 DNA 시퀀스를 측정하기 위한 분자 전자 회로의 다른 선호되는 형태의 개략도를 나타낸다. 효소는, 그 효소가 게이팅 기능 및 전도를 제공할 수도 있는 회로를 형성하기 위해, 소스 및 드레인 전극들 사이에서 프라이머리 전도성 엘리먼트에 세컨더리 엘리먼트로서 결합된다. 이 회로는 인가되는 소스-드레인 및 게이트 전압들 하의 전류, 또는 (일정한 인가되는 전류에서의 전압과 같은) 유사한 시스템 특성들과 같은 전기적 특성들을 측정하기 위한 계측기를 포함한다. 시간 트레이스로서 측정된 특성 S(t) 은 DNA 상에서의 효소의 진행성 작용, 및 이 프로세싱 동안 전기적 컴포넌트로서의 그것의 가변적 특성들로 인해, DNA 의 기저 시퀀스를 반영한다.
도 51 은 반도체 디바이스들로부터의 소스-드레인-게이트 기하구조, 및 프라이머리 전도 엘리먼트로서 전극들 사이의 분자 브릿지, 및 근접성 및 잠재적으로 전기적 접속을 보장하는 하나의 수단으로서 효소를 브릿지에 결합하는 결합 포인트 또는 접합 기를 갖는 보다 설명적인 선호되는 실시형태로 도 2 의 개략도를 나타낸다.
도 52 는, dNTP 들을 포함하는 적합한 완충재가 존재한다고 가정하고, 프라이밍된 단일 가닥 DNA 템플릿을 연장하고 있는 폴리메라제를 효소가 포함하는 선호되는 실시형태를 나타낸다. 통합 프로세스 (도시된 A 뉴클레오티드의 통합) 는 측정된 전류 트레이스에서 대응하는 식별가능한 피처 (feature) 를 생성하고 이에 의해 시퀀스를 결정한다.
도 53 은 전류 i 와 같은 측정된 회로 파라미터에서의 신호 스파이크로서 표시된, 통합의 검출가능한 신호가 존재하는 경우의 시퀀싱의 일 실시형태를 나타낸다. 단일 뉴클레오티드 타입들 (A, C, G, T) 의 시험적 플로우들이 수행되고, 워시 (wash) 단계들에 의해 분리되며 (뉴클레오티드 플로우들 및 워시들의 타이밍은 시간 축 상의 문자들 및 밑줄들에 의해 표시됨), 결과적인 관찰된 신호 스파이크들은 표시된 바와 같이 시퀀스를 결정한다. "TT" 와 같은 호모폴리머 시퀀스 시리즈는 대응하는 시험적 플로우 동안의 다수의 통합 스파이크들로서 표시된다. 도시된 것은, A 가 통합되고 단일 스파이크를 생성하는 상황에서 A 염기를 플로잉한 결과, 및 결과적인 DNA 시퀀스의 다음 염기이다.
도 54 는 검출가능한 신호들을 생성하기 위한 변형된 뉴클레오티드들의 사용을 나타낸다. 나타낸 것은, 각 dNTP 가 통합 프로세스에서 전류에 대해 검출가능한 영향을 갖는 (적색 볼들로서 표시된) 변형 기를 운반하는 경우이다. 이러한 변형은 쪼갤 수 있는 감마 포스페이트 상에서의 것일 수 있고, 따라서, 폴리메라제에 의해 제거될 수 있을 것이며, 또는 감지 반응 후에 수행되는 별개의 분할 반응에서 쪼개질 수 있을 것이다. 도시된 것은 변형된 A 염기가 통합되는 경우이다. 개념이 예시되고, 여기서, 4 개의 상이한 변형 기들은 4 개의 상이한 수들의 부착된 볼들 (G:1, A:2, T:3, C:4) 로서 표현되고, 각 뉴클레오티드에 대한 트레이스 내의 동일한 수의 작은 스파이크들을 가지도록 트레이스들을 강화하는 결과를 초래한다.
도 55 는 시험적 플로우 방법에서 사용되는 통합의 검출가능한 신호가 존재하는 경우의 시퀀싱의 실시형태에서 통합 신호를 강화하기 위해 변형된 뉴클레오티드의 사용을 나타낸다. 나타낸 것은, 각 dNTP 가, 통합 프로세스에서 전류에 대해 검출가능한 영향을 갖는 (적색 볼로서 표시된) 변형 기를 운반하는 경우이다. 이러한 변형은 쪼갤 수 있는 감마 포스페이트 상에서의 것일 수 있고, 따라서, 폴리메라제에 의해 제거될 수 있을 것이며, 또는 감지 반응 후에 수행되는 별개의 분할 반응에서 쪼개질 수 있을 것이다. 도시된 것은 시험적 플로우 프로세스의 A 단계이고, 여기서, A 는 통합을 위한 맞는 염기이다.
도 56 은 시퀀스 정보의 키네틱 인코딩을 나타낸다. 통합 스파이크들 사이의 시간은 통합되고 있는 염기로서 표시되고, 여기서, dNTP 농도들에서의 차이로 인해: A 는 최저 농도에 있고, 따라서, 스파이크들 사이의 긴 시간은 A 통합을 위해 예상되는 대기 시간을 나타내는 한편, G 는 최고 농도에 있어서, 스파이크들 사이의 최단 시간은 G 통합 (제 1 간격) 을 나타낸다.
도 57 은 브릿지의 선호되는 실시형태를 나타내고, 이 브릿지는, 티올 링키지 (DNA 단부들에서의 티올화된 뉴클레오티드들, 또는 알파 나선 말단들에 위치된 시스테인) 를 통해 금 컨택들에 결합된 나선형 폴리머 (dsDNA 또는 단백질 알파 나선) 이고, 효소에 접합된 스트렙타비딘에의 결합을 위한, 특정적으로 합성된 내부 바이오틴을 갖는다.
도 58 은, 태생의 또는 조작된 접합 사이트들을 이용하여, 관심대상의 단백질이 IgG 에 직접적으로 접합될 수 있거나, 관심대상의 단백질에 접합되는 (안티-IgG 항체, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은) IgG 특정 바인딩 단백질들을 통한 결합으로, 전극 상의 컨택 포인트들에 대한 특정 친화도 (프라이머리 컨택 포인트 재료, 또는 표면의 항원 유도에 대한 친화도) 를 갖는 (태생의 또는 조작된) IgG 단백질로서, 브릿지의 다른 선호되는 실시형태를 나타낸다.
도 59 는, 완전한 정보를 달성하기 위해, 기술된 방법들의 상이한 실시형태들을 이용하여 동일한 (또는 복제된) DNA 템플릿들의 복제 시퀀싱으로부터의 부분적 시퀀스 정보의 조합을 나타낸다. 청색 트레이스들은, (단일 시퀀싱 런 (run) 에서 직접적으로 관찰가능하지 않은) 조합된 정보의 회색 트레이스에 대해 상대적인, 각각의 별개의 경우로부터의 부분적 정보를 나타낸다. 여기서 나타낸 것은, (오직 A 염기들만이 검출될 수 있는 것으로 도시된) 부분적 정보를 생성하기 위해 (좌측 실시형태), 그리고 다시, 완전한 시퀀스를 획득하기 위해 결합되는 (G, T, C 가 검출되는 것으로 도시된) 상보적 또는 보조적 시퀀싱 정보를 생성하기 위해 (우측 실시형태, 브릿지 및 효소에 대한 변화를 나타냄), 템플릿이 시퀀싱되는 것이다. 2 개의 시퀀싱 실시형태들은 복제 템플릿들을 이용하여 물리적으로 또는 시간적으로 분리되고 독립적일 수 있고, 또는, - 아마도 완충재 변화, 온도 변화 또는 게이트 전압과 같은 인가된 전압들에서의 변화에 의해 생성되는 - 상이한 시간들에서의 동일한 센서 시스템의 상이한 상태들, 동일한 템플릿의 재-판독일 수 있을 것이다. 임의의 수의 이러한 상보적 실시형태들은 최종 시퀀스 결정을 향상시키기 위해 결합된 그들의 정보를 가질 수 있을 것이다.
도 60 은 효소가 엑소뉴클레아제인 일 실시형태를 나타낸다. 신호들은 회로 파라미터들에 대한 효소 입체구조, DNA 입체구조, 및 자유 뉴클레오티드들의 효과에 의해 생성된다.
도 61 은 진행성 효소 (processive enzyme) 가 이중 가닥 DNA 템플릿을 푸는 DNA 헬리카제인 일 실시형태를 나타낸다.
도 62 는 효소가 DNA 전치 능력을 갖는 단백질 나노포어 및 운동 단백질 효소로 형성된 복합체인 일 실시형태를 나타낸다.
도 63 은 통합된 칩 센서 어레이 디바이스를 나타낸다. 이 포맷은, 단일 DNAS 프래그먼트의 복제들에 대한 시퀀스 데이터의 강건한 평균화 또는 데이터 통합을 위해, 동시에 많은 시퀀스들로부터의 시퀀스의 대량 병렬 감지를 수행하기 위한 방식, 및 각 사이트에서의 다양한 또는 동일한 센서 구성들을 전개하는 옵션을 제공한다.
도 64a 는 완결부 (terminator) 시퀀싱 프로세스에서의 시험적 런을 나타낸다. dNTP 들 (청색) 및 디데옥시 완결부들의 혼합물, ddNTP 들 (보라색) 의 존재 하에, 완결부가 랜덤하게 통합될 때까지, 중합 및 감지가 진행되고, 표시된 바와 같이 (도시된 포지션 8 까지) 염기 포지션을 카운트하기 위해 사용되는 통합 스파이크들을 생성한다. 반응의 종단부에서, 완결부 염기 (이 경우에 A) 를 식별하기 위해 감지 측정이 발생한다. 따라서, 기저 시퀀스는 포지션 8 에서 A 를 갖는다. 이 템플릿, 또는 복제 템플릿들에 대해 이러한 측정들을 반복하고, 정보를 조합함으로써, 템플릿을 따른 모든 로케이션들에서의 염기들의 완전한 시퀀스가 결정될 수 있다.
도 64b 는 완결부 시퀀싱의 대안적인 실시형태를 나타내고, 여기서, 오직 단일 염기 완결부, 도시된 경우에, A 디데옥시 완결 (ddATP, 보라색) 이 주어진 반응에서 사용된다. 이 모드에서, 반응이 종결될 때, 문제의 염기가 A, 완결부라는 것이 암시되고, 통합 스파이크들의 수의 카운트는 템플릿에서의 이 A 의 포지션을 제공한다. 복제 템플릿들로 A 에 대한 많은 런들을 반복하면 템플릿에서의 모든 A 로케이션들을 랜덤하게 결정할 것이고, 다른 완결부 염기들 C, G, T 에 대해 유사한 일련의 런들을 수행하는 것은 템플릿에서의 모든 이들 염기들의 각각의 로케이션들을 결정하고 이에 의해 전체 시퀀스를 결정할 것이다.
도 64c 는 완결부 시퀀싱의 일 실시형태를 나타내고, 여기서, 관심대상의 복제된 템플릿이 표시된 각각의 칩 상으로 로딩되고, 모든 A 완결 데이터는 최상부 시리즈에서 표시된, 병렬적 센서 어레이 상에서의 하나의 런으로부터 축적되고, C-, G-, 및 T-완결 반응들에 대해 유사하게 진행되며, 각각으로부터의 단일 염기 결과들은 의문의 템플릿의 전체 시퀀스를 결정하기 위해 축적된다 (적색 화살표).
도 65 는 부착된 효소 대신에 분자 센서에서의 DNA 혼성화 (hybridization) 프로브의 사용, 및 전류와 같은 회로 파라미터를 모니터링하는 것에 의한 혼성화의 검출을 나타낸다. 혼성화는 상이한 전류 레벨에 의해 표시된다. 하나의 선호되는 실시형태는 프로브에 위치된 바이오틴부착된 염기를 통해 스트렙타비딘 (주황색 그룹) 에 DNA 혼성화 프로브를 결합할 것이다. 이 형태의 프로브 및 검출 측정은, 복제된 템플릿 분자들에 반해, 정보성 프로브들의 셋트를 이용하여 많은 이러한 측정치들을 모으는 것에 기초하는, 혼성화에 의한 시퀀싱을 지원한다.
도 66 은 혼성화 프로브를 센서 내로 통합하는 대안적인 실시형태들을 나타내고, 여기서, 프로브는 브릿지 분자의 전부 또는 일부를 형성한다. 선호되는 실시형태에서, 프로브를 포함하는 DNA 는 DNA 에서 금 컨택 포인트들 및 티올이 부착된 뉴클레오티드들을 갖는 금-티올 링키지를 이용하여 컨택 포인트들에 결합될 것이다. 도면은 이러한 혼성화 프로브가 DNA 브릿지 분자의 전부 또는 일부로서 구성될 수 있는 3 가지 상이한 방식들을 나타낸다. 아래의 경우에서, 프로브는 기저 DNA 에 더 부분적으로 혼성화하여 추가된 엄격함을 위해 타겟과 경쟁적 혼성화를 셋업할 수 있을 것이다.
도 67 은 신호를 강화하기 위해 아마도 검출가능한 그룹들 (보라색) 을 포함하는 하나 이상의 염기들을 통합하기 위해 효소적 확장 (청색 화살표에 의해 표시된 프로브의 3' 확장가능한 단부) 을 이용함으로써 프라이머리 혼성화 신호를 강화하는 하나의 예를 나타낸다. 이러한 효소적 확장은 양자 모두, 전류 플롯에서의 3 개의 레벨들 (혼성화 없음, 혼성화, 확장 산물 존재) 에 의해 표시된 바와 같이, 전자적 센서 신호를 강화하는 수단, 및 적절한 페어링을 위한 엄격성 / 체크들을 부가한다. 단일 염기 확장의 경우에, 염기 아이덴터티가 (4 개의 dNTP 들로부터, 또는 일련의 개별 dNTP 확장 시도들을 통해서) 검출가능한 경우에, 시퀀스 정보의 하나 더 많은 염기를 또한 추가할 수 있고, 방법의 시퀀싱 능력을 강화할 수 있다.
도 68 은 대량의 / 거시적 프로세스에서 밀봉 및 개봉될 수 있는 마이크로웰들 또는 나노웰들에 봉입된 센서를 나타낸다. 이것은 다른 모드들의 검출을 용이하게 하기 위해 반응물들 및 반응 산물들을 국지화한다. 이것은 또한, 웰 당 다수의 센서 타입들, 또는 센서 당 다수의 프로브 분자들로부터 혜택을 받을 수도 있어서, 반응 산물을 검출하기 위한 프로브와 함께 진행성 효소가 존재할 수 있다.
도 69 는 실험적 작업을 위해 통상적으로 사용되는 브릿지 및 프로브 분자 구조의 상세들을 나타낸다. 이 경우에서의 브릿지는 도시된 20 nm 길이의 이중 가닥 DNA 분자 (60 염기들) 이고, 금속 전극 상의 금 컨택들에 대한 결합을 위해 양 5' 단부들에서 티올기들을 갖는다.
도 70 은 분자 센서들 상의 전기적 측정들을 위한 테스트 셋업의 개략도를 나타낸다. 도 70 의 상부 부분에서, 전기-기판 구조의 횡단면 및 브릿지 분자를 통해 전압들을 인가하고 전류들을 측정하기 위한 분석기에의 부착이 도시된다. 도 70 의 하부 부분에서, 회로들을 브릿징하기 위한 전극 어레이의 투시도가 도시된다.
도 71a 는 브릿지 바인딩을 위한 금 금속 도트 컨택들을 갖는 티타늄 전극들의 어레이의 전자 현미경 이미지이다. 전극들은 실리콘 기판 상에 있고, 전자-빔 리소그래피에 의해 생성되었다.
도 71b 는 도 71a 에서의 전극 갭들 중 하나의 전자 현미경 확대 이미지이고, 7 nm 의 전극 갭 및 15 nm 의 금-대-금 간격이 금 도트 컨택 갭을 나타낸다.
도 71c 는 도 71b 로부터의 단일 전극 갭의 전자 현미경 확대 이미지이고, 2 개의 전극들의 팁들에서 대략적으로 10 nm 직경 금 도트들을 나타낸다.
도 72 는 전극 테스트 칩 아키텍처를 나타낸다. 이 경우에, 전극 어레이는 전자-빔 리소그래피를 이용하여 1 cm 실리콘 기판 상에 형성되었다. 도 72 에서의 일련의 3 개의 SEM 이미지들은 10 nm 스케일의 전극 갭까지 증가하는 분해능으로 20 개의 전극 쌍들을 보여주고 있다.
도 73 은 실리콘 산화물 패시베이션 층이 용액으로부터 전극들을 보호하기 위해 사용되는 센서 디바이스의 일 실시형태를 나타낸다. 패시베이션에서의 오프닝들은 nm 스케일로 전극 영역을 그리고 10 미크론 스케일로 전기적 컨택 패드들을 노출시킨다.
도 74 는 센서 칩 표면에 대한 액체 용액들의 제어된 노출을 지원하기 위한 플로우 셀의 일 실시형태를 나타낸다. 플로우 셀은 몰딩된 PDMS 폴리머이다.
도 75 는 전기적 측정들을 위해 칩 캐리어에 탑재된 칩을 나타낸다.
도 76 은, 공기, 물 및 희석 염 완충재에서 개방 회로 전극들의 제어들과 함께, 습식 (희석 염 완충재) 및 건식 (공기) 에서의 DNA 브릿지 분자들 및 완전한 센서 복합체들 (폴리메라제와의 브릿지) 의 측정된 전류-대-전압 (I-V) 특성들을 보여주는, 조립된 센서 복합체의 전도도를 나타낸다. 도면은 브릿지 및 센서 복합체가 인가된 소스-드레인 전압의 1 Volt 에서 100 mpico-Amp 전류들의 정도로 전도되는 것을 보여준다. 측정들은 SMU 를 통해 반도체 파라미터 분석기에서 행해졌다.
도 77 은 금-도트 컨택 전극들 상으로의 분자 센서 자기-조립의 전자적 모니터링을 나타낸다. 브릿지 및 분자 센서 복합체의 조립을 모니터링하기 위해 전류 대 시간 측정치들이 사용된다. 상부 좌측: 페이즈 1: 이중 가닥형 DNA 브릿지는 전류에서의 점프에 의해 나타내어지는 바와 같이, 5' 단부들 상에서 티올기들과 조립되고 금 컨택 포인트 상으로 조립된다. 상부 우측: 페이즈 2: 폴리메라제-스트렙타비딘 복합체는 전류에서의 점프에 의해 나타내어지는 바와 같이, dsDNA 브릿지 상에서 바이오틴부착된 사이트에 바인딩된다. 하부 우측: 페이즈 3: 프라이밍된 단일-가닥형 DNA 템플릿은 전류 대 시간에서의 스파이크에 의해 나타내어지는 바와 같이 폴리메라제에 바인딩되어 복합체를 완성한다.
도 78 은 2 레벨들의 확대로 최종 조립 구조의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 확대 이미지에서, 브릿지-복합체는 임의의 라벨링 없이 가시적이고, (녹색 화살표에 의해 포인팅된) 전극들을 연결하는 흐릿한 고 콘트래스트 영역으로서 보인다.
도 79 는 센서로 통합 신호들을 측정하는 4 개의 플롯들이고, 센서로 통합 신호들을 측정하는 것을 나타내고, 통합 및 중합을 위해 다양한 프라이밍된, 단일 가닥형 DNA 시퀀싱 템플릿들 및 dNTP 들이 센서에 공급되는 것으로부터 발생하는 전류 신호들을 보여준다. 각각의 경우에, 주요 신호 스파이크들은 별개의 통합 이벤트들로부터의 신호들을 표현하고, 여기서, 폴리메라제 효소는 연장 가닥에 또 다른 염기를 추가한다. 상부 좌측: 템플릿은 20 T 염기들이다; 상부 우측, 템플릿은 20 G 염기들이다; 하부 좌측, 템플릿은 20 A 염기들이다; 하부 우측, 템플릿은 20 C 염기들이다. 관찰되는 통합의 근사 레이트는 초 당 10-20 염기들이고, 레이트 제한 인자들 (예컨대, 보다 낮은 dNTP 농도) 로 인해 초 당 ~1 염기의 보다 낮은 레이트를 제외하고는, 표준 효소 키네틱스 (kinetics) 와 일치한다.
도 80 은 단일 염기 통합 이벤트로부터 생성된 신호의 확대를 나타낸다. 신호는 이중-피크 구조이고, 이는 통합 이벤트를 검출하는 것에 추가하여, 염기의 아이덴터티를 특성화하는데 도움을 주기 위해 잠재적으로 사용될 수 있을 것이다.
도 81 은 메틸화된 염기들을 감지하는 것의 일 실시형태를 나타낸다. 이 도면은 템플릿에서 메틸화 상태 또는 개별 메틸화된 염기들을 감지하기 위한 센서의 잠재적인 사용을 보여준다. 도면은 템플릿의 메틸화되지 않은 대 메틸화된 부분으로부터 초래되는 상이한 신호들을 도시한다. 보다 높은 신호들은 메틸화된 부분보다는 메틸화되지 않은 부분으로부터 발생한다. 나타낸 실험은 표시된 템플릿 시퀀스에 대해, 표시된 바와 같이 센서 칩 상으로 일련의 상이한 용액 추가들에 대한 트레이스들을 측정하는 것으로 이루어진다. dCTP 플로우는 단일 염기 통합 스파이크를 생성하였고, dGTP 의 추가는 그러면 템플릿의 CG 트랙트 (tract) 를 가로질러 통합이 진행하는 것을 가능하게 하였고, 메틸화된 대 메틸화되지 않은 템플릿으로부터의 신호에서의 차이를 강조하였다.
도 82 는 센서의 긴 판독 능력들을 나타낸다. 이 도면은 긴 DNA 프래그먼트들을 판독 또는 분석하기 위한 잠재성을 보여주고, 이는 전체 게놈 시퀀스들의 데노보 조립과 같은 데이터의 장 범위 연속성이 중요한 애플리케이션들에 대해 중요하다. DNA 템플릿은 5.4kb PhiX 바이러스의 게놈이다. 좌측에서: 템플릿 (dNTP 믹스) 의 저-시간-분해능 판독으로부터의 차분 신호들, 대 중합 없이 제어 상의 수반 (완결부 ddNTP 믹스, 폴리메라제 활동 차단됨). 우측에서: 긴 템플릿 DNA 가 가시적인 전극들의 SEM 이미지.
도 83a 는 펩티드 알파-나선 브릿지 분자를 포함하는 센서의 일 실시형태를 나타낸다. 실제로 실행된 하나의 특정 선호되는 실시형태에서의 브릿지 분자는 66 아미노산 시퀀스를 갖는 펩티드를 포함한다.
도 83b 는 알려진 바이오틴-뉴트라비딘 바인딩 반응을 통해 뉴트라비딘 분자에 커플링된 알파-나선 브릿지, 및 또한 알려진 말레이미드-시스테인 공유 결합 반응을 통해 폴리메라제 상에 표면 시스테인에 접합된 추가적인 바이오틴-말레이미드 링커를 통해 부착된 폴리메라제를 포함하는 완전히 조립된 센서의 일 실시형태를 나타낸다.
도 84a 는 폴리메라제 통합들로부터의 신호들을 강화하기 위해 (도 84b 에서 묘사된 dCP4-Cy7 와의 혼합물로서) 예 9 에서 사용된 변형된 C 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 84b 는 폴리메라제 통합들로부터의 신호들을 강화하기 위해 (도 84a 에서 묘사된 dCP4-락토오스와의 혼합물로서) 예 9 에서 사용된 변형된 C 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 85a 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 플롯은, 브릿지를 금 컨택들에 부착하기 위해, 1μM 펩티드 농도에서, BPS 완충재에서 1 시간 동안 펩티드 브릿지 분자로 배양된 테스트 칩 상에서의 전극들에 대한 전류-대-전압 트레이스들이다. 2 볼트 인가된 소스-드레인에서 3 나노-암페어 전류를 달성하는 최고 전류 트레이스는 브릿지 분자를 제자리에 갖는 전극을 나타낸다.
도 85b 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 브릿지된 센서가 2 볼트의 인가된 소스-드레인 전압으로 뉴트라비딘 용액에 노출될 때, 대략적으로 10 초 내지 50 초의 시간에서 브릿지에 대한 후속하는 뉴트라비딘 바인딩의 시그니처를 나타내는 전류-대-시간 트레이스이다.
도 85c 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 뉴트라비딘-브릿지 복합체가 폴리메라제-말레이미드-바이오틴의 용액에 노출될 때, 10-20 초의 시간에서, 뉴트라비딘-브릿지 복합체를 바인딩하는 폴리메라제-말레이미드-바이오틴의 시그니처를 나타내는 전류-대-시간 트레이스이다.
도 85d 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 조립된 센서에 템플릿 DNA 를 포함하는 용액이 제공될 때 결과적인 시퀀싱 신호들을 전개하고, 시퀀스는 일련의 GT 반복들: (10xGT) TTT (10x GT) AAA (10x GT) CCC (10x GT) 을 갖는다. 도면은 이들 신호들의 하나의 가능한 해석으로 주해되고, 여기서, 템플릿의 GT 반복 트랙트들에 대응하는 주요 스파이크들, 및 전체 3 개의 상이한 템플릿 DNA 분자들은 나타낸 45 초 동안 센서와 계합된다.
본원에서의 예시적인 실시형태들의 상세한 설명은 예시 및 그 최상의 모드로서 예시적인 실시형태들을 도시하는 동반된 도면들을 참조한다. 이 예시적인 실시형태들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자 (이하, '통상의 기술자' 라 함) 가 발명을 실시하게 하는 것을 가능하게 하기 위하여 충분히 상세하게 설명되어 있지만, 다른 실시형태들이 실현될 수도 있고, 논리적, 화학적, 및 기계적 변화들이 발명들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 행해질 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 이에 따라, 본원에서의 상세한 설명은 제한이 아니라, 오직 예시의 목적들을 위하여 제시된다. 예를 들어, 이와 다르게 언급되지 않으면, 방법 또는 프로세스 설명들 중의 임의의 것에서 인용된 단계들은 임의의 순서로 실행될 수도 있고, 제시된 순서로 반드시 제한되지는 않는다. 또한, 단수에 대한 임의의 참조는 복수의 실시형태들을 포함하고, 하나를 초과하는 컴포넌트 또는 단계에 대한 임의의 참조는 단수 실시형태 또는 단계를 포함할 수도 있다. 또한, 부착된, 고정된, 접속된 등에 대한 임의의 참조는 영구적, 분리가능한, 임시적, 부분적, 전체적, 및/또는 임의의 다른 가능한 부착 옵션을 포함할 수도 있다. 추가적으로, 컨택 없음 (또는 유사한 어구들) 에 대한 임의의 참조는 또한, 감소된 컨택 또는 최소의 컨택을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 단일 분자 바이오센서 디바이스는 제 1 전극 및 제 2 전극을 포함할 수 있다. 제 1 전극 및 제 2 전극은 전극들 및/또는 전극들에 부착된 컨택들에 의해 정의된 센서 갭에 의해 분리된다. 제 1 및 제 2 전극들은 센서 갭에 걸쳐 이어지는 브릿지 분자에 의해 결합될 수 있다. 브릿지 분자는 핵산 또는 아미노산 폴리머들과 같은 바이오폴리머를 포함할 수 있다. 브릿지는 또한, 합성 유기 분자, 바이오폴리머 모노머 (biopolymer monomer) 들의 합성 유사체 (synthetic analog) 들을 포함하는 폴리머 (polymer), 또는 생물학적 분자로부터 유도되지 않은 다른 전체적 합성 모노머들을 포함할 수도 있는 화학적으로 합성된 분자를 포함할 수도 있다. "바이오폴리머" 와 "화학적으로 합성된 분자" 사이의 차이는, 예를 들어, 후속하는 바인딩 및 브릿징을 위해 그렇지 않은 경우에 자연적으로 발생하는 다중 핵산 시퀀스의 3' 및 5' 단부들을 합성적으로 변형하는 것과 같이, 그렇지 않은 경우에 천연 바이오폴리머를 유용한 브릿지 분자로 변형하는 합성 변환을 위한 가능성을 배제하는 것으로서 엄격하게 문언적이도록 의미되지 않는다. 브릿지 분자는 바이오폴리머 또는 합성 분자로 이루어지든지 간에, 알려진 원자적으로 정밀한 분자 구조를 가질 수도 있다. 전극들로의 브릿지 분자 부착은 컨택에 의해 중재될 수도 있다. 프로브 분자 또는 분자 복합체 (molecular complex) 는 브릿지 분자에 결합될 수 있다. 프로브는 단일 타겟 분자와 상호작용하도록 구성된 효소와 같은 바이오분자일 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 센서 디바이스는 병렬로 배열된 다수의 단일 분자 바이오센서들을 포함할 수 있다. 이러한 멀티-센서 디바이스들은 타겟 및 다른 분자들의 복합 혼합물에서의 다수의 개별적인 타겟 분자들의 병렬 검출, 구별, 및/또는 특성화 또는 식별을 수행하기 위하여 이용될 수 있다.
도 1 은 다양한 실시형태들에 따라, 센서 (101) 를 포함하는 센서 디바이스 (100) 의 개략적인 표현을 예시한다. 센서 (101) 는 제 1 전극 (102) 및 제 2 전극 (103) 을 포함한다. 센서 (101) 는 또한, 이하에서 더 상세하게 설명된 바와 같이, 게이트 (104) 를 포함할 수도 있다. 센서 (101) 는 제 1 전극 (102) 및 제 2 전극 (103) 에 기능적으로 결합된 센서 복합체 (105) 를 더 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 센서 복합체는 개개의 전극들에 부착된 제 1 컨택 (106) 및 제 2 컨택 (107) 을 통해 전극들에 결합될 수도 있다. 센서 복합체 (105) 는 이하에서 더 상세하게 설명된 바와 같이, 브릿지 분자 및 프로브 분자와 같은 다수의 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 센서 복합체 (105) 는 주변 환경과 상호작용할 수 있음으로써, 센서 (101) 가 감지 기능을 수행하는 것을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 도 1 에서 예시된 바와 같이, 센서 복합체 (105) 는 DNA 분자와 같은 타겟 분자 (108) 와 상호작용할 수도 있고, 센서 디바이스는 타겟 분자의 존재 및/또는 성질들을 검출하기 위하여 이용될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 센서 디바이스 (100) 및 센서 (101) 는 센서 (101) 의 전기적 성질의 변화를 검출하기 위하여 회로 (120) 에 동작적으로 접속될 수도 있다. 회로 (120) 는 바람직하게는, 센서 (101) 로의 마이크로-스케일 근접성을 갖는 집적 회로이지만, 회로 (120) 는 또한, 벤치-톱 전류 계측기 (bench-top currentmeter) 와 같은 외부의 전기적 계측기로서 내장될 수 있다. 센서 디바이스 (100) 는 복수의 센서들 (101) 을 포함할 수 있다. 집적 회로 (120) 는 CMOS 제조 방법들을 이용하여 제조될 수도 있는 회로 아키텍처를 포함할 수 있다. 집적 회로 (120) 는 센서를 위한 지원을 제공하는 동일한 칩 내에서 제조되는 각각의 센서 (101) 를 위한 전자 측정 회로를 포함할 수 있다. 상이하게 표현하면, 센서 디바이스 (100) 는 센서 (101) 및 집적된 마이크로회로에서의 집적 회로 (120) 를 포함할 수 있다. 집적 회로 (120) 는 판독 회로부, 및 외부 신호 프로세싱 시스템 (121) 으로의 접속을 위한 입력/출력 피처들을 더 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 센서 (101) 를 갖는 공통 반도체 칩 상에서 존재하는 집적 회로 (120) 의 이용은 거시적인 외부 회로 엘리먼트들에 의해 생성될 수 있는 판독들에서의 전자 노이즈의 소스들을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 회로는 감도 및 판독을 위한 성능 요건들에 따라 1 내지 200 의 범위인, 작은 수의 트랜지스터들을 포함하는 혼합된 신호 CMOS 센서일 수도 있다. 이러한 회로는 다양한 실시형태들에서 단일 센서 (101) 에서의 전류를 측정하도록 기능할 수 있다. 또한, 센서 디바이스 (100) 는 동일한 샘플과 컨택하는 큰 수의 센서들의 동시 동작을 지원하기 위하여 센서들 (101) 의 어레이를 위한 센서/판독 회로들을 포함하는 집적 회로 (120) 를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 센서 (101) 에 의해 컨택된 샘플은 액체-상 (liquid-phase) 샘플을 포함할 것이다. 샘플을 포함하는 용액은 센서를 이용하여 수행된 전기적 측정들에서 노이즈를 감소시키기 위하여 극도로 희석될 수도 있고 낮은 이온 강도 (ionic strength) 에 있을 수도 있다. 취득된 신호는 전형적으로, 센서에서의 전극들 (102 및 103) 사이에서 흐르는 전류일 것이지만, 그것은 전극들 사이의 전압, 전극들 사이의 저항/전도도 (resistance/conductance), 또는 게이트 전압과 같은 관련된 관찰가능한 전자 파라미터일 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 최신 CMOS 제조 방법들을 이용한 제조를 따르는 집적된 마이크로칩 칩 포맷에서의 센서 (101) 및 집적 회로 (120) 의 구성은 고도로 간결한 아키텍처를 갖는 센서 디바이스들의 생산을 가능하게 할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 센서를 위한 집적 회로는 센서 갭의 약 100 ㎛ 내에서, 또는 센서 갭의 약 50 ㎛ 내에서, 또는 센서 갭의 약 20 ㎛ 내에서, 또는 센서 갭의 약 10 ㎛ 내에서, 또는 센서 갭의 약 5 ㎛ 내에서, 또는 센서 갭의 약 1 ㎛ 내에서 위치될 수도 있다. 또한, 다양한 실시형태들에서, 센서 디바이스는 복수의 센서들을 포함할 수 있고, 각각의 센서는 위에서 특정된 파라미터들 내에서 위치된 연관된 집적 회로를 가질 수 있다.
신호 프로세싱 시스템 (121) 은 센서 디바이스 (100) 의 전자 제어를 제공하고, 센서 디바이스 및 그 내부의 각각의 센서 (101) 로부터 수신된 신호를 수신하고, 저장하고, 분석하도록 구성될 수 있다. 신호 프로세싱 시스템 (121) 은, 각각의 센서 (101) 에 인가된 전압 및 전류의 제어를 포함하는 전자 제어 기능들을 수행하고, 각각의 센서 (101) 로부터 수신된 신호에 대한 신호 프로세싱 기능들을 수행하도록 구성된 프로세서 및/또는 소프트웨어를 갖는 컴퓨터 시스템을 포함할 수 있다.
예를 들어, 그리고 도 1 에서 예시된 바와 같이, 센서 (101) 를 포함하는 센서 디바이스 (100) 는 핵산 시퀀싱 반응을 수행하기 위하여 이용될 수도 있다. 디바이스의 동작 동안, 전압은 센서 (101) 의 제 1 전극 및 제 2 전극 사이에서 인가될 수도 있고, 타겟과의 센서의 상호작용들은 집적 회로 (120) 및 신호 프로세싱 시스템 (121) 을 이용하여 측정될 수 있는 바이오폴리머 브릿지 분자 (예컨대, 333, 도 3 을 참조) 를 통한 전류 플로우의 조절을 생성할 수도 있다. 센서 (101) 는 타겟 분자 (108) 의 피처들과의 센서 복합체 상호작용에 응답하여 센서에 의해 생성된 신호 피처들 (123) 을 갖는 시간 t 에 대한 신호 패턴 (122) 을 생성할 수도 있다. 신호 프로세싱 시스템 (121) 은 신호 패턴을 수신 및 프로세싱할 수 있고, 이 문맥에서, 신호의 해석인 신호 패턴에 응답하여 시퀀스 출력 (124) 을 제공할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 단일 분자 바이오센서는 전기적 회로에서 채널 또는 전도성 경로로서 역할을 하는, 부착된 브릿지 분자 및/또는 프로브, 및/또는 타겟 분자, 및/또는 이 컴포넌트들에 매우 근접한 용액-상 (solution-phase) 분자들을 갖는, 전계 효과 트랜지스터 (field effect transistor; FET) 와 같은 트랜지스터의 형태를 취할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 단일 프로브 분자를 포함하는 센서 복합체는 이하에서 더 상세하게 설명된 바와 같이 단일 타겟을 바인딩하거나 단일 타겟과 상호작용하여, 이에 의해 바이오센서에 단일 분자 감도를 제공하도록 구성될 수도 있다. 이러한 트랜지스터 실시형태는 2 또는 3 단자 트랜지스터, 또는 멀티-게이트 디바이스들의 경우와 같은 잠재적으로 더 많은 단자들을 포함할 수도 있다.
도 2a 및 도 2b 는 다양한 실시형태들에 따라, 센서 디바이스 (200) 의 도면들을 예시한다. 센서 복합체들은 센서 디바이스 (200) 의 예시된 도면들에서 도시되어 있지 않다. 센서 디바이스 (200) 는 복수의 센서들 (201) 을 포함하고, 각각의 센서는 제 1 전극 (202) 및 제 2 전극 (203) 을 포함한다. 각각의 센서는 센서 갭 (239) 을 더 포함할 수 있다. 예시된 실시형태에서, 각각의 센서는 제 1 전극에 부착된 제 1 컨택 (206), 및 제 2 전극에 부착된 제 2 전극 (207) 을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 전극들은 반도체 기판 표면 상에서 배치될 수 있다. 예를 들어, 센서 디바이스 (200) 는 실리콘 디옥사이드 (silicon dioxide) 층 (261) 위에 놓이는 실리콘 나이트라이드 (silicon nitride) 층 (260) 을 포함할 수 있다. 센서 디바이스 (200) 는 전극들이 그 상에서 배치되는 반도체 기판 층 (들) 아래에 놓이는 매립된 게이트 (204) 를 더 포함할 수 있다. 위에서 설명된 다양한 컴포넌트들은 실리콘 칩 (263) 과 같은 지지체 상에서 제조될 수 있다. 도 2a 에서 개략적으로 예시된 바와 같이, 제 1 전극 (201), 제 2 전극 (202), 및 게이트 (204) 의 각각은, 예시도에서 도시된 바와 같이, 외부 계측기일 수도 있지만, 대안적으로, 집적 회로부 (세부사항들은 도시되지 않음) 일 수 있는 신호 프로세싱 시스템 (221) 에 접속될 수도 있다.
도 3 을 지금부터 참조하면, 센서 (301) 및 센서 복합체 (305) 의 부분의 측면도가 더 상세하게 예시되어 있다. 센서 (301) 는 제 1 전극 (302) 및 제 2 전극 (303) 을 포함한다. 제 1 전극 (302) 및 제 2 전극 (303) 은 기판 (320) 상에서 배치될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 센서 (301) 는 각각 제 1 전극 (302) 및 제 2 전극 (303) 에 동작적으로 결합된 제 1 컨택 (306) 및 제 2 컨택 (307) 을 더 포함할 수 있다. 그러나, 컨택들은 엄격하게 요구되지는 않고, 본 개시물에 따른 센서는 제 1 및 제 2 컨택을 포함할 필요가 없다. 제 1 전극 (302) 및 제 2 전극 (303) 의 단부들은 전극 갭 (330) 을 정의한다. 마찬가지로, 센서 (301) 와 같은, 컨택들을 포함하는 센서에 대하여, 제 1 컨택 (306) 과 제 2 컨택 (307) 사이의 거리는 컨택 갭 (331) 을 정의한다. 임의의 소정의 제 1 컨택 및 제 2 컨택에 대한 컨택 갭의 실제적인 치수는 참조를 위하여 이용된 컨택의 구성 및 컨택의 포인트에 따라 변동될 수도 있다. 예를 들어, 도 3 에서 예시된 반구형 (hemispherical) 제 1 컨택 (306) 및 제 2 컨택 (307) 에 대하여, 컨택 갭 (331) 의 치수는 컨택의 가장 근접한 포인트들 사이에서, 또는 중심으로부터 중심까지 측정될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극 갭 및 컨택 갭 중의 하나, 또는 집합적으로 또는 전극들 및/또는 컨택들의 다양한 조합들에 의해 정의된 갭은 센서 갭으로서 지칭될 수도 있다.
도 3 을 계속해서 참조하면, 센서 (301) 는 센서 복합체 (305) 를 더 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 센서 복합체 (305) 는 브릿지 분자 (333) 및 프로브 (334) 를 포함할 수 있다. 프로브 (334) 는 스트렙타비딘-바이오틴 (streptavidin-biotin) 복합체로서 여기에서 도시되는 링커 (linker) (337) 를 통해 브릿지 분자 (333) 에 결합될 수 있고, 바이오틴은 DNA 브릿지 (333) 의 뉴클레오티드 내로 공유결합으로 통합될 수 있고, 스트렙타비딘은 폴리메라제 (334) 에 화학적으로 공유결합으로 교차-링크될 수 있다. 센서 복합체 (305) 의 다양한 컴포넌트들의 각각은 이하에서 더 상세하게 설명된다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자 (333) 는 화학적으로 합성된 브릿지 분자 또는 바이오폴리머 브릿지 분자를 포함할 수 있다. 화학적으로 합성된 브릿지 분자 또는 바이오폴리머 브릿지 분자는 구조적으로 그리고 기능적으로의 양자로 센서 갭에 걸쳐 이어지도록 구성될 수도 있다. 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자 또는 바이오폴리머 분자는, 알려진 또는 예측가능한 구조적 파라미터들을 갖는 브릿지 분자의 구성, 컨택 포인트들로의 자기-조립 및 브릿지 분자로의 프로브 분자의 자기-조립을 가능하게 하는 피처들의 통합 뿐만 아니라, 전극들의 전기적 접속을 위한 적당한 전기화학적 성질들을 제공하는 원자적으로 정밀한 분자 서브유닛들 (예컨대, 폴리머 브릿지 분자로의 통합을 위한 모노머 유닛들) 의 선택 및 이용을 통해 구성될 수도 있다.
화학적으로 합성된 브릿지 분자는 합성 유기 화학의 분야의 통상의 기술자에 의해 조립될 수 있는 분자이다. 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자는 폴리피롤 (polypyrrole), 폴리아닐린 (polyaniline), 또는 폴리티오펜 (polythiophene) 백본을 포함할 수 있다. 도 21 을 간략하게 참조하면, 폴리티오펜-기반 (polythiophene-based) 화학적으로 합성된 브릿지 분자 (2100) 의 일반적인 구조의 예가 예시되어 있다. 화학적으로 합성된 브릿지 분자 (2100) 는, 브릿지 분자 (2100) 에서의 특정 로케이션에서 구성될 수도 있는 프로브 지지 모이어티 (probe support moiety) (2102) 의 어느 한 측 상의 n 1 및 n 2 티오펜 고리들인, 브릿지 분자의 백본을 형성하는 티오펜 고리들 (2101) 의 사슬을 포함할 수 있다. 각각의 티오펜 고리 (2101) 는 폭이 대략 0.3 nm 이므로, 약 10 내지 약 100 개의 고리들을 포함하는 화학적으로 합성된 브릿지 분자는 약 3 nm 내지 약 30 nm 갭에 걸쳐 이어지도록 구성될 수 있다. 화학적으로 합성된 브릿지 분자의 말단 (terminus) 들 (예컨대, A1 및 A2) 은 티올 (thiol) 또는 아민 기들, 또는 전극 또는 컨택 재료들에 바인딩하도록 구성된 다른 기들을 포함할 수 있다. 화학적으로 합성된 브릿지 분자는 또한, 프로브 분자의 부착을 제공하기에 적당한 링커 (예컨대, L) 로 구성될 수 있다. 통상의 기술자에게 지금 알려진, 또는 통상의 기술자에 의해 이후에 고안될 수도 있는 임의의 적당한 백본 모이어티로 이루어진 임의의 다른 화학적으로 합성된 브릿지 분자는 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따라 이용될 수도 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "바이오폴리머" 는 생물 (living organism) 에 의해 생성될 수 있는 적어도 하나의 모노머 유닛을 포함하는 임의의 분자를 포함할 수 있지만, 바이오폴리머 또는 폴리머 자체를 포함하는 실제적인 모노머 유닛은 유기체 (organism) 에 의해 생성될 필요가 없고 체외에서 합성될 수 있다. 바이오폴리머들의 예들은 DNA, RNA, 및 단백질들과 같은 이것들의 잘 알려진 형태들을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 (polynucleotide) 들, 폴리펩티드 (polypeptide) 들, 및 폴리사카리드 (polysaccharide) 들을 포함한다. 바이오폴리머를 포함하는 브릿지 분자들은 콜라겐 단백질 (collagen protein) 들에서 발생하는 바와 같은 간단한 "코일드-코일 (coiled-coil)" 구성, 또는 면역글로빈 (immunoglobin) 분자들 (예컨대, IgG) 에서와 같은, 무겁고 가벼운 사슬 폴리머 단백질들의 더 복잡한 접힘 (folding) 에서의 멀티-사슬 (multi-chain) 폴리머 단백질들을 포함할 수 있다. 바이오폴리머들을 포함하는 이러한 복합체들은 또한, 수소 결합 (hydrogen bonding) 에 의해 나선형 이중 가닥 (helical double strand) 으로 바인딩된 2 개의 DNA 단일 가닥 분자들인, DNA 이중 나선과 같은 공통 핵산 듀플렉스 나선 (common nucleicacid duplex helix)들, PNA-PNA 듀플렉스들 뿐만 아니라, DNA-RNA, DNA-PNA, 및 DNA-LNA 하이브리드 듀플렉스들을 포함한다. 바이오폴리머 분자는 자연적으로 발생하거나 바이오폴리머로서 분류되어야 할 유기체에 의해 생성될 필요가 없다. 그 대신에, 본 개시물의 목적들을 위하여, 용어 "바이오폴리머" 는 효소적으로 (enzymatically) 뿐만 아니라 비-효소적으로 (non-enzymatically) 합성되는 분자들을 포함할 수 있고, 자연적으로-발생하는 모노머 유닛들의 합성 유사체들을 포함하는 분자들을 유사하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이오폴리머들은 펩티드 핵산 (peptide nucleicacid; PNA) 들 및 잠금형 핵산 (locked nucleicacid; LNA) 들, 개량된 안정성 성질들을 가지는 DNA 및 RNA 의 합성 유사체들을 포함할 수 있다. 게다가, 바이오폴리머는 분자에 추가될 수도 있는 다양한 변형들 중의 임의의 것을 포함할 수 있다. 바이오폴리머 분자들의 이용은 센서 기능을 위한 적당한 크기 및 화학을 가지는 정밀하게 제어된 구조체들의 합성을 포함하는 다양한 이익들을 제공할 수 있고, 그것들은 센서를 위한 타겟 분자들과 자연적으로 양립가능할 수도 있고 (예컨대, 동일한 액체 완충재 배지 (liquid buffer medium)와 양립가능함), 바이오기술 산업은 이러한 분자들을 설계하고, 제작하고, 합성하기 위하여, 그리고 그것들을 경제적으로 그리고 높은 품질 제어로 제조하기 위하여 광범위한 능력들을 개발하였다.
브릿지 분자는 센서 갭에 걸쳐 이어지고, 브릿지 분자와 전극 및/또는 컨택 사이의 전자 통신을 제공하기 위하여 적당한 방식으로 센서 갭의 어느 한 면 상의 전극 및/또는 컨택에 결합되도록 구성될 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 이중-가닥형 (double-stranded) DNA 나선 또는 α-나선형 폴리펩티드와 같은 선형 바이오폴리머를 포함할 수 있다. 도 3 에서 예시된 바와 같이, 브릿지 분자 (333) 는 제 1 컨택 (306) 에 결합된 제 1 단부 (334) 및 제 2 컨택 (307) 에 결합된 제 2 단부 (335) 를 갖는 선형 바이오폴리머 이중-가닥형 DNA 브릿지 분자를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 강성의 브릿지 구조체는 센서 복합체의 조립 동안 및 조립 후에 양호하게-정의된 구성을 취한다는 측면에서 장점들을 제공할 수도 있다. 이론에 의해 구속되도록 희망하지 않으면서, 선형 바이오폴리머는 그 굴곡 강성 (bending rigidity) 에 의해 설명될 수도 있는 반-플렉시블 (semi-flexible) 폴리머를 포함할 수도 있다. 짧은 길이의 스케일로, 선형 바이오폴리머는 폴리머를 굴곡시키기 위하여 강한 힘을 요구하는 강성의 폴리머로서 거동할 수도 있는 반면, 더 긴 스케일로, 선형 바이오폴리머는 더 용이하게 굴곡되거나 만곡될 수도 있다. 선형 바이오폴리머가 환경적 조건들의 어떤 셋트에서 강성의 분자로서 그 내에서 필수적으로 거동하는 특징적인 굴곡 길이 척도는 지속 길이로서 지칭된다. 지속 길이는 굴곡력 (bending force) 이 폴리머 상에서 가해지는 환경적 조건들에 종속될 수 있고, 주변 환경의 온도 및 이온 조건들과 같은 변수들은 지속 길이에 영향을 줄 수 있다. 이중-가닥형 DNA 와 같은 선형 바이오폴리머의 지속 길이는 이론적 모델링에 기초하여 추정될 수도 있거나, 그것은 다양한 실시형태들에 따른 디바이스가 이용될 수도 있는 미리 결정된 실험적 조건에 대응하는 환경적 조건들의 셋트에 대하여 경험적으로 측정될 수도 있다. 예를 들어, 이중-가닥형 DNA 의 지속 길이는 약 30 nm 내지 약 80 nm 로 계산되었고, α-나선형 펩티드의 지속 길이는 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른 센서가 이용될 수도 있는 조건들을 근사화할 수도 있는 다양한 조건들에서 약 80 nm 내지 약 100 nm 로 계산되었다. 이에 따라, 다양한 실시형태들에서, 위에서 설명된 개개의 지속 길이 파라미터들보다 더 작은, 그 장축 (major axis) 을 따라 측정된 바와 같은 단부-대-단부 (end-to-end) 길이를 가지는 이중-가닥형 DNA 분자 또는 α-나선형 펩티드는 필수적으로 강성의 폴리머로서 거동할 수도 있음으로써, 디바이스 조립 및 성능에 대한 어떤 장점들 또는 이익들을 제공할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, DNA 또는 아미노산들로 이루어진 선형 바이오폴리머들의 이용은 바이오폴리머의 모노머 조성 (즉, 주 구조) 에 기초한 미리 결정된 길이를 가지는 나노-스케일 센서 컴포넌트들의 간단한 구성을 허용한다. 이론에 의해 구속되도록 희망하지 않으면서, 지속 길이보다 더 작은 단부-대-단부 길이를 갖는 선형 바이오폴리머의 이용은 다양한 실시형태들에 따른 바이오분자 감지 디바이스의 구성 동안에 자기-조립 단계의 효율을 강화시킬 수도 있다. 이러한 선형 바이오폴리머들의 이용은 그 미세기계적 성질들이 굴곡되거나 접힐 수도 있는 더 긴 선형 바이오폴리머들에 대한 것보다 더 예측가능한 파라미터들 내에서 바이오폴리머 브릿지 분자의 사양들을 유지하기 위한 능력을 제공함으로써, 예를 들어, 브릿지 분자 합성, 취급, 자기-조립, 또는 센서 동작 동안에 바람직하지 않은 확률론적 효과들의 영향을 감소시킨다. 또한, 선형 바이오폴리머들의 이용은 센서 갭까지의 브릿지 분자 길이의 정밀한 사양 (즉, 전극 갭 및/또는 컨택 갭 치수 및 아키텍처) 를 허용하여, 이론적인 구조적 모델들 및 디바이스 개선들의 성능을 용이하게 테스트하고 증분식의 양호하게-제어된, 그리고 경험적으로-테스트가능한 변형들을 만들기 위한 추가의 능력을 제공한다. 다양한 실시형태들에서, 선형 바이오폴리머 브릿지 분자는 센서 디바이스에서 이용된 스케일 (예컨대, 약 5 nm 내지 약 30 nm 사이의 단부-대-단부 길이) 에서의 선형 바이오폴리머 브릿지 분자의 필수적으로 강성인 본질로 인한, 제 1 컨택 및 제 2 컨택 중의 하나에 대한, 제 1 에서의 제 1 자기-조립 앵커 및 제 2 단부 제 2 자기-조립 앵커 양자의 오결합 (miscoupling) 의 감소된 레이트를 제공하도록 구성될 수도 있다. 유사하게, 바이오폴리머 브릿지 분자는 단일-단부 결합의 감소된 레이트를 제공하도록 구성될 수도 있다. 이것은 실질적으로 강성의 브릿지 분자가 일단 제 1 컨택에서 결합되면, 컨택들의 간격으로 인해, 희망하는 제 2 컨택 포인트의 근처에서 더 많은 시간을 소비하기 위하여 제 2 단부를 한정함으로써, 희망하는 제 2 결합 반응의 레이트를 증가시킬 때에 발생할 수도 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 바이오폴리머 브릿지 분자는 이중-가닥형 DNA 분자를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 이중-가닥형 DNA 는 티올-변형된 뉴클레오티드 또는 염기를 포함하는 티올-변형된 올리고를 포함할 수 있다. 티올-변형된 뉴클레오티드는 금 나노비드 (gold nanobead) 또는 유사한 표면 컨택에 바인딩하도록 구성된 자기-조립 앵커를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 자기-조립 앵커는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 위치될 수 있는 5'-티올 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이중-가닥형 DNA 분자는 올리고뉴클레오티드들의 상보적인 쌍을 포함할 수 있고, 각각의 올리고뉴클레오티드가 5'-티올 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있어서, 조립된 이중-가닥형 DNA 는 이중-가닥형 DNA 분자의 양자의 말단들에서 위치된 자기-조립 앵커를 포함한다. 예를 들어, 다양한 실시형태들에서, 이중-가닥형 DNA 분자는 다음의 시퀀스들을 갖는 올리고뉴클레오티드들을 포함할 수 있고:
5'-/5ThioMC6-D/TGC GTA CGT ATG TCA TGA ATG GCG CAG ACT GAT GTC CTA TGA CGT CGC TAC TGC AGT ACT-3' (SEQ ID NO: 1), 및
5'-/5ThioMC6-D/AGT ACT GCA GTA GCG ACG TCA TAG GAC A/iBiodT/C AGT CTG CGC CAT TCA TGA CAT ACG TAC GCA-3' (SEQ ID NO: 2), 여기서, "/5ThioMC6-D/" 은 5'-티올 변형자 (modifier) 를 나타내고, "/iBiodT/" 는 내부 바이오틴-변형된 데옥시티미딘 뉴클레오티드 (deoxythymidine nucleotide)(IntegratedDNA Technologies, Inc., Coralville, IA) 를 나타낸다. 서로에 대해 어닐링될 때, 이 올리고들은 분자의 각각의 단부에서 위치된 5'-티올 변형된 뉴클레오티드를 갖는 이중-가닥형 DNA 분자를 제 1 및 제 2 자기-조립 앵커들로서 제공한다.
이중-가닥형 DNA 분자 브릿지는 또한, 프로브 분자를 상보적인 아비딘-타입 (avidin-type) 링커 컴포넌트를 갖는 브릿지에 링크하는 것을 가능하게 하기 위하여 바이오틴 링커 컴포넌트를 더 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 그리고 위에서 설명된 역방향 올리고뉴클레오티드 시퀀스에서 예시된 바와 같이, 바이오틴-변형된 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥형 DNA 분자 브릿지의 올리고들 중의 하나로 통합될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 바이오틴-변형된 올리고는 변형된 티미딘 잔기 (바이오틴-dT) 를 통한 것과 같은 내부 변형이다. C6 스페이서를 통한 티미딘으로의 부착, 트리에틸렌글리콜 (triethyleneglycol) 스페이서를 통한 부착, 광절단가능한 스페이서 아암 (photocleavable spacer arm) 을 통한 부착, 이중 바이오틴 변형들, 데스티오바이오틴 (desthiobiotin) 변형들, 및 바이오틴 아지드 (biotin azide) 변형들을 포함하는 다양한 바이오틴 변형 구성들이 이용될 수도 있다. 통상의 기술자에게 지금 알려져 있거나 이후에 고안될 수도 있고, 프로브 분자로의 링크를 가능하게 하기 위하여 올리고뉴클레오티드에 대해 행해질 수도 있는 다른 변형들은 본 개시물의 범위 내에 있다. 유사하게, 디곡시게닌 (digoxigenin) 과 같은 단백질 바인딩 파트너를 갖는 다른 공통적인 소분자 (small molecule) 들은 브릿지 분자에서의 정밀하게 원자적으로 특정된 포인트들에서의 프로브 분자들로의 접합 (conjugation) 의 이러한 목적들을 위한 바이오틴의 역할과 유사한 역할을 행할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 펩티드 바이오폴리머 브릿지 분자는 전극 또는 컨택 바인딩 특성들, 구조적 특성들, 전기적 성능 특성들 등을 포함하는 다양한 바람직한 브릿지 분자 구조 및 성능 특성들을 제공하기 위하여 적당한 다양한 구성들 및/또는 피처들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 바이오폴리머 브릿지는 금, 팔라듐, 또는 백금과 같은, 강한 티올 바인딩에 관여하는 특정 금속 컨택들로의 티올-금속 바인딩을 통해 자기-조립 앵커로서 역할을 하기 위하여 아미노 말단 및 카르복실 (carboxyl) 말단 중의 하나 또는 양자에서 L-시스테인 (L-cysteine) 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 바이오폴리머 브릿지 분자는 자기-조립 및 회로로의 전기-기계적 접속의 목적들을 위하여 금 컨택들을 선택적으로 그리고 강하게 바인딩하기 위한 알려진 용량을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 특정 펩티드들은 다음의 아미노산 시퀀스들을 갖는 것들을 포함한다: MHGKTQATSGTIQS (SEQ ID NO: 3), VSGSSPDS (SEQ ID NO: 4), 및 LKAHLPPSRLPS (SEQ ID NO: 5). 이러한 성질들에 대하여 선택된 다른 펩티드들은 다른 특정 금속 또는 재료 컨택들을 유사하게 바인딩시킬 수 있다. 예를 들어, VPSSGPQDTRTT (SEQ ID NO: 6) 는 알려진 알루미늄 바인딩 펩티드이고, MSPHPHPRHHHT (SEQ ID NO: 7) 는 알려진 실리콘 디옥사이드 바인딩 펩티드이다. 다양한 다른 실시형태들에서, 바이오폴리머 브릿지 분자는 선형, 강성, 전도성 브릿지를 제공하는 안정적인 알파-나선 입체구조 (conformation) 들의 형성을 촉진하기 위하여 알려진 다음의 아미노산 시퀀스 모티프 (motif) 들 중의 하나로부터 선택된 아미노산 모티프 또는 모티프들의 반복들을 포함하는 펩티드 시퀀스를 포함할 수 있다: EAAAR (SEQ ID NO: 8), EAAAK (SEQ ID NO: 9), EEEERRRR (SEQ ID NO: 10), 및 EEEEKKKK (SEQ ID NO: 11). 이러한 펩티드 바이오폴리머 브릿지 분자는 또한, 프로브 분자 복합체들로의 아비딘-기반 (avidin-based) 접합을 위한 정밀하게 원자적으로 정의된 로케이션에서 접합 포인트를 제공하기 위하여 공유결합으로 부착된 바이오틴을 갖는 라이신 (lysine) 잔기로 구성되는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 변형된 라이신은 그렇지 않을 경우에 알파-나선의 성질들을 유지하거나 최소로 변경하기 위하여, 이러한 펩티드 시퀀스 모티프에서 라이신 또는 아르기닌 (arginine) 잔기를 대체할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 바이오폴리머 브릿지 분자는 다른 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 그리고 도 4 에서 예시된 바와 같이, 바이오폴리머 브릿지 분자 (433) 는, 신축되거나, 접히거나, 어떤 정도의 부 구조를 포함하는 선형 바이오분자를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 바이오폴리머 브릿지 분자는 구상 단백질 (globular protein) 들, 항체들, 및 멀티-서브유닛 단백질 복합체들을 포함하는 3차 및/또는 4차 구조를 가지는 분자들을 더 포함할 수 있다. 바이오폴리머 브릿지 분자 (533) 가 면역글로빈 G 단백질 (IgG) 을 포함하는 예가 도 5 에서 예시되어 있다. 예시된 실시형태에서, 전기적 컨택들 (506, 507) 은 금 나노-입자들이고, IgG 는 이러한 입자들을 바인딩하기 위하여 특정 친화도 (affinity) 로 확립되었다.
센서 (301) 와 유사하게, 도 4 및 도 5 에서 예시된 구성들은 각각 링커들 (각각 437 및 537) 을 통해 바이오폴리머 브릿지 분자들에 결합된 프로브 (각각 436 및 536) 를 포함한다. 예시된 실시형태들은 상이한 구조적 구성들에서의 상이한 금속성 또는 비-금속성 전도 또는 반전도 컨택들을 포함하는, 상이한 재료들 및 구성들을 포함하는 전극들 또는 컨택들에 결합될 수도 있는 가능한 바이오폴리머 브릿지 분자 구성들의 범위를 예증하도록 의도된 것이다. 다양한 실시형태들에서, 전극들 또는 컨택들은 InnovaCoat GOLD 나노입자들 (Innova Biosciences) 과 같은 제품들을 이용하여 브릿지 조립 및/또는 부착을 가능하게 하기 위하여 추가로 코팅 (coat) 될 수도 있거나, 처리 (treat) 될 수도 있거나, 유도체화 (derivatize) 될 수도 있다.
다양한 실시형태들에 따른 프로브는 임의의 적당한 분자 또는 멀티컴포넌트 (multicomponent) 분자 복합체를 포함할 수 있다. 프로브는 센서에 의해 검출되어야 할 분자 또는 모니터링되어야 할 생화학적 반응에 기초하여 선택될 수도 있다. 프로브들의 다양한 예들은 펩티드들, 단백질들, 효소들, 핵산들, 리보자임 (ribozyme) 들, 촉매 DNA 들 등을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 효소는 라이소자임 (lysozyme), 키나아제 (kinase), 또는 폴리메라제를 포함할 수 있다. 기판 또는 타겟 분자의 바인딩 또는 프로세싱에 응답하여 물리적, 화학적, 또는 전자적 구성에서의 특정 변화를 나타내는 임의의 분자 또는 복합체는 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따라 프로브로서 이용될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 프로브는 개별적인 DNA 또는 RNA 타겟 분자들과 상호작용하기 위하여 적당한 폴리메라제 또는 역전사효소 (reverse transcriptase) 와 같은 효소를 포함할 수 있다. 성장하는 올리고뉴클레오티드 가닥으로의 뉴클레오티드 염기들의 템플릿-종속적 통합을 촉매화하는 효소들은 템플릿 가닥 핵산 염기들을 순차적으로 조우하는 것, 및/또는 템플릿-특정된 자연적 또는 유사체 염기들을 통합하는 것 (즉, 통합 이벤트) 에 응답하여 입체구조적 변화들을 거친다. 이러한 입체구조적 변화들은 프로브가 결합되는 브릿지 분자를 통한 전기적 전류를 조절할 수 있음으로써, 템플릿 분자에 종속적인 방식으로 시퀀스-특정 신호 패턴을 제공할 수 있다. 위에서 설명된 바와 같이, 신호 패턴은 신호 프로세싱 시스템에 의해 검출될 수도 있고 시퀀스 데이터 출력으로 변환될 수도 있다. 또한, 타겟 핵산 시퀀스에서의 변형된 뉴클레오티드의 존재는 고유한 입체구조적 변화들과, 센서 디바이스 및 신호 프로세싱 시스템이 염기-대-염기 (base-by-base) 에 기초하여, 예를 들어, 타겟 시퀀스에서의 염기들의 메틸화 (methylation) 를 직접적으로 결정하는 것을 가능하게 할 수 있는 신호 패턴에서의 대응하는 신호 피처들을 생성할 수도 있다. 이러한 라벨 없는 (label-free) 직접적인 시퀀싱 방법은 DNA 의 모두 4 개의 염기들에 대응하는 자연적 및/또는 유사체 염기들의 혼합물을 포함하는 뉴클레오티드 염기 믹스를 이용하여 시퀀싱 반응에서의 뉴클레오티드-특정 통합 이벤트의 구별을 허용할 수도 있지만, 직렬 및/또는 순환적 방식으로 개별적인 자연적 또는 유사체 염기들을 순차적으로 제공하는 것을 포함하는 시퀀싱 프로세스가 또한 이용될 수도 있다. 프로브 분자로서의 역전사효소의 이용은 중간 cDNA 변환 단계에 대한 필요성 없이 RNA 분자들의 직접적인 시퀀싱을 유사하게 가능하게 할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 그리고 위에서 간략하게 설명된 바와 같이, 프로브는 자기-조립 링커를 통해 브릿지 분자에 부착될 수 있다. 자기-조립 링커는 제 1 바이오분자를 제 2 바이오분자에 부착하기 위하여 적당한 다수의 구조체들 중의 임의의 것을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 자기-조립 링커는 제 1 링커 컴포넌트, 및 제 1 링커 컴포넌트에 대해 상보적인 제 2 링커 컴포넌트를 포함할 수 있다. 제 1 링커 컴포넌트 및 제 2 링커 컴포넌트는 제 2 링커 컴포넌트에 대한 제 1 링커 컴포넌트의 친화도에 기초하여 조립된 링커를 형성하기 위하여, 자기-조립에 의해 합체될 수도 있다. 제 1 링커 컴포넌트는 예를 들어, 브릿지 분자와 연관될 수 있고, 제 2 링커 컴포넌트는 프로브와 연관될 수 있다. 브릿지 분자와 연관된 링커 컴포넌트는 브릿지 분자에서의 특정 사이트에 대해 조작될 수 있어서, 브릿지로의 프로브의 자기-조립은 브릿지 분자 상의 미리 결정된 로케이션에서의 브릿지 분자로의 프로브의 결합을 생성한다. 프로브와의 연관성을 위하여 선택된 링커 컴포넌트는 링커 컴포넌트의 크기 및 그것이 프로브에 접합되는 위치의 양자에 대하여, 프로브와 타겟 사이의 간섭을 최소화하도록 구성될 수도 있다. 이러한 방식으로, 상보적인 제 1 및 제 2 링커 컴포넌트들을 합체하는 것은 브릿지 분자로의 프로브의 기능적인 부착을 제공할 수 있다. 자기-조립 링커는 컴포넌트들이 서로와의 강한 비-공유 결합 (non-covalent bond) 을 형성하는, 아비딘 (또는 다른 아비딘-유사) 단백질 제 1 링커 컴포넌트 및 바이오틴 소분자 제 2 링커 컴포넌트에 의한 바이오틴-아비딘 결합 메커니즘을 포함할 수 있다. 다른 아비딘-유사 단백질들은 스트렙타비딘, 리즈아비딘 (rhizavidin), 브라다비딘 (bradavidin), 뉴트라비딘 (NeutrAvidin), 아비딘 또는 스트렙타비딘의 다른 다양한 아미노-산 변형된 형태들 뿐만 아니라, 바이오틴-바인딩 기능성을 보유하는 이러한 아비딘들의 이가 (divalent) 또는 모노머 유도체들을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 예를 들어, 바이오틴은 브릿지 분자에 접합될 수도 있고, 스트렙타비딘은 프로브 분자에 접합될 수도 있다. 자기-조립 링커는 또한, 바이오접합 (bioconjugation) 을 위한 잘 알려진 "클릭-화학 (click-chemistry)" 메커니즘들을 포함할 수 있다. 자기-조립 링커는 또한, 예를 들어, 프로브 분자에 접합된 항체로의 브릿지 분자 결합 상에 존재하는 항원 (antigen) 과의 항원-항체 결합을 포함할 수 있다. 자기-조립 링커는 또한, 예를 들어, 스파이캐처 (SpyCatcher) 펩티드 제 1 링커 컴포넌트 및 스파이태그 (SpyTag) 펩티드 제 2 링커 컴포넌트를 포함할 수 있고, 2 개의 컴포넌트들은 비가역적인 공유 결합을 형성하기 위하여 바인딩한다. 통상의 기술자에게 지금 알려져 있거나, 통상의 기술자에 의해 이후에 고안될 수도 있는 임의의 구성에서의 임의의 다른 자기-조립 링커 시스템이 프로브를 브릿지 분자에 결합하기 위하여 이용될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 센서는 브릿지 분자와는 별개인 프로브 분자를 포함할 필요가 없다. 그 대신에, 브릿지 분자 자체는 타겟 분자에 의해 작용되도록 구성될 수도 있다. 예를 들어, 브릿지는 키나아제 바인딩 사이트와 같은 단백질 바인딩 사이트를 포함할 수 있고, 브릿지로의 타겟 단백질의 바인딩 및/또는 타겟 단백질에 의한 브릿지의 변형에 기초하여 샘플에서의 대응하는 단백질의 존재 및/또는 활성을 검출하기 위하여 이용될 수 있다.
도 6a 및 도 6b 를 지금부터 참조하면, 센서 봉입부 (sensor enclosure) 를 갖는, 그리고 갖지 않는 부분적으로-제조된 센서 디바이스 (600) 의 사시도들이 예시되어 있다. 센서 디바이스 (600) 는 매립된 게이트 (640) 를 포함하는 3 단자 센서 디바이스이다. 도 6a 에서 예시된 디바이스 (600) 는 전극 갭들 (630) 에 의해 분리된 제 1 전극들 (602) 및 제 2 전극들 (603) 과 함께, 기판 (641) 및 옥사이드 (642) 아래에 놓이는 게이트 (640) 와 같은, CMOS 제조 기법들을 이용하여 생산될 수도 있는 센서 디바이스의 다양한 피처들을 포함하고, 각각의 전극은 부착된 컨택 (606/607) 을 포함한다. 브릿지 분자 및 프로브를 포함하는, 위에서 설명된 다양한 센서 복합체 컴포넌트들의 부착은 다운스트림 자기-조립 단계들에서 수행될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 그리고 도 6b 에서 예시된 바와 같이, 센서 디바이스 (600) 는 센서를 브릿지 및/또는 프로브 분자들을 포함하는 용액과 컨택함으로써 센서들의 조립을 완료하기 이전에, 센서 갭들 (630) 주위에서 플로우 셀 (flow cell) 을 봉입 (enclose) 하거나 형성하도록 구성된 봉입부 (enclosure) (643) 로 먼저 구성될 수도 있다. 마찬가지로, 봉입부 (643) 는 또한, 시퀀싱 반응들과 같은 어세이들을 수행하기 위하여 이용될 수도 있다. 봉입부 (643) 는 별도로 형성될 수 있고, 디바이스 (600) 를 포함하는 구조체에 부착될 수 있다.
바이오분자 검출 및 핵산 염기 구별
다양한 실시형태들에서, 디바이스 (100) (도 1) 와 같은 단일 분자 감지 디바이스의 동역학 (dynamics) 및 키네틱스 (kinetics) 를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 브릿지 분자를 포함하는 센서 (101) 의 전기적 전도성에서의 변화들을 측정하기 위한 임의의 방법은 본원에서 설명된 센서 디바이스를 모니터링하기 위하여 이용될 수 있다. 다양한 실시형태들에서는, 약 10 V 미만의 전압이 바이오분자 브릿지 분자를 포함하는 센서에 인가될 수 있고, 이하에서 더 상세하게 설명된 다양한 실시형태들에서는, 약 0.5 V 의 전압이 인가된다. 센서를 통해 흐르는 전류는 집적 회로 (120) 를 이용하여 시간의 함수로서 측정될 수 있다. 센서 복합체 (105) 에서의 프로브에 의한 타겟 바인딩 및/또는 프로세싱 이벤트들 (즉, 효소 프로브의 경우에 효소 활성) 은 센서 (101) 의 전도성에 대한 변화들을 생성할 수 있어서, 신호 피처들 (123) 을 포함하는 시간 t 에 대한 신호 패턴 (122) 을 생성하기 위하여 측정된 전류를 조절할 수 있다. 이러한 이벤트들, 및 구조적, 화학적, 및 전자적 변화들 (즉, 효소, 기판들, 및 주변 용액에서의 전하 분포들) 을 포함하는 연관된 입체구조적 변화들은 타겟 바인딩 및 프로세싱의 키네틱 피처들을 포함할 수 있고, 다양한 이벤트들은 당해 분야에서 알려져 있는 신호 프로세싱 기법들을 이용하여 측정될 수 있거나, 레코딩될 수 있거나, 구별될 수 있거나, 분석될 수 있거나, 또는 저장될 수 있는 신호 피처들 (123) 을 포함하는 전류 변동들을 생성할 수 있다. 신호 피처들은 삼각형, 정현파이거나, 임의의 수의 푸리에 (Fourier) 컴포넌트들을 가지는 형상들을 갖는 웨이블렛 (wavelet) 들을 포함하는 가능한 형태들의 범위 중의 임의의 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 센서에서 프로브로서 이용된 폴리메라제는 템플릿 염기 (즉, 타겟 분자 피처) 와의 각각의 개별 상호작용 및/또는 템플릿-종속적 뉴클레오티드 통합을 위한 폴리메라제 키네틱 시그니처 (polymerase kinetic signature) 를 제공할 수 있고 (즉, 폴리메라제 키네틱 시그니처는 템플릿 염기-종속적임), 핵산 템플릿 타겟은 타겟 분자에서의 개별 위치들에서의 타겟 분자 피처들의 시퀀스 (즉, 제 1, 제 2, 및 n 번째 타겟 분자 위치들에서의 제 1, 제2, 및 n 번째 타겟 분자 피처들) 를 포함할 수 있고, 각각의 타겟 분자 피처는 본 개시물에 따른 센서에 의한 검출 동안에 대응하는 신호 피처를 생성할 수 있다. n 개의 타겟 분자 피처들은 이 n 개의 타겟 분자 피처들에서 상보적인 뉴클레오티드들을 순차적으로 통합하기 위하여 폴리메라제 효소에 의해 프로세싱되는 단일 가닥형 DNA 템플릿 분자 (즉, 타겟) 의 n 개의 연속적인 염기들에 대응할 수 있다. 일련의 신호 피처들을 포함하는 신호 패턴의 진폭들, 기간들, 및 형상들은 신호 패턴을 신호 통합 맵과 비교하여 타겟의 무결성을 결정하기 위하여 신호 프로세싱 시스템 (121) 을 이용하여 분석될 수 있는 타겟-특정 센서 응답을 인코딩할 수 있다. 신호 검출 및 분석의 시간 분해능 (time resolution) 을 증가시키는 것은 프로브-타겟 상호작용의 키네틱 가변성, 전이들, 및 중간 상태들을 추가로 분해하기 위한 능력을 제공할 수도 있다.
뉴클레오티드 통합의 충실도는 정확한 핵산 시퀀싱에 대해 탁월하므로, 다양한 실시형태들에서, 시퀀싱하는 방법은, 템플릿-기반 뉴클레오티드 통합의 입체구조적 변화들을 증가시킴으로써, 더 명확한 신호들을 생성하고, 및/또는 그렇지 않을 경우에 유사체 염기의 통합을 구별하기 위한 개량된 능력을 제공함으로써, 개량된 시퀀싱 정확도를 제공하는 유사체 염기들에 의존할 수도 있다. 템플릿-종속적 뉴클레오티드 통합의 키네틱 또는 동적 구별을 강화시키기 위하여 이용될 수 있는 비-라벨링된 (non-labeled) 유사체 염기들은 잘 알려져 있고, 퓨린 (purine) 및 피리미딘 (pyrimidine) 염기들의 변형들, 및 뉴클레오티들의 디옥시리보오스 (deoxyribose) 또는 리보오스 (ribose) 및 포스페이트 (phosphate) 부분들을 포함할 수 있다. 특히, 이것은 추가적인 기들을 뉴클레오티드의 감마-포스페이트 (gamma-phosphate) 에 추가하는 것을 포함할 수 있고, 이는 통합 동안에 절단되고, 그러므로, 성장하는 가닥 및 폴리메라제와의 그 상호작용에 영구적으로 충격을 주지 않는 크고 다양한 분자 변형들을 수락한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은 핵산 템플릿 시퀀스에서의 비변형된 및 변형된 뉴클레오티드 염기들의 검출을 제공할 수 있다. 예를 들어, 방법은 N 6-메틸아데노신 (methyladenosine), N 4-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신 (hydroxymethylcytosine), 5-포르밀시토신 (formylcytosine), 및 5-카르복실시토신 (carboxylcytosine) 염기들을 포함하는 변형된 템플릿 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 비염기 (abasic) 사이트들과 같은 손상된 템플릿 시퀀스 위치들을 구별하기 위하여 적당할 수도 있다. 이론에 의해 구속되도록 희망하지 않으면서, 시퀀싱 반응 동안의 상보적인 핵산 가닥으로의 뉴클레오티드의 DNA 폴리메라제 촉매화 통합은 템플릿 가닥에서의 뉴클레오티드의 아이덴터티 (identity) 에 종속적인 방식으로 차별적인 폴리메라제 키네틱스를 나타낼 수도 있다. 본 개시물에 따른 디바이스들 및 방법들을 이용하면, 핵산 템플릿에서의 뉴클레오티드 염기의 아이덴터티는 통합 이벤트에 대응하는 전자 시그니처 (electronic signature) 의 검출에 기초하여 실시간에 근접하여 결정될 수도 있다. 형광단-라벨링된 (fluorophore-labeled) 뉴클레오티드의 통합과 연관된 형광 신호 (fluorescence signal) 의 검출에 의존하는 다른 시스템들 및 방법들과 달리, 형광-기반 검출 시약들 및 신호 검출 디바이스들이 요구되지 않음으로써, 프로세스의 비용 및 복잡도를 감소시킨다.
다양한 실시형태들에서, 방법은 신호 트레이스로부터 노이즈를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 노이즈를 제거하는 것은 60 Hz 라인 노이즈를 제거하기 위한 것과 같은 신호 프로세싱을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 신호 트레이스로부터 노이즈를 제거하는 것은 신호 트레이스 해석의 에러를 감소시킬 수 있다. 신호로부터의 60 Hz 라인 노이즈의 제거 전 (상부 신호 트레이스) 및 후 (하부 신호 트레이스) 에, 12-염기 핵산 템플릿을 시퀀싱함으로써 생성된 신호 트레이스의 예는 도 7 에서 예시되어 있다. 노이즈 제거의 다양한 방법들은 이러한 노이즈의 특성에 따라 이용될 수도 있고, 이러한 방법들은 신호 프로세싱의 분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
다양한 실시형태들에서, 센서에 바인딩된 타겟의 시퀀스를 결정하기 위한 신호 프로세싱은 시퀀스의 정확한 결정이 아니라, 타겟의 아이덴터티의 확률적 결정을 포함할 수도 있다. 타겟 분자의 실제적인 시퀀스는 다수의 가능한 고유한 시퀀스들 중의 하나일 수도 있고, 각각의 가능한 고유한 시퀀스는 고유한 이론적인 신호를 가질 수도 있다. 타겟 분자의 시퀀스의 결정은 고유한 이론적인 신호들의 데이터베이스를 포함하는 신호 해석 맵과의 실험적으로 측정된 신호의 비교를 요구할 수도 있다. 신호 해석 맵은 알려진 타겟 시퀀스들을 이용하여 생성된 트레이닝 데이터 셋트 또는 라이브러리, 노이즈, 블러 (blur), 드리프트 (drift) 등과 같은 신호 아티팩트 (artifact) 를 감소시키기 위한 포지티브 및 네거티브 제어 측정들에 기초한 신호 프로세싱 뿐만 아니라, 신경 네트워크들, 클러스터링 (clustering), 곡선 피팅, 모델 피팅, 베이지안 추론 (Bayesian inference) 등과 같은 머신 러닝 (machine learning) 및/또는 통계적인 방법들의 적용에 기초하여 생성될 수도 있다.
센서
디바이스의
제조 및 조립
본 개시물의 다양한 실시형태들에서는, 본원에서 설명된 바와 같은 분자 바이오센서 디바이스를 생산하는 방법이 제공된다. 분자 바이오센서 디바이스를 생산하는 방법은 CMOS 제조 프로세스들 및 분자 생물학 (molecular biology) 방법들의 조합을 포함할 수 있다. CMOS 제조들 프로세스들은, 당해 분야에서 잘 알려져 있고, FET 들과 같은 디바이스들을 포함하는 집적 회로들의 상업적인 스케일 생산을 위하여 적당한 고-분해능 광학적 리소그래피 (optical lithography) 방법들을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, CMOS 제조 프로세스들은 반도체 기저부 상에서 디포짓팅된 제 1 전극 및 제 2 전극을 가지는 개별적인 센서들을 포함하는 집적 회로들을 생산하기 위하여 이용될 수 있고, 제 1 전극 및 제 2 전극은 정밀하게 정의된 센서 갭에 의해 분리될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 나노-전극, 갭, 및 컨택 설계는 CMOS 프로세스들 내에서 완전히 제조가능하도록 선택될 것이다. 특히, 특정한 간단한 기하구조들이 이 엘리먼트들에 대하여 선택될 경우, 그것들은 위상-시프팅 마스크 (phase-shifting mask) 들, 다중-패턴화, 및 주요한 파운드리 회사들 (예컨대, TSMC 또는 GlobalFoundries) 에서의 것들과 같은 특정 제조 설비들에 의해 구체화된 바와 같은 현재 및 미래의 16 nm 노드들, 14 nm 노드들, 10 nm 노드들, 7 nm 노드들, 및 5 nm 노드들을 포함하는 최고 분해능 CMOS 제조 노드들을 달성하기 위하여 이용된 다른 기법들과 조합된, 극자외선 (EUV; Extreme UV) 및 원자외선 (DUV; Deep UV) 소스들과 같은 높은 분해능의 광학적 리소그래피 방법들을 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 프로세스들은 직선 라인 세그먼트 (segment) 들, 직선 라인 절단부들, 및 원형 스폿 (spot) 들과 같은 어떤 특정 패턴 피처들을 만들기 위한 고유하게 높은 분해능을 가진다. 나노-전극, 나노-컨택, 및/또는 갭 기하구조들의 설계에서의 이 프로세스-특정 기하학적 엘리먼트들의 이용은 연관된 CMOS 프로세스에서 다양한 실시형태들에 따른 센서 디바이스의 제조를 가능하게 할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 채용된 제조 기법들은 또한, 전자-빔 리소그래피 (e-beam lithography), 나노-임프린트 리소그래피 (nano-imprint lithography), 또는 포커싱된 이온 빔 밀링 및 플라즈마 에칭과 같은 밀링 및 에칭 기법들과 같은, 비-CMOS (non-CMOS) 프로세스 방법들을 포함할 수도 있다. 분자 생물학 제조 방법들은 원자 구성에 대한 정밀한 제어에 의한 희망하는 브릿지 분자들의 합성, 및 업스트림 CMOS 또는 다른 제조 방법 프로세스에서 생성된 전자 센서 컴포넌트들 및/또는 구체적으로 설계된 자기-조립 반응 프로세스들에서의 다른 바이오분자들과의 바이오분자들의 상호작용 및 결합을 허용하기 위하여 적당한 조건들 하에서 액체 상 (liquid phase) 에서의 이러한 바이오분자들의 용액들의 전달을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 본원에서 설명된 센서 디바이스를 제조하는 방법은 집적 회로 마이크로칩을 제조하는 것, 센서 전극들 및/또는 컨택들의 제조, 브릿지 바이오분자의 합성, 브릿지 바이오분자를 전극들 및/또는 컨택들에 조립하는 것, 프로브를 브릿지 바이오분자에 결합하는 것, 플로우 셀에서 센서 디바이스를 봉입하는 것을 포함하는 단계들을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 센서는 2 단자 회로를 포함할 수 있거나, 센서는 게이트를 갖는 3 단자 회로를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 게이트는 매립된 게이트 구성을 가질 수도 있지만; 그러나, finFET 구조체들을 포함하는 횡방향 게이트 및 다른 게이트 구성들이 또한 이용될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 전극, 컨택, 및/또는 게이트는 전도성 금속 재료들로 이루어질 수도 있다. 예를 들어, 전극, 컨택, 및/또는 게이트는 알루미늄, 티타늄, 크로뮴 (chromium), 구리, 금, 팔라듐, 백금 등을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극, 컨택, 및/또는 게이트는 n-타입 및 p-타입 반도체 전극들을 만들기 위하여 이용될 수도 있는 도핑된 반도체 재료들을 포함하는 반도체 재료들을 포함할 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극 및 전극에 부착된 컨택은 동일한 재료를 포함할 수 있고, 다양한 다른 실시형태들에서, 컨택은 그것이 부착되는 전극과는 상이한 재료를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 전극은 임의의 적당한 구조적 구성을 가질 수도 있다. 예를 들어, 전극은 일반적으로 직사각형 단면을 포함할 수 있지만, 다른 기하학적 및 불규칙적인 단면 프로파일들이 가능하고 본 개시물의 범위 내에 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극은 약 30 nm 미만, 또는 약 25 nm 미만, 또는 약 20 nm 미만, 또는 약 15 nm 미만, 또는 약 14 nm 미만, 또는 약 13 nm 미만, 또는 약 12 nm 미만, 또는 약 11 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만, 또는 약 9 nm 미만, 또는 약 8 nm 미만, 또는 약 7 nm 미만, 또는 약 6 nm 미만, 또는 약 5 nm 미만, 또는 약 4 nm 미만, 또는 약 3 nm 미만의 최대 단면 치수 (즉, 전극의 단면에서의 전극의 최대 치수) 를 가질 수 있다.
유사하게, 다양한 실시형태들에서, 컨택은 임의의 적당한 구조적 구성을 가질 수도 있다. 예를 들어, 컨택은 일반적으로 반-구형 (semi-spherical) 또는 반구형 단면 프로파일을 포함할 수 있지만, 다른 기하학적 및 불규칙적인 단면 프로파일들이 가능하고 본 개시물의 범위 내에 있다. 다양한 실시형태들에서, 컨택은 약 20 nm 미만, 또는 약 15 nm 미만, 또는 약 14 nm 미만, 또는 약 13 nm 미만, 또는 약 12 nm 미만, 또는 약 11 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만, 또는 약 9 nm 미만, 또는 약 8 nm 미만, 또는 약 7 nm 미만, 또는 약 6 nm 미만, 또는 약 5 nm 미만, 또는 약 4 nm 미만, 또는 약 3 nm 미만의 최대 단면 치수 (즉, 컨택의 단면에서의 컨택의 최대 치수) 를 가질 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 전극 및 제 2 전극은 소스 및/또는 드레인으로서 대안적으로 지칭될 수도 있고, 다양한 실시형태들에서, 소스 및/또는 드레인은 전극과는 별개의 구조적 컴포넌트를 포함할 수 있다.
제조하는 방법은 기판의 표면 상에서 제 1 전극 로케이션 및 제 2 전극 로케이션을 정의하기 위하여 리소그래피 방법들을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 제 1 전극 로케이션 및 제 2 전극 로케이션은 전극 제조의 완료 시에 그것들 사이에 정밀하게 정의된 전극 갭을 생성하기 위하여 정의될 수도 있다. 유사하게, 다양한 실시형태들에서, 제조하는 방법은 제 1 컨택 포지션 및 제 2 컨택 포지션을 정의하기 위하여 리소그래피 방법들을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 제 1 컨택 포지션 및 제 2 컨택 포지션은 컨택 제조의 완료 시에 그것들 사이에 정밀하게 정의된 컨택 갭을 생성하기 위하여 정의될 수도 있다. 마찬가지로, 컨택은 정의된 구조체로 구성될 수 있다. 바이오센서를 제조하기 위하여 이용될 수도 있는 다양한 방법들은 이하에서 더 상세하게 설명된다.
지금부터 도 8 을 참조하면, 전극들을 제조하기 위한 리소그래픽 방법 (800) 이 예시되어 있다. 다양한 실시형태들에서, 제조 방법은 실리콘 산화물 층 (881), 레지스트 층 (882) 이 오버레이 (overlay) 된 실리콘 기판 (880) 과 같은 마이크로칩 기판과 함께 시작할 수도 있다. 레지스트 층은 폴리(메틸 메타크릴레이트) [poly(methyl methacrylate)] 와 같은 임의의 적당한 레지스트 재료를 포함할 수 있다. 접착 촉진제 (adhesion promoter) 들이 또한, 본 개시물에 따라 제조 프로세스에서 이용될 수도 있다. 예시된 실시형태에서, 전자-빔 리소그래피는 레지스트 층을 노출하고 레지스트 층에서 제 1 전극 트랙 (883) 및 제 2 전극 트랙 (884) 을 정의하기 위하여 이용된다 (단계 (810)). 리소그래피 단계에 후속하여, 레지스트는 리소그래피 단계에서 정의된 구역들에서 레지스트를 제거하기 위하여 현상된다 (단계 (820)). 다음으로, 디포지션 단계 (단계 (830)) 는 기판 표면 상에서 제 1 전극 (802) 및 제 2 전극 (803) 을 형성하기 위하여 수행될 수도 있다. 예를 들어, 금속 스퍼터 코팅 (metal sputter coating) 을 포함하는 임의의 적당한 재료 및 디포지션 방법이 이용될 수도 있다. 마찬가지로, 전극과 기판 사이의 적당한 본딩 (bonding) 을 제공하기 위한 중간 부착 층의 적용과 같은 임의의 적당한 기판 표면 처리는 디포지션 단계를 수행하기 이전에 수행될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 제 1 및 제 2 전극들은 스퍼터링 증착 방법을 이용하여 금으로부터 제조된다. 디포지션 단계에 후속하여, 리프트-오프 (lift-off) 단계 (단계 (840)) 는 잔여 레지스트를 제거하여, 기판의 표면 상에서 배치된 제 1 전극 및 제 2 전극을 남기기 위하여 수행된다.
다양한 실시형태들에서, 방법 (800) 과 같은, 나노-전극들을 제조하기 위한 리소그래픽 방법은 고도로 정밀한 전극 구성들을 달성할 수 있다. 예를 들어, 전극들은 일관된 길이, 폭, 및 두께 사양들로 구성될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극은 약 20 nm 의 폭과 같은, 약 10 nm 내지 약 40 nm 사이의 폭을 가질 수 있다. 마찬가지로, 제 1 전극 및 제 2 전극에 의해 정의된 전극 갭은 정밀한 전극 갭 치수로 구성될 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극 갭 치수는 약 3 nm 내지 약 30 nm 사이일 수도 있다. 예를 들어, 다양한 실시형태들에 따른 센서에서의 한 쌍의 전극들에 대한 전극 갭은 약 3 nm 내지 약 30 nm 사이, 또는 약 4 nm 내지 약 25 nm 사이, 또는 약 5 nm 내지 약 20 nm 사이, 또는 약 6 nm 내지 약 17 nm 사이, 또는 약 7 nm 내지 약 15 nm 사이일 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 전극 갭은 약 3 nm, 약 4 nm, 약 5 nm, 약 6 nm, 약 7 nm, 약 8 nm, 약 9 nm, 약 10 nm, 약 11 nm, 약 12 nm, 약 13 nm, 약 14 nm, 또는 약 15 nm 의 치수로 제조될 수 있다. 통상의 기술자에게 분명한 바와 같이, 위에서 설명된 다양한 방법 단계들은 CMOS 제조 및/또는 다른 마이크로전자 제조 방법들을 이용한 센서 디바이스들의 상업적-스케일 생산을 따르는 프로세스에서 높은 밀도로 그리고 고도로 정밀한 물리적 사양들로 다수의 쌍들의 전극들을 병렬로 생산하기 위하여 이용될 수 있다.
이론에 의해 구속되도록 희망하지 않으면서, 위에서 설명된 바와 같은 전극 갭 치수를 갖는 전극 갭 (또는 센서 갭) 을 가지는 센서를 제공하는 것은 센서 성능 및/또는 제조에 대하여 다양한 장점들을 제공할 수도 있다. 예를 들어, 약 3 nm 미만인 치수를 가지는 전극 갭에 대하여, 용액 (즉, 샘플 환경) 및 벌크 (bulk) 를 통한 전류 전도의 가짜 소스들은 증가하기 시작하여, 추가된 노이즈를 생성할 것이다. 게다가, 이러한 갭들은 효소들과 같은 관심 있는 다양한 프로브 분자들을 수용하기 위하여 충분히 크지 않을 수도 있다. 또한, 이러한 갭들은 현재의 CMOS 제조 능력들과 양립가능하지 않다. 바이오폴리머들 또는 화학적으로 합성된 분자들을 이용하는 것에 의한 것과 같이, 약 30 nm 보다 더 큰 전극 갭들에 대한 원자적으로 정밀한 사양들을 갖는 브릿지 분자들을 제조하는 비용 및 복잡도는 상당히 상승하고, 다양한 브릿지 분자들 강성은 약 30 nm 를 초월하여 길이들과 함께 감소할 수도 있다. 마찬가지로, 많은 분자들의 전도성은 그 길이들을 초월하여 유용한 파라미터들 미만으로 상당히 하락하고, 더 큰 길이들은 또한, 높은 밀도의 어레이들에서의 센서들을 근접하게 포장하기 위한 능력을 제한한다. 이에 따라, 약 3 nm 내지 30 nm 의 범위에서의 전극 갭들을 갖는 센서들은 센서 디바이스의 기능, 제조가능성, 확장성, 및 경제성에 대하여 어떤 장점들을 제공할 수도 있다.
위에서 설명된 방법에 따라 제조된 센서 디바이스의 예는 각각 37-배, 5000-배, 및 50,000-배 배율에서의 센서 디바이스 (1000) 의 표면의 주사 전자 현미경사진들을 도시하는 도 11a 내지 도 11c 에서 예시되어 있다. 센서 디바이스 (1000) 는 20 개의 센서들을 위한 나노-전극들 및 나노-컨택들 뿐만 아니라, 외부 전류 계측기로의 접속을 위한 리드 (lead) 들 및 패드들을 포함한다. 기판의 표면 상에서 위치된 패드들 및 리드들은 도 11a 에서 명확하게 가시적이다. 센서 전극들은 도 11b 의 중심에서 더 밝은 수직 띠로서 보인다. 도 11c 에서, 제 1 전극들 (1102) 및 제 2 전극들 (1103) 은 제 1 및 제 2 전극들 사이에서 정의된 전극 갭 (1120) 과 함께, 명확하게 보일 수 있다.
다양한 실시형태들에서, 그리고 지금부터 도 9 를 참조하면, 바이오분자 감지 디바이스를 제조하는 방법은 컨택의 로케이션을 제조하고 및/또는 결정하기 위한 리소그래픽 방법 (900) 을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 제조 방법은 제 1 전극 (802) 및 제 2 전극 (803) 이 그 상에 배치되는 기판을 포함하는 마이크로칩과 함께 시작할 수도 있다. 마이크로칩은 실리콘 산화물 층 (881) 및 적당한 레지스트 층 (982) 이 오버레이된 실리콘 기판 (880) 을 포함할 수 있다. 예시된 실시형태에서, 전자-빔 리소그래피는 레지스트 층을 노출하고 레지스트 층에서 제 1 컨택 포지션 (985) 및 제 2 컨택 포지션 (986) 을 정의하기 위하여 이용된다 (단계 (910)). 다양한 실시형태들에서, 컨택의 로케이션은 전극 갭에 인접한 전극의 원위 단부 (distal end) 근처와 같이, 제 1 전극 및 제 2 전극 중의 하나를 오버레이하기 위하여 정의될 수도 있다. 컨택에 대하여 정의된 크기 및 패턴은 이하에서 설명된 바와 같이, 더 이후의 프로세스 단계들에서 형성된 컨택의 크기 및 형상을 결정하는 것에 기여할 수도 있다. 리소그래피 단계에 후속하여, 레지스트는 리소그래피 단계에서 정의된 컨택 포지션들에서 레지스트를 제거하기 위하여 현상된다 (단계 (920)). 다음으로, 디포지션 단계 (단계 (930)) 는 제 1 및 제 2 전극 표면들 상에서 제 1 컨택 (906) 및 제 2 컨택 (907) 을 형성하기 위하여 수행될 수도 있다. 전극들에 관하여, 임의의 적당한 재료 및 디포지션 방법이 이용될 수도 있다. 마찬가지로, 전극과 기판 사이의 적당한 본딩을 제공하기 위한 중간 부착 층의 적용과 같은 임의의 적당한 기판 표면 처리는 디포지션 단계를 수행하기 이전에 수행될 수도 있다. 컨택들은 전극들과는 상이한 재료를 포함할 수 있거나, 컨택들은 전극들을 제조하기 위하여 이용된 것과 동일한 재료를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 제 1 및 제 2 컨택들은 전기화학적 디포지션 방법을 이용하여 금으로부터 제조된다. 디포지션 단계에 후속하여, 리프트-오프 단계 (단계 (940)) 는 잔여 레지스트를 제거하여, 제 1 및 제 2 전극들의 표면들 상에서 배치된 제 1 컨택 및 제 2 컨택을 남기기 위하여 수행된다.
대안적으로, 다양한 실시형태들에서, 컨택을 제조하기 위한 방법은 사전형성된 컨택 나노입자들의 디포지션을 포함할 수 있다. 사전형성된 컨택 나노입자들은, 레지스트 층에서 형성되고, 컨택 나노입자를 받아들이고 그것을 컨택 포지션에서 위치시키도록 구성된 공극 (void) 내로 디포짓팅될 수 있거나, 컨택 나노입자들은 컨택 포지션에서의 부착을 달성하기 위하여 화학적 유도체화 층을 이용하여 디포짓팅될 수 있다.
도 10 에서 예시된 바와 같이, 사전형성된 컨택 입자를 레지스트 층에서 형성된 공극 내로 디포짓팅 (depositing) 하는 방법 (1000) 은 단계들 (910 및 920) 에 대한 방법 (900) 에 대하여 위에서 설명된 것과 동일한 단계들을 포함할 수 있다. 사전형성된 컨택 입자를 받아들이도록 구성된 공급의 생성에 후속하여, 복수의 사전형성된 컨택 입자들 (1087) 을 포함하는 용액은 디바이스와 컨택될 수 있고, 입자들은 압력, 혼합, 표면 장력 (surface tension), 부력 (buoyancy), 원심력 (centrifugal force), 또는 입자를 공극 내로 도입하기 위한 다른 방법들을 이용하여 공극들 내로 디포짓팅될 수 있다. 입자들의 디포지션에 후속하여, 잉여 용액 및 입자들은 제거될 수도 있다. 리프트-오프 단계는 단계 (940) 에 대하여 위에서 설명된 바와 같이, 잔여 레지스트를 제거하기 위하여 수행될 수 있고, 사전형성된 컨택 입자들은 강하게 부착된 제 1 및 제 2 컨택들 (1006, 1007) 을 형성하기 위하여 필요한 바와 같이 추후에 전극들에 대해 임의적으로 어닐링될 수 있다.
대안적으로, 화학적 유도체화 처리를 이용하여 사전형성된 컨택 나노입자들을 디포지션하는 방법은 도 9 에서 예시된 방법에 대하여 위에서 설명된 단계들 (910 및 920) 과 유사한 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 실리콘 기판 표면과 양립가능한 하나의 이러한 폭넓게 이용된 표면 유도체화는, 아미노실란 (aminosilane) 들 (예를 들어, APTES) 또는 메르캅토실란 (mercaptosilane) 들 (예를 들어, MPTES) 과 같은 분자들로 기판 표면을 코팅하는 것을 포함할 수 있는 실란화 (silanization) 이다. 이 분자들은 실리콘 표면에 부착되고, 그 다음으로, 그 노출된 단부들은 그것들을 표면에 바인딩하기 위하여 금 나노입자들과 같은 다른 재료들에 용이하게 교차-링크된다. 그 다음으로, 단계 (930) 와 유사한 단계에서는, 컨택 금속 또는 다른 재료를 디포지션하기보다는, 이러한 유도체화 처리가 적용될 수 있다. 단계 (940) 와 유사한 리프트-오프 단계가 수행된 후에, 제 1 전극 및 제 2 전극은 제 1 컨택 및 제 2 컨택의 부착을 위하여 의도된 로케이션들에서의 표면 유도체화를 포함할 것이다. 유도체화된 전극 표면들을 포함하는 디바이스는 복수의 사전형성된 컨택 입자들을 포함하는 용액과 컨택될 수 있다. 입자들은 유도체화된 전극 표면들에 대해 상보적이거나, 또는 그렇지 않을 경우에 구체적으로 유도체화된 전극 표면들에 바인딩되는 표면 또는 코팅을 가질 수도 있음으로써, 컨택 입자들을 정의된 컨택 포지션들로 국소화할 수도 있다. 유도체화 처리 및 임의의 입자 코팅은 필요한 바와 같이, 제거 단계에서 제거될 수도 있고, 사전형성된 컨택 입자들은 위에서 설명된 바와 같이 전극들에 대해 어닐링될 수도 있다. 이 접근법의 예는 금 나노입자를 구체적으로 바인딩하기 위한 APTES-코팅된 실리콘 표면의 이용이다.
다양한 실시형태들에서, 컨택 구조체들은 원자간력 현미경법 (atomic force microscopy; AFM) 의 이용에 의해, 또는 원하지 않는 비드 (bead) 들의 AFM 제거에 선행하는 잉여 비드들의 디포지션에 의해 전극들 상에서 금 나노입자 비드들을 위치시키는 것과 같은 다양한 직접적인 수단에 의해 생성될 수 있다.
다양한 다른 실시형태들에서, 컨택 구조체들 및/또는 전극 갭은 포커싱된 이온 빔 (focused ion beam; FIB) 밀링을 이용하는 것에 의한 것과 같은, 재료 제거를 통해 적소에서 형성될 수 있다. 예를 들어, 전극 갭은 FIB 를 이용하여 이전에 확립된 연속적인 금속 나노배선 (nanowire) 으로 조각될 수 있음으로써, 전극 갭을 형성하는 것과 동시에, 제 1 전극 및 제 2 전극을 생성할 수 있다.
센서 또는 센서들의 어레이의 전극들 및 컨택들의 제조에 후속하여, 센서 (들) 는 센서 (들) 로의 유체 용액의 제어된 도입을 허용하기 위하여 적당한 플로우 셀 또는 유사한 디바이스에서 봉입될 수도 있다. 플로우 셀에서 센서 칩을 봉입하는 것은 PDMS 또는 다른 폴리머 또는 플라스틱으로부터 플로우 셀을 금형함으로써, 그리고 칩을 둘러싸기 위하여 이것을 이용함으로써 전형적으로 행해져서, 제조된 전극들 및 컨택들이 브릿지 및 프로브 조립 뿐만 아니라 완성된 센서 (들) 를 이용하는 후속 어세이들을 위하여 적당하게 노출되게 된다. 다양한 실시형태들에서, 표면 패시베이션 처리 (surface passivation treatment) 는 액체 샘플들과의 컨택으로부터 발생할 수 있는 전기적 노이즈를 감소시키기 위하여 기판 표면 및 노출된 전극들의 부분들에 적용될 수도 있다. 패시베이션 처리는 미처리된 센서 갭의 구역에서 전극들 및/또는 컨택들을 남기기 위하여 적용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시형태들에서는, 센서 갭과 정렬된 30 nm 폭 구역이 미처리된 상태로 될 수도 있다. 패시베이션 처리는 플로우 셀로 센서 칩을 봉입하기 이전에 수행될 수도 있다. 다양한 실시형태들에 따른 센서는, 약 0.5 V 의 전압이 인가되고, 센서가 낮은 이온 강도 완충재 용액에서 침지되고, 그렇지 않을 경우에 효소, 예를 들어, DNA 폴리메라제 I 효소의 활성을 지원하기 위하여 적당할 때, 약 1 pA 미만, 또는 약 0.9 pA 미만, 또는 약 0.8 pA 미만, 또는 약 0.7 pA 미만, 또는 약 0.6 pA 미만, 또는 약 0.5 pA 미만, 또는 약 0.4 pA 미만, 또는 약 0.3 pA 미만, 또는 약 0.2 pA 미만의 전자적 노이즈를 가질 수 있다.
바이오폴리머 브릿지의 제조는 생체내 (in vivo) 합성 방법들, 생체내 효소 합성 방법들, 화학적 합성 방법들, 또는 그 임의의 조합을 포함하는, 바이오폴리머 분자들을 합성하기 위하여 이용될 수도 있는 다양한 방법들 중의 임의의 것에 의해 수행될 수 있다. 본 개시물에 따라 브릿지 분자로서의 이용을 위하여 적당한 바이오폴리머 분자들을 생성하기 위한 다양한 방법들은 통상의 기술자에게 잘 알려질 것이다. 마찬가지로, 본원에서 설명된 바와 같이 앵커 또는 링커 컴포넌트를 제공하기 위하여 바이오폴리머 브릿지 분자를 유도체화하거나 변형하기 위한 방법들은 마찬가지로 잘 알려져 있다. 본원에서 설명된 다양한 특정 바이오폴리머 브릿지 분자들은 예로서 제공되고, 본 개시물의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 하고, 합성 브릿지 분자들은 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따라 이용될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 프로브로의 바이오폴리머 브릿지 분자의 부착은 자기-조립 화학적 반응에 의해 수행될 수도 있다. 마찬가지로, 전극들 또는 컨택들로의 바이오폴리머 브릿지 분자의 부착은 또한, 자기-조립 화학적 반응에 의해 수행될 수도 있다. 이러한 자기-조립 반응들은 부착되어야 할 2 개의 컴포넌트들을 컴포넌트들 중의 적어도 하나를 포함하는 용액을 통해 서로 컨택하도록 함으로써 수행될 수도 있다. 다양한 실시형태들에서, 프로브로의 바이오폴리머 브릿지의 부착은 전극들 또는 컨택들로의 브릿지의 컨택 전, 후, 또는 컨택과 동시에 수행될 수 있다. 유사한 고려사항들은 합성 화학에 의해 생성된 브릿지 분자에 적용한다.
다양한 실시형태들에서, 센서 디바이스를 만드는 방법은 바이오폴리머 브릿지 분자를 제 1 전극 및 제 2 전극에 조립하는 것을 포함한다. 브릿지 분자 조립 단계는 자기-조립 단계를 포함할 수 있다. 자기-조립은 제 1 및 제 2 전극을 포함하는 부분적으로 구성된 센서 디바이스를, 브릿지 분자를 포함하는 용액과 컨택함으로써 수행될 수 있다. 브릿지 분자는 브릿지 분자의 제 1 단부 및 제 2 단부와, 제 1 전극 및 제 2 전극 사이의 친화도에 기초하여 제 1 전극 및 제 2 전극에 자기-조립할 수 있다. 다양한 실시형태들에서, 센서 컴포넌트들의 자기-조립은 예 2 에서 이하에서 설명된 바와 같이, 그리고 도 13 내지 도 15 를 참조하여, 센서 디바이스에 의해 전자적으로 모니터링될 수 있다. 전자적 모니터링은 품질 제어 기능을 제공할 수 있고, 적당하게 조립되는 디바이스에서 센서들을 식별하기 위하여 역할을 할 수 있다. 미리 결정된 파라미터들 내에서 조립 프로세스 신호들을 제공하지 않는 센서들 회로들로부터의 신호는 디바이스로 수행된 시퀀싱 분석들과 같은 다운스트림 분석들에서 무시될 수도 있다.
예 1
바이오폴리머 브릿지 자기-조립
약 20 nm 의 단부-대-단부 길이를 갖는 이중-가닥형 DNA 바이오폴리머 브릿지 분자는 5'-티올 변형을 포함하는 SEQ ID NO: 1 에서 기재된 올리고, 및 5'-티올 변형 및 내부 바이오틴 변형을 포함하는 SEQ ID NO.: 2 에서 기재된 올리고를 이용하여 구성되었다. 브릿지 분자들은 스트렙타비딘-금 태그를 이용하여 시각화 목적들을 위하여 라벨링되었다. 금 나노입자 컨택들의 테스트 어레이 (1200) (도 12) 는 금 컨택들의 쌍들을 디포짓팅하기 위하여 전자-빔 리소그래피 기법들을 이용하여 제조되었고, 컨택들의 각각의 쌍은 중심-대-중심으로, 약 20 nm 의 컨택 갭을 정의한다. 금-라벨링된 브릿지 분자들을 포함하는 완충된 용액은 금 나노입자 컨택들의 테스트 어레이와 컨택하게 되었다. 잠시의 배양 주기에 후속하여, 잉여 용액은 제거되었고, 어레이는 워시되었고, 주사 전자 현미경법 (scanning electron microscopy; SEM) 에 의해 촬상되었다. 금 컨택들 (1270) 및 금 태그들 (1271) 의 배열을 도시하는 SEM 이미지는 도 12 에서 예시되어 있다. (화살표들로 표시된) 몇몇 컨택 쌍들에 대하여, 금 태그 (1271) 는 컨택 쌍 사이에서 배치된 것으로 보일 수 있어서, 이는 컨택들의 쌍으로의 바이오분자 브릿지 분자의 성공적인 자기-조립을 표시할 수 있다.
예 2
자기-조립 단계들의 검출
중심-대-중심으로, 약 20 nm 의 컨택 갭을 갖는 전극들에 부착된 금 컨택들을 포함하는 단일 센서를 갖는 센서 디바이스는 전자-빔 리소그래피 기법들을 이용하여 제조되었다. 센서는 플로우 셀 내부의 제 1 단부로의 액체의 도입, 및 플로우 셀의 제 2 단부로부터의 액체의 변위를 허용하기 위하여 어느 하나의 단부 상에서 개방되었던 1 mm 폭 대 0.4 mm 높이의 채널을 포함하는 PDMS 플로우 셀과, 센서와 컨택하는 셀 용액으로 봉입되었다. 플로우 셀 채널은 센서를 포함하는 전극들의 방향에 대해 직교적으로 배향되었고, 센서는 플로우 셀 채널의 길이의 대략 중간에 위치된다. 낮은 이온 강도 완충재 용액은 플로우 셀로 도입되었고, 0.5 V 전위는 (예 1 에 대하여 위에서 설명된 바와 같은, 그러나 금 태그 없는) 이중-가닥형 DNA 브릿지 분자의 도입 및 자기-조립 (도 13), 스트렙타비딘-태그된 클레노브 (Klenow) 프래그먼트의 도입 및 바인딩 (도 14), 50 염기 프라이밍된 (primed) 단일-가닥형 DNA 분자의 도입 및 바인딩 (도 15), 및 클레노브 프래그먼트에 의한 템플릿-기반 합성을 개시하기 위한 dNTP 믹스의 도입 (도 16) 의 추후의 직렬 단계들의 전반에 걸쳐 센서에 인가되었다. DNA 템플릿 분자의 시퀀스는 폴리-A 영역을 특징으로 하는 다음의 올리고 시퀀스를 포함하고:
5'- cgc cgc gga gcc aag aaa aaa aaa aaa aaa aaa aa ttgcatgtcctgtga-3'
그리고 이용된 프라이머 (primer) 는:
3'- aac gta cag gac act-5' 이었다.
게다가, 폴리-C, G, 및 T 트랙트 (tract) 들에 의해 대체된 폴리-A 트랙트를 갖는 유사한 시퀀스들은 상이한 템플릿 염기들의 효과를 조사하기 위하여 이용되었다.
도 13 에서 예시된 바와 같이, 측정된 전류는 3/2 주기 상에서 상승한다. 신호 트레이스에서의 2 개의 굴절들 포인트들 (A 및 B) 은 제 1 및 제 2 컨택으로의 5'-티올-변형된 말단 염기 앵커들의 바인딩에 대응하는 것으로 생각된다. 스트렙타비딘-태그된 클레노브 프래그먼트를 포함하는 용액의 도입 (도 14) 을 따르는 신호 트레이스는 바이오폴리머 브릿지의 바이오틴 링커 컴포넌트를 컨택하고 바인딩하는 클레노브 프래그먼트 효소의 스트렙타비딘 링커 컴포넌트에 대응할 가능성이 있는 약 1.5 s 에서의 전류에 있어서의 예리한 증가를 나타낸다. 도 15 에서, 예리한 신호 피크는 플로우 셀로의 템플릿 가닥의 도입을 따르는 신호 트레이스에서 존재하고, 피크는 클레노브 프래그먼트에 의해 템플릿 바인딩에 대응하도록 해석된다. 도 16 에서 예시된, DNA 염기들에 대한 전부를 포함하는 dNTP 믹스의 도입을 따르는 측정된 신호 트레이스는 약 1 s 에서 별개의 신호 피처를 마찬가지로 나타낸다. 이것은 폴리메라제 효소로부터의 합성된 듀플렉스의 해리 (dissociation) 를 나타낼 수도 있고, 약 0.7 s 로부터 약 0.95 s 까지의 신호 트레이스는 바인딩된 템플릿 DNA 에 기초한 뉴클레오티드 통합에 응답하여 센서에 의해 생성된 키네틱 시그니처 (kinetic signature) 에 대응할 수도 있다.
예 3
뉴클레오티드 염기 통합들의 검출
바이오폴리머 브릿지 분자 및 클레노브 프래그먼트 프로브를 포함하는 센서 디바이스는 예 2 에서 위에서 설명된 바와 같이 제조되었고 조립되었다. 센서 디바이스는 다양한 길이들 및 시퀀스 조성들의 단일-가닥형 DNA 템플릿들을 이용하여 수행된 DNA 합성 반응들에 응답하여 신호 트레이스들을 생성하기 위하여 이용되었다. 도 17 은 단일 염기의 통합을 제공하는 템플릿 시퀀스에 대한 신호 트레이스를 예시한다. 0.5 s 에서의 신호 피처는 클레노브 프래그먼트 및 염기 통합의 템플릿-종속적 활성에 대응하도록 해석되고, 0.6 s 바로 후의 훨씬 더 약한 신호 피처들은 시스템에서의 노이즈 또는 가짜 신호의 일부 형태에 대응하도록 해석된다. 도 18 은 다양한 템플릿 트랙트들에 대한 신호 트레이스들을 예시한다. 예 2 에서 위에서 설명된 템플릿 및 프라이머는 예시된 반응들에 대하여 이용되었다.
상부 및 하부 신호 트레이스들은 dNTP 들을 갖지 않는 완충재가 센서로 도입되는 제어 실험들이다. (상부부터 하부까지) 제 2, 제 3, 및 제 4 신호 트레이스들은 (템플릿의 20 A 염기들에 의해 지도된 20 개의 통합 이벤트들로 귀착되도록 예상된) dTTP 를 용액으로 도입하는 것, 그 다음으로, (템플릿에서의 GAA 트리플렛 (triplet), 3' 내지 5' 에 의해 지도된 또 다른 3 개의 통합들을 허용하도록 예상된) dCTP 의 추가, 그 다음으로, 생성된 신호들이 20, 3, 및 12 통합 이벤트들로부터 발생하도록 (템플릿의 지도된 잔여 12 염기들로서 폴리머화하도록 예상된) dNTP 의 추가에 응답하여 생성되었다. 각각의 신호 트레이스에 대한 화살표들 사이에서 위치된 신호 피처들을 포함하는 신호 트레이스는 템플릿-종속적 효소 활성으로 인한 신호 조절에 대응하도록 해석된다. 이 교란된 신호 영역들의 상대적인 기간들은 20:3:12 의 예상된 비율이고, 제 3 의 이러한 트랙트는 12 개의 개별 통합 이벤트들에 대응할 수도 있는 명확한 스파이크를 디스플레이한다. 도 7 은 12 개의 언페어링된 (unpaired) 템플릿 염기들과의, 위에서 설명된 디바이스 및 위에서 설명된 템플릿을 이용하여 수행된 DNA 합성 반응에 의해 생성된 신호 트레이스의 추가적인 예를 예시한다. 이 결과들은 다양한 실시형태들에 따른 센서가 템플릿-종속적인 DNA 폴리메라제 프로브 활성에 응답하여 신호 피처들을 포함하는 신호 트레이스를 생성할 수 있다는 것을 입증한다. 이것은 또한, 신호를 명확하게 함에 있어서의 노이즈 제거의 값을 입증하고: 도 7 에서의 상부 패널은 원시 측정된 신호이고, 하부 패널은 노이즈를 제거하기 위한 신호 프로세싱을 거쳤고, 이 경우, 특정 60 Hz 라인 노이즈는 대역통과 필터로 제거되었다.
예 4
메틸화된 템플릿 염기들의 검출
바이오폴리머 브릿지 분자 및 클레노브 프래그먼트 프로브를 포함하는 센서 디바이스는 예 2 에서 위에서 설명된 바와 같이 제조되었고 조립되었다. 센서 디바이스는 양자의 시토신 및 5-메틸시토신 변형된 뉴틀레오티드들을 포함하는 단일-가닥형 DNA 템플릿을 이용하여 수행된 DNA 합성에 응답하여 신호 트레이스들을 생성하기 위하여 이용되었다. 템플릿 시퀀스는 시퀀스 5'-13x(N)-5x(GmC)-5x(GC)-G-3' (즉, 5'-NNN NNN NNN NNN NGmC GmCG mCGmC GmCG CGC GCG CGC G-3' (SEQ ID NO: 12), 여기서, N 은 임의의 표준 뉴클레오티드이고, 여기서, mC 는 5-메틸시토신임)) 를 가지는 언페어링된 염기 뉴클레오티드들을 포함하였다. 이 템플릿 시퀀스는 시퀀스 5'-C-5x(GC)-5x(GC)-13x(N)-3' (즉, 5'-CGC GCG CGC GCG CGC GCG CGC NNN NNN NNN NNN N-3' (SEQ ID NO: 13)) 를 가지는 상보적인 합성된 가닥을 생성하도록 설계되었고, 밑줄표시된 구아노신 (guanosine) 염기들은 템플릿 가닥에서의 5-메틸시토신 변형된 뉴클레오티드들의 위치들에 대응한다. 0.5 V 는 센서에 인가되었고, 전류는 순차적인 도입들과, 물, 완충재, dCTP 의 완충된 용액, dGTP 의 완충된 용액, 및 모두 4 개의 dNTP 염기들의 믹스를 갖는 완충된 용액과의 배양들의 과정을 통해 측정되었다. 이것의 예상된 결과는 단일 dCTP 통합 이벤트, 그 다음으로, 20 개의 dGTP 및 dCTP 통합 이벤트들일 것이고, 그것의 첫 번째 10 개는 비변형된 시토신 염기들에 대한 것이고, 후자의 10 개는 5-메틸시토신 변형된 뉴클레오티드들에 대한 것이다. 메틸화의 검출은 이 20 개의 이벤트들 중의 두 번째 10 개에서의 신호의 상이한 특성으로서 나타날 것이다.
각각의 시약과의 배양 동안에 생성된 신호 트레이스들이 도 19 에서 예시되어 있다. 물 및 완충재와의 배양은 변동을 거의 갖지 않는 매우 낮은 기준선 전류를 생성하였다. dCTP 를 포함하는 용액의 추가는 템플릿 리드 염기 G 에 대한 dCTP 의 단일 염기 통합에 대응하는 예리한 시퀀스 피처를 생성하였다. 양자의 dCTP 및 dGTP 를 포함하는 용액을 생성하는 dGTP 의 추가는 비변형된 뉴클레오티드들에 대응하는 10 개의 염기 통합들을 통한 합성과, 그 다음으로, 템플릿 가닥에서의 5-메틸시토신 염기들에 대응하는 10 개의 염기 통합들을 통한 합성을 허용하였다. 이 배양 주기에서 생성된 신호 트레이스는 약 0.35 s 로부터 약 0.5 s 까지의 더 높은 전류를 갖는 신호 피처들과, 그 다음으로, 약 0.5 s 로부터 약 0.65 s 까지의 더 낮은 전류를 갖는 신호 피처들을 도시한다. 신호 진폭에서의 이 시프트는 폴리메라제 및 결과적인 신호 조절에 대한 템플릿 시퀀스의 메틸화 스테이터스의 효과에 응답하여 센서 신호에서의 별개의 변화로서 해석된다. 이 증거는 시퀀싱 반응 동안에 타겟 시퀀스에서의 변형된 뉴클레오티드들의 존재를 직접적으로 구별하기 위하여 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른 센서의 능력을 지원한다.
예 5
긴 DNA 가닥 판독들 상에서의 신호의 검출
바이오폴리머 브릿지 분자 및 클레노브 프래그먼트 프로브를 포함하는 센서 디바이스는 예 2 에서 위에서 설명된 바와 같이 제조되었고 조립되었다. 센서 디바이스는 phi X 174 박테리오파지 (bacteriophage) 의 게놈 (genome) 으로부터 유도된 대략 5400 bp 템플릿 시퀀스를 포함하는 단일-가닥형 DNA 템플릿을 이용하여 수행된 DNA 합성에 응답하여 신호 트레이스들을 생성하기 위하여 이용되었다. dNTP 믹스는 실험적인 시퀀싱 반응에서 제공된 반면, ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate; 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트) 믹스는 제어 반응을 위하여 제공되었다. ddNTP 믹스는 이러한 디데옥시 완결부 (terminator) 의 하나의 통합 후에 폴리머화 프로세스를 종결시키고, 이에 따라, 필수적으로, 감지 신호를 시퀀싱하는 것이 발생하지 않아야 한다. 데이터는 개별적인 통합 스파이크들을 관찰하기에는 너무 개략적인 20 ms 시간 샘플링 분해능에서 취득되었지만, 대략 초 당 20 개의 염기들의 예상된 효소 레이트에서 전체 폴리머화 프로세스를 관찰하기 위하여 충분히 긴, 300 초를 초과하는 타이머 주기에 대한 데이터 수집을 허용하였다.
도 20 은 ddNTP 믹스를 이용한 제어 반응에 대한 것 (하부 트레이스) 과 비교하여, dNTP 믹스와의 실험적인 반응에 의해 생성된 신호 트레이스 (상부 신호 트레이스) 를 예시한다. 실험적인 시퀀싱 런 (sequencing run) 에 대한 신호 트레이스는 제어 반응에서 결여되는 다수의 별개의 총 신호 피처들 (화살표들로 언급됨) 을 포함하였고, 또한, 제어 반응보다 더 높은 전류를 생성하였다. 도시된 100 초 주기에 대하여 생성되었던 신호 트레이스는, 본 개시물의 다양한 실시형태들에 따른 센서가 긴 템플릿 시퀀스에 대한 확장된 시퀀싱 런의 과정 동안에 DNA 폴리메라제 프로브의 템플릿-기반 뉴클레오티드 통합 활성에 응답하여 검출가능한 신호를 생성하기 위하여 적당할 수도 있다는 것을 제안한다. 이에 따라, 이러한 센서가 프로세싱할 수 있는 길이 또는 템플릿에 대한 즉각적인 제한이 없다.
예 6
분자
브릿지
자기-조립
이 예는 분자 전자 회로를 위한 분자 브릿지 컴포넌트를 제조하는 새로운 방법들을 교시한다. 브릿지 분자를 나노-스케일 전기 회로에 삽입하는 것은 분자 일렉트로닉스 분야에서 흔한 제조 시도이다. 통상적으로, 분자 엘리먼트는 도 22 에서 도시된 바와 같이 2 개의 전극들 사이에서 접속된다. 분자 일렉트로닉스에서 흔한 문제는 예시된 바와 같이 주어진 분자 회로 엘리먼트를 전극들 사이에서 조립하는 것이다. 최종 디바이스는 브릿지를 형성하는 분자와 전극들 사이의 양호한 기계적 및 양호한 전기적 접속 양자를 필요로 한다. 임의의 수동적 조립을 비실용적이게 하는 나노-스케일 사이즈 및 다수의 전극 쌍들 때문에 디바이스는 이 브릿징된 구성 내로 자기-조립되는 것이 또한 바람직하다.
이 예의 목적은 분자 일렉트로닉스 애플리케이션들을 위한 분자 브릿지 구조들을 제공하는 것이다. 이들은 다양한 일렉트로닉스 사용들을 위해 제공하는 전극들에 걸친 정밀한 자기-조립 회로 엘리먼트들이다. 이것은 물질의 특정 조성물들, 이들을 확립하기 위한 제조, 및 이들 구조들의 품질을 보증하는 것에 관련된 방법들을 포함한다. 이것은 이러한 브릿지 분자 시스템들의 특정 선호되는 실시형태들을 포함한다.
이 예는 어떤 부류의 회로들을 확립하기 위한 특정 시스템, 및 그것의 특정 선호되는 실시형태들을 교시한다. 이것을 해결하기 위한 선호되는 방법은 고도로 국지화된, 정밀하게 포지셔닝된, 재료 입자 또는 패치를 도입하는 것이고, 이는 본 명세서에서, 자기-조립 안내의 필요성들의 일부 또는 전부에 봉사하는 나노 "컨택 포인트 (contact point)" 로서 지칭되고, 기계적 및 전기적 접속을 제공한다. 이들 목적을 위한 이러한 컨택 포인트의 사용은 도 23 에서 예시된다. 이 목적을 위해, 컨택 포인트는, (i) 타겟 분자 상의 접합 기를 선택적으로 바인딩하고; (ii) 고도로 공간적으로 국지화되며; (iii) 원하는 포지션에 정확하게 위치되고; 그리고 (iv) 기판에 제자리에 바인딩되는, 적합한 재료로 이루어진다. 도 23 에서 예시된 바와 같이, 컨택 포인트 "A" 는 정밀한 자기-조립을 안내하고 전기적 또는 기계적 접속을 제공할 수 있는 공간적으로 국지화된, 정밀하게 포지셔닝된 재료 엘리먼트이다. 컨택 포인트 "A" 를 전극에 추가하고 그 다음에 분자 엘리먼트를 부착하는 기본 단계들이 도 23 에서 좌측에서 도시된다. 종국적 결과는 도 23 의 우측에서 도시된 소망된 회로이다. 엘리먼트 "B" 는 컨택 포인트 "A" 에 선택적으로 바인딩될 수 있는 브릿지 분자 상의 접합 기이다.
이를 위해 요구되는 컨택 포인트-브릿지 분자 시스템의 주요 특성들은: (1) 컨택 포인트는 고도로 공간적으로 국지화된다 ("작다" 또는 "점같다"); (2) 컨택 포인트는 정밀하게 사전-정의된, 특정된 로케이션이다; (3) 컨택 포인트는 그것의 기능적 역할을 지원하기 위해 맞는 재료 구성으로 이루어진다; 및 (4) 브릿지 분자는 컨택 포인트를 특정적으로 바인딩하는 양 단부들 상의 접합 기로 구성된다.
동일한 특성들은 직접적으로 또는 간접적으로 중 어느 일방으로 지지 비계로서 다양한 나노-전기-기계적 디바이스들의 지도된 조립에서 역할을 수행하는 것과 같이, 여기서 나타낸 회로 구성의 단지 예시보다 더 넓은 유용성을 갖는다.
이러한 컨택 포인트/브릿지 분자 시스템은, 내부 컨택을 추가로 가질 수도 있고, 여기서, 후속 분자들이 부착되어 현장에서 수행되는 경우에 가장 효율적인 일련의 조립 단계들을 통해 보다 복잡한 분자 구성들을 형성할 수 있다. 전극들 상의 컨택 포인트들에 의해 지도된 그리고 브릿지 분자 내부의 이러한 일련의 조립 단계들이 도 24 에서 도시된다. 도 24 에서 도시된 바와 같이, 일련의 조립 단계들에서, 프라이머리 브릿지 분자에 대해 공액 바인딩 사이트 "E" 를 갖는 추가적인 분자 컴포넌트들 "D" 에서 특정적으로 바인딩하기 위해 추가적인 컨택 기 "C" 가 사용된다. 특히, 현장에서 수행될 때, 조립의 이들 단계들은, 적절한 조립이 달성된 때/경우를 아는 수단을 제공하기 위해, 기저 회로로 전자적으로 모니터링될 수 있다. 디바이스 내부의 전류를 통한 이 조립 모니터링은 도 25 에서 도시된다. 도 25 는 전류에서의 스파이크들이 어떻게 센서 디바이스의 자기-조립에서의 각 단계들에 관련되는지를 예시한다. 조립을 모니터링하는 능력은 기저 회로의 전류 감지 특성들과 결합되어 현장 조립 프로세스의 이점이다. 일반적으로, 본 예는: 주어진 전극들에 대해, (i) 나노-컨택 포인트들이 전극들 상에서 확립되고; (ii) 공액 특정 바인딩 그룹들이 컨택 포인트들 사이의 갭에 걸칠 수 있는 브릿지 분자의 2 개의 포인트들에서 제공되며; (iii) 공액 특정 바인딩 그룹을 갖는 브릿지 분자에서 내부 바인딩 그룹이 식별되고; (iv) 브릿지에 부착될 다른 분자 엘리먼트들이 접합부에 특정적으로 부착되었고; (v) 프라이머리 브릿지 바인딩 및 세컨더리 분자 바인딩을 포함하는, 일련의 바인딩 이벤트들이 전극들 상에서 현장에서 수행되고; 그리고 (vi) 인가된 전압 하에서 회로에서 내부 전류를 따르게 함으로써 바인딩 이벤트들이 완료에 대해 모니터링되는, 시스템을 제공한다.
특히, 컨택 포인트들은, 재료-특정적 바인딩이 자기-조립을 지도 (direct) 하기 위해 사용될 수 있도록, 제 2 재료를 포함하는 전극 상에서의 나노-제조의 임의의 수단에 의해 디포짓팅된, 제 1 재료의 비드들일 수도 있다. 여기서, 비유사한 재료들은 예를 들어 "재료 1" 및 "재료 2" 로서 지칭될 수도 있다.
특히, 비드들은 금속성일 수도 있고, 선호되는 실시형태들에서, 비드들은 금이다. 이 경우에, 브릿지 분자 상의 그룹은 티올 치환기 (-SH), 또는 (예컨대, 활성화, 디설피드의 분할을 통해, 또는 일시적으로) 자유 티올기로 환원될 수 있는 설피드기를 포함하는 임의의 그룹일 수 있고, 이는 그 다음에 특정, 잘 알려진 티올-금 결합에 관여할 것이다.
또한, 금, 및 금속들 및 반도체 재료들을 포함하는 다른 재료들에 결합하는 잘 알려진 짧은 펩티드들이 존재한다. 컨택 비드 재료 1 에 대해 이러한 펩티드가 주어지면, 브릿지는 컨택 포인트들에 걸칠 수 있는 2 개의 구분되는 "단부" 사이트들에서 2 개의 이러한 펩티드 도메인들을 보유하는 임의의 단백질일 수 있다. 펩티드-재료 바인딩은 그 다음에 특정 컨택 포인트 바인딩을 제공할 수 있다. 특히, 브릿지 분자가 조작된 단백질인 경우에, 그것은, 바람직하게는 펩티드를 외부 바인딩을 위해 보다 이용가능하게 만드는 링커 그룹들로, 이들 펩티드들을 선형 시퀀스 내로 조작할 수 있다. 선호되는 링커 그룹들은 GS 또는 GGGS 와 같은 글리신 및 세린 리치 펩티드 링커들이다. 이러한 펩티드들은 다중-체인 단백질을 형성하기 위해 조립될 수도 있는 다중 체인들 상에서, 또는 단백질 브릿지를 형성하는 단일 체인 상에서 2 개의 사이트들 내로 조작될 수 있다.
하나의 선호되는 실시형태는 특정 시스템으로 이루어지고, 여기서, 금 비드는 전극 재료 2 와는 상이한 컨택 재료 1 로서 확립된다. 그 금은 스페이서 및 링커를 추가로 포함하고 특정 면역글로빈-G (IgG) 항체, 또는 적어도 2 개의 동일하게 바인딩하는 아암들을 갖는 임의의 다른 항체가 존재하는 펩티드 항원으로 종단되는, 시스테인-종단된 펩티드를 갖는 유도체이다. 시스테인은 티올 링키지에 의해 금에 특정적으로 바인딩될 것이다. 그 다음에, 펩티드 항원에 대한 특정 항체는 금 비드 컨택들 사이에 브릿지를 형성하기 위해 바인딩될 수 있다. 더욱이, 이 시스템에서, 효소들과 같이 임의의 다른 단백질들에 교차링크되는 안티-IgG 항체들은 추가적인 분자 컴포넌트를 특정적으로 바인딩하는 역할을 수행할 수 있다. 특정 선호되는 실시형태에 대해, 유도 펩티드는 GS-리치 플렉시블 링커 다음에 "FLAG-태그 (FLAG-tag)" 항원 펩티드 (DYKDDDDK) 를 갖는 CALNN 펩티드, 예를 들어 CALNNGSGSDYKDDDDK 로 이루어질 수 있다. 이 펩티드는 상업적으로 이용가능한 잘 확립된 안티-FLAG IgG 항체들을 가지고, 이는, 이 특정 상황에서, 이들 금-펩티드 컨택 포인트들에 대해 자기-조립할 분자 브릿지를 형성한다. 예를 들어, 이것이 쥐 안티-FLAG 항체인 경우에, 염소-안티-쥐 IgG 와 같은 안티-쥐 IgG 는 브릿지를 특정적으로 바인딩할 것이고, 브릿지에 결합되도록 소망되는 임의의 다른 단백질에 교차결합될 수 있다.
다른 선호되는 실시형태는, 컨택 포인트 재료가 각 전극의 단부에서 나노제조에 의해 확립된 금 비드를 포함하고, 브릿지 분자는, 양쪽 단부에 하나 또는 2 개의 티올기들이 존재하도록, 각 단일 가닥의 5' 및/또는 3' 단부들에서 변형된 뉴클레오티드들 (티올화된 뉴클레오티드들) 로서 통합된 티올-기들을 갖는, 이중 가닥형 DNA (sdDNA) 분자를 포함한다. 추가적인 티올화된 뉴클레오티드들은 보다 많은 티올-금 링키지들을 제공하기 위해 dsDNA 의 단부들 부근에 있을 수 있을 것이다. 이것은 바람직하게는 브릿지 분자 프레임워크에서 자기-조립한다. 또한, 단일의 바이오틴부착된 뉴클레오티드는, 바람직하게는 하나의 가닥의 중간 염기에서, dsDNA 의 내부에 특정적으로 통합될 수 있다. 이것은 (태생의 또는 변경된) 스트렙타비딘 분자에 대한 특정 링키지 사이트를 제공한다. 스트렙타비딘은 이 시스템의 세컨더리 결합 분자를 형성하기 위해 효소와 같은 임의의 다른 소망되는 단백질에 교차결합될 수 있다.
다른 선호되는 실시형태는, 컨택 포인트 재료가 각 전극의 단부에서 나노제조에 의해 확립된 금 비드를 포함하고, 브릿지 분자는 아미노 및 카르복실 말단들에서/부근에서 시스테인 아미노산들을 가져서, 이들이 금 컨택 포인트들에 대한 특정 티올-금 링키지들을 형성할 수 있도록 하는 것이다. 이것은 바람직하게는 브릿지 분자 프레임워크에서 자기-조립할 것이다. 또한, 단일의 바이오틴부착된 아미노산은, 바람직하게는 하나의 가닥의 중간 염기에서, 내부 알파-나선 내로 특정적으로 통합될 수 있다. 이것은 (태생의 또는 변경된) 스트렙타비딘 분자에 대한 특정 링키지 사이트를 제공한다. 스트렙타비딘은 이 시스템의 세컨더리 결합 분자를 형성하기 위해 효소와 같은 임의의 다른 소망되는 단백질에 교차결합될 수 있다.
다른 선호되는 실시형태는 브릿지 분자로서 IgG 항체에 기초하는 것이다. 이러한 항체는 항원에 반하여 일으켜질 수 있고, 항원을 포함하는 컨택 포인트를 생성하는 임의의 수단은 연관된 IgG 항체로 하여금 IgG 상에서 2 개의 Fab 아암들의 특정 항원-항체 바인딩을 이용하여 2 개의 컨택 포인트들을 특정적으로 바인딩하도록 허용할 것이다. 더욱이, 이 시스템에서, 효소들과 같이 임의의 다른 단백질들에 교차 결합되는 안티-IgG 항체들은 추가적인 분자 컴포넌트를 특정적으로 바인딩하는 역할을 수행할 수 있다.
IgG 시스템의 추가적인 선호되는 실시형태에서, 항체들은 금 나노입자들에 반하여 일으켜지고, 바람직하게는 쥐 또는 토끼와 같은 숙주 동물들 내로 주입될 것이다. 이러한 동물들에 의해 생성된 항체들은, 재료 1 컨택이 백신접종을 위해 사용되는 금 나노입자들과 충분히 유사한 금 비드인 경우에, 다양한 형태들의 금 입자 바인딩 특이성을 가질 수 있고, 따라서 상기 IgG 컴포넌트의 역할을 수행할 수 있다. 이러한 항체들의 특이성은 재료 특정적 (금), 및 백신접종 나노입자의 근사 사이즈에 대해 잠재적으로 사이즈 특이성을 가질 수 있다.
이 IgG 시스템의 추가적인 선호되는 실시형태에서, 3 내지 10 nm 사이즈의 범위 (직경) 에서의 금 나노입자가 백신접종에서 사용될 것이고, 별개의 제조 프로세스가 전극들 상에 비교가능한 사이즈의 금 비드 컨택 포인트들을 확립할 것이다.
이 IgG 시스템의 추가적인 선호되는 실시형태에서, 3 내지 10 nm 사이즈의 범위 (직경) 에서의 금 나노입자가 백신접종에서 사용될 것이고, 동물들은, 금 입자들의 사이즈 범위, 또는 일반적으로 금 입자들 중 어느 일방에 대해 특정 친화도를 갖는 특정 IgG 소스들을 식별하도록, 금 나노입자들의 사이즈들의 범위에 대한 그들의 바인딩 응답에 대해 그들의 혈청 및/또는 분리된, 정제된 IgG (예컨대, ELISA 어세이를 통한) 를 테스트함으로써, 선택된다. 이들 IgG 는 그 다음에, 연관된 금 컨택 포인트들 (사이즈 범위 특정적, 또는 일반적으로 금 비드) 에 대해 브릿지 분자 시스템들을 형성한다.
이 IgG 시스템의 추가적인 선호되는 실시형태에서, 컨택-특정적 바인딩을 갖는 바람직한 IgG 를 생성하는 것으로서 식별된 동물들은 그 다음에 단일 클론의 항체들을 생성하기 위해 하이브리도마 융합 프로세스를 겪는다. 패널로부터의 항체들은 그 다음에, 바람직한 모노클로날들을 선택하기 위해 그들의 IgG 바인딩 특성들에 대해 스크리닝된다. 이들은 그러면 분자 브릿지 시스템에 대해 IgG 에 대한 선호되는 소스이다. 이것은 정밀 분자에 무한하게 대량 생성될 수 있는 특정 특성들을 제공한다.
IgG 시스템을 확립하기 위한 이러한 접근법의 대안적인 선호되는 실시형태에서, 컨택-특정적 바인딩을 갖는 바람직한 IgG 를 생성하는 것으로서 식별된 동물들은 그 다음에, 기저 IgG 가변 도메인들에 대해 후보 DNA 시퀀스들을 식별하기 위해 B-셀 수용체 딥 시퀀싱을 겪고, 바람직한 수용체 시퀀스들은 클로닝되고 표현되며, 바람직한 IgG 항체들의 특정 단일 클론의 형태들을 획득하기 위해 그들의 금 입자 바인딩 활성도에 대해 재-테스트된다.
이 IgG 시스템의 추가적인 바람직한 실시형태에서, IgG 분자들은 바인딩 포켓들의 가변 도메인들에서 재료 바인딩 펩티드들을 갖는 시작 템플릿으로부터 직접적으로 조작된다. 이것은 특정 티올-금 링키지를 갖는 시스테인 아미노산의 수반을 포함할 수 있을 것이고, 바람직하게는 이용가능성을 강화하기 위해 적합한 GS-리치 링커를 갖는, 표준의 또는 신규한 금 바인딩 펩티드를 포함할 수 있을 것이다. 완전히 조작된 IgG 는 금 비드 컨택들을 갖는 분자 브릿지 시스템을 형성할 것이다. 대안적으로, 상기 재료로부터 이루어진 컨택 포인트들과 양립가능한, 다른 재료들을 바인딩하는 펩티드들이 사용될 수 있다. 또한, 분자 브릿지 시스템에서의 사용을 위해 새로운 이러한 재료 바인딩 펩티드들을 식별하기 위해, 컨택 포인트들에 대해 사용될 수 있는 재료들의 타입을 추가로 확장하거나, 브릿지 분자에 대한 주어진 재료 컨택 포인트들의 바인딩 특성들을 향상시키기 위해, 파지 디스플레이 스크리닝과 같은 분자 스크리닝의 방법들이 사용될 수 있다.
상기 IgG 브릿지 시스템들의 대안적인 실시형태에서, 세컨더리 바인딩 분자는 동족의 안티-IgG 항체 대신에, 단백질 A 또는 단백질 G 에 기초할 수 있을 것이다.
다른 실시형태에서, 효소는 이 시스템에서 프라이머리 브릿지 분자를 형성하기 위해 직접 조작될 수 있다. 이것은, 상술된 방식으로 재료 바인딩 펩티드 도메인들 또는 시스테인 잔기들을 운반하도록 효소 단백질을 조작하는 것에 의해 및/또는 표준 스파이-캐처 (Spy-Catcher) 펩티드 접합 시스템에서, 단백질, 및 컨택 포인트의 일부를 포함하는 접합 펩티드 상의 스파이 또는 캐처 도메인들 중 어느 일방으로 조작하는 것에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 만들어질 2 개의 접속들을 위해, 2 개의 구분되는 컨택 포인트 커플링 시스템들이 채용되는 경우에 (하나의 컨택 포인트에 대해 티올-골드 링키지, 및 타방에서 스파이-캐처 링키지), 2 개의 부착 포인트들을 달성하기 위해서, 그리고 심지어 컨택들의 선호되는 배향들을 정의하기 위해서, 티올-링키지, 재료 바인딩 펩티드들, 및 스파이-캐처 펩티드 커플들의 조합이 추구될 수 있을 것이다.
모든 이러한 분자 브릿지 시스템들에 대해, 브릿지 구성을 확립하는 것의 선호되는 수단은 디바이스 전류의 활성적 모니터링으로, 일련의 현장 바인딩 반응들을 행하는 것이다. 전류에서의 변화들은 그러면, 조립의 개별 단계들이 달성된 포인트: 개방 회로, 프라이머리 브릿지 바운드, 세컨더리 분자 바운드를 식별한다. 추가적인 선호되는 실시형태에서, 관찰되는 전류 레벨들을 추가로 조정하기 위해 사용될 수 있는 게이트 전압을 인가하기 위해 제 3 전극 (매립된 게이트) 이 사용된다. 또한, 다른 실시형태들에서, 조립 동안 및 후에 시스템의 다양한 입체구조들에 대해 핑거프린트들을 식별하는 것을 제공하기 위해 AC 신호들에 대한 전압 스펙트로스코피 / 응답이 사용될 수 있다.
추가적인 선호되는 실시형태에서, 그 게이트 및 인가된 전압은 브릿지 구조의 전압-유도 방출에 의해 정션 (junction) 을 "리셋 (reset)" 하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 고 전압들/전류들은 일반적으로 임의의 분자 브릿지 구조를 부분적으로 또는 완전히 파열/열화시킬 것이다. 이것은 전압 유도가능 산도 또는 pH 변화들, 또는 용액으로부터 국지적 열화 인자들의 다른 전압 유도를 가질 수도 있는 적합한 "스트리핑 완충재 (stripping buffer)" 와 관련하여 행해질 수 있다.
또한, 특정 실시형태들에서, 인가된 전압들 (소스-드레인 또는 게이트) 은 조립 프로세스를 가속화 또는 드라이브하기 위해 전압-강화된 조립을 잠재적으로 제공할 수 있다.
추가적인 선호되는 실시형태에서, 상술된 모든 방법들은 이러한 분자 브릿지 시스템들의 대형 어레이들을 생성하는 것과 양립가능하다. 이러한 상황에서, 어레이에서의 개별 디바이스들로부터의 디바이스 전류의 실시간 모니터링은 어느 디바이스들이 잘 형성되는지를 식별하고, 개별 디바이스 전압들에 대한 제어는, 어떤 시스템들에서, 전압 지도된 또는 가속화된 조립, 및 전압-지도된 디바이스들의 재설정/재초기화/스트리핑을 가능하게 할 것이다.
다양한 실시형태들에서, 분자 브릿지들을 생성하기 위한 시스템 및 프로세스는 전극 단부들 상에서 나노-컨택 포인트들을 확립하는 것; 프라이머리 브릿지 분자 상의 2 개의 포인트들에서 공액 바인딩 그룹들을 확립하는 것; 선택적으로, 브릿지 분자 내의 내부 컨택 포인트 및 그 내부 컨택 포인트에 대한 접합 기를 갖는 세컨더리 분자를 확립하는 것; 및 개별 조립 이벤트들이 실제로 발생한 것을 확립하기 위해 기저 회로를 통하는 전류에 의해 모니터링되는, 일련의 반응들에서 자기-조립을 허용하는 것을 포함한다. 다양한 예들에서, 컨택 포인트들은 제 1 재료, 재료 1 의 비드들이고, 전극들은 다른 재료, 재료 2 의 것이며, 공액 바인딩 그룹들은 재료 1-특정적 바인딩 능력을 갖는 그룹들이다. 예를 들어, 재료 1 은 재료 특정적 바인딩 펩티드를 포함하고, 이 펩티드가 접합 기로서 사용된다.
다양한 실시형태들에서, 재료 1 은 금이고, 재료 특정적 바인딩 펩티드는 알려진 금 바인딩 펩티드들 중 하나이다. 다른 양태들에서, 특정 바인딩으로서 금-티올 링키지에 대해, 재료 1 은 금이고, 접합 기는 티올기를 포함한다. 추가로, 재료 1 은 금일 수도 있고, 재료 특정적 바인딩 펩티드는 공액 바인딩 그룹에 포함되는 아미노산 시스테인이다.
다른 실시형태들에서, 재료 1 은 금이고, 브릿지 분자는 이중 가닥형 DNA 이며, 양 단부들에는 티올-포함 뉴클레오티드들이 존재한다. 또는, 재료 1 은 금이고, 브릿지 분자는 이중 가닥형 DNA 이며, 양 단부들에는 티올-포함 뉴클레오티드들이 존재하고, 내부 바이오틴부착된 뉴클레오티드가 존재하고, 세컨더리 분자는, 선택적으로, 추가적인 단백질, 특히 효소, 특히 폴리메라제에 교차-결합되는, 스트렙타비딘 (태생의 또는 변이된) 이다. 다른 양태들에서, 재료 1 은 금이고, 브릿지 분자는 금-티올 링키지를 통해 재료 특정적 바인딩을 제공하기 위해 양 말단들에서 또는 부근에서 시스테인을 포함하는 알파-나선 단백질이다.
다양한 실시형태들에서, 내부 바이오틴부착된 아미노산이 존재할 수도 있고, 세컨더리 분자는, 선택적으로, 추가적인 단백질, 특히 효소, 특히 폴리메라제에 교차-결합되는, 스트렙타비딘 (태생의 또는 변이된) 이다. 재료 1 은 특정 IgG 항체 A 에 대한 항원을 포함할 수도 있고, 여기서, A 는 항원에 대한 특정 바인딩에 의해 브릿지 분자를 형성한다.
다른 예들에서, 다른 단백질, 특히 효소, 특히 폴리메라제에 교차-결합되는 안티-A 안티-IgG 항체는 시스템의 세컨더리 분자를 형성한다. 이들 IgG 시스템들에서, 재료 1 은, 나노-제조 프로세스에 의해 확립된, 일 단부에 시스테인기를 갖는 펩티드로 유도된 금 비드일 수도 있고, 특정 IgG 항체를 갖는 펩티드 항원을 포함한다. 유도성 펩티드는, 제로 또는 보다 많은 아미노산들의 GS-리치 스페이서에 이어서 FLAG-태그 펩티드 항원을 갖는 CALNN 으로 이루어질 수도 있고, 항체 A 는 [숙주]-안티-FLAG IgG 이며, 세컨더리 바인딩 분자는 안티-[숙주]-IgG 이고, 여기서, [숙주] 는 표준 항체 숙주 동물들, 및 특히 쥐, 염소, 토끼 중 임의의 것이고, 세컨더리 IgG 는, 선택적으로, 임의의 다른 단백질, 특히 효소, 특히 폴리메라제에 접합된다.
브릿지 분자는 재료 1 의 나노입자들로 숙주 동물들을 백신접종함으로써 일으켜지는 IgG 항체일 수도 있고, 이 재료 1 특이성은 브릿지 바인딩을 위한 기초이다. 이 시스템에서, 세컨더리 분자는 동족의 안티-IgG 이고, 이는 선택적으로 다른 단백질, 특히 효소, 특히 폴리메라제에 교차 결합될 수도 있다. 대안적으로, 세컨더리 분자는 단백질 A 또는 단백질 G 일 수 있을 것이고, 이는, 선택적으로 다른 단백질, 특히 효소, 특히 폴리메라제에 교차-결합되는, IgG 를 특정적으로 바인딩한다. 재료 1 은 금일 수도 있고, 항체들은 금 나노입자들로 숙주 동물들을 백신접종함으로써 일으켜진다. 예를 들어, 금 나노입자들은 3 nm 내지 10 nm 사이즈 범위이고, 특히, 쥐들 또는 토끼들의 숙주 동물들에서, 그리고 특히, 여기서 항체들은 금 나노입자들의 사이즈들의 범위에 대하여 그들의 바인딩 프로파일에 기초하여 그들의 사전선택을 겪는다.
항체들은 양호한 항체 바인딩 응답을 가지도록 선택된, 그리고 추가적으로, 주어진 나노-제조 프로세스에 의해 제조된 금 비드 컨택에 반하여 양호한 바인딩 응답을 가지도록 선택된, 숙주 동물들로부터 유도된 단일클론의 항체들로서 생성될 수도 있다.
항체들은, 양호한 항체 바인딩 응답을 가지도록 선택된 동물들로부터, 그리고 주어진 나노-제조 프로세스에 의해 제조된 금 비드 컨택에 대하여 양호한 바인딩 응답을 가지도록 추가로 선택된 클론들로, B-셀 수용체 시퀀싱 및 클로닝에 기초하여 조작될 수도 있다.
일부 예들에서, 브릿지 분자는 Fab 바인딩 포켓들의 가변 도메인들에서 특정된 아미노산 시퀀스들을 갖는, IgG 템플릿 상에서 조작된 합성 단백질일 수도 있고, 이러한 시퀀스들은, GS-리치 펩티드 링커들과 관련하여, 재료 1-바인딩 펩티드들을 포함한다. 세컨더리 바인딩은 가능하게는 다른 단백질, 특히 효소, 그리고 특히 폴리메라제에 교차-결합되는, 동족의 안티-IgG 항체에 의해 제공된다. 이러한 조작된 단백질들에 대해, 세컨더리 바인딩에 대한 대안적인 접근법을 위해, 추가적으로, 특정 바인딩 펩티드의 형태로 세컨더리 컨택 사이트에서 조작하는 것이 가능하고, 이 특정 바인딩 펩티드는, 다른 조작된 단백질들, 특히 조작된 효소들, 및 특히 조작된 폴리메라제들에서, 그리고 특히 이러한 방식으로 스파이-캐처 펩티드 접합 시스템을 이용하여 (스파이 또는 캐처 펩티드는 IgG 템플릿 내로 조작됨), 접합 펩티드들에 바인딩될 수 있다. 재료 1 은 금일 수도 있고, 바인딩 포켓들 내로 조작된 재료 특정적 펩티드들은 GS-리치 링커들 및 스페이서들과 관련하여, 시스테인들, 금-결합 펩티드들을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 프라이머리 브릿지 분자는, 그것의 선형 단백질 시퀀스, 또는 그것이 다중결합 단백질인 경우에 그것의 복합 사슬들의 시퀀스 내로의 컨택 포인트들에 대해 접합되는 바인딩 그룹들을 직접 포함하도록 조작된, 단백질, 바람직하게는 효소, 바람직하게는 폴리메라제 효소를 포함할 수도 있다.
컨택 포인트들은 스파이 또는 캐처 도메인들을 포함할 수도 있고, 단백질은 접합 펩티드들을 포함할 수도 있으며, 스파이-캐처 펩티드 접합 시스템은 컨택 포인트들에 대한 결합을 제공한다. 컨택 재료는 금일 수도 있고, 단백질은, 전극 컨택 포인트들에 대한 결합을 제공하기 위해, GS-리치 링커들과 관련하여, 바인딩 그룹들로서 금 바인딩 펩티드들 또는 시스테인 아미노산들을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 게이트 전압은 프로세스 모니터링 양태에서 다른 전압 제어를 제공하기 위해 사용된다. 예를 들어, 게이트 전압 및 인가된 소스/드레인 전압은, 구축 및 결과적인 분자 브릿지 구성들의 스테이지들을 추가적으로 특성화하기 위해, 그리고 잘-형성된 구조들을 식별하기 위해, 전압 스펙트로스코피, I-V 특성화, 또는 AC-신호 응답을 수행하기 위해 사용된다. 게이트 전압 및 인가된 소스/드레인 전압은 브릿지 형성을 가속화하기 위해, 그리고 부적절하게 형성된 브릿지 구성들을 제거하기 위해 사용된다.
다양한 예들에서, 분자 브릿지 구성들은, 잘 형성된 사이트들의 식별, 및 전압 지도된 감지 및 액추에이팅을 이용한 재설정/스트리핑/재초기화를 포함하는, 전극들의 어레이 상에서와 같이, 큰 어레이들에서 배치될 수도 있다.
본 명세서의 예 6 에서, 도 26 내지 도 34 는, 상기 실시형태들에 대한 실험적 결과들을 나타내고, 이하에서 보다 상세히 논의된다. 도면들의 제 1 그룹은, 티올-금 지도된 바인딩을 통해, 금 컨택 도트 쌍들의 테스트 어레이들에 대한 다양한 타입들의 브릿지 분자들 바인딩/브릿징을 나타낸다. 이것은 DNA, 펩티드 및 항체 브릿지들을 커버한다. 도면들의 다음 그룹은, 티올-금 지도된 바인딩을 통해 금 컨택 도트들 또는 타겟들을 갖는 전극들에 대한 바인딩/브릿징을 나타내고, 결과들은 촬상 및 전기적 측정들 양자에 의해 평가된다.
도 26 내지 도 34 는 추가적으로: 바인딩 테스트 어레이: dsDNA 브릿지; 바인딩 테스트 어레이: dsDNA 브릿지, 향상된 바인딩; 바인딩 테스트 어레이: 펩티드 알파 나선 브릿지; 바인딩 테스트 어레이: IgG 항체 브릿지; 전기적 브릿지 / 바인딩 측정들을 위한 테스트 셋업의 개략; 금 도트 컨택들을 갖는 테스트 전극들; 브릿징 및 분자 조립의 전기적 신호들; 촬상을 이용한 브릿지 분자 바인딩의 전기적 신호들; 및 제자리에 라벨링된 브릿지를 갖는 전극의 이미지를 제공한다.
이제 도 26 을 참조하면, 브릿징된 컨택들 (녹색 박스) 및 브릿징되지 않은 컨택들 (적색 박스) 의 이상적 이미지들의 도식적 표현들이 예시된다. 도 27 에서, 이중 가닥형 DNA 분자들이 금-도트 컨택 포인트들 사이에 브릿지들을 형성하기 위해 사용되었다. 이 예에서, 브릿지 분자는, 컨택 도트들에 대한 티올-금 바인딩을 위한 각 가닥의 5' 단부들 상의 티올기들을 갖는, 이중 가닥형 DNA 분자 길이 20 nm (60 염기들) 이다. 금 도트들은 실리콘 기판 상에 전자-빔 리소그래피를 통해 형성된다. DNA 브릿지는 라벨링된 브릿지의 전자 현미경 촬상을 허용하도록 바이오틴-금 라벨의 바인딩을 위해 하나의 가닥 상에 바이오틴부착된 염기 30 을 갖는다. 도 27 은 브릿징 반응들 및 라벨링 반응들 후의 기판의 EM 이미지를 나타낸다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지를 갖는 컨택들을 강조한다.
도 28 은 금 컨택 포인트들의 어레이에 대한 보다 높은 효율성의 20 nm 이중-가닥형 DNA 브릿지 바인딩의 이미지이다. 브릿지들은 촬상을 위해 작은 금 도트로 라벨링된다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지 예를 강조한다. 금 컨택 포인트들, 및 브릿지에 대한 보다 높은 레벨들의 바인딩은 고 염 완충 용액에서의 디포지션으로 인한 것이다 (브릿지 반응 조건들: 5X TBS 완충재에서 1 시간 동안 바인딩 어레이로 배양된 1 μM 브릿지 농도).
도 29 는 금 도트 컨택 포인트들의 테스트 어레이에 대한 알파-나선 펩티드 브릿지 바인딩의 이미지이다. 브릿지 분자는 길이 10 nm 의 펩티드 알파-나선이고, 시스테인들의 티올기들을 통한 금에의 티올 바인딩을 위해 말단들에서 시스테인 아미노산들을 갖는다. 브릿지들은 스트렙타비딘-금 비드로 라벨링된, 내부 리신-바이오틴을 통해 라벨링된다. 많지 않은 컨택 금 도트들이 바운드 브릿지를 가지고, 많은 쌍들의 금 도트들이, 도트-대-도트 브릿지와 일치하는, 도트들 사이에 위치된 브릿지를 갖는다. 이 실험을 위해, 펩티드 브릿징 반응 조건들은: 1X PBS 완충재에서 1 시간 동안 배양된 1 μM 브릿지 농도였다. 녹색 사각형은 잘 형성된 브릿지 예에 대해 강조한다.
도 30 은 IgG 항체 브릿지 바인딩의 이미지이다. 금 도트 컨택 어레이들은 처음에, 시스테인/티올-금 바인딩을 통해 CALNN-FLAG-태그 펩티드로 유도체화된다. 안티-FLAG 태그 IgG 는 특정 친화도 바인딩을 통해 FLAG-태그들에 바인딩된다. 항체 위치는 IgG 일정 도메인에 바인딩되는 금-도트-단백질-A 라벨을 이용하여 촬상을 위해 라벨링된다. 도 30 은 금 컨택/CALNN-FLAG 에 바인딩되는 안티-IgG 를 나타낸다. 수개의 도트 쌍들은 도트들 사이에 위치된 항체를 나타내고, IgG 아암들이 도트들에 걸친, 완전한 브릿지 형성을 제시한다. 녹색 사각형들은 잘 형성된 브릿지 예들을 강조한다.
도 31 은 브릿지 분자들 상에서의 전기적 측정들을 위한 테스트 셋업의 개략을 예시한다. 도면의 상부 부분에서, 전극-기판 구조의 단면, 및 전압들을 인가하고 브릿지 분자를 통하는 전류들을 측정하기 위한 분석기에 대한 부착이 예시된다. 도면의 하부 부분에서, 브릿징 회로들에 대한 전극 어레이의 투시도가 예시된다. 전극들의 각 쌍은 금속-1 전극들 상에 금속-2 컨택 포인트들을 갖는다.
도 32 내지 도 33 은 브릿지 분자 바인딩의 전기적 시그니처를 예시한다. 도 32 에서, 전류 대 시간은 브릿지-전극 바인딩 이벤트들을 나타내는 3 개의 스파이크들을 보여준다. 도 33 은, 관찰된 3 개의 신호 스파이크들과 일치하는, 가장 우측의 전극 (녹색 화살표) 에 바인딩된 3 개의 브릿지들을 나타내는, 동일한 전극에 대한, 라벨링된 브릿지들의 EM 이미지이다. 이들은 전극 갭을 브릿징하지 않고, 하지만, 심지어 걸친 전극들 없는 브릿지 분자의 바인딩이 검출가능한 전기적 신호를 생성할 수 있는 것을 보여준다.
도 34 는 금 전극들의 dsDNA 브릿징의 EM 이미지이다. 하나의 가닥의 3' 및 5' 단부 상의 티올기들을 갖는 20 nm dsDNA 브릿지는 금-코팅된 전극들 (녹색 화살표) 사이의 브릿지로서 바인딩되는 것으로 나타난다. 브릿지는 금-도트-스트렙타비딘 라벨을 통해 중앙 바이오틴부착된 염기에서 금 도트로 라벨링된다. 전극들은 실리콘 상에서 5 nm 크롬 기판 상에서 15 nm 금 층을 갖는다. 표면은 실리콘 산화물 층에 의해 패시베이션되고, 오픈 영역은 20 nm 넓이로 브릿징을 위해 전극들의 금 표면을 노출시킨다 (어두운 수평 밴드가 노출된 영역이고, 실리콘-산화물이 덮고 있지 않다).
예 7
전극들 상에 나노-
컨택
포인트들 도입
이 예는 정밀 위치, 형상 및 사이즈로, 전극과 같은 기판 상에 비드들을 준비하기 위한 제조의 새로운 방법들을 보여준다. 이들 방법들의 주요 신규한 특징은, 그것들이 프로세스에서 사용되는 패터닝 방법들의 기본 패턴 피처들보다 직경이 더 작은 기판 상에 비드들을 포지셔닝하기 위한 방식을 제공한다는 것이다.
이 예는 정밀 포지션 및 작은 사이즈로 고체 기판 상에 전개되는 나노입자들에 관한 것이다. 하나의 선호되는 애플리케이션은, 나노미터 스케일로 잘 정의된, 바람직한 위치들에 대한 다음 타입들의 이벤트들, 특히 기계적 접속들, 전기적 접속들, 및 자기 조립을 공간적으로 국지화하기 위해, 기판 상의 "컨택 포인트들" 로서 나노스케일 재료 입자들의 사용이다.
이를 위한 하나의 가능한 필요성은 상기 논의되었고, 소망되는 분자 스케일 회로를 생성하는 맥락에서 도 22 에서 보다 자세히 예시되었다. 여기서, 분자 엘리먼트는 2 개의 전극들 사이에 접속될 것이다. 이것은 분자 일렉트로닉스의 분야에서 흔한 문제이다.
이러한 문제를 해결하기 위한 하나의 선호되는 방식은 나노 "컨택 포인트들" 로서 본 명세서에서 지칭되는 고도로 국지화된, 정확하게 위치된, 재료 입자를 도입하는 것이고, 이는 자기-조립 안내, 및 기계적 및 전기적 접속 제공의 필요성들의 일부 또는 전부를 위해 기능한다. 이러한 컨택 포인트의 사용은 도 23 에서 상기 논의되고 예시되었으며, 여기서, 엘리먼트 "A" 는 컨택 포인트이다. 이 목적을 위해, 컨택 포인트는 타겟 분자를 선택적으로 바인딩하는 적합한 재료로 이루어지고, 고도로 공간적으로 국지화되며, 원하는 포지션에 정밀하게 위치된다.
이 애플리케이션을 위해 필요한 나노-입자의 주요한 특성들은 (1) 그것이 고도로 공간적으로 국지화된다는 것 ("소형" 또는 "점-유사" 이어야만 한다); (2) 정밀하게 사전정의된 특정된 로케이션; 및 (3) 그것의 기능적 역할을 지원하기 위해 적절한 재료로 이루어져야 한다는 것이다.
동일한 특성들은 여기에 나타낸 회로 구성의 단지 예보다 더 넓은 유용성을 갖는다. 예를 들어, 플라즈몬 공진 디바이스들의 영역에서, 전자기 에너지와의 나노입자 상호작용은 중요한 관심사이다.
기판 상에 소망되는 작은 사이즈 및 정밀한 로케이션을 가지는 나노스케일 비드들을 효율적으로 제조하기 위해 일반적으로 시도하고 있다. 나노스케일 리소그래피 또는 밀링의 표준 방법들은, 프라이머리 패터닝 프로세스에 의해 설정된 디스크의 형상 및 직경으로, 기판 상에 원하는 재료의 디스크를 형성하기 위해서 사용될 수 있다. 이들은 전자-빔 리소그래피, 포토 리소그래피, UV 리소그래피, 익스트림-UV 리소그래피 및 임프린트 리소그래피, 및 스퍼터링 또는 기상 증착과 같은 다양한 재료 디포지션 방법들과 결합된, 이온 빔 밀링과 같은 잘 알려진 패터닝 방법들을 포함한다. 이러한 표준 접근법의 가장 중요한 제한은, 재료 디스크의 직경이 패터닝 프로세스에 의해 설정되고, 패터닝 프로세스의 최소 분해능이 원하는 나노스케일 비드 사이즈를 제공할만큼 충분히 작지 않을 수도 있다는 것이다. 이것은 특히, 소망되는 비드는, 가장 현대의 광학적, UV 또는 전자-빔 리소그래피 시스템들, 또는 이온 빔 밀링 시스템들의 분해능 한계들 부근에 또는 그 너머에 있는 10 nm 미만의 직경을 갖는다. 본 발명은, 기판 상에 정확하게 포지셔닝된 비드들을 제조하기 위해 이들 표준의, 효율적인 패터닝 방법들을 이용하기 위한 수단이고, 여기서, 비드들은 프라이머리 패터닝 프로세스의 분해능 한계보다 직경이 더 작다. 이들 비드들은 또한 정밀하게 정의된 형상들로 정밀하게 포지셔닝된다.
이 예는, 프로세스에서 사용된 프라이머리 패턴 생성 방법의 최소 피처 사이즈보다 직경이 실질적으로 더 작은, 정밀하게 제어된 사이즈, 형상 및 로케이션의 비드들을 제조하는 3 가지 예시적인 방법들을 교시한다. 그 방법들은 다음과 같다:
본 명세서에서 "프로세스 (1)" 로서 지칭되는 제 1 방법이 도 35 및 도 36 에서 예시된다. 제 1 방법은, 표준 패터닝 방법에 의해 디스크를 보호 레지스트 층 내로 패터닝하는 것으로 이루어진다. 이 단계는 보호 레지스트 층을 초래하고, 여기서, 기판 상의 소망되는 디스크 영역이 노출된다. 이것 다음에, 접착 재료를 디포짓팅하기 위한 디포지션 프로세스가 이어지고, 이는 다시 접착 재료의 화학적 성질에 따라 표준 디포지션 또는 코팅 방법들에 의해 행해질 수 있다. 접착성 재료는 기판에 그리고 또한 비드 재료에 바인딩 가능하여야 한다. 이것은 그 다음에, 접착성 디스크 상에서 제 자리에 바인딩할 수 있는 (콜로이드성 현탁액과 같은) 대량의 나노-입자들을 만드는 표준 수단에 의해 미리 제조된, 소망되는 비드들을 포함하는 용액에 노출된다. 비드들이 충분히 큰 경우에, 그리고 저 농도에서, (통상적으로 "입체 장애" 로서 알려진) 물리적인 사이즈 제약들은 디스크에서 바인딩할 기껏해야 하나의 비드를 허용할 것이다. 그 다음에, 레지스트가 용해되는 방식으로 부착된 비드를 남기게 된다. 대안적인 실시형태에서, 레지스트는, 일단 프라이머리 비드가 제자리에 있게 되면, 그것의 존재가 추가적인 비드들이 접착성 영역에 액세스하는 것을 제한하는데 도움이 됨에도 불구하고, 이 시퀀스의 단계들에서 제거될 수 있고, 따라서, 전자의 접근법이 선호되는 실시형태이다. 접착성은 이 프로세스에서 영구적일 수도 있고, 또는 대안적인 실시형태에서, 그것은, 아마도 기판에 비드를 바인딩하는 추가적인 프로세스 단계들과 관련하여, 용해에 의해 제거되고 비드를 제자리에 남겨두도록 하는 일시적인 양태의 절차일 수 있을 것이다. 임의의 경우에, 특히, 이 비드는 디스크 그 자체보다 직경이 더 작을 수 있고, 그렇지 않은 경우에 접착성 디스크의 중앙 부근에 포지셔닝된다. 특히, 디스크의 직경의 절반을 갖는 비드는 적절한 사이즈 배타성을 제공하여 오직 하나의 비드가 디스크 당 바인딩될 수도 있을 것이다.
도 35 는 원하는 로케이션에서 작은 비드를 제조하기 위해 사용되는 프로세스 (1) 의 단계들을 나타낸다. 도 35 의 상부 좌측 부분으로부터 시작하여, 레지스트의 층 (회색) 이 기판 상에 패터닝되고 (청색), 직경 D 의 오픈 디스크를 갖는다. 그 다음에, 접착 층 (녹색) 이 디스크 내로 디포짓팅된다. 그 다음에, 표준 수단에 의해 제조된 사전 제조된 비드들의 용액이 이것에 대해 노출되고, 여기서, 그 비드들은 입체 장애가 접착성 디스크 당 오직 하나의 비드만을 허용하도록 직경 d 를 갖는다. 레지스트의 제거 후에, 남는 것은 접착성 디스크의 중앙 부근에 위치되고 하지만 디스크 직경 D 보다 더 작은 사이즈의 직경 d 의 비드이다. 이 프로세스는 도 36 에서 보다 큰 명확성을 위해 3D 로 묘사되고, 프로세스 (1) 의 중요 엘리먼트들의 투시도 및 정면도 양자를 보여준다.
제 2 방법, "프로세스 (2)" 가 도 37, 도 38, 도 39a 및 도 39b 에 예시된다. 기판으로부터 시작하여, 그것이 넓은 것보다 더 긴 폭 W 의 직사각형 영역을 패터닝하기 위해 임의의 표준 패터닝 방법이 사용되고, 이 직사각형 패턴 내로 다소의 두께의 소망되는 비드 재료 M 의 고체-상, 얇은 층을 디포짓팅하기 위해 임의의 표준 디포지션 방법이 사용된다. 이 구성은 그 다음에, 시스템이 최소 에너지의 구성을 향해 진화하도록 허용할, 적합한 어닐링 프로세스를 이용하여 어닐링된다. 적절한 조건들 하에서, 이것은 디포짓팅된 재료 스트립이 표면 장력의 작용 하에서 비드들로 쪼개지게 하여, 전체적으로 동일 체적의 재료를 포함하는 더 작은 직경의 비드들의 행을 형성하게 할 것이다. 재료 M 의 결과적인 비드들은 스트립의 폭 W 보다 더 작은 직경을 가지고, 동일한 중앙라인 부근에서 더욱 정밀하게 센터링된다. 비드-대-비드 간격은 통계적으로 유사할 것이고, 다시 이 간격은 비드 직경보다 실질적으로 더 클 수 있다. 이 프로세스의 최종 단계는 원래 스트립의 선호되는 단부 부근에서의 단지 단일의 노출된 비드를 초래하도록 의도된다.
이것을 달성하기 위한 이러한 프로세스의 2 가지 대안적인 실시형태들은 다음과 같다:
(a) 표준 패터닝 방법에 의해 패터닝된 제거가능한 재료 / 레지스트의 디포짓팅된 층으로 스트립의 단부에서 가장 가까운 비드를 보호하고, 그 다음에, 모든 다른 비드들을 세척하여 제거하고, 그 다음에, 초기 스트립의 단부 부근에서 소망된 단일의 노출된 비드에 도달하도록 보호된 비드를 노출하는 것; 또는
(b) 표준 패터닝 및 디포지션 방법들로, 스트립의 단부에 가장 가까운 것을 제외하고 비드들을 커버하는 층을 디포짓팅하고, 다시, 스트립의 선호되는 단부에 가장 가까운 소망된 비드만을 노출되게 남겨두는 것.
어느 수단에 의해서도, 스트립의 언급된 단부에 가장 가까운 단일의 노출된 비드가 남는다. 이 비드는 또한, 거의 구형일 수 있고 하지만 일반적으로 수반되는 재료들의 벌크 및 표면 상호작용 에너지들 및 어닐링 프로세스에 의해 정의되는 정밀하게 정의된 형상을 가질 것이다. 어닐링은 통상적으로, 적합한 분위기 매질 (선호되는 실시형태들에서 진공, 또는 공기, 또는 질소와 같은 불활성 기체들일 수도 있음) 에서 시스템을 담그고, 그 다음에 일정 기간 동안 시스템의 온도를 상승시키는 것에 의해 수행된다. 이 비드-업 프로세스가 발생하기 위해서는, 디포지션 재료, 기판 재료, 및 분위기 매질은 적합한 물리적 특성들을 가져야만 한다. 선호되는 실시형태는 다음과 같은 특성들을 가질 것이다: (i) 재료-기판 표면 장력이 기판-분위기 표면 장력을 초과한다; 그리고 (ii) 재료는 기판을 방해하지 않는 온도에서 어닐링 또는 융해될 것이다.
이들 우호적인 조건들 하에서, 적합한 어닐링 온도, 통상적으로 용융점 훨씬 더 아래까지 가열 시에, 재료는 이동가능하게 될 것이고 적합한 어닐링 시간이 경과하도록 허용하면, 재료는 표면 장력의 작용 하에 비드들의 행으로 쪼개질 것이고, 일반적으로 훨씬 더 작은, 둥근 비드들을 형성할 것이다. 비드는 재료와 기판 사이에 매우 큰 표면 장력이 존재하는 경우에 거의 구형일 것이고, 그 외의 경우에 표면 장력들에 따라 성형된다. 이 비드의 직경 d 는 초기 디포지션 패턴의 폭 W 보다 더 작을 것이다. 따라서, 이 프로세스는 초기 패터닝 프로세스의 한계들보다 실질적으로 더 작은 직경 d 의 컨택 포인트를 달성한다. 이 비드 로케이션은 역시 원래의 지점의 중앙 부근에서 센터링되어 남을 것이고, 따라서, 또한 공간적 국지화를 강화하면서 정밀하게 특정된 포지션을 보유할 것이다. 이 프로세스의 다른 중요한, 신규한 이점은, 최종 비드 형상들이 초기 디포지션 패턴이 아닌 표면 장력들에 의해 정의되기 때문에, 초기 디포짓팅된 재료 층이 불규칙성들을 가지는 경우에도, 결과적인 비드는 잘 정의된 형상을 갖는다는 점이다.
이 제 2 방법은 다음과 같이 도 37, 도 38, 및 도 39a 및 도 39b 에서 캡처된다:
도 37 은 프로세스 (2) 실시형태 (a) 의 단계들을 나타낸다: 도면의 상부 좌측으로부터 시작하여, 적합한 기판 상에 폭 W 의 비드 재료 (금) 의 직사각형의 디포지션은, 어닐링 시에, 그리고 표면 작력의 작용 하에서, 비드들의 라인으로 쪼개진다. 그 다음에, 제거가능한 레지스트의 보호 층 (적색) 이 패터닝되고 디포짓팅되어, 단일 비드를 포함할 영역을 보호한다. 남은 비드들은 제거되고, 그 다음에, 레지스트가 제거되어, 재료이 원래의 직사각형의 선호되는 단부 부근에 단일 비드를 남기게 된다. 도 38 은 프로세스 (2) 의 대안적인 실시형태 (b) 를 나타내고, 여기서, 도 37 에서 도시된 것에 반해, 최종 디포짓팅된 층 (적색) 이 원치 않는 비드들을 커버하기 위해 사용되고, 오직 선호되는 단부에서의 비드만을 노출된 채로 그리고 더 큰 나노 디바이스에서의 사용을 위해 이용가능하도록 남겨둔다.
도 39a 는 프로세스 (2) 의 하나의 선호되는 실시형태의 일 예를 나타내고, 여기서, 사용되는 패터닝 방법은 전자-빔 리소그래피이고, 목표는 2 개의 전극 스트립들의 근접 단부들에서 비드들을 만드는 것이다. 도시된 것은, 직사각형 층들의 비드들로의 쪼갬의 시점을 통과하는, 그리고 최종 단계들 이전에 각 직사각형의 선호되는 단부에서 단일의 비드를 달성하기 위한 프로세스를 나타낸다. 도 39b 는 상승된 및 하강된 기판 릿지들로 이루어지는 기판 상의 실제로 실행된 도 39a 의 프로세스를 나타내는 전자 현미경 이미지이고, 그 릿지들 상으로 금 층이 디포짓팅되어 비드들로 쪼개지도록 허용된다. 이 이미지는, 비드들이 직사각형 스트립들의 기저 폭보다 직경이 실질적으로 더 작고, 좁아진 (하강된) 스트립들은 비드들의 단일 라인이 형성하기에 충분히 작다.
제 3 방법, "프로세스 (3)" 이 도 40 에서 예시된다. 기판으로부터 시작하여, 그것이 넓은 것보다 더 긴 폭 W 의 직사각형 영역을 패터닝하기 위해 임의의 표준 패터닝 방법이 사용된다. 이 직사각형 패턴은 추가로 뭉툭하게 될 수도 있고, 하지만, 선호되는 실시형태에서, 비드가 형성될 지정된 단부 상에서 포인팅되며, 이는 비드 로케이션 정밀도를 강화할 수도 있다. 그 다음에, 재료 2 가 그것에 강력하게 접착되는 것을 의미하는, 제 2 재료 (2) 에 대한 접착 재료인 제 1 재료 (1) 의 층 (청색) 을 이 패턴 내로 디포짓팅하기 위해 임의의 표준 디포지션 방법이 사용되고, 그 시점까지, 도 37 에서와 같이 비딩 업은 어닐링 시에 발생하지 않는다. 제 2 재료 (2) 는 또한 이 동일한 패턴 내로 디포짓팅된다. 그 다음에, 이 표면에서 얇은 계면 층 (회색) 이 확립되고, 이는 그렇지 않은 경우에 존재할 벌크 구조에서의 파열을 생성하는 재료의 임의의 층 또는 분자 격자 구조에서의 변경이고; 선호되는 실시형태에서, 이것은 진공계에서의 파괴를 도입하여 공기에 대한 노출을 허용하고 산화 층이 표면에서 형성되도록 허용함으로써 행해진다. 계면 층이 확립된 후에, 소망된 비드 재료인 재료 3 의 추가적인 얇은-층 디포지션이 동일한 패턴으로 이루어지고, 여기서, 선호되는 실시형태에서 재료 3 은 재료 2 와 동일하다. 이 구성은 그 다음에, 오직 작은 치수들의 선호되는 단부만이 노출되게 남겨두는 두꺼운 패시베이션 층의 디포지션에 의해 보호된다. 이 구성은 그 다음에 상기 방법 (2) 와 동일한 고려사항들 하에서 어닐링을 겪는다. 본 구성에서, 노출되는 재료 3 의 얇은 층은 상기 방법 (2) 에서 논의된 바와 같이 어닐링의 작용 하에 쪼개지고 비드업되어 노출된 영역보다 작은 치수들의 비드를 형성할 것이다. 재료 1 이 접착 층이기 때문에, 선호되는 실시형태에서 재료 2 및 3 이 동일한 재료인 경우에도, 이 어닐링 프로세스 하에서 재료 2 층은 비드업되지 않을 것이다. 계면 층은 일시적인 것이고, 특히 그것이 산화 층이고 어닐링이 상승된 온도에서 행해지는 선호되는 실시형태에서, 이 프로세스 동안 치환될 것이다. 결과는, 원래의 직사각형 패턴의 원하는 단부 부근에 위치된, 패터닝된 치수들의 그리고 보다 작은 직경의 소망된 재료 3 의 비드이다. 언급된 바와 같이, 선호되는 실시형태에서, 재료 2 및 3 은 계면 층으로서 산화 층을 갖는 동일한 재료이고, 추가적인 선호되는 실시형태에서, 이 재료는 금일 것이고, 금 지지 표면 상에서, 수퍼-분해능 치수들의 금 비드를 생성할 것이다.
일반적으로, 이들 3 개의 프로세스들 (1), (2) 및 (3) 은 보다 넓은 나노제조 필요성들을 지원하여, 질서정연하게, 특정된 어레이 패턴들로 배치된 비드들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 도 41 은 프로세스 (1) 이 어떻게 접착성 디스크들의 어레이를 생성하기 위해 쉽게 사용될 수 있고 접착성 재료의 패터닝된 디포지션을 수퍼-분해능의, 정밀하게 포지셔닝된 그리고 정밀하게 성형된 비드들의 어레이로 효율적으로 변환하는지를 나타낸다. 따라서, 그것은 프라이머리 패터닝 프로세스에 의해 달성가능한 것을 초과하는 분해능으로 나노스케일 비드들의 정렬된 어레이들을 위한 고도로 효율적인 제조 프로세스를 제공한다. 도 41 은 프로세스들 (1) 또는 (2) 를 이용하여 생성된 비드들의 어레이를 나타낸다. 프로세스 (1) 의 경우에, 초기 패터닝 및 재료 디포지션 프로세스가 기판 상에 접착성 재료 디스크들의 어레이를 형성하기 위해 사용될 수 있다 (원래의 풋프린트들은 점선 원들에 의해 표시됨). 프로세스는 그 다음에 도시된 수행된 비드들을 디포짓팅할 것이다. 대안적으로, 방법 (2) 가 사용되는 경우에, 디포짓팅된 초기 재료 직사각형들의 어레이에 기초하여 단일 보호 단계로 비드들의 전체 열들이 확립될 수 있다. 도 41 은 기판 상에서의 잠재적으로 임의의 확장의 질서정연하게, 패터닝된 비드들의 어레이의 부분을 나타낸다.
도 42 는, 도 34 에서 나타낸 타입의, 분자 전자 디바이스들의 어레이들을 제조하는 것에서 있을 비드들의 어레이를 생성하기 위해 이들 제조 프로세스들을 이용하기 위한 하나의 선호되는 애플리케이션을 나타낸다. 기술된 어레이 프로세스는 도 40 에서 나타낸 바와 같이 전극 쌍들의 팁들에서 포지셔닝된 비드들의 어레이를 제조하기 위해 사용될 것이다. 방법 (2) 및 (3) 은, 단일의 보호 단계 (도 38 및 도 39a 에서의 적색 층) 가 전극들의 단부에서 비드들의 전체 행을 보호 및 확립할 수 있기 때문에, 이 특정 타입의 패턴에 잘 맞음에 유의한다. 도 41 에서와 같은 이러한 비드들은 도 34 에서 나타낸 바와 같이 분자 전자 회로들에 대한 나노-컨택 포인트들로서 작용할 수 있다. 프로세스의 비드의 사용은, 스케일러블 어레이 포맷에서, 최종 분자 전자 디바이스들을 생성하기 위해 사용되는 전체 제조 프로세스의 일부일 것이다. 이것은 특히 단일의 집적 회로 칩 상에서 많은 이러한 디바이스들의 어레이를 생성하기 위해 사용될 수 있을 것이다.
다양한 실시형태들에서, 본 개시는 원래 패턴의 것보다 더 작은 직경을 갖는 비드를 디포짓팅하기 위한 프로세스를 제공하고, 이 프로세스는: 기판 재료를 제공하는 것; 패턴 생성 및 접착 디포지션 프로세스들을 제공하는 것; 용액에서 다수의 사전-제조된 비드들을 제공하는 것; 패터닝 프로세스에 의해 설정된 직경으로, 패턴 생성 및 접착 디포지션 프로세스들을 이용하여 기판 상에 접착성 재료의 디스크 또는 패치를 확립하고, 레지스트 코팅에 의해 기판의 잔부를 보호하는 것; 및, 용액에서의 다양한 사전-제조된 비드들을 접착제에 노출시키고, 그 위에 바인딩하는 것, 여기서, 사전제조된 비드들은 접착성 재료의 디스크 상에 하나의 비드가 바인딩할만큼만 공간이 존재하도록 충분히 큰 직경을 가짐; 및 비드 바인딩 이전에 또는 후에 중 어느 일방에서, 레지스트 코팅이 제거되고, 비드가 분리되고 접착성 패치에 바인딩되게 남겨두는 것을 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 최종 비드는 약 20 나노미터보다 작은 직경을 가질 수도 있다. 다른 예들에서, 비드 직경은 약 10 나노미터보다 작을 수도 있다.
다양한 양태들에서, 패턴 생성 프로세스들은, 전자-빔 리소그래피; 포토 리소그래피; UV 리소그래피; 익스트림 UV 리소그래피; X-레이 리소그래피; 나노-임프린트 리소그래피; 및 이온 빔 밀링 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.
다양한 예들에서, 전술한 프로세스들은 비드들의 정렬된 어레이를 형성하기 위해 사용될 수도 있고, 여기서, 비드 로케이션들의 패턴은 프라이머리 패터닝 프로세스에 의해 지도된다. 예를 들어, 비드 패턴은, 그것이 분자 전자 디바이스들의 어레이에 대해 전극들의 패턴에 대한 컨택 포인트 로케이션들에서 비드들을 배치하도록 하는 것일 수도 있다. 일부 양태들에서, 프로세스는 단일 칩 상에서 100 개보다 많은 컨택 포인트들을 제조하는 것을 포함할 수도 있다. 다른 예들에서, 프로세스는 단일 칩 상에서 10,000 개보다 많은 컨택 포인트들, 또는 단일 칩 상에서 심지어 1,000,000 개보다 많은 컨택 포인트들을 제조하는 것을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 사전-제조된 비드들은 예를 들어 콜로이드성 금 나노-입자들과 같은 금속성 나노-입자들을 포함할 수도 있다. 일부 예들에서, 사전-제조된 비드들은 금 나노-입자들을 포함하고, 접착제는 티올화된 실란 재료를 포함한다.
전술한 프로세스들의 다양한 양태들에서, 접착성 재료는 후속하여 제거되고, 입자는 다른 능동적 또는 수동적 수단에 의해 바인딩된 기판 상에 제자리에 남겨진다. 일부 예들에서, 사전-제조된 나노-입자의 직경은 접착성 디스크의 직경의 1/2 보다 더 크거나 동일하여, 기껏해야 하나의 이러한 입자가 바인딩되도록 허용한다.
다른 예들에서, 접착제는 디스크와는 약간 다른 형상으로 패터닝될 수도 있다.
전술한 프로세스들의 변형들에서, 이들 다른 제한 인자들 중 어느 것 또는 전부와 관련하여 예를 들어 입자 사이즈 (보다 큰 직경이 바람직하다) 와 같은 접착 사이트 당 디포짓팅된 단일 입자를 선호하도록 하는 수단이 사용된다: 레지스트에서의 오목부의 애스펙트 비 (높은 높이/폭이 유리), 사전-제조된 입자들의 용액의 농도 (보다 낮은 농도가 유리), 다수의 프라이머리 비드들이 하나의 사이트에 컨택하는 것을 방지하기 위해 사이즈 배제 목적들 (보다 많은 이러한 배치 비드들이 유리) 을 위해 존재하는, 바인딩될 수 없는 비드들의 다른 종들과 프라이머리 비드들의 혼합물, 및 바인딩 반응의 지속기간 (보다 짧은 시간이 유리).
사이트 당 하나보다 많은 비드들이 부착될 수 있도록, 하지만, 부착의 정확한 포인트 및 부착의 시간에서 랜덤한, 사이트 로딩의 확률적 프로세스에 따라 (프와송 로딩 통계학), 사이트들의 일부 부분이 잘 형성된 사이트에 대해 요망되는 바와 같이 단일 비드를 얻게 되도록 하는 방식으로 비드들이 디포짓팅될 수도 있다.
제거가능한 코팅이 후속 프로세싱 단계에서 제거되는 경우에, 그리고 나노입자들의 용액에 대한 노출이 완료된 후에, 접착 사이트 당 하나의 입자로 디포지션을 제한하기 위한 사이즈 배제를 위해, 나노-입자는 그것의 유효 직경을 증가시키는 제거가능 코팅을 더 포함할 수도 있다.
예 7 은, 자기-조립형 분자 디바이스들에 대한 컨택 포인트들로서의 사용을 위해 소망되는 로케이션들에서 비드들을 확립하기 위해, 사전-형성된 나노스케일 비드들이 표면 상에 디포짓팅되고 패터닝된 영역에 부착하는 본 발명에 대한 실험적 결과들을 설명한다. 나타낸 ELISA 어세이 결과들은 추가적으로, 교시된 바와 같이 표면들에 바인딩된 비드들이 특정 분자 바인딩을 가지기 위한 기능적 능력을 보유하는 것을 보여주고, 이는 분자 자기-조립 반응들에 대한 기초이다.
도 43 내지 도 46a - 46d 는 이들 결과들을 추가로 설명하고, 적절하게 유도체화된 표면 영역들에 대한 비드들의 바인딩의 EM 이미지; 비-유도체화된 표면 영역들 상의 비드들의 부존재를 나타내는 EM 이미지; 유도체화된 표면 영역에 바인딩된 비드들의 AFM 이미지; 및 표면-바운드 금 비드들에 대한 기능적 분자 바인딩 어세이를 포함한다.
도 43 은 접착성 표면 상에 디포짓팅된 금 비드들의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 비드들은 직경이 대략 5 nm 내지 10 nm 인 금 나노입자들이다. 접착성 표면은 나노스케일 폴리머 매트릭스 (Anteo Diagnostics, Inc. 로부터의 Mix & GoTM) 를 이용하여 아주 다양한 재료 표면들을 편리하게 바인딩하는 상업적으로 이용가능한 "분자 풀 (molecular glue)" 로 유도체화된 실리콘 웨이퍼이다. 디포지션 완충재 사용들은 카보네이트 완충재이다. 이미지는, 효율적인 디포지션을 나타내는, 고 밀도로, 표면에 부착된 비드들을 보여준다.
도 44 는 비-유도체화된 실리콘 표면에 대해 접착성인 금 비드들을 포함하는 제어 샘플의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 이것은, 표면 바인딩을 안내하기 위한 적절한 유도체화 없이 그리고 적절한 디포지션 완충재 없이 비드들의 표면 부착의 매우 낮은 바탕 레벨이 존재하는 것을 나타낸다. 따라서, 표면의 패터닝된 유도체화는 비-유도체화된 영역들 상의 디포지션 없이, 패터닝된 영역들에 대한 비드 바인딩을 정밀하게 지도하기 위해 사용될 수 있다.
도 45 는 유도체화된 접착성 표면 상에 디포짓팅된 금 비드들의 원자간력 현미경 (AFM) 이미지들을 도시한다. 비드들은 직경이 대략적으로 5 nm 내지 10 nm 인 금 나노입자들이다. 접착성 표면은, 나노스케일 폴리머 매트릭스 (Anteo Diagnostics, Inc. 로부터의 Mix & GoTM) 를 이용하여 매우 다양한 재료 표면들을 편리하게 바인딩하는 상업적으로 이용가능한 "분자 풀" 로 유도체화된 실리콘 웨이퍼이다. 디포지션 완충재 사용들은 카보네이트 완충재이다. 이 이미지는 나노미터 분해능의 토포그래피로 표면 구조를 보여준다. 밝은 백색 영역들은 표면에 부착된 금 나노입자들의 농도들이다.
도 46a 내지 도 46d 는 표면에 바인딩된 금 비드들의 기능적 테스팅을 나타낸다. 데이터는, 바인딩된 비드들이 비드들에 대한 특정 친화도로 단일 분자들을 바인딩하기 위한 기능성을 보유하는 것을 나타내고, 이에 의해, 분자 자기 조립 사용들을 위한 적합성을 보여준다. 도 46a 내지 도 46d 는 상기 본 명세서에서 논의된 방법을 통해 웰들 내로 바인딩된 금 비드들로 웰 플레이트에서 수행된 ELISA 어세이의 상세들을 나타낸다. 이 어세이에서, 사전-수행된 5 nm 금 비드들에 대한 특정 바인딩을 가지도록 쥐에서 일으켜진 항체들 (PAS 18037-18041) 은 Mix & GoTM (Anteo Diagnostics, Inc.) 유도된 접착성 표면을 갖는 ELISA 플레이트의 웰 바닥들에 부착된, 동일 배치로부터의 비드들에 대한 바인딩 친화도에 대해 평가된다. 도 46a 는, 행들에서 표시된 다양한 희석제들에서, 완충재, 친화도 항체들, 나이브 (
) 혈청, 및 제어 비-특정적 쥐 IgG 의 삼중 열 반복들로, 웰들 내로 디포짓팅된 금 나노입자들의 다양한 농도들을 전개하는 플레이트 맵을 도시한다. 도 46b 는 ELISA 플레이트로부터의 최종 판독치들의 컬러 코딩된 강도 맵이다. 도 46c 는 수치적 ELISA 판독치들의 대응하는 테이블이다. 마지막으로, 도 46d 는, 표면 상에 디포짓팅된 비드 농도들의 전체 범위에 걸쳐, 특정 친화도를 갖는 항체가 다양한 제어들보다 표면 비드들보다 더 큰 바인딩을 갖는 것을 보여주는, 그래픽 형태로 요약된 최종 데이터 결과들을 나타낸다. 이것은, 비드들이 ELISA 어세이의 엄격한 바인딩 및 세척 조건들을 거쳐 표면에 바인딩된 채로 유지되고, 또한, 관심대상의 분자 (여기서 특정 IgG 항체) 에 대해 미리 확립된 특정 분자 바인딩 특성들을 보유하는 것을 보여준다.
예 8
분자 전자 센서들을 이용한 핵산 분석
이 예는 분자 전자 센서들을 이용하여 핵산들, 그리고 구체적으로 DNA 또는 RNA 를 시퀀싱하는 방법들을 교시한다. 이러한 센서의 일 실시형태가 도 47 에서 예시되고 이하에서 논의된다.
DNA 의 시퀀스의 결정은 생물학적 연구에서, 및 유전학의 생물의학적 및 헬스케어 애플리케이션들에서 근본적으로 중요한 측정 프로세스이다. DNA 의 구조 및 분자 생물학에서의 그것의 기본적인 역할은 1953 년에 Watson 및 Crick 에 의해 처음 설명된 이후로, 주어진 DNA 분자를 구성하는 핵산 염기들의 시퀀스를 결정하기 위한 효율적인 방법들을 개발하는데 주요한 초점이 맞춰졌었다. 태생의 DNA 분자는 상보적 가닥들로 형성된 이중 가닥 나선이고, 이들의 각각은, 통상적으로 A, G, T, 및 C 로서 표시되는, 4 개의 핵산 염기들로 구성된 바이오폴리머이다. DNA 를 시퀀싱하는 것은 이 폴리머에서 이들 핵산 염기들의 정확한 시퀀스를 결정하는 것이다. DNA 시퀀스를 결정하기 위한 처음 일반적인 방법은 1977 년에 Sanger 에 의해 도입되었다. Hood 및 다른 사람들의 작업을 통해, 이 Sanger 시퀀싱 프로세스를 수행하는 자동화된 머신들이 늦은 1980년대 말에 개발되고 상업화되었다. 이들 기구들은 인간 게놈 프로젝트에 힘을 실어줬고, 이 프로젝트는 1억 달러 초과의 총 시퀀싱 비용으로, 2001 년에 인간들에 대한 레퍼런스 시퀀스를 결정하였다. 이 작업의 과정에서, 보다 효율적인 DNA 시퀀싱 방법들을 개발하기 위한 실질적인 노력들이 있었다. 2004 년에, 이것들 중 처음의 것은 대량 병렬 시스템들이 Rothberg 에 의해 도입되고 상업화되었다. 후속하여, 단일 DNA 분자들을 분석하거나, 진행성 효소들의 속도로 실시간으로 빠르게 분자들을 분석하거나, 또는 전자 반도체 칩 센서 디바이스들을 이용하여 DNA 시퀀스를 감지할 수 있는 것들을 포함하는, 몇몇 다른 대량 병렬적 시퀀싱 플랫폼이 도입되었다. $1000 아래로 인간 게놈을 시퀀싱할 수 있는 시스템들이 또한 2014년에 상업화되었다. 이러한 거대한 진전에도 불구하고, 시퀀싱 기술이 더 빠르고 더 싸게 될, 그리고 시퀀스의 보다 낮은 에러들, 더 긴 연속적 판독들의 형태로 보다 높은 품질의 시퀀스 데이터를 제공하거나 RNA 또는 변형된 염기들을 판독하기 위한 여전히 실질적인 잠재성이 존재한다. 기구들이 더 작고 또는 휴대가능하며, 보다 강건하고, 비용이 덜 들며, 대량-생산가능하게 될 실질적인 잠재성이 또한 존재한다. 또한, RNA 분자들의 시퀀싱, 그리고 도 48 에서 도시된 메틸화된 뉴클레오티드들과 같이, 자연스럽게 발생하는 DNA 에서 존재할 수도 있는 변형된 뉴클레오티드들의 시퀀스를 결정함에 있어서, 관심대상의 관련된 문제들이 존재한다. 이들 통상적으로 발생하는 메틸화된 형태들이 DNA 에서 존재할 때, 이것은 생물학적 관련성을 가질 수도 있으므로, 시퀀스에서 그들의 존재를 역시 판독해낼 수 있는 것이 바람직하다. 보다 일반적으로, DNA 가 변형된 또는 유사 뉴클레오티드들, 또는 손상된 염기들을 포함하는 경우에, 존재하는 표준 염기들의 것과 관련하여, 이들의 시퀀스를 역시 결정하는 것이 바람직할 수도 있다.
분자 일렉트로닉스의 분야가 1940년대 및 1950년대에 분자들에서의 전자 이송 및 분자 결합들의 이론에 대한 기본적인 작업의 수렴, 및 1959년에 Feynman 에 의해 옹호된 바와 같은 나노테크놀로지의 출현으로부터, 1970년대에 출현하였다. 중심 전제는, 개별 분자들이 정류자들, 스위치들 또는 센서들과 같은 회로 컴포넌트들로서 작용하는, 나노-스케일 전자 회로들에서의 중요한 컴포넌트들을 형성할 수 있다는 것이다. 이것의 고유한 가치는, 그것이 소형화 및 저 전력 회로에서의 궁극을 가능하게 하였다는 점이다. 추가적인 가치는, 개별 분자들이, 그들의 분자적 상호작용들을 통해, 그리고 특히 개별 분자들의 감지 특성들에 대해, 센서들로서의 고유 특성들을 가질 수 있다는 점이다. 이들이 고도로 복잡한 그리고 특정적 분자적 상호작용들을 진화시켰음에 따라, 단백질들 또는 효소들과 같은 바이오분자들을 이용하여, 바이오-센싱의 영역에서 이것은 특히 참이다.
원자 전자 디바이스들에 관한 초기 작업은 1970년대에 시작하였지만, 1990년대말 및 2000년대 초에서만 나노-엔지니어링의 상태가 컴포넌트로서 단일 분자와 통합된 회로들의 특성들의 확장적인 조사를 시작하기 위해 필요한 정도의 정교함에 도달하였다. 통상적으로, 이러한 분자는 전극들 사이의 브릿지로서 회로 내로 통합되어, 전압이 인가될 수 있도록 한다. 센서로서의 애플리케이션을 위해, 이러한 브릿지 분자는 그것이 타겟 피분석물들과 상호작용함에 따라 그것의 전도 특성들을 변경할 것이다. 부과되는 게이트 필드를 통해 분자의 감지 특성들을 추가로 튜닝하기 위해 인가되는 "게이트" 전압이 추가로 존재할 수도 있다.
이 예의 목적은 분자 전자 센서 디바이스들을 이용한 DNA 시퀀스의 결정 및 관련 핵산 분석들을 보여주기 위한 것이다. 이것은, 이 목적을 위해 유용한 특정 디바이스 실시형태들, 및 DNA 또는 RNA 분자들의 시퀀스를 결정 또는 특성화하기 위해 이러한 디바이스들을 이용하는 방법들을 포함한다.
본원에서는 핵산 분석을 위해 유용한 분자 일렉트로닉스 센서의 2 개의 일반적 형태들이 교시된다. 이것은, 소스 및 드레인 전극들, 및 추가적인 전압 제어를 위한 게이트 전극을 갖는 3 단자 디바이스 내로 결합되는, 어떤 형태의 타겟 핵산을 프로세싱하는 효소 (태생의 또는 증강된 특성들을 갖도록 조작된) 로 이루어진다. 하나의 선호되는 개략적 실시형태가 도 1 에서 도시되고, 여기서, 효소 (105) 는 프라이머리 회로 엘리먼트로서 안에 결합되고, 전체 회로는 (인가되는 전압들 하의 회로에서의 전류, 또는 인가되는 전류들 하의 전압과 같은) 전기적 특성을 측정하는 계측기로 구성되고, 여기서, 측정된 트레이스는 그에 의해, 효소 (105) 와 계합된 DNA 분자 (108) 의 시퀀스에 관련된다. 이러한 구성은, 효소-DNA 입체구조들이 복합체를 통해/주위로 전하의 전도를 실질적으로 변경할 때 선호된다. 이러한 상황에서, "효소" 의 개념은, 기저 DNA 시퀀스에 관련될 수 있는, DNA 분자와의 상호작용의 검출가능한 신호들을 생성하는 임의의 분자이도록, 분자 생물학에서의 엄격한 의미보다 더 넓을 수도 있다.
이 예의 맥락에서, 도 47 은 DNA 시퀀스를 측정하기 위한 분자 전자 회로의 하나의 선호되는 형태의 개략도를 나타낸다. 인가되는 소스-드레인 및 게이트 전압들 하의 전류, 또는 (일정한 인가되는 전류에서의 전압과 같은) 유사한 시스템 특성들과 같은 전기적 특성을 측정하기 위한 계측기를 포함하는 회로를 형성하기 위해 효소가 소스 및 드레인 전극들 사이에 결합된다. 시간 트레이스로서 측정된 특성 S(t) 는, DNA 상의 효소의 진행성 작용, 및 이 프로세싱 동안 전기적 컴포넌트로서의 그것의 가변적 특성들로 인해, DNA 의 기저 시퀀스를 반영한다.
도 49 는 프라이머리 전도성 엘리먼트에 대한 전도성 및 게이팅 활성 양자를 가질 수 있는 세컨더리 또는 병렬적 회로 엘리먼트로서 효소가 그 안에 결합되는 다른 선호되는 개략적 실시형태를 나타내고, 여기서, 전체 회로는 (인가되는 전압들 하에서의 회로에서의 전류, 또는 인가된 전류 하의 전압과 같은) 전기적 특성을 측정하는 계측기로 구성되며, 여기서, 측정된 트레이스는 그에 의해 효소와 계합되는 DNA 분자의 시퀀스에 관련된다. 구성은 보다 표준의 소스-드레인-게이트 기하구조에서 실현된다. 이 구성은, 효소-DNA 입체구조 변화들이 시퀀스-종속성 게이트 전압들을 인가하는 다른 게이트 전극으로서 주로 작용하는, 프라이머리 전도성 엘리먼트에 가변 게이팅 전압들을 인가할 수 있을 때 선호된다. 이러한 맥락에서, "효소" 의 개념은, 기저 DNA 시퀀스에 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있는, DNA 분자와의 상호작용의 검출가능한 신호들을 생성하는 임의의 분자이도록, 분자 생물학에서의 엄격한 의미보다 더 넓을 수 있다.
도 50 은 DNA 시퀀스를 측정하기 위한 분자 전자 회로의 다른 선호되는 형태의 개략을 나타낸다. 효소가 게이팅 기능 및 전도를 제공할 수도 있는 회로를 형성하기 위해, 효소는 소스 및 드레인 전극들 사이에 프라이머리 전도성 엘리먼트에 대해 세컨더리 엘리먼트로서 결합된다. 회로는 인가되는 소스-드레인 및 게이트 전압들 하의 전류, 또는 (일정한 인가되는 전류에서의 전압과 같은) 유사한 시스템 특성들과 같은 전기적 특성을 측정하기 위한 계측기를 포함한다. 시간 트레이스로서 측정된 특성 S(t) 는, DNA 상의 효소의 진행성 작용, 및 이 프로세싱 동안 전기적 컴포넌트로서의 그것의 가변적 특성들로 인해, DNA 의 기저 시퀀스를 반영한다.
도 51 은, 근접성, 및 잠재적으로 전기적 접속을 보정하기 위한 하나의 수단으로서, 브릿지에 효소를 결합하는 결합 포인트 또는 접합 기, 및 프라이머리 전도성 엘리먼트로서 전극들 사이의 분자 브릿지, 및 반도체 디바이스들로부터의 소스-드레인-게이트 기하구조를 갖는 보다 설명적인 선호되는 실시형태로 도 1 의 개략도를 나타낸다.
분자 전자적 시퀀싱 감지 디바이스들의 이들 일반적 부류들을 교시하였고, 우리는 이제 시퀀스를 측정 또는 특성화하기 위해 이들을 이용하는 특정의 선호되는 실시형태들 및 방법들을 교시한다.
도 52 에서 도시된 하나의 선호되는 실시형태에서, 효소는 폴리메라제이고, DNA 분자는 프라이밍된 단일 가닥이고, 효소의 진행성 작용은 용액에서 dNTP 들로부터의 상보형 가닥의 합성이다. 폴리메라제는 dNTP 들을 포함하는 적합한 완충재가 존재하는 것을 가정하여, 프라이밍된 단일 가닥형 DNA 템플릿을 연장하고 있다. 통합 프로세스 (도 52 에서 도시된 바와 같이 A 뉴클레오티드의 통합) 는 측정된 전류 트레이스에서 대응하는 식별가능한 피처를 생성하고, 이에 의해 시퀀스를 결정한다. 전류와 같은 측정되는 회로 파라미터는 모니터링되고, 어느 염기가 통합되는지를 결정하고, 이에 의해 비동시적 방식으로 템플릿 DNA 의 시퀀스를 결정하기 위해 특정 트레이스 피처들이 사용될 수 있다. 하나의 선호되는 실시형태에서, 소스-드레인 및 게이트에 대한 일정한 인가되는 전압들 하에서, 전류가 모니터링되고 있다. 다른 선호되는 실시형태에서, 측정되고 있는 회로 파라미터는, 소스-드레인 전압 또는 게이트 전압을 스위핑 (sweeping) 함으로써 획득된 I-V 특성일 수도 있고, 이 I-V 곡선은 고 주파수로 반복적으로 측정될 수도 있어서, 어느 염기가 통합의 프로세스에 있는지 완전한 I-V 곡선이 획득될 수 있을 것이다. 다른 선호되는 실시형태에서, 교류에 대한 응답이 측정된 회로 파라미터로서 사용될 수 있을 것이고, 이 펄싱은 의문의 염기가 통합을 겪고 있는 동안 정보를 획득하기 위해 충분히 높은 주파수로 수행된다.
도 53 에서 도시된, 다른 선호되는 실시형태에서, 시퀀싱은, 통합이 검출가능한 신호를 생성할 때 수행될 수 있지만, 통합되는 염기의 아이덴터티를 반드시 결정할 필요는 없다. 이 시나리오에서, 오직 하나의 염기만을 포함하는 시험적 용액들이 예를 들어 A 의 시도, 세척, C 의 시도, 세척, G 의 시도, 세척, T 의 시도, 세척, 그리고 반복과 같이, 세척/플러싱에 의해 순차적으로 추가되고, 분리될 수 있고, 특정 염기 시도 동안 관찰되는 결과적인 신호들은 그 염기 중 하나 이상의 통합을 나타내고 그리고 그것에 대해 대응하는 시퀀스를 나타낸다. 무한히 반복되는 이 시험적 프로세스는 반-동시적 방식으로 시퀀스를 결정한다.
본원에 추가로 개시된 것은, 상기 2 가지 시퀀싱 방법들의 다른 변형이고, 여기서, 가역적 완결부 뉴클레오티드가 ddNTP 디데옥시 완결부들의 용액에 대한 노출에 의해 제 1 페이즈 (phase) 에서 통합되고, 다음으로, 제 2 페이즈가 이어지고, 여기서, 회로 감지가 후속 뉴클레오티드 노출들에서 계속되고, 폴리메라제의 바인딩 포켓에 뉴클레오티드들이 일시적으로 존재하지만 존재하는 완결부로 인해 통합되지 않는 동안의 신호들을 수집한다. 이들 노출들은, 모든 dNTP 들의 혼합물에서 (A/C/G/T 가, 그것들이 폴리메라제 바인딩 포켓에 상주할 때, 구분가능한 트레이스들을 가질 때 선호됨) 또는 개별적 A, C, G, T 용액들에 대한 시험적 노출에서 (바인딩 포켓에서 상주의 신호들이 염기들 사이에서 구분가능하지 않을 때 선호됨) 행해질 수도 있다. 어느 경우에도, 이러한 신호들은, 포켓에서 정확하게 페어링된 염기, 대 포켓에서 부정확하게 페어링된 염기 사이에 다소 검출가능한 방식으로 상이할 것이고, 비록 완결부로 인해 어느 것도 통합될 수 없음에도 불구하고, 정확하게 페어링된 뉴클레오티드들이 부정확하게 페어링된 뉴클레오티드들을 행하는 것보다 바인딩 포켓에서 상이한 상주 특성들을 갖는다는 사실을 반영한다. 충분히 긴 시간에 걸친 이러한 노출 또는 노출들로부터 신호 정보를 수집하는 것으로부터, 정확하게 페어링된 염기의 식별이 포켓 내 스파이크들의 지속기간과 같은 신호 차이들로 인해 달성된다. 이 시점에서, 완결부는 역 반응을 통해 제거되고, 다음 완결된 염기가 통합되고, 프로세스는 반복된다. 이러한 방식으로, 시퀀스가 결정된다. 데이터는 임의적으로 긴 시간 동안 수집될 수 있기 때문에, 충분히 많은 차별적 신호를 축적함으로써, 정확한 다음 염기에 관한 임의의 요망되는 레벨의 확실성을 달성하는 것이 가능하다.
전술한 방법들에서, 타겟팅되지 않은 또는 타겟팅된 시퀀싱 중 어느 일방을 달성하기 위해, 상술된 바와 같이, 유사한 타겟팅되지 않은 또는 타겟팅된 프라이밍 (priming) 이 사용될 수도 있음이 교시된다.
추가적으로 개시되는 것은, 상기 일반적인 시퀀싱 방법들은 이하에서 전개되는 바와 같이 다양한 방법들에 의해 강화될 수 있다는 것이다.
뉴클레오티드들
도 54 및 도 55 에서 나타낸 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드들은, 통합의 검출, 또는 상기 방법들에서의 통합을 겪는 상이한 염기들의 구별 중 어느 일방을 강화하는, 구별가능한 또는 검출가능한 신호들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 감마 포스페이트 상의 그룹들을 갖는 뉴클레오티드들은 일시적으로 구별가능한 신호들을 생성하기 위해 사용될 수 있고, 여기서, 강화 그룹은 폴리메라제 통합 프로세스의 과정에서 쪼개진다. 특히, 이 개시물은, 측정된 전류 신호 강도 또는 피처들을 강화하는 국지적, 일시적 전계-효과 게이팅을 생성하기 위해 하전된 기들이 사용될 수 있는 것을 교시한다. 이 개시물은 또한, 제거가능한 검출가능 기를 가지는 뉴클레오티드들이 시험적 통합 방식으로 사용될 수 있고, 각각의 이러한 시험적 통합 후에, 다수의 검출 단계, 및 그 다음에, 검출가능한 기를 제거하기 위한 단계가 존재할 수도 있음을 교시한다. 이 개시물은, 이러한 기들이 하전된 기들일 수 있을 것이고, 검출은, 아마도 저 전도성 완충재, 또는 검출가능한 기를 활성화시키는 완충재와 같은, 검출을 용이하게 하는 상이한 완충재의 존재 하에, 전류, 또는 특정 인가된 전압들, 전압 스윕들, 또는 AC 전압들에 대한 응답과 같은 회로의 전기적 검출 특성들을 이용하는 것일 수 있음을 교시한다. 이 개시물은, 이러한 변형된 뉴클레오티드들이 또한 완결부 기를 또한 포함할 수 있을 것이고, 그 다음에, 시퀀싱 프로세스는 각각의 통합 및 검출 단계가 완료된 후에 완결부 및 검출가능한 기의 합성, 및 쪼갬에 의해 가역적 완결부 시퀀싱의 방식으로 행해질 수 있음을 교시한다.
또한, 교시된 방법들에서, 시스템 실시간 전기적 파라미터들에 의해 모니터링되는 바와 같은 통합의 키네틱스가 각각의 통합된 염기를 식별하기 위해 사용될 수 있도록, 구별가능한 키네틱 시그니처들을 가지도록 상이한 뉴클레오티드들이 준비될 수 있을 것이다. 특히, 상이한 키네틱 시그니처들은 용액에서의 상이한 뉴클레오티드들의 상이한 농도, 또는 통합 키네틱스를 변경하는 그것들에 대한 변형들로 인한 것일 수 있을 것이다. 키네틱 시그니처들은 도 56 에서 나타낸 바와 같이 통합 스파이크의 높이 또는 폭, 또는 통합 스파이크들 사이의 시간-간격을 포함할 수 있을 것이다.
도 56 은 시퀀스 정보의 키네틱 인코딩을 도시한다. 통합 스파이크들 사이의 시간은 통합되고 있는 염기를 나타내었고, 여기서 dNTP 농도들 사이의 차이에 대해 행하는 것은 다음과 같은 것을 나타낸다: A 가 최저 농도이고, 따라서, 스파이크들 사이의 긴 시간은 A 통합을 위해 예상되는 대기 시간을 나타내는 한편, G 는 최고 농도여서, 스파이크들 사이의 최단 시간은 G 통합을 나타낸다 (제 1 간격).
효소
추가로 개시되는 것은, 폴리메라제 효소가 생성되는 신호들을 강화하기 위해 단백질 조작 (protein engineering) 에 의해 변형될 수 있다는 것이다. 이것의 하나의 선호되는 실시형태는, 그것의 표면 상에서 하전된 아미노산기들을 배치하는 것이고, 이는, 효소가 입체구조를 변화시키고 대응하여 국지적 전계 구조를 변화시킴에 따라 전류 변동들을 유도할 수 있다.
회로 파라미터들
추가로 개시되는 것은, 게이트 전압이 통합 또는 염기 식별의 이들 신호들을 최대로 강화하기 위해 설정될 수 있다는 것이다. 우리는, 인가된 AC 전압 또는 전압 스펙트로스코피 또는 특정 인가된 전압 파형들에 대한 응답이 통합의 검출, 또는 염기 식별을 강화하기 위해 사용될 수 있음을 교시한다. 특히, 게이트-드레인 전압, 및/또는 게이트 전압은, 특정 뉴클레오티드 (태생의 또는 변형된) 가 상주하는, 통합 하에서, 통합되는, 또는 프로세스의 검출 프로세스를 겪는 시간 동안 시스템에 대한 I-V 특성들을 획득하기 위해 스위핑될 수도 있다. 이러한 I-V 특성은 어느 염기 또는 염기들이 존재하는지를 결정할 수 있다.
완충재
추가로 개시되는 것은, 염들 및 뉴클레오티드들을 일반적으로 포함하는, 이 프로세스에서 사용되는 완충재가 신호들을 생성하기 위해 최적화될 수 있다는 것이다. 특히, 완충재는, 예를 들어, 완충재 이온들에 의해 운반되는 전류로부터의 노이즈를 감소시키기 위해서, 또는 Debye 길이 및 전계들이 용액을 통해 침투하는 대응하는 범위를 증가시키기 위해서, 실질적으로 희석될 수도 있다. 이러한 희석된 완충재에서, 우리는 또한, 통합될 dNTP 들이, 용액에서의 마그네슘 이온들의 비교적 낮은 농도를 유지하면서 폴리메라제에 대한 그것들의 이용가능성을 증가시키기 위해, 사전-착체화될 수 있을 것이라는 것을 교시한다.
브릿지
추가적인 선호되는 실시형태들이 도 57 및 도 58 에서 예시된다. 도 57 은, 티올 링키지 (DNA 단부들에서의 티올화된 뉴클레오티드들, 또는 알파 나선 말단들에 배치된 시스테인) 를 통해 금 컨택들에 결합된, 그리고 효소에 접합되는 스트렙타비딘에 대한 결합을 위해, 특정적으로 합성된 내부 바이오틴을 갖는 나선형 폴리머 (dsDNA 또는 단백질 알파 나선) 를 포함하는 브릿지의 선호되는 실시형태를 나타낸다. 도 58 은, 전극 상의 컨택 포인트들에 대한 특정 친화도 (프라이머리 컨택 포인트 재료, 또는 표면의 항원 유도체화에 대한 친화도) 를 갖는 IgG 단백질 (태생의 또는 조작된) 로서 브릿지의 다른 선호되는 실시형태를 나타내고, 그렇지 않은 경우 관심대상의 단백질에 접합되는 (안티-IgG 항체, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은) IgG 특정적 바인딩 단백질들을 통한 결합을 가지고, 또는 관심대상의 단백질은 태생의 또는 조작된 접합 사이트들을 이용하여 IgG 에 직접 접합될 수 있을 것이다. 브릿지 분자는 분자의 단부에서 티올화된 뉴클레오티드들을 통해 전극들 상의 금 컨택 비드들에 결합된, 이중 가닥형 DNA 분자이다. 그 결합은, 다시 폴리메라제에 접합될 수 있을 스트렙타비딘에 접합될 수 있는, DNA 에 대해 내부의 바이오틴부착된 뉴클레오티드를 이용함으로써 달성된다. 유사하게, 브릿지는 단백질 알파-나선일 수 있고, 그 외에 유사하게 결합 및 링크될 수 있다. 브릿지의 다른 선호되는 실시형태는, 소스 및 드레인 상의 컨택 포인트들에 대한 적합한 특정 친화도를 갖는, 그리고 도 58 에서 나타낸 바와 같이, 폴리메라제에 접합되는 (안티-IgG, 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은) IgG-바인딩 단백질에 의해 매개되는 결합을 갖는, (태생의 또는 조작된) IgG 항체 분자이다.
복제 및 통합
도 59 에서 예시된 바와 같이, 상기한 것과는 상이한 특정 실시형태들로 수행되는 독립적 시퀀싱 런들로부터 획득된 그 데이터는 부분적으로 획득된 정보로부터 완전한 시퀀싱 정보를 생성하기 위해 통합될 수도 있다. 도 59 는, 완전한 정보를 달성하기 위해, 기술된 방법들의 상이한 실시형태들을 이용하여 동일한 (또는 복제된) DNA 템플릿들의 복제 시퀀싱으로부터 부분적 시퀀스 정보의 조합을 나타낸다. 청색 트레이스들은 (단일 시퀀싱 런에서 직접 관찰가능하지 않은) 조합된 정보의 회색 트레이스에 대한, 각각의 별개의 인스턴스로부터의 부분적 정보를 나타낸다. 여기서 나타낸 것은, (오직 A 염기들만이 검출될 수 있는 것으로 도시된) 부분적 정보를 생성하기 위해 템플릿이 시퀀싱되고 (좌측 실시형태), 그리고 다시, (브릿지 및 효소에 대한 변화를 나타내는, 우측 실시형태) 그 후에 완전한 시퀀스를 획득하기 위해 결합되는 (G, T, C 가 검출되는 것으로 도시된) 상보적 또는 보조적 시퀀싱 정보를 생성하기 위해, 템플릿이 시퀀싱된다. 2 개의 시퀀싱 실시형태들은 복제 템플릿들을 이용하여 물리적으로 또는 시간적으로 분리되고 독립적일 수 있을 것이고, 또는, 동일한 템플릿을 재판독하여 - 아마도 완충재 변화, 온도 변화 또는 게이트 전압과 같은 인가된 전압들에서의 변화에 의해 생성된 - 상이한 시간들에서 동일한 센서 시스템의 상이한 상태들일 수 있을 것이다. 임의의 수의 이러한 상보적 실시형태들이 최종 시퀀스 결정을 향상시키기 위해 결합된 그것들의 정보를 가질 수 있을 것이다. 하나의 선호되는 실시형태에서, 이것은 완충재, dNTP 들, 온도, 인가된 전압들, 모니터링되는 회로 파라미터들, 계측 프로세스 등에 대한 변화들과 같이, 상이한 시스템적 조건들 하에서의, 동일한 센서-DNA 켤레일 수 있을 것이고, 여기서, DNA 템플릿은 몇몇 방식으로 (스트립 및 재연장, 동일한 가닥을 다시, 또는 상보형 가닥을 조사하기 위해 원형 또는 U 자형 템플릿들을 통한 판독) 재판독된다. 다른 선호되는 실시형태에서, 하나의 디바이스 제조는 단일 칩 포맷 상에 통합되는 (상이한 브릿지 분자들, 효소들 등, 또는 하나의 선호되는 실시형태에서, 상이한 인가된 전압들) 센서들의 다양성을 포함할 수도 있다. 병렬적으로, 상이한 센서들이 그들 각각의 DNA 의 카피들을 조사하도록, 다수의 복제 템플릿들 (클론들, 또는 PCR 복제들) 이 인가된다. 이들 독립적 센서 측정치들은 그 다음에, 조사 하의 템플릿에 대한 완전한 시퀀싱 정보를 획득하기 위해 통합된다. 하나의 선호되는 실시형태에서, 센서들은 그들의 제어된 특성들에서 실질적으로 동일할 수 있을 것이고, 다양성은 단지 센서 특성들 및 성능에서의 노이즈 또는 제어되지 않은 변동들을 평균화하는 수단을 제공한다. 다른 선호되는 실시형태에서, 상보적 검출 파워를 가지는 상이한 브릿지들 및 변형된 효소들은, 병렬적으로 상보적 정보를 생성하기 위해, 동일한 템플릿에, 그리고 시퀀싱 화학에서 동일한 프라이머리 용액들에 노출된, 하나의 칩 상에 전개될 수 있다. 다른 선호되는 실시형태에서, 의문의 센서는 그것의 템플릿을 보유하고, 이 템플릿은, 보다 완전한 시퀀스 정보를 달성하기 위해 통합될 수 있는, 부분적 시퀀스 정보의 상호적 획득들의 시간 상의 시리즈를 생성하기 위해, 상이한 조건들 (완충재들, 온도, 인가된 전압들, 회로 계측, dNTP 들의 농도들 또는 dNTP 들의 혼합물들 (태생의 또는 변형된)), 또는 상이한 시퀀싱 런들에서 상기와 같이 상이한 시퀀싱 방법들 하에서, (연장된 가닥의 스트립핑을 통해, 또는 원형 또는 U 자형 템플릿들의 사용을 통해) 적합하게 다수회 판독된다.
추가로 개시된 것은, 상기와 같은 시스템들은 또한 도 48 의 메틸화된 염기들과 같은, DNA 가닥에서 존재하는 다양한 변형된 뉴클레오티드들 또는 염기 유사물들을 구별할 수 있다.
상기 방법들에서, 통합 단계들은 획득된 신호들로부터 구별가능하지 않은 뉴클레오티드들을 수반할 수 있을 것이어서, 부분적으로 결정된 시퀀스 정보 결과들 (예컨대, 인가된 dNTP 혼합물이 {A, T} 에서와 같이 뉴클레오티드들의 서브셋트를 포함할 수 있을 것이다), 및 통합 스파이크는 따라서 그 서브셋트의 멤버가 통합된 것을 나타낸다. 이것은 부분적 시퀀스 정보를 산출할 수 있다. 이러한 정보는 상이한 부분적 관찰들과 양립가능한 기저 시퀀스를 추가로 결정하기 위해, 상술된 바와 같이 복제 시퀀싱을 통해 상보적인 방식들로 (상이한 뉴클레오티드 서브셋트들) 조합될 수 있다.
분자적 핑거프린팅
구별가능한 통합 스파이크에 부분적으로 또는 단독으로 기초하는 등과 같은 상기 방법들은 장 범위 분자적 핑거프린팅 (molecular fingerprinting) 을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 이 애플리케이션에서, 국지적 시퀀싱 정보를 생성하는 방법들 중 임의의 것이 국지적 시퀀싱 정보의 신장을 생성하기 위해 채용될 수 있다. 그 다음에, 모든 4 개의 dNTP 들이 추가되고, 시스템은 긴 시간 동안 자유롭게 통합하도록 허용되며, 그 시간 동안, 이 통합 페이즈에 의해 걸쳐지는 염기들의 수의 측정치를 제공하기 위해 통합 스파이크들이 검출되고 카운팅된다. 그 다음에, 이 페이즈는 예를 들어 dNTP 완충재를 제거함으로써 억제되고, 다른 국지적 시퀀스 피처를 결정하기 위해 국지적 시퀀싱 방법이 재개된다. 이 프로세스는 긴 DNA 템플릿의 범위에 걸쳐 반복될 수 있다. 결과적인 시퀀스 컨텍스트들 (Si), 및 그것들 사이의 염기 거리 (di) 가, 리스트 {S1, d1, S2, d2, S3, d3 ...} 로서, DNA 프래그먼트의 전체 구조를 식별하는 핑거프린트를 형성한다. 이 정보는, 중첩하는 프래그먼트들의 수집의 큰 스케일 구조적 맵핑을 위해, 또는 주어진 레퍼런스 게놈에 대한 이러한 맵핑을 위해 사용될 수 있다.
다른 선호되는 실시형태들에서, 효소는 시퀀싱되고 있는 대응하는 DNA 또는 RNA 템플릿을 갖는, RNA 폴리메라제 또는 역전사효소일 수 있을 것이다.
신호 프로세싱 및
시퀀스
분석 알고리즘들
신호 프로세싱 방법들은 획득된 신호로부터 시퀀스를 결정하는데 필요할 수도 있다. 이것은, 데이터의 트레이닝 또는 교정 트레이닝을 이용한 분류기 시스템의 트레이닝 또는 머신 트레이닝, 및 기저 시퀀스를 결정 또는 제한하기 위한 다양한 디컨볼루션 또는 분류 또는 은닉 마르코프 모델들의 사용을 포함할 수도 있다. 이 개시물은, 이들 방법들이 종종 전체 시퀀스 결정 프로세스의 필수 부분들임을 교시한다. 선호되는 실시형태들에서, 이것은 피처들을 세그먼트화하기 위해, 그리고 노이즈로부터 피처들을, 및 대안적 후보 시퀀스 엘리먼트들과 연관된 피처들 사이에서 구별/분류하기 위해 신호 프로세싱 방법들을 포함한다. 이 프로세스는, 스파이크들 사이의 시간, 스파이크 높이, 지속기간, 세그먼트화된 신호들 내의 서브-피처들로서의 이러한 피처들과 같은 파라미터들을 포함하는, 세그먼트화된 신호들로부터의 파라미터 추출을 포함할 수도 있다. 최종 시퀀스 결정 분석은 그 다음에, 기저 시퀀스의 모델들에 프로세싱된 신호들을 피팅하고 디컨볼루션하기 위한 알고리즘들, 및 데이터에 가장 잘 맞는 모델을 찾는 것, 및 이러한 맞는 것들에 신뢰도 레벨들 또는 확률을 할당하는 것을 추가로 포함할 수도 있다. 특히, 분석의 하나의 선호되는 실시형태에서, 원시 신호들을 노이즈제거하기 위한 프리-프로세싱, 및 원시 신호들의 세그먼트화, 및 원시 신호들의 정규화가 존재할 수도 있고, 그 다음에, 일반적으로, 기저 시퀀싱으로부터 생성된 신호들의 모델들이 존재하고, 기저 시퀀싱 후보들로부터 관찰된 데이터가 나오은 확률이 할당된다. 최대 우도 시퀀스가 그 다음에 결정될 수 있다. 다른 선호되는 실시형태에서, 관찰된 및 예측된 신호들 사이의 비용 함수적 측정된 차이의 최적화로서 시퀀스 예측이 정의될 수 있고, 최적화 이론의 방법들이 기저 시퀀스에 대한 이러한 공식화를 효율적으로 해결하기 위해 사용될 수도 있다.
상기 방법들은, 단지 프래그먼트의 길이, 또는 부분적 시퀀스 정보, 또는 수개의 가능한 시퀀스 그룹들 중 하나 내로 DNA 템플릿을 분류하기 위해 사용될 수 있는 정보와 같이, 완전한 시퀀스보다 덜 유용한 DNA 의 몇몇 특성을 측정할 수도 있다. 이것은 단일 염기 시퀀싱 또는 게노타이핑 (genotyping) 애플리케이션들을 포함한다. 이것은 또한, 미소부수체 마커 타이핑, 또는 타이핑 인델 폴리모피즘에서 사용되는 바와 같이 프래그먼트 길이 분석을 포함한다.
그렇게 획득된 시퀀스 정보는 에러들을 필터링하여 제거하고 기저 시퀀스를 결정하기 위해, 동일한 DNA 분자, 또는 그것의 복제들의 다수의 시도들로부터 조합될 수도 있다. 우리는, 이들 데이터를 조합함으로써, 제 2 가닥이 제거될 수 있을 것이고, 동일한 분자가 재시퀀싱될 수 있을 것임을 교시한다. 우리는, DNA 분자가 원형인 경우에, 정확도를 향상시키기 위해 그것은 선형으로 판독함으로써 반복적으로 시퀀싱될 수도 있고, 그것이 U 자형 형태를 가지는 경우에, 양 가닥들은 정확도를 향상시키기 위해 전방향 및 역방향 시퀀스 정보를 획득하기 위해 선형으로 판독될 수도 있음을 교시한다. 시퀀싱 기법들의 분야의 통상의 기술자에게 알려진 이들 및 다른 이러한 방법들은 본 발명들과 양립가능하다.
효소는 리가아제일 수도 있고, 시퀀스 정보를 도출하거나 그 시퀀스를 분류하기 위해 DNA 올리고들의 리게이션이 검출되고 사용된다. 동일한 분자에 대해 연속적으로 행해지든지 또는 상이한 라운드들에서 행해지든지 간에, 시퀀스를 결정하기 위해 연속적 리게이션의 다수의 라운드들이 사용될 수 있다. 리게이션의 신호들은 상기한 다양한 수단에 의해 강화될 수 있다.
효소는 예를 들어 도 60 에 대해 나타낸 바와 같이 엑소뉴클레아제 (exonuclease) 일 수 있고, 이에 의해, 염기들의 아이덴터티 또는 수가 그것들이 프로세싱되고 릴리스됨에 따라 검출된다. 제거 또는 염기 식별의 신호들은 상기한 다양한 수단에 의해 강화될 수 있을 것이다. 도 60 은 효소가 엑소뉴클레아제인 일 실시형태를 예시한다. 회로 파라미터들에 대한, 효소 입체구조, DNA 입체구조, 및 자유 뉴클레오티드들의 영향에 의해 신호들이 생성된다.
다른 실시형태들에서, 효소는 도 61 에서 나타낸 바와 같이 헬리카제일 수도 있고, 염기들의 아이덴터티 및 수는 그들이 헬리카제를 통과함에 따라 검출된다. 제거 또는 염기 식별의 신호들은, 특히 DNA 를 포함하는 뉴클레오티드들의 변형, 또는 헬리카제에 대한 조작된 변경들을 포함하는 상기한 다양한 수단에 의해 강화될 수 있을 것이고, 도 61 은 진행성 효소가 DNA 헬리카제이고, 이중 가닥형 DNA 템플릿을 푸는 일 실시형태를 나타낸다.
효소는 또한, 도 62 에서 도시된 바와 같이, 단백질 나노포어를 포함할 수도 있다. 도 62 는, 효소가 DNA 전치 능력을 갖는 운동 단백질 효소 및 단백질 나노포어로 형성된 복합체인 실시형태를 나타낸다. 특히, 그것은 DNA 전치 기능 (예컨대, 헬리카제, 폴리메라제, 또는 바이러스성 운동 단백질) 및 단백질 나노포어와 진행성 효소의 복합체일 수 있을 것이다. 이 실시형태에서, 시스템 전류 또는 다른 전기적 파라미터들 또는 응답에서의 변화들은 나노포어를 가로지르는 염기들을 반영한다. 디컨볼루션 방법들은 기저 시퀀스를 재구성하기 위해 사용될 수 있다. DNA 가 이러한 맥락에서 원형인 경우에, 향상된 정확도를 위해 동일한 분자가 반복적으로 판독될 수 있다. 염기 식별의 신호들은 상기한 다양한 수단에 의해 향상될 수 있을 것이다.
시퀀싱 화학의 분야에서의 통상의 기술자는 또한, 향상된 시퀀싱 결과들을 생성하기 위해 본 발명의 상기 엘리먼트들 중 많은 것들을 어떻게 결합할지를 이해한다.
모든 상기한 방법들은, 대량의 제조가능한 디바이스들 상에서의 많은 DNA 프래그먼트들의 대량의 병렬적 시퀀싱을 달성하기 위해, 대량의 병렬적 방식으로, 이러한 센서들의 어레이를 포함하고 측정 회로 및 데이터 독출 회로를 지원하는, 도 63 에서 나타낸, 센서 어레이 집적 회로 칩 상에서 수행될 수 있다. 도 63 은 집적된 칩 센서 어레이 디바이스를 나타낸다. 이러한 포맷은, DNAS 프래그먼트의 복제들에 대한 시퀀스 데이터의 강건한 평균화 또는 데이터 통합을 위해, 동시에 많은 시퀀스들로부터 시퀀스의 대량의 병렬적 감지, 및 각 사이트에서 다양한 또는 동일한 센서 구성들을 전개하는 옵션을 수행하기 위한 방식을 제공한다. 특히, 전체 센서는 10 nm 치수들을 갖는 나노-스케일 디바이스일 수 있고, 측정 지원 일렉트로닉스는 14 nm 의 또는 미만의 CMOS 반도체 노드들을 이용하는 것이 요망되는 경우에 국지적으로 집적될 수 있어서, 칩 상의 집적된 센서들의 초 고 밀도 어레이를 허용한다. 이것은 표준 치수들의 단일 칩 (즉, 단일 스텝퍼 노광 영역) 상에 10,000,000 까지의 센서들을 가능하게 할 수 있을 것이다. 또한, DNA 분자들의 클론의 또는 복제의 개체군이 이 포맷으로 적용되는 경우에, 도 59 에서 그리고 상기 설명된 바와 같이 다양하거나 동일할 수 있을 센서들의 어레이에 대하여, 동일한 분자의 다수의 판독들이 훨씬 보다 정확한 시퀀싱 결과를 생성하기 위해 시퀀싱에서의 에러들을 필터링하여 제거하기 위해 조합될 수 있다.
센서 어레이들에 대한 다중-사이트 분석
다수의 사이트들에서 프라이밍된, 긴 단일-가닥형 DNA 프래그먼트는, 설명된 시퀀싱 방법들 중 임의의 것을 이용하여, 상이한 센서 로케이션들에서 폴리메라제 효소들에 의해 캡처되는 다수의 프라이밍된 사이트들에서 개시된 시퀀싱, 및 이러한 센서 어레이에 대해 도입될 수 있을 것이다. 이것은 긴 프래그먼트로부터 동시에 다수의 시퀀싱 판독치들을 획득하기 위한 신규한 방식을 제공한다. 이것은 이러한 프래그먼트를 판독하는 것을 가속화하고, 또한, 변형들, 하플로타이핑, 또는 큰 스케일 구조적 분석의 페이징과 같은, 프래그먼트의 장 범위 구조를 조립하기 위해 사용될 수 있는 정보를 제공할 수 있다.
완결부
시퀀싱
완결부 시퀀싱에서, 디데옥시 완결부 ddNTP 및 dNTP 들의 혼합물이 공급되어서, (태생의 또는 신호를 강화하기 위해 변형된) dNTP 통합들로부터의 통합 신호 스파이크들이, 완결부가 통합될 때까지 (태생의 또는 추가된 검출 기를 갖는), 템플릿을 따른 염기 포지션 (포지션 1, 2, 3, ..., L, 여기서, L 은 염기들에서의 템플릿 길이) 의 카운트를 제공하도록 한다. 상기 완결부는 그 다음에, 검출 절차를 통해 조사되고, 이 검출 절차는, 상이한 검출 완충재, 온도의 사용, 또는, 선호되는 실시형태에서, 존재하는 ddNTP 를 식별하고 이에 의해 템플릿을 따른 지정된 포지션에서 염기를 식별하기 위해 전압 스윕들 또는 파형들 또는 AC 응답 또는 I-V 특성들의 사용과 같이, 동일 형태, 또는 상이한 형태의 감지일 수도 있다. 복제된 템플릿들이 공급된, 도 63 에서와 같은 센서 어레이 칩 상에서 바람직하게는 병렬적으로 수행되는, 많은 이러한 테스트 런들로부터의 데이터를 조합하는 것, 및 그 결과들을 어셈블링하는 것에 의해, 각각의 가능한 염기 로케이션 (1,2,3, ...,L) 에서의 염기의 아이덴터티가 결정되고 그에 의해 전체 시퀀스가 결정될 수 있다. 도 64b 에서 도시된, 완결부 시퀀싱의 다른 선호되는 실시형태에서, 별개의 반응들은 단지 ddATP 완결부들과 혼합된 dNTP 들을 이용한 런일 수 있고, 각각의 이러한 런은 그 반응이 dATP 대신에 ddATP 의 랜덤한 통합을 통해 종결되는 템플릿에서 A 염기의 포지션을 식별할 것이다. 많은 이러한 런들을 수행하는 것은 템플릿에서 모든 A 염기들의 로케이션들을 식별할 것이다. 이것은 바람직하게는, 하나의 병렬적 반응에서 모든 이러한 A-완결 데이터를 축적하기 위해 센서 어레이 칩 상에서 단일의 병렬적 반응 런에서 행해진다. 유사하게, C-, G-, 및 T- 완결을 위한 별개의 반응들이 각각 템플릿에서 이들 염기들의 로케이션들을 결정하기 위해 각각 수행되고, 모든 이러한 단일의 염기 완결 결과들의 조합은 전체 시퀀스를 결정할 것이다. 도 64a 는 완결부 시퀀싱 프로세스에서의 시험적 런을 나타낸다. dNTP 들 (청색) 및 디데옥시 완결부들, ddNTP 들 (보라색) 의 혼합물의 존재 시에, 중합 및 감지가 진행되어, 완결부가 랜덤하게 통합될 때까지, 나타낸 바와 같이 염기 포지션을 카운트하기 위해 (도시된 포지션 8 까지) 사용되는 통합 스파이크들을 생성한다. 반응의 종료 시에, 완결부 염기 (이 경우에, A) 를 식별하기 위해 감지 측정이 발생한다. 따라서, 기저 시퀀스는 포지션 8 에서 A 를 갖는다. 이 템플릿, 또는 복제 템플릿들에 대해 이러한 측정들을 반복하는 것, 및 그 정보를 조합하는 것에 의해, 템플릿을 따른 모든 로케이션들에서 염기들의 완전한 시퀀스가 결정될 수 있다.
이것의 선호되는 실시형태는, 어레이 당 하나의 고 레벨 반응 런으로, 기저 템플릿 DNA 의 시퀀스를 효율적으로 결정하기 위해, 도 64c 에서 나타낸 바와 같이, A-, C-, G-, 및 T- 완결 반응들에 대해 각각 전용되는, 4 개의 센서 어레이 칩들을 이용하는 것이다.
혼성화에
의한 시퀀싱
추가적으로 개시되는 것은, 센서 구성의 특수한 경우를 이용하는, 혼성화에 의해 시퀀싱이고, 여기서, 부착되는 분자는 효소가 아니고, 오히려 브릿지에 속박되는 DNA 혼성화 프로브이고, 또는, 다른 선호되는 실시형태에서, 프로브는, 도 65 및 도 66 에서 예시된 바와 같이, 브릿지의 전부 또는 일부로서 작용한다. 보다 일반적으로, 브릿지 복합체는 이용가능한 혼성화 프로브를 포함하고, 많은 가능한 실시형태들이 존재한다. 이 경우에서의 센서 신호는, 타겟 DNA 단일 가닥에 대한 혼성화가 발생하였는지 여부를 나타낸다. 혼성화 프로세스에 의한 일반적으로 알려진 시퀀싱에서와 같이, 프로브들이 타겟 DNA 에 대해 혼성화를 행하거나 행하지 않는 총 데이터는, - 바람직하게는 도 63 에서와 같이 센서 어레이 상에서 병렬적으로 수행되는 - 많은 이러한 측정들에 기초하여, 무슨 가능한 기저 시퀀스들이 템플릿 시퀀스의 전체 결정까지 그 데이터와 가장 양립가능한지를 추론하기 위해 사용될 수 있다. 이 프로세스에서, 신호는 도 67 에서 나타낸 바와 같이 확장 반응들을 통해 강화될 수 있고, 여기서, 효소의 확장은 검출가능한 신호를 증가시키는 기들을 포함하는 하나 이상의 염기들 상에 통합할 수 있다. 또한, 부적절하게 페어링된 혼성체들에 대해 구별/불안정화하기 위해 게이트 전압을 이용하여 전자적 엄격성이 적용될 수 있어서, 오류의 혼성화 검출을 감소시킬 수 있다. 엄격성은 또한, 오류의 혼성화 검출을 제거하기 위해, 불완전체로부터 완벽한 페어링 (pairing) 을 구별할 수도 있는, 레코딩된 신호에 기초하는 것일 수도 있다. 추가적인 교시는, RNA 또는 핵산 유사물들 (LNA 들, PNA 들 등) 로 이루어진 프로브들, U 자형 구성들의 사용, 이노신 또는 다른 보편적 바인딩 프로브 염기들의 사용, 및 또한 특이성 측정들로서의 폴리메라제 확장 또는 리게이션과 같은 효소적 프로세싱과 같은, 엄격성을 증가시키기 위한 당해 기술분야에서의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법들이 또한 적용될 수 있다는 것이다. 칩 포맷에서, 혼성화에 의한 시퀀싱은 병렬적으로 수행될 수 있다. 용액에서 적용되는 검출가능한, 구별가능한 혼성화 프로브들의 조합적 셋트의 바인딩/리게이션, 또는 프라이머리 리게이션 프로브의 시퀀싱될 수 있는 확장의 다소의 수의 염기들과 함께, 칩 프로브들 상에 대한 프로브 혼성화의 조합은, 이러한 접근법의 시퀀싱 능력, 즉, 보다 많은 시퀀스 정보를 요구하기 위한 능력을 추가로 확장할 수 있다. 우리는 또한, 칩 상에서 특색없이 배치된 혼성화 프로브들이, 상기 프로브들 상의 검출가능한 라벨들을 포함하는 것에 의해, 또는 프로브들 상의 바인딩 바코드들을 디코딩하기 위한 조합적 바인딩 프로세스에 의해 디코딩되고 식별될 수 있음을 교시한다. 특히, 프로브들은 일련의 검출가능한 올리고 혼성체들에 의해 디코딩가능한, 조합적 DNA 바코드들을 운반할 수 있을 것이다. 프로브들은 이전의 광학적 촬상 프로세스에 의해 디코딩되는, 광학적 라벨들 또는 바코드들을 운반할 수 있을 것이다. 우리는 추가적으로, 센서 사이트들의 전자적 어드레싱이 직접적인 방식으로 혼성화 프로브들을 놓기 위해 사용될 수 있어서, 알려진 프로브들이 원하는 사이트들에 놓이도록 할 수 있을 것임을 교시한다. 우리는, 혼성화 프로세스를 가속화하기 위해 전압이 사용될 수 있고, 특히, 프로브에 대해 자유 DNA 템플릿들을 유인하기 위해 게이트 전압이 사용되어, 혼성화의 속도를 증가시키고, 필요한 템플릿의 양을 감소시킬 수도 있음을 교시한다.
추가적으로 교시되는 것은, 데노보 구조적 조립 또는 레퍼런스에 대한 구조적 조립을 위해, 긴 프래그먼트들의 대량의 병렬적 핑거프린팅을 수행하기 위해 상술된 분자적 핑거프린팅 시퀀싱 화학과 함께, 어레이의 사용이다.
상기 프로세스들에서 사용되는 프로브 분자들 또는 효소들은, DNA 와의 그들의 상호작용을 가능하게 하거나 강화하기 위해, 또는 그 상호작용을 불가능하게 하거나 금지하기 위해 중 어느 일방을 위해, - 태생적 형태로, 또는 조작된 변형을 통해, 또는 (유도된 산 또는 염기와 같은) 완충재의 특성들을 통해서 중 어느 일방으로 - 전자적으로 제어가능할 수 있을 것이다. 특히, 이것은 예를 들어 게이트 전압에 의해 영향을 받을 수 있을 것이다. 우리는 추가적으로, 이것은, 데이터를 보다 빨리, 또는 보다 엄격한 (더 양호한 신호 대 노이즈) 조건들 하에서 모으기 위한, 그리고 어느 방식에서든, 동작 시간의 단위 당 수집된 정보의 순 양을 증가시키기 위한 사용일 수 있음을 교시한다. 특히, 어레이 셋팅에서, 어레이 상의 상이한 센서 프로브들 또는 효소들의 상이한 전자적 제어는 의문의 시퀀스 또는 시퀀스 특성들에 대한 전체적인 보다 큰 정보유익성을 제공할 수 있을 상보적 정보의 다양성을 모으기 위해 사용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 전자적 제어가 효소 프로세싱의 속도를 증가 또는 감소시킬 수 있는 경우에, 상이한 센서들은 프래그먼트들의 상이한 영역들에 대해 보다 빨리 프로세싱하고, 그 다음에, 복제에서의 센서 어레이에 적용된 긴 템플릿의 길이를 다른 보다 정확한 평가를 획득하기 위해 보다 정확한 로컬 정보에 초점을 맞출 수 있을 것이다.
프로브 분자들은 게이트 전압과 같은 전자적 제어 하에서 그들의 DNA 템플릿을 릴리스하도록 만들어질 수도 있다. 이것은, 시스템으로부터 그것들을 릴리스 및 플러싱 (flushing) 함으로써, 획득된 시퀀싱 정보에 기초하여, 바람직한 프래그먼트들을 보유하기 위해, 그리고 원치않는 프래그먼트들을 빼기 위해 사용될 수 있다. 원하는 프래그먼트들은, 보다 확장적인 시퀀싱, 또는 서브시퀀스 분석을 통해 존재할 수도 있는 변형된 또는 손상된 염기들의 결정과 같은 추가적인 사용들을 위해 분위기 용액으로부터 후속하여 릴리스되고 수집될 수 있다. 이러한 후속하는 분석은 질량 스펙트로메트리와 같은 본 수단 또는 다른 수단을 통한 것일 수 있을 것이다. 예를 들어, 이것은, 발생한 DNA 손상을 연구하기 위해 암 세포들로부터 DNA 를분석하는 상황에서, 또는, 뉴런 세포들 또는 줄기 세포들과 같은 특수한 환경들에서 발생하는 DNA 의 변형을 연구함에 있어서 관심대상의 것일 수 있을 것이다.
액체 이동들 및 프로세싱
설명된 다양한 시퀀싱 방법들은 하나 이상의 완충재들과 작용하는 것을 수반한다. 우리는 이러한 상황에서 이들 디바이스들과 효율적으로 작용하는 몇가지 방식들을 교시한다. 우리는 플로우 셀에서 센서 또는 센서 어레이를 배치하는 것, 및 완충재들을 셀 안으로 그리고 셀 밖으로 펌핑하기 위해 미세 유체 시스템을 이용하는 것을 교시한다. 우리는 또한, 펌핑 시스템들로 가능한 것보다 더 신속한 유체 교환을 달성하기 위해, 상이한 완충재 용기들 사이에서 센서 또는 센서 어레이 칩 그 자체를 이송하고 그것을 각각에서 침지시키는 것을 교시한다.
마이크로웰
격리
추가적인 검출 방법들을 또한 가능하게 하는 액체 이동의 일반적인 고려의 특수한 경우에서, 우리는 또한, 어레이에서의 개별 센서들은 그들 자신의 마이크로웰 오목부들 (즉, 마이크로-사이즈의 용량을 갖는 웰들), 또는 복수의 이러한 마이크로웰 당 상주할 수도 있고, 센서들의 전체 어레이들은 도 68 에서 도시된 바와 같이, 다수의 이러한 마이크로웰들 내에서 포함됨을 교시한다. 단일의 거시적 커버링/언커버링 또는 시일링/언시일링 프로세스가 프로세싱 및 액체 이동을 동시에 하기 위해 이러한 웰들을 시일링 및 언시일링하기 위해 사용된다. 이점은, 시일링된 마이크로웰에서, 반응들 및 반응 산물들이 국지화되고, 벌크 유체로 손실되지 않으며, 그리고 더욱이, 임의의 이러한 트랩된 분자들이 반복적으로 둘러싸인 센서에서 근접하여 통과하고, 이는, 전자적 검출가능한 신호를 생성하기 위해 반응물이 국지적으로 축적할 필요가 있는, 또는 주어진 타겟이 검출가능한 신호를 달성하기 위해 동일한 센서로부터 다수회 계합하고 계합해제될 필요가 있는 상이한 타입들의 감지 반응들을 용이하게 할 수도 있다. 또는, 초기 트리거 분자는 국지적으로 시간에 걸쳐 구축되어야만 하는 시그널링 분자의 생산을 케스케이드하도록 이끌 수도 있다. 특히, 이것은, 프라이머리 시퀀싱 반응이 (폴리메라제 확장, 릴리싱 H, 피로포스페이트, 및 감마 포스페이트에 부착된 태그들, 또는 엑소뉴클레아제, 잘라내진 다음 염기 릴리싱과 같이) 분자를 릴리스하는 경우에, 유용할 수 있고, 분자 센서는, 이 분자, 이러한 분자들의 축적들, 또는 트리거 분자로부터 초래되는 분자들의 케스케이드들을 검출할 필요성이 있는 프로브 분자를 포함한다. 도 68 은 벌크 / 거시적 프로세스에서 시일링 및 언시일링될 수 있는 마이크로웰들 또는 나노웰들에서 둘러싸인 센서를 예시한다. 이것은 다른 모드들의 검출을 용이하게 하기 위해 반응물들 및 반응 산물들을 국지화한다. 이것은 또한, 웰 당 다수의 센서 타입들, 또는 센서 당 다수의 프로브 분자들로부터 혜택을 받을 수도 있어서, 진행성 효소가 반응 산물을 검출하기 위해 프로브와 함게 존재할 수 있도록 한다.
다양한 예들에서, 3 단자 분자형 전자 센서는 프라이머리 소스 및 드레인 전극들 및 전계 효과 게이트 전극을 포함하고, 여기서, 프로브 분자는 소스 및 드레인 전극들 사이에 결합되거나, 프로브 분자는 소스 및 드레인 전극들 사이에 결합된 브릿지 분자에 결합되고, 여기서, 프로브 분자는 핵산 폴리머와의 검출가능한 상호작용에 관여하고, 여기서, 검출은 회로 파라미터들의 모니터링을 포함한다. 다양한 예들에서, 검출가능한 상호작용은, 후보 시퀀스 엘리먼트들의 일부 셋트에 대한, 이에 의해 상호작용하는 핵산 폴리머의 시퀀스 구성에 관련될 수 있다. 폴리머는 예를 들어 DNA 또는 RNA 의 형태일 수도 있고, 후보 시퀀스 엘리먼트들의 셋트는 각각 DNA 에 대해 {A,C,G,T} 또는 RNA 에 대해 {A,C,G,U} 일 수도 있다.
다양한 예들에서, 후보 시퀀스 엘리먼트들은 변형된 뉴클레오티드들을 포함할 수도 있고, 관련된 시퀀싱 프로세스는 이에 의해, DNA 템플릿에서의 수정된 뉴클레오티드들을 식별한다. 변형된 뉴클레오티드들은 5-메틸-C 와 같은 메틸 C 의 다양한 형태들을 포함할 수도 있고, 관련 시퀀싱 프로세스는 이에 의해 DNA 템플릿에서 이들 변형된 뉴클레오티드들을 식별한다.
다양한 실시형태들에서, 프로브 분자는 효소, 또는 DNA 또는 RNA 혼성화 프로브이다. 나중의 2 개의 실시형태들의 선호되는 구성들은 도 66 에서 도시된다. 일 예로서, 프로브 분자는 예를 들어 Phi29 또는 그것의 변이종, 또는 Pol I 또는 그것의 변이종과 같은, DNA 폴리메라제를 포함한다.
다양한 다른 비제한적인 예들에서, 프로브 분자는 역전사 효소, 리가아제, 엑소뉴클레아제, DNA 를 전치시키는 효소, 헬리카제, 단백질 나노포어, 전치시키는 효소와 복합화된 단백질 나노포어, 또는 리보솜 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.
비제한적인 예들에서, 브릿지 분자는 예를 들어 이중 가닥형 DNA, 단백질 알파-나선, IgG 항체, 소스 및 드레인 전극들 상의 컨택 포인트들에 대한 특정 친화도를 갖는 IgG 항체, 또는 소스 및 드레인 전극들 상의 컨택 포인트들에 대한 특정 친화도를 갖도록 조작된 IgG 항체 템플릿일 수도 있다.
다양한 양태들에서, 소스 및 드레인 전극들에 결합되는 컨택 포인트는 금 비드와 같은 금 컨택, 및 브릿지 분자에서의 티올 포함 기 사이의 티올-금 결합을 통한 것이다. 보다 구체적인 예에서, 내부 결합 포인트는 브릿지 분자에서의 바이오틴, (태생의 또는 변형된) 스트렙타비딘, 및 그 스트렙타비딘에 접합된 프로브 분자를 통한 것일 수도 있다.
센서의 엘리먼트들의 조립은 다중-단계, 현장 조립 프로세스의 과정 동안 전기적 파라미터들을 통해 모니터링될 수도 있다. 예를 들어, 모니터링되는 전기적 파라미터는 게이트 전압 및 인가되는 소스-드레인 전압 하의 소스-드레인 전류; 인가되는 소스-드레인 전류 하의 소스-드레인 또는 게이트 전압; 인가되는 소스-드레인 전압 및 게이트 전압 하의 소스-드레인 전류; 소스-드레인 전압 및/또는 게이트 전압이 값들의 범위를 통해 스위핑됨에 따른 I-V 특성; 및 소스-드레인 또는 게이트에 인가된, 인가된 전압 파형에 대한 전류 응답 중 어느 하나일 수도 있다.
다른 양태들에서, 프로브 분자는 폴리메라제일 수도 있고, 그에 의해, 검출가능한 신호는, 폴리메라제에 바인딩되는 프라이밍된, 단일-가닥형 DNA 분자 템플릿의 시퀀스를 결정하기 위해 일련의 뉴클레오티드 시도 플로우들을 통해 모니터링되는 통합의 신호이다. 보다 구체적인 예들에서, 폴리메라제는 통합의 신호를 강화하기 위해 변형된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드들은 통합의 신호를 강화하기 위해 변형될 수도 있다.
다양한 양태들에서, 프로브 분자는 폴리메라제이고, 검출가능한 신호는 상이한 염기들을 또한 구별하는 통합의 신호이며, 이것은 시스템이 시퀀스를 결정하기 위해 dNTP 들의 혼합물에 노출되는 동안 모니터링된다. 또한, 폴리메라제는 통합의 신호를 강화하기 위해 변형될 수도 있고, 뉴클레오티드들은 상이한 염기들의 통합의 구별가능한 신호를 강화하기 위해 변형될 수도 있다.
다양한 예들에서, 센서는 템플릿에서 ({A,C,G,T} 에 추가하여) 5-메틸-C 와 같은 추가적인 변형된 염기들의 존재를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
프로브 분자는 폴리메라제인 예들에서, 검출가능한 신호는 통합의 신호이고, 이것은 완결부 시퀀싱 반응들을, 그리고 각각의 구분되는 완결부 -A, -C, -G, -T 에 대해 수행하기 위해, 그리고 이에 의해 템플릿 분자의 시퀀스를 조립하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 전기적 측정은 4 개의 상이한 완결부들을 구별할 수 있고, 완결부 시퀀싱은 완결부의 식별표시를 갖는, 완결부들의 혼합의 많은 런들의 결과들의 조립을 통해 수행된다.
다른 예들에서, 프로브 분자는 DNA 또는 RNA 혼성화 프로브를 포함하고, 이러한 프로브들의 다양성으로부터의 DNA 상호작용의 신호들은 대응하는 반응들에 대해 복제되어 공급되는 DNA 프래그먼트를 시퀀싱 또는 카테고리화하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 예들에서, 센서 어레이 포맷이 전개될 수도 있다. 예를 들어, 1,000 개 이상의 이러한 센서들의, 10,000 개 이상의 이러한 센서들의, 또는 100,000 개 이상의 이러한 센서들의, 또는 1,000,000 개 이상의 이러한 센서들의, 또는 10,000,000 개 이상의 이러한 센서들의, 또는 100,000,000 개 이상의 이러한 센서들의 어레이. 전개는 CMOS 센서 일렉트로닉스를 포함하는 칩 상에서일 수도 있다. 이러한 칩 시스템은 프로브들 및 DNA 의 상호작용의 다수의 검출가능한 신호들을 병렬로 수집함으로써 DNA 를 시퀀싱하기 위해 사용될 수도 있다. 이들 다양한 실시형태들에서, 칩 시스템은 다수의 DNA 분자들의 대량의 병렬적 시퀀싱을 수행하기 위해서, 또는 다양한 완결부 시퀀싱 반응들을 통해, 복제에서 공급되는 DNA 프래그먼트의 완결부 시퀀싱을 수행하기 위해서 사용될 수도 있으며, 각각은 4 개의 구분되는 칩들 상에서 대량의 병렬적 방식으로 또는 단일 칩 상에서 일련의 4 개의 반응들에서 적용된다.
칩 시스템들은, 각 타입의 요구되는 횟수의 개별 반응들을 달성하기 위해, 4 개의 구분되는 칩들 상에서 대량의 병렬적 방식으로, 또는 단일 칩 상에서 일련의 4 개의 반응들에서 각각 적용되는, 다양한 완결부 시퀀싱 반응들을 통해, 복제에서 공급된 DNA 프래그먼트의 완결부 시퀀싱을 행하기 위해 사용될 수도 있다. 칩 시스템들은 요구되는 횟수의 개별 반응들을 달성하기 위해 단일 칩 상에서 대량이 병렬적 방식으로 수행되는 다양한 완결부 시퀀싱 반응들을 통해, 복제에서 공급되는 DNA 프래그먼트의 완결부 시퀀싱을 수행하기 위해 사용될 수도 있다. 칩 시스템들은, 데노보 프래그먼트 조립 또는 레퍼런스에 대한 조립을 집합적으로 달성하도록, 어레이에 적용된 프래그먼트들의 분자적 핑거프린팅을 생성하기 위해, 개요들로서 시퀀싱 방법, 및 개요된 바와 같은 통합 검출 신호와 함께 사용될 수도 있다.
이들 다양한 칩 시스템들에서, 프로브들은 프래그먼트에 대해 혼성화에 의한 시퀀싱을 수행하기 위해 충분히 유용한 정보성의 DNA 혼성화 프로브들의 집합일 수도 있다. 프로브 아이덴터티들은 일련의 디코딩 반응들을 통해 디코딩될 수 있는 조합적 방식으로 인코딩될 수도 있다. 예를 들어, 디코딩 반응들은 혼성화 태그들의 풀들에 대한 혼성화 반응들을 포함할 수도 있고, 상기 반응 결과들의 판독은 관찰가능한 회로 파라미터들을 이용한, 혼성화 신호들의 전자적 검출을 통한 것이다.
일부 예들에서, 프로브들은 프래그먼트에 대해 혼성화에 의해 시퀀싱을 수행하기 위해 충분히 유용한 정보성의 DNA 혼성화 프로브들의 집합일 수도 있고, 상기 프래그먼트는 그것의 시퀀스를 결정하기 위해 복제에서 어레이에 적용된다.
다양한 실시형태들에서, 완충재 변형들 또는 조건들은 보다 많이 희석된/저-이온 강도의 완충재들과 같은, 전술된 예들 중 임의의 것에서 신호 검출을 향상시키기 위해서 사용될 수도 있다.
센서들의 다양성은, 보다 큰 전체 정확도를 달성하기 위해 추가로 결합되는, 상기 시퀀싱 방법들에서와 같이 상보적 측정들을 하기 위해 칩-기반 센서 어레이 에 대해 사용될 수도 있다. 특히, 하나의 DNA 프래그먼트가 복제에서의 어레이에 공급될 때, 어레이 상의 독립적인 센서들로부터의 정보는 증가된 정확도로 프래그먼트의 시퀀스를 결정하기 위해 사용된다. 센서들의 다양성은 브릿지 구조에서의 다양성을 통해서, 또는 변형된 프로브 분자들에서의 다양성으로 제공될 수도 있다. 다양한 양태들에서, 센서들의 다양성은 어레이 상의 센서들의 구성들 및 동작 조건들에서의 랜덤한 (제어되지 않은) 다양성을 통한 것이고, 이 정보의 집합은 보다 정확한 시퀀스를 획득하기 위해 이러한 노이즈를 제거하는 방식을 구성한다.
프로브 분자가 폴리메라제인 예들에서, 뉴클레오티드들은 상이한 키네틱 시그니처들을 가져서 검출가능한 신호를 제공하도록 하는 방식으로 준비되고 공급될 수도 있다. 상이한 키네틱스는 용액에서의 뉴클레오티드들의 상이한 농도들로 인한 것일 수도 있고, 시그니처는 통합 신호들 사이의 타이밍을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 센서의 효소는 엑소뉴클레아제이고, DNA 템플릿은 검출을 강화하기 위해 변형된 염기들로 준비될 수도 있으며, 엑소뉴클레아제는 상기 뉴클레오티드들의 이러한 검출을 강화하기 위해 추가로 변형될 수도 있으며, 시퀀싱 신호들은 엑소뉴클레아제가 순서대로 염기들을 쪼갬에 따라 발생하여 획득된다.
다양한 예들에서, (태생의 또는 변형된) 프로브 분자는 전자적으로 제어되기 위한 능력을 가져서, 그것의 DNA 와의 반응은 인에이블되거나 강화되거나 억제되거나 디스에이블될 수 있다. 예를 들어, 프로브 분자는 그것의 진행성을 인에이블 또는 강화 또는 억제 또는 디스에이블하는 면에서 전자적으로 제어될 수 있는 효소일 수도 있고, 이것은 수집되는 시퀀스 데이터의 정보적 유용성을 향상시키기 위해 사용된다. 특히, 칩 센서 어레이 포맷에서, 이것은, 이러한 상이하게 획득된 측정치들의 다양성이 병렬적으로 획득되도록, 전체 정보적 유용성을 증가시키도록 허용한다. 특히, 폴리메라제의 경우에, 이것은 모든 센서들에 대해 적용되는 긴, 복제의 프래그먼트의 보다 먼 영역들에 도달하고 그리고 그 다음에 느리게 하고 조사하기 위해 템플릿들을 따른 개별 폴리메라제들을 더 빨리 이동시키기 위해 사용될 수 있을 것이다.
다양한 실시형태들에서, 게이트 전압은 신호 검출을 향상시키도록 설정될 수도 있다.
혼성화에 의한 시퀀싱에 속하는 예들에서, 전자적 제어들은, 혼성화를 가속화하기 위해 프로브들 부근의 템플릿 DNA 의 전압 구동된 농도, 부적절하게 페어링된 하이브리드들을 물리치기 위한 전압 기반 엄격성, 또는 정확하게 혼성화된 프래그먼트들을 신속하게 어닐링하기 위한 이 엄격성의 전압 사이클링, 또는 미스매칭된 또는 부적절한 혼성화로부터 적절한 혼성화를 구별하는 방식으로 검출된 신호를 변경하는 인가된 전압들과 같이, 퍼포먼스를 향상시키기 위해 적용될 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, DNA/RNA 템플릿들은 전자적으로 유지되거나 릴리스될 수도 있고, 그리고, 시퀀스 결정에 기초하여, 어떤 프래그먼트들은 보유되고, 나머지는 릴리스되고 제거되며, 보유된 것들이 후속하는 사용들 또는 추가적인 분석을 위해 용액에서 릴리스되고 캡처된다.
일부 예들에서, 의문의 완결된 염기를 식별하기 위해 보다 확장적인 전자적 식별 감지에 이어서, 완결부의 제거 및 시퀀싱될 소망되는 수의 염기들까지 이 프로세스들의 반복을 위한 시간을 허용하기 위해 완결된 반응을 제공하기 위해 가역적 완결부 염기가 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 시험적 뉴클레오티드 dNTP 혼합물들의 도입, 및, 정확하게 페어링된 및 부정확하게 페어링된 염기들 사이의 바인딩 포켓 내에 있는 동안 생성된 일시적 신호들에서의 검출가능한 차이들로 인한 다음 염기의 결정에 이어서, 완결부의 제거, 및 프로세스를 다음 단계로 진행시키기 위해 다른 가역적 완결부의 통합, 및 시퀀싱될 소망되는 수의 염기들까지 이 프로세스들의 반복을 허용하는 신호 데이터를 획득하는 것에 의해, 완결부를 지난 다음 염기의 프로빙을 가능하게 하기 위해 가역적 완결부가 사용될 수도 있다.
사용될 수도 있는 프라이머는 비-확장가능/완결부 프라이머이고, 그 안의 조사는 프라이머를 따르는 제 1 염기의 아이덴터티를 획득하기 위해 단일 염기 시퀀싱을 수행하기 위해 사용된다.
다양한 예들에서, 효소는 폴리메라제일 수도 있고, 그것의 사용은, 잠재적으로 별도의 타겟팅 반응 단계 없이, 현장에서 타겟팅되는 시퀀싱을 달성하기 위해, 브릿지 또는 폴리메라제 분자들 상에 제자리에 속박되는 이러한 프라이머들, 또는 템플릿들의 어느 도입 이전에, 템플릿들을 프라이밍하기 위한 타겟팅된 프라이머들일 수도 있다. 여기서, 이러한 프라이머들은 표준 올리고 프라이머들, 또는 증가된 친화도의 프라이머들, 또는 재조합효소에 의해 강화된 프라이머들일 수도 있고, 후자는 이중 가닥형 DNA 를 프라이밍하기 이한 것이다.
칩 어레이 시스템에서, 다수의 사이트들에서 프라이밍된 긴 DNA 분자는 다수의 폴리메라제에 의해 캡처되도록 사용되고 도입될 수도 있고, 다수의 동시적 시퀀싱 반응들을 겪고, 변형 페이징, 하플로타입, 또는 연속적, 긴 DNA 분자의 구조를 결정하기 위해 사용될 수도 있다.
일부 예들에서, 마이크로-웰 챔버들 내의 복수의 분자형 센서들은, 독립적 포함된 반응들 및 검출들이 둘러싸인 웰들 내에서 발생할 수 있도록 하는 방식으로, 이러한 웰들을 시일링 및 언시일링하기 위해, 칩 상의 다수의 이러한 마이크로웰, 및 단일 거시적 프로세스로, 칩 상에 배치될 수도 있다. 이것은, 분자형 센서 프로브 분자가 진행성 반응 그자체 (중합, 또는 엑소뉴클레아제) 로부터 생성된 또는 릴리스된 부산물 분자를 검출하는 다수의 신호 검출 방식들, 또는 후속 분자성 케스케이드 분자들이 이러한 프라이머리 분자들로부터 기인하도록 가능하게 한다.
마이크로유체적 시스템 및 플로우 셀은 센서 또는 센서 어레이에 대해 필요한 반응 혼합물들 및 완충재들을 제공한다.
칩 어레이 시스템에서, 칩은, 시퀀싱 프로세스에서 사용되는 상이한 완충재들에 대한 신속한 노출을 달성하도록, 반응 완충재들의 상이한 용기들 사이에서 직접 이송될 수도 있다.
프로브 분자가 폴리메라제인 예들에서, 이들 예들은, 원형화된 템플릿, 또는 U 자형-적응된 템플릿과 함께, 가닥 치환 폴리메라제의 사용을 제공하여서, 정확도를 강화하는 동일한 템플릿의 다수의 판독치들을 생성하기 위해 양 가닥들의 판독, 또는 동일한 가닥의 반복되는 판독들이 달성되도록 한다. 또한, 동일한 템플릿의 스트리핑 및 재-시퀀싱은 동일한 종단을 직접적으로 달성할 수 있다.
예 8 은 몇몇 중요한 애플리케이션 셋팅들 (예컨대, 호모폴리머 길이, 단일 염기 결정, 메틸화, 및 긴 판독들) 에서 폴리메라제에 의한 통합의 관찰 신호들에 대한 기본 센서의 구성, 그것의 특성들, 및 그것의 애플리케이션에 대한 실험적 결과들을 전개한다. 이 예는 결정적 애플리케이션에 대한 실제로의 실행을 확립하고, 다른 애플리케이션들이 유사하게 실제로 실행될 수 있는 전제에 대한 강한 기초를 제공한다. 이 예들은, 예컨대, 도면들에서 예시된, 분자 센서 구조, 전기적 측정 셋업, 전극 이미지들, 센서 칩 이미지, 칩 패시베이션, 플로우 셀, 칩 패키징, 센서의 I-V 특성들, 센서 자기-조립의 전기적 관찰, 호모폴리머 DNA 에서의 별개의 폴리메라제 통합 이벤트 신호들, 단일 염기 검출 신호, 메틸화된 DNA 검출, 및 긴 판독 능력에 대한 결과들을 전개한다.
DNA 시퀀스의 결정은 기본적으로 중요한 측정 프로세스이다.
도 69 는 이 실험적 작업을 위해 사용되는 분자 구조를 예시한다. 도 69 는 실험적 작업을 위해 통상적으로 사용되는 브릿지 및 프로브 분자 구조의 상세들을 나타낸다. 이 경우에서의 브릿지는 금속 전극 상의 금 컨택들에의 결합을 위해 양 5' 단부들에서 티올기들을 갖는, 나타낸 20 nm 길이 (60 염기들) 의 이중 가닥형 DNA 분자이다. 프로브 분자는 스트렙타비딘 단백질에 화학적으로 교차결합되는 폴리메라제, 여기서, E. Coli Pol I 이고, 이 스트렙타비딘 단백질은 다시 합성 DNA 올리고에서 바이오틴 부착된 뉴클레오티드에서 브릿징에 결합된다. 도 69 는 분자들 및 원자들의 6 배로 스케일링되어 도시된다.
이제 도 70 을 참조하면, 분자 센서들에 대한 전기적 측정들을 위한 테스트 셋-업의 개략이 도시된다. 도 70 의 상부 부분에서, 전극-기판 구조, 및 브릿지 분자를 통한 전류들을 측정하고 전압들을 인가하기 위한 분석기에 대한 부착의 단면도가 도시된다. 도 70 의 하부 부분에서, 브릿징 회로들에 대한 전극 어레이의 투시도가 예시된다. 전극들의 각 쌍은 금속-1 전극들 상의 금속-2 컨택 포인트들을 갖는다 (즉, 다른 금속들임). 본 실험들에서, 컨택 포인트들은 금 비드들 또는 금 코팅된 전극 팁들이고, 이는 티올-금 바인딩을 통해 티올화된 분자들의 장소 내로의 자기-조립을 지원한다.
도 71a, 도 71b, 및 도 71c 는 다양한 레벨들의 확대도로 전극들의 전자 현미경 이미지들을 도시한다. 이미지들은 브릿지 바인딩을 위해 사용되는 금 금속 도트 컨택들을 갖는 전극들의 것이다. 전극들은 실리콘 기판 상에 있고, 전자-빔 리소그래피를 통해 생성되었다. 도 71a 는 전극들의 어레이의 EM 이미지이다. 여기서, 전극들은 금 도트 컨택들을 갖는 티타늄이다. 도 71b 는 7 nm 의 전극 갭 및 15 nm 의 금-대-금 간격을 갖는 금 도트 컨택들을 보여주는 클로즈업의 EM 이미지이다. 도 71c 는 전극들의 팁들에서 대략적으로 10 nm 의 금 도트들을 보여주는 클로즈업의 EM 이미지이다.
도 72 는 전극 테스트 칩 아키텍처를 예시한다. 이 경우에, 전극 어레이는 전자-빔 리소그래피를 이용하여 1 cm 실리콘 기판 상에 형성되었다. 도 72 에서의 일련의 3 개의 SEM 이미지들은 전극 갭의 10 nm 스케일까지 하향한 증가하는 분해능으로 20 개의 전극 쌍들을 보여준다.
도 73 은 용액으로부터 전극들을 보호하기 위해 디바이스 상에 패시베이션 층의 사용을 나타낸다. 이 경우에, 패시베이션 층은 실리콘 산화물이다. 패시베이션에서의 오프닝들은 노나미터 스케일로 전극 영역들을, 그리고 10 미크론 스케일로 전기적 컨택 패드들을 노출시킨다.
도 74 는 센서 칩 표면에 대한 액체 용액들의 제어된 노출을 지원하기 위해 사용된 플로우 셀을 예시한다. 이 경우에, 플로우 셀은 몰딩된 PDMS 폴리머를 포함한다.
도 75 는 전기적 측정들을 위해 칩 캐리어에 장착된 칩을 나타낸다.
도 76 은 조립된 센서 복합체의 전도성의 특성화를 전개한다. 도 76 은 공기, 물 및 희석된 염 완충액에서 오픈 회로 전극들의 제어들과 함께, 습식 (희석된 염 완충액) 및 건식 (공기) 조건들에서 DNA 브릿지 분자들 및 완전한 센서 복합체들 (폴리메라제를 갖는 브릿지) 의 전류-대-전압 (I-V) 특성들을 보여준다. 도 76 은 브릿지 및 센서 복합체가 인가된 1 Volt 의 소스-드레인 전압에서 100 mpico-Amp 전류의 정도로 도전시키는 것을 보여준다. 측정들은 SMU 를 통해 반도체 파라미터 분석기 상에서 행해진다.
도 77 은 금-도트 컨택 전극들을 갖는 분자 센서의 자기-조립의 전자적 모니터링을 예시한다. 전류 대 시간 측정들은 브릿지 및 분자 센서 복합체의 자기-조립의 진행을 모니터링하기 위해 사용되었다. 도 77 에서 상부 좌측에서의 플롯은 페이즈 1 을 보여주고, 여기서, 이중 가닥형 DNA 브릿지는 전류에서의 점프에 의해 나타내어진 바와 같이 전극 금 컨택 포인트 상에 조립되는 5' 단부들 상의 티올기들과 조립된다. 도 77 에서의 상부 우측에서의 플롯은 페이즈 2 를 보여주고, 여기서, 폴리메라제 스트렙타비딘 복합체는 전류에서의 점프 업에 의해 나타내어진 바와 같이 dsDNA 브릿지 상에서 바이오틴부착된 사이트에 바인딩된다. 도 77 에서의 하부 우측에서의 플롯은 페이즈 3 을 보여주고, 여기서, 프라이밍된 단일-가닥형 DNA 템플릿은 전류 대 시간에서의 스파이크에 의해 나타내어진 바와 같이 복합체를 완성하기 위해 폴리메라제에 바인딩된다.
도 78 은 최종 조립체들의 이미지를 제공한다. 더 높은 해상도 이미지에서, 브릿지-복합체는 라벨링 없이 직접 볼 수 있고, (녹색 화살표에 의해 가리켜진) 전극들을 잇는 흐릿한 고 콘트라스트 영역으로서 보인다.
도 79 는 센서로 통합 신호들을 측정하는 4 개의 플롯들이다. 도 79 에서의 플롯들은, 통합 및 중합을 위해 다양한 프라이밍된, 단일 가닥의 DNA 시퀀싱 템플릿들 및 dNTP 들이 공급되는 센서로부터 발생하는 전류 신호들을 보여준다. 각각의 경우에, 주요 신호 스파이크들은 이산 통합 이벤트들로부터의 신호들을 나타내고, 여기서, 폴리메라제 효소는 연장되는 가닥에 다른 염기를 추가한다. 도 79 의 상부 좌측 부분에서의 플롯에서, 템플릿은 20 T 염기들이고; 상부 우측에서의 플롯에서, 템플릿은 20 G 염기들이며; 하부 좌측 부분에서의 플롯에서, 템플릿은 20 A 염기들이고; 하부 우측에서의 플롯에서, 템플릿은 20 C 염기들이다. 관찰되는 통합의 근사 레이트는 초 당 10 내지 20 염기들이고, 이것은 레이트 제한 인자들 (예컨대, 보다 낮은 dNTP 농도) 로 인해 초 당 ~1 염기의 보다 낮은 레이트에 대한 것을 제외하고는 표준 효소 키네틱스와 일치한다.
도 80 은 단일 염기 통합 이벤트로부터 생성된 신호의 클로즈업이다. 이 경우에, 그 신호는, 통합 이벤트를 검출하는 것에 추가하여, 염기를 식별하는 것을 돕기 위해 잠재적으로 사용될 수 있을 이중-피크 구조를 갖는다.
도 81 은 메틸화된 염기들의 전기적 감지를 나타내는 플롯들을 제공한다. 도 81 은 템플릿에서 개별 메틸화된 염기들 또는 메틸화 상태를 감지하기 위한 센서의 잠재적 사용을 보여준다. 플롯들은 템플릿의 메틸화된 부분들 (녹색 트레이스) 대 메틸화되지 않은 부분들로부터 발생하는 상이한 신호들을 보여준다. 메틸화된 부분보다 메틸화되지 않은 부분으로부터 더 높은 신호들이 발생된다. 나타낸 실험은, 예를 들어 나타낸 템플릿 시퀀스에 대해, 나타낸 바와 같이 센서 칩 상으로의 일련의 상이한 용액 추가들에 대한 트레이스들을 측정하는 것으로 이루어진다. dCTP 플로우는 단일 염기 통합 스파이크를 생성하였고, dGTP 의 추가는 그 다음에 템플릿의 CG 트랙트를 가로질러 진행하기 위한 통합을 가능하게 하였고, 메틸화된 대 메틸화되지 않은 템플릿으로부터의 신호에서의 차이를 강조하였다.
도 82 는 센서의 장기-판독 능력을 나타낸다. 이 도면은 긴 DNA 프래그먼트들을 판독 또는 분석하기 위한 잠재성을 보여주고, 이는 전체 게놈 시퀀스들의 데노보 조립과 같이 데이터의 장 범위 연속성이 중요한 애플리케이션들에 대해 중요하다. DNA 템플릿은 5.4kb PhiX 바이러스의 게놈이다. 좌측의 전류 대 시간 플롯에서, 템플릿 (dNTP 믹스) 의 저-시간-분해능 판독, 대 중합 없이 제어 상의 추종 (완결부 ddNTP 믹스, 차단된 폴리메라제 활성도) 으로부터의 상이한 신호들이 기록된다. 우측에서의 SEM 이미지는 가시적인 긴 템플릿 DNA 를 갖는 전극들을 도시한다.
예 9
변형된
dNTP
들로 염기 통합 신호들을 검출하는 펩티드
브릿지
센서를 갖는 분자 센서
센서의 다른 선호되는 실시형태는 브릿지 분자로서 단백질 알파-나선을 이용한다. 단백질 알파-나선들은, 그것들이 비교적 강성이고, 전자 이송 및 전류 전도를 허용하는 것으로 알려져 있으며, 그것들이 구조의 정밀한 명세들로 원자적으로 그리고 자기 조립을 위한 결합기들로 펩티드들로서 합성될 수 있기 때문에, 바람직한 구조들이다. 이러한 펩티드 알파 나선 브릿지 및 연관된 센서는 도 83a 및 도 83b 에서 예시된다. 이 예의 실험적 작업에서 사용되는 특정 펩티드는 다음의 66 아미노산 시퀀스를 갖는 펩티드이다:
CAEAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAA{Lys-Ahx-Biotin}EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARC (SEQ ID NO: 14)
이것은, 펩티드에 대해 알파-나선 구조를 선호하는 것으로 알려진, 모티프 EAAAR 의 반복들에 기초한 61-아미노 펩티드를 특징짓는다. 말단들에서의 시스테인 아미노산들은 크롬 전극 상에서 금 컨택들에 결합하는 티올-금을 제공한다. 펩티드 대신의 중앙의 리신은 결합 목적들을 위해 뉴트라비딘 단백질의 바인딩을 지원하기 위해, Ahx (6 개의 탄소 선형 아미노헥산) 링커 상에 바이오틴을 포함하도록 변형된다. 펩티드의 알파 나선형 형태는 길이가 대략적으로 9 nm 이다. 폴리메라제는 알려진 말레이미드-시스테인 공유 결합 반응을 통해 폴리메라제 상에서 표면 시스테인 아미노산에 바인딩된 바이오틴-말레이미드기를 통해 뉴트라비딘에 결합된다.
도 83a 는 언급된 66 아미노산 시퀀스 펩티드를 이용하여 실제로 실행된, 펩티드 알파-나선 브릿지를 갖는 이 실시형태를 나타낸다. 도 83b 는 완전히 조립된 센서를 나타내고, 알파-나선 브릿지가 알려진 바이오틴-뉴트라비딘 바인딩 반응을 통해 뉴트라비딘에 결합되고, 또한, 폴리메라제가, 알려진 말레이미드-시스테인 공유 결합 반응을 통해, 폴리메라제 상의 표면 시스테인에 접합된 추가적인 바이오틴-말레이미드 링커를 통해 부착된다.
이 실시형태의 실제로의 실험적 실행은 도 85a 내지 도 85d 에서 도시된다. 20 개의 전극 쌍들을 갖는 테스트 칩이 다른 예들에서와 같이 전자-빔 리소그래피에 의해 제조되었다. 전극은 크롬이고, 펩티드 브릿지에의 결합을 위해 금 층이 디포짓팅되었다. 칩은 브릿지 디포지션 직전에 산소 플라즈마 클리너에서 240 초 동안 클리닝되었다. 펩티드 브릿지는 한 시간 동안, 1μM 농도에서, PBS 완충재에서 칩으로 배양되었다. 그것에 후속하여, PBS 에서, 전극들의 전류-전압 특성들이 측정되었고, 소스-드레인 전압이 0 에서 2 볼트로 변화한다. 최고의 전류를 갖는 전극 쌍이 조립 및 시퀀싱 동안 모니터링 시간에 대해 선택되었다. 브릿지 바인딩을 위해 뉴트라비딘을, 뉴트라비딘-브릿지에의 바인딩을 위해 폴리메라제-말레이미드-바이오틴을, 그리고 폴리메라제 통합 활동을 위해 DNA 텝플릿 + dNTP 들을 공급하는 프로세스를 통해 전류 대 시간이 모니터링되었다. 도 85a 내지 도 85d 에서 도시된 바와 같이, 센서 조립 프로세스의 뉴트라비딘 바인딩 및 폴리메라제 바인딩에 대응하는 신호 스파이크가 생성되었다. 폴리메라제는 템플릿-뉴클레오티드 용액에 노출되었을 때 활성을 보였고, 이는 DNA 템플릿을 캡처하고 상보적 염기들을 통합하는 센서의 일련의 3 개의 이벤트들로서 (나타낸 바와 같이) 해석될 수 있을 것이다.
템플릿 시퀀스는 10-GT 반복들의 4 개의 주요 트랙트들을 가졌다. 구체적으로, 템플릿 시퀀스는 다음을 포함하였다:
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT (SEQ ID NO: 15)
도시된 데이터 해석에서, GT 트랙트들은 상이한 들어오는 템플릿들과 센서의 연속적인 계합들 내에서, 지속되는 활성의 스파이크들을 생성한다. 이 예는, 브릿지 분자의 다른 선호되는 형태들이 시퀀스 분석의 기초인 통합 신호들을 생성할 수 있는 것을 나타낸다.
이 G-리치 템플릿으로부터의 통합 신호를 강화하기 위해서, 변형된 C 가 통합 반응 혼합물에 대해 사용되었다. 구체적으로, dNTP 뉴클레오티드 혼합물에서의 표준 dCTP 뉴클레오티드가 도 84a 및 도 84b 에서 도시된 2 개의 상이한 변형된 dCTP 분자들의 동일한 부분들의 혼합물로 대체되었고, 그것의 형태들은 표준 dCTP 에 대한 실질적 전자-화학적 변화들을 만들기 위해 선택되었다. 이들 형태들, 도 84a 에서 묘사된 dC4P-락토오스, 및 도 84b 에서 묘사된 d4CP-Cy7 은 CLICK 화학 반응을 통해 생성된다. 양자의 형태들은 트리포스페이트 링키지를 테트라-포스페이트 링키지로 대체하고, 그리고, DBCO CLICK 화학 링커를 통해, 말단 포스페이트 상에 추가적인 기를 부가한다. 여기서 사용된 기들은, dCTP 의 dCP4-락토오스 및 dCP-Cy7 변형된 형태들을 초래하는, 설탕, 락토오스, 및 염색 분자 "Cy7" 였다. 프라이머리 dCTP 의 감마에 변형들이 추가되어서, 통합 동안, 변형들이 폴리메라제에 의해 발휘되어, 오직 태생의 산물 DNA 만이 남도록 한다. 이러한 접근법은, 효소 기능 또는 진행성을 손상시킬 수 있을 DNA 의 형태를 변경함이 없이, 큰 분자적 섭동들, 및 따라서 신호 강화를 허용한다.
도 85a 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 s 시퀀스 감지 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 플롯은, 브릿지를 금 컨택들에 부착하기 위해, 1 μM 펩티드 농도에서, PBS 완충액에서 1 시간 동안 펩티드 브릿지 분자로 배양된 테스트 칩 상의 전극들에 대한 전류-대-전압 트레이스들이다. 2 볼트의 인가된 소스-드레인에서 3 나노-암페어 전류를 달성하는 최고 전류 트레이스는 제자리에 브릿지 분자를 갖는 전극을 나타낸다.
또한, 도 85b 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 s 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 브릿지 센서가 2 볼트의 소스-드레인 전압이 인가된 상태에서 뉴트라비딘 용액에 노출될 때, 대략적으로 10 초 내지 50 초의 시간에서 브릿지에 바인딩되는 후속 뉴트라비딘의 시그니처를 나타내는 전류-대-시간이다.
도 85c 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 s 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 뉴트라비딘-브릿지 복합체가 폴리메라제-말레이미드-바이오틴의 용액에 노출될 때, 10-20 초의 시간에서, 뉴트라비딘-브릿지 복합체를 바인딩하는 폴리메라제-말레이미드-바이오틴의 시그니처를 나타내는 전류-대-시간 트레이스이다.
마지막으로, 도 85d 는 알파-나선 펩티드 브릿지를 이용한 s 시퀀스 감지 실험으로부터의 추가적인 데이터를 나타낸다. 플롯은, 일련의 GT 반복들: (10xGT) TTT (10x GT) AAA (10x GT) CCC (10x GT) 을 갖는 시퀀스를 갖는, 템플릿 DNA 를 포함하는 용액이 조립되는 센서에 제공될 때 결과적인 시퀀싱 신호들을 전개한다. 도 84d 는 이들 신호들의 하나의 가능한 해석으로 주석이 달리고, 여기서, GT 에 대응하는 주요 스파이크들은 템플링의 트랙트들을 반복하고, 그리고, 전체적인 3 개의 상이한 템플릿 DNA 분자들은 도시된 바와 같이 45 초 동안 센서와 계합한다.
추가적인 예들
본 개시의 추가적인 비제한적인 예들은 다음을 포함한다.
센서로서, 제 1 전극에 결합된 제 1 컨택; 제 2 전극에 결합된 제 2 컨택; 제 1 컨택 및 제 1 전극 중의 하나와 제 2 컨택 및 제 2 전극 중의 하나 사이에서 정의된 센서 갭; 및, 제 1 단부 및 제 2 단부를 포함하는 브릿지 분자를 포함하고; 브릿지 분자는 바이오폴리머 브릿지 분자이고; 그리고, 상기 브릿지 분자는 제 1 단부에서 제 1 컨택에 결합되고, 제 2 단부에서 제 2 컨택에 결합되는, 센서.
센서로서, 기판 표면 위에 놓이는 제 1 전극; 상기 기판 표면 위에 놓이는 제 2 전극; 상기 제 1 전극과 상기 제 2 전극 사이에서 정의된 센서 갭; 및, 제 1 단부 및 제 2 단부를 포함하는 브릿지 분자를 포함하고, 상기 센서 갭은 약 5 nm 내지 약 30 nm 사이의 센서 갭 치수를 포함하고; 그리고, 상기 브릿지 분자는 제 1 단부에서 제 1 컨택에 결합되고, 제 2 단부에서 제 2 컨택에 결합되는, 센서.
다양한 실시형태들에서, 센서는 게이트 전극을 더 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 센서 갭은 약 5 nm 내지 약 30 nm 사이의 센서 갭 치수를 갖는다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자의 제 1 단부는 제 1 자기-조립 앵커 (self-assembling anchor) 를 포함하고, 및/또는 브릿지 분자의 제 2 단부는 제 2 자기-조립 앵커를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 바이오폴리머 브릿지 분자를 포함한다. 다양한 실시형태들에서, 바이오폴리머 브릿지 분자의 제 1 및/또는 제 2 단부들은 다양한 화학적 반응들에 의해 화학적으로 변형된다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 화학적으로 합성된 브릿지 분자를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 선형 바이오폴리머를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 브릿지 분자의 지속 길이보다 더 작은 단부-대-단부 길이를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 센서 갭 치수를 근사화하도록 구성된 단부-대-단부 길이를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 핵산 듀플렉스를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 핵산 듀플렉스는 DNA 듀플렉스, DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스, DNA-PNA 하이브리드 듀플렉스, PNA-PNA 듀플렉스, 및 DNA-LNA 하이브리드 듀플렉스 중의 하나를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 핵산 듀플렉스는 티올-변형된 올리고를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 자기-조립 앵커 및 제 2 자기-조립 앵커 중의 하나는 5'-티올 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 핵산 듀플렉스는 내부 바이오틴-변형된 뉴클레오티드를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 펩티드 시퀀스를 포함하고, 제 1 자기-조립 앵커 및 제 2 자기-조립 앵커 중의 하나는 L-시스테인 잔기를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 브릿지 분자를 포함하는 유체 배지가 제 1 컨택 및 제 2 컨택 중의 하나와 컨택될 때에 브릿지 분자 입체구조를 생성하기 위하여 자기-조립하도록 구성된다.
다양한 실시형태들에서, 센서는 프로브를 더 포함하고, 프로브는 브릿지 분자에 부착된다.
다양한 실시형태들에서, 센서는 브릿지 분자에 부착된 링커를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 프로브는 단일 타겟 분자를 계합하도록 구성된다.
다양한 실시형태들에서, 분자 브릿지 및/또는 프로브는 효소를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 효소는 폴리메라제 및 역전사 효소 중의 하나이다.
다양한 실시형태들에서, 타겟 분자는, 각각의 타겟 분자 피처가 개별 포지션을 가지는 복수의 타겟 분자들 피처들로서, 제 1 포지션에서의 제 1 타겟 분자 피처, 제 2 포지션에서의 제 2 타겟 분자 피처, 및 n 번째 포지션에서의 n 번째 타겟 분자 피처를 포함하는 복수의 타겟 분자들 피처들을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 프로브는 복수의 상이한 타겟 분자들을 포함하는 용액에서의 반응 동안에 타겟 분자와 계합하도록 구성된 효소이고, 반응은 시간 주기 t 를 포함하고, 타겟 분자와 컨택하는 것은 복수의 타겟 분자 피처들에 응답하여 효소에서의 복수의 입체구조 변화들을 생성하고, 복수의 구성 변화들의 각각은 신호 피처를 생성하기 위하여 센서에서의 전기적 전류를 조절한다.
다양한 실시형태들에서, 시스템은 상기 본 명세서에서 설명된 바와 같은 센서를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 시스템은 센서에 결합되고 신호 피처를 검출하도록 구성된 신호 프로세싱 시스템을 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 시스템 및/또는 센서는 시간 주기 t 에 걸쳐 검출된 복수의 신호 피처들을 포함하는 신호 트레이스를 생성하도록 구성된다.
다양한 실시형태들에서, 시스템은 신호 해석 디바이스를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 신호 해석 디바이스는 신호 해석 맵을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 신호 해석 맵은 알려진 타겟 시퀀스로부터의 신호 트레이스에 대하여 교정된다.
다양한 실시형태들에서, 신호 해석 디바이스는 타겟 시퀀스에 의해 생성된 신호 트레이스에 응답하여 신호 해석을 반환하도록 구성된다.
다양한 실시형태들에서, 신호 해석은 신호 트레이스 해석이 가능한 실제적인 시퀀스와 매칭될 가능성의 확률적 평가를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은: 상기의 예들 중의 임의의 것에 따른 센서를 제공하는 단계; 핵산 템플릿을 폴리메라제와 컨택하는 단계로서, 폴리메라제는 센서의 부분을 포함하는 브릿지 분자에 결합되는, 상기 컨택하는 단계; 선택적으로 전기적 전위를 센서에 인가하는 단계; 뉴클레오티드 염기 믹스를 제공하는 단계; 폴리메라제에 의해, 뉴클레오티드 염기 믹스로부터, 합성된 핵산으로의 뉴클레오티드의 통합을 포함하는 통합 이벤트를 수행하는 단계; 및, 통합 이벤트에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은, 시간 주기 t 에서 수행된 일련의 통합 이벤트들을 더 포함하고, 이 일련의 통합 이벤트들은 신호 피처들의 시퀀스를 포함하는 신호 트레이스를 생성한다.
다양한 실시형태들에서, 각각의 신호 피처는 일련의 통합 이벤트들 중의 하나에 대응한다.
다양한 실시형태들에서, 신호 트레이스는 노이즈를 더 포함하고, 방법은 신호 트레이스로부터 노이즈를 제거하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 각각의 통합 이벤트는 템플릿 염기-종속적인 폴리메라제 키네틱 시그니처를 생성한다.
다양한 실시형태들에서, 폴리메라제 키네틱 시그니처는 신호 피처에 기여한다.
다양한 실시형태들에서, 상기 방법은 비변형된 템플릿 뉴클레오티드에 응답하여 생성된 제 1 신호 피처, 및 변형된 템플릿 뉴클레오티드에 응답하여 생성된 제 2 신호 피처를 구별하기 위하여 적합하다.
다양한 실시형태들에서, 변형된 템플릿 뉴클레오티드는 N 6-메틸아데노신, N 4-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신, 및 5-카르복실시토신 중의 하나이다.
다양한 실시형태들에서, 변형된 템플릿 뉴클레오티드는 비염기 사이트이다.
다양한 실시형태들에서, 바이오분자 감지 디바이스는, 기판 표면 상에서 제 1 전극 및 제 2 전극을 형성하는 것으로서, 제 1 전극 및 제 2 전극은 전극 갭에 의해 분리되는, 상기 제 1 전극 및 제 2 전극을 형성하는 것; 제 1 전극 상에서 제 1 컨택을, 그리고 제 2 전극 상에서 제 2 컨택을 배치하는 것으로서, 제 1 컨택 및 제 2 컨택은 컨택 갭에 의해 분리되는, 상기 배치하는 것; 및, 브릿지 분자를 제 1 컨택 및 제 2 컨택에 부착하는 것을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 바이오분자 감지 디바이스는, 프로브를 브릿지 분자에 결합하기 위하여 브릿지 분자를 프로브와 컨택하는 것을 더 포함하고, 프로브는 자기-조립에 의해 브릿지 분자에 결합된다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자를 제 1 컨택 및 제 2 컨택에 부착하는 것은 자기-조립 단계를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 전극 갭 및/또는 컨택 갭은 약 5 nm 내지 약 30 nm 사이이다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 컨택 및/또는 제 2 컨택은 약 5 nm 의 직경을 갖는 금 나노입자들을 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 컨택 포지션 및/또는 제 2 컨택 포지션은 리소그래피 방법을 이용하여 결정된다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 전극 및 제 2 전극을 포함하는 기판 표면 상에서 포토레지스트 층이 배치되고, 리소그래피 방법을 이용하여 제 1 컨택 포지션 및 제 2 컨택 포지션을 정의한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은, 표면 유도체화 처리를 제 1 컨택 포지션 및 제 2 컨택 포지션에서 기판 표면에 적용하는 것을 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 표면 유도체화 처리는 실란화를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은, 금 층을 디포짓팅하는 것, 및 제 1 전극 상에 배치된 제 1 금 컨택 및/또는 제 2 전극 상에 배치된 제 2 금 컨택을 남기기 위하여 리프트-오프 단계를 수행하는 것을 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 방법은, 디바이스를 복수의 금 나노입자들을 포함하는 용액과 컨택하는 것, 및 제 1 컨택 포지션에서의 제 1 금 나노입자, 및/또는 제 2 컨택 포지션에서의 제 2 금 입자를 도입하는 것을 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 브릿지 분자를 프로브와 컨택하기 이전에, 자기-조립에 의해 제 1 컨택 및 제 2 컨택에 부착된다.
다양한 실시형태들에서, 브릿지 분자는 브릿지 분자를 자기-조립에 의해 제 1 컨택 및 제 2 컨택에 부착하기 이전에, 자기-조립에 의해 센서 복합체를 생성하기 위하여 프로브와 컨택된다.
다양한 실시형태들에서, 방법은, 제 1 전극 및 제 2 전극에 전자적으로 결합된 집적 회로를 제조하는 것을 더 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 집적 회로, 제 1 전극, 및 제 2 전극은 혼합된-신호 집적 회로를 포함한다.
다양한 실시형태들에서, 집적 회로, 제 1 전극, 및 제 2 전극은 CMOS 제조 방법을 이용하여 제조된다.
다양한 실시형태들에서, 제 1 및 제 2 컨택은 CMOS 제조 방법을 이용하여 제조된다.
다양한 실시형태들에서, 집적 회로, 제 1 전극, 및 제 2 전극은 전계 효과 트랜지스터를 생산하기 위하여 적합한 제조 방법을 이용하여 제조된다.
이익들, 다른 장점들, 및 문제들에 대한 해결책들은 특정 실시형태들에 대하여 본원에서 설명되었다. 또한, 본원에서 포함된 다양한 도면들에서 도시된 접속 라인들은 다양한 엘리먼트들 사이의 예시적인 기능적 관계들 및/또는 물리적 결합들을 나타내도록 의도된 것이다. 많은 대안적인 또는 추가적인 기능적 관계들 또는 물리적 접속들이 실제적인 시스템에서 존재할 수도 있다는 것을 주목해야 한다. 그러나, 이익들, 장점들, 문제들에 대한 해결책들, 그리고 임의의 이익, 장점, 또는 해결책이 발생하게 하거나 더욱 확연해지게 할 수도 있는 임의의 요소들은 발명들의 중요하거나, 요구되거나, 필수적인 특징들 또는 엘리먼트들로서 해석되지 않아야 한다. 발명들의 범위는 따라서, 첨부된 청구항들 이외의 어떤 것에 의해서도 제한되지 않아야 하고, 단수인 엘리먼트에 대한 언급은, 명시적으로 그렇게 기재되지 않으면, "하나 및 오직 하나" 를 의미하도록 의도되지 아니하고, 오히려 "하나 이상" 을 의미하도록 의도된다. 또한, "A, B, 또는 C 중의 적어도 하나" 와 유사한 어구가 청구항들에서 이용되는 경우, 그 어구는 A 단독으로 실시형태에서 존재할 수도 있거나, B 단독으로 실시형태에서 존재할 수도 있거나, C 단독으로 실시형태에서 존재할 수도 있거나, 또는 엘리먼트들 A, B, 및 C 의 임의의 조합, 예를 들어, A 및 B, A 및 C, B 및 C, 또는 A 및 B 및 C 가 단일 실시형태에서 존재할 수도 있다는 것을 의미하도록 해석된다는 것이 의도된다. 상이한 교차-해칭은 동일하거나 상이한 재료들을 반드시 나타내기 위한 것은 아니지만, 상이한 파트들을 나타내기 위하여 도면들의 전반에 걸쳐 이용된다.
시스템들, 방법들, 및 장치가 본원에서 제공된다. 본원에서의 상세한 설명에서, "하나의 실시형태", "실시형태", "예시적인 실시형태" 등에 대한 언급들은, 설명된 실시형태가 특정한 특징, 구조, 또는 특성을 포함할 수도 있지만, 모든 실시형태가 특정한 특징, 구조, 또는 특성을 반드시 포함하지는 않을 수도 있다는 것을 표시한다. 또한, 이러한 어구들은 동일한 실시형태를 반드시 지칭하고 있지는 않다. 또한, 특정한 특징, 구조, 또는 특성이 실시형태와 관련하여 설명될 때, 명시적으로 설명되든지 또는 그렇지 않든지, 다른 실시형태들과 관련하여 이러한 특징, 구조, 또는 특성에 영향을 미치는 것은 본 기술분야의 통상의 기술자의 지식 내에 있는 것으로 사료된다. 본원에서 설명된 다양한 예들 및 실시형태들은 핵산 타겟들에 관련하여 신호 검출의 방법들을 지칭하지만, 본 개시물의 디바이스들 및 방법들은 핵산들의 검출 및 시퀀싱을 포함하는 애플리케이션들로 결코 제한되지 않는다. 마찬가지로, 본원에서 설명된 다양한 예들 및 실시형태들은 바이오폴리머 브릿지들 분자들을 포함하는 센서들을 지칭하지만, 화학적으로 합성된 브릿지 분자들은 본 개시물의 범위 내에 있다. 설명을 읽은 후에, 대안적인 실시형태들에서 개시물을 어떻게 구현할 것인지는 관련 분야 (들) 에서의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
또한, 본 개시물에서의 엘리먼트, 컴포넌트, 또는 방법 단계는 엘리먼트, 컴포넌트, 또는 방법 단계가 청구항들에서 명시적으로 기재되는지 여부에 관계없이 공중에게 헌정되도록 의도된 것은 아니다. 본원에서의 청구항 엘리먼트는 엘리먼트가 어구 "하기 위한 수단" 을 이용하여 분명하게 기재되지 않으면, 미국 특허법 35 U.S.C. 112(f) 의 조항들 하에서 해석되지 않아야 한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어들 "포함한다", "포함하는", 또는 그 임의의 다른 변형은 비-배타적 포함을 커버하도록 의도된 것이어서, 엘리먼트들의 리스트를 포함하는 프로세스, 방법, 물품, 또는 장치는 그러한 요소들만을 포함하는 것이 아니라, 명시적으로 열거되지 않은, 또는 이러한 프로세스, 방법, 물품, 또는 장치에 고유한 다른 엘리먼트들을 포함할 수도 있다.
Claims (13)
- 센서로서,
소스 전극;
센서 갭에 의해 상기 소스 전극으로부터 이격된 드레인 전극;
게이트 전극으로서, 상기 소스 전극, 상기 드레인 전극 및 상기 게이트 전극은 협동하여 전극 회로를 형성하는, 상기 게이트 전극; 및
상기 센서 갭을 가로질러 브릿징하여 상기 소스 전극과 상기 드레인 전극을 연결하는 브릿지 분자; 및
상기 브릿지 분자에 결합된 프로브를 포함하고,
상기 프로브의 핵산과의 상호작용은 상기 전극 회로의 적어도 하나의 파라미터를 모니터링함으로써 검출가능한, 센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 그것의 변종들을 포함하는, 센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 프로브는 효소를 포함하는, 센서. - 제 3 항에 있어서,
상기 효소는 DNA 폴리메라제, 역전사 효소, 엑소뉴클레아제, 또는 헬리카제를 포함하는, 센서. - 제 4 항에 있어서,
상기 효소는 DNA 폴리메라제를 포함하는, 센서. - 제 5 항에 있어서,
상기 DNA 폴리메라제는 Phi29, PolI, 또는 그것의 변이종인, 센서. - 제 1 항에 있어서,
상기 브릿지 분자는 항체, 이중-가닥형 DNA 또는 단백질 알파-나선을 포함하는, 센서. - 제 7 항에 있어서,
상기 항체는 IgG 항체를 포함하는, 센서. - 제 8 항에 있어서,
상기 IgG 항체는 상기 소스 전극 또는 상기 드레인 전극 상의 적어도 하나의 컨택 포인트를 인식하는, 센서. - 제 8 항에 있어서,
상기 IgG 항체는 상기 소스 전극 및 상기 드레인 전극 상의 컨택 포인트들을 인식하는, 센서. - 센서로서,
기판 표면 위에 놓인 제 1 전극;
상기 기판 표면 위에 놓인 제 2 전극;
상기 제 1 전극과 상기 제 2 전극 사이에 정의된 센서 갭; 및
제 1 단부 및 제 2 단부를 포함하는 브릿지 분자를 포함하고,
상기 센서 갭은 약 5nm 와 약 30nm 사이의 센서 갭 치수를 포함하고; 그리고, 상기 브릿지 분자는 상기 제 1 단부에서 제 1 컨택에 결합되고 상기 제 2 단부에서 제 2 컨택에 결합되는, 센서. - 제 11 항에 있어서,
바이오폴리머 브릿지 분자는 핵산 듀플렉스를 포함하는, 센서. - 제 12 항에 있어서,
상기 핵산 듀플렉스는 DNA 듀플렉스, DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스, DNA-PNA 하이브리드 듀플렉스, PNA-PNA 듀플렉스, 및 DNA-LNA 하이브리드 듀플렉스 중 하나를 포함하는, 센서.
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