JP6004470B2 - 試料の固定化方法 - Google Patents

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Description

本発明は、導電性基板上への試料の固定化方法に関する。より詳細には、例えば試料を電子顕微鏡で観察するための、導電性基板上への試料の固定化方法に関する。
核酸、タンパク質等の生体高分子、ナノ粒子等の試料の分子レベルでの観察は、生物学、医学、薬学、農学、工学等の分野において注目を集めている。例えば、生体高分子の分子レベルでの観察が可能になれば、生体高分子の構造および挙動の理解、並びに生命現象の理解が進み、医療、創薬の分野にも応用することが可能になると考えられる。また、例えば、遺伝情報を担う重要な生体高分子として知られるDNAは、近年、その自己集合化特性、塩基相補性および電気伝導特性の工学的応用について注目されている。
上記試料の分子レベルでの観察を行う方法の例として、顕微鏡を用いた方法が挙げられる。分子レベルでの観察への応用が試みられている顕微鏡としては原子間力顕微鏡(AFM)、走査型電子顕微鏡(SEM)等が挙げられる。上記顕微鏡にて試料を観察するためには、試料を基板へ固定化することが重要である。
これまでに、基板への試料の固定化方法に関して多くの研究がなされており、例えばDNAはマイカ(雲母)表面に自己集合化構造を形成しやすいことがわかっている。マイカ基板へのDNAの固定化を容易にする方法として、非特許文献1には、光架橋剤を介してDNAをマイカ基板へ固定化させる方法が記載されている。非特許文献1では、マイカ基板に固定化した試料をAFMによって観察している。
非特許文献2では、HOPG基板と対向電極との間に電圧を印加することによって、HOPG基板上にDNAを固定化する方法、および、AFMによる試料の観察結果が記載されている。
Shlyakhtenko, L. S. et. al.,Biophysical Journal 77, p.568-576, 1999. Oliveira Brett, A. M. and Chiorcea Paquim, A.-M.,Bioelectrochemistry 66,p.117-124,2005.
AFMでは、高さ方向(換言すれば、試料を固定化している基板の表面に対して略垂直な方向)の情報を評価できるが、SEMでは、横方向(換言すれば、試料を固定化している基板の表面に対して略平行な方向)の情報を評価できる。SEMは、基板表面に電子線を当てることによって、AFMよりも広範囲のデータを短時間に取得することができるという点で優れている。
しかしながら、上記従来の技術は、SEM等の電子顕微鏡での観察に供することができる試料を作製するための、導電性基板上に効率よく試料を固定化する方法を実現できないという問題点を有している。
具体的には、SEMでは、試料表面の帯電を防ぐため、導電性基板に試料を固定化する必要がある。上述した非特許文献1に記載の技術ではマイカ基板を用いているが、マイカ基板は導電性を有していないため、電子顕微鏡による試料の観察が不可能であるという問題点を有していた。
また、導電性基板の表面が帯電している場合、電荷を有する試料を導電性基板上に固定化させることは困難である。例えば、導電性基板として知られている高配向性焼結グラファイト(HOPG)は表面が負に帯電しており、またDNAもリン酸基が負に帯電しているため、互いに反発し合い、HOPG基板上にDNAを固定化することはできなかった。上述した非特許文献2において使用されているDNAは仔ウシの胸腺に由来するものであり、比較的長鎖のDNAであると考えられる。非特許文献2に記載の技術は、基板上にDNAを付着させる技術ではあるが、短鎖のDNAをつなぎ合わせながら基板上に吸着させて自己集合化構造を形成させることを目的としたものではない。従って、非特許文献2に記載の技術では、DNAが自己集合化構造を形成する程度まで効率よく固定化することはできないという問題点を有していた。
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は電子顕微鏡での観察に供することができる試料を作製するために、導電性基板上に効率よく試料を固定化する方法を提供することにある。
上記の課題を解決するために、本発明に係る試料の固定化方法は、電荷を有する試料を導電性基板上に固定化する、試料の固定化方法であって、上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程と、上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程と、上記イオン溶液に含まれる溶媒を除去する第1溶媒除去工程と、上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程と、上記試料溶液に含まれる溶媒を除去する第2溶媒除去工程と、を含んでいることを特徴としている。
上記構成によれば、電極対に電圧を印加することによって、試料とは逆の電荷を有するイオンを導電性基板上に均一に分散させることができる。よって、電荷を有する試料を、当該試料とは逆の電荷を有するイオンを介することによって、均一に導電性基板に固定化することができる。また、上記構成によれば、導電性基板上に試料を固定することができるため、電子顕微鏡を用いて試料を観察することができる。さらに、上記構成によれば、導電性基板上に試料を自己集合化させて固定化することができる。
本発明に係る試料の固定化方法では、上記導電性基板は、表面が原子レベルで平坦であることが好ましい。
上記構成によれば、導電性基板の表面の凹凸が少ないので、試料の観察を行う場合に、試料と基板とを明確に区別することができる。
本発明に係る試料の固定化方法では、上記導電性基板は、高配向性焼結グラファイトによって形成されていることが好ましい。
高配向性焼結グラファイト(HOPG)は炭素原子からなり、当該炭素原子間の距離が非常に小さいため、原子レベルで平坦である。よって、上記構成によれば、試料を固定化した場合に、試料と基板とを明確に区別することができる。
本発明に係る試料の固定化方法では、上記電極対は、1対の導電性基板からなることが好ましい。
上記構成によれば、一方の導電性基板をカソードとし、もう一方の導電性基板をアノードとすることができる。よって、カソード側の導電性基板には陽イオンを、アノード側の導電性基板には陰イオンを誘引することができる。
本発明に係る試料の固定化方法では、上記イオン分散工程では、上記1対の導電性基板のうち、一方の導電性基板上に陽イオンを分散させ、もう一方の導電性基板上に陰イオンを分散させることが好ましい。
上記構成によれば、表面に陽イオンが分散した導電性基板と表面に陰イオンが分散した導電性基板とを同時に作製することができる。すなわち、負に帯電した試料を固定化するための導電性基板と正に帯電した試料を固定化するための導電性基板とを同時に提供することができる。
本発明に係る試料の固定化方法では、上記試料は、核酸、タンパク質またはナノ粒子であることが好ましい。
上記構成によれば、核酸、タンパク質またはナノ粒子を導電性基板上に自己集合化させることができ、当該核酸、タンパク質またはナノ粒子の自己集合化構造を電子顕微鏡にて観察することができる。
本発明に係る試料の固定化方法では、上記試料は、50塩基以下または50塩基対以下の核酸であることが好ましい。
上記構成によれば、試料の取扱いが容易である。また上記構成によれば、核酸を基板上で自己集合化させることができ、核酸の自己集合化構造を電子顕微鏡によって観察することが容易となる。
さらに、50塩基以下または50塩基対以下の核酸を導電性基板上に自己集合化させることによって、微細な網目状の構造を形成することができる。
本発明の試料の固定化方法は、電荷を有する試料を導電性基板上に固定化する、試料の固定化方法であるため、走査型電子顕微鏡による観察に供することが可能な試料を提供することができるという効果を奏する。
また、本発明の試料の固定化方法は、上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程と、上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程とを含んでいるため、導電性基板上に上記イオンを均一に分散させることができるという効果を奏する。
さらに、本発明の試料の固定化方法は、上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程を含んでいるため、電荷を有する試料を、上記イオンを介することによって、均一に導電性基板に固定化することができるという効果を奏する。
また、本発明の試料の固定化方法は、上記導電性基板上に試料を自己集合化させた状態で固定化することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る試料の固定化方法を実施するための装置の概略図である。 本発明の一実施形態に係る試料の固定化方法において用いられる導電性基板の外観を示す図である。 本発明の一実施形態に係る試料の固定化方法において用いられる導電性基板の概略図である。 本発明の実施例で用いたHOPG基板のAFM画像である。 図5の(a)および(b)は本発明の実施例で用いたHOPG基板のAFM画像である。図5の(c)は、図5の(b)中の断面ABにおける断面図である。 本発明の実施例1における、HOPG基板上に固定化されたDNAの画像である。図6の(a)および(b)はAFM画像である。図6の(c)および(d)はFE−SEM画像である。 図7の(a)および(b)は本発明の実施例1における、HOPG基板上に固定化されたDNAのAFM画像である。図7の(c)は、図7の(a)中の断面ABにおける断面図である。 図8の(a)および(b)は本発明の実施例2における、HOPG基板上に固定化されたDNAのAFM画像である。図8の(c)は、図8の(a)中の断面ABにおける断面図である。 図9の(a)は本発明の比較例1における、HOPG基板上に固定化されたDNAのAFM画像である。図9の(b)は、図9の(a)中の矢印における断面図である。
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
<導電性基板>
電子顕微鏡を用いて試料を観察するためには、導電性基板上に試料を固定化する必要がある。本実施の形態の試料の固定化方法は、電子顕微鏡による観察に供するプレパラートの作製に利用することができるが、勿論、当該目的に限定されない。
なお、本明細書において用いられる電子顕微鏡の種類としては、走査型電子顕微鏡(SEM)が好ましく、中でも電界放出形走査電子顕微鏡(FE−SEM)を好適に使用できる。
本発明において、導電性基板は、導電性(電気伝導性)を有する基板であれば特に限定されるものではなく、基板自体が導電性を有する材料で形成されていてもよく、導電性を有する材料が混合されているために導電性を有している基板であってもよい。また、導電性を有する材料によってコーティングされた基板であってもよい。
導電性基板の例としては、例えば、金属(例えば、金、銀、銅またはアルミニウム等)によって形成またはコーティングされている基板や、グラファイト(例えば、高配向性焼結グラファイト(HOPG))によって形成またはコーティングされている基板等が挙げられる。
上記導電性基板は、原子レベルで平坦(atomic flat)であることが好ましい。なお、本明細書において「原子レベルで平坦」とは、基板表面の少なくとも1000×1000nmの領域において、最も低い点から最も高い点までの高さが2nm以下であることを意味する。なお、「原子レベルで平坦」であるか否かは、原子間力顕微鏡(AFM)によって判定することが可能である。
導電性基板が「原子レベルで平坦」であれば、導電性基板の表面の凹凸が少ないので、試料の観察を行う場合に、試料と基板とを明確に区別することができる。また、導電性基板が「原子レベルで平坦」であれば、導電性基板の表面の凹凸が少ないので、導電性基板上に効率良く試料を固定化できるとともに、試料を効率よく自己集合化させることができる。
本発明において、「固定化」とは、試料の少なくとも一部が導電性基板上に安定して固定されている状態を指す。例えばDNA等の生体高分子では、基板上に自己集合化構造を形成することが知られている。なお、本明細書において「自己集合化」とは、分子間に様々な相互作用が働いた結果、自発的に分子が集合し、特定の構造を形成することを意味する。上記相互作用には、原子間の静電相互作用、分子間力、溶媒から受ける熱搖動力等が包含される。特にDNAでは自己集合化した結果、網目状の構造を形成することが知られており、本願では当該構造を「ネットワーク構造」とも呼ぶ。
上記導電性基板は、HOPGによって形成またはコーティングされている基板であることが特に好ましい。HOPGは炭素原子からなり、当該炭素原子間の距離が非常に小さいため、原子レベルで平坦な表面を実現できる。よって、上記構成によれば、試料を固定化した場合に、試料と基板とをより明確に区別することができる。
<固定化される試料>
本発明において、固定化される試料は観察の対象となる試料であって、電荷を有する試料である。
本発明において「電荷を有する試料」とは、少なくとも一部が帯電している試料である。具体的に、上記試料は、少なくとも一部が、正または負の何れかに帯電している試料であってもよい。また、上記試料は、一部が正に帯電し、別の一部が負に帯電している試料であってもよい。この場合には、試料全体として見たときに、試料が正または負の何れか一方に偏って帯電していればよい。
上記試料には例えば核酸、タンパク質等の生体高分子、ナノ粒子等が挙げられる。上記構成によれば、核酸、タンパク質またはナノ粒子を導電性基板上に自己集合化させることができ、当該核酸、タンパク質またはナノ粒子の自己集合化構造を電子顕微鏡にて観察することができる。核酸としては特に限定されず、DNAであってもよく、RNAであってもよい。また、核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。ナノ粒子としては、金属クラスタ等が挙げられる。
上記試料は、50塩基以下の核酸であってもよいし、50塩基対以下の核酸であってもよい。上記構成によれば、試料の取扱いが容易である。また上記構成によれば、核酸を基板上で自己集合化させることができるため、核酸の自己集合化構造を電子顕微鏡によって観察することが容易となる。
さらに、50塩基以下または50塩基対以下の核酸を導電性基板上に自己集合化させることによって、ナノメートルサイズの微細な網目状の構造を形成することができる。当該網目状の構造は、これまで半導体技術では極めて困難とされてきた数ナノメートルの構造物を基板表面に構築するために利用できると考えられる。
<イオン供給工程>
本発明に係る試料の固定化方法は、上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程を含んでいる。
本発明において「イオン溶液」とは、イオンを含んでいる溶液を指し、例えば電解質を溶媒に溶解させて作製すればよい。
上記イオン溶液に含まれるイオンは、固定化の対象である試料とは逆の電荷を有するイオンであればよく、特に限定されるものではない。例えば試料が負に帯電している場合は、当該イオンは陽イオンであればよく、例えばMg2+、Ca2+等の二価の金属イオン、Na、K等の一価の金属イオンが好適に用いられる。一方、試料が正に帯電している場合は、当該イオンは陰イオンであればよく、例えばCl等が好適に用いられる。
上記イオン溶液を構成する溶媒は極性溶媒であれば特に限定されないが、水であることが好ましい。上記構成によれば、取り扱いが容易である。また、上記溶媒は特に超純水であることが好ましい。上記構成によれば、不純物による影響を排除できる。
上記イオン溶液は、少なくとも固定化の対象である試料とは逆の電荷を有するイオンを含んでいれば良く、当該イオンとは異なる電荷を有するイオンを同時に含んでいても良い。
上記イオン溶液としては、例えばMgCl水溶液、CaCl水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
<イオン分散工程>
本発明に係る試料の固定化方法は、上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程を含んでいる。
導電性基板は、例えば表面を洗浄した場合や劈開した場合に帯電する。例えば、HOPGの表面は負に帯電する。また、生体高分子およびナノ粒子も水溶液中では帯電していることが多く、例えばDNAはリン酸基が負に帯電している。そのため、HOPGとDNAとは反発し合い、HOPG上にDNAを固定化することは困難である。しかし、本発明に係る試料の固定化方法は、導電性基板上に、試料とは逆の電荷を有するイオンを分散させるため、導電性基板表面と同一の電荷を有する試料であっても、当該試料とは逆の電荷を有するイオンを介することによって、導電性基板に固定化することができる。
本発明において、「イオンを分散させる」とは、イオンが導電性基板の表面上に均一に広がった状態にすることを指す。
上記イオン分散工程では、イオンを導電性基板上に分散させるために、導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対に電圧を印加し、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引する。上記構成によれば、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に均一に分散させることができる。よって、上記イオンを介して試料を導電性基板上に均一に固定化することができる。
具体的には、導電性基板をアノード側に用いれば、導電性基板上に陰イオンを誘引することができる。そして、当該陰イオンを誘引した導電性基板上には、更なる工程を経て、正の電荷を有する試料が固定化されることになる。一方、導電性基板をカソード側に用いれば、導電性基板上に陽イオンを誘引することができる。そして、当該陽イオンを誘引した導電性基板上には、更なる工程を経て、負の電荷を有する試料が固定化されることになる。
本発明において「電極対」とは対になった電極であり、つまり2個の電極が1組となった電極である。本発明においては、電極対は導電性基板を少なくとも一方の電極として含んでいればよい。導電性基板と対をなす、もう一方の電極は電極として機能するものであれば特に材料、形状等は限定されない。勿論、電極対を形成する電極の両方が導電性基板であってもよい。
上記イオン分散工程では、電極対として上記導電性基板を2枚使用し、当該1対の導電性基板の間に電圧を印加することが好ましい。上記構成によれば一方の導電性基板には陰イオンを、もう一方の導電性基板には陽イオンを誘引することができる。
すなわち、1対の導電性基板の間に陰イオンを含んでいる溶液を配置した場合、アノード側の導電性基板に陰イオンが誘引される。その結果、表面に陰イオンが分散した導電性基板を作製することができる。同様に、1対の導電性基板の間に陽イオンを含んでいる溶液を配置した場合、カソード側の導電性基板に陽イオンが誘引される。その結果、表面に陽イオンが分散した導電性基板を作製することができる。
また、上記イオン分散工程は、1対の上記導電性基板のうち、一方の導電性基板上に陽イオンを分散させるとともに、もう一方の導電性基板上に陰イオンを分散させる構成であってもよい。
すなわち、1対の導電性基板の間に、陽イオンと陰イオンとの両方を含んでいるイオン溶液を配置して電圧を印加し、アノード側の導電性基板に陰イオンを分散させるとともに、カソード側の導電性基板に陽イオンを分散させる構成であってもよい。上記構成によれば、表面に陽イオンが分散した導電性基板と表面に陰イオンが分散した導電性基板とを同時に作製することができる。つまり、負に帯電した試料を固定化するための導電性基板と正に帯電した試料を固定化するための導電性基板とを同時に提供することができる。
導電性基板に電圧を印加する方法としては、特に限定されないが、例えば図1に示すような装置を用いればよい。具体的には、2枚の導電性基板1をさらに良好な導電性を有する材料3に固定し、図1に示す装置内に配置する。当該装置には電源4およびオン/オフスイッチ5が接続されている。向かい合わせて配置した2枚の導電性基板1の間にイオン溶液2を配置し、当該2枚の導電性基板1からなる電極対に電圧を印加する。
本発明に係る導電性基板は、例えば図2のように固定されてもよい。図2に示される導電性基板1は、良好な導電性を有する材料3上に固定されている。良好な導電性を有する材料3としては、例えば真鍮基板を好適に用いることができる。また、良好な導電性を有する材料と導電性基板とを接着する材料にも導電性を有する材料を用いることが好ましく、銀ペーストを用いて固定することが好ましい。上記構成によれば、効率よく電圧を印加することができる。
電圧を印加した後、導電性基板を図1に示す装置から取り外すと、図3に示すような状態になる。すなわち、カソード側の導電性基板1上には陽イオンを含んでいる溶液21が付着しており、アノード側の導電性基板1には陰イオンを含んでいる溶液22が付着している。
<第1溶媒除去工程>
本発明に係る試料の固定化方法は、上記イオン溶液に含まれる溶媒を除去する第1溶媒除去工程を含んでいる。上記構成によれば、表面にイオンが吸着している導電性基板を作製することができる。
溶媒を除去する方法や条件は特に限定されない。例えば、溶媒を除去する温度としては試料が凍結しない温度であればよく、30℃〜100℃であってもよく、0℃〜15℃であってもよい。より、効率的に試料を固定化(自己集合化)させるという観点からは、上記温度のなかでは、15℃〜30℃であることが好ましいといえる。また、溶媒を除去する時間としては、特に限定されないが、より、効率的に試料を固定化(自己集合化)させるという観点からは、24時間程度であることが好ましいといえる。
溶媒を除去する方法や条件としては、例えば、自然乾燥させることが好ましく、特に保存容器内に一晩安置して自然乾燥させることが好ましいといえる。
<試料固定化工程>
本発明に係る試料の固定化方法は、上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程を含んでいる。
上記構成によれば、上記イオン分散工程において分散させたイオンが陽イオンであれば、負に帯電した試料を導電性基板上に固定化することができる。一方、分散させたイオンが陰イオンであれば、正に帯電した試料を導電性基板上に固定化することができる。
上記試料溶液は試料を含んでいる溶液である。試料溶液に含まれる溶媒は極性溶媒であれば特に限定されないが、水であることが好ましい。上記構成によれば、取り扱いが容易である。また、上記溶媒は特に超純水であることが好ましい。上記構成によれば、不純物による影響を排除できる。
上記試料固定化工程では、試料溶液を導電性基板上に配置した後、放置することが好ましい。上記構成によれば試料を十分に導電性基板上に固定化することができる。また、試料がDNAであれば、発達した自己集合化構造を形成させることができる。
ただし、試料溶液配置後の放置時間はイオン溶液の濃度との関係で調節されることが好ましい。イオン溶液の濃度が100μmol/l以上である場合、放置時間は20分以下であることが好ましい。また、イオン溶液の濃度が40μmol/l以下である場合、放置時間は60分以上であることが好ましい。
<第2溶媒除去工程>
本発明に係る試料の固定化方法では、上記試料溶液に含まれる溶媒を除去する第2溶媒除去工程を含んでいる。上記構成によれば、イオンを介して表面に試料が固定化されている導電性基板を作製することができる。
溶媒を除去する方法や条件は特に限定されない。例えば、溶媒を除去する温度としては、0℃〜15℃であってもよく、15℃〜30℃であってもよい。より効率的に試料を固定化(自己集合化)させるという観点からは、上記温度のなかでは、15℃〜30℃であることが好ましいといえる。特に、試料がDNAである場合は、人の体温を大きく上回る温度では分解される可能性がある。また、溶媒を除去する時間は、上記試料溶液の濃度に応じて調節すればよい。より効率的に試料を固定化(自己集合化)させるという観点からは、上記時間は、20分〜60分であることが好ましいといえる。
溶媒を除去する方法や条件としては、例えば、自然乾燥させることが好ましい。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、説明の便宜上、図面中で同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記する。
〔試料の固定化〕
まず、図2に示すように、導電性基板1を良好な導電性を有する材料3へ固定した。本実施例では、導電性基板1としてHOPG基板を用い、良好な導電性を有する材料3として真鍮基板を用いた。HOPG基板と真鍮基板とは銀ペーストを用いて接着した。その後、HOPG基板の表面に存在する埃の除去を行い、原子レベルで平らな表面を出すためにメンディングテープを用いてHOPG基板を劈開した。劈開したHOPG基板の表面のAFM画像を図4に示す。図4に見られる模様は炭素原子の作る六員環によるものであると考えられる。
次に、図1に示す装置に2枚のHOPG基板を固定し、当該2枚のHOPG基板の間にイオン溶液2としてMgCl水溶液を滴下した。図1の装置によってHOPG基板に対して電圧を1時間印加した後、2枚のHOPG基板を引き離すと、図3に示すような状態になった。ここで、カソード側のHOPG基板には陽イオンとしてMg2+を含んでいる溶液が付着しており、アノード側のHOPG基板には陰イオンとしてClを含んでいる溶液が付着している。
当該HOPG基板を一晩自然乾燥させて、水分を除去した。Mg2+を分散させたHOPG基板の表面のAFM画像を図5に示す。図5の(a)は、HOPG基板の表面の5.0×5.0μmの領域を示しており、図5の(b)は、HOPG基板の表面の5.0×5.0μmの領域を示している。図5の(c)は、図5の(b)のA−B間の断面図を示している。なお、図5の(c)において多数の凹凸が見られるが、以下の実施例では、原子レベルで平坦であると見なせる領域において、DNAによる自己集合化構造が形成されているかどうかを確認した。
上記のMg2+が分散しているHOPG基板にDNA水溶液を滴下して放置した後、水分を除去し、AFMまたはSEMによる観察を行った。当該DNA水溶液は、poly(dA)とpoly(dT)とが二重らせん構造を形成している50bpのDNA断片を0.5μmol/lの濃度で超純水に溶解させたものである。以下の実施例および比較例には、当該DNA水溶液を2時間攪拌した後、低温(15℃〜30℃)で一晩放置したものを使用した。
〔実施例1〕
MgCl水溶液の濃度を40μmol/l、電圧を2V、DNA水溶液を滴下してから水分を除去するまでの放置時間を60分として試料をHOPG基板上に固定化した。当該試料のAFMおよびFE−SEM(日立、S−5000L)による観察結果を図6に示す。
図6の(a)および(b)はAFMによる観察結果であり、図6の(a)は、HOPG基板の表面の2.0×2.0μmの領域を示しており、図6の(b)は、HOPG基板の表面の5.0×5.0μmの領域を示している。図6の(c)および(d)はSEMによる観察結果であり、図6の(c)は、HOPG基板の表面の2.0×2.0μmの領域を示しており、図6の(d)は、HOPG基板の表面の5.0×5.0μmの領域を示している。
図6の(a)〜(d)から、HOPG基板の表面にはDNAが固定化されており、DNAが自己集合化構造(ネットワーク構造)を形成していることがわかる。また、AFMはもちろんのこと、SEMにおいても当該試料を観察可能であり、鮮明な画像を得ることができた。
上記試料の高さ方向の情報を包含している、AFMによる観察結果を図7に示す。図7の(a)は、図6の(a)と同一の領域を示しており、図7の(b)は、HOPG基板の表面の2.0×2.0μmの領域を示している。図7の(c)は、図7の(a)のA−B間の断面図を示している。
図7においても、HOPG基板上にDNAが固定化されており、当該DNAによって鮮明なネットワーク構造が形成されていることがわかる。2本鎖DNAの構造を略円筒と考えた場合、当該円筒の横断面の直径は約2nmである。実施例1の場合は、図7の(c)に示す通り、自己集合化構造の高さが約2nmであることから、HOPG基板上に2本鎖DNAの単層の自己集合化構造が形成されていることがわかる。
〔実施例2〕
MgCl水溶液の濃度を100μmol/l、電圧を2V、DNA水溶液を滴下してから水分を除去するまでの放置時間を20分として試料をHOPG基板上に固定化した。なお、HOPG基板上に固定化された試料の高さ方向の情報を得るため、観察にはAFMを用いた。
AFMによる観察結果を図8に示す。図8の(a)は、HOPG基板の表面の1.0×1.0μmの領域を示しており、図8の(b)は、HOPG基板の表面の900×900nmの領域を示している。実施例2においてもHOPG基板上にDNAが固定化されており、当該DNAによって鮮明なネットワーク構造が形成されていることがわかる。
また、実施例1と実施例2とを比較すると、実施例2では、DNAの自己集合化構造が一様に広がるまでの時間がより短縮されることが明らかとなった。これは、MgCl水溶液の濃度が濃い場合、DNA一分子に対する基板表面近傍のMg2+の個数が増加し、DNAの吸着が促進されるためであると考えられる。
〔比較例1〕
HOPG基板の間にMgCl水溶液を配置せずに、DNA水溶液を直接HOPG基板上に配置し、電圧を印加した。上記の点以外は上述の〔試料の固定化〕に示した手順に従って実験を行った。なお、HOPG基板上に固定化された試料の高さ方向の情報を得るため、観察にはAFMを用いた。
AFMによる観察結果を図9に示す。図9の(a)は、HOPG基板の表面の2.0×2.0μmの領域を示しており、図9の(b)は、図9の(a)中の矢印における断面図を示している。
図9の(b)に示す通り、自己集合化構造の高さが平均して5〜6nmであり、実施例1および2のようなDNAの単層の自己集合化構造は形成されていないことがわかる。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明は、例えば生物学、医学、薬学、農学、工学等の分野において、電子顕微鏡による生体高分子およびナノ粒子の観察に好適に利用することができる。
1 導電性基板
2 イオン溶液
3 良好な導電性を有する材料
4 電源
5 オン/オフスイッチ
21 陽イオンを含んでいる溶液
22 陰イオンを含んでいる溶液

Claims (7)

  1. 電荷を有する試料を導電性基板上に固定化する、試料の固定化方法であって、
    上記導電性基板を少なくとも一方の電極として含む電極対の間に、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを含むイオン溶液を配置するイオン供給工程と、
    上記電極対に電圧を印加することによって、上記試料とは逆の電荷を有するイオンを上記導電性基板上に誘引するとともに分散させるイオン分散工程と、
    上記イオン溶液に含まれる溶媒を除去する第1溶媒除去工程と、
    上記イオンが分散された上記導電性基板上に、上記試料を含む試料溶液を配置し、上記イオンを介して上記試料を上記導電性基板上に固定化する試料固定化工程と、
    上記試料溶液に含まれる溶媒を除去する第2溶媒除去工程と、を含んでいることを特徴とする試料の固定化方法。
  2. 上記導電性基板は、表面が原子レベルで平坦であることを特徴とする請求項1に記載の試料の固定化方法。
  3. 上記導電性基板は、高配向性焼結グラファイトによって形成されていることを特徴とする請求項2に記載の試料の固定化方法。
  4. 上記電極対は、1対の導電性基板からなることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の試料の固定化方法。
  5. 上記イオン分散工程では、上記1対の導電性基板のうち、一方の導電性基板上に陽イオンを分散させ、もう一方の導電性基板上に陰イオンを分散させることを特徴とする請求項4に記載の試料の固定化方法。
  6. 上記試料は、核酸、タンパク質またはナノ粒子であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の試料の固定化方法。
  7. 上記試料は、50塩基以下または50塩基対以下の核酸であることを特徴とする請求項6に記載の試料の固定化方法。
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