JP4520857B2 - 走査型プローブ顕微鏡検査（ｓｐｍ）読取用の特定の情報をエンコードするナノバーコードの制御された整列 - Google Patents

Description

技術分野
本発明の方法、組成物および装置は、分子生物学および生体分子の分析の分野に関し、核酸、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない。特に、本発明は、ナノバーコードおよび走査型プローブ顕微鏡検査（SPM）を使用して、核酸および／または他の生体分子を検出、同定および／または配列決定するための方法、組成物および装置に関する。

背景
生体分子、例えば核酸またはタンパク質の同定および／または配列決定は、医療診断、法医学、毒物学、病理学、細菌戦争、公衆衛生および多数の他の分野で必須である。現在、多大な研究が核酸またはタンパク質の同定および／または配列決定に向けられているが、他の生体分子、例えば炭水化物、多糖類、脂質、脂肪酸等も重要でありうる。本明細書に開示される方法、組成物および装置は、核酸の同定および／または配列決定に限定されず、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない他の種類の生体分子の分析にも使用される。

核酸検出のための標準的な方法、例えば、サザンブロット法または核酸チップへの結合は、蛍光性または放射性のプローブ分子をターゲット核酸分子とでハイブリッド形成する方法に依存する。核酸配列決定の公知の方法は、典型的に、サンガージデオキシ技術または核酸チップへのハイブリッド形成のいずれかを使用する。

オリゴヌクレオチドハイブリッド形成に基づくアッセイは、ターゲット核酸の検出に広く使用されている。ターゲット核酸に対して配列が相補的であるプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光性部分、放射性部分または他の部分に接着し、Watson-Crick塩基対形成によって核酸へハイブリッド形成することが可能である。この技術に関する多くの変形例が公知である。より近年には、何百または何千ものオリゴヌクレオチドプローブを含むことができるDNAチップが設計されている。ターゲット核酸の、チップ上のオリゴヌクレオチドへハイブリッド形成は、蛍光分光法、放射能等を使用して検出されてもよい。感受性および／または特異性に関する問題が、正確に相補的ではない配列の間の核酸ハイブリッド形成から生じることもある。試料中の低レベルのターゲット核酸の存在が検出されないこともある。

サイズによって分けられる4色蛍光性または放射性の核酸の検出に基づくサンガージデオキシ核酸配列決定の方法は、配列決定されることが可能な核酸の長さによって限定される。典型的に、核酸配列の500から1,000の塩基しか1回に決定することができない。現在の方法を使用すると、完全な遺伝子配列の決定には、遺伝子の多くのコピーを生成し、重なり合うフラグメントに切断し、配列決定することが必要であり、その後、重なり合っているDNA配列を集めてもよい。このプロセスは、難儀であり、高価で、能率が悪く、時間がかかる。これは典型的に、蛍光性または放射性の部分も使用し、それは、安全および廃棄物処理問題を引き起こす可能性がある。オリゴヌクレオチドチップへのハイブリッド形成を使用するより近年の核酸配列決定の方法は、短い核酸配列を推察するか、または試料中の特異的な核酸の存在を検出するために使用することはできるが、長い核酸配列を同定する場合には適切ではない。

タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを同定するために、様々な技術が利用可能である。一般に、これらは、タンパク質上の1つ以上のエピトープドメインを認識することができる抗体の結合および検出を含む。タンパク質の抗体に基づく同定はかなり速いが、そのようなアッセイは、抗体の異なる抗原との交叉反応のため、ターゲット分析対象物の低い抗原性のため（アッセイの低い感度につながる）、抗体の様々な表面への非特異的な結合等のため、受け入れられないほど高いレベルの偽陽性または偽陰性の結果を示す場合がある。これはまた、個別のタンパク質またはペプチドを認識することができる抗体の調製を必要とする。そのため、予め特性決定されていない新規のタンパク質を同定するには、適しない。

生体分子、例えば核酸またはタンパク質を検出し、同定および／または配列決定するための速く正確で高い感感度の方法の必要性が生じる。

例示的な態様の説明
開示された方法、組成物および装置は、生体分子、例えば核酸を検出、同定および／または配列決定するために使用するものである。本発明の特定の態様において、方法、組成物および装置は、1,000を超えるか、2,000を超えるか、5,000を超えるか、10,000を超えるか、20,000を超えるか、50,000を超えるか、100,000を超えるか、またはそれさえも超える長さの塩基の非常に長い核酸分子の配列を得るために適切である。利点として、1回のシーケンスランで長い核酸配列を読み取る能力があること、配列データを高速で得ること、低コストで配列決定すること、および配列データの1ユニット当たりに必要な操作時間の量の点から効率が高いことが挙げられる。他の利点として、偽陽性結果の発生率が低く、高感度で正確な核酸の検出および／または同定が挙げられる。

下記の詳細な説明は、本発明の開示された態様の、より徹底的な理解を提供するために、多数の特定の情報を含む。しかし、これらの特定の情報なしで本発明の態様を実施してもよいことは、当業者には明らかである。その他の場合には、当技術分野において公知の装置、方法、手順および個別の構成要素は、本明細書で詳細には説明されていない。

定義
本願で使用される「1つの」（aまたはan）は、アイテムの1つ以上を意味してもよい。

本願で使用される「約」は、値の10％以内を意味する。例えば、「約100」は、90から110の間の値を意味する。

「核酸」は、DNA、RNA（リボ核酸）、一本鎖、二本鎖または三本鎖の、およびそのいずれかの化学修飾を包含する。事実上あらゆる核酸の修飾が考えられる。「核酸」は、2以上の塩基のオリゴヌクレオチドから、完全長の染色体DNA分子まで、ほぼいかなる長さであってもよい。核酸は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含むが、それらに限定されない。

「コード化プローブ」は、1つ以上のナノバーコードに接着したプローブ分子を意味する。プローブ分子は、1つ以上のターゲット分子への選択的および／または特異的な結合を呈する分子である。本発明の様々な態様において、各異なるプローブ分子は、弁別可能なナノバーコードに接着してもよく、そのため、特定のプローブの結合は、異なるプローブ分子の集団から、検出されてもよい。本発明の態様は、使用されてもよいプローブ分子の種類に関して限定されない。当技術分野において公知のいかなるプローブ分子が使用されてもよく、例えば、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、レセプタタンパク質、ペプチド、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン等を含むが、それらに限定されない。本発明の一定の態様において、コード化プローブは、オリゴヌクレオチドおよび／または核酸を含んでもよく、そのオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の配列を同定する1つ以上のナノバーコードに共有的にまたは非共有的に接着している。本発明の様々な態様において、コード化プローブの線系列は、一緒にライゲートされてもよい。ライゲートされた分子の各コード化プローブは、弁別可能なナノバーコードに接着してもよく、その配列を同定するのを可能にする。ライゲートされた分子の各コード化プローブの配列もまた決定されてもよいため、ライゲートされた分子全体の配列が同定されてもよい。代替の態様において、オリゴヌクレオチドプローブ内の各ヌクレオチドは、弁別可能なナノバーコードに接着してもよく、コード化プローブの配列がヌクレオチドの配列から同定されるのを可能にする。

「ナノバーコード」は、コード化プローブを検出および／または同定するために使用されてもよい組成物を意味する。下記において詳細に検討される非限定的な実施例において、ナノバーコードは、1つ以上のマイクロメートル以下の金属バーコード、カーボンナノチューブ、フラーレン、または走査型プローブ顕微鏡検査によって検出され同定されることができる他のいずれのナノスケール部分を含んでもよい。ナノバーコードは単一の部分に限定されず、本発明の一定の態様において、ナノバーコードは、例えば、互いに接着した2つ以上のフラーレンを含んでもよい。例えば、フラー連は、特定の順番で一緒に接着した一連の大きなフラーレンおよび小さなフラーレンから構成されてもよい。ナノバーコードの異なるサイズのフラーレンの順番は、走査型プローブ顕微鏡検査によって検出されてもよく、これを使用して、例えば、接着したオリゴヌクレオチドプローブの配列を同定してもよい。

「ターゲット」または「分析対象物」分子は、コード化プローブに結合してもよい分子であり、核酸、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない。本発明のいくつかの態様において、コード化プローブのターゲット分子への結合を使用して、試料中におけるターゲット分子の存在を検出してもよい。

分子コーミング
本発明の様々な態様において、ナノバーコード、コード化プローブ、および／またはコード化プローブに結合されたターゲット分子は、表面に接着してもよく、分析のために整列されてもよい。いくつかの態様において、コード化プローブは表面に整列されてもよく、下記に検討されるように組み込まれたナノバーコードが検出されてもよい。コード化プローブの整列は、コード化プローブの同定のさらに高い正確さ、および/またはスピードを提供する。整理されていないパターンで表面上に位置されるコード化プローブまたはナノバーコードは、お互いに重なり、または、それらの検出および/または同定を部分的に分りにくくし、複雑にするかもしれない。代替の態様において、ナノバーコードは、プローブ分子から取り外されてもよく、表面に整列され、検出されてもよい。一定の態様において、個別のターゲット分子に結合されたコード化プローブの順番は保持されてもよく、例えば、走査型プローブ顕微鏡検査によって検出されてもよい。他の態様において、ターゲット分子の複数のコピーが試料中に存在してもよく、ターゲット分子の同定および／または配列は、複数のコピーに結合するコード化プローブのすべての配列を重なり合っているターゲット分子配列内に集合させることによって、決定されてもよい。例えば、重なり合っている部分的な核酸またはタンパク質の配列を隣接する配列内に集合させることは、当技術分野においては公知である。様々な態様において、ナノバーコードは、プローブ分子に接着している間に検出されてもよく、または検出される前にプローブ分子から取り外されてもよい。

表面へ接着するための、および核酸等の分子、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはナノバーコードを整列するための、方法および装置は、当技術分野においては公知である（例えば、Bensimonら、Phys. Rev. Lett. 74: 4754-57, 1995; Michaletら、Science 277: 1518-23, 1997；米国特許第5,840,862号、第6,054,327号、第6,225,055号、第6,248,537号、第6,265,153号、第6,303,296号および第6,344,319号を参照されたい）。ナノバーコード、コード化プローブおよび／またはターゲット分子は、表面へ接着してもよく、空気−水メニスカスまたは他の種類の界面に固有の物理的な力を使用して、整列されてもよい。この技術は、一般に、分子コーミングとして知られている。ナノバーコード、コード化プローブ、および／または水性媒体中に溶解したターゲット分子は、一方の端もしくは両方の端で、表面、例えば、シラン化ガラススライド、ビオチン化表面、金コート表面、またはそのような分子に結合することができることが当技術分野において知られている他のいかなる表面に接着してもよい。表面は、水性媒体からゆっくり引き抜かれてもよい。極性または荷電したターゲット分子、ナノバーコード、および／またはコード化プローブは、親水性（水性）媒体に優先的に分配する。このようにして、表面を水性媒体から除去することは、結果として、結合したターゲット分子、ナノバーコード、および／またはコード化プローブを、メニスカスの運動の方向に平行に伸ばすことになる。伸ばされた分子の測定された長さとその実際のサイズとの間には直接相関があり、伸ばされた長さの1μmは、核酸配列の約2,000塩基に対応する（Herrickら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 222-227, 2000）。

ひとたび表面が水性媒体から完全に除去されると、接着したナノバーコード、および／またはコード化プローブは、より容易に且つ正確に分析が可能なように平行に整列される。本発明の一定の態様において、コード化プローブの両端が表面に接着する場合には、整列したコード化プローブはU字形構造に配列され、これもまた分析が容易である。この技術は、ターゲット分子、ナノバーコード、および／または整列されるべきコード化プローブのサイズによって限定されず、染色体以内であれば、核酸に作用することができる（例えば、Michaletら、1997; Herrickら、2000）。メニスカスの運動の適切な速度で、発生した剪断力は、比較的低く、結果として、数百kbまたはそれより長い整列されたDNAフラグメントになる（Michaletら、1997）。

分子コーミングは、分子が処理された表面へ強力に非特異的に吸着することによって阻害される（Bensimonら、1995）。このようにして、本発明の様々な態様において、ターゲット分子またはコード化プローブの1つ以上の端のみが表面に結合するように、表面は処理される。核酸および他の種類のコード化プローブを表面へ結合するための方法は、当技術分野においては公知であり、下記に要約される。非限定的な実施例において、ターゲット分子、ナノバーコードまたはコード化プローブは、分子の一方の端または両方の端でビオチン残基で共有的に修飾されてもよい。アビジンまたはストレプトアビジンがコートされた表面に露出されると、ビオチン化された端のみが表面に結合する。表面への非特異的な吸着は、疎水性である表面、例えばシラン化された表面の使用によって減少されてもよい。

本発明の態様は、使用されてもよい表面の種類によって限定されない。表面の非限定的な例として、ガラス、機能化ガラス、セラミック、プラスチック、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、PTFE（ポリテトラフルオロエチレン）、PVP（ポリビニルピロリドン）、ゲルマニウム、ケイ素、石英、ガリウムヒ素、金、銀、ナイロン、ニトロセルロース、または表面に接着したナノバーコードおよび／またはコード化プローブを有することができる当技術分野において公知の他の材料が挙げられる。接着は、共有相互作用によっても非共有相互作用によってもよい。本発明の一定の態様において、表面はガラススライドまたはカバースリップの形態であるが、表面の形状は限定されず、表面はいかなる形状であってもよい。本発明のいくつかの態様において、表面は平面である。

表面にターゲット分子、ナノバーコードおよび／またはコード化プローブを整列するための代替方法は、当技術分野において公知である。（例えば、Bensimonら、1995; Michaletら、1997、米国特許第5,840,862号、第6,054,327号、第6,225,055号、第6,248,537号、第6,265,153号、第6,303,296号および第6,344, 319号を参照されたい）。整列のいかなる公知の方法を、特許請求された主題の範囲内で使用してもよいと考えられる。本発明の一定の態様において、水性媒体に溶解したターゲット分子、ナノバーコード、またはコード化プローブが可動メニスカスを通って引かれるときに、整列が発生する。メニスカスが動く機構は重要ではなく、例えば、表面をバッファ溶液に浸漬して、これを溶液からゆっくり引き抜くことによって、達成されてもよい。または表面は、溶液に浸漬されてもよく、メニスカスの高さは、蒸発によってまたは液体の除去によって、ゆっくり低下してもよい。本発明の別の態様において、溶液の滴は、カバースリップと表面、例えばガラススライド、との間に置かれてもよい。表面は、カバースリップから離れてゆっくり引かれてもよい。溶液がカバースリップに接着するため、これは、結果として、カバースリップが表面に接触する縁で、空気−水界面が形成されることになる。この界面を動かして、ターゲット分子、ナノバーコードおよび／またはコード化プローブを、表面に整列させる。ナノバーコードおよび／またはコード化プローブを整列させるための別の代替方法は、下記により詳細に検討される分子コーミングの代わりにまたはその最中のいずれかに、フリーフロー電気泳動を使用することを含む。

核酸
検出、同定および／または配列決定されるべき核酸分子は、当技術分野において公知のいかなる技術によって調製されてもよい。本発明の一定の態様において、核酸は、自然発生的なDNAまたはRNA分子である。事実上いかなる自然発生的な核酸が、開示された方法によって、検出、同定および／または配列決定されてもよく、例えば、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、および葉緑体DNA、ならびに、リボソームRNA、トランスファーRNA、ヘテロ核RNA、およびメッセンジャーRNAを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、分析されるべき核酸は、天然のホモジェネート、または細胞、組織または器官の抽出物に存在してもよい。他の態様において、核酸は、分析前に部分的にまたは完全に精製されてもよい。代替の態様において、分析されるべき核酸分子は、化学合成によって、または当技術分野において公知の広く様々な核酸増幅、複製および／または合成方法によって、調製されてもよい。あるいは、下記の実施例に記述されているように、コード化プローブおよび/またはナノバーコードは、マイクロ流体分子コーミングによって整列されるかもしれない。

様々な形態の細胞核酸を精製するための方法は公知である（例えば、Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987；Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、eds. Sambrook, FritschおよびManiatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照されたい）。引用された文献に開示された方法は、模範的なだけであり、当技術分野において公知のいずれの変形例を使用してもよい。一本鎖 DNA（ssDNA）が分析されるべき場合には、ssDNAは、いずれかの公知の方法によって、二本鎖DNA（dsDNA）から調製されてもよい。そのような方法は、dsDNAを加熱し、鎖が分離するのを可能にすることを含んでもよく、または例えばM13へのクローニング等の公知の増幅または複製の方法によって、dsDNAからssDNAを調製することを含んでもよい。いかなるそのような公知の方法を使用して、ssDNAまたはssRNAを調製してもよい。

本発明の一定の態様は、自然発生的な核酸の分析に関するが、実際にはいずれかの種類の核酸を使用することができる。例えば、様々な増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR（商標））増幅、によって調製された核酸を分析することができる。（米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号を参照されたい）。または分析されるべき核酸は、標準ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、BAC（細菌人工染色体）またはYAC（酵母人工染色体）によって、クローン化されてもよい（例えば、BergerおよびKimmel, 1987; Sambrookら、1989を参照されたい）。核酸インサートは、例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断したのち、アガロースゲル電気泳動によってベクターDNAから分離してもよい。核酸インサートを分離する方法は、当技術分野においては公知である。開示された方法は、分析されるべき核酸の源に関して限定されず、原核生物、細菌、ウイルス、真核生物、哺乳類および／またはヒトを含むいずれの種類の核酸が、特許請求された主題の範囲内で分析されてもよい。

本発明の様々な態様において、下記に検討されるように、単一の核酸の複数のコピーが、コード化プローブのハイブリッド形成によって分析されてもよい。例えば様々な増幅および／または複製方法によって単一の核酸を調製し、複数のコピーを形成することは、当技術分野においては公知である。または単一のクローン、例えば、BAC、YAC、プラスミド、ウイルス、または単一の核酸インサートを含む他のベクターを分離し、増殖させてもよく、分析のためにインサートを取り出し、精製してもよい。クローン化し、精製された核酸インサートを得るための方法は、当技術分野においてよく周知である。

特許請求された主題の範囲は、核酸の分析に限定されず、タンパク質、脂質および多糖類を含むがそれらに限定されない他の種類の生体分子の分析にも関係することを、当業者は完全に理解する。様々な種類の生体分子を調製および／または精製するための方法は、当技術分野において公知であり、そのような方法が使用されてもよい。

コード化プローブライブラリ
本発明の一定の態様において、コード化プローブは、プローブ分子のライブラリを含んでもよく、各異なるプローブは、弁別可能なナノバーコードに接着している。所与のライブラリ内で、特異的なプローブ分子の2つ以上のコピーがあることが可能である。この場合、同一プローブの各コピーは、同一のナノバーコードに接着する。使用されるプローブおよびナノバーコードの種類は限定されず、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、レセプタタンパク質、ペプチド、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン等を含むが、それらに限定されないいかなる種類の公知のプローブ分子が使用されてもよい。さらに、いずれの種類の弁別可能なナノバーコードが使用されてもよい。

オリゴヌクレオチドライブラリ
本発明の様々な態様において、コード化プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、例えば、規定された配列のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、弁別可能なナノバーコードに接着してもよく、分析されるべき核酸、および一緒にライゲートされた隣接するコード化プローブに、ハイブリッド形成されてもよい。核酸から分離した後に、ライゲートされたコード化プローブは、上記に検討されたように、表面に接着し、整列されてもよい。整列したコード化プローブは、次いで、走査型プローブ顕微鏡検査（SPM）によって分析されてもよい。SPM分析は、コード化プローブのナノバーコードの検出および同定を可能にし、且つ、核酸に結合するコード化プローブの配列の決定を可能にする。その情報を使用して、核酸を同定および／または核酸配列を決定することができる。特許請求された主題は、SPM検出方法に限定されず、表面に整列されたナノバーコードおよび／またはコード化プローブを検出し、同定することができるいかなる分析方法を使用してもよいことを、当業者は完全に理解する。また、SPM分析は、オリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブの検出および同定に限定されず、いかなる種類のコード化プローブおよび／またはナノバーコードで使用されてもよいことをも、当業者は完全に理解する。

本発明の代替の態様において、コード化プローブは、隣接するコード化プローブのライゲーションなしで検出されてもよい。コード化プローブは、同一ターゲット分子の複数コピーにハイブリッド形成されてもよい。ハイブリッド形成されていないコード化プローブが除去されてもよく、ハイブリッド形成されたコード化プローブが検出される。いくつかの態様において、依然としてターゲット分子にハイブリッド形成されながら、コード化プローブが検出されてもよい。またはコード化プローブは、例えば試料を加熱することによって、ターゲット分子から取り外されてもよく、次いで、検出される。そのような態様において、ナノバーコード構成要素は、検出前にコード化プローブのプローブ構成要素から除去されてもされなくてもよい。

本発明の一定の態様において、コード化プローブは、依然としてターゲット分子に接着しながら、検出されてもよい。短いオリゴヌクレオチドプローブとターゲット核酸との間の結合相互作用が比較的弱い強度であることを考えると、そのような方法は、例えば、コード化プローブが架橋試薬を使用してターゲット分子へ共有結合している場合に、または抗体−抗原相互作用のように、プローブ分子とターゲットとの間の結合相互作用がより強い場合に、より適切であるかもしれない。

本発明の様々な態様において、オリゴヌクレオチド型のコード化プローブは、DNA、RNA、またはそのいずれの類似体、例えば、ペプチド核酸（PNA）であってもよく、これは、核酸の特異的な相補的な配列を同定するのに使用することができる。本発明の一定の態様において、1つ以上のコード化プローブライブラリが、1つ以上の核酸分子へハイブリッド形成するために調製されてもよい。例えば、4096すべてまたは約2000の非相補的6-mer、または16,384すべてまたは約8,000の非相補的7-merを含有する1セットのコード化プローブを使用してもよい。オリゴヌクレオチドコード化プローブの非相補的サブセットが使用されるべきであれば、複数のハイブリッド形成および配列分析を実施してもよく、分析の結果は、算定方法によって単一のデータに統合されてもよい。例えば、ハイブリッド形成および配列分析のために非相補的6-merのみを含むライブラリを使用した場合、第1のライブラリから除外されたコード化プローブ配列にハイブリッド形成された同一のターゲット核酸分子を使用する第2のハイブリッド形成および分析が実施されてもよい。

本発明のいくつかの態様において、コード化プローブライブラリは、所与のオリゴヌクレオチド長さに可能な配列すべてを含んでもよい（例えば、6-merライブラリは、4096コード化プローブから構成される）。そのような場合には、一定のコード化プローブは、相補的なコード化プローブ配列とハイブリッドを形成する。そのようなハイブリッドは、ハイブリッド形成されていないコード化プローブと同様に、公知の方法、例えば、高速液クロマトグラフィ（HPLC）、ゲル透過クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、限外濾過、および／またはハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィを使用して、ターゲット分子にハイブリッド形成されたコード化プローブから分離されてもよい。所与の長さのすべての可能な配列のオリゴヌクレオチドの完全セットまたは特定のサブセットを選択し生成するための方法は、公知である。様々な態様において、長さが2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれ以上のヌクレオチドのコード化プローブが使用されてもよい。

本発明の一定の態様において、コード化プローブライブラリは、一方または両方の端で不変の核酸配列に接着したコード化プローブの中間にランダム核酸配列を含んでもよい。例えば、12-merコード化プローブのサブセットは、各端で不変の2-merに接着したランダム8-mer配列の完全セットから構成されてもよい。これらのコード化プローブライブラリは、その不変の部分にしたがって再分割されることができ、核酸に別個にハイブリッド形成されることができ、その後、各異なるコード化プローブライブラリの組み合わされたデータを使用して分析され、核酸配列を決定する。必要なサブライブラリの数は、ランダム配列に接着する不変の塩基の数の関数であることを当業者は完全に理解する。代替の態様は、ランダムオリゴヌクレオチド配列に接着した特異的な不変の部分を含む単一のコード化プローブライブラリで、複数のハイブリッド形成および分析を使用してもよい。核酸上のいずれかの所与の部位に、異なるが重なり合っている配列の複数のコード化プローブが、わずかにずれたやり方でその部位に結合することが可能である。このようにして、単一のライブラリで複数のハイブリッド形成および分析を使用して、重なり合っているずれたコード化プローブ配列をコンパイルすることによって、核酸の完全な配列を得ることができる。

オリゴヌクレオチドライブラリに関与する本発明の態様において、オリゴヌクレオチドは、いかなる公知の方法によって、例えば、Applied Biosystems 381A DNA合成装置（Foster City、CA）または類似の器具で合成することによって、調製されてもよい。またはオリゴヌクレオチドは、様々な販売元（例えば、Proligo, Boulder, CO; Midland Certified Reagents, Midland, TX）から購入することができる。オリゴヌクレオチドが化学的に合成される態様において、ナノバーコードは、合成に使用される1つ以上のヌクレオチド前駆物質に、共有結合させてもよい。またはナノバーコードは、オリゴヌクレオチドプローブが合成された後に、接着してもよい。他の代替において、ナノバーコードは、オリゴヌクレオチド合成と同時に接着してもよい。

本発明の一定の態様において、コード化プローブは、ペプチド核酸（PNA）を含んでもよい。PNAは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）用の単量体単位を備えたDNA類似体のポリアミド型である。PNAは、例えば、PE Biosystems（Foster City, CA）のような企業が販売している。またはPNA合成は、第3アミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下で0-（7-アザベンゾトリアゾル-1-yl)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）を使用する、9-フルオロエニルメトキシカルボニル（9-fluoroenylmethoxycarbonyl）（Fmoc）モノマー活性、およびカップリングで実施されてもよい。PNAは、逆相高速液クロマトグラフィ（RP-HPLC）によって精製することができ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析によって実証することができる。

ナノバーコード
各コード化プローブは、少なくとも1つの共有的または非共有的に結合したナノバーコードを組み込んでもよい。ナノバーコードを使用して、個別のコード化プローブを検出および／または同定してもよい。本発明の一定の態様において、各コード化プローブは、2つ以上の接着したナノバーコードを有してもよく、その組み合わせは、特定のコード化プローブに独特である。ナノバーコードの組み合わせを使用して、ライブラリ内のコード化プローブを特異的に同定するために利用することができる弁別可能なナノバーコードの数を拡大することができる。本発明の他の態様において、コード化プローブは、各々が、接着した単一の独特のナノバーコードを有してもよい。唯一必要なことは、各コード化プローブから検出された信号が、そのコード化プローブを異なるコード化プローブから弁別可能に同定することができなければならないということである。

本発明の一定の態様において、ナノバーコードは、コード化プローブの合成の前に、前駆物質内に組み込まれてもよい。オリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブでは、アデニン（A）およびグアニン（G）の位置で共有結合の内部アミノ酸修飾が考えられる。内部接着は、市販のホスホロアミダイトを使用して、チミン（T）の位置で実施されてもよい。いくつかの態様において、A位置およびG位置にプロピルアミンリンカーを備えたライブラリセグメントを使用して、ナノバーコードをコード化プローブに接着してもよい。内部アミノアルキルテールの導入によって、ナノバーコードの合成後接着が可能になる。リンカーは、Synthetic Genetics（San Diego, CA）等のベンダーから購入してもよい。本発明の1つの態様において、ナノバーコードの適切なホスホロアミダイト誘導体を使用する自動カップリングが考えられる。そのようなナノバーコードは、オリゴヌクレオチド合成中に、5'-末端に連結されてもよい。

一般に、ナノバーコードは、コード化プローブがターゲット分子へ結合するのを、例えば、核酸へハイブリッド形成するのを、を容易にするために、ナノバーコードとの立体障害を最小限にするようなやり方で、プローブに共有的に接着する。コード化プローブへ一定の程度の可撓性を提供するリンカーを使用してもよい。ホモまたはヘテロの二官能価リンカーは、様々な市販品製造元から入手可能である。

オリゴヌクレオチド塩基へ接着する点は、塩基によって異なる。いずれの位置で接着することも可能であるが、一定の態様において、接着は、相補的塩基への水素結合に関与しない位置で発生する。このようにして、例えば、ウリジン、シトシンおよびチミン等のピリミジンの5位置または6位置への接着が、可能である。アデニンおよびグアニン等のプリンでは、リンカーは、8位置を経由してもよい。特許請求された方法および組成物は、例えばオリゴヌクレオチド等のいずれの特定の種類のプローブ分子にも限定されない。ナノバーコードを他の種類のプローブ、例えば、ペプチド、タンパク質および／または抗体プローブへ接着するための方法は、当技術分野においては公知である。

本発明の態様は、使用されてもよいナノバーコードの種類に関して限定されない。当技術分野において公知のいずれの種類のナノバーコードが使用されてもよいと考えられる。非限定的な例として、カーボンナノチューブ、フラーレン、およびマイクロメートル以下の金属バーコードが挙げられる。

金属バーコード
ナノバーコードとして使用される可能性のあるマイクロメートル以下の金属バーコードの例は、当技術分野においては公知である（例えば、Nicewarner-Penaら、Science 294: 137-141, 2001）。Nicewarner-Penaら（2001）は、異なる種類の金属から構成されたマイクロメートル以下のストライプでエンコードされたマルチメタルマイクロロッドを調製する方法を開示している。このシステムによって、非常に大きな数、2種類の金属を使用した場合で4160まで、3種類の異なる金属を使用した場合で8×10⁵までの弁別可能なナノバーコードを作ることが可能である。そのようなナノバーコードは、コード化プローブ内に組み込まれてもよく、SPM技術によって読み取られてもよい。金属粒子、例えば金または銀をオリゴヌクレオチドおよび他の種類のプローブ分子へ接着する方法は、当技術分野においては公知である（例えば、米国特許第5,472,881号を参照されたい）。金属ナノバーコード（商標）は、市販品販売元（例えば、Nanoplex Technologies, Mountain View, CA）から得ることができる。金属ナノバーコード（商標）は、市販品販売元（例えば、Nanoplex Technologies, Mountain View, CA）から得ることができる。

量子ドットマイクロビーズ
ナノバーコードはまた、Hanら（Nature Biotech. 19: 631-635, 2001）に開示されているように、量子ドットタグ付マイクロビーズを含むことができる。異なるサイズの量子ドット（硫化亜鉛（zin-sulfide）でキャップされたカドミウムセレン化物ナノ結晶）を、正確に制御された割当量でポリマーマイクロビーズに埋め込むことにより、マルチカラー光学コード化マイクロビーズが作られている。2001文献は、蛍光タグの取付けおよび検出のためのマイクロビーズの使用に関しているが、当業者であれば、そのようなビーズをSPMイメージング等の他の検出態様に使用してもよいことを理解するであろう。または、定電流陽極腐蝕法によってエンコードされた多孔性シリコンフォトニック結晶が提案されている（Cuninら、Nature Materials 1: 39-41, 2002）。そのようなミクロンサイズのナノ構造粒子は、ナノバーコードのSPMの検出にも使用することができる。

カーボンナノチューブ
開示された方法に使用されるナノバーコードの別の例として、単層カーボンナノチューブ（SWNT）が挙げられる。ナノチューブは、SPM方法によって弁別されてもよい様々な形状およびサイズに作られてもよい（例えば、Freitagら、Phys. Rev. B 62: R2307-R2310, 2000; Claussら、Europhys. Lett. 47: 601-607, 1999; Claussら、Phys. Rev. B. 58: R4266-4269, 1998; Odomら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 960: 203-215, 2002を参照されたい）。Odomら（2002）は、サイズが10nm以下のSWNTのトンネルスペクトルにおける別々のピークを検出することができるSTM（走査型トンネル顕微鏡）技術を開示している。そのようなピークは、カーボンナノチューブの電子状態密度（DOS）におけるバンホーブ特異点を表してもよい。

カーボンナノチューブの電子特性は、チューブの長さによって調節される。電子波動関数の長さに対する感受性は、長さLのチューブのエネルギーレベル分割の概算によって示される。
ΔE=hvF/2L （式 1）
ただし、hはプランク定数であり、vFはフェルミ速度（8.1×10⁵m／秒）である（Venemaら、「Imaging Electron Wave Functions of Carbon Nanotubes」、Los Alamos Physics Preprints: cond-mat/9811317, 23 Nov. 1996）。電子エネルギーレベルの間の差は、ナノチューブの長さに反比例し、より長いチューブではより微細な分割が観察される。

本発明の一定の態様では、ナノバーコードとして使用されるナノチューブは、約10から200nmのチューブ長さおよび約1.2から1.4nmの直径を有してもよい。ナノバーコードとして使用されるべきナノチューブの長さまたは直径は限定されず、事実上いかなる長さまたは直径のナノチューブをも考慮してもよい。

ナノチューブは、公知の方法によって調製されてもよく、または商業的供給元、例えば、CarboLex (Lexington、KY), NanoLab (Watertown、MA), Materials and Electrochemical Research (Tucson, AZ) またはCarbon Nano Technologies Inc. (Houston, TX)、から得られてもよいと考えられる。使用前に、合成されたかまたは購入されたかのいずれかのナノチューブに、幾分の処理をすることが、適切である場合もある。処理は、ナノチューブをプローブへ接着するのを容易にし、コード化プローブを形成するために、ナノチューブを他の汚染物質から精製すること、混合直径および／または長さのナノチューブを別々の直径および長さのナノチューブに分離すること、ナノチューブ端キャップを除去すること、および／または共有修飾すること、を含んでもよい。

本発明の一定の態様において、変動する長さおよび／または直径のカーボンナノチューブは、当技術分野において公知の様々な技術によって作られてもよく、炭素アーク放電、炭化水素の触媒熱分解による化学蒸着、プラズマ支援化学蒸着、触媒金属含有グラファイトターゲットのレーザアブレーション、または凝縮相電気分解を含むが、それらに限定されない（例えば、米国特許第6,258,401号、第6,283,812号および第6,297,592号を参照されたい）。いくつかの態様において、ナノチューブは、質量分析法によってサイズソートされてもよい（Parkerら、J. Am. Chem. Soc. 113: 7499-7503, 1991を参照されたい）。またはナノチューブは、コード化プローブ内に組み込む前に、個別のナノチューブの形状を正確に測定するために、AFM（原子間力顕微鏡）またはSTM（走査型トンネル顕微鏡）を使用して、ソートされてもよい。当技術分野において公知のサイズ細分化の他の方法、例えば、ガスクロマトグラフィ、飛行時間型質量分析法、限外濾過法または等価の技術が考えられる。ひとたびソートされると、カーボンナノチューブは、誘導体化し、公知の配列のオリゴヌクレオチドプローブにまたは他のいずれの種類のプローブに共有結合させることができる。

カーボンナノチューブに可能なチューブ長さの最小漸進的変化は炭素−炭素結合の長さであり、すなわち、約0.142nmである。200nmのチューブ長さの範囲で、これは、約1400の別々のナノバーコードを可能にする。しかし、この方法は、1つのコード化プローブにつき単一のナノチューブに限定されない。代替の態様において、異なる長さおよび直径の複数のナノチューブが、単一のコード化プローブに接着してもよい。異なる長さのナノチューブを使用して、可能な弁別可能なナノバーコードの数は指数関数的に増大する。いくつかの態様において、分析を簡略にするために、単一のナノチューブが単一のプローブ分子に接着してもよい。

本発明の他の態様は、規定された長さおよび直径のカーボンナノチューブを作る方法に関する。非限定的な模範的な態様において、チップは、予め選択された厚さのSiCの層を含んでもよく、例えばケイ素または触媒（例えばニッケル等の金属原子）がドープ塗布されたケイ素から構成された層に重なり合っている。標準チップ処理方法、例えば、フォトリソグラフィおよびエッチングまたはレーザアブレーション等を使用して、SiC層は、いずれの長さ、幅、厚さおよび形状のSiC沈殿物に分割されてもよい。その後、チップは、真空下で加熱されてもよく、例えば、約1400℃で約10^-7トールで、または約10^-3から10^-12トール、10^-4から10^-10トール、または10^-5から10^-9トール、および1200から2200℃または1400から2000℃である。これらの状態下で、SiC結晶は自発的に分解し、ケイ素原子を失う（米国特許第6,303,094号）。残っている炭素原子は、カーボンナノチューブ内に自発的に集まる。SiC沈殿物のサイズおよび形状は、いずれの長さおよび直径のカーボンナノチューブを作るために、正確に制御されてもよい。

上記に検討された本発明の模範的な態様は、限定的なものではなく、選択された長さおよび直径のカーボンナノチューブを作るいずれの方法が使用されてもよい（例えば、米国特許第6,258,401号、第6,283,812号および第6,297,592号）。いくつかの態様において、ナノチューブの長さは、レーザビーム、電子ビーム、イオンビームまたはガスプラズマビームを使用して端をトリムすることによって、調整されてもよい。またはナノチューブの端は、チューブの端を酸化的に除去するために、酸素含有雰囲気中でホットブレードに接触されることができる。ナノチューブを含むブロックはまた、ナノチューブの先端を切り取るために、切削または研磨されることができる。

本発明の一定の態様において、カーボンナノチューブは、プローブ分子への接着を容易にするために、反応基で誘導体化されてもよい。非限定的な実施例において、ナノチューブは、カルボン酸基を含むように誘導体化されてもよい（米国特許第6,187,823号）。カルボン酸誘導体化ナノチューブは、標準化学反応によって、例えば、プローブに位置する第1級または第2級のアミン基とアミド結合のカルボジイミド媒介形成によって、プローブ分子に接着してもよい。誘導体化および架橋の方法は限定的ではなく、当技術分野において公知のいずれの反応基または架橋方法が使用されてもよい。

フラーレン
本発明の代替の態様において、フラーレンが、ナノバーコードとして使用されてもよい。フラーレンを作る方法は周知である（例えば、米国特許第6,358,375号）。フラーレンは、カーボンナノチューブ用に上記に開示されたものに類似した方法によって、誘導体化し、プローブ分子に接着してもよい。フラーレン含有コード化プローブは、ナノチューブ用に上記に開示されたものに類似したSPM技術によって同定されてもよい。

本発明の一定の態様において、フラーレンは、オリゴヌクレオチドコード化プローブ内の個別のヌクレオチドに接着してもよい。そのような場合には、2つの異なる種類の弁別可能なフラーレンが必要なだけであるが、それは、オリゴヌクレオチドには4種類のヌクレオチドしか見出されず、2種類のフラーレンが4つの異なる組み合わせ（例えば、AA、BB、ABおよびBA）に組み合わされてもよいからである。個別のヌクレオチドがナノバーコードに接着する場合には、ターゲット核酸へのハイブリッド形成との立体障害を回避するために、ヌクレオチドとフラーレンとの間に公知の連結基を使用することが適切であるかもしれない。

開示された方法に使用されるナノバーコードは、本明細書に開示された態様に限定されず、プローブに接着されて検出されることができる他のいかなる種類の公知のナノバーコードを含んでもよいことを当業者は完全に理解する。使用される可能性のあるナノバーコードの他の非限定的な例として、量子ドットが挙げられる（例えば、Schoenfeldら、Proc. 7th Int. Conf. on Modulated Semiconductor Structures, Madrid, pp. 605-608, 1995; Zhaoら、1st Int. Conf. on Low Dimensional Structures and Devices, Singapore, pp. 467-471, 1995）。量子ドットおよび他の種類のナノバーコードは、公知の方法によって合成されてもよいし、市販品販売元（例えば、Quantum Dot Corp., Hayward, CA）から得られてもよい。使用される可能性のある他のナノバーコードとして、例えば、Nanoprobes Inc.（Yaphank、NY）およびPolysciences, Inc.（Warrington、PA）が販売しているナノ粒子が挙げられる。

ハイブリッド形成およびオリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブのライゲーション
本発明の様々な態様において、ターゲット核酸のオリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブライブラリへのハイブリッド形成は、完全に相補的な核酸配列の間にしかハイブリッド形成を可能にしない厳しい状況下で発生してもよい。厳重さの低いハイブリッド形成は一般に、20℃から50℃までの温度範囲で0.15Mから0.9MのNaClで実施される。厳重さの高いハイブリッド形成は一般に、50℃から70℃までの温度範囲で0.02Mから0.15MのNaClで実施される。適切な厳重さの温度および／またはイオン強度は、部分的には、オリゴヌクレオチドプローブの長さ、ターゲット配列の塩基含有量、およびホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはハイブリッド形成混合物内の他の溶媒の存在、によって決定されることが理解される。上述の範囲は模範的なものであり、特定のハイブリッド形成反応のための適切な厳重さは、正および／または負の対照と比較することによって、経験的に決定されることが多い。当業者は、日常的にハイブリッド形成状態を調整することができ、正確に相補的な核酸配列の間にしか厳重なハイブリッド形成が発生しないことを可能にする。

ひとたび短いコード化プローブが核酸にハイブリッド形成されると、隣接するコード化プローブは、公知の方法を使用して、一緒にライゲートされてもよい（例えば、米国特許第6,013,456号を参照されたい）。6塩基から8塩基ほどの短いオリゴヌクレオチド配列が、ターゲット核酸に効率的にハイブリッド形成されてもよい（米国特許第6,013,456号）。プライマ独立ライゲーションは、長さが少なくとも6塩基から8塩基のオリゴヌクレオチドを使用して、達成されてもよい（KaczorowskiおよびSzybalski、Gene 179: 189-193、1996；Kotlerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4241-45, 1993）。核酸テンプレートにハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドコード化プローブをライゲートする方法は、当技術分野においては公知である（米国特許第6,013,456号）。隣接するオリゴヌクレオチドコード化プローブの酵素ライゲーションは、DNAリガーゼ、例えば、T4、T7またはTaqリガーゼまたは大腸菌DNAリガーゼを使用してもよい。酵素ライゲーションの方法は公知である（例えば、Sambrookら、1989）。

分子の固定化
本発明の様々な態様において、分析されるべきターゲット分子は、コード化プローブ結合の前、後および／またはその最中に、固定化されてもよい。例えば、ターゲット分子の固定化を使用して、結合されたコード化プローブを、結合されていないコード化プローブから、分離するのを容易にしてもよい。一定の態様において、ターゲット分子の固定化を使用して、コード化プローブの検出および／または同定の前に、結合されたコード化プローブを、ターゲット分子から分離してもよい。下記の検討は核酸の固定化に関するが、様々な種類の生体分子を固定化する方法が当技術分野においては公知であり、特許請求された方法に使用されてもよいことを当業者は完全に理解する。

核酸の固定化を使用して、例えば、ターゲット核酸をライゲートされたコード化プローブから、およびハイブリッド形成されていないコード化プローブから、または互いにハイブリッド形成されたコード化プローブから、分離するのを容易にしてもよい。非限定的な実施例において、ターゲット核酸は固定化されて、コード化プローブへハイブリッド形成するのを可能にしてもよく、その後、ハイブリッド形成された隣接するコード化プローブが、一緒にライゲートされる。結合された核酸を含む基質は、徹底的に洗浄されて、ハイブリッド形成されていないコード化プローブ、および他のコード化プローブへハイブリッド形成されたコード化プローブを除去する。洗浄に続いて、ハイブリッド形成されライゲートされたコード化プローブは、約90から95℃で数分間加熱することによって、固定化されたターゲット核酸から除去されてもよい。ライゲートされたコード化プローブは、表面へ接着してもよく、上記に開示されたように、分子コーミングによって整列されてもよい。次いで、整列したコード化プローブは、SPMによって分析されてもよい。

核酸の固定化は、当技術分野において公知の様々な方法によって達成されてもよい。本発明の模範的な態様において、固定化は、基質にストレプトアビジンまたはアビジンをコートし、その後、ビオチン化核酸を接着することによって、達成されてもよい（Holmstromら、Anal. Biochem. 209: 278-283, 1993）。固定化は、ケイ素、ガラスまたは他の基質にポリエルリジン（リジン）（poly-L-Lys（lysine））でコートし、その後、二官能価架橋試薬を使用して、アミノ修飾またはスルフヒドリル修飾された核酸を結合させることによって発生してもよい（Runningら、BioTechniques 8: 276-277, 1990; Newtonら、Nucleic Acids Res. 21: 1155-62, 1993）。アミン残基は、架橋にアミノシランを使用することによって、基質に導入されてもよい。

固定化は、化学的に修飾された基質に5'-リン酸化核酸を直接共有結合させることによって実施してもよい（Rasmussenら、Anal. Biochem. 198: 138-142, 1991）。核酸と基質との間の共有結合は、水溶性カルボジイミドまたは他の架橋試薬を用いる縮合によって形成される。この方法は、5'-リン酸を経由する核酸の優勢な5'-接着を容易にする。模範的な修飾された基質は、酸浴内で処理され、SiOH基をガラスに露出するガラススライドまたはカバースリップを含む（米国特許第5,840,862号）。

DNAは、最初にガラス基質をシラン化し、次いでカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドで活性化することによって、通例、ガラスに結合する。代替的な手順は、分子の3'末端または5'末端のいずれかで組み込まれたアミノリンカーを経由して連結されたDNAを備えた、3-グリシドキシプロピルトリムエトキシシラン（GOP）、ビニルシラン、またはアミノプロピルトリムエトキシシラン（APTS）等の試薬を使用してもよい。DNAは、紫外線を使用して膜基質に直接結合されてもよい。核酸用の固定化技術の他の非限定的な例は、米国特許第5,610,287号、第5,776,674号および第6,225,068号に開示されている。例えば、Covalink, Costar, Estapor, BangsおよびDynal等の核酸結合用の市販の基質が入手可能である。開示された方法は、核酸の固定化に限定されず、例えば、オリゴヌクレオチドコード化プローブの一方または両方の端を基質に接着するために使用される可能性もあることを、当業者は完全に理解する。

核酸または他のターゲット分子を固定化するために使用されるべき基質の種類は、限定されない。本発明の様々な態様において、固定化基質は、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、平面的な基質、またはほぼいかなる材料を含む固体基質の他のいかなる構造であってもよい。使用されてもよい基質の非限定的な例として、ガラス、シリカ、シリケート、PDMS（ポリジメチルシロキサン）、銀または他の金属コート基質、ニトロセルロース、ナイロン、活性クォーツ、活性ガラス、ポリビニリデンジフロライド（PVDF）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、他のポリマー、例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリメチルメタクリレート、および核酸分子と共有結合を形成することができるナイトレン、カルベンおよびケチルラジカル等の光反応種を含有するフォトポリマーが挙げられる（米国特許第5,405,766号および第5,986,076号を参照されたい）。

二官能価架橋試薬を本発明の様々な態様に使用してもよい。二官能価架橋試薬は、その官能基、例えば、アミノ、グアニジノ、インドール、またはカルボキシル特異性基、の特異性にしたがって分類することができる。これらの中で、遊離アミノ基に関する試薬は、その市販品としての入手可能性、合成の容易さ、およびそれを加えることができる穏和な反応状況のため、人気がある。架橋分子の模範的な方法は、米国特許第5,603,872号および第5,401,511号に開示されている。架橋試薬として、グルタルアルデヒド（GAD）、二官能価オキシラン（OXR）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（EGDE）およびカルボジイミド例えば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）が挙げられる。

走査型プローブ顕微鏡検査
走査型プローブ顕微鏡（SPM）は、マイクロメートルおよび／またはナノメートルの尺度で、物体の物理的特性を測定するために使用される器具の種類である。SPM技術の異なる様相が利用可能であり、下記においてより詳細に検討する。SPM分析のいずれかの様相は、コード化プローブ検出および／または同定のために使用してもよい。一般に、SPM器具は、物体の特性を測定するために、表面の非常に近くに、非常に小さな先の尖ったプローブを使用する。いくつかの種類のSPM器具において、プローブは、長さ数百ミクロンおよび厚さ約0.5〜5.0ミクロンであってもよいカンチレバーに装着されてもよい。典型的に、プローブ先端は、表面特性の局所変動をマッピングするために、xyパターンで表面上をラスター走査される。生体分子をイメージングしたり、ナノバーコードとして使用される分子を検出したりするために使用されるSPM方法は、当技術分野においては公知である（例えば、Wangら、Amer. Chem. Soc. Lett., 12: 1697-98. 1996; Kimら、Appl. Surface Sci. 130, 230, 340-132: 602-609, 1998; Kobayashiら、Appl. Surface Sci. 157: 228-32, 2000; Hiraharaら、Phys. Rev. Lett. 85: 5384-87, 2000; Kleinら、Applied Phys. Lett. 78: 2396-98, 2001; Huangら、Science 291: 630-33, 2001; Andoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12468-72, 2001）。

走査型トンネル顕微鏡検査（STM）
走査型トンネル顕微鏡検査は、1980年代初期に開発された最初のSPM技術であった。STMは、プローブ先端と表面との間に量子力学的電子トンネルが存在することに依存する。先端は単一原子点へと鋭利化され、表面上でラスター走査され、表面に実際に接触せずに数オングストロームのプローブ−表面ギャップ距離を維持する。小さな電圧差（ミリボルトから数ボルトのオーダで）が、プローブ先端と試料との間に加えられ、先端と試料との間のトンネル電流が測定される。先端が表面を走査するため、試料の電気特性および位相的性質の差が、トンネル電流の量に変動を生じさせる。本発明の一定の態様において、先端の相対高さは、コンピュータとのインタフェースを有し、フィードバック制御を備えた圧電要素によって制御されてもよい。コンピュータは、電流強度をリアルタイムでモニタすることができ、先端を上または下に動かし、比較的一定の電流を維持する。異なる態様において、先端の高さおよび／または電流強度は、走査された表面の画像を展開するためにコンピュータによって処理されてもよい。

STMは、試料の電気特性および試料位相を測定するため、異なる種類の導電性材料、例えば、金属バーコードの異なる種類の金属を弁別することができる。STMは、局所電子密度も測定することができる。トンネルコンダクタンスは状態の局所密度（DOS）に比例するため、ナノチューブの直径および長さに依存して電子特性が変動するカーボンナノチューブを弁別するために、STMを使用することもできる。STMを使用して、電気特性が異なるいずれかのナノバーコードを検出および／または同定してもよい。

STMプローブ先端は、表面上の各コード化プローブを検出し同定するために、整列されたコード化プローブを含む表面上で走査されてもよい。ライゲートされたコード化プローブを同定することもできる。ターゲット分子は、どのコード化プローブがターゲット分子に結合するかを決定することによって、同定されてもよい。コード化プローブが特異的な配列（例えばオリゴヌクレオチド配列）の存在を示す本発明の態様において、生体分子の配列は、ターゲット分子に結合するコード化プローブの配列から決定されてもよい。

原子間力顕微鏡検査
SPMの別の様相は、原子間力顕微鏡検査（AFM）である。AFMによる生体分子分析の方法は、一般に当技術分野において公知である（例えば、Uchihashiら、「非接触モード原子間力顕微鏡検査の分子イメージングへの適用（Application of Noncontact-Mode Atomic Force Microscopy to Molecular Imaging）」、http://www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi）。AFM顕微鏡検査において、プローブは、分析されるべき表面に接触するバネ荷重のまたは可撓性のあるカンチレバーに接着する。接触は、分子力範囲内で起こる（すなわち、ファンデルワールス力の相互作用の範囲内）。AFM内で、異なるモードの作用が可能であり、接触モード、非接触モードおよびタッピングモード（TappingMode）（商標）を含む。

接触モードにおいて、プローブ先端と試料表面との間の原子間力が、先端−試料距離を一定に保ちカンチレバーの撓みを測定することによって、典型的に、位置感受性デテクタでレーザをカンチレバーに反射することによって、測定される。カンチレバー撓みは、結果として、反射したレーザビームの位置の変化になる。STMの場合、プローブ先端の高さは、フィードバック制御を備えた圧電要素を使用してコンピュータ制御されてもよい。本発明のいくつかの態様において、比較的一定の撓みの程度は、プローブ先端を上げるかまたは下げるかによって、維持される。プローブ先端は試料に実際にファンデルワールス（Van der Waal）接触してもよいため、接触モードAFMは、非剛性試料を変形する傾向がある。非接触モードにおいて、先端は、試料表面上で約50から150オングストロームの間に維持され、先端は振動する。先端と試料表面との間のファンデルワールス相互作用は、先端振動の相、振幅または周波数の変化に反映する。非接触モードで達成される解像度は比較的低い。

タッピングモード（TappingMode）（商標）において、カンチレバーは、圧電要素を使用して、その共鳴周波数でまたはその近辺で振動する。AFM先端は、空気中で1秒当たり約50,000から500,000サイクルの周波数で、ならびに液体中ではより低い周波数で、試料表面に周期的に接触（タップ）する。先端が試料表面に接触し始めるときに、振動の振幅は減少する。振幅の変化を使用して、試料の位相的性質を決定する。AFM分析は電気伝導度に依存しないため、これを使用して非導電性材料の位相的性質を分析してもよい。カーボンナノチューブ、フラーレンおよびナノ粒子を含むがそれらに限定されない位相的性質が異なる一定の種類のナノバーコードが、AFM技術によって検出および／または同定されてもよい。

AFMの代替モードにおいて、試料の位相的プロファイル以外の追加情報が得られてもよい。例えば、水平力顕微鏡検査（LFM）において、プローブはその長さ方向に垂直に走査され、カンチレバーの捩れの程度が決定される。カンチレバーの捩れは、表面の摩擦特性に依存する。コード化プローブの摩擦特性はその組成に依存して変動するため、LFMは、異なるコード化プローブを検出し同定するのに有用であってもよい。

別の変形例は、化学力顕微鏡検査（CFM）であり、プローブ先端を化学種で官能化し、試料上で走査して、化学種と試料との間の接着力を検出する（例えば、Frisbieら、Science 265:2071- 2074、1994）。ナノバーコード材料用に異なる親和力を備えた化学物質、例えば金または銀は、AFMプローブ先端に組み込まれてもよく、表面上を走査して、ナノバーコードを検出し同定してもよい。使用される可能性のある別のSPMモードは、フォースモジュレーションイメージングである（Maivaldら、Nanotechnology 2: 103, 1991）。Uchihashiら（http://www. foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi）は、非接触モードAFMで周波数変調を使用する生体分子イメージングの方法を開示している。

コード化プローブを検出および／または同定するために使用されてもよい可能性がある他のSPMモードとして、磁気力顕微鏡検査（MFM）、高周波MFM、磁気抵抗感受性マッピング（MSM）、電気力顕微鏡検査（EFM）、走査型容量顕微鏡検査（SCM）、走査型広がり抵抗顕微鏡検査（SSRM）、トンネルAFMおよび導電性AFMが挙げられる。一定のこれらの様相において、試料の磁気特性が決定されてもよい。磁気特性および電気特性によって同定することができる金属バーコードおよび他の種類のナノバーコードが設計されてもよいことを、当業者は完全に理解する。

コード化プローブ検出および同定に使用されるSPM器具は、市販されている（例えば、Veeco Instruments, Inc., Plainview, NY; Digital Instruments, Oakland, CA）。または注文設計されたSPM器具が使用されてもよい。

ナノバーコードおよび走査型プローブ顕微鏡検査
本発明の模範的な態様が図1〜図4に例示されている。図1Aおよび図1Bは、表面にコード化プローブ130を表面100に整列するための非限定的な方法を例示する。表面100、例えば、公知の方法によってストレプトアビジンでコートされているガラス顕微鏡スライド表面100が、例えば、ビオチン化されたコード化プローブ130を含有する溶液110に浸漬される。溶液110は、容器120に含まれてもよい。

非限定的な例において、コード化プローブ130は、ターゲット核酸分子にハイブリッド形成されているオリゴヌクレオチドプローブを含む。核酸分子は、ナイロン膜、96ウェルマイクロタイタープレートまたは他の固定化基質に接着することによって、固定化されてもよい。例えば全4096の可能な6-mer配列を含むビオチン化されたオリゴヌクレオチドは、市販品販売元（例えば、Midland Certified Reagents, Midland, TX）から得られてもよい。ビオチン化されたオリゴヌクレオチドは、例えば、マイクロメートル以下の金属バーコード（Nicewarner-Penaら、2001）に接着して、コード化プローブ130を形成してもよい。コード化プローブ130は、ターゲット核酸にハイブリッド形成することが可能である。ハイブリッド形成後、隣接するコード化プローブ130は、リガーゼを使用して一緒にライゲートされる。ハイブリッド形成されていないコード化プローブ130、および互いにハイブリッド形成されたコード化プローブ130は、徹底的な洗浄によって除去され、核酸にハイブリッド形成されたコード化プローブ130のみを残す。コード化プローブ130は、溶液110を95℃で5分間加熱することによって、除去される。固定化基質に接着した核酸が除去され、ライゲートされたコード化プローブのみを溶液110に残す。

溶液110に保持されているビオチン化されたコード化プローブ130は、一方の端で、ストレプトアビジンがコートされた表面100に接着する。表面100は、溶液110からゆっくり除去される。または溶液110からの液体は、例えば、蒸発または緩徐なポンプ作用によって、容器120からゆっくり除去される。空気−水界面のメニスカスが表面100上をゆっくり動くため、接着したコード化プローブ130は、表面100に整列される。整列したコード化プローブ130は、AFM、STMまたは他の走査プローブ方法によって分析されてもよい。

本発明の別の模範的な態様が図2に例示されている。コード化プローブ230を含む溶液210の滴が、ガラススライド等の表面220に置かれる。一定の態様において、スライド220を、上記に開示されたように処理して、コード化プローブ230の一方または両方の端に結合させてもよい。滴210は、表面220とガラスカバースリップ200との間に挟まれる。様々な態様において、カバースリップ200は一定の位置に保持されてもよく、一方、表面220は、カバースリップ200からゆっくり引き離される。これによって、カバースリップ200の縁に、コード化プローブ230を整列するように作用するメニスカスが形成される。

本発明の種々の態様において、コード化プローブ130、230は、一方の端ではなく両方の端で、表面100、220に接着してもよい。この場合、コード化プローブ130、230、の整列は、結果として、線形に並んだ分子ではなく、U字形の分子になる（例えば、米国特許第5,840,862号）。図1および図2に例示した模範的な態様は、コード化プローブ130、230の両端を表面100、220（図示せず）に接着することによって実施することもできる。

図3に例示されたもう一つの模範的な態様において、コード化プローブ340は、フリーフロー電気泳動によって表面300に整列されてもよい。表面300は、導電性材料および非導電性材料の交互のバンド、例えば、ガラスシート320にコートされた金フィルム310の切れを含んでもよい。交流電場330の存在で、荷電残基、例えばリン酸基をオリゴヌクレオチドに含むコード化プローブ340が、電場330とで整列する。コード化プローブ340を表面300に整列するために、分子コーミングに加えてまたはその代わりに、フリーフロー電気泳動が使用されてもよい。フリーフロー電気泳動を実施する方法は公知である（例えば、AdjariおよびProst, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 4468-71, 1991）。しかし、本願は、分子を表面に整列するためのフリーフロー電気泳動の最初の使用を呈する。

実施例
実施例1：ナノタグ要素
表1は、その分子構造がナノバーコード製造に使用されることができるナノタグ要素の典型的なリストを示す。挙げられた要素の大半は、ナノメートルサイズの構造部分を有する。ナノタグ要素は、親構造によってグループ分けされ、フラーレン分子、POSS（多面性オリゴマーシルセスキオキサン）分子および有機金属化合物に分類される。POSS分子は、シルセスキオキサンケージ構造に基づく、比較的新しい種のハイブリッド構造である。フラーレン分子およびPOSS分子は、ほぼ対称的な三次元構造であり、一方、有機金属化合物は、平面または非対称三次元構造のいずれかである。フラーレンは、どの溶媒にも比較的低い溶解性を示す。POSS分子は、プラスチックポリマー内で添加剤として使用され、個別の付着物に対して凝集を示す。有機金属化合物は、金属中心と有機対応物との組み合わせ対合のおかげで、広い多様性を有するという利点がある。加えて、これらの分子の三次元的多様性は、3D非対称から2D対称までの範囲である。有機金属化合物の多くは、下流側で要素をバーコードに加工するために、二官能化することができる。有機金属分子は、多数のイメージング研究の対象であり、分子イメージングによって容易に観察される構造部分を有する。当業者は、表1に挙げられたナノタグ要素が典型的な例に過ぎないことを理解するであろう。量子ドットおよびカーボンナノチューブをはじめとする広く様々なナノタグ要素が当技術分野で公知であり、ナノバーコードを作るために使用することができる。そのような公知のナノタグ要素のいずれかを使用して、ナノバーコードおよびコード化プローブを製造することができる。

実施例2：合成スキーム
二官能性中間体
図5は、ナノタグの介在によるバーコード合成の典型的なスキームを例示し、個別のユニットを、制御された段階的頭尾アセンブリにより、特異的なポリマー配列にするための構成単位として使用される二官能化ナノタグ要素の製造を含む。この手法は、分子生化学で、自動固相合成機でペプチドおよびオリゴヌクレオチドを作るために使用される。図5Aは、典型的なナノタグ要素の、二官能性分子への初期転換を示す。2つの官能基（R1およびR2）が、タグ要素の対向する端に付着している状態で示されている。図5Bは、一方の基を、他方の官能基の活性化により、選択的かつ一時的に保護する状態を示している。そのような技術は、例えば、固相ペプチド合成で周知である。図5Cは、制御された重合で構成単位を段階的に加える状態を示している。通常、一時的な保護基は、成長するポリマーの末端から除去され、次の構成単位が、新たに脱保護された末端に連結される。複数のサイクルがバーコードポリマーを伸ばす。

典型的なR1官能基は、CH₂0HおよびCONHC₃H₆NH₂を含む。典型的なR2官能基は、CH₂OHおよびCOOHを含む。CH₂OHがR1およびR2基として使用される場合には、R1基はジメトキシトリチル基で保護されてもよく、この保護基は、酸処理によって除去することができる。次いで、R2基を、シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイトによって活性化してもよい。R1基がCONHC₃H₆NH₂であり、R2基がCOOHである場合には、R1基はトリチル基によって保護されてもよく、この保護基は、酸処理によって除去することができる。R2基は、例えば、カルボジイミド処理によって活性化されてもよい。他の保護／脱保護の化学的手法が例えば固相ペプチドまたはオリゴヌクレオチド合成で周知であり、そのような公知の方法のいずれをナノバーコード製造に使用してもよい。

主鎖介在合成
主鎖介在ナノバーコード合成は、標準ペプチドまたはオリゴヌクレオチド固相合成をモデルにしている。ナノタグ要素を一官能化類似物に転換し、次いで、アミノ酸またはヌクレオチドホスホロアミダイトのいずれかに付着させる。構成単位は、適切にブロックされ、標準自動固相合成のために活性化される。全体的スキームが図6に示されている。まず、適切なR基の付加によってタグユニットを一官能化する（図6A）。ペプチドまたはオリゴヌクレオチド系の重合を使用して、官能化したタグ基を、共有的にタグ付けされたアミノ酸サブユニット（図6B）またはヌクレオチドサブユニット（図6C）に転換する。

そのようなスキームで1つ考慮すべきことは、ポリペプチドやオリゴヌクレオチド等の自然発生的ポリマー分子の主鎖選択ならびに公知の物理的および化学的性質である。タグ要素をアミノ酸またはオリゴヌクレオチド類似物に化学的に付着することは、等しく困難である。ホスホロアミダイト重合の化学的性質は、ペプチド化学的性質よりも10倍頑強であり、コード化プローブの下流合成とでより適合性である。しかし、ペプチドは、コード化プローブへ構造エントロピーを提供することができるαらせん等の二次構造を生じさせることができる。表2は、市販の出発製品に基づいた候補を要約する。当業者は、リストに挙げられた候補サブユニットは典型的な例に過ぎず、広く様々な他の潜在的サブユニットが当技術分野で公知であり、使用されてもよいことを理解するであろう。

ナノタグ要素でのポリマー装飾
コード化プローブ合成への別の代替的な手法は、ポリマー足場を形成することを伴い、この足場にナノタグ要素をポリマー後アセンブリによって付着させる。例えば、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが直鎖状足場分子を提供し、それにナノタグ要素をアセンブリ後付着させてもよい。有利なことに、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを製造する方法は、当技術分野で周知である。しかし、ナノ構造の他の形態が多次元足場を提供してもよい。この手法の難しさは、2種類以上のタグ要素（スペーサーを含まない）をポリマー内に入れることが困難であるという点である。また、保護／脱保護のための高い特異性がそのようなスキームを制限する。立体障害が完全な装飾を妨げることもある。この処理では、典型的なコード化プローブを形成するための難易度はもっとも低い。その理由は、スキームのポリマー合成部分がよく特徴づけられ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの翻訳後修飾の方法が公知であるからである。オリゴヌクレオチドに基づいたコード化プローブの非限定的な例を下記の実施例に記す。コード化プローブに基づく典型的なオリゴヌクレオチドの分岐点は、SPM技術によって検出することもできるし、ナノ粒子や他の種のナノタグ要素のための付着部位として作用することもできる。

適切な間隔をおいた特異的部位で活性基を有するペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、市販品の製造元から購入することができる。次いで、ポリマーを一官能化ナノタグ要素に暴露すると、すべての活性部位が修飾される。方針次第では、ナノタグ要素を装飾するために固相化学技術を使用して、不要な分子間重合を防止してもよい。

表3は、典型的な一官能化ナノタグ要素および装飾のためのその関連ポリマーをリストしている。リストした構成要素はすべて、現在、市販されているもので、装飾の化学的手法は公知である。完全なラベル付けと溶解度が重要である、分子が装飾されるため、その溶解度が影響を受け、沈殿を生じることが多い。また、構造は、二次および三次的な構造の特性を受けやすく、複雑な折り畳みパターンを生じさせる。折り畳みは、平らな表面上への付着によって影響を受けることもある。このようにして、より剛性の高い主鎖が一定の利点を示すことがある。当業者は、リストした官能化ナノタグ要素は限定的なものではなく、他にも様々な官能化ナノタグ要素、例えば量子ドットまたはカーボンナノチューブなどが公知であり、使用してもよいことを理解するであろう。

ポリマーサブユニットの直接読取
第4の方針は、一定のアミノ酸またはヌクレオチド類似物の電荷密度のSTMイメージングに基づく。この手法は、ペプチドまたは特異的な配列のオリゴヌクレオチドの合成物を購入し、その後、スポッティングおよびイメージングによって達成することができる。表4は、いくつかの典型的なサブユニットおよびそのポリマー配列内への組み込みをリストしている。二次構造およびイメージング提示は、これらのポリマーを設計するときに、考慮することができる。

下記の実施例で開示するようにして、典型的なコード化プローブサブユニットおよびその特性を決定した。

実施例3：典型的なコード化プローブサブユニットの合成
ペプチドポリマー
装飾ポリマーまたは直接ポリマーイメージングの製造の場合に潜在的に使用される典型的なペプチドポリマーを調製した（SEQ ID NO: 1）。5mgスケールの固相ペプチド合成を実施した。結果として得られたペプチドをHPLCによって純度約98%まで精製した。質量分析法を使用して、完全長生成物の存在を実証した。ペプチドのカルボキシル末端が修飾されてアミド末端基を形成していた。

配列は、ケラチン、Ropタンパク質（Rop protein）およびポリアラニンに類似した配列に基づいて、アミノ末端およびリジンからの第二級アミンがらせんの同一側に面するαらせんであると予測された。これらのアミンは、標準ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）または水溶性カルボジイミド架橋を使用して、活性化カルボキシル基で一官能化された分子のための優良な付着部位を形成する。カルボキシル末端のアミド封鎖基を使用して、ペプチドの相互の重合を防止した。

リジン側鎖を装飾することにより、ヘリカルバンドル（例えば4-らせんバンドル）への第四級構造形成の可能性を排除または最小化してもよい。ペプチド濃度もまた、より高次の構造の形成に影響を及ぼす役割を担っている。

上記で論じたように、標準的な固相ペプチド合成によって第2の合成ペプチド配列（SEQ ID NO: 2）を調製した。配列は、異なるアミノ酸およびそのイメージング能力を試験するように設計した。αらせん構造は、一方の側にらせん選好性のアミノ酸を付加し、他方の側を他のアミノ酸の側鎖で装飾することによって設計した。このようにして、アラニンおよびメチオニン残基をらせんの一方の側に配置し、一方、残留するアミノ酸の代表的なものをらせんの他方の側に配置した。

二官能価フラーレン
固相オリゴヌクレオチド合成との適合性を有する典型的な二官能価ナノバーコードのサブユニットを、修飾されたC70フラーレンの構造のまわりに設計した。本発明の一定の態様において、第一級アルコールを2つの官能基として使用し、そうして、ジオールフラーレン類似物を形成した。第二級および第三級のアルコールを使用してもよいが、それらは、反応性が低く、立体障害度が高い。合成の第1段階は、二官能化フラーレン分子の形成を含み、そこで、官能基は、OH、CH₂OHまたはCOOHであることができる。代替の態様において、ジカルボキシル化フラーレンを調製してもよく、カルボキシル基を縮合試薬（例えば、DCC）の存在中に1-アミノ,3-プロパノール等の試薬と反応させて2種のアルコールを形成してもよい。アミン基は、カルボキシルとで縮合し、結果として、ヒドロキシル残基で終端する炭化水素鎖の付着が起こる。この経路は、炭化水素鎖の長さが異なり、制御されたフラーレン鎖の組立て時にフラーレンのスペーシングに最終的に影響を及ぼす数種の有用な生成物をもたらすことができる。カルボキシル化フラーレンの使用において警告すべき1つの事項は、より少ない生成物およびより低下した収率を結果的に生じさせるさらなる反応の関与である。

誘導体化に続いて、二官能化生成物を精製する。二官能化サブユニットからコード化プローブを効果的に形成するために、2つの官能基を分子の対向する端に位置させる。1つの官能価または2つの隣接する修飾を備えた不純物を除去する。2つの官能基の位置が180度未満の距離となる場合があってもよいが、2つの官能基の位置が150度未満になることは、コード化プローブ形成では受け入れられない。

精製したジオール生成物を、図7に開示されるように、合成のために構成単位内に更に修飾する。トリチル化反応は簡潔であり、ジオール修飾フラーレンの塩化ジメチルトリチルとの反応を含む。DMT-Clでの誘導体化は、望ましいモノDMTとビスDMTとの混合物を生成する。モノトリチル化生成物を精製し、ジトリチル化生成物から分離する。モノトリチル化生成物のホスホラミド化は、不活性反応条件下で標準反応によって発生する。クロロ-2シアノエチル-N,Nジイソプロピル-ホスホロアミダイト試薬は、市販されており、新鮮な状態で1回だけ使用することが最良である。反応はすぐに進行し、高い収率をもたらす。この反応で形成された生成物は、シリカゲルクロマトグラフィーでの移動性を高め、簡単な精製を可能にする。最終生成物は、シリカの小さなパッドを使用して、清浄されることが多い。最終生成物を真空下で乾燥させ、アルゴン下で乾燥貯蔵する。生成物は、標準的なホスホロアミダイト化学的手法を使用して、ポリマー配列に組み込んでもよい。

2つの対向する極の端に焦点を合わせた局所電子分布によると考えられるC(70)の不完全な球形を利用して、二官能価C(70)サブユニットを設計した。対向する部位に位置する非常に反応性の結合の2つによって足場を設けるために、C(70)フラーレンを選択した。二対のエナンチオマーを含む5つの二置換異性体が予想された。ヌクレオチド中に存在する2種のヒドロキシル基を組み込む設計は、オリゴヌクレオチド合成に関して共通のプロトコルを使用することを可能にする。第一級アルコールは、DMT-Clによって主に誘導体化され、ホスフィチレーション（phosphitylation）に利用可能な第二級アルコールだけが残される。アルコール基は、C₂-C₈リンカーによってC(70)足場から分離される。

第一級および第二級アルコールを含む二官能価フラーレンの典型的な構造が図8に示されている。第一級アルコールを形成するためには、Reformatsky型反応により、有機亜鉛を使用して、またはPrato付加により、例えばコハク酸半アルデヒドを使用して、モノカルボン酸基を導入して、置換ピロリジン誘導体を導くことができる。予想される収率は、15〜30%である。C(70)エステルは、カルボニル基と一緒にDibal-Hで還元することができる。第二級アルコール基の前駆物質、ケトンは、市販のメチルビニルケトンのトリメチルシリルエノールを用いて、Prato付加またはディールス・アルダー手法によって導入することができる。収率は35%および50%である。

実施例4：典型的な二官能価フラーレンの製造
本発明の典型的な態様において、C70フラーレンジオールを製造し、それを、DMTr（ジメトキシトリチル）保護され、ホスホロアミダイト活性化された化合物に転換した。この生成物をナノバーコードの合成に使用することができる。ホスホロアミダイト基の縮合によって形成されたリン酸主鎖は、フラーレンの水溶性を高めることができ、結果として得られるコード化プローブの後の使用を容易にする。

二官能価フラーレン合成に使用されるC70ジオール中間体は、ニューイングランドペプチド合成部（New England Peptide synthesis division）（Fitchburg, MA）から得た。中間生成物は、活性化および重合を阻止するために適切な溶媒で限られた溶解度を有するものであった。生成物は、約1.0年と見積もられた半減期で親化合物への自発的逆転を示した。

また、上記に開示されたスキームの使用により、Midland Certified Reagents（Midland, TX）、Applied Biosystems（Foster City, CA）またはQIAGEN Operon（Alameda, CA）によって合成された、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸に基づくコード化プローブを製造した。

実施例5：基質調製および分子付着
様々な基質をコード化プローブのイメージングに使用することができる。イメージングはゆっくりであり（分単位）、分子は速く動く（何分の1秒単位）。したがって、分子の運動を制限するために、試料は、基質に吸収され、結晶格子の一部にならなければならない。マイカを使用するAFMによるDNAのイメージングは、この概念を典型的に示す。DNAは、Ni²⁺またはMg²⁺等の二価金属を使用して、リン酸主鎖を介してマイカに結合する。DNAおよびマイカは両方とも負に荷電しており、DNAをマイカに吸着するには、Mg²⁺またはNi²⁺等の対イオンを使用する必要がある（Biophys. J. 70: 1933, 1996; PNAS 94:496, 1997; Biochemistry 36: 461, 1997）。二価カチオンは、負に荷電したDNA主鎖に対して対イオンとして働き、マイカに結合するために更なる電荷を与える。AFMの場合にDNAを結合するためにはAPマイカ（官能化アミノプロピルマイカ）が使用されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:496, 1997）。

金担持マイカ基質のアニーリング
外径1.00mm、内径0.75mmの石英毛管の1片をSutter Instruments P-2000毛管プラー内に引くことにより、石英毛管トーチを作成した。ガラスに刻みを入れ、毛管が約200μmの内径を有する地点で破断させた。次いで、表面を平らに粗研磨し、3Mインペリアルラッピングフィルムを使用して研磨した。石英ディスクを加熱ブロック上130℃で5分間加熱した。ディスクは、石英チップから1.5インチの炎を使用する水素トーチによって燃焼させた。ピンセットを使用して、新たな金基質をディスクの中心に配置した（突合せ側を上にして）。基質を、マイカ表面にしか触れない予め燃焼させた1cm×1cm×1mmの石英ブロックを使用して押し下げて保持し、放置して5分間加熱した。石英毛管トーチは、炎の先端がちょうど金表面に接触するように、ディスク面に対して30度に保持された。1秒サイクルで2インチのパスを使用して炎を金表面上に繰り返し通過させた（45回）。基質は、使用するまで、元の容器内でアルゴン下で貯蔵した。

基質上のDNA付着
DNAをマイカ上に付着させ、AFMによって走査した。1〜10Kb範囲の異なるサイズのプラスミド分子（1,000塩基の長さで異なる）の集団を使用し、AFM画像を得た（図示せず）。

金への直接付着
イメージングされるべき分子は、基質に直接または間接的に付着させることができる。直接付着は、基質と特異的に反応して共有結合を形成する官能基によってナノタグを修飾することを含む。水性条件下での還元された金に対する硫黄の求核攻撃のための条件は当技術分野で公知である。この手法は最適化されており、穏和な状況下で実現可能であると思われる。直接付着のための酸化還元の反応速度をpHによって制御してもよい。反応は特異的であり、他のナノタグと交叉反応させるべきではない。別の手法は、より反応性の攻撃基、例えばラジカルに基づく機構または光触媒反応を使用することができる。一般に、ラジカル反応速度は速く、ロバストであるが、しばしば制御を欠く。1つの最終的な手法は、光またはpHで脱保護されるケージ化硫黄類似物を使用する。この手法は、第一の手法に類似した機構を使用するが、反応を開始し、限局するために特異性の追加要素を有する。金表面へ共有付着するための典型的な反応基として、スルフヒドリル基、酸素ラジカル、炭素ラジカルおよび光活性化試薬、例えば当技術分野で公知の様々な硫黄化合物が挙げられる。これらのうち、金表面へのスルフヒドリル修飾オリゴヌクレオチドの付着がもっとも広く研究され、多数の文献に開示されている。加えて、チオール修飾オリゴヌクレオチドプローブは、一般的な販売元（例えば、Midland Certified Reagents, Midland TX）から市販されている。

金への間接付着
基質へのターゲットの間接付着は、基質およびナノバーコードに付着部位を提供する「リンカー」分子を伴う。この方針では、二官能価リンカー分子が使用される。リンカー分子は、金へ付着するために1つの官能基と、バーコードに付着するために別の官能基とを有する。この手法の1つの利点は、基質を望ましい密度でリンカー分子で修飾することができ、第2の反応によってバーコードを付着する前にイメージングによって実証することができる点である。

非限定的な実施例では、リンカー分子は、スルフヒドリル基を使用し、リンカーの対向する端に異なる官能基がある状態で金に付着することもできる。1つの非限定的な例はカルボキシル基である。アミノレート化されたスペーサーバーコードは、末端カルボキシルとで特異的に（しかし不可逆的に）反応することができる。アミンをカルボキシル基でカルボジイミド介在縮合することは、十分に理解されている化学的経路である。

実施例7：STMイメージング
金ナノ粒子
AFM画像は、金ナノ粒子およびラムダDNAで得られた。使用された基質は、ポリL-リジンコートされたガラスカバースリップおよびアミノ処理されたマイカ（APマイカ）であった。APマイカは、新たに劈開させたマイカを3-アミノプロピルトリエトキシシランで気相処理することによって得た。50nm、10nm、5nmおよび2nmの金ナノ粒子をTed-pella Inc.（Redding, CA）から購入した。ポリL-リジンカバースリップ基質を用いて、10μlの金コロイド溶液をカバースリップ上で乾燥させた。APマイカを用いて、100μlの金コロイド溶液を基質上に15分間配置した。次いで、余分な溶液をKimwipeで吸い取った。Digital Instruments NanoScope（登録商標）をタッピングモードAFMで使用するAPマイカ基質のAFMイメージングは、滑らかで構造物のない表面を示した。APマイカは、金ナノ粒子を固定するための良好な表面であることがわかった。50nmの金ナノ粒子は、AFMによって容易にイメージングされた（図示せず）。5および10nmの金ナノ粒子もまた、AFMによってはっきりと視認できた（図示せず）。2nmの金ナノ粒は、個々に識別可能であったが、解像は、より大きなナノ粒子の場合ほどシャープではなかった（図示せず）。

10、5および2nmの金ナノ粒子の混合物の中で異なるサイズのナノ粒子を識別することは可能であった（図示せず）。2および5nmのナノ粒子は、タッピングモードAFMを使用して、測定された高さによって識別することができた。これらの結果は、異なるサイズのナノ粒子に基づいたナノバーコードをSPMイメージング技術によって識別することができることを示す。

別の非限定的な実施例において、20μｌのポリL-リジン溶液（0. 01%、Sigma Chemicals, St. Louis, MOから）を約5分間マイカ基質上に配置し、次いでナノピュア水（18ΜΩ）ですすぎ、フィルタ処理したN₂ガス下で乾燥させた。金ナノ粒子（PolysciencesまたはTed-Pella Inc.から）を30秒間音波処理した。稀釈していないナノ粒子の25μl試料を、ポリL-リジンコートされたマイカ上に約10分間配置し、次いで、ナノピュア水ですすぎ、フィルタ処理したN₂ガス下で乾燥させた。Digital Instruments NanoScope（登録商標）をタッピングモードAFMで使用して画像を得た（図示せず）。

また、ラムダDNAのHind III消化物をAFMによってイメージングした。消化されたラムダDNAの1μg/ml溶液をHEPESバッファ（40mM HEPES、5 mM NiCl、pH6.8）中で調製した。DNA溶液の30μl試料を、処理されたマイカ基質上に10分間付着され、ナノピュア水ですすぎ、N₂ガス下で乾燥させた。消化されたラムダDNAのAFM画像が図9に示されている。二本鎖DNA分子がAFMイメージングによってはっきりと視認される。

フラーレン
グラファイト表面に付着した単一のフラーレン分子の画像を、STMイメージングにより、Digital Instruments NanoScope（商標登録）（図示せず）を14.46nm走査サイズで使用して得た。複数のフラーレンがペプチドによって接続され、イメージングされている。4つのフラーレンがSEQ ID NO: 1のペプチドに付着していた。STMスキャニングにより、4つのフラーレンそれぞれを示す画像を得た（図示せず）。

実施例8：核酸の整列
ラムダDNAをマイクロ流体分子コーミングによって整列させた。基質に重なるPDMSの層の中にマイクロ流体チャネルを調製した。マイクロ流体チャネルは、Andersonらの方法（"Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping", Anal. Chem. 72:3158-3164, 2000）にしたがって、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を成形することによって製造した。基質は、例えば、上記で論じたように調製したAPマイカまたは金コートされた基質を含んでもよい。試料をマイクロ流体チャネルの一端でチャンバに導入し、チャネルの他端の溜めに真空を加えてもよい。チャネル内に1つ以上の支柱を加えることによって、分子コーミングによる分子の整列を可能にする。PDMS層を除去し、基質をナノピュア水ですすぎ、N₂ガス下で乾燥させる。複数のチャンバおよび／またはマイクロ流体チャネル、異なるパターンのマイクロ流体構成要素、異なるマイクロ流体流ならびにチャネル内の異なる構造を使用して、様々な整列を形成することができる。

図10および図11は、MMCプロセスによって整列された、ラムダDNA分子の例を示す。完全に伸張され、整列されたラムダDNAは長さ約17μmであった。分子は、予想されたように、マイクロ流体の流れの方向に平行に整列した。この結果は、表面にコード化プローブを整列させ、ターゲットとでまたは他とでハイブリッド形成させたのち、解放する可能性を実証する。コード化プローブ分子の整列は、SPMイメージング技術によるそのイメージングおよび同定を容易にする。

実施例9：オリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブのAFMイメージング
別の非限定的な実施例において、コード化プローブは、図12に示すように、一緒にハイブリッド形成された短いオリゴヌクレオチド配列のセットとして製造することもできる。図面の各線が単一の合成オリゴヌクレオチドを表し、上部鎖には9つ、下部鎖には4つある。ハイブリッド形成は、SPM技術によってイメージングすることができる分岐点を形成する。または、分岐点は、上記で論じたように、金属ナノ粒子または他のタグ要素のための付着部位として作用してもよい。典型的なオリゴヌクレオチドコード化プローブ配列が図13に提供され、互いにハイブリッド形成された上部鎖および下部鎖の配列を示す。明瞭化のために、分岐配列は図13には示されていない。図14は、コード化プローブの上部鎖を形成する9つの別個のオリゴヌクレオチドの完全配列を示す。分岐部位を形成するために互いにハイブリッド形成する部分が示されている。例えば、「A」とラベル付けられたPT1（SEQ ID NO: 3）の3'末端は、「A'」とラベル付けられたPT2（SEQ ID NO: 4）の5'末端とでハイブリッド形成する。同様に、BはB'に結合し、CはC'に結合するなどである。

典型的なコード化プローブを、上記で論じたように、AFM技術によってイメージングした。コード化プローブのAFM画像が図15の矢印によって示されている。比較のために、線形化した2.8kbのプラスミド二本鎖DNA分子がコード化プローブに隣接して示されている。

本明細書に開示され、特許請求される方法、組成物および装置のすべては、本開示を踏まえて、過度に実験を労することなく、構成し、使用することができる。特許請求された主題の概念、本質および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載された方法、組成物および装置に変形を加えてもよいことは、当業者には明らかである。より具体的には、関係のある一定の物質が本明細書に記載された物質に置き換えられても、同一のまたは類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変はすべて、特許請求された主題の本質、範囲および概念内であるとみなされる。

（表１）典型的なナノタグ要素

（表２）主鎖介在合成のためのサブユニットの潜在的候補

（表３）ポリマー装飾のための典型的なサブユニット

（表４）直接ポリマーイメージングのための典型的なサブユニット

下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明で開示された態様の一定の様相をさらに明示するために含まれる。本発明の態様は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、1つ以上のこれらの図面を参照することによって、より良好に理解される。
コード化プローブ130を整列するための模範的な方法を例示し、各々は、表面100に、プローブ分子に接着した1つ以上のナノバーコードを含む。（A）コード化プローブ130を含む溶液110内への表面100の浸漬。（B）整列したコード化プローブ130を含む表面100の溶液110からの除去。 コード化プローブ230を表面220に整列するための代替の模範的な方法を例示する。（A）コード化プローブ230を含む溶液210の滴が、カバースリップ200とガラススライド220との間に挟まれる。カバースリップ200が適所に保持される間に、スライド220が動かされ、結果としてコード化プローブ230が整列される。 コード化プローブ340を表面300に整列するための別の代替の模範的な方法を例示する。 プローブ分子410に接着したナノバーコード420を含む模範的なコード化プローブ400を例示する。個別のナノバーコード420は、下記により詳細に検討されるように、1つ以上の部分から構成されてもよい。 コード化プローブの合成のための典型的なスキームを示す図である。（A）典型的なナノタグ要素をR1およびR2官能基を含む二官能価分子に転換する。（B）一方の官能基を保護し、他方を活性化する。（C）制御された重合で構成単位を段階的に加える。 主鎖介在ナノバーコード合成のための一般的なスキームを示す図である。（A）タグユニットの一官能化。（B）アミノ酸類似物への転換。（C）ヌクレオチド類似物への転換。 コード化プローブに組み込むための二官能価フラーレンジオールの典型的な修飾を示す図である。 コード化プローブ合成に使用される二官能価フラーレンの典型的な構造を示す図である。 原子間鏡検法によって得られた消化ラムダDNAの典型的な画像を示す図である。 マイクロ流体分子コーミング（MMC）によって整列されたDNA分子の例を示す図である。 マイクロ流体分子コーミング（MMC）によって整列されたDNA分子の別の例を示す図である。 一緒にハイブリッド形成された個別のオリゴヌクレオチド鎖13個から構成された典型的なオリゴヌクレオチドに基づくナノバーコードを示す図である。 図12のナノバーコードの個別のオリゴヌクレオチドの構成要素を示す図である。図12に示されるように、ナノバーコードの上部鎖を作るために使用され、図14に表される配列の下線部に相当する（配列番号：3〜11）、9個のフラグメント（順に、PT1からPT9へラベル付けられる）と、下部鎖（配列番号：12〜15）を作るために使用された4個のフラグメント（#1から#4へラベル付けられる）とがあることに注意されたい。PT1は、配列番号:3の1〜30残基に相当する。PT2は、配列番号:4の11〜40残基に相当する。PT3は、配列番号:5の21〜60残基に相当する。PT4は、配列番号:6の11〜40残基に相当する。PT5は、配列番号:7の21〜60残基に相当する。PT6は、配列番号:8の11〜40残基に相当する。PT7は、配列番号:9の21〜60残基に相当する。PT8は、配列番号:10の11〜40残基に相当する。PT9は、配列番号:11の22〜61残基に相当する。ハイブリッド形成されたナノバーコードは、走査型プローブ鏡検法によって検出可能な分岐点を呈する。 分岐点を含むPT1からPT9の完全配列を記載する。 原子間鏡検法によってイメージングされた、図12および図13のナノバーコードを示す図である（矢印、図の右上）。また、比較のために、2.8kbの線形化したプラスミドDNAが示されている。

Claims (18)

1. ａ）1つまたは複数のコード化オリゴヌクレオチドプローブを得る段階であって、各コード化オリゴヌクレオチドプローブが少なくとも1つのナノバーコードに付着したオリゴヌクレオチドプローブ分子を含み、ここで該ナノバーコードは、１または複数のコード化オリゴヌクレオチドを検出および／または同定するための組成物である段階と、
   ｂ）ターゲット分子をコード化オリゴヌクレオチドプローブと接触させる段階であって、該ターゲット分子は核酸であり、ここで該ターゲット分子は固定化された基体に付着している段階と、
   ｃ）前記核酸にハイブリダイズした隣接したコード化オリゴヌクレオチドプローブを連結させて、連結したコード化オリゴヌクレオチドプローブを形成する段階と、
   ｄ）該連結したコード化オリゴヌクレオチドプローブを前記核酸および連結していないコード化オリゴヌクレオチドプローブから分離する段階と、
   ｅ）前記連結したコード化オリゴヌクレオチドプローブを、フリーフロー電気泳動を用いて分子コーミングにより表面上に整列させる段階と、
   ｆ）前記コード化オリゴヌクレオチドプローブを同定する段階と、
   を含む方法。
2. 特定の長さのオリゴヌクレオチド用の可能なすべての配列を含むコード化プローブのライブラリをターゲット分子に接触させる、請求項１記載の方法。
3. ナノバーコードが、カーボンナノチューブ、フラーレン、マイクロメートル以下の金属バーコード、ナノ粒子、および量子ドットからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
4. コード化プローブを走査型プローブ顕微鏡検査によって同定する、請求項１記載の方法。
5. 走査型プローブ顕微鏡検査手法が、原子間力顕微鏡検査、走査型トンネル顕微鏡検査、水平力顕微鏡検査、化学力顕微鏡検査、フォースモジュレーションイメージング、磁気力顕微鏡検査、高周波磁気力顕微鏡検査、磁気抵抗感受性マッピング、電気力顕微鏡検査、走査型容量顕微鏡検査、走査型広がり抵抗顕微鏡検査、トンネル原子間力顕微鏡検査および導電性原子間力顕微鏡検査からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
6. 表面に整列されたコード化プローブを走査型プローブ顕微鏡検査によって同定する、請求項１記載の方法。
7. 核酸に結合するオリゴヌクレオチドの配列を決定することをさらに含む、請求項６記載の方法。
8. 核酸に結合するオリゴヌクレオチドの配列から核酸の配列を決定することをさらに含む、請求項７記載の方法。
9. 核酸に結合するコード化プローブから核酸を同定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
10. ターゲット分子が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、脂質、糖脂質または多糖類である、請求項１記載の方法。
11. 2つ以上のターゲット分子が試料中に存在し、試料中のすべてのターゲット分子を同時に分析する、請求項１０記載の方法。
12. 2つ以上のターゲット分子が試料中に存在し、同種類のすべてのターゲット分子を同時に分析する、請求項１０記載の方法。
13. a）複数のコード化プローブを得る段階であって、各コード化プローブが少なくとも1つのナノバーコードに付着し、該コード化プローブの少なくとも２つが、異なる検出可能な信号を生成することができる２つまたはそれを超える量の同定可能な異なるナノバーコードを含み、ここで該ナノバーコードは、カーボンナノチューブ、フラーレン、マイクロメートル以下の金属バーコード、ナノ粒子、量子ドット、それらの組合せ、およびナノタグ要素から作られたナノバーコードからなる群から選択される段階と、
    b）1つまたは複数のターゲット分子をコード化プローブと接触させる段階であって、該コード化プローブは、オリゴヌクレオチドを含み、かつ前記ターゲット分子上の異なる位置に結合する段階と、
    ｃ）前記ターゲット分子上で互いに隣接する前記コード化プローブを連結して連結したコード化プローブを形成し、該連結したコード化プローブをマイクロ流体チャンネルを用いて分子コーミングにより基体表面上で整列させて整列したコード化プローブを形成し、ここで、前記連結したコード化プローブは、マイクロ流体チャンネルにおいてマイクロ流体の流れの方向に整列される段階と、
    ｄ）前記整列したコード化プローブを同定する段階と、
    ｅ）該整列したコード化プローブに基づき１または複数のターゲット分子を検出する段階と、
    を含む方法。
14. ターゲット分子が、核酸である、請求項１３記載の方法。
15. 結合したコード化プローブから核酸の配列の少なくとも一部を決定する段階をさらに含む、請求項１４記載の方法。
16. コード化プローブを表面に整列する前に、ターゲット分子から結合したコード化プローブを分離する段階をさらに含む、請求項１３記載の方法。
17. ａ）走査型プローブ顕微鏡と、
    ｂ）基体と、
    ｃ）該基体上に固定化された少なくとも1つのターゲット分子であって、該ターゲット分子は核酸であるターゲット分子と、
    ｄ）該核酸に連結された少なくとも１つのコード化オリゴヌクレオチドプローブであって、各コード化オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも1つのナノバーコードに付着しているコード化オリゴヌクレオチドプローブと、
    ｅ）前記核酸から分離した後、前記コード化オリゴヌクレオチドプローブが付着する表面と、
    ｆ）該表面上の分離されたコード化オリゴヌクレオチドプローブを整列させる、フリーフロー電気泳動装置と、
    を含む、核酸配列決定用のシステム。
18. 走査型プローブ顕微鏡が、原子間力顕微鏡または走査型トンネル顕微鏡である、請求項１７記載のシステム。

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