CN102150037B - 集成电荷传感器的纳米流体通道及基于该纳米流体通道的方法 - Google Patents

集成电荷传感器的纳米流体通道及基于该纳米流体通道的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种电探测器，其包括集成有电荷传感器的纳米流体通道。所述电荷传感器可为纳米管、纳米线、晶体管或电容，并且可以是碳、硅、碳/硅或其他半导体材料。纳米通道的深度与德拜屏蔽距离接近。本发明还提供了以电探测器探测带电分子或生物或化学物类的方法。溶液中的带电分子或物类被驱动通过电探测器的纳米通道，并与电荷传感器接触，从而产生可探测到的信号。本发明还提供了检测局部溶液电势的方法。流经电探测器纳米通道的溶液与电荷传感器接触，从而产生可探测到的局部溶液电势信号。

Description

集成电荷传感器的纳米流体通道及基于该纳米流体通道的方法
相关申请
本申请要求于2008年7月11日递交的申请号为61/080,170，名称为“集成纳米线的纳米流体通道”的美国临时专利申请的优先权，其全部内容被引用纳入本申请。
关于联邦资助研发的声明
本公开的发明是在政府的支持下完成的，相关的合同包括国家科学基金会的NSF987677号合同、国立卫生研究院的NIH HG001506号合同以及国家科学基金会STC项目下的ECS-987677的合同。政府对本发明拥有权利。
1.技术领域
本发明涉及集成电荷传感器的纳米流体通道(“纳米通道”)，所述电荷传感器可为纳米管、纳米线、晶体管或电容。本发明还涉及用电荷传感器检测纳米流体通道内的生物或化学物类的方法。本发明还涉及利用电荷传感器检测纳米流体通道局部溶液电势的方法。本发明还涉及测量带电分子，特别是带电生物或化学物类的构象、长度、速度或荧光强度的方法。
2.发明背景
2.1以纳米流体通道作为目标分子的探测器
近年来，已经对利用纳米技术制造的，充满流体的通道(“纳米流体通道”或“纳米通道”)和孔结构作为操作和探测单个生物分子的工具进行了研究。尤其是纳米通道和纳米裂缝已被用于伸长和观察荧光标记的DNA分子。片段长度分析、限制性位点图谱(Riehn，R.，et al.，Restriction mapping in nanofluidic devices.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005.102(29)：p.10012-10016)及使用结合的探针得到目标模体(motif)的物理图谱(Phillips，K.M.，et al.，Application of single molecule technology to rapidly map longDNA and study the conformation of stretched DNA.Nucleic Acids Research，2005.33(18)：p.5829-5837)都被证明是单分子伸长的结果。很多研究致力于理解空间局限诱导的伸长的物理过程。DNA在如此环境中延伸是因为关键的分子内距离尺度，如回转半径(通常为100纳米级别)和持续长度(通常为60纳米)，与纳米通道直径或纳米裂缝深度(10-100nm)相当(Tegenfeldt，J.O.，et al.，The dynamics ofgenomic-length DNA molecules in 100-nm channels.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，2004.101(30)：p.10979-10983)。生物分子的大小和利用纳米技术制造的操控装置的长度尺寸相似使得单分子控制成为可能。此外，随通道尺寸减小，DNA分子与通道边界的液体动力学偶合变得更加显著。液体动力学摩擦有助于在分子被探测时保持稳定。这与电探测通过纳米孔的DNA分子的技术相比是一个改进(Healy，K.，B.Schiedt，and A.P.Morrison，Solid-state nanopore technologies for nanopore-based DNA analysis.Nanomedicine，2007.2(6)：p.875-897)，在电探测中，热搅动是限制长度测量分辨率的一个主要因素。
2.2纳米管和纳米线作为带电分子传感器
除了对利用纳米通道进行单分子操作的改进外，在相关领域也做了很多工作，比如使用纳米管和纳米线探测单分子。
半导体纳米线可以在溶液中感应到附近的带电分子。人们认为这既可能是通过场效应门控也可能是因为电荷注入而发生，这两者都导致纳米线电导率的变化。因此，如果带电分子足够接近纳米线，通过观察纳米线电导率的变化，它的存在会被观察到。如果目标分子远离纳米线，溶液中离子可以完全屏蔽掉其电荷，使纳米线探测不到。
纳米管和纳米线已被证明可以用于探测生物分子，既使是在单个蛋白质结合和解离的水平上(Patolsky，F.，G.Zheng，and C.M.Lieber，Nanowire sensors for medicineand the life sciences.Nanomedicine，2006.1(1)：p.51-65；Patolsky，F.，G.F.Zheng，andC.M.Lieber，Nanowire-based biosensors.Analytical Chemistry，2006.78(13)：p.4260-4269)。纳米线和纳米管的尺寸通常与目标分子相同或者更小的事实决定了纳米管和纳米线的灵敏度。因此，单个带电及结合的生物分子会导致纳米线整个横截面的载流子浓度的变化。此外，对于单壁碳纳米管(SWCNTs)和DNA，纳米管的直径可以几乎和DNA碱基之间距离一样小(分别为0.7nm和0.34nm)，并且比双链分子的宽度还要小(2nm)。
溶液中的离子能够屏蔽电荷的长度称为离子屏蔽距离。利用纳米线进行检测的主要挑战之一，就是控制分子位于等于、或小于纳米线的离子屏蔽距离处。在过去，这是通过表面官能化或其它方法使目标分子化学依附在纳米线表面来实现的。如果分子能够依附在表面，目标分子通常就位于屏蔽距离之内，从而可通过电场效应导致纳米线电导率的改变。该方法的劣势包括但不限于以下事实，针对每一目标分子，可能需要用一个特定的化合物来官能化纳米线，或者某些纳米线的官能化非常困难。
2.3单个DNA分子的探测
用荧光观测在纳米通道中伸长的单个DNA分子是现有技术。使用荧光探测来测量单个DNA片段的长度是可能的。目前已有的“芯片实验室”装置(如，来自US Genomic Corporation)被用于测量DNA片段长度。这些装置通过一个不同于荧光检测的方法来实现DNA片段长度的测量。这些设备中没有使用纳米线，也没有使用纳米级通道，仅使用了微米级通道。
光学长度测量有几个物理限制。首先，使用光学检测必需采用大型光学仪器(显微镜、灯或激光器、CCD探测器等)。在标准状态下，该设备往往会占据整个光学平台上的空间，而且很多是不能小型化的，即便是其最先进和最昂贵的型号。这严重限制了希望制造便携、低成本的“芯片实验室”的产品设计者。第二，光学系统提供的空间分辨率是有限的。由于光的波属性和荧光显微镜所采用的典型波长，即使采用最好的光学系统，所能获得的空间分辨率依然被限制在200nm左右。DNA分子中有很多值得研究的特征小于200nm。比如，相邻碱基对之间的间距为0.3nm。DNA链上的多个杂交探针的位置(数量由U.S.Genomics当前生产的设备测定)之间可能只距离几个纳米。
因此，业界需要一种便携的、低成本的、精确的“芯片实验室”探测器，其具有能够探测单个目标分子长度的空间分辨率。还需要一种包括电荷传感器的探测器，其能够探测距离所述电荷传感器约等于或小于离子屏蔽距离的目标分子。业界还需要一种目标分子不化学依附于其上的传感器。还需要一种微芯片或者微装置，用于目标分子的无标记电子分析，比如miRNA在单个细胞中的表达，其所有的操作步骤都集成到该芯片上。
在第2部分或本申请其他部分中对任何参考文献的引用或提及，不应被视为承认所引用文献已成为本发明的现有技术。
3.发明内容
提供了一种包括纳米流体通道和电荷传感器的电探测器，其中：
所述电荷传感器选自由以下构成的组：纳米线、纳米管、晶体管以及电容器，以及
所述电荷传感器的一部分被集成在所述纳米流体通道中，从而使所述电荷传感器接触到纳米流体通道中的液体。
在一个实施方式中，所述电荷传感器的部分是位于所述纳米流体通道之内或其表面上。
在另一实施方式中，所述整个电荷传感器位于所述通道之内或其表面上。
在另一实施方式中，所述电探测器包括电荷传感器电极，该电极位于所述通道之内或其表面上。
在另一实施方式中，所述的电探测器包括多个纳米流体通道。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的个数是2-10、10-50、50-100、100-500、500-1000、或1000-5000个。
在另一实施方式中，每个所述的电荷传感器的一部分被集成在所述纳米流体通道中。
在另一实施方式中，所述电荷传感器的个数是2-10、10-50、50-100、或100-500个。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度与德拜屏蔽距离相近。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度小于德拜屏蔽距离。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度是德拜屏蔽距离的2-10倍。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度是0.1nm到1mm。
在另一实施方式中，所述德拜屏蔽距离是0.1nm到1000nm。
在另一实施方式中，所述德拜屏蔽距离是10nm。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的宽度是0.1nm到1nm、1nm到5nm、5nm到10nm、10nm到50nm、50nm到100nm、100nm到500nm、500nm到1μm、1μm到5μm、或5μm到10μm。
在另一实施方式中，所述纳米管是一种p型或n型纳米管。
在另一实施方式中，所述纳米线或纳米管包含一种半导体材料。
在另一实施方式中，所述纳米线或纳米管包含碳或硅。
在另一实施方式中，所述晶体管是场效应晶体管(FET)。
在另一实施方式中，所述场效应晶体管是一层薄膜，该薄膜位于所述纳米流体通道的表面上。
在另一实施方式中，所述电探测器包括流体连接到所述纳米流体通道的微流体或宏观流体结构。
在另一实施方式中，所述微流体或宏观流体结构是储液池或通道。
在另一实施方式中，所述微流体或宏观流体结构选自由以下构成的组：细胞分选区域、过滤区域、分离区域、核酸放大区域、反应区域和储存区域。
在另一实施方式中，一个目标分子(例如，在所述纳米流体通道中的溶液中或液体中)与所述电荷传感器接触。
在另一实施方式中，所述目标分子不与电荷传感器接触。
在另一实施方式中，所述目标分子被抑制或限制在靠近电荷传感器的感应范围。
在另一实施方式中，所述目标分子是无标记或未标记的。
在另一实施方式中，所述电荷传感器是可寻址的半导体电荷传感器，其起到电解液栅型场效应晶体管的作用。
在另一实施方式中，所述电荷传感器是非官能化的。
在另一实施方式中，所述电荷传感器是官能化的。
在另一实施方式中，所述电荷传感器是以选自由以下构成的组的分子官能化的：抗体(或其中一部分)和寡核苷酸。
在一个具体的实施方式中，所述电荷传感器以与miRNA结合的寡核苷酸探针官能化。
在另一实施方式中，所述的电探测器包括一个基片。
在另一实施方式中，所述基片是一种半导电的或绝缘的基片。
在另一实施方式中，所述基片包含锗或是锗基基片。
在另一实施方式中，所述基片包含硅(或硅的衍生物)或是硅基基片。
在另一实施方式中，所述硅基基片选自由以下构成的组：硅、硅石(二氧化硅)以及玻璃(例如，硼硅玻璃)。
在另一实施方式中，所述的二氧化硅基片是熔融的。
在另一实施方式中，所述基片是电绝缘的或至少包括一电绝缘表层。
在另一实施方式中，所述基片是透明的。
在另一实施方式中，所述透明基片的厚度适用于对纳米流体通道中的目标分子利用期望的显微镜物镜进行光学观测。
在另一实施方式中，所述电探测器的透明基片的厚度约170nm。
在另一实施方式中，除了电探测之外，还对所述纳米流体通道中的目标分子进行光学观察。
在另一实施方式中，通过施加一个恒定源漏偏置电压，并通过观察流过电荷传感器的电流，观察电荷传感器电导率的变化，该恒定源漏偏置电压由恒定源漏偏置电压发生器(例如，一个电压源和一个电表)产生。
在另一实施方式中，所述电探测器包括恒定源漏偏置电压发生器。
在另一实施方式中，所述偏置电压选自由以下构成的组：交流偏置电压、周期信号及非周期信号。
在另一实施方式中，所述电探测器包括源极和漏极电极对，其通过电触点与所述电荷传感器连接。
在另一实施方式中，所述电探测器包括一绝缘体来隔绝连接至所述电荷传感器的源极和漏极电极对的电触点。
在另一实施方式中，所述电触点是铂。
在另一实施方式中，所述绝缘体是氮化硅。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的尺寸把目标分子或粒子限制在电荷传感器感应范围内。
在另一实施方式中，所述电荷传感器位于所述通道内并与被限制的目标分子或微粒足够接近，以避免明显的电荷屏蔽。
在另一实施方式中，所述电荷传感器感应范围是所述电荷传感器直径加上两倍离子屏蔽距离。
在另一实施方式中，所述目标分子或微粒是带电的分子或微粒。
在另一实施方式中，所述带电分子或微粒是非缔合的或自由的。
在另一实施方式中，所述带电分子或微粒附于另一实体。
在另一实施方式中，所述带电分子或微粒是标记的或未标记的(无标记的)。
在另一实施方式中，所述目标分子或微粒是生物物类，例如病毒、核酸(例如，DNA、RNA、miRNA)、蛋白质、细胞、细胞碎片或细胞器、纤维微粒、金属微粒、或量子点。
在另一实施方式中，所述目标分子或粒子被探测、控制和操控。
还提供了一种探测目标生物或化学物类，或者与该物类相关联的标签的方法，包括：
提供所述电探测器；
使所述目标物类或者包括所述目标物类的实体流过所述电探测器的纳米流体通道；以及
使所述电荷感应器和所述目标物类或其标签接触，从而产生可探测到的指示所述目标生物或化学物类的存在的信号。
在另一实施方式中，所述物类在溶液中或所述实体是溶液。
在另一实施方式中，以电动力驱动所述物类是通过所述纳米流体通道。
在另一实施方式中，所述可探测到的信号是电荷传感器电导率的变化。
在另一实施方式中，所述方法包括监视所述电荷传感器的电导率。
在另一实施方式中，所述方法包括可视化在所述电荷传感器附近的所述物类。
在一个具体实施方式中，目标分子(或与目标分子相关的标签)与一种疾病或紊乱(例如，癌症)相关，而所述方法可用于诊断这种疾病或紊乱。
在另一实施方式中，所述方法用于快速测量核酸(例如，DNA)片段的长度和/或筛选核酸片段。
还提供了一种检测溶液局部电势的方法，包括：
提供所述电探测器；
使所述溶液流过所述电探测器的纳米流体通道；以及
使所述电荷传感器与所述溶液接触，从而产生可探测到的溶液局部电势信号。
在一个实施方式中，所述可测定的信号是电荷传感器电导率的变化。
在另一实施方式中，所述方法包括监视所述电荷传感器电导率。
还提供了一种测量单个目标带电分子或微粒的构象、长度、速度或光学可探测到的特征、标记或标签浓度的方法，包括：
提供：
以光学可探测到的标记(或特征、标签或修饰)标记的带电目标分子或微粒，
一纳米裂缝，
一纳米流体通道，以及
通过激光先后聚焦在纳米通道上形成的两个空间上分隔的焦点容积；
以电泳驱动所述带电分子或微粒通过所述纳米裂缝进入所述纳米流体通道；
输送所述被拉伸的带电分子或微粒通过所述两个空间上分隔的焦点容积，从而产生时间上相互错开的第一光学可探测到的信号和第二光学可探测到的信号；
测量所述第一和第二光学可探测到的信号中的光子爆发(或光子计数信号)；
测量所述第一和第二光学可探测到的信号中的光子爆发(或光子计数信号)；
利用对所述第一和第二光学可探测到信号中的光子爆发(或光子计数信号)的测量进行速度或互相关测量；以及
根据所述速度或互相关测量计算所述目标分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度。
在一个实施方式中，带电分子或微粒被限制于纳米通道中，并被动态地拉伸至超过其平衡长度。
在另一实施方式中，所述方法包括提供电探测器，其包括纳米裂缝和纳米流体通道。
在另一实施方式中，光学可探测到的标记是荧光标记。
在另一实施方式中，所述方法包括：
提供连接到第一光电二极管的第一光纤和连接到第二光电二极管的第二光纤；
将所述第一光学可探测到的信号中的图像投射到所述第一光纤；
将所述第二光学可探测到的信号中的图像投射到所述第二光纤；
用所述第一光电二极管探测所述第一光学可探测到的信号中的图象；
用所述第二光电二极管探测所述第二光学可探测到的信号中的图象；
确定沿纳米液流通道轴线的单位通道长度和时间发射的光子数；
确定每一光纤位置处的最终图像；及
通过测定到达每个光电二极管的光子数测量每一光学可探测到的信号。
在另一实施方式中，所述方法包括分析所述两个被测量的光学可探测到的信号的互相关函数。
在另一实施方式中，所述方法包括进行单分子爆发分析。
在另一实施方式中，所述带电目标分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度的计算包括进行对数分布的高斯拟合。
在另一实施方式中，所述电探测器是“芯片实验室”装置，用于隔离，限制和操控目标分子。
4.附图说明
以下结合附图对本发明进行描述，其中，相似的标号代表相似的元素。需要明确的是，在一些例子中，发明的不同特征可能被夸张、放大以助理解。
图1。电探测器的一个实施方式包括集成了电荷传感器的纳米流体通道。电荷传感器，如纳米线、纳米管、晶体管以及电容器，可被集成到纳米流体通道中。图1(左侧)是一个俯视图，所示灰色方块为源漏电极对。水平线表示通道侧壁。深黑线为电荷传感器，在此实施方式中是碳纳米管。图中弯弯曲曲的线代表一个在纳米通道中沿着通道轴线运动的DNA分子，并很快将位于所述纳米管上方。图1(右上图)是所述装置的侧视图。在这个特定的实施例中，纳米线电荷传感器位于通道的“地板”上。然而，该装置可以被倒过来，从而所述电荷传感器就位于所述通道的“天花板”了。溶液中漂浮的带电离子用正负号显示。图1(右下图)展示了，出于感应的目的，一个需要考虑的参数是纳米通道的总深度与离子屏蔽距离之间的关系，离子屏蔽距离即溶液中的带电分子被溶液中其他离子屏蔽的距离。
图2。把电荷传感器，比如纳米线，集成至纳米流体通道的工艺的概述。
图3。为示例性框图，展示了电探测器的俯视图和6.1部分所批露的实验步骤。
图4。电探测器的侧视图，其中，纳米通道中有一个示例性的伸长的DNA分子。两个单壁碳纳米管(所示圆形横切面)垂直于纳米流体通道的轴和图的平面。一个正在穿过纳米通道DNA分子从图像左侧往右侧移动。带负电荷的DNA分子(纳米通道中部的弯曲的实线)被一片带正电荷的离子包围。详见6.1部分。
图5A-B。A)一集成了纳米管电荷传感器的纳米流体通道的横截面图。B)一集成在电探测器里的p型纳米管的能带图。详见6.1部分。
图6A-B。展示碳纳米管的电解液栅扫描的设置和由此对能带结构产生的影响的框图。上面(黑色)能带图表示非门控的p型纳米管。下面(灰色)能带图描述了当栅电压相对源和漏电极更偏向正极时有一个朝耗尽的偏移(箭头所示)。A)无保护的纳米管源漏电极电触点。B)纳米管源漏电极电触点通过一些绝缘层与溶液电绝缘。详见6.1部分。
图7。同时进行光学和电学探测的实验设置。详见6.1部分。
图8A-B。A)在两个源漏电压下，源漏电极电流随电解质栅扫描的变化。B)在三个不同的栅电势下电流随源漏电压的变化。详见6.1部分。
图9。主图：在多个源漏偏置电压下，一个集成在电探测器纳米流体通道中的纳米管的电流随电解液栅电压变化。插图：在100mV源漏偏置电压下，电流和栅极电压之间关系的半对数线图。详见6.1部分。
图10。掩埋电极和暴露电极产生的漏电流的图。图示了两个独立的装置的栅和漏极之间的漏电流。如图所示，一组数据来自一个部分制备完成的电探测器，如图6A所示，其中源漏电极是暴露的并与电解液接触。另一组数据来自一个制造完成的电探测器，其中源漏电极被掩盖在氮化硅的下面，并与电解质溶液分开，如图5所示。详见6.1部分。
图11A-D。一个制造完成的电探测器(即接触电极被氮化物盖住)采用四组不同的源漏电极对时的电流和栅电势之间关系的线图示。详见6.1部分。
图12。左图：DNA分子在电探测器的纳米流体通道区域内或附近的示例性框图。在这个图中，两个分子同时在通道内。通过施加一个小电压(～1V)，可以缓慢地驱动这些分子向上或向下运动。右图：是两个DNA分子在一个带有碳纳米管电荷传感器的电探测器的纳米流体通道中的时间追踪图。第一个分子在时间t＝0秒时进入通道，第二个分子在t＝25秒时进入。当t＝29秒时，电场方向倒置，致使两个分子改变他们移动的方向。详见6.1部分。
图13。电探测器特定实施方式的框图。为了方便观察，每个图像中所有的特征构造不是完全按照互相之间的比例来画的。一些尺寸用箭头和标记来指出。左上图：一个完整的流体网络视图。大圆圈代表六个宏观的储液池用于流体和DNA上样。粗黑线代表流体通道用于从储液池向装置内输送DNA。右上图：3个微通道分支与更大的上样通道连接的区域特写图。这相当于A中的大长方形。左下图：微通道分支中部的特写图。这相应于A中的小长方形。如图所示，每个微通道分支中存在两个探测区域。右下图：探测区域的特写图。两个铂电极(一个源极和一个漏极)分开有1μm的空隙。详见6.2部分。
图14。6.2部分描述的制备过程的几个被选步骤。每一个横截面视图都标记了它相对应的步骤号和名称。详见6.2部分。
图15。说明选择性在除去牺牲层中的重要性的示意图。左列)通道深度仅仅由牺牲层厚度决定。右列)通道深度由牺牲层厚度加上蚀刻掉的覆盖材料的厚度确定。详见6.2部分。
图16。基于a-Si/氮化物的通道被用TMAH蚀刻部分除去a-Si之后的图像。穿露孔是深色的长方形。浅灰区域是a-Si牺牲层尚未被蚀刻掉的地方。详见6.2部分。
图17。基于Cr/氮化物的通道被用Cr-14铬蚀刻剂部分除去Cr之后的图像。A-C)微通道区域蚀刻之前、25分钟之后以及3小时之后的图像。D-F)纳米通道区域蚀刻之前、25分钟之后以及3小时之后的特写图。详见6.2部分。
图18。通道顶壁结构的变形。A)应力对变形的影响。B)在均匀的负载下，氮化物厚度和通道跨度宽度对于变形的影响。详见6.2部分。
图19A-C。说明薄膜应力、厚度和通道宽度对通道完整性的影响。A)一条40微米宽的没有支撑柱的通道。左手边的显微照片是一个光学图像，其中，强度的变化由腔的高度的变化造成。右手边的图像是同一通道的SEM显微图像。左图上的黑线代表轮廓测定法扫描的位置。B)在壁和支撑柱之间具有不同空间的通道的单个图像。C)所展示的三条通道说明了氮化物厚度对坍塌可能性的影响。详见6.2部分。
图20A-D。和Autostep掩模对准器一起使用的各种微(μ)DFAS标记图案。A)“实心长方形”的CAD图的截图。微DFAS标记为正型。B)“分段线”的CAD图的截图，微DFAS标记为正型。C)“实心长方形”的CAD图的截图，微DFAS标记为负型。D)微DFAS标记蚀刻到熔融二氧化硅晶片中的明视场图像。详见6.2部分。
图21A-D。A)μDFAS标记图案1蚀刻到熔融二氧化硅中的暗视场图像。B)μDFAS标记图案1在SPR9550.9光阻剂下的暗视场图像。C)μDFAS标记图案2蚀刻到熔融二氧化硅中的暗视场图像。D)μDFAS标记图案2在SPR9950.9光阻剂下的暗视场图像。详见6.2部分。
图22A-I。针对两种不同厚度的LOR的光阻剂和掀离光阻(LOR)的剖面图。左列图展示厚度为100nm的LOR在各阶段的剖面图。A)以100nm厚的LOR和900nm厚的光阻剂制备获得熔融二氧化硅晶圆。B)曝光之后，晶圆放入300MIF显影剂。最初，光阻剂被曝光的图案溶解了。C)在显影过程中，LOR被各向同性地蚀刻，其速度比曝光的光阻剂慢，但是比未曝光的光阻剂快。D)用电子束蒸镀沉积一薄层金属。E)以500nm厚的LOR和900nm厚的光阻剂制备获得熔融二氧化硅晶圆。F-I)光阻剂被显影并且LOR被等向性蚀刻。详见6.2部分。
图23。一个包括纳米线的电探测器的示意图。详见6.4部分。
图24。(左图)是一个100毫米直径的熔融二氧化硅晶圆的照片，其包含27个装置，每一装置由16个用于单分子分析的流体通道的并行阵列构成。(中图)具有纳米通道阵列电探测器的示意图。(右图)纳米通道阵列(c)的自上而下扫描的电子显微照片，以及单一纳米通道(d)的放大的图像。详见6.4部分。
图25。电探测器上的微流体网络的一个实施方式的示意图。详见6.4部分。
图26。用于细胞操纵、裂解、逆转录和cDNA毛细管电泳的PDMS微流体通道示意图。详见6.4部分。
图27A-B。实验示意图。(A)荧光标记DNA分子被电泳驱动通过一个纳米裂缝进入一个纳米流体通道(DNA1)从而被动态拉长。以两束先后聚焦的激光探测该纳米通道。被驱动通过形成的焦点容积的DNA分子产生两个在时间上错开的相似荧光信号(DNA2)。这些信号可以用来确定单分子样本的统计数据，比如速度、长度、折叠信息和荧光强度，并且在此处所展示的工作中用来说明DNA在纳米流体通道中移动的一些物理学特性。(B)在50V的装置偏压下，由所述两个焦点容积产生的两个光子计数信号p以及窗口时间(bin time)为100μs的对时间的拟合。该拟合产生DNA表观长度lA＝9.10±0.05μm、速度vS＝1315±3μm/s以及折叠长度和表观长度之比lL/lA＝22.3±.4％。详见6.5部分。
图28A-D。光学设置以及装置。(A)两束激光被导向显微镜物镜的后面，并聚焦在沿单个纳米通道长度的不同位置。这两组荧光信号被收集、分开并聚焦在与雪崩光电二极管(APDs)耦合的光纤上。(B)铬蚀刻掩模的光学显微照片展示了纳米通道装置的结构。白色箭头标记阵列中8个纳米通道之一的入口。掩模由用光学光刻技术为纳米裂缝制作的粗糙层和用电子束光刻技术为纳米通道制作的精细层所构成。电子束层被设计成降低写时间和接近曝光效应(proximity exposure effects)。(C)展示纳米裂缝和纳米通道之间的界面的显微照片。蚀刻深度为100nm，纳米通道宽90nm。(D)展示纳米通道入口的电子显微照片。装置底部10-20nm的粗糙度是由蚀刻工艺造成的。详见6.5部分。
图29A-B。单分子分析。(A)具有最多三个折叠的七个理论分子构象被用与描述纳米通道中电动力伸展的DNA分子。从这些构象开发出六个被命名为α-ζ的分析模型，用于拟合测量到的荧光爆发，其中ε模型涵盖两种形状。(B)展示了来自第一焦点容积(信号1)的荧光爆发及其拟合。以折叠模型和其下所画的构象解释荧光爆发(拟合显示为红色)。爆发8展示了分子中部的一个罕见的折叠、节或者重叠片段，其被β模型拟合。最常观察到的爆发形状是形状2、4以及5，其它都很罕见。详见6.5部分。
图30A-F。λ噬菌体DNA。在一个一分钟的试验中，416个来自λ噬菌体DNA样本的分子被分析。在装置偏置电压U＝50V，平均的分子速度是
Figure BPA00001329213200151
(A)表观长度lA的分布。(B)真实长度lR的分布。(C)示意性的定义具有单环的分子的表观长度lA、真实长度lR、自由长度lF以及折叠(成环)长度lL。(D)单位分子光子计数(cnts)与表观长度lA的关系。(E)单位分子光子计数(cnts)与真实长度lR的关系。通过原点的线性拟合的斜率为4,430±20cnts/μm。(F)每个分子的光子计数的分布。(D)和(E)之间的比较说明折叠解释了在不同表观长度上具有相同光子计数的分子的分布。通过高斯拟合光子计数(F)和真实长度分布(C)得到完整的λ噬菌体DNA分子的平均光子计数为48,000±2,000以及平均真实长度为10.7±0.3μm。在平均光子计数和平均真实长度的两个标准偏差之间的所有分子被认为是完整的λ噬菌体DNA分子(水平和垂直箭头所示的区域)。这占被分析分子的52％，其余分子则是λ噬菌体DNA分子的片段或多联体。(E插图)完整分子自由长度与真实长度的比值lF/lR分布。79％的完整分子的lF/lR＞0.5。详见6.5部分。
图31A-B。速度和折叠。(A)展示了752个λ噬菌体DNA分子的相对于表观长度/真实长度比值lA/lR的速度vS的分布。展示了在装置偏置电压U＝50V下，后续三轮一分钟的实验(包括图30A-F中的实验)中的完整的λ噬菌体DNA分子。具有增加的折叠和较小lA/lR的DNA分子具有稍高的速度vS。(B)以上所展示的分子的归一化的速度分布vS与折叠数量之间的关系。折叠数量是由所选的用于分析每一分子的分析模型所确定的(见图29B)，并且其是通道中的平行链数量的度量。在分子构象中有三个折叠的DNA分子具有较高的速度vS。详见6.5部分。
图32A-B。速度、长度和装置偏压。展示了λ噬菌体样本的DNA分子的速度和长度与装置偏压的关系。对于每一偏压进行五轮连续的实验，并且分析了互相关函数以及单分子光子爆发。(A)展示了平均单分子速度
Figure BPA00001329213200161
和平均互相关速度
Figure BPA00001329213200162
与装置偏压U之间的关系。的线性拟合产生斜率mS＝60.9±1.4μm/(Vs)，而
Figure BPA00001329213200164
的线性拟合产生斜率mC＝61.0±0.7μm/(Vs)。线图互相重叠。(B)展示了真实长度lR的分布与装置偏压的关系。该长度分布的最大值显示为黑色，并且对应大多数完整的λ噬菌体DNA分子，随着装置偏压U的提高，在真实长度lR中该最大值随之提高。这一行为不像互相关曲线产生的平均长度
Figure BPA00001329213200165
(黑点)那么明显，可能是由于分析忽略了折叠和分裂。不同装置偏压U下的分子数为：1V下为263，2V下为381，5V下为226，10V下为144，20V下为270，50V下为417，75V下为1217，以及100V下为868。详见6.5部分。
图33A-F。长度、速度以及尺寸。对包含λ噬菌体DNA及其HindIII酶切的混合物的样本的分析。在两分钟内探测到15,144个分子，平均速度为
Figure BPA00001329213200166
(A)真实长度lR的分布。峰值被拟合至9个经修改的高斯函数(红色)。(B)真实长度lR与碱基对数量的关系。(C)单位分子光子计数cnts与碱基对数量的关系。(D)单位分子光子计数cnts对真实长度lR的分布。(E)每分子光子计数的分布。(F)色彩编码的分子数量对分子速度vS和真实长度lR的强度直方图(此处展示为灰阶图)。详见6.5部分。
图34。计算获得的方程式7中的分子探测效率(MDE)函数p(x)(灰)和方程式S-2中的其经修改的S型函数W(x)(黑)之间的比较。两条曲线都是在以下假设下计算获得的：光纤直径为50μm，物镜放大倍数为40倍，爱里斑高斯半径为σ＝140nm，归一化振幅为p0＝1cnts/s。虽然W(x)并不产生p(x)的曲线部分，但与其在两侧的斜率和平台期是一致的。详见6.5部分。
5.具体实施方式
提供了一种电探测器，其包括纳米流体通道和集成在该纳米流体通道中的电荷传感器。其中，电荷传感器可以是纳米线、纳米管、晶体管或电容器。还提供了用电荷传感器探测在纳米流体通道中的带电物类，比如生物或化学物类，的方法。还提供了光学探测位于纳米流体通道内的带电、带标记或带标签的物类的方法。还提供了制作电探测器的方法。在一个实施方式中，制作方法包括纳米制造工艺和微米制造工艺的结合。在另一实施方式中，电探测器是一个“芯片实验室”装置，可以用来隔离、限制或操控物类，比如目标分子或微粒。
下文披露的将纳米级电荷感应器集成到纳米流体通道(“纳米通道”)中是在装置性能方面的重要进步。它也能使我们生产出更加紧凑、便携和便宜的产品。
发明详述被分成如下的多个部分，只是为了清楚披露，而非为了限制。
5.1电探测器
提供了一种包括纳米流体通道和电荷传感器的电探测器，其中：
所述电荷传感器选自由以下构成的组：纳米线，纳米管，晶体管和电容器，以及
所述电荷传感器的一部分被集成在所述纳米流体通道中，从而使所述电荷传感器接触到所述纳米流体通道中的液体。
在一个实施方式中，所述电荷传感器的部分位于所述纳米流体通道的内部或表面上。
在另一实施方式中，所述整个电荷传感器位于所述通道的内部或表面上。
在另一实施方式中，所述电探测器包括电荷传感器电极，所述电极位于所述通道的内部或表面上。
在另一实施方式中，所述电探测器包括多个纳米流体通道。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的个数是2-10、10-50、50-100、100-500、500-1000、或1000-5000个。
在另一实施方式中，所述多个电荷传感器的每一个的部分都被集成在纳米流体通道中。
在另一实施方式中，所述电荷传感器的个数是2-10、10-50、50-100、或100-500个。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度与德拜屏蔽距离相近。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度小于德拜屏蔽距离。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度是德拜屏蔽距离的2-10倍。
另一实施方式中，所述纳米流体通道的深度是0.1nm到1mm。
在另一实施方式中，所述德拜屏蔽距离是0.1nm到1000nm。
在另一实施方式中，所述德拜屏蔽距离是10nm。
在另一实施方式中，所述纳米流体通道的宽度是0.1nm-1nm、1nm-5nm、5nm-10nm、10nm-50nm、50nm-100nm、100nm-500nm、500nm-1μm、1μm-5μm或5μm-10μm。
具有纳米流体通道和纳米级电荷传感器的电探测器可用于隔离、限制或操纵目标物类，例如分子或微粒，从而使这些物类能够被探测、测量、表征或评估。
在一个实施方式中，电荷传感器(例如，纳米管或纳米线)包括半导体材料。
所述电荷传感器可以包括碳、硅、硅和碳或任何业界已知的其他类型的场效应晶体管。
在另一实施方式中，晶体管是场效应晶体管(FET)。
在另一实施方式中，场效应晶体管是一层薄膜，该薄膜位于纳米流体通道的表面上。
在一个具体实施方式中，纳米管是p型或n型纳米管。
图1展示了集成了电荷传感器的纳米流体通道的一个实施例。图1(左图)是一个俯视图，所示灰色方块为源漏电极对。水平线为通道侧壁。深黑线为碳纳米管，但是任何能以此种方式连接源极和漏极的纳米管或纳米线(例如，碳、硅、碳和硅)都适用。弯曲的线代表一个在通道轴线方向上沿着纳米流体通道运动的DNA分子，并很快将位于纳米管上方。任何带电分子(例如，核酸(例如，DNA，RNA，miRNA)、蛋白质、病毒微粒、细胞、细胞成分、细胞碎片)都能够被这个电探测器感应。
图1(右上图)是集成了纳米线的纳米流体通道的侧视图。在这一特定的实施方式中，纳米线位于通道底部。在其它实施方式中，它可以位于通道顶部或者悬浮在通道中间(在z平面内)。溶液中漂浮的带电离子用正负号表示。
图1(右下图)展示了出于感应的目的，有一个参数需要考虑，那就是纳米通道的总深度与离子屏蔽距离的关系，离子屏蔽距离即溶液中的带电分子被溶液中其他离子屏蔽的距离。在一个具体的实施方式中，纳米通道总深度和离子屏蔽距离之间的关系为大约相等或为同一数量级。在一个实施例中，纳米流体通道充满了液体，从而使目标分子能流过通道。如果通道的深度被设计成大约等于或小于离子屏蔽距离，所有流经通道的目标分子将能够足够接近纳米线传感器以影响其导电性，从而被探测到。
在某些情况下不推荐采用这种方式，比如从含有多种化学物类的溶液中分离一种化学物类，所有的带电分子都接近纳米管并可引发探测反应，不论其具有什么样的化学结构。然而，在某些情况下则推荐采用这种方式。一个比较有利的情形是探测单个DNA分子。在一个实施方式中，如6.1部分所述，单个DNA分子被检测到。
在一些实施方式中，包括纳米流体通道和集成在纳米流体通道内的电荷传感器的电探测器可被作为“芯片实验室”装置使用。
在一个实施方式中，电探测器有一个包含在纳米级流体通道(纳米流体通道)内部，或集成于其上的电荷传感器，如图1所示。电探测器使用方式为，用溶液填充纳米通道，当调整溶液电势或者当目标分子流过电荷传感器的附近，监测流过电荷传感器(如纳米线或纳米管)的电流。
任何目标分子物类都可以用电探测器探测。在一个实施方式中，溶液中包含待探测的目标生物或化学物类。
在另一实施方式中，电探测器包括流体连接到纳米流体通道的微流体或宏观流体结构。
在另一实施方式中，微流体或宏观流体结构是储液池或通道。
在另一实施方式中，微流体或宏观流体结构选自由以下组成的组：细胞分选区域、过滤区域、分离区域、核酸放大区域、反应区域和储存区域。
在另一实施方式中，目标分子与电荷传感器接触。
在另一实施方式中，目标分子不与电荷传感器接触。
在另一实施方式中，目标分子或粒子位于电荷传感器附近。
在另一实施方式中，目标分子或粒子是无标记或未标记的。
在另一实施方式中，电荷传感器是可寻址的半导体电荷传感器，其起到电解质栅型场效应晶体管的作用。
在另一实施方式中，电荷传感器是非官能化的。
在另一实施方式中，电荷传感器是官能化的。
在另一实施方式中，电荷传感器是以选自由以下构成的组的分子官能化的：抗体(或其中一部分)以及寡核苷酸。
在另一实施方式中，电探测器包括一个基片。
在另一实施方式中，基片是半导体或绝缘体基片。
在另一实施方式中，基片是锗基片或含有锗。
在另一实施方式中，基片是硅基片，硅基基片，含有硅(或硅的衍生物)。
在另一实施方式中，硅基基片选自由硅、硅石(二氧化硅)和玻璃(例如，硼硅玻璃)构成的组。
在另一实施方式中，二氧化硅基片是熔融的。
在另一实施方式中，基片是电绝缘的或至少包括一层电绝缘表层。
在另一实施方式中，基片是透明的。
在另一实施方式中，透明基片的厚度适于对纳米流体通道中的目标分子或粒子利用显微镜物镜进行光学观测。
在另一实施方式中，电探测器的透明基片的厚度约170nm。
在另一实施方式中，除了电探测之外，还对纳米流体通道中的目标分子进行光学观察。
在另一实施方式中，电探测器包括恒定源漏偏置电压发生器(比如，电压源和电表)，其中，利用恒定源漏偏置电压发生器产生恒定源偏置电压，并监测流过电荷传感器的电流，以观察电荷传感器电导率的变化。
在另一实施方式中，偏置电压选自由以下构成的组：交流偏置电压、周期信号及非周期信号。
在另一实施方式中，电探测器包括通过电接点与电荷传感器电连接的源极和漏极电极对。
在另一实施方式中，电探测器包括绝缘体来隔绝连接至电荷传感器的源极和漏极电极对的电触点。
在另一实施方式中，电触点是铂。
在另一实施方式中，绝缘体是氮化硅。
在另一实施方式中，纳米流体通道的尺寸把目标分子或微粒限制在电荷传感器的感应范围内。
在另一实施方式中，电荷传感器位于通道内并与被限制的目标分子或微粒足够接近以避免明显的电荷屏蔽。
在另一实施方式中，感应范围是电荷传感器直径加上两倍离子屏蔽距离。
在另一实施方式中，目标分子或微粒是带电的分子或微粒。
在另一实施方式中，目标分子或微粒是非缔合的或自由的。
在另一实施方式中，目标分子或微粒附于另一实体。
在另一实施方式中，目标分子或微粒是标记的或未标记的(无标记的)。
在另一实施方式中，目标分子或微粒是生物物类，比如：病毒、核酸(例如，DNA，RNA，miRNA)、蛋白质、细胞、细胞碎片或细胞器、纤维微粒、金属微粒、或量子点。
在另一实施方式中，目标分子或粒子可被检测、控制和操作。
5.2制作电探测器的方法
提供了用于制造电探测器的方法，其包括使用业界已知的标准光刻工艺、微电子机械加工技术以及碳纳米管生长技术。
电探测器可使用纳米/微米制造工艺制造。这些工艺包括但不限于光刻、反应离子蚀刻、湿法化学蚀刻、化学气相薄膜沉积、蒸发薄膜沉积以及化学气相生长纳米线。
在一个实施方式中，电探测器是利用业界已知的微米制造工艺的组合制造的。下文提供了该过程的概述以及三个具体实施例在。第6.2-6.4部分进一步给出了生产电探测器的方法的其他实施例。
初始基片可以是能够经受所有处理步骤的空白熔融二氧化硅晶片、空白硅晶片或业界已知的其他扁平的、适用的基片。例如，电绝缘基片或具有非导电表面的基片都可以使用。在基片上构建以下层以创建纳米通道-纳米线装置：
对准标记层
金属触点层
纳米线催化层
牺牲材料层
一个(或多个)绝缘层
各种穿露孔(或通道)层
在此，“层”被定义为指进行了以下一个或多个动作：基于光刻的图案化，湿法或干法蚀刻，金属蒸镀，和/或化学气相沉积。
在一个实施例中(“版本1制造工艺”)，制作过程如下：
利用光刻技术在晶片上界定定位标记，并使用湿法或干法蚀刻技术将标记转到晶片上。
利用光刻技术在晶片上界定金属源漏电极图案，并沉积金属。
利用光刻技术界定催化剂颗粒板图案，并沉积催化剂颗粒。
采用化学气相成长法在芯片上长纳米线
利用光刻技术界定纳米通道牺牲材料的图案，并沉积牺牲材料。
沉积绝缘薄膜材料(其将成为通道的顶壁)。
利用光刻技术在晶片上界定蚀刻孔，并使用湿法或干法蚀刻技术将蚀刻孔标记转到绝缘薄膜上。
利用湿法或干法蚀刻技术移除牺牲材料。
使用绝缘薄膜沉积工艺封闭蚀刻孔。
在另一个实施例中(“版本2制作工艺”)，其制作过程如下：
利用光刻技术在晶片上界定定位标记，并使用湿法或干法蚀刻技术将标记转到晶片上。
利用光刻技术在晶片上界定金属源漏电极的图案，并沉积金属。
利用光刻技术界定催化剂颗粒板，并沉积催化剂颗粒。
通过化学气相成长法在芯片上长纳米线。
在芯片上沉积一层起保护作用的超薄绝缘层。这可以降低在制备过程中纳米线产生短路的可能性。
利用光刻技术界定纳米通道牺牲材料的图案，并沉积牺牲材料。
沉积绝缘材料薄膜(其将成为通道的顶壁)。
利用光刻技术在晶片上界定蚀刻孔，并使用湿法或干法蚀刻技术将蚀刻孔标记转到绝缘薄膜上。
利用湿法或干法蚀刻技术移除牺牲材料。
利用湿法或干法蚀刻技术蚀刻超薄膜起保护作用的绝缘层，从而使纳米线暴露在通道中。
使用绝缘薄膜沉积工艺封闭蚀刻孔。
在另一个实施例中(“版本3制作工艺”)，其制作过程如下：
利用光刻技术在晶片上界定定位标记，并使用湿法或干法蚀刻技术将标记转到晶片上。
利用光刻技术为纳米通道牺牲材料界定图案，并沉积牺牲材料。
在芯片上沉积一层起保护作用的超薄绝缘层。这可以降低在随后的高温步骤中(比如纳米线生长)牺牲材料与工艺气体反应的可能性。
利用光刻技术在晶片上界定金属源漏电极的图案，并且沉积金属。
利用光刻技术界定催化剂颗粒板的图案，并沉积催化剂颗粒。
利用化学气相成长法在芯片上长纳米线。
沉积绝缘薄膜材料(其将成为通道的顶壁)。
利用光刻技术在晶片上界定蚀刻孔，并使用湿法或干法蚀刻技术将蚀刻孔标记转到绝缘薄膜上。
利用湿法或干法蚀刻技术去除牺牲材料。
利用湿法或干法蚀刻技术蚀刻超薄膜起保护作用的绝缘层，从而使纳米线暴露在通道中。
使用绝缘薄膜沉积工艺封闭蚀刻孔。
图2概述了制作电探测器的方法，其中电荷传感器，如纳米线，可以集成到纳米流体通道中。图2展示了为实现纳米线集成的牺牲层的加工工艺。图2左侧展示了纳米线可以被集成到纳米流体通道的工艺。图2右侧展示了双重牺牲层的加工过程，在制造过程中纳米线得到了氮化硅薄膜的保护。双层牺牲层只在某些情况下才需要，其可以由普通技术人员视情况而定。
在某些实施方式中，电探测器可以展示出比光学衍射极限要好2到3个数量级的空间分辨率。鉴于对于业界已知的光学探测方法，“光学探针”是指溶液中被照亮的区域，在纳米通道—纳米线的例子中，分辨率是由电探针的直径决定的。该直径被定义为纳米线直径加两倍离子屏蔽距离。利用通过一般生长获得的纳米管和纳米线以及合理高离子强度的溶液，以在此披露的方法和业界已知的方法可以获得大约1nm的电探针。
由于微电子技术已经高度发展，而且由于本探测方法是纯电学的，所有需要的用于控制电探测器，转导和放大信号，甚至分析信号的元器件都可以被小型化，这与先有光传递，再有电传导(比如在标准荧光显微镜的情况下)的情况截然相反。除了可以使便携芯片实验室真正成为可能，利用微制造方法本身的规模经济可以大幅降低电探测器的制造成本。
5.3使用电探测器的方法
电探测器可以用来探测目标分子或物类，如带电分子和生物或化学物类。在一个实施方式中，提供了一种检测目标生物或化学物类或与其相关的标签的方法，其包括：
提供电探测器；
使包含目标物类或与目标物类相关的标签的实体流过电探测器的纳米流体通道(例如，溶液中的目标分子)；
使目标物类或标签与电荷传感器接触，从而产生可探测的指示目标生物或化学物类存在的信号。
根据本方法，电探测器可被用作生物分析和化学分析领域内的分析工具。它也可作为纳米流体科学领域内的研究工具。电探测器可用于分析几乎任何带电分子或物类，例如，生物或化学物类，包括但不限于：病毒、核酸(如DNA，RNA，miRNA)、蛋白质、细胞、细胞碎片、细胞细胞器、纤维微粒、金属微粒或量子点。
还提供了一种探测局部溶液电势的方法，其包括：
提供电探测器；
使溶液流过纳米流体通道；以及
使电荷感应器与溶液接触，从而产生可探测到的局部溶液电势的信号。
根据这种方法，电探测器可用于精确测量纳米流体通道内的局部溶液的电势。电探测器可用于探测单个分子(如DNA)。此用途具有获得DNA片段长度信息的应用。这样的信息是被寻求的，其可以通过在进行各种商业上相关的生物测试时使用电探测器而获得。
电探测器还可以在广泛的生物和化学测试进行应用(例如，临床诊断、药物开发、病原体检测、基础生命科学研究)。如以上所披露，电检测器可用于测量核酸(或核酸片段)的长度。实际上许多涉及探测溶液中带电大分子的测试也可以受益于利用电探测器在受限环境中的直接电感应。电探测器也可作为纳米流体装置中的一般传感元件，测定微米通道或纳米通道的局部溶液电势，例如，在为研究通道中离子分布和流体运动。
提供了一种测量目标分子或粒子的构象、长度、速度、光学可探测到的特征、标记或标签强度的方法，其包括：
提供：
具有光学可探测的特征、标记或标签的目标分子或粒子(比如，带电分子或微粒)，
一纳米裂缝，
一纳米流体通道，以及
由先后聚焦在纳米通道上的激光形成的两个空间上分隔的焦点容积；
通过电泳驱动带电分子或微粒通过纳米裂缝进入纳米流体通道，从而将带电的分子或微粒限制在纳米通道中，并使带电分子或微粒动态伸长超过其平衡长度；
输送带电分子或微粒通过两个空间上分隔的焦点容积，从而产生时间上相互错开的第一光学可探测信号和第二光学可探测信号；
测量第一和第二光学可探测信号的光子爆发(或光子计数信号)；
测量第一和第二光学可探测信号的光子爆发(或光子计数信号)；
利用对第一和第二光学可探测的信号中的光子爆发(或光子计数信号)的测量进行速度或互关联测量；
根据速度或互相关测量计算带电分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度。
在某些实施方式中，带电目标分子或粒子是核酸，如DNA或RNA，或其片段或衍生物。在一个具体实施方式中，核酸(或其片段)是荧光标记的。
在一个具体实施方式中，目标分子(或与目标分子相关的标签)与一种疾病或紊乱(如癌症)相关，并且该方法被用于诊断该疾病或紊乱。
在其它实施方式中，核酸可与核酸探针杂交，或公价连接到探针或标签上，或利用本领域的公知技术进行局部修饰(如甲基化)。这样的修饰可能会改变核酸电荷，因而可以被电探测器检出，从而无需结合的探针或标签。
6.5部分(例5)公开了本方法的几种优选的实施方式。
在另一实施例中，该方法包括提供电探测器，其中电探测器包括(和提供)纳米裂缝和纳米流体通道。根据这一实施例，如果需要的话，无论是光学检测和电(电荷)检测都可以在电探测器内实现。
在另一实施例中，光学探测标记是荧光标记。
在另一实施例中，该方法包括：
提供连接到第一光电二极管的第一光纤和连接到第二光电二极管上的第二光纤；
将第一光学可探测信号中的图像投射到第一光纤；
将第二光学可探测信号中的图像投射到第二光纤；
用第一光电二极管探测第一光学可探测信号中的图象；
用第二光电二极管探测第二光学可探测信号中的图象；
确定沿纳米液流体通道轴线的，单位通道长度和时间的，发射的光子数；
确定每一光纤位置处的最终图像；及
通过测定到达每个光电二极管的光子数测量每一光学可探测到的信号。
在另一实施例中，该方法包括分析两个测得的光学可探测信号的互相关函数。在另一实施例中，该方法包括进行单分子爆发分析。在另一个实施例中，计算带电目标分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度包括进行对数分布的高斯拟合。例子6.5给出了这些分析和计算的示例性方法。
5.4探测DNA和其他核酸的方法
DNA分子是一种弹性很好的线性聚合物，可以利用业界已知的多种方法进行拉伸，包括在纳米流体通道中由空间局限导致的伸长。而且，沿DNA分子骨架结构的电荷是大致均衡的，因此，如果利用电荷灵敏探测器探测一个限制在纳米通道中的拉长的DNA链，探测器的输出结果是一个高度大致恒定的脉冲序列，其持续时间由DNA链的长度和速度决定。
如果通过DNA分子的速度是已知的或可以测量的，那么可以根据脉冲列持续的时间就来确定其长度。当以这种模式使用，包括纳米流体通道和电荷传感器的电探测器可以为多种不同的生物分析(例如，酶切后分析、miRNA的分析、癌症检查)提供DNA片段长度的快速测量。
在一个具体实施例中，电探测器被用于无标记电子分析单细胞中miRNA的表达。
在另一个实施例中，所有业界已知的核酸处理步骤(例如，放大、过滤或可选的标记或标签)与电探测器一起集成在芯片上。
业界已知的观察、测量和表征核酸，如DNA或RNA的其他方法可以与电探测器一起使用，从而迅速并准确地确认或扩充电探测器测量限制在电探测器的纳米流体通道中的单一核酸分子的构象、长度、速度以及荧光强度的能力。这些附加的数据还可以用于，例如，支持通过电长度测量和探针位置测量而得出的结论。虽然这些信息可以与电探测结合，但是不会产生与电探测器相同的空间分辨率。
例如，如果基片或电探测器的纳米流体通道的底壁或顶壁是透明的，荧光检测可与电探测同时使用。光学探测所提供的长度测量是快速确认利用电探测的长度测量的有效的和便捷的方法。虽然光学测量不太可能达到电测量的高分辨率，但附加数据会可以与电测量数据相关联，并会提高从电测量数据中得出结论的可靠性。用光学探测也许不是在每种情况下都理想的。例如，如果便携性是重要的，笨重的光学系统就不合适了。
在一个具体实施例中，如6.5部分所述，以电泳把带电分子驱动通过纳米裂缝进入纳米通道，以限制并被动态延伸超出其平衡长度，从而可进行反复的激光诱导荧光光谱探测。单分子分析算法可以用来模拟荧光爆发，并确定每个伸展的分子的折叠构象。
6.例子
6.1例1：集成了碳纳米管电荷传感器的纳米流体通道
6.1.1简介
本例子说明包括纳米流体通道和集成在纳米流体通道中的碳纳米管传感器的电探测器可被用于电探测高度局限的环境中的带电分子，并可同时进行荧光观测。随后的例子(6.2-6.4部分)描述了制造电探测器的方法，其中，电探测器包括纳米流体通道和集成在纳米流体通道中的电荷传感器，其中，电荷传感器是纳米线或纳米管。
可单独寻址的、半导体的、单壁碳纳米管整合在充满溶液的深度为15-100纳米、宽度为500纳米的通道中。在适当的缓冲条件下，这种尺寸的通道的深度与离子屏蔽距离相近。因此，通过纳米通道的带电DNA分子会门控半导体纳米管，在恒定源漏偏压下引起电流的变化。采用如此尺寸的充满液体的通道的电探测器还有一个作用，就是它可以使基因组长度的DNA分子在空间局限诱导下被部分拉长。
本例子描述了一种电探测器，其中，一单壁碳纳米管(SWCNT)被集成在一纳米级流体(纳米流体)通道中。图3展示了电探测器的几何构造和实验步骤。与源漏电极接触的SWCNT传感器被如此集成在纳米流体通道内，从而使纳米管只有中间部分位于通道中，即在通道内部，并与目标电解质溶液接触。
该纳米流体通道还能用于拉长并限制DNA分子，从而使DNA分子通过通道时，被强制从距离纳米管传感器很近的地方通过。该纳米管可以场效应晶体管(FET)模式来探测由DNA通过引起的对溶液电势的干扰。纳米管电导率的变化可以通过施加恒定漏偏电压并监控通过纳米管的电流来观察。
图3是从上往下观察电探测器的示意图，它还展示了本实施例披露的方法。该电探测器包括集成在纳米流体通道中的单壁碳纳米管，从而当DNA分子通过通道时，通过纳米管的电流可被监控。在制造过程中，采用了化学气相沉积法在金属催化板上长纳米管。
如图3所示，纳米管的生长具有长度和方向上的分布，在一些情况下，纳米管如此着陆从而把源漏电极连接起来。微流体和纳米流体通道的组合使用可以引导单个DNA分子向连接的纳米管运动。
在一个实施例中，分子可被缓慢地驱动通过纳米流体通道。当它的位置与电连接的半导体纳米管重叠时，纳米管的电导率会由于门控场效应而改变。
与其他纳米管或纳米线生物感应实验不同的是，该方法采用纳米管探测器来感应未结合的生物分子，这与现有技术报道的化学官能化的纳米管的门控不同(Katz，E.and I.Willner，Biomolecule-functionalized carbon nanotubes：Applications innanobioelectronics.Chemphyschem，2004.5(8)：p.1085-1104)。
文献还记载了集成在微米级PDMS通道中的碳纳米管可用于探测由电极界面氧化还原反应引起的局部电势的变化(Larrimore，L.，et al.，Probing electrostaticpotentials in solution with carbon nanotube transistors.Nano Letters，2006.6(7)：p.1329-1333)，或由压力驱动的通过通道的电解质流产生的流动电势引起的局部电势的变化(Bourlon，B.，et al.，A nanoscale probe for fluidic and ionic transport.NatureNanotechnology，2007.2(2)：p.104-107)。在本实施例中描述的实施方案中，只有溶液电势的改变是门控纳米管的原因。
6.1.2理论
生理溶液中的双链DNA是一种带很多电荷的大分子，其表面电势大约在-100毫伏数量级上(Wagner，K.，et al.，Analytical Debye-Huckel model for electrostaticpotentials around dissolved DNA.Biophysical Journal，1997.73(1)：p.21-30)。在一离子溶液中，流动电荷载流子的重排能够屏蔽特征长度外的DNA的大表面电势，该特征长度被称为德拜屏蔽距离。可能是基于这个原因，以往用纳米管或纳米线探测DNA分子的方法都只关注DNA分子结合至探测器表面的情况。
在本实施例中，设计并制造了一电探测器，其中，被驱动通过纳米流体通道的DNA分子被迫从足够靠近纳米线探测器的地方通过，从而探测器所在处的溶液电势被干扰(图4)。
图4展示了一个电探测器的侧视图，其中，通道中有一个拉长的DNA分子。两个单壁碳纳米管(如圆形横切面所示)垂直于纳米流体通道的轴和图像平面。它们与两个未显示的源漏电极对接触。图中，一个DNA分子正自左向右穿过通道。带负电荷的DNA分子(红色的)被一片带正电荷的离子包围着。在距离DNA骨架为y的地方，溶液电势受到的干扰量为其总值的
Figure BPA00001329213200321
纳米管表面的电势干扰可门控电探测器，影响其电导率。这可以在恒定源漏偏置电压下测量电流变化而获得。
在电解质溶液中，在带电对象表面附近，电势从zeta电位(固定在表面的不移动的离子的电势)到取决于溶液离子强度的一定距离之外的总电势的转变。德拜屏蔽距离λD是一个方便的描述这一电势下降的参数，λD定义为
Figure BPA00001329213200322
其中Γ/2是溶液的离子强度。采用德拜-黑格尔近似，在距离DNA表面y的地方，电解质电势的改变为
在本实施例中公开的电探测器实施方式中，碳纳米管位于足够靠近被限制的DNA分子骨架的地方，因此能避免显著的电荷屏蔽。对于固定在纳米流体通道下表面上的碳纳米管，和位于纳米管上方的并且在通道中拉长的DNA分子，平均纳米管/DNA间距约为通道高度的一半。如果DNA的zeta电位是100毫伏，离子屏蔽距离是10纳米，通道深度是50纳米，则可预计纳米管处受到溶液电势的微扰在10毫伏的数量级上。理论上，由于热搅动引起的DNA分子的构象和垂直位置的变化会导致纳米管传感器附近电势波动。然而，假设这样的波动的发生的时间比测量时间短，因此被忽略不计。
估算过DNA分子导致的电势变化的数量级，计算获得其导致的纳米管电导率的变化。对于溶液中的半导体碳纳米管(CNTs)，高迁移率、低接触电阻和良好的栅耦合是可能的(双电层电容为4×10-9F·m-1)，其导致电解液栅跨导为～e2/h/V(Rosenblatt，S.，et al.，High performance electrolyte gated carbon nanotube transistors.Nano Letters，2002.2(8)：p.869-872)。施加一个10毫伏的电解液栅电压会导致电导率在
Figure BPA00001329213200324
数量级上的变化。
然而，这是一个上限，因为其假设了沿着整个纳米管长度方向上电势的改变为
Figure BPA00001329213200331
给定器件的设计和离子屏蔽距离是大约为10纳米，仅有部分长度的纳米管会被DNA电势所影响。尽管如此，根据理论计算，依然很可能会探测到溶液电势受到这样的微扰。
对碳纳米管的扫描栅显微镜的研究已经进行了很多(Bachtold，A.，et al.，Scanned probe microscopy of electronic transport in carbon nanotubes.Physical ReviewLetters，2000.84(26)：p.6082-6085；Freitag，M.，et al.，Controlled creation of a carbonnanotube diode by a scanned gate.Applied Physics Letters，2001.79(20)：p.3326-3328；Kim，Y.，et al.，Mapping potential landscapes of semiconducting carbon nanotubes withscanning gate microscopy.Nanotechnology，2007.18(47)；Zhang，L.M.and M.M.Fogler，Scanned gate microscopy of a one-dimensional quantum dot.Nano Letters，2006.6(10)：p.2206-2210)，而且都支持这一想法。本实施例的结果表明扫描探针AFM尖端对纳米管的局部门控可以影响纳米管的电导率，即使受影响的纳米管的长度在几十个纳米的数量级上(Freitag，M.，et al.，Controlled creation of a carbon nanotube diode bya scanned gate.Applied Physics Letters，2001.79(20)：p.3326-3328)。尽管Freigag等人指出最强的栅耦合效应发生在电触点的附近，但在纳米管长度的任何位置处其可被门控至不同程度。对于本实施例公开的电探测器的实施方式，图5展示了DNA门控调整纳米管能带结构的方法。
图5A展示了电探测器横截面，其包括集成了纳米管电荷传感器的纳米流体通道。连接碳纳米管的源漏电极触点被埋在一层绝缘的氮化硅下面。纳米流体通道将电解质溶液限制在纳米管的中心部分，并迫使DNA分子处在一个靠近纳米管的垂直位置。因为通道的宽度大于深度，DNA分子在横向上有更大的自由度。
图5B展示了集成在电探测器纳米流体通道中的p型纳米管的能带图。如果溶液电势相对于源漏电极更负，则对能带图产生第一干扰(虚线，大弧度)。如果DNA分子电势足够大，则第二干扰(实灰线，小弧)会存在于导带和价带中。
调整能带结构和电解质门控纳米管的机理已经被研究过，并且为业界已知。在过去的几年中，很多理论试图解释在探测器中电解质溶液中纳米线跨导的机制，比如图6所示的探测器设计。肖特基势垒调节，纳米管载流子浓度静电门控，纳米管表面和溶液之间的电容效应，和纳米管中电子迁移率降低等理论均被提出。
Heller等人认为，根据理论，以上每一个机理都会在质量上显著影响I·V1g(电流对液体栅电压)曲线(Heller，I.，et al.，Identifying the mechanism of biosensingwith carbon nanotube transistors.Nano Letters，2008.8：p.591-595)。实验数据和以上四种不同机理的模型的比较表明，对于如图6A所示的装置，载流子浓度的静电门控和肖特基势垒效应是造成生物分子结合时电导率变化的主要原因。此外，当电触点如图6B所示被盖住，并且只有一部分SWCNT暴露在溶液中时，生物分子的结合对I·V1g的影响与纳米管中载流子浓度门控模型一致。后一种情况与电探测器最为相似，其纳米管/铂金电触点嵌在一层氮化硅薄膜的下面，并且只有纳米管的中心部分与溶液接触。最终，DNA分子被驱动通过通道的时候，也会被限制到和暴露的纳米管中心部分产生相互作用。
图6展示了碳纳米管电解液栅扫描的装置，和由此对能带结构产生的影响，其由Heller等人的报告结果改编获得(Identifying the mechanism of biosensing withcarbon nanotube transistors.Nano Letters，2008.8：p.591-595)。黑色能带图表示非门控的p型纳米管。浅灰色图描述了当栅电压相对源漏电极更正时朝耗尽级的偏移。图6A展示了未受保护的纳米管源漏电极电触点。在这种情况下，发现肖特基势垒调节和载流子浓度门控是导致调节纳米管电导率的原因。图6B展示了纳米管源漏电极电触点通过一些绝缘层来与溶液电绝缘。在这种情况下，可以排除肖特基势垒调节作为纳米管电导率调节的机理。
6.1.3材料与方法
电探测器的制造
为了将无泄漏的纳米级流体通道与起作用的碳纳米管晶体管相结合，开发了一个制造工艺，该工艺采用业界已知的标准光刻技术和MEMs系统加工技术和碳纳米管生长工艺。在此披露了电探测器制造的综述。6.2-6.3部分中有更多细节。对于本实施例中描述的电探测器的实施方式，采用了牺牲层方法来制造集成电子元件的通道。
最初，在厚170微米、直径100毫米的熔融二氧化硅晶圆(Mark Optics)上图案化并蚀刻对准标记层。然后，利用光刻、电子束蒸发以及掀离工艺的组合，沉积一层图案化的厚10-50nm的铬。这层图案化的铬是作为最终微流体和纳米流体通道网络的牺牲材料。用等离子增强化学气相沉积工具在所述铬上沉积一层低应力氮化物薄层(厚10-30纳米)。这层氮化物薄层保护了铬，防止它与碳纳米管生长过程中的工艺气体反应。接下来，采用光刻、电子束蒸发和掀离工艺的组合在不同的层上分别沉积图案化的Ti/Pt层作为接触电极(厚4纳米/30纳米)以及Al2O3/Co层(厚15纳米/3埃)作为催化板。然后，用一个KS7100晶片锯将这个晶圆切成多个芯片。
接着，以乙烯作为碳源前驱体，在800℃下，以化学气相沉积工艺(CVD)在各个晶片上进行碳纳米管生长。生长工艺之后，采用等离子增强化学气相沉积(PECVD)来沉积第二层低应力氮化物层，厚度为～2微米。然后在Oxford 80反应离子蚀刻(RIE)设备(Oxford)中，用光刻和干法蚀刻(CHF3/O2)沿着通道长度和在铂催化板上形成用于针接触的穿露孔。在光阻剥离之后，芯片被浸没在CR-14铬蚀刻剂(Cyantek)中3-6小时，在这段时间内液体蚀刻剂通过穿露孔进入并除去铬牺牲层。用dH2O去离子水和IPA异丙醇浸洗(各15分钟)芯片，然后用氮气吹干。在这个时候检查CNT的电导率。
根据氮化物保护层的厚度，通过把芯片在70摄氏度下浸没在MF312(5％TMAH)中15-45分钟，来蚀刻掉用于隔开CNTs和通道的氮化物保护薄层。在这之后，用dH2O去离子水和IPA异丙醇浸洗芯片，然后再次用氮气吹干。沉积第三层即最后一层低应力氮化硅层，厚度为500nm。该层用于封住沿着微流体和纳米流体通道长度方向上蚀刻剂穿露孔。
最后，用光刻和干法蚀刻的组合去除铂板上新沉积的500纳米厚的氮化物薄膜，让探针尖端接触到。在剥离芯片表面的光阻后(resist)，用金刚石划线器轻轻地划氮化物，制造出六个微通道末端的入口，并且通过目测对准宏观储液池并固定到微通道入口上方的芯片上。
观察装置
光学装置。用装有100x/1.35NA油浸物镜(Olympus)的IX71倒置显微镜(Olympus，Melville，NY)来对纳米流体通道中的单个DNA分子进行荧光观测。用Cascade 512b EMCCD(Photometrics)和在Labview(NationalInstruments)中所编写的软件，以每秒10幅的速度来获得图像。录像作为一系列.GIF文件保存下来，并用MATLAB程序进行分析。
电学装置。为了在可视化靠近纳米管的DNA分子的同时监控纳米管的电导率，将如图7所示电装置与光学元件组装在一起。铂电极位于储液池中，用来电驱动DNA分子通过通道。在另一个实施方式中，如6.1.4部分(结果与讨论)中所述，探测过程中铂电极可以用银/氯化银参比电极代替。利用真空支架将2到4个探针操纵器(Quarter Research，Bend，Oregon)固定在平台上，他们用来使探针尖端与源漏电极板相接触。源极电压与一个DAC数码模拟转换器连接并用免费软件LABVIEW程序MeasureIt.vi来控制。漏极和接地端间的电流用Ithaco 1211电流前级扩大器(DL Instruments，Ithaca，NY)来监控，其输出信号传输到ADC并被用同一个LABVIEW程序记录下来。电流前级扩大器的增益设置在107到109之间，时间常数设置在3毫秒到100毫秒之间。采样速率设置为等于或小于时间常数的倒数，确保记录到的测量的统计独立性。图7展示了可同时进行光学和电探测的装置。
6.1.4结果与讨论
测量空气中的碳纳米管
为了证实在整个制造过程中碳纳米管(CNTs)的存在，电探测器的电导率从最初CNT生长就被记录，其时，纳米管还暴露在空气中。每一芯片上38对源漏电极对中的每一对都可被单独寻址及进行纳米管检测。因为CVD工艺的碳纳米管生长的随机性，事先无法知道有多少个纳米管接通了源电极和漏电极之间的空隙。生长工艺之后，对于施加的源漏偏置电压，一些电极对没有电流反应，这些电极对被认为是没有纳米管接通电极对之间的空隙。尽管可以想像在上述情况下SWCNT已经存在但只是没有电荷载流子，但这种情况是极少发生的。这是基于许多随后采用水栅的测量得出的结论。大多数情况下，如果有纳米管存在，在高源漏偏置电压下至少能探测到一些很小的电流。如果电流存在，可以认为至少有一个纳米管接通了空隙。对于大部分芯片，在这个阶段还没有获得关于纳米管生长情况的更多细节信息。每一芯片仅简单地用源漏电极对接通数量来表征。如果至少有几个被连接了，那么该芯片的处理步骤将被继续。根据晶圆或CVD生长批次，大部分芯片在一轮生长工艺中，在38个可能被连接的电极对中能有5到30个被连接。在源漏偏置电压为10毫伏下，大多数连接的电极对的I-Vsd曲线显示电探测器的电阻在100千欧到10兆欧，电流噪声强度均方根为10-17Amp2/Hz到10-15Amp2/Hz。
在纳米管上沉积了氮化物覆盖层之后，观察到电导率的变化。这是由于电荷附着在氮化物/纳米管界面上(Chen，B.H.，et al.，A carbon nanotube field effect transistorwith tunable conduction-type by electrostatic effects.Solid-State Electronics，2006.50(7-8)：p.1341-1348；Kojima，A.，et al.，Air stable n-type top gate carbon nanotube filedeffect transistors with silicon nitride insulator deposited by thermal chemical vapordeposition.Japanese Journal of Applied Physics Part 2-Letters & Express Letters，2005.44(8-11)：p.L328-L330；Mizutani，T.，et al.，Effects of fabrication process on current-voltage characteristics of carbon nanotube field effect transistors.Japanese Journal ofApplied Physics Part 1-Regular Papers Short Notes & Review Papers，2005.44(4A)：p.1599-1602)。另外，很多纳米管的噪音水平表现出降低趋势。这也是由于氮化物和纳米管之间的直接接触。
电解质门控测量
因为芯片上不存在金属栅，以下分析了电导率的变化。尽管在氮化物沉积之前可以使用水栅，但即使在沉积了很少量的氮化物之后，水门控就不太有效了。尽管如此，我们还是可以进行水门控反应对比，即比较刚长好的纳米管和那些在完全制造好的电探测器中(其中氮化物保护层被除去，和纳米管的一部分与纳米流体通道缓冲溶液接触)的纳米管的水门控。具有暴露表面的CNT器件可以使用电解质栅进行研究，该技术首先被证明用于多壁纳米管(Kruger，M.，et al.，Electrochemicalcarbon nanotube field-effect transistor.Applied Physics Letters，2001.78(9)：p.1291-1293)，随后是单壁纳米管(Rosenblatt，S.，et al.，High performance electrolyte gatedcarbon nanotube transistors.Nano Letters，2002.2(8)：p.869-872)。源漏电极以正常方式接触，但是纳米管的正上方被直接滴加了一滴盐水，随后用一个铂或银电极来门控这个电解质溶液，如图6A所示。在相对于漏极电势为-800毫伏到+800毫伏之间扫描了电解质电势。由于电极或纳米管本身的电化学氧化或还原，栅电势超过大约±1伏就会毁坏电探测器。
图8展示了半导体设备典型的I-V曲线
图8A展示了两个源漏电压下，源漏电流随电解质栅扫描的变化。当VSD＝0，测量到的I完全取决于IGD，栅极和漏极之间的电化学漏电流。从正值到负值并循环的栅扫描相当于电化学文献中的循环伏安法。曲线的形状取决于质量传递或电子转移动力学，并是包括扫描速率在内的参数的函数(Bard，A.and L.Faulkner，Electrochemical Methods.2001：John Wiley & Sons)。对于给定的扫描速率和电极表面积，可以根据以上的方法测量漏电流，并随后减去漏电流。图8B展示了在三个不同的栅电势下电流和源漏电压的关系。从这些曲线中很明显看出，可以很容易测量到50毫伏数量级的栅电势变化。
带有单个碳纳米管的电探测器表现出双极行为是很常见的。在零和负的栅电压下，这些纳米管通常是p型的。施加较大的正栅电压会产生n型行为。根据之前定义的半导体纳米管表征的度量方法，对于n型和p型区域，本实施例所披露的电探测器都可以用跨导值来表征。
对于电解液栅扫描，测量到的电流值I是源漏电极之间的电流ISD和栅极与漏极之间电流IGD的总和。每一分量可以被进一步分解。源漏电流是通过纳米管的电流和源漏电极之间离子电流的总和。栅-漏极电流是栅和漏极表面暴露的面积之间的电流与栅和纳米管之间电流的总和。根据VG和VSD的值，和纳米管的电子特性，在特定时间内总电流可能的来源之一可能占主导地位。
当最初分析完成的带有纳米管的电探测器数据时，相信存在一个小的漏电流，它可能由1)纳米管拓扑造成的通过介电层空间的栅和漏极之间的电解质电流，或2)栅和碳纳米管表层之间的直接的漏电流所造成。对图9所示的VSD＝0的数据的分析披露了大栅值下的一些小的负电流。这些支持了小漏电流的观点。
图9(主图)展示了在多个源漏偏置电压下，集成在电探测器纳米流体通道中的纳米管的电流和电解质栅电压之间的关系。这个特定的纳米管表现出双极行为。它最高的跨导约25μS/VG。图9(插图)展示了在100毫伏源漏偏置电压下电流相对栅电压的半对数图。指数衰减用S＝185毫伏/十年的次阈值摆幅(虚线斜率的倒数)来表征。
在完成的电探测器中，源漏偏置电流为零时观测到的电流根本不是漏电流。其似乎是由源漏电极之间的环境电压差造成的。尽管源电极设置为零伏，与漏极电势之间有一些小的负电压差。这个小的偏压差产生了可被栅电势调节的电流，但是它不是由栅和漏极之间的漏电流产生的。图10和图11A-D给出了这个观点的证据。
图10展示了掩埋电极与暴露电极产生的栅-漏极漏电流的不同。图10画出了掩埋电极与暴露电极产生漏电流的对比。绘制了两个独立的电探测器的栅和漏极之间的漏电流。一组数据(已标记)来自部分制造完成的装置，其中，源漏电极是暴露的，并与电解液接触，如图6A所示。另一组数据(已标记)来自制造完成的装置，其中，源漏电极被掩盖在氮化硅的下面，并与电解质溶液分开，如图5所示。这里测量的两个电探测器都被认为源漏电极之间没有纳米管连接。尽管这里的图显示的是在一个100毫伏的偏置电压下，然而电流的反应与偏置电压为0毫伏、1毫伏和10毫伏情况下几乎完全一样。这里的主要结果是掩埋电极相对于暴露电极所产生不同的漏电流。对于掩埋电极，没有明显的栅漏极漏电流。对于暴露电极，漏电流为循环伏安形式，与对质量运输限制的异相反应的预期一致。
图11A-D展示了四个不同电探测器的栅扫描，其中，名义上的源漏偏置电压设置在0毫伏和10毫伏。图11A-D描绘了制造完成的电探测器(即接触电极被氮化物盖住)四组不同的源漏电极对的电流和栅电势之间的关系。这里研究的每一对电极对都有一个或多个连接的半导体碳纳米管。每个图中上面一组数据相应于1毫伏名义上的源漏偏置电压。这些数据组的电流的数量级在y轴给出。
每个图中下面一组数据相应于0毫伏名义上的源漏偏置电压为。为了便于观看，这些数据组的值被放大了10倍。因此，在图A、B、C和D中的数据组中测到的最大电流为-3.3纳安，-1纳安，-2纳安和-2纳安。有一个小的约-0.1毫伏的环境偏差源漏电压。证据表明即使存在漏电流，其值也很小。
荧光视频监控靠近纳米管的DNA
DNA分子在电泳作用下通过纳米流体通道被荧光视频记录。单个T4分子(长度为120kbp)和片段很容易被观察到，并且被快速驱动进入电探测器的纳米管区域(图12)。一旦到达，以小电压就可以定位这些分子。当纳米管的电导率正被监测，这一级别的控制可以使DNA分子被如此定位，使得其在延长的时间期间内直接停留在纳米管正上方。
图12(左)是位于电探测器的纳米流体通道区域内部以及附近的DNA分子的示意图。在这个图中，两个分子同时在通道内。通过施加一个小电压(～1伏)，这些分子可以被缓慢地驱动沿通道向上或向下运动。图12(右)是带有碳纳米管电荷传感器的电探测器的纳米流体通道中的两个DNA分子的时间轨迹图。第一个分子在时间t＝0秒时进入通道，第二个分子在t＝25秒时进入。当t＝29秒时，电场方向倒置，致使两个分子改变他们移动的方向。
与电子噪音有关的因子
作为确定系统本底噪音的第一步，估计了液体栅碳纳米晶体管的内在电流噪音。由于探测DNA的方法的本质，低频噪音功率(大约1赫兹及以下)是我们最想了解的。已经有很多关于SWCNT的噪音特性的研究，1/f噪音也得到了证实。
源漏电流的噪音谱，I，作为频率，f，的函数，通常用Hooge模型的观点来解释(Hooge，F.N.，1/F Noise Sources.IEEE Transactions on Electron Devices，1994.41(11)：p.1926-1935)。在这个模型中，噪音是由独立的电荷载流子的扩散事件造成的。最近Mannik等人采用一个电荷-噪音模型，对纳米管中的1/f噪音作出了不同的解释(Mannik，J.，et al.，Charge noise in liquid-gated single-wall carbon nanotubetransistors.Nano Letters，2008.8：p.685-688)。在这个模型中，低频噪音是由纳米管附近或暂时附着在纳米管表面的电荷波动所造成的。比如，这样电荷波动可能是基片表面纳米管附近的硅羟基官能团中的氢分离出来或者是溶液中的离子吸附到纳米管表面上造成的。这表明电流-噪音功率，SI(f)，应当与描述电荷波动数量级的因子，Sinput，乘以纳米管跨导的平方(dI/dVG)2，成正比。
除了说明低频噪音谱被电荷-噪音现象控制以外，Mannik等人还证明了噪音功率与纳米管长度相关(Mannik，J.，et al.，Charge noise in liquid-gated single-wallcarbon nanotube transistors.Nano Letters，2008.8：p.685-688)。Mannik等人指出SI(f)∝1/L对直径为2纳米，长度范围在60纳米到3.4微米之间的纳米管都成立，而我们的纳米管恰好落入这一尺寸范围。为了获得为电探测器估计的数量级，Mannik等人的用于440纳米长的CNT传感器的电流噪音谱密度的值被用来估算装置的噪音。对于1赫兹带宽和10毫伏的源漏电压，Mannik等人发现，在扫描液体栅电势时，f＝1Hz时电流噪音谱密度在10-26到10-18Amp2/Hz。这符合当源漏偏置电压为VSD＝10mV，上升时间为30毫秒时，在大约.5皮安到5纳安之间的电流的RMS不确定性。
连接宏观尺度的储液池的纳米流体通道和微流体通道系统作为电阻，被认为是噪音的第二个来源。归因于Johnson噪声，每赫兹带宽的电压的变化为
Figure BPA00001329213200411
为了计算纳米管所在处的电压变化，可以采用几何学考量和已知的缓冲溶液的电阻系数，来计算流体系统各个部分的电阻。考虑一个简单的例子，单个纳米管位于纳米通道的中心，并只与微通道串联。假定缓冲溶液的电阻系数为ρ，而每个通道部分的电阻为ρ·g，其中g＝l/(d·w)是一个几何因子，其中l、w和d分别为通道部分的长度、宽度和深度。
模型中所有的通道都是同一个深度，在这个计算中被设定为d＝100纳米。为了计算的目的，第一个微通道被近似为5毫米长，30微米宽。第二个微通道被近似为1毫米长，5微米宽，以及纳米通道被近似为从末端到中间为5微米，宽500纳米。因此，几何因子为g1＝1.7×109m-1，g2＝2×109m-1以及g3＝1×109m-1。
如Stein等人提出，在低离子强度下，纳米级通道中的电解质电阻率ρnano与总电阻率ρbulk之间具有较为显著的差值(Stein，D.，M.Kruithof，and C.Dekker，Surface-charge-governed ion transport in nanofluidic channels.Physical Review Letters，2004.93(3))。Stein等人研究了深度范围在70纳米到1015纳米之间的通道，并观察到通道电导率随着深度和离子强度递减。他们还提出了在很低离子强度下，有一个电导率饱和水平，这个现象可用表面电荷所控制的离子运输的主导来解释。电探测器就在这个浓度环境下操作。
Stein等人报告的值被用于电阻系数的估算。假定满足饱和条件，ρnano·d≈2·108Ω·(宽度/长度)，无论通道的高度是多少。用这个值估算出通道的总电阻，假定离子强度足够低以至于表面控制的离子运输主导电导率。给定通道的几何尺寸，R＝(ρ·d)·L·w-1＝(2·108Ω)·(10-3m/10-5m)＝2·1010Ω。因此，在纳米管所在处，通道内归因于通道内流体的热运动的每赫兹带宽的电压的变化为通过场效应，在VSD＝10mV时，这就转化成Johnson诱导的电流噪声
Figure BPA00001329213200422
其中频率依赖性很微小，因为跨越电阻的热搅动会产生白色噪声谱。请注意，实际的通道系统更为复杂，因为不是只有2个而是有6个储液池(见6.2部分)。还有6个微通道上样臂通到每一个储液池，以及19个平行的纳米流体通道分支。尽管如此，这里描述的简单例子给出了对这种类型流体系统的Johnson噪声的粗略估算，并由此估算出它对纳米管电流噪声的影响。
考虑了第三个影响电流噪声的因子，储液池电极和缓冲溶液之间的界面。电极界面处的化学互作用可以导致额外的溶液电势变化。Minot等人的研究也证实了这一点(Minot，E.D.，et al.，Carbon nanotube biosensors：The critical role of the referenceelectrode.Applied Physics Letters，2007，91)。Minot等人指出，当使用碳纳米管来进行生物传感测量时，使用通过玻璃料与溶液分开的参比电极来精确控制溶液电势是非常关键的。他们指出许多之前报导的纳米线生物传感实验在溶液中采用裸电极，这会导致随着时间变化不能准确知道溶液电势。例如，当铂电极浸没在含有目标蛋白质分子的牛血清白蛋白里，电极表面的互作用会导致总的溶液电势有20-40毫伏数量级的变化。
在当前实施例中，可以想象DNA分子、结晶盐片或其他扩散在宏观储液池内的微粒的累积可能与裸电极产生作用并导致一个类似的总的溶液电势的变化。因为DNA分子的“信号”干扰预计只在10毫伏数量级上，电极表面和溶液中的杂质之间的相互作用应当被避免。为了防止这个，可以使用银/氯化银参比电极：浸没在高浓度的AgCl氯化银溶液中并用玻璃料与储液池中的本体溶液隔开。这样的参比电极可以保持溶液电势稳定在1毫伏波动范围以内。因此估计参比电极/溶液-杂质相互作用对背景噪声产生的影响为1毫伏RMS波动，产生在VSD＝10mV时的电流噪声PSD为SE(f)＝(1mV)2·(dI/dV1g)2＝15×10-14Amp2/Hz。
考虑了最后一个可能的噪声来源，即测量装置本身。选择远大于源动态阻抗Rd的前置放大器增益，来防止前置放大器产生显著噪声。对于107的增幅和1毫秒的上升时间，主导的前置放大电流噪声在50飞安数量级上(DL Instruments，Applying the Model 1211 Current Preamplifier to Tunneling Microscopy 1987；availablefrom：http://www.dlinstruments.com/technotes/technotes.html)。这远远小于由其他来源产生的噪声。其他因子如60赫兹拾取和声波振动也可能产生噪声。然而，由于它们极大地取决于装置的细节，并没有对其进行估算。我们假定，通过努力可以把它们产生的噪声控制在小于上述几个其他噪声来源。
6.1.5结论
将碳纳米管集成到纳米流体通道中代表了电探测非缔合生物分子的第一步。本实施例披露了实现这一集成的装置的设计和制造方法。也实现了对该装置的光学和电学属性的表征。
将电动力驱动和实时荧光视频显微镜相结合，在检测区观察到单个DNA分子并对其进行操控。纳米流体通道中内置的SWCNT通过调节溶液电势来门控。门控特征与那些开放表面上的管不同。由于源漏电极的绝缘，漏电流被降低到一个低于噪声的水平。
6.2实施例2：包括集成了碳纳米管的纳米流体通道的装置的制造
6.2.1简介
6.1部分所述的电探测器是由结合了业界已知的标准微电子机械(MEMS)加工技术和碳纳米管生长技术制造的。该实施例描述了一个优选的制作集成了碳纳米管传感器的纳米流体通道装置的实施方式。
6.3部分描述了制造方法的具体实施方式。
6.2.2装置特征
基于6.1节中所述利用集成的碳纳米管来电探测纳米流体通道中的带电DNA分子的概念，包括纳米流体通道和集成在纳米流体通道中的电荷传感器的电探测器优选具有以下特征：
(1)纳米流体通道的深度优选与德拜屏蔽距离相近。对合理低的离子强度的溶液，该屏蔽距离可以约为10纳米。
(2)纳米流体通道优选与微通道如此连接，使得可能以可控制的方式把DNA分子载入通道，并将其单个地流至集成的碳纳米管上方。优选地，同时进行通道中荧光标记的DNA分子的光学观察。所以，优选厚度为170微米的熔融二氧化硅基片。
(3)为了按预期方式操作电探测器，优选可寻址的半导体纳米管，其起到电解质栅型场效应晶体管(FETs)的作用。为了纳米管对溶液电势中小的干扰有反应，集成的碳纳米管优选与通道中的电解质溶液直接接触。
这些要求给制造工艺增加了一些限制。
(1)一些在熔融二氧化硅中制造纳米裂缝和纳米通道的标准工艺不能被采用。涉及熔融粘接和对两个熔融二氧化硅晶圆进行高温退火以封闭通道的工艺不能被采用。熔融粘接要求晶圆表面平整和干净(即没有电极产生的表面隆起或纳米管生长产生的灰)。通常，为充分地清洁表面，采用湿化学清洗接着再用高功率氧等离子处理。进行氧等离子和接触粘合之后，在1050摄氏度下空气中进行过夜退火。但是，碳纳米管既经受不了氧等离子工艺，也经受不住在高于～300摄氏度下在空气中(特别是氧气)的烘烤。如果电极之类的结构存在于晶片表面，熔融粘接的质量就会很差，而且高温退火将损坏纳米管。
(2)为了能可靠地驱动分子进入纳米通道探测区域，上样通道网络优选地将探测区域和宏观储液池连接。这些通道应当无泄漏，并且通道壁应当是绝缘的。如果采用光刻技术，10纳米深的通道的最小的高宽比需要通道的壁和顶部必需相对坚硬来避免坍塌。上述要求和对通道无泄漏的要求阻碍了把，例如，PDMS作为通道结构。
(3)纳米管对附近DNA分子的响应的信噪比很可能很低，甚至可能低于整体(unity)。因此，准确地将DNA分子定位在纳米管上方并保持一段长时间是重要的。这要求良好地可视化DNA分子，在实践中要求使用高数值孔径物镜。因此，优选在170微米厚的熔融二氧化硅基片上制造装置。这使得可以使用100x、1.35N.A.的油浸物镜，其已足够可视化DNA分子。在一个优选的方面，对单个分子荧光显微镜观察，通道的材料显示低自体荧光。
(4)对于置于通道内部的纳米管，生长优选发生在早于进行其他工艺步骤。小直径单壁碳纳米管的生长通常要求使用催化剂，如铁(Fe)或钴(Co)。一些薄膜加工机器有样品限制。例如，MOS炉禁止用含金属的样品。在开发制造方法过程中有必要考虑这些限制。
6.2.3方法
装置制造工艺概述
本实施例描述了一个制造工艺的实施方式。该工艺的其他变化对于本领域普通技术人员是显而易见的。选择这个版本是为了优化装置的产率和产量同时满足以上列出的基本要求。尽管没有必要使产率和产量达到“高产量生产”的等级，这是一个通常用来描述工业生产的等级，依然优选生产足够的工作装置使得可以完全彻底地测试所述装置的设计。即使是一个完全制造好的带有工作纳米管的装置也可能在实验进行的过程中被轻易的损坏。这种损坏可能是，例如，纳米管接触溶液的电解损坏，或纳米通道的堵塞。采用以下的工艺，技术人员几个星期之内就能制造出大约10-20个工作装置。
装置及其几何构造
本实施例中公开的电探测器的实施方式有一个连续的微流体和纳米流体通道系统，其与宏观储液池和纳米管传感器所在的一个或多个纳米流体通道探测区域相连。本实施例中公开的制造方法在每个芯片上制造一个装置，其中，每个芯片是一个20毫米x20毫米的熔融二氧化硅片，二氧化硅片的一面有各种各样的特征构造。每个装置包括19个平行的纳米通道分支，其具有与嵌入的碳纳米管接触的38个单独可寻址的源漏电极对。这样的电探测器的示意图被展示于图13中。
图13展示了装置示意图。为了方便观察，每个图像中所有的特征构造不是完全按照互相之间的比例来画的。必要时，用红箭头和标记来指出关键的尺寸。左上图展示了一个完整的流体网络视图。圆圈代表六个宏观的储液池用于流体和DNA的上样。粗黑线代表流体通道，用于传送DNA从储液池进入电探测器内。这些通道宽40微米，深100纳米，长几毫米。上样通道中间的支撑柱(未显示)帮助防止顶端结构坍塌。左边和右边的上样通道由19个更小的微通道分支连接，微通道宽6微米和深100纳米。右上图是3个微通道分支与较大的上样通道连接的区域的特写图。这对应于1A中的黑色大长方形。左下图是一个微通道分支中心部分的特写图。这对应于左上图中的黑色小长方形。如图所示，每个微通道分支中存在两个探测区域。右下图是一个探测区域的特写图。两个铂电极(一个源极一个漏极)分开有1微米的空隙。6微米的微通道分支逐渐变小成为一个500纳米的纳米通道穿过源漏电极之间的空隙。数目不详的碳纳米管接通电极之间的空隙。每个纳米管的一部分位于纳米通道中并且与流体直接接触。
主要制造步骤
制造工艺可分解成14个主要步骤，这些被归类为3个阶段：
I.整片晶圆的洁净室处理(主要步骤1-3，如下所示)
II.在从整片晶圆上切割所得的芯片上的碳纳米管生长(主要步骤5，如下所示)
III.芯片的洁净室处理(主要步骤6-13，如下所示)
从用170微米的熔融二氧化硅晶圆开始，14个主要制造步骤是：
1)对准层
2)铂/钛电极层
3)氧化铝为载体的钴催化层
4)晶圆切割
5)碳纳米管生长
6)氮化硅薄层
7)微通道/纳米通道铬牺牲层
8)氮化硅厚层
9)穿露孔层#1(用于湿蚀刻牺牲材料)
10)湿蚀刻牺牲材料
11)湿蚀刻氮化硅薄层
12)氮化硅薄层#2(用于封住穿露孔)
13)穿露孔层#2(使探针尖端可接触到源漏极触板)
14)宏观储液池连接
图14中，用了一个示意图来说明14个主要步骤中的9个，尽管下面我们对14个主要步骤中的每一个都进行了一些描述。
图14展示了14个主要步骤中被选择的几个。这里只展示了那些能够被说明清楚的步骤。每一个横截面视图都标记了它相对应的步骤号和名称。
步骤1)对准标记(没有实际显示)被湿蚀刻成至4英寸，170微米厚的熔融二氧化硅晶圆。
步骤2)铂电极垫沉积到晶片上。
步骤3)用光刻、电子束蒸发和掀离把钴催化板沉积到晶圆上。
步骤4)切割(未显示)。
步骤5)切割之后(图示未显示)，芯片被放入纳米管炉进行碳纳米管(CNT)生长。
步骤6)在晶圆上沉积一层5-20纳米的氮化硅薄层，盖住熔融二氧化硅、铂触点和纳米管。
步骤7)通过光刻、电子束蒸发和掀离，在晶圆上形成一层10纳米厚，图案化的铬层。
步骤8)一层2微米厚的低应力厚层氮化硅直接沉积到纳米管上。
步骤9)沿着微通道长度的方向定义穿露孔(未显示)
步骤10)沿着微通道长度方向定义穿露孔之后(图示未显示)，用CR-14铬蚀刻剂(Cyantek)把铬牺牲层有选择性地蚀刻掉。
步骤11)湿蚀刻掉埋有纳米管的氮化物保护层。蚀刻高度用经加热的MF-312(5％TMAH，Microposit Corp)计时蚀刻来控制。湿蚀刻之后接着吹干通道，用氮化物封住穿露孔，重新蚀刻触点界面并装上宏观流体储液池，以上这些都未显示在图中。
步骤1，对准层。熔融二氧化硅晶片最初没有特征构造，标记必须形成于晶片上，以使得每一层后续的光刻层能对准。在这个工艺中采用了两种类型的对准标记，其是为GCA Autostep Aligner设计的。全局GCA标记用于进行肉眼粗对准。然后用Micro-DFAS(暗场对准系统)标记进行精细对准。
步骤2，铂/钛电极层。用光刻、电子束蒸发和掀离界定用来接触碳纳米管的源漏电极。电极由铂(30纳米厚)和钛(5埃厚)组成。钛的目的是为了增加铂金属和熔融二氧化硅晶片的粘合性。
步骤3，氧化铝为载体的钴催化层。催化板，用于促进纳米管生长，采用光刻、电子束蒸发和掀离来定义。蒸发材料是Ti(5埃)、Al2O3(15纳米)以及Co(2.5埃)。钛是用来增加氧化铝和熔融二氧化硅的粘合性。氧化铝的使用有两个目的。第一，已知催化剂沉积在氧化铝上比沉积在二氧化硅上能产生更好生长。要得到一层连续的薄膜要求至少10纳米的厚度。第二，氧化铝的厚度提高了Co钴颗粒相对于Pt铂接触板的位置。这提高了碳纳米管在生长阶段位于Pt触点上的可能性。
步骤4，晶片切割。在碳纳米管生长之前，用一个晶片锯将4英寸(100毫米)的装置晶片切割成16块芯片(20毫米x20毫米)。每块芯片包含一个如6.2.2部分所述的装置。这个切割的步骤使芯片适合放入碳纳米管炉。熔融二氧化硅炉管的内径大约是22毫米。
晶片切割过程可能对MEMs类结构造成损坏。在制造步骤的开发过程中，我们发现在源漏电极之间的熔融二氧化硅区域易发生损坏。这一问题通过以下方式得到解决：采用一个厚抵抗涂层来防止切割过程中特征结构被碎屑破坏，以及对装置几何构造的改变，如缩短铂线的长度，以降低铂引起的应力。
步骤5，碳纳米管生长。采用现有技术中的化学气相沉积方法，用碳纳米管炉来长单壁碳纳米管。根据想得到的纳米管产量使用两个生长方法中的一个。一种方法包括用乙烯作为碳前驱体，并在800摄氏度下生长，得到一个中等的碳纳米管产量。一种方法包括用乙烯和甲烷作为碳前驱体，并在900摄氏度下生长，得到一个较高的碳纳米管产量。纳米管生长只在Co钴催化剂颗粒所在的地方启动。得到的每个纳米管的方向和长度是随机的，由泊松统计获得连接源漏电极的纳米管的数量。
步骤6，氮化硅薄层。纳米管长好之后，用等离子增强化学气相沉积(PECVD)工艺将一薄层氮化硅共形地沉积到它们上面。这层薄层优选大约10纳米厚。这层氮化物薄层的功能是保护步骤10中碳纳米管不被湿铬蚀刻剂蚀刻掉。如果与碳纳米管直接接触一长段时间，Cr-14铬蚀刻剂中的强氧化剂(硝酸铈铵)会损坏碳纳米管。因此，在铬蚀刻过程中，纳米管与通道用氮化物薄层分开。这层薄层以后用一种不会损坏碳纳米管的蚀刻剂除去。用氮化物盖住纳米管也可以提供保护并减少在接下来的制造步骤中由静电引起的损坏。
因为氮化物直接沉积到裸露的纳米管上，选择沉积参数时以不损坏纳米管为准。选择PECVD氮化硅而非PECVD二氧化硅，是因为众所周知的原因，裸露的纳米管在RF氧等离子中会迅速地被蚀刻掉。在工艺开发过程中观察到低频射频RF等离子直接接触裸露的纳米管时会引起纳米管的损坏(表现为电导率降低)。这是一个物理离子轰击的结果。为了保护纳米管不被低频氮化物沉积损坏，首先进行一个短的高频氮化物沉积。这盖住了纳米管并保护它们不被物理离子轰击损坏。在下面的标题为“氮化物沉积对碳纳米管电学性质的影响”的章节中描述了更多细节。
步骤7，微通道/纳米通道铬牺牲层。采用光刻、电子束蒸发和掀离工艺沉积一层铬到晶片上。铬的图案界定了想得到的微通道和纳米通道的形状和厚度。最终的通道高度优选不低于铬牺牲层的厚度(尽管可能更多地取决于步骤11的湿蚀刻)。铬被选为牺牲层材料是由于相对于氮化硅和熔融二氧化硅，其在CR-14铬蚀刻剂中的选择性更高。
步骤8，氮化硅厚层。铬沉积之后，牺牲层材料和碳纳米管被一层厚的(～2微米)低应力氮化物盖住。这层氮化物之后成为纳米流体装置的“顶壁”。因此，它的力学性质是维护通道结构完整的一个重要特性。选用一层低拉伸应力和厚度为～2微米的氮化物薄膜来保护氮化物不会在牺牲材料被除去之后裂开或坍塌。发现高拉伸应力的薄膜会裂开，较薄的薄膜会坍塌。发现具有压缩应力性质的薄膜会弯曲。这些影响的测试和表征在以下标题为“碳纳米管生长”的章节中描述。
步骤9，穿露孔层#1(为了牺牲层材料的湿蚀刻)。用光刻和干化学蚀刻的组合制造出穿过厚氮化硅层的穿露孔。穿露孔沿着微通道和纳米通道区域长度的方向分布。在这个步骤中，除了用于湿化学蚀刻的穿露孔以外，还制造了在触点上方的孔，使探针尖端能够接触到源漏电极接触板。
步骤10，牺牲材料的湿蚀刻。用Cyantek CR-14铬蚀刻剂除去铬牺牲层。沿着通道长度的方向穿露孔之间间距大约为50微米，横向的蚀刻速率是10微米/小时，所有的铬在大约3小时内被除去。通常蚀刻能允许进行大约两倍长的时间(5-6小时)。在Cr-14蚀刻剂中，对于铬和氮化硅之间的选择性非常高，如同铬和熔融二氧化硅之间的选择性一样。
步骤11，氮化硅薄层的湿蚀刻。除去铬层之后，制造了一个通道系统，它们的深度与原来的铬层一样。这允许了下一湿蚀刻剂(MIF312)的快速传递。在MIF312中三甲基氢氧化铵(TMAH)是总容积的5％。加热时，TMAH蚀刻低应力GSI PECVD氮化硅的速度为大约2纳米/分钟。这样就可以进行氮化硅的向上蚀刻，直到碳纳米管从氮化物顶壁中裸露出来。根据之前沉积的氮化物保护层的厚度，在70摄氏度下将芯片浸没在MIF312中15分钟到45分钟。
步骤12，氮化硅薄层#2(封闭穿露孔)。第二个湿蚀刻步骤之后，干燥芯片并测试纳米管的电导率。封闭在湿蚀刻中用过的穿露孔来完成通道。用PECVD再一次沉积低应力氮化硅。最终的氮化硅薄膜为中等厚度(几百纳米)，以确保所有的穿露孔都被完全的封住。
步骤13，穿露孔层#2(为了允许探针尖端能接触到源漏电极触点)。沉积了最终的氮化硅层之后，触点再次暴露。这是采用光刻和反应离子蚀刻的组合完成的。
步骤14，宏观储液池的安装。在接近最终状态的芯片中，触点是暴露的，但是纳米通道和微通道是完全封闭的。用一个钻石划线器轻轻地划氮化物层来建立位于六个微通道末端的入口。然后通过肉眼观察将宏观储液池对准通道的入口，用RTV密封剂粘到芯片上。粘合完成之后，装置就准备好可以被充满和在实验中使用了。
制造过程中选中工艺的深入描述
蚀刻的描述
湿蚀刻速度。为了描述除去铬牺牲层步骤的特征，首先描述另一种材料层的蚀刻，非晶硅，在决定选用铬之前，它被作为一个牺牲层候选材料进行了测试。如业界所知，在TMAH中非晶硅和氮化硅之间具有非常好的选择性。有报道指出在5％TMAH中对于a-Si和LPCVD氮化物，选择性高达20000∶1。因此，这个材料组合是牺牲工艺的良好的候选材料。测试了a-Si和GSI PECVD氮化物的蚀刻速度之后，发现选择性远远低于预期，即大约是50∶1.
表1汇集了测得的蚀刻速度和文献中指出的数值。第一列数据是从Williams(2003)，Journal of Microelectromechanical Systems，vol.12，no.6，December 2003得到的。第三列数据是从Merlos(1993)Sensors and Actuators A，37-38 737-743得到的。
Figure BPA00001329213200521
表1
表1给出了在Cr-14和MF-312蚀刻剂中各种可能的壁和牺牲材料的蚀刻速度。对每一个蚀刻剂和材料都有一个实验得到的蚀刻速度值，或文献报道值，或两者都有。测得的铬和氮化硅之间的选择性在误差范围内是无限的。测得的非晶硅和氮化硅之间在5％TMAH中的选择性在48∶1到62∶1之间，取决于使用的氮化物的配方是高应力还是低应力的。这与文献报道的非晶硅和高应力氮化物的选择性为20000∶1的数值不一致。这个差异归因于文献中研究所用的高应力氮化物是LPCVD沉积的氮化物，而本实施例中研究所用的是PECVD沉积的氮化物。
a-Si和GSI PECVD氮化物的弱选择性造成通道逐渐变细以及在靠近穿露孔入口处深很多。图15展示了这个观察到的现象，而图16展示了湿蚀刻步骤之后的通道的光学图像。随后还测量了铬的湿蚀刻选择性。在蚀刻的各个阶段，在部分被蚀刻的通道中，纳米通道入口和铬之间的距离可以用光学显微镜来测量。这些图像的例子如图17所示。观察到的速度是大约10微米/小时或27纳米/分钟。在测量误差范围内，在Cr-14蚀刻剂中铬和氮化硅具有无限的选择性。
图15是一个示意图，说明了选择性在除去牺牲层中的重要性。左列)通道深度仅仅由牺牲层厚度决定。右列)通道深度由牺牲层厚度加上蚀刻掉的覆盖材料的厚度决定。
图16展示了用TMAH蚀刻部分除去a-Si之后的基于a-Si/氮化物的通道的图像。穿露孔是深色的长方形。浅灰区域是尚未蚀刻掉a-Si牺牲层的地方。熔融二氧化硅表面和氮化物顶壁之间的空隙在深度上变化，这是由于随着向内蚀刻a-Si时，同时向上蚀刻氮化物。
图17展示了用Cr-14铬蚀刻剂部分除去铬之后的基于Cr/氮化物的通道的图像。图17A-C分别是微通道区域蚀刻之前，25分钟之后，3小时之后的图像。图17D-F分别是纳米通道区域蚀刻之前，25分钟之后，3小时之后的特写图。请注意，因为蚀刻后的通道的所有部分深度相同，蚀刻后的通道区域没有像图16中的通道那样用不同颜色表示。
干蚀刻速度
采用反应离子蚀刻、轮廓测定法和干涉测量法，测量了氮化硅的干蚀刻速度。在三氟甲烷/氧气(CHF3/O2)，Oxford 80#1氮化物配方中低应力氮化物是98纳米/分钟。
氮化物沉积
在低于400摄氏度条件下用PECVD沉积的氮化硅薄膜通常是非晶的，它们的结构上的、电学以及光学性质强烈依赖于沉积参数(Lin，K.C.and S.C.Lee，Thestructural and optical-properties of A-SINXH prepared by plasma-enhanced chemical-vapor deposition.Journal of Applied Physics，1992.72(11)：p.5474-5482；Parsons，G.N.，J.H.Souk，and J.Batey，Low hydrogen content stoichiometric silicon-nitride filmsdeposited by plasma-enhanced chemical vapor-deposition.Journal of Applied Physics，1991.70(3)：p.1553-1560)。具有以下特征的电探测器是优选的，其中，氮化物薄层具有低自体荧光，是电绝缘的，以及在纳米通道天花板或壁的形式中结构稳定。
在测试各种氮化物沉积参数时，观察到所有测试过的参数范围内头两个条件都得到了满足。变化最大的是薄膜的力学性质。只有一个很窄的沉积参数范围能得到一个有令人满意的力学性质的薄膜。
因为本节中后面详细讨论的原因，优选沉积的薄膜是低拉伸应力。已知一些沉积参数会影响材料的残余应力，包括沉积温度(Walmsley，B.A.，et al.，Effects ofdeposition temperature on the mechanical and physical properties of silicon nitride thinfilms.Journal of Applied Physics，2005.98(4)：p.6；Martyniuk，M.，et al.，Stress in low-temperature plasma enhanced chemical vapour deposited silicon nitride thin films.SmartMaterials and Structures，2006，15 S29-S38，doi：10.1088/0964-1726/15/1/006)，导致化学计量学含量的变化的前驱体气体的比例(Pearce，C.W.，et al.，Characteristics ofsilicon-nitride deposited by plasma-enhanced chemical vapor-deposition using a dualfrequency radiofrequency source.Journal of Applied Physics，1992.71(4)：p.1838-1841)，以及沉积过程中产生等离子的频率或频率组合(Pearce，C.W.，et al.，Characteristics of silicon-nitride deposited by plasma-enhanced chemical vapor-deposition using a dual frequency radiofrequency source.Journal of Applied Physics，1992.71(4)：p.1838-1841；Cianci，E.，et al.，Dual frequency PECVD silicon nitride forfabrication of CMUTs′membranes.Sensors and Actuators a-Physical，2006.127(1)：p.80-87)。
尽管沉积温度可以用来部分调节应力，并通常是氮化物沉积过程中的一个自由参数，此处的工艺中优选在沉积温度300摄氏度下进行。其他合适的温度可以很容易地由业界技术人员决定。由于CNTs在氮化物沉积之前已经存在于芯片上，如果芯片在载入PECVD机器过程中被加热到远高于300摄氏度时，腔体内的氧气会使CNTs燃烧。而且，如业界所知，提高沉积温度会使残余应力增加。如本节后面所展示的，采用业界已知的标准流程，和沉积薄膜名义应力值相比，拉伸应力减小了。没有采用低于300摄氏度的温度，因为有报道显示当沉积温度朝着200摄氏度降低，观察到薄膜的质量变差，因为薄膜的孔隙度增加(Walmsley，B.A.，et al.，Effects of deposition temperature on the mechanical and physical properties of siliconnitride thin films.Journal of Applied Physics，2005.98(4)：p.6)。
确定了300摄氏度为优选的沉积温度之后，通过改变等离子体的频率特征来调节薄膜的应力。如Pearce等人报道(Pearce，C.W.，et al.，Characteristics of silicon-nitride deposited by plasma-enhanced chemical vapor-deposition using a dual frequencyradiofrequency source.Journal of Applied Physics，1992.71(4)：p.1838-1841)，采用两个射频发生器，一个在13.56MHz和一个在几百kHz，通过调整每个源的功率，可以改变薄膜内在应力。观察到低频激发有利于形成(N-H)氮-氢键，而氮-氢键和硅-氢(Si-H)键的相对数量会影响应力。随着低频功率的比例从50％增加到70％，薄膜应力平滑地从50MPa拉伸力过渡到150MPa压缩力。
所用的GSI PECVD机器有两个射频来源，一个在13.56MHz，另一个在300kHz，最大输出功率分别是1000W和200W。
与更高的温度相比，优选沉积参数为300摄氏度。与硅基片相比，优选熔融的二氧化硅基片。这些差别通过热膨胀特性的不匹配来影响薄膜的应力。低温沉积减少了不匹配的影响。报道的硅、熔融二氧化硅以及氮化硅的在327摄氏度下的线性热膨胀系数分别是3.7、0.5以及2.8 10-6K-1。温度从300摄氏度到20摄氏度的转变导致三种材料自身14％、9.3％以及2.4％的收缩(Thermal Expansion，NonmetallicSolids.Thermophyisical Properties of Matter，the TPRC Data Series.Vol.13.1977，IFIPlenum：NY，NY)。对于堆叠的材料，认为基片晶圆主导热收缩过程，而薄膜被迫使服从。
当在300摄氏度下沉积到硅晶圆上的一层氮化硅薄膜冷却到室温时，它被迫在一个方向收缩到原始长度的14％。这大于它本来可能经历的9.3％的线性压缩，如果它没有被固定在硅表面的话。这个热收缩不匹配使得薄膜具有一个比它原来自身所有的要高的压缩应力。
对于沉积到熔融二氧化硅晶圆上的氮化硅薄膜，效果是相反的。熔融二氧化硅基片在一个方向上仅仅收缩2.4％，而氮化物本身，由于冷却会收缩9.3％。因为氮化物不被允许完全松弛，与未固定于熔融二氧化硅相比，该薄膜具有更高的拉伸应力。
因此从300摄氏度冷却到25摄氏度对于沉积在硅上的和对于沉积在熔融二氧化硅上氮化物薄膜的应力的影响是相反的。
接下来考虑了微通道和纳米通道顶壁的各种类型的应力。以双钳樑模拟通道顶壁。在所有情况下通道的长度远大于通道的宽度和深度，因此沿着通道轴的方向的尺寸被忽略，而仅仅考虑横截面。根据氮化物薄膜的应力，樑受到力可导致其以几种不同的方式变形。例如，高压缩应力导致朝上或朝下垂直方向上的变形，如图18A和19A所示。在另一个极端，高拉伸应力薄膜不可避免地导致顶壁在沿着通道方向的很多点上裂开(数据未显示)。低拉伸应力薄膜代表了理想情况，但是如果该应力的数量级太小，樑不能抵抗任何制造步骤中干燥通道时由扩散力和/或作用在壁上的毛细管力所造成的变形。
为了确定合适的应力，研究了从高到低的拉伸应力。找到能同时避免裂开和坍塌的条件。在均匀的负载下，例如由顶壁和底部之间的扩散力所引起的，樑经历的最大的挠曲，z，定义为，
Figure BPA00001329213200561
其中，L是樑的长度(我们的例子中是纳米通道的宽度)，λ是负载，E是杨氏模量(应力的函数)，h是薄膜的高度(樑的厚度)。用这个公式作为指导，与应力相比，最大挠曲更强烈地取决于薄膜的厚度和通道跨越的距离。优选改变两个其他参数来制造在自身应力下既不会裂开，也不会坍塌的通道顶壁。
图18A-B展示了通道顶壁结构的变形。图18A展示了应力对弯曲的影响。图18B展示了在均匀的负载下，氮化物厚度和通道跨度对于弯曲的影响。
在图18B、19B和19C中，显示了在给定一个不变的内在应力条件下，樑的长度(通道宽度)和厚度对于坍塌可能性的影响。在这些测试之前，确定了会得到一个低拉伸应力的沉积参数，因此不会发生裂开。在图19B和图19C的图像中，沉积过程中采用了同样的频率组合。
在一个实施方式中，优选沉积参数为：高频功率19％(190W)，低频功率81％(162W)，沉积时间20分钟(＝2微米厚的薄膜)，最大通道宽度16微米。这得到一个小到可以忽略不计的通道裂开或坍塌的可能性，该通道有一个厚度为10纳米薄的铬牺牲层。也可以采用低于10纳米的铬层。对于厚度小于1000纳米的氮化物薄膜，没有发现能同时防止通道的坍塌和薄膜的裂开的应力程度。
图19A-C展示了各种显微照片，说明薄膜应力、厚度和通道宽度对通道完整性的影响。图19A展示了40微米宽的没有支撑柱的通道。采用纯低频沉积工艺以IPE CVD机器沉积这层薄膜，这层薄膜在一个高度压缩应力下。除去铬之后，顶壁发生了朝上和朝下的变形。左手边的显微照片是一个光学图像，其中不同深浅的灰(在光学图像中原本为色彩)和强度的变化来自于腔的高度的变化。右手边的图像是对于同一个通道的SEM扫描电子电镜显微图像。横跨左边图像的黑线代表轮廓测定法扫描的位置，其中发现顶壁的最大垂直挠曲是2微米。
图19B展示了通道宽度对于坍塌可能性的影响，可以通过观察单个具有各种壁和支撑柱之间空间的通道的图像看出。浅色的区域代表底部和顶壁之间为25纳米的空气间隙。深色区域代表直接接触下面的熔合二氧化硅基片的氮化物。最右边的浅灰色区域代表湿蚀刻停止之前还没有被除去的铬(25纳米厚)。
图19C展示的三条通道说明了氮化物厚度对坍塌可能性的影响。代表1650纳米厚薄膜的均匀的灰色阴影通道是唯一一个没有坍塌的。注意到在所有情况下，都采用断面扫描来核实某些特定部位的顶壁有没有坍塌。
碳纳米管生长
催化剂沉积。钴催化剂颗粒沉积到用光刻技术限定的区域，如标题为“装置制造工艺概述”的部分中的6.2.3部分中的实施例中所述。最终选择钴而不是铁作为催化剂是因为GSI PECVD机器的加工限制。然而在项目的初始阶段采用了铁催化剂。
根据对得到的几千张SEM图像的观察，采用钴催化剂长出的碳纳米管平均比用铁催化剂长出的要短和密度较小。钴催化剂生长和铁催化剂生长都得到足够密度的纳米管，其长度大于几个毫米。
纳米管装置产率
用6.1和6.2部分(实施例1和2)中所述的装置设计和步骤，观察到源漏电极被0-10个纳米管接通。每对电极对上实际的纳米管数量是随机的，并由泊松统计决定。罕见事件统计的概率质量函数是
f ( k , λ ) = λ k exp ( - λ ) k !
其中，在当前实施例中，f是一对源漏电极对有k连接它们的概率，如果连接源漏电极对的纳米管平均数量为λ。如果，例如，每对电极对连接纳米管平均数是λ＝1，那么一对给定电极对有正好是k＝1个连接的纳米管的概率是f＝e-1≈0.36，一对给定电极对没有连接的纳米管的可能性也是f＝e-1≈0.36，一对给定电极对上有多于一个连接纳米管的可能性也是f＝e-1≈0.36。
当在800摄氏度下进行乙烯生长工艺时，在给定装置几何构造和催化剂颗粒的条件下，只有大约10％的电极对没有连接的纳米管。当在750摄氏度下进行同样的工艺，没有超过噪音等级的电流的电极对的比例接近90％。这些生长是在在三周的时间段内(所以纳米管熔炉的温度很可能还没有偏离太多)，在从同一片晶圆切割出来的芯片上进行的(即，同样的催化工艺)。
在上述工艺中，温度调节可在一定程度上控制纳米管的产率。其他影响每个装置上纳米管连接数量的因素有催化剂和源漏电极板尺寸，源漏电极分开的距离，催化剂厚度，催化剂载体(三氧化二铝或熔融二氧化硅)，T型铂板的高度和铬牺牲层的高度。在整个工艺开发过程中调节了这些参数和其他参数，它们中的任何一个都可以用更加系统的方法来研究。
光刻
微(μ)DFAS对准标记
在任何基于多层光刻的工艺中，层间必须被精确地对准。在本实施例所描述的方法中，通过采用Autostep机器专用的系统来实现对准，微暗场对准系统(microDFAS或μDFAS)。为了使用这个系统，在晶圆上直接蚀刻等距间隔的标记的图案化层。在后续的对准和曝光步骤中，这些标记被用于把晶圆和Autostep的标度线对准。有几种可用的图案，每一种都能被microDFAS系统识别。选择一种适合我们的基片和光阻的图案对于良好的对准是至关重要的。图20A-D展示了三种可能的microDFAS图案的示意图(图20A-C)，和其中一个图案的明场图像(图20D)。
这些标记的暗场图像看上去十分不同。在暗场显微镜下，蚀刻掉的特征结构的边缘看上去最亮，通过比较图20D和图21A可以看出。在对准晶圆时，microDFAS系统采用每一个长方形的长边。在图21A中，长方形的边缘看上去非常清晰。如果对准标记看上去清晰，那么机器会比较容易进行精确的对准。通常，如果基片晶圆是硅，给特征结构涂上一层光阻剂不会影响暗场对准图案。在电探测器中，基片晶圆是熔融二氧化硅，它的折射率和光阻剂相似。因此当光阻剂不均匀地涂在蚀刻掉的长方形上，在暗场图像中边缘看上去被铺平了而不是清晰。原本明显的边缘被模糊，并移向每个长方形的中间部分。这导致了microDFAS系统差的对准标记信号和不一致的对准。
作为一个“长方形边缘”图案的替代，可以通过在原来长方形“边缘”所在处蚀刻小圆圈来定义一系列的线。这样，光阻剂不能使暗场图像严重失真，就像图21C-D所示的那样明显。采用这个图案使得用microDFAS系统获得好得多的对准效果。
图20A-D展示了各种可以和Autostep掩模对准器一起使用的microDFAS标记图案。图20A是正型“实心长方形”microDFAS标记的CAD图像的截图。阴影部分在光刻步骤中曝光并被蚀刻到基片晶圆上。每个长方形的宽是6微米，半节距也是6微米。
图20B是正型“分段线”microDFAS标记的CAD图像的截图。组成分段线的阴影小方块之间间隔大约2微米。分段线之间间隔6微米。
图20C是负型“实心长方形”microDFAS标记的CAD图像的截图。阴影部分在光刻步骤中曝光，并且被蚀刻到基片晶圆上。因此长方形没有被蚀刻，并且从表面上突起。没有展示负型版本的“分段线”图案。
图20D是蚀刻到熔融二氧化硅晶圆上的microDFAS标记的明场图像。这个标记是如图21A所示的“实心长方形”图案，其中长方形被蚀刻到晶圆中大于2微米。
图21A是蚀刻到熔融二氧化硅中的μDFAS标记图案1的暗场图像。图21B是SPR955 0.9光阻剂下μDFAS标记图案1的暗场图像。由于长方形蚀刻标记沟槽的不均匀填充，蚀刻标记线的边缘在暗场中变得模糊。图21C是蚀刻到熔融二氧化硅中的μDFAS标记图案2的暗场图像。图21D是SPR995 0.9光阻剂下μDFAS标记图案2的暗场图像。由于长方形蚀刻标记沟槽的不均匀填充，蚀刻标记线的边缘在暗场中变得模糊。然而，对于孔，这没有关系，因为整个孔被μDFAS系统看成是一个“边缘”。
LOR厚度和最小特征结构间距
工艺中有几个“主要步骤”采用了光刻电子束蒸发和掀离的组合。采用了这样一种方法，其中，采用了双层光阻，或更确切地，一层掀离光阻(LOR)和一层标准光阻层的组合。这个方法也产生清晰的金属边缘轮廓，但是不要求长的图像反转步骤，并且对于某些特定的图案允许更直接的掩模设计。
有几个版本的LOR可使用，其每一都有不同的粘度，并且旋涂到晶圆上时会产生不同厚度的LOR薄膜。对于大多数金属掀离应用，优选LOR 5A或10A，其产生的薄膜厚度范围分别为400-600纳米和900-1100纳米。通常LOR5A是测试过的粘度最小的剥离防蚀涂层。然而，如果图案上有相互间距小于一毫米的特征结构，那么可能需要一层更薄的LOR薄膜。
在显影过程中，光阻剂曝光部分快速溶解之后，直接位于光阻剂下的LOR被各向同性地蚀刻，立即形成倒凹。然而，要求继续蚀刻LOR，直到它从将要沉积金属的图案化的区域被完全清除掉。如果LOR厚度为500纳米，那么最小的横向倒凹是500纳米。对于两个间距小于1微米的特征结构，它们之间所有的LOR都被蚀刻掉。在最理想的情况下，这会得到一个悬空的光阻剂的桥，仍然可以用于掀离。这个情形被图22B所展示。然而经常性的，这个光阻剂的桥要么被扯掉，要么坍塌，不得不重新拍摄图案。
图22A-I展示了对于两种不同厚度LOR的光阻剂和掀离光阻(LOR)的剖面。左边一列图展示了100纳米厚的LOR在各种阶段的剖面。图22A中，准备了熔融二氧化硅晶圆，其上有100纳米LOR(下层)和900纳米光阻剂(上层)。图22B中，在曝光之后，晶圆被放入300MIF显影剂。起初，光阻剂中曝光的图案溶解。图22C展示了，在显影过程中，LOR被各向同性地蚀刻，其速度比曝光的光阻剂慢得多，但是比未曝光的光阻剂快得多。图22D中，用电子束蒸发沉积了一层金属薄层。图22E，准备了熔融二氧化硅晶圆，其上有500纳米LOR(下层)和900纳米光阻剂(上层)。
在图22F-I中，光阻剂被显影，并且LOR被各向同性地蚀刻。如果两个特征结构之间的间距是1000纳米或更少，那么这些特征结构之间的在光阻剂下面的LOR会被完全清除掉。因此有可能光阻剂层会坍塌或扯掉，从而影响蒸镀金属的图案。
因此，采用了一层厚度在100纳米数量级上的LOR层，如图22a所示。这是铂电极层的情况，因为源漏电极之间的间隙是大约1微米。
氮化物沉积对碳纳米管电学性能的影响
在有氧气存在的条件下，加热会使碳纳米管燃烧。相似地，氧等离子也会毁坏它们。开发本实施例中所述的制造工艺之前，有报道指出用热化学气相沉积法沉积氮化硅的过程中碳纳米管CNTs不会燃烧(Holt，J.K.，et al.，Fabrication of a carbonnanotube-embedded silicon nitride membrane for studies of nanometer-scale masstransport.Nano Letters，2004.4：p.2245-2250；Mizutani，T.，et al.，Effects of fabricationprocess on current-voltage characteristics of carbon nanotube field effect transistors.Japanese Journal of Applied Physics Part 1-Regular Papers Short Notes & Review Papers，2005.44(4A)：p.1599-1602)。此外，一个小组报道了碳纳米管也可以承受PECVD氮化物沉积，但另一个小组报道了等离子增强化学气相沉积PECVD会立刻毁坏纳米管，所以用热化学气相沉积来代替。
尽管我们在CNF中不能使用热化学气相沉积炉(材料限制)，我们可以使用GSI PECVD，如上面提到的。这是选择氮化硅作为覆盖材料的一部分原因。覆盖材料是沉积在铬牺牲层上面的材料。当后续蚀刻掉铬的时候，这个覆盖材料成为纳米通道或微通道的顶壁。
通过工艺开发，证实了碳纳米管可以承受等离子增强化学气相沉积PECVD氮化硅沉积的报导，但是只在某些特定的工艺限制下。在观察到碳纳米管继续存在时，在氮化物沉积过程中仅使用了高频RF等离子。然而，当前工艺要求必须使用低频RF等离子来制造出低拉伸应力的氮化物薄膜。为了使氮化物薄膜(覆盖层)力学上稳定(不裂开或坍塌)，在氮化物沉积过程中大部分时间必须使用低频RF等离子。
只有低频RF等离子氮化物沉积会产生具有合适的力学性能的氮化物。然而，发现低频RF等离子会毁坏纳米管。因此，首先采用一个短暂的高频RF沉积来产生一层氮化物薄层盖住纳米管而不毁坏它们。高频RF等离子不影响纳米管。一旦它们被少量氮化物保护，就可以使用低频RF等离子来沉积剩下的氮化物薄膜。这样，氮化物覆盖层具有理想的力学性质，但是纳米管没有被毁坏。对于纯高频RFPECVD氮化物沉积，单个碳纳米管看来似乎既提高也降低它们的电导率，然而许多纳米管的平均电导率没有显著的改变。这是由纳米管表面和附着在沉积的氮化硅上的电荷之间的相互作用，去除水蒸汽，或从碳纳米管CNT表面去除氧气所造成的(Mizutani，T.，et al.，Effects of fabrication process on current-voltage characteristicsof carbon nanotube field effect transistors.Japanese Journal of Applied Physics Part 1-Regular Papers Short Notes & Review Papers，2005.44(4A)：p.1599-1602；Kojima，A.，et al.，Air stable n-type top gate carbon nanotube filed effect transistors with siliconnitride insulator deposited by thermal chemical vapor deposition.Japanese Journal ofApplied Physics Part 2-Letters & Express Letters，2005.44(8-11)：p.L328-L330；Chen，B.H.，et al.，A carbon nanotube field effect transistor with tunable conduction-type byelectrostatic effects.Solid-State Electronics，2006.50(7-8)：p.1341-1348)。随着低频RF等离子功率的增加，单个的和平均纳米管电导率会急剧下降。而且，这个电导率的下降只会在氮化物沉积开始的几秒钟发生。一段短暂的沉积之后，接下来的任何氮化物沉积都不会导致纳米管电导率的改变，无论采用什么沉积时间或频率。
纳米管毁坏的机理是在低频电磁场作用下被加速进入基片表面的离子的物理轰击。一旦纳米管最初被氮化物层覆盖住，它们看起来似乎受到保护而免于进一步的破坏。因此，按以下步骤在碳纳米管上沉积氮化硅。
首先，用高频等离子在一段很短的时间内沉积一层氮化硅薄膜。在5秒内沉积了10纳米氮化物。沉积了这层高应力薄膜之后，用双频等离子沉积一层低应力氮化物厚层。20分钟沉积得到一层低应力薄膜，厚度为2微米，并且其具有微和纳米通道壁/顶壁材料所要求的力学性质。
6.3实施例3：包括集成了碳纳米管的纳米流体通道的装置的详细制造流程
以下是一个制造流程的实施例，本实施例是基于6.2部分(实施例2)中所述的制造电探测器的方法来实施的。
步骤1：制造对准层
1.预处理：
a.得到三片直径为100毫米，厚度为170微米的熔融二氧化硅晶圆。(Mark Optics)晶圆的伤痕亮点参数应该等于或小于40/20，RMS表面粗糙度应该＜20埃。
b.用金刚石划片器将晶圆号码刻到晶圆的背面。
c.用一个自动离心-润洗-干燥机器清洁晶片。
2.光阻剂制备
a.p-20助粘剂；用3000RPM速度离心，5000R/S，45秒
b.SPR 2203.0光阻剂；用3000RPM速度离心，5000R/S，45秒
c.在加热板上用115摄氏度烘烤2分钟。
3.在Autostep掩模对准器中进行光刻
a.将所需的光刻掩模装入到掩模对准器。
b.曝光0.3秒
c.曝光后在115摄氏度下烘烤2分钟
d.通过手动浸泡和搅拌，在300MIF中显影90秒。
4.反应离子蚀刻(Oxford 80#1或Oxford80#2)
a.用20秒氧等离子在150W下清除晶圆浮渣
b.CHF3/O2氧化物配方；蚀刻59分钟(Oxford 80#1)或1小时20分钟(Oxford 80#2)
c.用40秒氧等离子在150W下除去含氟高分子聚合物
5.光阻去除。用热光阻去除剂浴清洁晶片～2小时，接着离心-润洗-干燥。
步骤2：Pt/Ti电极层
1.光阻剂准备：
a.p-20助粘剂；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
b.LOR 1A(掀离光阻剂lift off resist)；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
c.在加热板上用180摄氏度烘烤5分钟。
d.SPR 9550.9光阻剂；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
e.在加热板上用100摄氏度烘烤2分钟。
2.光刻
a.将所需的掩模装入掩模对准器。
b.曝光0.14秒。
c.曝光后在115摄氏度下烘烤2分钟
d.通过手动浸泡和搅拌在300MIF中显影60秒。
3.除去浮渣(Branson)：进行标准光阻剂去除浮渣操作1分钟。
4.Ti/Pt的电子束蒸发(偶数小时或奇数小时蒸发器)
a.装入样品，钛金属块，铂金属块，和新的石英晶体监控器QCM
b.用0.2-0.4埃/秒的速度蒸发4纳米钛
c.用0.2-0.4埃/秒的速度蒸发30纳米铂
5.Ti/Pt掀离
a.将晶片放入“1165”Microposit去除剂中并放置过夜
b.(第二天)声波处理20-30分钟，将晶片转移到IPA中，从IPA中取出并用氮气干燥。
步骤3：以氧化铝为载体的钴催化层
1.光阻剂制备：
a.p-20助粘剂；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
b.LOR 1A(掀离光阻剂)；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
c.在加热板上用180摄氏度烘烤5分钟。
d.SPR 9550.9光阻剂；用4000RPM速度离心，5000R/S，45秒
e.在加热板上用100摄氏度烘烤2分钟。
2.光刻
a.将所需的掩模装入掩模对准器。
b.曝光0.14秒。
c.曝光后在115摄氏度下烘烤2分钟
d.通过手动浸泡和搅拌在300MIF中显影75秒。
3.除去浮渣(Branson)：运行标准光阻剂去除浮渣操作1分钟。
a.以Al2O3为载体的钴催化剂的电子束蒸发
b.装入样品，钛金属块，氧化铝钴金属块，和新的QCM
c.用0.1埃/秒的速度蒸发0.3纳米钛
d.用0.2-0.4埃/秒的速度蒸发15纳米氧化铝
e.用0.1埃/秒的速度蒸发0.25纳米钴
4.负载的催化剂的掀离
a.将晶片放入“1165”Microposit去除剂中放置过夜
b.(第二天)声波处理20-30分钟，将晶片转移到IPA中，从IPA中取出并用氮气干燥。
步骤4：晶圆切割
1.光阻剂制备(保护特征结构不被切割碎片破坏)：
a.SPR 220 7.0光阻剂；用2000RPM速度离心，1000R/S，45秒
b.在加热板上用115摄氏度烘烤2分钟。
2.切割(晶圆锯)
a.将晶片切成20毫米x20毫米的方块
b.从芯片上剥下胶带。在芯片上刻上标签。
3.光阻去除
a.将芯片放入“1165”Microposit去除剂中并放置几个小时或更长时间。
b.声波处理20-30分钟，将晶片转移到IPA中，从IPA中取出并用氮气干燥。
步骤5：碳纳米管生长
1.单壁碳纳米管的CVD生长：
a.在900摄氏度烘烤每个部分10分钟来清洁炉管。冷却到500摄氏度。
b.在炉中心的管中插入三片芯片。在500摄氏度和大气压下(管末端敞开)烘烤30分钟煅烧芯片。冷却到室温(炉温度计＜100摄氏度)。
c.将输气管接到炉管末端，通入室温下的工艺气体来除掉系统中的氧气。用电子气体流量控制器，通入以下气体～10分钟：
i.0.8SLM氩气
ii.0.2SLM氢气
iii.5.5SCCM乙烯
d.关掉乙烯，继续通入氩气和氢气。升高温度到700摄氏度并保持30分钟。这一步骤的目的在于还原催化剂。
e.升高温度到800摄氏度，等待3分钟。
f.在保持氢气和氩气的同时加入乙烯。保持10分钟。这是CNT生长阶段。
g.减少乙烯。降低温度到室温，同时保持氢气和氩气流量。
h.关掉所有的气体，打开熔炉试管末端并取出芯片。将芯片放在导电箱中，来减少静电荷聚集的可能性。
2.探针台测量(可选的)。在这个阶段优选对每个芯片的感应区域(在该实施例中有38个感应区域)进行直流源漏电极测量。大约一个小时可以测试3或4块芯片。
a.进行测量之前，采取措施来降低静电荷毁坏纳米管的可能性。确保房间的相对湿度是大约45％。用台式去离子器。单独将每一个漏极通过一个10giga-ohm千兆欧姆的电阻串联接地。如果静电荷已经聚集，这最后一步有助于缓慢将其驱散。
b.也可能在这个时候以电解质门控纳米管，用一滴盐水和一个第三栅电极。如果这步已经完成，确保在干燥之前用去离子水润洗芯片。
步骤6：氮化硅薄层
1.GSI PECVD沉积氮化硅“保护”薄层。首先使用具有以下改变的“高应力氮化物”配方。
a.温度＝300摄氏度
b.RF#1＝35％功率；RF#2＝0％功率
c.沉积时间在2秒到5秒之间。
2.接下来用具有以下改变的“低应力氮化物”配方。
a.温度＝300摄氏度
b.RF#1＝35％功率；RF#2＝0％功率
c.沉积时间在5秒到10秒之间，取决于所需的氮化物保护层的厚度。
步骤7：微通道/纳米通道铬牺牲层
1.光阻剂制备：
a.p-20助粘剂；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
b.LOR 1A(掀离光阻剂)；用4000RPM速度离心，10000R/S，45秒
c.在加热板上用180摄氏度烘烤5分钟。
d.SPR 955 0.9光阻剂；用4000RPM速度离心，5000R/S，45秒
e.在加热板上用100摄氏度烘烤2分钟。
2.光刻
a.将所需的掩模装入掩模对准器。
b.曝光0.14秒。
c.曝光后在115摄氏度下烘烤2分钟
d.通过手动浸泡和搅拌在300MIF中显影75秒。
3.除去浮渣(Branson)：进行标准光阻剂去除浮渣操作1分钟。
4.铬的电子束蒸镀(偶数小时或奇数小时蒸发器)
a.装入样品、铬、和新的QCM
b.用0.2-0.4埃/秒的速度蒸镀10纳米铬
5.铬的掀离
a.将晶片放入“1165”Microposit去除剂中并放置过夜
b.(第二天)声波处理20-30分钟，将晶片转移到IPA中，从IPA中取出并用氮气干燥。
步骤8：氮化硅厚层
GSI PECVD沉积氮化硅厚层。使用具有以下改变的低应力氮化物配方(业界已知有很多适用版本)：
a.温度＝300摄氏度
b.RF#1＝35％功率；RF#2＝0％功率
c.沉积5秒。这得到一层保护CNT的薄膜。
d.RF#1＝19％功率；RF#2＝80％功率
e.沉积20分钟。这得到大约2微米的氮化物。
步骤9：穿露孔层#1
1.光阻剂制备：
a.p-20助粘剂；用3000RPM速度离心，5000R/S，45秒
b.SPR 2203.0光阻剂；用3000RPM速度离心，5000R/S，45秒
c.在加热板上用115摄氏度烘烤2分钟。
2.光刻
a.将所需的掩模装入掩模对准器。
b.曝光0.3秒；0.36秒和0.3秒。
c.曝光后在115摄氏度下烘烤2分钟
d.通过手动浸泡和搅拌在300MIF中显影90秒。
3.反应离子蚀刻(Oxford 80#1或Oxford80#2)
a.用20秒150W的氧等离子清除晶圆浮渣
b.CHF3/O2氮化物配方；蚀刻40分钟(Oxford 80#2)
c.用40秒150W的氧等离子除去含氟高分子聚合物
4.光阻去除。用“1165”Microposit去除剂清洁晶圆。浸泡几个小时或过夜。
转移到IPA中，然后用氮气干燥。
步骤10：铬牺牲层材料的湿化学蚀刻
1.将芯片放在Cr-14铬蚀刻剂中。蚀刻6-8小时或过夜。
2.将芯片转移到一个装有去离子水的烧杯中。将装有芯片的去离子水烧杯移至光阻罩中。让芯片浸泡15-30分钟。
3.将芯片转移到一个装有IPA的烧杯中。浸泡5分钟。取出并用氮气干燥，然后对芯片做电学测量，或继续以下步骤11，第2子步骤，而不经过转移至IPA和干燥。
步骤11：氮化物保护薄层的湿化学蚀刻
1.将芯片插入一个装有IPA的烧杯中。浸泡5分钟。
2.将芯片转移到一个装有去离子水的烧杯中。将芯片转移到一个装有MF312(5％TMAH)的烧杯中
3.将装有芯片的烧杯移到一个通风橱中。
4.将芯片转移到一个加热的装有MF312的烧杯中(该烧杯应当预先加热到70摄氏度)。在70摄氏度下蚀刻20-60分钟，根据必须除去的氮化物保护层的厚度决定。
5.将芯片转移到装有去离子水的烧杯中。将装有芯片的去离子水烧杯移到光阻罩(photoresist hood)中。将芯片转移到装有IPA异丙醇的烧杯中。浸泡5分钟。取出并用氮气干燥，然后对芯片进行电学DC直流测量。
步骤12：氮化硅薄层#2的沉积
1.GSI PECVD沉积氮化硅“保护”薄层。使用具有以下改变的低应力氮化物配方。
2.温度＝300摄氏度
3.RF#1＝19％功率；RF#2＝80％功率
4.沉积时间＝5分钟。
步骤13：穿露孔层#2
1.光阻剂制备：
a.p-20助粘剂；用3000RPM速度离心，5000R/S，45秒
b.SPR 220 3.0光阻剂；用3000RPM速度离心，5000R/S，45秒
c.在加热板上用115摄氏度烘烤2分钟。
2.光刻
a.将所需的掩模装入掩模对准器。
b.曝光0.3秒
c.曝光后在115摄氏度下烘烤2分钟
d.通过手动浸泡和搅拌在300MIF中显影90秒。
3.反应离子蚀刻(Oxford 80#1或Oxford80#2)
a.用20秒150W的氧等离子清除晶片浮渣
b.CHF3/O2氮化物配方；蚀刻5-7分钟(Oxford 80#1)或7-9分钟(Oxford 80#2)
c.用40秒150W的氧等离子除去含氟高分子聚合物
4.光阻去除。用“1165”Microposit去除剂清洁晶片。浸泡几个小时或过夜。
转移到IPA异丙醇中，然后用氮气干燥。
步骤14：宏观储液池的连接。
1.用一个金刚石划线器在每个微通道末端刻划开口。
2.用刀片割下加样器枪头的末端以制造出六个储液池。
3.把RTV密封剂粘在每个加样器枪头的底部边缘上，然后把它按到微通道末端的表面上。
6.4例子4：利用硅纳米线晶体管的单细胞对microRNA的表达的快速及超灵敏探测
6.4.1概述
研究人员最近发现，被称为microRNA(miRNA)的小核糖核酸分子的表达可用于准确地对人类癌症进行分类，从而协助治疗。但是检测这些存在于复杂组织中单个细胞内的癌症标记比较困难。这一实施例描述了通过结合纳米技术和微流体技术而建立的革新技术，使研究和临床工作者能够快速、灵敏地测量单个细胞中miRNA的表达。微流体技术与硅纳米线电子传感器的组合被用于快速、超灵敏、多路复用检测miRNA在来自组织样本的单个细胞中的表达。
业界已知microRNA的表达与各种人类癌症有关，并且microRNA可以作为肿瘤抑制因子和原癌基因。如本例所示，基于单个细胞microRNA的表达来区别良性肿瘤和恶性肿瘤是一个在癌症研究、诊断和治疗过程中的强大工具。本实施例展示了一种将微流体技术和硅纳米线电子感应器结合的强大技术，以利用来自组织样本的单个细胞进行快速、超灵敏、多路复用的miRNA的表达的探测。已经建立的使用标准化互补金属氧化物半导体(CMOS)兼容技术的“自上而下的纳米加工技术可用于高效地构建可复写的半导体硅纳米线晶体管阵列。以商业化的寡核苷酸探针官能化这些纳米线，所述寡核苷酸探针可与和癌症形成有关的miRNA或其相应的互补DNA(cDNA)相结合。纳米线与目标miRNA的微流体输送通道相结合使得实时、超灵敏的miRNA表达的电子检测成为可能。
硅纳米线已经被证明对DNA(Gao Z，et al.″Silicon Nanowire Arrays forLabel-Free Detection of DNA.″Analytical Chemistry，2007：3291-3297；HahmJ，Lieber CM.″Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNAsequence variations using nanowire nanosensors.″Nano Letters，2004：51-54)、蛋白质(Stern E，et al.″Label-free immunodetection with CMOS-compatible semiconducting nanowires.″Nature，2007：519-522)以及单个病毒(Patolsky F.et al.″Electrical detection of single viruses.″Proc Natl Acad SciUSA，2004：14017-1402)的无标记探测非常灵敏，这是因为硅纳米线的表面体积比很高，因此他们的载流子迁移率可以被表面微小的电势变化所调节。与实时定量聚合酶链式反应相比，本实施例所述方法有两个主要优点：它不需要潜在的逆转录的cDNA的偏选扩增，同时与荧光检测相比，电探测提供了更可靠、简单的设备护理的方法。此外，还可以加装单独的微流体装置，用于在逆转录的cDNA送达电荷感应芯片后进行所有的单个细胞样本的准备。业界已知的纳米加工技术用于有效构建可复写的硅纳米线晶体管阵列。这些纳米线分别以商业化的寡核苷酸探针官能化，所述寡核苷酸可与癌症形成相关的miRNA结合。将微流体传送通道与纳米线结合来探测目标microRNA使得实时、超灵敏地电探测microRNA的表达成为可能。
首先，纳米光刻工具被用于制造包含数百个纳米线传感器芯片的硅晶圆。该工艺以标准的半导体加工技术优化，其提供了出色的重现性，并允许电读出线路直接集成在芯片中。纳米线晶体管的电子特性使得可以在最大化几何特性的同时限制噪声来表征。
第二，微流体通道网络被集成到传感器芯片上，以可控地把探针和目标miRNA送达到不同区域以进行多路复用检测。用业界已知的荧光和电结合分析技术可以确定特定寡核苷酸探针官能化纳米线表面的能力。
第三，对决定纳米线传感器性能极限的关键因素进行了系统研究。这些因素包括可探测的miRNA的最低量，以及对于给定的浓度、选择性以及交叉反应性的变化，装置响应的变化。
第四，开发出了单独的微流体装置，以操纵、裂解、从单个细胞中提取microRNA，并随后传输到电荷感应芯片。因此，通过结合在纳米电子学和微流体学最新最先进的技术，发出了一种强大的传感器，其可以无标记地电分析单个细胞中microRNA表达，并且所有处理步骤都集成在芯片上。
该技术与现有技术相比具有显著的进步性，因为它提供了无潜在的偏选扩增步骤的敏感探测，大大减少了昂贵试剂的使用量，而且携带方便。通过开发一种用于现场检验的系统来检测复杂癌症组织中miRNA的表达。本发明在本实施例中描述的实施方式将有助于协助癌症早期诊断及预测。
6.4.2简介
MicroRNA(miRNAs)是新近发现的一类非编码蛋白的RNA，它由调节基因表达的一22个核苷酸组成(Ambros V.2003，Cell，Vol.113，pp.673-676)。在过去的五年里，研究人员发现，少量基因的microRNA表达谱可用于识别实体肿瘤癌症(Lu J，et al.″MicroRNA expression profiles classify human cancers.″Nature 435，no.7043(2005)：834-838；Volinia S，et al.″A microRNAexpression signature of human solid tumors defines cancer gene targets.″Proc Natl Acad Sciences USA 103，no.7(2006)：2257-2261)，也可以用于解决一个重要的临床问题，识别出其中发生未知来源的癌症的组织(Rosenfeld N，etal.″MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin.″NatureBiotechnology 26，no.4(2008)：462-469)。研究显示在各种不同肿瘤中miRNA的表达可作为癌症诊断和治疗的强大工具(Esquela-Kerscher A，Slack FJ.″Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.″Nature Reviews Cancer，2006：259-269)。本实施例描述了包括半导体硅纳米线晶体管的芯片的研发，以快速超灵敏地探测从复杂的组织中提取的单细胞中miRNA谱。可灵敏、快速地检测来自复杂肿瘤组织单细胞中的miRNA的表达的电探测器将对某些癌症的早期诊断、预后以及治疗产生重大影响。
比如，在美国胰腺癌是第四大致死癌症，其预后也是所有癌症中最差的，这反应出我们不能够在早期发现它并缺乏有效治疗(Oliveira-Cunha M，SiriwardenaAK，Byers R.″Molecular Diagnosis in Pancreatic Cancer.″DiagnosticHistopathology，2008：214-222)。一个miRNA的标签已被确定可用于区别于正常良性胰腺肿瘤与胰腺癌(Lee EJ，et al.″Expression profiling identifiesmicroRNA signature in pancreatic cancer.″International Journal of Cancer，2007：1046-1054)。但是用于确定这种标签的方法针对每个个体需要含有成千上万的细胞的起始样本。由于有越来越多的证据表明miRNA表达的改变与慢性淋巴细胞白血病(Calin GA，et al.″MicroRNA profiling revelas distinct signaturesin B cell chronic lymphocytic leukemias.″Proc Natl Acad Sci USA，2004：11755-11760)、大肠癌(Miachel MZ，et al.″Reduced accumulation of specificmicroRNAs in colorectal neoplasia.″Mol Cancer Res，2003：882-831)、肺癌(Johnson S，et al.″RAS is regulated by the let-7microRNA family.″Cell，2005：635-647)、乳腺癌(Iorio MV，et al.″MicroRNA gene expressionderegulation in human breast cancer.″Cancer Res，2005：7065-7070)以及甲状腺癌(He H，et al.″The role of microRNA genes in papillary thyroidcarcinoma.″Proc Natl Acad Sci USA，2005：19075-19080)等都有关联。因此，如果能够实时测量单个细胞中独特的miRNA的标签，将为癌症研究和临床提供一个不可缺少的工具。仅需要单个细胞的感应装置也将给癌症研究人员提供一个独特的工具，使得对肿瘤动物模型中miRNA的表达随时间的发展的研究具有更高的保真度。此外，传感器的便携性(芯片约1厘米乘1厘米，仅在读出数据的时候需要与计算机通过导线连接)以及可以仅在几十分钟内测量几乎不可觉察的微量miRNA数量的能力使其比任何现有技术都更适用于现场检验装置。因此，本发明该实施例中描述的实施方式将对癌症科学领域产生重要影响。此外，miRNA也显示与其它人类疾病的发病机制相关，包括神经退行性疾病，病毒病，糖尿病和肥胖(Weiler J，et al.″Anti-miRNA oligonucleotides(AMOs)：ammunition totarget miRNAs implicated in human disease？″Gene Therapy，2006：496-502)。
6.4.3研究设计
使用标准半导体技术以氧化物上硅晶圆制造包括半导体硅纳米线阵列的芯片采用CMOS工艺制造含有半导体硅纳米线的芯片。采用纳米光刻工具自上而下制造晶圆，其每一都包含几百个纳米线传感器芯片。以标准半导体处理技术优化了这一工艺，标准半导体处理技术提供了出色的重现性并允许芯片直接集成电读出电路。纳米线晶体管的电子特性使得可以确定最大化其跨导的几何性质(主要是宽度和高度)，并同时限制噪声。
将含有不同横向尺寸纳米线的样品芯片以标准方法进行电子测试。在利用液体和固体栅比较晶体管的性能之后，发现具有较宽纳米线(约500nm)的芯片有潜力与具有细纳米线(100纳米以下)的芯片具备同样的性能。这样就可以采用分步光刻技术制造芯片，而不是采用用于制造细线样品的更昂贵和费时的电子束光刻技术制造。利用标准的和已知的技术构造了用于既时读出纳米线通道的放大器和控制软件。
将微流体通道网络集成到芯片上
微流体通道被集成到芯片上，用于受控运输探针和目标miRNA到可寻址区域，从而可进行多路复用检测。通道的设计和制造是通过使用标准的已知的方法完成的。利用光刻技术和光阻剂直接热粘合至玻璃罩晶圆上，把微流体通道集成到芯片上。利用标准的已知的方法制造并优化与不同纳米线单独对应的阀门。
利用标准的荧光和电结合测定确定了以特定寡核苷酸探针官能化硅烷化后的纳米线表面的能力。用于官能化纳米线的硅烷化程序为业界已知，而探针结合至纳米线可以使用标准方法来证实。
测定纳米线传感器的性能极限
纳米线传感器进行多路复用miRNA检测的性能极限被系统地测定，同时对胰腺癌肿瘤细胞系的miRNA表达谱进行测量。性能因素包括最低可探测到的miRNA的量、设备对于诸如特定miRNA的浓度变化、选择性变化、交叉反应变化所产生的反应以及同时可探测到的不同miRNA的数量。使用胰腺肿瘤细胞系，电荷传感器在测定胰腺癌中16种最异常表达的miRNAs时的性能(Lee EJ，et al.″Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.″InternationalJournal of Cancer，2007：1046-1054)与Northern印迹法和定量PCR的结果相比较。
开发单独的微流体输送装置
开发了单独的微流体装置用于操纵、裂解和提取单细胞中的miRNA，以随后输送至电荷传感器芯片。使用软光刻技术制造了具有不同阀调机制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，并可以将单个细胞从储液池运输到萃取室进行细胞裂解。微流体通道的构建和软气动阀的集成是利用业界已知的标准方法实现的。
使用标准方法将miRNA逆转录成cDNA。电泳驱动cDNA通过纳米毛细管电泳分离通道，以在此描述的方法测量cDNA的迁移率，然后cDNA被转移到电荷传感器芯片进行后续量化。
6.4.4方法
开发了由半导体硅纳米线组成的芯片，用于实时和超灵敏地检测来自复杂组织单个细胞的miRNA。与表面结合组合的半导体纳米线提供了一个强大的无标记检测方法，其对生命科学的应用非常有吸引力。该芯片包含了独立可寻址的半导体硅纳米线，这些纳米线已经被寡核苷酸探针(Invitrogen)官能化，这些探针用于结合由miRNA逆转录过来的互补DNA(cDNA)。该检测方法依赖于纳米线作为场效应晶体管的能力，即当目标分子和探针分子杂交的时候，因其表面电势的细微变化而呈现电导率的变化。纳米线的灵敏度产生结果，因为其表面电势(称为门控)的变化会导致纳米线整个横截面内的电荷载流子的枯竭或积累。
图23是一个纳米线感应装置的示意图。经寡核苷酸探针官能化用于miRNA检测(浅灰色的S曲线)的半导体硅纳米线(暗灰色圆柱)，其通过铂探针电极连接在硅绝缘体芯片上。一个银参比电极被插入微流体通道的电解质溶液中，并且所有导线都连接到测量电流随时间变化的计算机。当目标cDNA分子结合到纳米线上并改变局部静电势，电流会显著地改变。实际上，电荷传感器芯片与无铅芯片载体是用导线连接，并被插入定制的放大器，使用一根电缆将芯片连接到计算机。
业界已知半导体硅纳米线是通过场效应机制，感应低于飞摩尔级浓度的DNA，并且只要求10-21摩尔的起始原料(6)。
目前有两种大概的方法用于生产硅纳米线，通常称为“自上而下”或“自下而上”法。自下而上的方法依赖于某些原子和分子的根据受控化学反应自组装为更复杂结构的能力。自上而下的方法从大块材料开始，并使用纳米加工机械图案化并蚀刻材料成为所需的纳米结构。自下而上的方法已经实现了超灵敏无标签探测生物物类，比如DNA(Hahm J，Lieber CM.″Direct ultrasensitive electrical detection of DNAand DNA sequence variations using nanowire nanosensors.″Nano Letters，2004：51-54)、蛋白质(Cui Y，Lieber CM.″Functional nanoscale electronic devices assembledusing silicon nanowire building blocks.″Science，2001：851-853)以及病毒(PatolskyF，et al.″Electrical detection of single viruses.″Proc Natl Acad Sci USA，2004：14017-1402)。然而，该方法依赖于将事先合成的纳米线转移到预定义电触点的晶圆上。由于无法在一个准确位置上合成纳米线，所以每个晶圆的装置的产率以及性能都是不同的。大规模生产单独可寻址硅纳米线用于多路复用传感需要均匀的和可重复的工艺，其每个芯片上纳米线的产率高，并且具有相似的电学性能。
因此，能够与互补金属氧化物半导体制造(CMOS)技术兼容的自上而下制造纳米线的方法是优选的。这意味着该芯片可以在任何半导体工厂以低成本进行批量生产。本发明的半导体纳米线传感器不同于DNA微阵列芯片，在一些方面，DNA微阵列芯片已是基因组RNA表达测量的主力。主要区别是，在硅纳米线中，目标和探针核酸的结合直接改变通过硅纳米线的电流(通畅为微安或纳安)，而这一电流改变是可以实时监控的。纳米线传感器更具优势，因为它无需为了读出数据以荧光标记目标，这是因为它测量杂交引起的电势改变。这意味着激光器、光谱过滤器以及成像设备等原来微阵列测量必需的设备，现在被连接纳米线芯片和计算机的导线所取代。
在另一实施方式中，如图24所示，电装置包括微流体通道系统用于定量的单个分子分析(见6.1部分)，其与纳米线阵列连接。微流体通道网络可以提供多路复用探测，这是因为空间上分离的纳米线可以有选择性地以针对给定miRNA的探针官能化。由于硅纳米线具有原生氧化膜，现有的关于连接核酸探针至二氧化硅或玻璃表面的化学的大量信息可用于纳米线的修饰。例如，硅烷化程序可用于纳米线的官能化(19)。包含比如4个、8个以及16个并行的具有共同的输入和输出储液池的微流体通道的芯片被设计成如此，使得可以连接单个注射泵以实现所有流体操作(见图25)。包含一个到几千个并行的微通道的芯片都在设想范围内。结合接触式光刻和SU-8光阻剂制造通道，该技术为业界已知已知，并且以简单的机械阀流经给定区域的流体。
图24(左图)是一个100毫米直径的熔融二氧化硅晶圆的照片，其包含27个装置，每一装置由16个用于单个分子分析的流体通道的并行阵列组成。加装流体接口(晶片左侧)以与通向通道的储液池连接。图24(中)是纳米通道阵列装置的示意图。(A)由两个熔融二氧化硅晶圆(a，b)粘合构成的装置的横截面图，上层晶圆具有纳米结构。微通道接通纳米通道和储液池(c)之间的界面。与通道的电连接是通过铂电极(d)实现的。(B)上层晶圆上纳米通道阵列的近景。图中展示了DNA分子已被引至上样区(a)，当它们进入纳米通道(b)时，以及在纳米通道中处于拉伸至平衡构像(c)。中图来自Mannion et al，Biophys.J.90，12(2006)。
图24(右图)是一个自上而下扫描纳米通道阵列(c)的电子显微照片，以及一个尺寸为150×135纳米(宽x高)的单个纳米通道(d)的放大图。图像(c)和(d)中的比例尺分别为920nm和195nm。右图来自Levy et al.，Nano Lett.8，11(2008)。
图25是纳米线传感器芯片上的微流体网络的示意图。在此实施方式中，其包括8个平行的通道与共同的入口和出口储液池连接。在芯片的中心部分的矩形表示半导体纳米线阵列所在的区域。芯片边缘的矩形连接到每一纳米线(未显示)的源极和漏极区域，并供线连接芯片与集成电路。该芯片每边约一公分，可以被装进定制的放大器。
微流体通道网络可以显著减少杂交所需的时间(相对于微孔而言)，因为它将目标限制在探针周围几十微米的范围内。根据芯片的几何尺寸、目标浓度以及对反应与扩散限制动力学的考虑确定流过通道的目标溶液的最佳流速，以在几分钟内达到平衡(Squires T，Messinger R，Manalis S.″Making it stick：convection，reaction，anddiffusion ni surface-based sensors.″Nature Biotechnology，2008：417-426)。微流体通道的使用使得芯片上的内部体积只在几纳升范围内，这有助于降低测量所需的昂贵的试剂的用量。
我们还开发了独立的微流体装置，用于处理、裂解、逆转录以及从单个细胞收集miRNA，随后将其输送至电荷传感器芯片。在阐述制造工艺之前，现将本发明的传感器和现有技术进行对比。如前所述，微阵列DNA芯片是目前最强大的和广泛使用的用于确定全基因组miRNA表达的方法之一。然而，最初所需的RNA是在微克级别，所以该技术不适用于单个细胞的定量分析。
Northern印迹是一个比较老的测量RNA表达的方法，相当费时而且需要使用放射性物质，并且它还缺乏对实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)的敏感度。
RT-qPCR经常被描述为敏感的RNA定量的黄金标准。这种技术可以测量单个细胞RNA的表达，并提供了一个宽动态范围，并且它与我们的电荷传感器在性能上最具可比性。RT-qPCR方法由以下步骤组成：通过逆转录产生RNA的单链cDNA复制，用PCR对cDNA进行扩增，以及实时定量检测cDNA产物。电荷传感器和RT-qPCR有共同的初始步骤(但也由于引物的不同而有很多变化)，即逆转录RNA。然而，从文献中我们了解到利用PCR扩增cDNA有很多问题，由于电荷传感器方法具有超灵敏的探测单个结合事件的能力而避免了这些问题(Bustin S，Nolan T.″Pitfalls of Quantitative Real Time Reverse-Transcription Polymerase ChainReaction.″Journal of Biomolecular Techniques，2004：155-166)。在生物样本中经常会发现的抑制成分可能导致PCR扩增循环的敏感性和动力学显著降低，这就会造成假阴性结果。此外，任何低丰度的cDNA的可重现量化都是有问题的，原因是在复杂的核酸混合物中扩增少量cDNA本身就有很多变数。这也被称为“蒙特卡罗”效应，既指模板的丰度越低，扩增之后所反应的丰度与实际差别越大(KarrerEE，et al.″In situ isolation of mRNA from individual plant cells：Creation of cell-specificcDNA libraries.″Proc Natl Acad Sci USA，1995：3814-3818)。
实施RT-qPCR方法的标准程序通常共需要约15小时；其中大约有一半的时间花在确定抑制剂、优化PCR步骤以及进行PCR扩增上(Nolan T，Hands R，Bustin S.″Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.″Nature Protocols，2006：1559-1582)。对于一个已经存在了20年的技术，该方法的许多阶段显著地缺乏标准化，使得研究人员得到令人沮丧的冲突的结果(Garson JA，et al.″Unreliable real-timePCR analysis of human endogenous retrovirus-W HERV-W_RNA expression and DNAcopy-number in multiple sclerosis.”AIDS Research and Human Retroviruses，2009：377-378)和退缩(Bohlenius H，et al.″Retraction.″Science，2007：317)。因此，这种创新地结合了微流体与纳米电子技术的电感应探测器的方法用于单个细胞中的miRNA表达的定量检测，比起现有技术有着显著进步。半导体硅纳米线传感器的优点是能够实现超敏感无标签检测而不需要扩增，标准的制造技术造就了高一致性、高产量和高再现性，同时减少了试剂花费，实时读出，并易于携带而且使得现场检验成为可能。此外，使用CMOS加工的方法意味着可以实现装置的低成本高产出的大批量生产。
构建纳米线传感器的制造方法
以硅绝缘体(SOI)晶圆为起始原料，其由连续的多层组成，包括大约360纳米的多晶硅<100>、400纳米氧化硅、500微米的硅衬底(SOITEC)，顶部硅层逐步被氧化并用HF蚀刻成40纳米厚度。用光刻和反应离子蚀刻(RIE)来界定纳米线触点结构。这些结构随后采用现有技术方法植入硼离子，这样，带电载流子的调控就发生在纳米线内，而不是像肖特基势垒晶体管那样，发生在电极和线之间的界面处。
利用电子束光刻技术界定了宽度介于50和1000纳米之间，长度大约3微米的纳米线。顶层氧化物以反应离子蚀刻去除，除了在纳米线和触点结构上的氧化物，其作为一层保护层。利用各向异性TMAH湿法蚀刻在被掩埋的氧化物表面界定纳米线，其依赖针对硅<100>和<111>方向的不同的蚀刻速率(8)。这是一个在此过程中优选的步骤，因为它可以产生光滑的纳米线，其与RIE形成的导线相比具有出色的电学特性。
光刻和掀离技术用于沉积作为电触点的金属片和与背部硅衬底连接的触点。接触线使用LPCVD氮化硅进行钝化，这样装置就可以在电解质溶液中操作。
制造出具有，比如，16、32以及64个分别可寻址的电荷传感器的芯片，虽然2-10、10-50、50-100或100-500个的范围也在设想范围内。在一些实施方式中，多个电荷传感器(比如2-10、10-50、50-100、或100-500)位于电探测器的单个纳米流体通道中。在其他实施方式中，多个电荷传感器是分布于2个或更多纳米流体通道中。
芯片还被制造成连接单个源漏电极对的电荷传感器(如纳米线)的个数是1、4以及8个。增加每个电触点的纳米线个数可获得更一致的晶体管性能，并且提供备份。
每一硅晶圆被切割成约150个一平方厘米面积的芯片。这些芯片线连接到68-pin无铅芯片载体集成电路上。这些芯片被放置在定制的盒子中，其实现了对16个通道同时的放大的直流读出，并连接到计算机上的数据采集卡(NationalInstruments)。
为了感应操作，封在小玻璃熔块中的银/氯化银参比电极被插入溶液中以设定栅电压。定制软件(LabVIEW中)用于确定重要的纳米线晶体管的半导体参数，包括阈值电压、跨导和亚阈值斜率。这些参数决定了纳米线在静电环境中对变化的反应的灵敏性和速度。
通过测量pH值变化导致的电流变化来校准纳米线，从而可以把它们与其他纳米电子装置进行比较。在确认纳米线的电子性能之后，利用标准方法为寡核苷酸探针的结合优化了利用硅烷化的官能化方案。在该优化过程中，可以采用荧光标记的探针(Invitrogen)来可视化地验证结合，就像电子手段一样。利用标准方法，以为微阵列实验的参照设计的探针和目标，系统地确定了纳米线感应器进行miRNA的多路复用探测的性能极限。性能因素包括可探测到的miRNA的最低量，装置对给定的下述参数的变化产生的响应的变化，比如miRNA的浓度、选择性、交叉反应性、达到结合平衡的时间、基于缓冲液的盐浓度的响应的变化以及可被同时测量的不同的miRNA的个数。
这些测试都是利用市售的寡核苷酸探针和cDNA目标(Invitrogen)来进行的。基本方法是当目标流过微流体通道中的纳米线上时，测量在源漏极纳米线跨导随时间的变化，以及最大化信噪比的液体栅电压(就像由电子表征确定的)。该测定的一个重要参数是缓冲液的盐浓度，因为它决定了带电分子周围的静电势的变化可以有效门控纳米线的距离(称为德拜长度)。低盐浓度下，杂交可在距纳米线很远的距离检测到，但这也将增加杂交的时间因为目标和探针的互相排斥也更强烈。因此，最好是确定一个最佳的盐浓度，在这些竞争因素之间取得适当的平衡。
随着这些测量完成后，就得到了在没有不纯的miRNA或逆转录酶的受控环境中，纳米线传感器多路复用检测miRNA的性能极限。
确认了纳米线在受控环境下的性能之后，测量来自胰腺肿瘤细胞系(AmericanType Tissue Collection，VA)、提纯的胰腺肿瘤(Ambion)的总RNA以及正常胰腺的总RNA(Ambion)中的miRNA谱表达。同样的方法也可以用于总RNA提取(Trizol，Invitrogen公司)和逆转录反应(Applied Biosystems)，如李等在2007年发表的文章所述(Lee EJ，et al.″Expression profiling identifies microRNA signature inpancreatic cancer.″International Journal of Cancer，2007：1046-1054)，其利用RT-qPCR方法检测到了胰腺癌的独特miRNA的标签。用来官能化纳米线的探针与李2007年在Northern印迹中用来确定RT-qPCR结果的探针相同。这一测试可以量化评估纳米线在“真实世界”试验中相对的RT-qPCR方法在miRNA检测的方面的性能，其将为重要的癌症研究目标提供答案。
为充分利用纳米线传感器的灵敏度的最后一个部分是独立传送系统的实现，其由微流体芯片构成，用于单个细胞操控、裂解、进行逆转录以及提取cDNA。在一个实施方式中，这可以通过采用软光刻技术制造出以下元件来实现，由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造的粘合至具有气动驱动阀(Unger MA，et al.″MonolithicMicrofabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.″Science，2000：113-116)的载玻片的微流体通道、温度控制器以及毛细管电泳通道。
图26展示了本实施方式的感应装置的一个示意图。细胞从输入储液池被电泳运输通过一个丁字枢纽，在该丁字枢纽处，单个细胞被转移到可以用气动阀隔离的500纳升的反应室中。通过在反应室上放置干冰片，这些细胞在一分钟内被快速冻融裂解(Toriello N，et al.″Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell geneexpression analysis.″Proc Natl Acad Sci USA，2008：20173-20178)。在本实施例中，为简单起见，单个细胞的捕获和裂解都需要试验人员从外部输入。无需外部输入的其他实施例是本领域熟练技术人员可以很容易地设想到的。
裂解的细胞在反应室中在42℃的恒定温度下进行为时30分钟的逆转录反应，该反应室包含在玻璃基板背面的电阻加热原件，其通过溅射钛和铂、光刻以及化学蚀刻制造获得。细胞裂解物以及逆转录的cDNA通过电泳从反应室运输通过毛细管电泳通道，而cDNA通过一个单独的通道被转移到一个临时出口，以与电荷传感器芯片集成在一起。
利用荧光标记的cDNA探针和显微镜技术以及业界已知的标准技术预先确定cDNA从CE通道被分流的时机(对于沿通道施加的给定的分离电流)。
图26示意性地展示了用于细胞操纵、裂解、逆转录和cDNA的毛细管电泳的PDMS微流体通道。把细胞从入口A电泳驱动到废液出口；沿途的外部电压通过切换将单个细胞运送到反应室B，在此单个细胞被隔离并进行细胞裂解和逆转录。垂直方向的L型通道表示控制线，通过芯片外的泵激活，并作为一个阀门对其下部通道中的液体进行压缩和断流。逆转录试剂通过进口C泵入包含电阻加热元件的反应室中。整个裂解的产物以及cDNA在电泳驱动下通过毛细电泳通道(紫色)到达废液出口。在事先计算好的时间，在电迁移的过程中，电压被暂时切换，从而发送cDNA到收集储液池以随后被运送到电荷传感器芯片。
6.5实施例5：纳米通道中的电动力伸展DNA的构象、长度和速度的测量
6.5.1摘要
本实施例展示了一个快速、精确测量局限在纳米通道中的单个的DNA分子的构象、长度、速度和荧光强度的方法。DNA分子通过电泳被驱动通过纳米裂缝进入纳米通道，以约束和动态伸长这些DNA分子使其超出其平衡长度，并通过激光诱导的荧光光谱对其进行反复测量。开发了单分子分析算法用于解析模拟荧光爆发并确定每个拉伸分子的折叠构象。本技术已经实现了114纳米分子长度分辨率和20ms/分子的分析时间，这使得可以对纳米通道中的DNA的物理行为的多个方面进行灵敏测量。λ噬菌体DNA被用来研究伸展对所采用装置偏置的依赖性、构象对速度的影响以及装置中DNA片段的量。测量了λ-噬菌体与自身HindIII内切酶，标准DNA梯状条带，的混合物的长度和荧光强度，这也使得可以在两个半数量级的范围内用长度来表征纳米通道中DNA的速度。
6.5.2简介
生物科学对分析能力的需求刺激了对单分子亚微米和纳米水平结构分析的进展。这些结构有助于以更高速度和精度操作和分析生物分子，而这是传统技术很难实现的。这种能力可以应用于从基因测序到病原体检测等广泛领域，也可以应用在分子生物学和生物物理学等基础研究领域。
一系列用于增强单分子分析的纳米级结构最近被开发出来，其中包括固态纳米孔(Li，J.，D.Stein，C.McMullan，D.Branton，M.J.Aziz，and J.A.Golovchenko.2001.Ion-beam sculpting at nanometer length scales.Nature 412：166-169；Li，J.L.，M.Gershow，D.Stein，E.Brandin，and J.A.Golovchenko.2003.DNA molecules andconfigurations in a solid-state nanopore microscope.Nat.Mater.2：611-615)、熵陷阱阵列(Han，J.and H.G.Craighead.1999.Entropic trapping and sieving of long DNAmolecules in a nanofluidic channel.J.Vac.Sci.Technol.A-Vac.Surf.Films 17：2142-2147；Han，J.and H.G.Craighead.2000.Separation of long DNA molecules in amicrofabricated entropic trap array.Science 288：1026-1029；Han，J.Y.and H.G.Craighead.2002.Characterization and optimization of an entropic trap for DNAseparation.Anal.Chem.74：394-401)、零模式波导(Samiee，K.T.，M.Foquet，L.Guo，E.C.Cox，and H.G.Craighead.2005.lambda-repressor oligomerization kinetics at highconcentrations using fluorescence correlation spectroscopy in zero-mode waveguides.Biophys.J.88：2145-2153；Levene，M.J.，J.Korlach，S.W.Turner，M.Foquet，H.G.Craighead，and W.W.Webb.2003.Zero-mode waveguides for single-molecule analysisat high concentrations.Science 299：682-686)、金属纳米裂缝近场扫描仪(Tegenfeldt，J.O.，O.Bakajin，C.F.Chou，S.S.Chan，R.Austin，W.Fann，L.Liou，E.Chan，T.Duke，and E.C.Cox.2001.Near-field scanner for moving molecules.Phys.Rev.Lett.86：1378-1381)以及纳米柱阵列(Turner，S.W.P.，M.Cabodi，and H.G.Craighead.2002.Confinement-induced entropic recoil of single DNA molecules in a nanofluidic structure.Phys.Rev.Lett.88：1281031-1281034；Kaji，N.，Y.Tezuka，Y.Takamura，M.Ueda，T.Nishimoto，H.Nakanishi，Y.Horiike，and Y.Baba.2004.Separation of long DNAmolecules by quartz nanopillar chips under a direct current electric field.Anal.Chem.76：15-22；Huang，L.R.，J.O.Tegenfeldt，J.J.Kraeft，J.C.Sturm，R.H.Austin，and E.C.Cox.2002.A DNA prism for high-speed continuous fractionation of large DNAmolecules.Nat.Biotechnol.20：1048-1051)。
与荧光光谱配合使用的亚微米和纳米级的流体通道也显示了其在操作和分析单个的DNA分子方面的巨大潜力。本部分工作主要关注快速、灵敏的分析技术，比如片段尺寸测量(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by single molecule detection in submicrometer-sized closedfluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422；Chou，H.P.，C.Spence，A.Scherer，and S.Quake.1999.A microfabricated device for sizing and sorting DNA molecules.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：11-13)、相关光谱(Foquet，M.，J.Korlach，W.R.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2004.Focal volume confinement by submicrometer-sizedfluidic channels.Anal.Chem.76：1618-1626)、结合分析(Stavis，S.M.，J.B.Edel，K.T.Samiee，and H.G.Craighead.2005.Single molecule studies of quantum dot conjugates ina submicrometer fluidic channel.Lab Chip 5：337-343)、核酸修饰的标记的识别(Stavis，S.M.，J.B.Edel，Y.G.Li，K.T.Samiee，D.Luo，and H.G.Craighead.2005.Detection and identification of nucleic acid engineered fluorescent labels insubmicrometre fluidic channels.Nanotechnology 16：S314-S323)、移动性测量(Stavis，S.M.，J.B.Edel，Y.G.Li，K.T.Samiee，D.Luo，and H.G.Craighead.2005.Single-molecule mobility and spectral measurements in submicrometer fluidic channels.J.Appl.Phys.98：449031-449035)和聚合酶链式反应分析(Stavis，S.M.，S.C.Corgié，B.R.Cipriany，H.G.Craighead，and L.P.Walker.2007.Single molecule analysis of bacterialPCR products in submicrometer fluidic channels，Biomicrofluidics 1，034105)。纳米流体通道中单个DNA分子的物理行为和遗传学分析也是热点研究的主题(Kaji，N.，Y.Tezuka，Y.Takamura，M.Ueda，T.Nishimoto，H.Nakanishi，Y.Horiike，and Y.Baba.2004.Separation of long DNA molecules by quartz nanopillar chips under a directcurrent electric field.Anal.Chem.76：15-22；Huang，L.R.，J.O.Tegenfeldt，J.J.Kraeft，J.C.Sturm，R.H.Austin，and E.C.Cox.2002.A DNA prism for high-speed continuousfractionation of large DNA molecules.Nat.Biotechnol.20：1048-1051；Mannion，J.T.and H.G.Craighead.2007.Nanofluidic structures for single biomolecule fluorescentdetection.Biopolymers 85：131-143；Craighead，H.2006.Future lab-on-a-chiptechnologies for interrogating individual molecules.Nature 442：387-393)。
亚微米级流体装置已经实现了液动力线性化DNA，当与反复荧光探测结合时，其可用于进行基因组测序(Chan，E.Y.，N.M.Goncalves，R.A.Haeusler，A.J.Hatch，J.W.Larson，A.M.Maletta，G.R.Yantz，E.D.Carstea，M.Fuchs，G.G.Wong，S.R.Gullans，and R.Gilmanshin.2004.DNA mapping using microfluidic stretching andsingle-molecule detection of fluorescent site-specific tags.Genome Res.14：1137-1146；Bakajin，O.B.，T.A.J.Duke，C.F.Chou，S.S.Chan，R.H.Austin，and E.C.Cox.1998.Electrohydrodynamic stretching of DNA in confined environments.Phys.Rev.Lett.80：2737-2740；Larson，J.W.，G.R.Yantz，Q.Zhong，R.Charnas，C.M.D′Antoni，M.V.Gallo，K.A.Gillis，L.A.Neely，K.M.Phillips，G.G.Wong，S.R.Gullans，and R.Gilmanshin.2006.Single DNA molecule stretching in sudden mixed shear andelongational microflows.Lab Chip 6：1187-1199111)。
DNA分子也被证明在纳米通道中可被拉长到大于其平衡长度(Tegenfeldt，J.O.，C.Prinz，H.Cao，S.Chou，W.W.Reisner，R.Riehn，Y.M.Wang，E.C.Cox，J.C.Sturm，P.Silberzan，and R.H.Austin.2004.The dynamics of genomic-length DNA molecules in100-nm channels.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：10979-10983)，该技术已被用于限制性酶谱(Riehn，R.，M.C.Lu，Y.M.Wang，S.F.Lim，E.C.Cox，and R.H.Austin.2005.Restriction mapping in nanofluidic devices.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：10012-10016)。进一步研究工作已经深入到纳米通道中被拉长的DNA链的其它物理特性，包括熵驱动动力学和压缩与纳米级压缩的对比(Reisner，W.，K.J.Morton，R.Riehn，Y.M.Wang，Z.N.Yu，M.Rosen，J.C.Sturm，S.Y.Chou，E.Frey，andR.H.Austin.2005.Statics and dynamics of single DNA molecules confined innanochannels.Phys.Rev.Lett.94：1961011-1961014；Reccius，C.H.，J.T.Maanion，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2005.Compression and free expansion of single DNAmolecules in nanochannels.Phys.Rev.Lett.95：2681011-2681014；Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational aaalysis of single DNAmolecules undergoing entropically induced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)。
很多研究也日益关注利用具有超过光学衍射空间分辨率的纳米通道来分析单分子，同时受益于成熟的荧光光谱技术的优势(Tegenfeldt，J.O.，C.Prinz，H.Cao，S.Chou，W.W.Reisner，R.Riehn，Y.M.Wang，E.C.Cox，J.C.Sturm，P.Silberzan，and R.H.Austin.2004.The dynamics of genomic-length DNA molecules in 100-nm channels.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：10979-10983)和其他方法(Tegenfeldt，J.O.，O.Bakajin，C.F.Chou，S.S.Chan，R.Austin，W.Fann，L.Liou，E.Chan，T.Duke，and E.C.Cox.2001.Near-field scanner for moving molecules.Phys.Rev.Lett.86：1378-1381；Gordon，M.P.，T.Ha，and P.R.Selvin.2004.Single-molecule high-resolution imagingwith photobleaching.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：6462-6465；Thompson，R.E.，D.R.Larson，and W.W.Webb.2002.Precise nanometer localization analysis for individualfluorescent probes.Biophys.J.82：2775-2783)。
在该实施例中，描述了快速、精确测量限制在纳米通道中的单个的DNA分子的形态、长度、速度和荧光强度的方法。DNA分子通过电泳被驱动通过纳米裂缝进入纳米通道，如图27A所示，在此纳米通道中该分子被局限并被动态拉长超出其平衡长度。然后被拉伸分子被输送经过两个空间上分离的焦点容积。空间上分离的焦点容积是由先后聚焦于纳米通道上的激光所形成的。这使得可以进行速度和互相关测量(Tegenfeldt，J.O.，O.Bakajin，C.F.Chou，S.S.Chan，R.Austin，W.Fann，L.Liou，E.Chan，T.Duke，and E.C.Cox.2001.Near-field scanner for moving molecules.Phys.Rev.Lett.86：1378-1381)并提高了统计有效性和实验通量。与在大流体通道中或自由溶液中的测量相比，使用纳米通道还可以减少荧光背景噪音，增加应激均匀性，并可以实现更高浓度的单分子检测(Foquet，M.，J.Korlach，W.R.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2004.Focal volume confinement by submicrometer-sizedfluidic channels.Anal.Chem.76：1618-1626；Stavis，S.M.，J.B.Edel，K.T.Samiee，andH.G.Craighead.2005.Single molecule studies of quantum dot conjugates in asubmicrometer fluidic channel.Lab Chip 5：337-343)。
对于每个被检测的DNA分子，来自所述两个荧光信号的光子爆发被匹配并随后拟合于描述DNA链的形态、长度、速度和强度的分析模型。图27B展示了由对DNA分子的所述分析所产生的信号和拟合的一个例子，该DNA分子被认为其前端折叠。这种分析算法使得进行超出光学衍射极限空间分辨率进行分子长度和构型分析成为可能。在所展示的工作中实现了114nm的分辨率，分析时间为每个分子20毫秒。如图27B所示的测量方法也可利用总荧光爆发强度来推断DNA的长度，这是已经被证明的一种分析方法(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by single molecule detection insubmicrometer-sized closed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422；Chou，H.P.，C.Spence，A.Scherer，and S.Quake.1999.A microfabricated device for sizing and sortingDNA molecules.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96)，并且这两个方法已经进行了比较和结合。这些因素的结合代表着突破现有空间分辨率和分析时间的应用的一个重要发展方向，比如单分子基因组测序。
本方法也可用在已知的λ-噬菌体DNA及其衍生物系统中，来研究DNA片段、折叠和动态伸展与采用的偏置之间的关系，速度与表观长度、折叠以及伸直长度之间的关系。这些实验的结果有助于说明纳米级环境中DNA分子电泳和摩擦的几个方面。研究发现DNA速度随折叠略有增加，伸展随采用的装置偏置和电场增加。对于DNA片段的混合，速度被认为几乎总是与长度保持一致，只是在短片段情况下略有下降。
6.5.3理论、方法和材料
单分子爆发理论
通过把在纳米通道中移动的各个DNA分子的荧光图像投射到两条不同的光纤上，产生两组收集到的光子计数信号，其中，所述光纤与单独的雪崩光电二极管连接。为了描述信号的总体形状，考虑了一个在长度和宽度为D的纳米通道中的具有N个碱基对以及伸直长度为L的DNA分子。其单链被均一地用Nf荧光分子进行染色，其染料/碱基对比例为g＝Nf/N，并且其均匀地拉伸到端到端长度lR＝sL，这里s是拉张因子(0≤s≤1)。如图27A所示的折叠分子因其一端为环形结构而区别于非折叠分子，从而造成沿通道长度更强的荧光团浓度。
对于一个非折叠的DNA分子，其荧光浓度c可被写成一个沿纳米通道轴x上的位置的函数：
c(x)＝c0[Θ(x-x0+lR/2)-Θ(x-x0-lR/2)]           (1)
其中Θ(x)为Heaviside阶跃函数，x0是分子的中心位置，c0＝Ng/(D2lR)是DNA链所在的通道体积的平均荧光浓度。
DNA链被聚焦的激光束照亮(但非衍射受限)，该激光束的功率为P，频率为ν。假设径向高斯形状的e-1/2半径为σB，在物镜焦平面的激光强度I(x，y)为：
I ( x , y ) = I 0 exp ( - x 2 + y 2 2 &sigma; B 2 ) - - - ( 2 )
其振幅为
Figure BPA00001329213200892
因子kEx用于补偿分色吸收造成的损失。其产生的荧光被放大倍数为m的物镜收集，并通过显微镜的套管透镜在一个直径为d的熔融二氧化硅纤维上成像。所研究的纳米通道的体积由作为光圈的该光纤沿x方向限于从-d/2m到-d/2m，由纳米通道沿y和z方向限于-D/2至D/2。因为σB＞d/m，假设DNA是由照射强度约为I0的恒定激光从三个方向同时照亮的，因为d/m＞＞D，所以计算就降到了一维。沿纳米通道x轴的单位通道长度和时间发射的光子数f(x)为：
f(x)＝f0[Θ(x-x0+lR/2)-Θ(x-x0-lR/2)]         (3)
其振幅为f0＝c0QεD2I0/(hv)，普朗克常数h，量子产率Q，与染料的自然摩尔消光系数为ε。光纤位置所产生的图像是显微镜物镜的强度点扩展函数为PSF(x)并且所述套管透镜被修改以实现所述物镜的m倍放大时，对f(x)的卷积：
i ( x ) = k Em m &Integral; - &infin; + &infin; f ( x &prime; ) PSF ( x / m - x &prime; ) d x &prime; - - - ( 4 )
因子kEm用于补偿物镜的收集效率和发射过滤器的吸收损失。假设e-1/2半径为σ的高斯点扩展函数为：
PSF ( x ) = 1 2 &pi; &sigma; exp ( - x 2 2 &sigma; 2 ) - - - ( 5 )
图像可以被描述如下：
i ( x ) = i 0 1 2 [ erf ( x / m - x 0 + l R / 2 2 &sigma; ) - erf ( x / m - x 0 - l R / 2 2 &sigma; ) ] - - - ( 6 )
其振幅为i0＝kEmf0/m。在显微镜图像平面内，影像聚焦在一光学多模光纤，并传输到光电二极管。光纤耦合及吸收损失减少的信号由因子kFib表示。因此，单位时间到达探测器的光子的数目p(x0)为：
p ( x 0 ) = k Fib &Integral; - d / 2 + d / 2 i ( x ) dx = p 0 m d { pt ( x 1 ) - pt ( x 2 ) - [ pt ( x 3 ) - pt ( x 4 ) ] } - - - ( 7 )
信号振幅为
p 0 = k Fib k Em f 0 d m = k Fib k Em c 0 Q&epsiv; D 2 k Ex Pd 2 &pi; &sigma; B 2 mhv - - - ( 8 )
其函数部分(i＝1，2，3，4)
pt ( x i ) = &sigma; 2 &pi; exp ( - x i 2 2 &sigma; 2 ) + x i 2 erf ( x i 2 &sigma; ) - - - ( 9 )
和
Figure BPA00001329213200907
Figure BPA00001329213200908
这个简单的积分是建立在所采用的阶跃型多模光纤的收集效率具有脉冲函数横向依赖的假设之上。
可以利用类似于无折叠情况的方式来描述前端折叠的分子的荧光团浓度。在所述通道内，其只占有表观长度lA，但通过加上折叠部分的长度lL可以计算出其端到端长度lR。荧光团浓度cfold可被写成：
cfold(x)＝c0[Θ(x-x0+lA/2)+Θ(x-x0-lA/2+lL)-2Θ(x-x0-lA/2)]   (10)
其引出光电二极管信号：
p fold ( x 0 ) = p 0 m d { pt ( x 1 ) - pt ( x 2 ) + [ pt ( x 3 ) - pt ( x 4 ) ] - 2 [ pt ( x 5 ) - pt ( x 6 ) ] } - - - ( 11 )
其中，
Figure BPA00001329213200913
Figure BPA00001329213200914
类似地，可以导出更高阶的折叠。
在该例子中，用两束激光来界定沿纳米通道长度的两个焦点容积，接着用两个光电二极管在两个不同的位置x＝0和x＝sd处对所述DNA链进行成像。所述时间依赖的信号就可以分别被描述为p(vS(t-t0))和p(vS(t-t0)-sd)，其中，t0是所述分子的中心在x＝0的时刻，而vS是所述链的速度。假设由于分子构象的改变和不同的光吸收损耗，在x＝0和x＝sd处不同的表观DNA长度(lA1，lA2)和幅度(p01，p02)是可能的。
互相关理论
通过分析测量获得的两个荧光信号的互相关函数，荧光相关谱测量(FCS)提供了有关所述样本的时均信息(Elson，E.L.and D.Magde.1974.FluorescenceCorrelation Spectroscopy Conceptual Basis and Theory.Biopolymers 13：1-27；Magde，D.，W.W.Webb，and E.Elson.1972.Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System-Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy.Phys.Rev.Lett.29：705-708；Magde，D.，E.L.Elson，and W.W.Webb.1974.Fluorescence Correlation SpectroscopyExperimental Realization.Biopolymers 13：29-61)。在该例子中采用了经改良的FCS方法来产生DNA链的平均速度和长度，接着，这些结果被用于引导后续的单分子爆发分析算法。已知互相关函数为：
G C ( &tau; ) = 1 + &Integral; &Integral; W 1 ( x ) W 2 ( x &prime; ) &rho; ( x , x &prime; , &tau; ) dxd x &prime; C &OverBar; 2 &Integral; W 1 ( x ) dx &Integral; W 2 ( x &prime; ) d x &prime; - - - ( 12 )
其中，所述两个焦点容积的分子荧光探测效率(MDE)函数为W1(x)＝W(x)和W2(x)＝W(x-sd)，
Figure BPA00001329213200922
为平均浓度(Brinkmeier，M.，K.Dorre，J.Stephan，and M.Eigen.1999.Two beam cross correlation：A method to characterize transport phenomenain micrometer-sized structures.Anal.Chem.71：609-616)。
假设有一个由单个长度为lC的无折叠DNA分子组成的样本。对于用于高速分析的速度vC，扩散可被忽略(Foquet，M.，J.Korlach，W.R.Zipfel，W.W.Webb，andH.G.Craighead.2004.Focal volume confinement by submicrometer-sized fluidicchannels.Anal.Chem.76：1618-1626)，从而浓度波动函数变为
Figure BPA00001329213200923
(Magde，D.，W.W.Webb，and E.L.Elson.1978.Fluorescence Correlation Spectroscopy.3.Uniform Translation and Laminar-Flow.Biopolymers 17：361-376)。
由于伸展的DNA链比被研究的通道长度(lC＞d/m)更长，W(x)等于方程式7中的p(x)。为了分析地解方程式12中的积分，以在x＝±lC/2处与p(x)的斜率相匹配的S型函数来近似表示W(x)：
W ( x ) = p 0 [ 1 - 1 1 + exp ( - 4 m / d ( | x | - l C / 2 ) ) ] - - - ( 13 )
根据业界已知的方法，利用Mathematica(Wolfram Research，Champaign，IL)获得GC(τ)的结果(未展示数据)。
因为GC(τ)会根据样本的折叠和片断随实验变化，互相关拟合是不完美的，但足以引导后续的单分子分析算法。当采用更小的纳米通道来减少DNA分子的折叠时，互相关拟合的质量会得到改善。
单分子爆发分析
针对两个光子计数信号的分析算法由以下构成：由对DNA分子的探测产生的荧光爆发的定位，两个光子计数信号中对应爆发的匹配，以及对应爆发的组合拟合。同时分析了伙伴爆发(partner bursts)，以实现从在两个焦点容积之间运动的时间，以及从两个独立的爆发，对分子速度的最灵敏的测定。根据变化的装置偏置和获得的分子速度修改分析参数。以下参数范围与装置偏置U的范围1V-100V相对应。为了改善和加速解析爆发拟合，最初在10μs的窗口时间(bin time)记录光子计数信号，再把这些信号重排(rebinned)至10μs-500μs。限制重排，以保持每一荧光爆发的形状。通过采用阈值化算法，两个信号中的所有爆发都被定位。单分子探测阈值被设置为大于平均背景噪声值至少七个标准偏差，平均背景噪声值是通过泊松拟合所述两个信号的总体光子计数分布至泊松分布而确定的。这实际上消除了来自不适当分析的所有噪声，由ΔtGap＝10ms-0.1ms分隔的多个爆发被组合为一个爆发。互相关分析的结果被用于找到匹配爆发。
对于第一光子计数信号在时刻t0的爆发，第二光子计数信号中匹配的爆发被定义为最接近时刻t0+tP的爆发，其中，tP＝sd/vC，是互相关曲线的峰值位置。只有当爆发位于t1＝t0+tP-ΔtP和t2＝t0+tP+ΔtP之间时，才考虑对其进行进一步分析，其中，ΔtP＝(d+lC)/vC。在样本不均匀的情况下，互相关曲线不被拟合，并且tP和ΔtP的值是人为地从互相关曲线上选择获得。
利用经修改的Levenberg-Marquard算法同时拟合伙伴爆发。用基于对现存爆发形状的观察的六种不同折叠模型来说明三个层级的分子折叠。通过比较第一伙伴爆发的最大光子计数和测量中所有爆发的最大光子计数分布，并忽略爆发开始和结束处的信号斜率，来确定折叠层级。
这个分布最大值被假设为由对完全位于焦点容积内的无折叠DNA链的探测产生的平均光子计数，并被作为通道1的拟合方程的幅值p0，1。用相似的方法选择通道2的拟合幅值p0，2。拟合幅值被固定，以正确地分析爆发。只有在运动分子速度很低并且实验运行时间超过2分钟(对应U＝1-2V的装置偏置)的情况下，对每一分子单独拟合爆发幅值才能获得更好的结果。这说明在纳米裂缝中的停留时间增加，从而导致在纳米裂缝表面上的染料损失的增加，以及纳米通道阵列附近光散射造成的光褪色。
假设分子折叠两次或三次，对比两个拟合模型，选择产生较低χ2的那个模型。通过加总从脉冲开始到结束的时间内的计数，来确定每个分子的光子计数。为了提高精确度，这些时间是由拟合算法确定，而非阈值化算法。利用在Labview(National Instruments，Austin，TX)中编程的客制化软件来实施该分析，这使得可以对每一拟合的自动选择的模型进行纠错。
少量的探测事件展示出在所有测量中，重叠的分子或分子激光破坏被排除在进一步分析之外，除了如图33所展示的具有16,000个分子的例子。用如图29B所展示的类型的重叠的爆发形状来识别来自重叠分子的爆发。观察到来自位于第一焦点容积内的完整分子的单个光爆发，其后跟随来自位于第二焦点容积内的片断的两个光爆发，其被当作光损伤。偶尔地，第二个爆发保持完整，但其荧光强度部分下降。
对数分布的高斯拟合
在如图33A-F所示的实验结果中，DNA长度的变化有2.6个数量级，因此，色彩编码的线图(在图33D展示为灰阶)以及图33A和33E中的分布用对数被纵向合并(binned)。对于图33A，假设真实长度峰值的每一都是高斯分布的。峰值i就可以被描述为
Figure BPA00001329213200941
其中，aRi为幅值，lRi为均值，σRi为标准偏差。以该曲线的竖条尺寸(bin size)dy纵向合并获得：
f log i ( l R ) = &Integral; r 1 r 2 f i ( l R &prime; ) dl R &prime; = &pi; / 2 a Ri &sigma; Ri [ Erf ( - 1 0 - dy / 2 l R + l Ri 2 &sigma; Ri ) - Erf ( - 10 dy / 2 l R + l Ri 2 &sigma; Ri ) ] - - - ( 14 )
采用积分边界以及用该类型的九个函数的叠加来拟合图33A中的真实长度分布，并且以类似的方式拟合图33E中的光子计数分布。
光学设置
结合使用具有Prior Pro-Scan II显微镜台(Prior Scientific，Rockland，MA)的Olympus IX71倒置显微镜(Olympus，Melville，NY)和纳米通道装置进行单分子探测。该显微镜台设有集成的位置传感器和伺服马达以控制横向漂移，而焦平面内的漂移是用显微镜台高度探头(Heidenhain，Traunreut，Germany)进行测量，并用外部聚焦伺服马达(Prior Scientific)来控制。采用氩-氪混合气体可调谐激光器(Melles Griot Laser Group，Carlsbad，CA)和固态蓝宝石激光器(Coherent，Santa Clara，CA)，结合Z488/10X激发滤光片(ChromaTechnology，Rockingham，VT)，在488nm下进行荧光激发。采用了很多光学元器件包括反射镜和运动支架(Newport，Irvine，CA)，把激光束引导至显微镜，它们的入射角被调整至使得焦点容积在沿纳米通道长度的方向上间隔11-12μm。除了如图33A-F中所示的实验外，两个激光器的功率都被调整到250μW，以在环形偏光器后的测值为准，而在如图33A-F中所示的实验中，激光的功率为1.5mW。
Z488RDC分光镜(Chroma)把激光束反射到UApo/340水浸物镜(40X，1.15NA，Olympus)的后部。收集到的荧光穿过发射滤光片(Omega Optical，Brattleboro，VT)。用分束器(Omega)把该信号等分，以显微镜的内套管透镜将其聚焦于两个高功率阶跃型熔融硅多模光纤(内径50μm，包层直径125μm，OZOptics Limited，Ottawa，ON，Canada)。在光纤的末端，用两个雪崩光电二极管SPCM-AQR-14-FC(Perkin Elmer，Fremont，CA)探测光。光学装置的总体图如图28A所示。采用了Photometrics Cascade 512B相机(图28A未示，Photometrics，Tucson，AZ)来对齐激光束和纳米通道，可视化实验，并成像数百个量子点(Qdot 525链亲和素联接体，Invitrogen，Carlsbad，CA)，这些量子点被吸收至熔融硅盖玻片用于表征显微镜物镜的点扩散函数。用标准偏差为σ＝140±20nm的高斯分布来描述该点扩散函数。光学设置的更多细节请参Stavis，S.M.，J.B.Edel，Y.G.Li，K.T.Samiee，D.Luo，and H.G.Craighead.2005.Single-molecule mobility and spectral measurements in submicrometerfluidic channels.J.Appl.Phys.98：449031-449035。
装置制造
利用电子束和光刻的组合在熔融硅上制作纳米通道。把150nm厚的聚(丙烯酸酯)抗蚀剂薄膜旋涂在厚500um的衬底晶圆上(Mark Optics，Santa Ana，CA)，再于其上蒸镀25nm厚的金薄膜。用电子束曝光机JBX-9300FS(JEOL，Peabody，MA)曝光装置的负像。在去除金和抗蚀剂显影后，通过蒸镀和掀离，纳米通道的图像转移到铬掩模上。以标准的光刻工艺和相同的掀离操作获得微通道蚀刻掩模。图28B展示了获得的铬掩模的光学显微照片。接着，利用Plasmalab80Plus RIE(Oxford Instruments，Eynsham，UK)，以CHF3/O2混合物，把所述微通道和纳米通道蚀刻至所述衬底。图28C和2D为电子显微照片，其展示了所述微通道和纳米通道之间的界面。通过对所述晶圆进行氧化铝喷粉穿过其背面，在所述衬底上切出入口孔和出口孔。为了封闭所述通道，把一块厚170um的熔融硅盖板晶圆(Mark Optics)粘合至所述衬底晶圆，并在1050℃的温度下进行退火。制作装置完成后，在使用过程中，用可再用的粘接剂把样本贮槽粘连至所述入口和出口孔。铂导线为样本溶液提供了电连接。制作工艺的进一步细节请参Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA molecules undergoing entropicallyinduced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545。
样本
以染料碱基对之比1到5的比例，用双嵌入荧光染料YOYO-1(Invitrogen)标记DNA样本。浓度为25ug/ml的λ噬菌体DNA(New England Biolabs，Ipswich，MA)被加热至65℃并继续加热5分钟，然后被加入至缓冲剂5X Tris-Borate-EDTA(TBE，pH 8.3，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中的染料YOYO-1混合物，其中，该缓冲剂中含6％(v/v)的β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)作为抗光褪色剂。以类似的方式制备λ-噬菌体(New England Biolabs)的HindIII内切酶，唯一不同之处在于其被加热至60℃。以相等的份数把内切酶和纯λ-噬菌体混合，总浓度为50ug/ml，在混合之前在适当的温度下对每一组分进行加热。接着，该样本被YOYO-1标记。在该例子中，缓冲剂还含有1％(w/w)聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP，分子量40kD，Sigma-Aldrich)以降低电渗流和非特定的DNA与通道壁的结合(38-40)。λ-噬菌体DNA的拉直长度Lλ＝16.5μm可以由碱基对间距0.34nm计算获得。近期的研究说明当染料/碱基对比率为1∶4时，与YOYO-1相似的染料TOTO-1使拉直长度Lλ增加30-35％(Bakajin，O.B.，T.A.J.Duke，C.F.Chou，S.S.Chan，R.H.Austin，and E.C.Cox.1998.Electrohydrodynamic stretching of DNA in confined environments.Phys.Rev.Lett.80：2737-2740；Perkins，T.T.，D.E.Smith，R.G.Larson，and S.Chu.1995.Stretching of a single tethered polymer in a uniform flow.Science268：83-87)。因此，对于1∶5的染料比率，可预见Lλ将增加23％至20um。
自相关函数
归一化的一维自相关函数GAC(τ)被定义为：
G AC ( &tau; ) = 1 + &Integral; &Integral; W ( x ) W ( x &prime; ) &rho; ( x , x &prime; , &tau; ) dxd x &prime; C &OverBar; 2 ( &Integral; W ( x ) dx ) 2 - - - ( S - 1 )
其中，ρ(x，x′，τ)为浓度波动函数，W(x)为分子探测效率函数(MDE)。对于以高速流过激光聚焦的通道的伸展开的DNA分子，我们假设
Figure BPA00001329213200972
因此有：
W ( x ) = p 0 [ 1 - 1 1 + exp ( - 4 m / d ( | x | - l / 2 ) ) ] - - - ( S - 2 )
MDE利用经修改的S型函数来描述流经激励强度均匀的区域的长DNA分子的探测。这个不变的激发形状近似所述光纤的结果，该光纤仅成像聚焦的但非衍射受限的激光点的中心区域，其中，该激光点由宽高斯函数描述。图34展示了方程式7中的MDE p(x)和简单得多的方程式S-2中的W(x)之间的对比。
我们还定义三个时间常量t1＝d/(mv)、t2＝sd/v以及t3＝L/v。从而获得：
GAC(τ)-1＝G0zA1/nA1                    (S-3)
前因子为：
G 0 = lim &tau; &RightArrow; 0 ( G A ( &tau; ) - 1 ) = t 1 t 3 [ 2 ln ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) - tanh ( t 3 t 1 ) - 1 ] / 4 C &OverBar; l [ 1 + t 1 2 t 3 ln ( 1 + e - 2 t 3 t 1 ) ]
分子为：
z A 1 = ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) [ 2 &tau; t 1 ( 2 e 8 &tau; t 1 - e 4 t 3 t 1 - e 4 ( t 3 + &tau; ) t 1 ) + ( e 4 &tau; t 1 + e 4 ( t 3 + &tau; ) t 1 - 2 e 4 t 3 t 1 ) ln ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) +
+ ( e 4 t 3 t 1 - e 8 &tau; t 1 ) ln ( e 2 t 3 t 1 + e 4 &tau; t 1 ) ]
分母为：
n A 1 = ( e 4 t 3 t 1 + e 4 &tau; t 1 ) ( - 1 + e 4 &tau; t 1 ) [ - e 2 t 3 t 1 + ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) ln ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) ]
互相关函数
所述归一化的一维互相关函数可被写成：
G CC ( &tau; ) = 1 + &Integral; &Integral; W 1 ( x ) W 2 ( x &prime; ) &rho; ( x , x &prime; , &tau; ) dxd x &prime; C &OverBar; 2 &Integral; W 1 ( x ) dx &Integral; W 2 ( x &prime; ) d x &prime; - - - ( S - 4 )
其中，ρ(x，x′，τ)为浓度波动函数，而MDE函数W1(x)和W2(x)描述DNA分子的序列检测。对于高速流过两束激光聚焦的并且聚焦分隔距离为sd的纳米流体通道的伸展的DNA分子，我们假设
Figure BPA00001329213200986
W1(x)＝W(x)，并且W2(x)＝W(x-sd)。因此，获得：
G CC ( &tau; ) - 1 = k C z C 1 / n C 1 for &tau; > sd / v k C z C 2 for &tau; = sd / v k C z C 3 / n C 3 for &tau; < sd / v - - - ( S - 5 )
前因素为：
k C = { C &OverBar; l [ 1 + t 1 2 t 3 ln ( 1 + e - 2 t 3 t 1 ) ] ln ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) } - 1
分子为：
z C 1 = 2 ( &tau; - t 2 ) t 1 e 4 ( t 2 + t 3 + &tau; ) t 1 - 4 &tau; t 1 e 8 &tau; t 1 + 2 ( t 2 + &tau; ) t 1 e 4 ( 2 t 3 + t 3 ) t 1 +
+ e 4 t 2 t 1 ( 2 e 4 ( t 2 + t 3 ) t 1 - e 4 &tau; t 1 - e 4 ( t 3 + &tau; ) t 1 ) ln ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) - ( e 4 ( 2 t 2 + t 3 ) t 1 - e 8 &tau; t 1 ) ln ( e 2 ( 2 t 2 + t 3 ) t 1 + e 4 &tau; t 1 )
z C 2 = ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) - 1 + ln ( 1 + e 2 t 3 t 1 ) - 1
z C 3 = 2 t 2 t 1 e 4 ( t 2 + t 3 + &tau; ) t 1 - 4 t 2 t 1 e 8 t 2 t 1 + 2 t 2 t 1 e 4 ( t 3 + 2 &tau; ) t 1 - 2 &tau; t 1 e 4 ( t 2 + t 3 + &tau; ) t 1 + 2 &tau; t 1 e 4 ( t 3 + 2 &tau; ) t 1 +
+ e 4 &tau; t 1 ( - e 4 t 2 t 1 - e 4 ( t 2 + t 3 ) t 1 + 2 e 4 ( t 3 + &tau; ) t 1 ) ln ( 1 + 2 e 2 t 3 t 1 ) + ( e 8 t 2 t 1 - e 4 ( t 3 + 2 &tau; ) t 1 ) ln ( e 4 t 2 t 1 + e 2 ( t 3 + 2 &tau; ) t 1 )
分母为：
n C 1 = ( e 4 t 2 t 1 - e 4 &tau; t 1 ) ( e 4 ( t 2 + t 3 ) t 1 - e 4 &tau; t 1 )
n C 2 = ( e 4 t 2 t 1 - e 4 &tau; t 1 )
n C 3 = ( e 4 t 2 t 1 - e 4 &tau; t 1 ) ( e 4 t 2 t 1 - e 4 ( t 3 + &tau; ) t 1 )
6.5.4结果和讨论
该例子展示了在纳米流体通道中动态地伸长、快速探测以及仔细分析单个DNA分子的方法。该例子还展示了利用该方法来研究当以这样的方式来操作DNA链时所发生的物理现象，包括速度随折叠的变化，伸展和速度随电场的变化，以及速度随长度的变化。还用已知系统及λ噬菌体DNA的变化实施了一些实验，包括λ噬菌体DNA的随机片断以及来自λ噬菌体DNA与其HindIII内切酶的混合物的受控片断(controlled fragments)。
单个λ噬菌体DNA分子的长度分析
每一轮实验产生两个光子计数信号迹线和它们的互相关函数。用阈值化算法识别两个光子计数信号中的荧光爆发。通过基于前面的互相关函数的拟合、针对速度vC的产出估计以及分子的平均表观长度lC来估计伙伴爆发发生的时间窗，从而匹配这些伙伴爆发。大部分爆发展示出多级荧光强度，这被解释为折叠的DNA分子的结果。观察到的爆发形状与在DNA迁移通过人造纳米孔时观察到的电流变化相似(Li，J.L.，M.Gershow，D.Stein，E.Brandin，and J.A.Golovchenko.2003.DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope.Nat.Mater.2：611-615；Chen，P.，J.J.Gu，E.Brandin，Y. R.Kim，Q.Wang，and D.Branton.2004.Probing single DNA molecule transport using fabricatednanopores.Nano Lett.4：2293-2298)。图27B展示了该现象的一个例子。
几乎所有分子展示出一定程度的前端折叠，在以前的涉及纳米通道内的单DNA分子的实验中也观察到这个现象(Reccius，C.H.，J.T.Mannion，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2005.Compression and free expansion of singleDNA molecules in nanochannels.Phys.Rev.Lett.95：2681011-2681014；Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA molecules undergoing entropicallyinduced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)，但程度较轻。所采用的装置中纳米裂缝和纳米通道之间增加的电场强度差异可能是造成这种前端折叠增加的原因。假设较大的电场梯度导致最先足够接近纳米通道的DNA分子的部分的随机进入，而不管较大的熵力会阻碍折叠的结构进入通道。“吸面条”的隐喻(Austin，R.2003.Nanopores-The art of sucking spaghetti.Nat.Mater.2：567-568)帮助解释了为什么很少在分子中间或尾部观察到折叠，在这些位置它们伸展开了。对于观察到的前端折叠，还有一些其他的可能的解释。对于在这些实验中所采用的高速度，由于流体动力效应或与通道表面的相互作用，分子可能在通道内折叠。在进入纳米通道之前，与纳米裂缝表面之间的相互作用导致伸长和折叠是可能的，并且与纳米通道表面之间的相互作用也可能导致链前端压缩。在较低速度下没有观察到这些解释的内容(Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA moleculesundergoing entropically induced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)，并且持续长时间的DNA长度和量化的爆发形状的存在包括图29中的3、6及7，不太可能造成压缩，这是为什么在该例子中倾向于折叠解释。当然，以上提到的影响的组合也是可能的，在这种情况下，可以利用采用可变的初始阶跃高度的经修改的方程式10来模拟具有短初始峰值的分子。这样可得到拟合函数，其形状与此处所用形状的差异只是在信号前沿斜率不同。由于当前对斜率的分析受荧光波动所限制，对于真实长度的结果将非常接近此处的当前结果。
基于这些观察，七种理论上的分子构象被用来描述三个层级的前端折叠，如图29A所示。当从右到左观察分子时，对于两次和三次折叠分别有两个和三个构象，相对于相邻的无折叠端，其分子折叠区域的长度不同。利用这七个分子构象开发出六个被命名为α-ζ的分析模型，用于拟合测量到的荧光爆发。这些荧光爆发模型的差异来自获得的沿通道轴线的荧光团浓度形状的数学描述。对于两次折叠，分子的表观长度既可能由单链端控制，也可能由环控制，导致不同的荧光团浓度层级。下一浓度层级的长度被描述为表观长度的一小部分。对于三次折叠，分子的表观长度也是既可能由单链端控制，也可能由环控制，导致两个不同的模型。两个左边的形状的长度均由单链端所控制，使其可以用同一模型ε来描述。在该例子中，几乎所有的单分子测量事件可以用这些模型来描述。图29B展示了荧光爆发的几个例子，及其对应的分子构象和解析拟合。如爆发形状1所示，虽然无折叠区域的荧光强度较为平稳，重叠信号波动依然比较明显。这说明虽然这些分子均匀地伸展开，但还没有完全伸展到其轮廓长度，导致链浓度波动。对于研究过的每一DNA分子，根据爆发高度为其选择一个拟合模型，然后两个伙伴爆发被一起拟合。例如，对应信号1以函数p(vS(t-t0))+pOff1，而对应信号2则以函数p(vS(t-t0)-sd)+pOff2来拟合无折叠分子，这两个函数都是基于方程式7的函数p(x0)。对于单个前端环的分子，以函数pfold(vS(t-t0))+pOff1来拟合信号1，以函数pfold(vS(t-t0)-sd)+pOff2来拟合信号2，这两个函数都是基于方程式11。
针对更高程度的折叠，建立了类似的函数。在所有的情况下，拟合参数包括速度vS，由两个信号产生的表观长度lA1和lA2，以及初始爆发时间t0。之前确定的参数比如激光点距离sd、光纤直径d、物镜放大倍数m、两个信号的背景噪声水平pOff1和pOff2以及点扩展函数σ的高斯半径对所有的拟合都保持不变。两个信号的信号幅度前因素p0，1和p0，2总体保持不变。对于超过两分钟的分析时间，这些前因素被拟合以补偿染料损失和纳米裂缝中的光褪色效应。根据折叠的程度，拟合附加的折叠因素，比如对于单折叠分子，fa＝lL1/lA1＝lL2/lA2。假设对于该实验两个信号的折叠因素都保持不变，然而表观长度(lA1、lA2)和折叠(成环)长度(lL1、lL2)是可能变化的。由于光纤对准的轻微不同，两个信号所给出的分子长度可能相差至10％，从而选择较高的平均长度，因为较小的值被认为是由于光纤的轻微偏差造成的。两个探测容积之间的链长的实际变化不太可能发生，因为认为长度变化是在10ms这个时间数量级上发生的(Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNAmolecules undergoing entropically induced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)。
在三个相似的实验中，以50V的装置偏置检测到752个完整的λ噬菌体分子。最常观察到由折叠模型β、γ及ε所描述的荧光爆发(分别为33％、46％、以及20％)，被观察到的爆发中只有1％是由其他模型所描述。自动拟合算法只针对短的片段选择δ拟合模型，虽然γ拟合模型也适用，并且从不针对完整的λ噬菌体分子选择δ拟合模型。图29B中所展示的八个爆发形状是作为稀有检测事件的例子，其没有被图29A中的六个基本模型所完全描述。模型β相对最能够描述该情况中的爆发形状，其可能是由分子、折叠或结的重叠所造成。以前也观察到过类似的现象(Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA molecules undergoing entropicallyinduced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)。在这个早期的研究中，在正从纳米通道熵退缩的DNA分子中检测到结，其不会像简单的折叠那样随时间消除。虽然该检测时间说明了利用这些模型来拟合这些荧光爆发的局限，这也同时展示了单分子测量中检测稀有种类和瞬态事件的能力。
图30A-F展示了一个一分钟实验的结果，其中，探测到416个来自λ噬菌体DNA样本的分子。图30C展示了用于描述具有单环的折叠DNA链的不同长度的定义。表观长度lA忽略链的任何折叠，仅通过分析DNA链从开始到末端的长度来确定。表观长度是值得注意的，因为其使得可以更直接地比较这里的结果和其他DNA分析方法，包括DNA纳米孔迁移和液动力伸展。成环长度lL是DNA折叠部分的长度，而真实长度lR是表观长度和成环长度之和。自由长度lF描述了DNA无折叠区域的长度。虽然表观长度也可以用简单的阈值化算法来确定，其他长度值只能通过拟合爆发形状来获得。
图30A和30B展示了这些不同长度值的比较。相较于图30A中的表观长度，对应λ噬菌体DNA分子，图30B中的真实长度的分布具有陡峭得多的峰值。基于说明表观长度的分析，该分布中的很多分子看起来是片段。当计算获得真实长度后，发现这些分子是完整的和折叠的，从而校正分布。当绘制出采集自每一分子的光子数量和表观长度(图30D)以及真实长度(图30E)之间的关系时，就可以观察到这个现象。虽然图30D中的分子表观长度分布普遍发散，图30E中的真实长度分布是聚焦的并且拟合至单条线。该样本还含有一小部分λ-DNA多聚体，相比于在图30A-F中被可视化的，其被观察到具有较高的光子计数和较长的长度。可以用高斯函数来拟合每一分子的光子计数和真实长度分布，对于完整λ噬菌体DNA分子产生48,000±2,000的平均光子计数以及10.7±0.3μm的平均真实长度。这比在100nm x 200nm的通道中测量到的λ噬菌体分子的7-8μm的平衡长度长(Tegenfeldt，J.O.，C.Prinz，H.Cao，S.Chou，W.W.Reisner，R.Riehn，Y.M.Wang，E.C.Cox，J.C.Sturm，P.Silberzan，and R.H.Austin.2004.Thedynamics of genomic-length DNA molecules in 100-nm channels.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：10979-10983；Reccius，C.H.，J.T.Mannion，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2005.Compression and free expansion of single DNAmolecules in nanochannels.Phys.Rev.Lett.95：2681011-2681014)，这是已经被预见到的，因为测量到的值不是平衡长度，而是动态地伸展开的长度。
之前是针对进入纳米通道时的T4-噬菌体DNA分子发现这个伸展效应的。接下来的松弛展示了9.3s的时间常量(Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA moleculesundergoing entropically induced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)。发现真实长度分布的高斯拟合的相对标准偏差比光子计数分布的小(3.1％对4.7％)。在平均光子计数和平均真实长度的两个标准偏差之间的所有分子被认为是完整的λ噬菌体DNA分子(图30D中黑色箭头所标的区域)，其占探测到的分子的52％。假设其余的较小的分子是λ噬菌体DNA分子的片段，并忽略探测到的少数的λ噬菌体多联体，这些片段的长度的综合除以λ噬菌体DNA分子的平均真实长度得到60，将其作为完整分子的原始数量。
这样，计算得到完整链的百分比为78％，这比用琼脂糖凝胶电泳测得的完整λ噬菌体DNA分子百分比86％低一些。该测量是由制造商用来自同一批的样本来进行的，并且用滚球背景校正分析了获得的荧光图像，其采用Image J(NationalInstitute of Mental Health，Bethesda，MA)，用于模拟空间平均的DNA谱带强度的高斯分布，以及用于区分完整分子和片段的均值附近的两个标准偏差的范围。分裂的贡献因素包括来自手动装载样本的液动力剪力，纳米通道装置中的电动力，以及来自激光散射的光子破坏。在此报告的分裂的量比在其他伸长和分析方法中所观察到的有优势(Chan，E.Y.，N.M.Goncalves，R.A.Haeusler，A.J.Hatch，J.W.Larson，A.M.Maletta，G.R.Yantz，E.D.Carstea，M.Fuchs，G.G.Wong，S.R.Gullans，and R.Gilmanshin.2004.DNA mapping using microfluidicstretching and single-molecule detection of fluorescent site-specific tags.Genome Res.14：1137-1146)。
为了估计本方法的分辨率，从利用模型β分析的97个分子，计算出被拟合的完整λ噬菌体分子的表观长度和真实长度的平均标准误差分别为84nm和114nm。对于更高阶的折叠，真实长度的平均标准误差将会增加：对于模型γ为143nm，对于模型ε为278nm。可以间接地把这些值和由Tegenfeldt等获得的分辨率150nm相比较，该分辨率是在1分钟时间内，针对平衡长度为8um的单个λ噬菌体分子在纳米通道中获得的(Tegenfeldt，J.O.，C.Prinz，H.Cao，S.Chou，W.W.Reisner，R.Riehn，Y.M.Wang，E.C.Cox，J.C.Sturm，P.Silberzan，andR.H.Austin.2004.The dynamics of genomic-length DNA molecules in 100-nm channels.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：10979-10983)。但是，这些值无法被直接关联，因为前者是单爆发的拟合的平均标准误差，而后者由长度测量分布的高斯拟合产生，其跨越较长的时间段，以平均化单个分子的热波动。
折叠的分子的自由长度值得特别注意，因为链的这个区域是在以后的实验中能够清晰地确定位点特异(site specific)的荧光标记的地方。图30E中的插图展示了所有完整分子的自由长度/真实长度lF/lR的分布。79％的完整分子的lF/lR＞0.5，这说明在这些例子中的一半(39.5％)中，可以确定直至链中间的任何位置。然而这是基于一半的分子是以正确的方向(例如，5’端先进入)进入通道的假设之上。这把能够产生有关荧光标记位点特异位置的信息的λ噬菌体分子降低到26％(0.67x 0.39)。图30E中的插图还证明了造成所有爆发的光子计数分布的峰值的原因是无折叠DNA链占据了焦点容积以及该值被当作信号前因素。
图30A-F中的方法的局限因素是焦点容积的长度l＝d/m＝1.25μm。当纳米通道中DNA分子的长度小于该值，所产生的荧光爆发不展示量化的强度级，而信号幅度仅由插入该链的燃料分子的数量确定。方程式7预测当分子折叠不影响这些信号的幅度时，其是在荧光爆发的开始和结束时斜率的突然变化中可见的。但是，由于在所展示的工作中信号波动太高，这些斜率的变化是无法探测的。在该例子中，α拟合模型被用于描述低于平均爆发高度的信号强度，产生由幅度峰值确定的表观长度值，并作为光子计数结果。从而对于长度小于1.25μm的分子，爆发拟合和光子计数方法收敛，如图30D所示。同样的局限影响了折叠长度小于1.25μm的折叠分子。
理论上，信号斜率中存在附加信息，如分子构象，但这些信息的分析又被以下因素模糊化：信号波动，以及由关于光学系统，如激光照明和光纤收集效率，的假设所产生的偏差。就构象而言，用同一拟合模型来描述折叠链的不同构象，因此不可能确定具有较短初始峰值的荧光爆发是由在端部折叠的链还是由在端部随机卷绕的分子所造成。虽然在DNA伸展的微通道结构中发现了后者(Tegenfeldt，J.O.，O.Bakajin，C.F.Chou，S.S.Chan，R.Austin，W.Fann，L.Liou，E.Chan，T.Duke，and E.C.Cox.2001.Near-field scanner for moving molecules.Phys.Rev.Lett.86：1378-1381)，但是其没有被利用10至20nm孔的DNA迁移实验所描述(Li，J.L.，M.Gershow，D.Stein，E.Brandin，and J.A.Golovchenko.2003.DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope.Nat.Mater.2：611-615)，在利用100nm的纳米通道对较长DNA分子的光学研究中也没有被发现(Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA moleculesundergoing entropically induced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)。可以通过降低焦点容积的长度获得对较小分子构象的进一步分析。这可以通过采用较小的光纤直径，采用放大倍数较高的物镜(造成此处所用光学系统的点距离降低)，或针对近场显微镜组合纳米通道和光学纳米裂缝(Tegenfeldt，J.O.，O.Bakajin，C.F.Chou，S.S.Chan，R.Austin，W.Fann，L.Liou，E.Chan，T.Duke，and E.C.Cox.2001.Near-field scanner for movingmolecules.Phys.Rev.Lett.86：1378-1381)。信号斜率中同样有速度信息，但其分析受到类似的限制。但是，通过同时拟合伙伴爆发克服了该局限，在该情况下，在焦点容积之间的移动时间左右速度的确定，因为其对组合拟合的影响很大。
以前的涉及DNA伸展和分析的工作已经利用了液体动力来伸长DNA，接着确定结合至特定主要位点(motif sites)的荧光核酸肽标记的位置，获得该链的序列信息(Perkins，T.T.，D.E.Smith，and S.Chu.1997.Single polymerdynamics in an elongational flow.Science 276：2016-2021；Phillips，K.M.，J.W.Larson，G.R.Yantz，C.M.D′Antoni，M.V.Gallo，K.A.Gillis，N.M.Goncalves，L.A.Neely，S.R.Gullans，and R.Gilmanshin.2005.Application of singlemolecule teehnology to rapidly map long DNA and study the conformation ofstretched DNA.NucleicAcids Res.33：5829-5837)。虽然该方法可以完全伸展DNA链，但是所使用的流体通道的照明是不均匀的。如此处所展示，纳米通道中的动态电泳伸展没有被优化至获得完全伸展的链，但是获得了纳米通道的均匀的照明。这提升了激发均匀度，并使得可以利用解析拟合确定DNA构象，理论上能够确定位点特定的信息，即使采用折叠的链。基于光子计数，均匀的照明还可以获得更精确的片段尺寸，从而可以获得能够被确认为完整的分子的百分比。在此并没有采用液动力伸展中常被采用的光子计数的速度校正(Phillips，K.M.，J.W.Larson，G.R.Yantz，C.M.D′Antoni，M.V.Gallo，K.A.Gillis，N.M.Goncalves，L.A.Neely，S.R.Gullans，and R.Gilmanshin.2005.Application of singlemolecule technology to rapidly map long DNA and study the conformation ofstretched DNA.Nucleic Acids Res.33：5829-5837；Chan，E.Y.，N.M.Goncalves，R.A.Haeusler，A.J.Hatch，J.W.Larson，A.M.Maletta，G.R.Yantz，E.D.Carstea，M.Fuchs，G.G.Wong，S.R.Gullans，and R.Gilmanshin.2004.DNA mapping using microfluidic stretching and single-molecule detection of fluorescent site-specific tags.Genome Res.14：1137-1146)。
也观察到电动力伸展沿纳米通道长度是均匀的，虽然分子没有被完全伸长。这说明即使在比液动力伸展低一个数量级的速度下，利用由较长照明时间产生的较强的荧光信号可以确定标记位置。通过在纳米通道的入口处建立更强的电场梯度，很可能获得链的进一步电动力伸展。通过采用更小的纳米通道，更少连接至纳米裂缝的平行纳米通道，或提高纳米裂缝的深度，可以获得至少一个数量级的更强的梯度。已经展示了10nm的纳米通道的制造(Cao，H.，Z.N.Yu，J.Wang，J.O.Tegenfeldt，R.H.Austin，E.Chen，W.Wu，and S.Y.Chou.2002.Fabricationof 10nm enclosed nanofluidic channels.Appl.Phys.Lett.81：174-176)，以及自纳米裂缝至微通道的DNA分子的重复迁移(Han，J.and H.G.Craighead.1999.Entropic trapping and sieving of long DNA molecules in a nanofluidicchannel.J.Vac.Sci.Technol.A-Vac.Surf.Films 17：2142-2147；Han，J.and H.G.Craighead.2000.Separation of long DNA molecules in a microfabricatedentropic trap array.Science 288：1026-1029)。
分子速度与折叠程度的关系
为了研究DNA折叠对速度的影响，结合了在U＝50V的装置偏置下的三轮1分钟的λ噬菌体DNA实验(包括图30A-F中所展示的实验)的结果。图31A展示了752个完整的λ噬菌体DNA分子的相对于表观长度/真实长度lA/lR的速度vS的分布。折叠增加的从而具有较小lA/lR的分子具有较高的速度vS。图31B绘制了速度分布vS与链中折叠数量的关系。用被选中的用于描述产生的荧光爆发的解析模型来确定每一分子中的折叠数量。发现折叠的总体影响是比较弱的。无折叠分子比较稀有，只产生了两个数据点，并且发现具有三个折叠的分子的速度vS比具有一个或两个折叠的分子的速度稍高。这可能是由折叠分子的平行链之间的增加的液动力相互作用造成的。因为电泳驱动的DNA分子应该是自由穿流的，只有当链区域很接近时这些液动力相互作用才会发生，这解释了影响弱的原因。但是，为了彻底解释该结果，分子动力学模拟可能是必要的。
分子速度、移动性及摩擦与装置偏置的关系
为了研究装置偏置对分子速度和长度的影响，在几个不同的装置偏置U下，取自λ噬菌体DNA样本的分子被驱动通过纳米通道。对每一装置偏置重复进行五轮实验，并且通过采用对应的模型分析了互相关曲线和单荧光爆发。图32A中绘制了平均单分子速度
Figure BPA00001329213201081
与装置偏置U之间的关系。
Figure BPA00001329213201082
的线性拟合产生斜率mS＝60.9±1.4μm/(Vs)，确认了速度如预期般地随装置偏置和电场而提高。为了比较，由互相关函数得出的有关速度的线图
Figure BPA00001329213201083
被加入该图，其展示了非常相似的斜率mC＝61.0±0.7μm/(Vs)。
根据装置的尺寸计算获得纳米通道中电场E和装置偏置U的比率为31cm-1。把所述的线性拟合的斜率除以该比率得到DNA分子的移动性为
Figure BPA00001329213201085
假设被标记的DNA分子(30)单位长度的电量为λ＝1.1e0/nm，并考虑折叠对速度只有轻微影响，估计获得单位拉直长度的摩擦系数为ξS＝λ/μS＝9.3fNs/μm2。这与在相似的纳米通道装置中所发现的10.0fNs/μm2很接近(Mannion，J.T.，C.H.Reccius，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2006.Conformational analysis of single DNA moleculesundergoing entropically induced motion in nanochannels.Biophys.J.90：4538-4545)。然而，该计算只能被看作是近似，因为一些连接至被研究的通道的平行的通道展示出随意的压缩，其对这个特定的装置中真实电场的影响是未知的。
伸展与装置偏置的关系
图32B展示了DNA链真实长度随增加的装置偏置的变化。由于λ噬菌体DNA分子的分裂，单分子长度的结果被绘制成灰阶强度分布而非平均值。因为每个分布的分子数在～140至～1200之间变化，对于每一装置偏置，展示了归一化的真实长度分布。大体上，对应于大多数完整的λ噬菌体DNA分子，真实长度分布的最大值保持不变，直至～10V。接着，直至75V才观察到真实长度的提高，其后，在更高的装置偏置下真实长度保持高台状。对该趋势的完整的解释超越了本研究的范围，从而必须把DNA伸展解释为是由纳米通道中的进入效应和熵限制，以及液动力和通道表面摩擦所造成的。由互相关分析产生的平均长度
Figure BPA00001329213201091
被绘制成单分子分布的叠加。单分子分布的提高趋势没有单分子分析程序那么明显，其中，该分析程序考虑了被相关分析所忽略的分子折叠和分裂。
长度及速度与DNA尺寸的关系
为了测试该方法的灵敏度，将其与之前所展示的基于强度测量的技术进行比较，并确定DNA速度与纳米通道中碱基对数量的关系，进行了实验。对于有关被局限于纳米级环境中的DNA的电泳的理论的发展，以及对于利用DNA尺寸依赖来达成生物分子分离，该关系是值得注意的。通过把λ噬菌体DNA及其HindIII内切酶等份混合获得具有较广DNA分子尺寸范围的样本。获得的混合物含有九种主要的DNA分子(以碱基对形式：125、564、2,027、2,322、4,361、6,557、9,416、23,130、及48,502)。在2分钟的实验中探测到超过16,000个分子，并且进行了自动分析，其结果被展示于图33A-F中。几乎所有分散的数据点都是泊松焦点容积占据统计所获得的重叠分子的结果(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by singlemolecule detection in submicrometer-sized closed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422)。
在该实验中还观察到另外两个现象，其中，如前所述，该实验要求对分析算法进行修改。第二光子爆发一直显示提高的折叠，通过允许伙伴爆发有不同的折叠因素解决了这个问题。这最有可能是由两个焦点容积之间的纳米通道的表面的粗糙度的提高所造成的(Reccius，C.H.，J.T.Mannion，J.D.Cross，and H.G.Craighead.2005.Compression and free expansion of single DNA molecules innanochannels.Phys.Rev.Lett.95：2681011-2681014)。最长的DNA分子也具有低于预期的光子计数和爆发高度，其被解释为由为具有超过20,000个光子的计数的分子选择较小的拟合幅值所造成。这被归因于纳米裂缝中较长DNA链的较低移动性，造成染料分子在纳米裂缝表面上的损失提高，以及由散射激光造成的光褪色。虽然之前只在较浅的纳米裂缝中观察到这个移动性效应(Cross，J.D.，E.A.Strychalski，and H.G.Craighead.2007.Size-dependent DNA mobility innanochannels.J.Appl.Phys.102：247011-247015)，由于更粗糙的纳米裂缝通道表面，在此可能产生相似的结果。
所述样本也含有一小部分λ噬菌体DNA多聚体，相比在图33A-F中被可视化的，其在更高的光子计数下被观察到，并且具有更长的长度。图33D展示了每个分子光子计数对真实长度lR的色彩编码的强度直方图。图33A和图33E中绘制了真实长度和每个分子光子计数的分布。图33A和图33E中的分布是分别以9次重叠和8次重叠的用对数修改的高斯函数来拟合的，如方程式14所描述。根据Foquet等的分析，两个线图中的峰值3都被解释为2,027bp和2,322bp片段的峰值的结合(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by single molecule detection in submicrometer-sized closed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422)。图33A中的峰值8由4,361bp和23,130bp片段的部分产生，其在互补的端部退火并产生额外的27,491bp片段(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by single molecule detection insubmicrometer-sized closed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422)，虽然该样本被加热以避免该影响。因为通过在较长的DNA长度上的光子计数推断DNA尺寸的分辨率较低，在图8E中没有观察到这个峰值。
表1列出了这些峰值位置的拟合结果及相关的标准偏差。
Figure BPA00001329213201111
表1.图33A和33E的拟合结果
在图33A和33E中，多个峰值被观察到，并将其匹配于已知的DNA链尺寸。图33A中的真实长度分布的拟合给出了真实长度lR和不同链尺寸的标准偏差。图33E中的每个分子的计数的分布的拟合给出了每个分子的计数及标准偏差。分子的百分比来自图33A。
对于两个拟合，相对标准偏差随链尺寸的提高以S形降低(未图示)，图33E中的峰值7是一个例外，因为它含有未解的27,491bp DNA链，在图33A中，其被拟合为一个单独的峰。对于较长的分子，两个测量的分辨率都得到提升，这与凝胶电泳相反。在以前的光子计数测量中也观察到了这点，其与染料荧光、探测效率以及结合至相同尺寸的链的染料分子数量的波动符合泊松统计的事实相关(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by single molecule detection in submicrometer-sizedclosed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422；Chou，H.P.，C.Spence，A.Scherer，and S.Quake.1999.A microfabricated device for sizing and sortingDNA molecules.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：11-13)。这些波动以相似的方式影响爆发拟合的质量，从而对于较长链导致类似的分辨率提升。因为染料结合是序列依赖的，因为YOYO-1从DNA的较低的脱落率(off-rate)，结合至链的染料分子的数量没有达到平衡。两个现象都负面地影响了分辨率。发现测量到的λ噬菌体DNA的长度13.1μm比图30A-F和图32A-B中的实验里所测量到的长。
这些实验是在不同的装置中实施的，这些装置可能具有不同的通道宽度，特别是在关键的通道入口处。在图33B和33C中，绘制出对应被拟合的峰值的平均长度以及每个分子的平均光子计数和为这些片段假设的碱基对数量之间的关系。以线性拟合描述了获得的依赖性，强调了每一峰值对应所期望的片断的事实。这也说明了伸展因素s＝lR/L依赖链长度。
所述拟合的斜率为mlR＝0.24±0.01nm/bp以及mC＝0.63±0.02cnts/bp。后者比Foquet等获得的2.5cnts/bp的四分之一小(Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing bysingle molecule detection in submicrometer-sized closed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422)，这可能是由于采用了不同的光学元器件包括更小的光线以及纳米裂缝表面对染料分子的吸收的提高。尽管探测效率较低，因为较小的纳米通道和采用两个焦点容积使得噪声降低，仍然解析出了最小的λ-Hind III内切酶片段的部分。
第二光子计数信号具有过滤效应，因为由互相关分析所预测到的在该时间范围内的无伙伴爆发的荧光爆发被删除。这允许时间范围比观察到的时间差变化大大约一个数量级，并且不影响所述分布。图33C中，最长DNA分子的光子计数明显位于线性拟合下方，这是由在所采用的装置中的染料损失的提高以及该分子的光褪色所造成的。
表1还给出了在每一峰值中探测到的占总分子数的百分比。考虑退火效应(请参如Foquet，M.，J.Korlach，W.Zipfel，W.W.Webb，and H.G.Craighead.2002.DNA fragment sizing by single molecule detection in submicrometer-sized closed fluidic channels.Anal.Chem.74：1415-1422)，峰值1-8包括预期的占总计数的百分比。由于高单分子探测阈值，峰值1具有降低的值，而由于长分子在纳米裂缝中的减速，峰值9被降低。
忽略λ-噬菌体分子，基于图33A中所示的结果，计算获得这些峰值中完整内切酶片段的总百分比为82％。用琼脂糖凝胶电泳测得的值为81％。相比于λ-噬菌体DNA，这个较高的完整分子的百分比是由与酶切片段峰值一致的随机片段造成的。
图33F是色彩编码的分子数量对分子速度vS和真实长度lR的强度直方图(此处展示为灰阶图)。在25V和100V的装置偏置下重复该测量(未展示结果)，观察到同样的趋势，其还与对自由溶液中具有相当长度的DNA分子观察到的趋势相似(Stellwagen，N.C.，C.Gelfi，and P.G.Righetti.1997.The Free SolutionMobility of DNA.Biopolymers 42：687-703)。这说明由不受局限的DNA的随机卷曲形状变形至伸长的和伸展的构象对长度大于通道宽度的链的速度仅有可忽略的影响。
观察到最小的片段(125bp)具有稍低的速度，在自由溶液中100bp附近也观察到相似的趋势(Stigter，D.2002.Wall effects on DNA stretch and relaxation.Biophysical Chemistry 101：447-459)，其被归因于电解液摩擦(electrolytefriction)。在此，其也可能与小于纳米通道的宽度和深度的DNA长度有关，其允许分子方向相对于通道长度更加横向，这导致液动力摩擦提高。较长分子不具有这些方向，因为特征在于维持长度的双链DNA的已知的刚度导致其方向更倾向于和通道轴线对齐。
为了正确地说明具有小于焦点容积长度d/m＝50μm/40＝1.25μm的表观长度的较短的DNA片段，必须精确地预先确定拟合方程的前因素p0，1和p0，2。只要单个的无折叠DNA链的爆发高度在整个实验过程中保持不变，这就是可能的。发现由于镜台或激光漂移，其时间限制为～2分钟，这限制了在低电压下探测到的分子数量。另外一个局限与装置载入时间相关。发现分子的荧光强度随DNA分子在装置的纳米裂缝区域所花费的时间而降低，即使在直接暴露于聚焦的激光之前。对该效应的解释包括由散射的或反射的激光造成的光褪色，或由于带正电荷的YOYO-1染料分子被带负电荷的通道壁所吸引而造成的损失。虽然所述溶液含有PVP以动态地覆盖通道表面并降低相互作用，但是在纳米通道出口之后确实观察到背景荧光的提高。对于如图33A-F所示实验所采用的装置而言，该现象尤其明显。
6.5.5结论
该例子展示了快速分析荧光标记的DNA分子的方法，并且实施了几个研究DNA在纳米通道中物理特性的实验。用电泳把DNA分子从纳米裂缝驱动至纳米通道中，以对其进行限制并动态地伸长这些链超过其平衡构象。沿纳米通道的长度按顺序聚焦两束激光，以诱导这些分子产生荧光爆发。这些爆发展示出指示折叠的多个强度级，并且用多种解析拟合模型分析了采集到的光子计数信号，获得了单个的DNA链的分子构象、长度以及速度。
通过把每一荧光爆发的形状拟合至解析模型以及通过光子计数确定了分子长度。虽然光子计数比较简单，对于此处所采用的光学系统以及较长的链，模拟和拟合这些爆发可以产生更好的分辨率，并且对于分析未知样本具有以下优势：对于爆发形状拟合无需校正样本，并且其较少受激发强度和荧光标记变化的影响。对于平均真实长度为11μm的单个的分子，对前端有一次折叠的λ-噬菌体DNA的分辨率是114nm，分析时间是每个分子～20ms。发现分子的速度随折叠的增加只是轻微地提高。该趋势的一个可能的原因是接近的链区域之间的液动力相互作用的提高。可以通过分子动态模拟针对液动力摩擦和表面相互作用对分子速度的影响进行更深入的研究。发现DNA伸展随采用的装置偏置和电场而增强，这是从纳米通道尺寸为纳米裂缝尺寸56倍的装置中得出的。
对λ-噬菌体和其Hind III内切酶的混合物的分析说明我们的方法可以通过长度识别出跨越2.5个数量级的尺寸范围的10个片段中的9个。与标准的琼脂糖凝胶电泳法相比，可以分析更长的链(＞20kbp)，测量时间至少快30倍，并且消耗的样本量少得多。虽然对于琼脂糖凝胶电泳法而言分辨率随尺寸降低，发现本方法正好与之相反。对于研究过的所有片段，发现速度几乎不变，这说明对于短的片断速度仅有少许降低。限制、伸长以及与通道表面的相互作用没有导致对速度的尺寸依赖的显著影响。
也可以获得信号开始和结束处斜率中的比焦点容积长度短的分子的长度和构象信息，只是当前其被信号波动模糊化了。可以通过利用更小的纳米通道进一步伸长这些DNA分子获得这些信息，其可能导致沿通道更均匀的碱基对浓度。这将产生波动更小的荧光信号，从而获得利用本方法的改善的长度测定。其他物理信息，比如分子构象和速度，的精确度也会提高，从而可进一步了解DNA分子在高度局限的环境中的行为。因为爆发拟合可以不受衍射限制提供空间信息，此处所描述的方法可用于极快速和超高空间分辨率测量。其他应用有位点特定的标记的位置以及生物物理效应，如结的形成。因为这个标记或结可能位于DNA的折叠区域，具有模糊的位置，就必须开发出模型用于提取位置信息。可以采用考量了提高了的形成更复杂的折叠构象和结的可能性的光子爆发拟合模型来分析含有更长DNA链的样本。
本发明不限于在此所描述的实施例的范围。事实上，根据以上描述，对于本领域的技术人员而言，对本发明的各种改动是显而易见的。这些改动依然落入后附权利要求的范围之内。
在此所引用的所有参考资料以参考的形式被全文并入，就像特别地以及单个地指出每一单个的发表、专利或专利申请以参考的形式被全文并入。
任何发表的引用是由于其在本申请的申请日前已公开，而不应被认为是承认其在本发明之前创作。

Claims (72)

1.一种电探测器，包括纳米流体通道和电荷传感器，其中：
所述电荷传感器选自由以下构成的组：纳米线、纳米管、晶体管以及电容，以及所述电荷传感器的至少一部分被集成在所述纳米流体通道中，从而使所述电荷传感器接触到所述纳米流体通道中的液体。
2.如权利要求1所述的电探测器，所述电荷传感器的至少一部分是位于所述纳米流体通道的内部或表面上。
3.如权利要求1所述的电探测器，所述电荷传感器的全部都位于所述纳米流体通道的内部或表面上。
4.如权利要求1所述的电探测器，其包括位于所述纳米流体通道内部或表面上的电荷传感器电极。
5.如权利要求1所述的电探测器，其包括多个纳米流体通道。
6.如权利要求5所述的电探测器，所述多个纳米流体通道的个数是2-10，10-50，50-100，100-500，500-1000，或1000-5000个。
7.如权利要求1所述的电探测器，其包括多个电荷传感器，其中，每个电荷传感器的一部分被集成在所述纳米流体通道中。
8.如权利要求7所述的电探测器，所述多个电荷传感器的个数是2-10，10-50，50-100，或100-500个。
9.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米流体通道的深度与德拜屏蔽长度相近。
10.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米流体通道的深度小于德拜屏蔽长度。
11.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米流体通道的深度是德拜屏蔽长度的2-10倍。
12.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米流体通道的深度是0.1纳米到1毫米。
13.如权利要求9-11任一项所述的电探测器，其中，所述德拜屏蔽长度是0.1纳米到1000纳米。
14.如权利要求13所述的电探测器，其中，所述德拜屏蔽长度是10纳米。
15.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米流体通道的宽度是0.1纳米到1纳米，1纳米到5纳米，5纳米到10纳米，10纳米到50纳米，50纳米到100纳米，100纳米到500纳米，500纳米到1微米，1微米到5微米，或5微米到10微米。
16.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米管是一种p型或n型纳米管。
17.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米线或纳米管包含一种半导体材料。
18.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米线或纳米管包含碳或硅。
19.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述晶体管是场效应晶体管（FET）。
20.如权利要求19所述的电探测器，其中，所述场效应晶体管是纳米流体通道表面上的一层薄膜。
21.如权利要求1所述的电探测器，其包括一微流体或宏观流体结构，其流体连接到所述纳米流体通道。
22.如权利要求21所述的电探测器，其中，所述微流体或宏观流体结构是储液池或通道。
23.如权利要求21所述的电探测器，其中，所述微流体或宏观流体结构是选自由以下构成的组：细胞分选区域、过滤区域、分离区域、核酸放大区域、反应区域和储存区域。
24.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒与电荷传感器接触。
25.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒不与电荷传感器接触。
26.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒被抑制或限制在靠近电荷传感器的感应范围。
27.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒是无标记或未标记的。
28.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述电荷传感器是可寻址的半导体电荷传感器，其起到电解质栅型场效应晶体管的作用。
29.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述电荷传感器是非官能化的。
30.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述电荷传感器是官能化的。
31.如权利要求30所述的电探测器，其中，电荷传感器是以一个分子官能化的，该分子选自由以下构成的组：抗体的一部分和寡核苷酸。
32.如权利要求31所述的电探测器，其中，所述寡核苷酸是一种与微RNA结合的探针寡核苷酸。
33.如权利要求1所述的电探测器，其包括一个基片。
34.如权利要求33所述的电探测器，其中，所述基片是一种半导体或绝缘基片。
35.如权利要求33所述的电探测器，其中，所述基片包含锗。
36.如权利要求33所述的电探测器，其中，所述基片是硅基基片。
37.如权利要求36所述的电探测器，其中，所述硅基基片选自由以下构成的组：硅、二氧化硅和玻璃。
38.如权利要求37所述的电探测器，其中，所述二氧化硅构成的硅基基片是熔融的。
39.如权利要求33所述的电探测器，其中，所述基片是电绝缘的或至少包括一电绝缘表面。
40.如权利要求33所述的电探测器，其中，所述基片是透明的。
41.如权利要求40所述的电探测器，其中，所述透明基片的厚度适用于对纳米流体通道中的目标分子或微粒利用显微镜进行光学观测。
42.如权利要求41所述的电探测器，其中，所述透明基片的厚度约170纳米。
43.如权利要求1所述的电探测器，其中，恒定源漏偏置电压发生器产生恒定源漏偏置电压，并且以监测流过所述电荷传感器的电流。
44.如权利要求43所述的电探测器，其中，所述偏置电压选自由以下构成的组：交流偏置电压、周期信号以及非周期信号。
45.如权利要求1所述的电探测器，其中，源极和漏极电极对通过电触点与电荷传感器电连接。
46.如权利要求45所述的电探测器，其包括一个绝缘体来隔绝连接至所述电荷传感器的源极和漏极电极对的电触点。
47.如权利要求46所述的电探测器，其中，所述电触点是由铂或银/氯化银制成的。
48.如权利要求46所述的电探测器，其中，所述绝缘体是氮化硅。
49.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述纳米流体通道的尺寸把目标分子或微粒限制在电荷传感器感应范围内。
50.如权利要求49所述的电探测器，其中，所述电荷传感器位于所述纳米流体通道内并与被限制的目标分子或微粒足够接近以避免明显的电荷屏蔽。
51.如权利要求1所述的电探测器，其中，所述电荷传感器感应范围是所述电荷传感器直径加上两倍离子屏蔽距离。
52.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒是带电的分子或微粒。
53.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒是非缔合的或自由的。
54.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒附于另一实体。
55.如权利要求52所述的电探测器，其中，所述目标分子或微粒是标记的或未标记的。
56.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒为病毒、核酸、蛋白质、细胞、细胞碎片或细胞器、纤维微粒、金属微粒、或量子点。
57.如权利要求1所述的电探测器，其中，目标分子或微粒被探测到、控制或操控。
58.一种探测目标生物或者化学物类或者与所述物类相关联的标签的方法，包括：
提供权利要求1所述的电探测器；
使所述目标生物或者化学物类或者带有所述目标生物或者化学物类的实体流过所述电探测器的纳米流体通道；以及
使电荷传感器和所述目标生物或者化学物类或所述标签接触，从而产生可探测到的指示所述目标生物或化学物类的存在的信号。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述物类存在于溶液中或者所述实体是溶液。
60.如权利要求58所述的方法，其中，所述目标生物或者化学物类是通过电动力驱动流过纳米流体通道。
61.如权利要求58所述的方法，其中，所述可探测到的信号是电荷传感器电导率的变化。
62.如权利要求61所述的方法，包括对所述电荷传感器电导率进行监测。
63.如权利要求58所述的方法，包括可视化所述电荷传感器附近的物类。
64.一种探测局部溶液电势的方法，包括：
提供如权利要求1所述的电探测器；
使所述溶液流过所述电探测器的纳米流体通道；以及
使所述电荷传感器与所述溶液接触，从而产生可探测到的局部溶液电势信号。
65.如权利要求64所述的方法，其中，所述可探测到的信号是电荷传感器电导率的变化。
66.如权利要求65所述的方法，包括对所述电荷传感器电导率进行监测。
67.一种测量带电目标分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度的方法，包括：
提供：
以光学可探测的标记、特征、标签或修饰标记的带电目标分子或微粒，
一个纳米裂缝，
一个纳米流体通道，以及
通过激光先后聚焦在纳米流体通道形成的两个空间上分隔的焦点容积；
以电泳驱动所述标记的带电目标分子或微粒通过所述纳米裂缝进入所述纳米流体通道；
输送所述标记的带电目标分子或微粒通过所述两个空间上分隔的焦点容积，从而产生时间上相互错开的第一光学可探测到的信号和第二光学可探测到的信号；
探测所述第一和第二光学可探测到的信号中的光子爆发或光子计数信号；
测量所述第一和第二光学可探测到的信号中的光子爆发或光子计数信号；
利用对所述第一和第二光学可探测到的信号中的光子爆发或光子计数信号的测量进行速度或互相关测量；
根据所述速度或互相关测量计算带电目标分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度，
其中所述方法包括提供如权利要求1所述的电探测器，其中，所述电探测器包括纳米裂缝和纳米流体通道。
68.如权利要求67所述的方法，其中，所述带电目标分子或微粒用光学可探测的标记
进行标记，所述光学可探测的标记是荧光标记。
69.如权利要求67所述的方法，其包括：
提供连接到第一光电二极管的第一光纤和连接到第二光电二极管的第二光纤；
将第一光学可探测到的信号中的图像投射到所述第一光纤；
将第二光学可探测到的信号中的图像投射到所述第二光纤；
用所述第一光电二极管探测所述第一光学可探测到的信号中的图象；
用所述第二光电二极管探测所述第二光学可探测到的信号中的图象；
确定沿纳米流体通道轴线的单位通道长度和时间发射的光子数；
确定每一光纤位置处的最终图像；及
通过测定到达每个光电二极管的光子数测量每一光学可探测到的信号。
70.如权利要求67所述的方法，包括分析被测量的所述第一和第二光学可探测到的信号的互相关函数。
71.如权利要求67所述的方法，包括进行单分子爆发分析。
72.如权利要求67所述的方法，其中，计算所述带电目标分子或微粒的构象、长度、速度或标记强度包括进行对数分布的高斯拟合。
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Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8003934B2 (en) * 2004-02-23 2011-08-23 Andreas Hieke Methods and apparatus for ion sources, ion control and ion measurement for macromolecules
EP2462245B1 (en) 2009-08-06 2016-10-05 Cornell University Device and methods for epigenetic analysis
US9605307B2 (en) 2010-02-08 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
US20120052188A1 (en) 2010-02-08 2012-03-01 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for assembling a lipid bilayer on a substantially planar solid surface
US9678055B2 (en) 2010-02-08 2017-06-13 Genia Technologies, Inc. Methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
US9121823B2 (en) * 2010-02-19 2015-09-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania High-resolution analysis devices and related methods
US8940148B2 (en) 2010-06-22 2015-01-27 International Business Machines Corporation Nano-fluidic field effective device to control DNA transport through the same
US10126291B2 (en) * 2013-02-18 2018-11-13 Anpac Bio-Medical Science Co., Ltd. Apparatus for disease detection
EP2588860A4 (en) * 2010-06-30 2017-01-25 ANPAC Bio-Medical Science Co., Ltd. Apparatus for disease detection
US11340214B2 (en) 2010-06-30 2022-05-24 Anpac Bio-Medical Science Co., Ltd. Apparatus for disease detection
US20120064567A1 (en) * 2010-09-09 2012-03-15 Imec Active micro sieve and methods for biological applications
GB201017905D0 (en) * 2010-10-25 2010-12-01 Mir Kalim U Preparation and analysis of samples
US8962242B2 (en) 2011-01-24 2015-02-24 Genia Technologies, Inc. System for detecting electrical properties of a molecular complex
US20120211805A1 (en) 2011-02-22 2012-08-23 Bernhard Winkler Cavity structures for mems devices
CA2831223C (en) 2011-03-24 2019-04-02 Anpac Bio-Medical Science (Lishui) Co., Ltd. Micro-devices for disease detection
EP2694671B1 (en) * 2011-04-04 2021-01-06 President and Fellows of Harvard College Nanopore sensor comprising a device for measuring the local electrical potential
US8558326B2 (en) * 2011-04-06 2013-10-15 International Business Machines Corporation Semiconductor devices having nanochannels confined by nanometer-spaced electrodes
US9274053B2 (en) * 2011-05-18 2016-03-01 Uvic Industry Partnerships Inc. Flow through metallic nanohole arrays
CN102346164B (zh) * 2011-07-01 2013-09-11 北京科技大学 一种基于超长氧化锌纳米线的尿酸传感器的构建方法
US10466160B2 (en) 2011-08-01 2019-11-05 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for retrieving and analyzing particles
US9404864B2 (en) 2013-03-13 2016-08-02 Denovo Sciences, Inc. System for imaging captured cells
WO2013019491A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Denovo Sciences Cell capture system and method of use
US9174216B2 (en) 2013-03-13 2015-11-03 DeNovo Science, Inc. System for capturing and analyzing cells
CN102447849B (zh) * 2011-09-06 2013-08-21 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种高压运放实现emccd信号驱动的系统
US11053535B2 (en) 2011-09-12 2021-07-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Devices with a fluid transport nanochannel intersected by a fluid sensing nanochannel and related methods
WO2013101672A2 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Agilent Technologies, Inc. Two dimensional nanofluidic ccd arrays for manipulation of charged molecules in solution
WO2013106562A1 (en) * 2012-01-10 2013-07-18 Northeastern University Wireless swnt sensor integrated with microfluidic system for various liquid sensing applications
EP3591408A1 (en) 2012-02-10 2020-01-08 The University of North Carolina at Chapel Hill Devices with fluidic nanofunnels, associated methods, fabrication and analysis systems
US8986629B2 (en) 2012-02-27 2015-03-24 Genia Technologies, Inc. Sensor circuit for controlling, detecting, and measuring a molecular complex
CN103424457B (zh) * 2012-05-18 2016-02-10 中国科学院微电子研究所 生物传感器及其dna测序方法
US20150219592A1 (en) * 2012-07-20 2015-08-06 Northeastern University Microfluidic-nanofluidic devices for detection and measurement of redox active substances
US20140045193A1 (en) * 2012-08-10 2014-02-13 Cedars-Sinai Medical Center Methionine metabolites predict aggressive cancer progression
US20170054858A1 (en) 2012-09-12 2017-02-23 Fabricio COELHO System and method for sharing collaborative digital photo albums
US20140103735A1 (en) * 2012-10-16 2014-04-17 California Institute Of Technology Systems and methods for wireless transducers through integrated on-chip antenna
EP2909601B1 (en) 2012-10-16 2019-09-11 Abbott Laboratories Method of increasing the debye length on a sensor surface within a sample solution and corresponding computer readable strorage medium
CN102923635B (zh) * 2012-10-26 2015-06-03 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 纳米流体二极管及其制造方法
US8906215B2 (en) * 2012-11-30 2014-12-09 International Business Machines Corporation Field effect based nanosensor for biopolymer manipulation and detection
US9752181B2 (en) 2013-01-26 2017-09-05 Denovo Sciences, Inc. System and method for capturing and analyzing cells
US20150368706A1 (en) * 2013-02-05 2015-12-24 Bionano Genomics, Inc. Methods for single-molecule analysis
US9759711B2 (en) 2013-02-05 2017-09-12 Genia Technologies, Inc. Nanopore arrays
US9625493B2 (en) * 2013-02-22 2017-04-18 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Process control monitoring for biochips
EP2962117B1 (en) * 2013-02-28 2019-10-09 The University of North Carolina At Chapel Hill Nanofluidic devices with integrated components for the controlled capture, trapping, and transport of macromolecules and related methods of analysis
US9707562B2 (en) 2013-03-13 2017-07-18 Denovo Sciences, Inc. System for capturing and analyzing cells
NZ711033A (en) 2013-03-13 2020-03-27 Univ North Carolina Chapel Hill Nanofluidic devices for the rapid mapping of whole genomes and related systems and methods of analysis
CN103246698B (zh) * 2013-03-29 2016-12-07 华东理工大学 基于纳米通道单分子检测系统的数据处理方法
CN103278548B (zh) * 2013-05-02 2015-03-04 华中科技大学 一种固态纳米孔dna测序的电信号校准方法
US9856535B2 (en) 2013-05-31 2018-01-02 Denovo Sciences, Inc. System for isolating cells
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
US10534361B2 (en) * 2013-06-10 2020-01-14 Abb Schweiz Ag Industrial asset health model update
US11055450B2 (en) * 2013-06-10 2021-07-06 Abb Power Grids Switzerland Ag Industrial asset health model update
RU142580U1 (ru) * 2013-08-02 2014-06-27 Байонано Дженомикс, Инк. Система наноанализа
CN103399043B (zh) * 2013-08-23 2015-05-27 哈尔滨理工大学 基于zeta电位研究无机粒子与LDPE复合材料的介电性能的方法
US9683958B2 (en) 2013-09-11 2017-06-20 Agilent Technologies, Inc. Nanofluidic device for charge analysis of straightened molecules
WO2015038953A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Wisconsin Alumni Research Foundation System and method for presenting large dna molecules for analysis
US9136136B2 (en) * 2013-09-19 2015-09-15 Infineon Technologies Dresden Gmbh Method and structure for creating cavities with extreme aspect ratios
US9551697B2 (en) 2013-10-17 2017-01-24 Genia Technologies, Inc. Non-faradaic, capacitively coupled measurement in a nanopore cell array
US10344324B2 (en) 2014-03-26 2019-07-09 International Business Machines Corporation Electrical trapping and stretching of charged biomolecules by single electrode gating structure
US9146211B1 (en) 2014-03-26 2015-09-29 International Business Machines Corporation Nano-ring gate electrode nanochannels
US9806217B2 (en) * 2014-04-30 2017-10-31 William Marsh Rice University Fully integrated CMOS-compatible photodetector with color selectivity and intrinsic gain
CA2953755C (en) * 2014-07-03 2022-05-03 Abionic Sa Capsule for rapid molecular quantification of a fluid sample such as whole blood
ES2697428T3 (es) * 2014-07-15 2019-01-23 Illumina Inc Dispositivo electrónico activado bioquímicamente
EP3471402B1 (en) * 2014-08-08 2023-05-31 Quantum-Si Incorporated Integrated device for temporal binning of received photons
EP3218934A4 (en) * 2014-11-13 2018-06-20 Neem Scientific Inc. Large scale, low cost nanosensor, nano-needle, and nanopump arrays
CA3005143A1 (en) 2014-12-01 2016-06-16 Cornell University Nanopore-containing substrates with aligned nanoscale electronic elements and methods of making and using same
AU2015360849B2 (en) * 2014-12-08 2018-10-11 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic device comprising lateral/vertical transistor structures and process of making and using same
US9733210B2 (en) 2014-12-31 2017-08-15 International Business Machines Corporation Nanofluid sensor with real-time spatial sensing
FR3032955A1 (fr) * 2015-02-19 2016-08-26 Centre Nat De La Rech Scient - Cnrs - Dispositif micro-fluidique et appareil comprenant un tel dispositif
US10471428B2 (en) 2015-05-11 2019-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Fluidic devices with nanoscale manifolds for molecular transport, related systems and methods of analysis
WO2016196702A1 (en) * 2015-06-03 2016-12-08 Carestream Health, Inc. Electrode
CN105021683B (zh) * 2015-06-05 2017-09-15 东南大学 面向生物分子检测的二硫化钼场效应晶体管的制作方法
US20180180567A1 (en) * 2015-06-23 2018-06-28 Bgi Shenzhen Microwell electrode and method for analysis of a chemical substance
KR20180054558A (ko) 2015-06-25 2018-05-24 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 생체분자 센서들 및 방법들
US9558819B1 (en) * 2015-08-13 2017-01-31 Arm Ltd. Method, system and device for non-volatile memory device operation
US20170052182A1 (en) * 2015-08-21 2017-02-23 University Of Iowa Research Foundation Optoelectronic cartridge for cancer biomarker detection utilizing silicon nanowire arrays
US10184903B2 (en) 2015-09-11 2019-01-22 Samsung Display Co., Ltd. Device for evaluating crystallinity and method of evaluating crystallinity
EP3391037B1 (en) 2015-12-14 2022-06-22 Zedna AB Crack structures, tunneling junctions using crack structures and methods of making same
WO2017123416A1 (en) * 2016-01-14 2017-07-20 Roswell Biotechnologies, Inc. Molecular sensors and related methods
EP3408220A4 (en) 2016-01-28 2019-09-04 Roswell Biotechnologies, Inc METHOD AND DEVICE FOR MEASURING ANALYTES USING LARGE CALCULAR MOLECULAR ELECTRONIC SENSOR ARRAYS
US10712334B2 (en) 2016-01-28 2020-07-14 Roswell Biotechnologies, Inc. Massively parallel DNA sequencing apparatus
CN105717097A (zh) * 2016-01-29 2016-06-29 福建医科大学 基于牛血清白蛋白-纳米铂/铋的硫离子检测试剂盒
JP6854532B2 (ja) 2016-02-09 2021-04-07 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 電子的、標識フリーのｄｎａおよびゲノムシークエンシング
US10597767B2 (en) 2016-02-22 2020-03-24 Roswell Biotechnologies, Inc. Nanoparticle fabrication
CA3018069C (en) * 2016-03-21 2019-09-03 Two Pore Guys, Inc. Wafer-scale assembly of insulator-membrane-insulator devices for nanopore sensing
US9829456B1 (en) 2016-07-26 2017-11-28 Roswell Biotechnologies, Inc. Method of making a multi-electrode structure usable in molecular sensing devices
CN106645357B (zh) * 2016-10-17 2019-06-28 南京大学 一种晶体纳米线生物探针器件的制备方法
SG10201709799SA (en) * 2016-11-29 2018-06-28 Helios Bioelectronics Inc Method for quantitatively profiling nucleic acids
KR102622275B1 (ko) 2017-01-10 2024-01-05 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 Dna 데이터 저장을 위한 방법들 및 시스템들
KR20230158636A (ko) 2017-01-19 2023-11-20 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 2차원 레이어 재료를 포함하는 솔리드 스테이트 시퀀싱 디바이스들
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
KR20200002897A (ko) 2017-04-25 2020-01-08 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 분자 센서들을 위한 효소 회로들
EP4023764A3 (en) 2017-05-09 2022-09-21 Roswell Biotechnologies, Inc. Binding probe circuits for molecular sensors
CA3063534A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Wisconsin Alumni Research Foundation System and method for en masse patterning of molecule structures
CN107203803B (zh) * 2017-05-31 2019-12-13 京东方科技集团股份有限公司 带电粒子计数装置及其制造方法
CN107356649B (zh) * 2017-06-14 2020-02-28 浙江大学 多路生物传感器及其制造方法
US10712333B2 (en) * 2017-06-28 2020-07-14 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Limited Semiconductor device for determining a biomolecule characteristic
CN107290422B (zh) * 2017-07-20 2019-04-19 浙江大学 一种基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统及方法
EP3651903A4 (en) 2017-08-29 2021-06-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. SYSTEM AND METHOD FOR ISOLATING AND ANALYZING CELLS
CN111373049A (zh) 2017-08-30 2020-07-03 罗斯威尔生命技术公司 用于dna数据存储的进行性酶分子电子传感器
CN108513619A (zh) * 2017-08-31 2018-09-07 深圳市大疆创新科技有限公司 信号处理芯片、图像处理系统和距离测量系统
JP7019894B2 (ja) 2017-08-31 2022-02-16 エスゼット ディージェイアイ テクノロジー カンパニー リミテッド 物体を感知する方法及びセンサシステム
KR20200067871A (ko) 2017-10-10 2020-06-12 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 무증폭 dna 데이터 저장을 위한 방법, 장치 및 시스템
CN108444954B (zh) * 2017-12-08 2020-09-11 广东顺德工业设计研究院(广东顺德创新设计研究院) 光谱信号峰值检测方法、装置以及系统
WO2020103012A1 (zh) * 2018-11-21 2020-05-28 深圳华大生命科学研究院 核酸分子检测方法、检测装置和检测系统
CN109580718A (zh) * 2018-12-28 2019-04-05 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 一种纳米厚度薄膜的制备方法
DE102019200929A1 (de) * 2019-01-25 2020-07-30 Robert Bosch Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls
US20220163519A1 (en) * 2019-03-20 2022-05-26 The Regents Of The University Of California Biomimetic nanovilli chips for enhanced capture of tumor-derived extracellular vesicles
WO2020210981A1 (en) 2019-04-16 2020-10-22 Boe Technology Group Co., Ltd. Micro-channel device and manufacturing method thereof and micro-fluidic system
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
KR20220016477A (ko) 2019-05-07 2022-02-09 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드 자동화된 단일 세포 처리를 위한 시스템 및 방법
CN110136173A (zh) * 2019-05-21 2019-08-16 浙江大华技术股份有限公司 一种目标定位处理方法及装置
SG11202112898WA (en) 2019-06-14 2021-12-30 Bio Rad Laboratories System and method for automated single cell processing and analyses
US10961563B1 (en) 2019-12-19 2021-03-30 Robert Bosch Gmbh Nanoscale topography system for use in DNA sequencing and method for fabrication thereof
WO2021181745A1 (ja) * 2020-03-09 2021-09-16 株式会社村田製作所 半導体デバイス及び半導体デバイスの製造方法
US11504719B2 (en) 2020-03-12 2022-11-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for receiving and delivering a fluid for sample processing
CN111438944B (zh) * 2020-04-02 2021-10-01 吉林大学 一种基于su-8胶电解法制备纳米尺度电射流喷头的方法
WO2021257594A1 (en) * 2020-06-15 2021-12-23 Roswell Biotechnologies, Inc. Molecular electronic sensors for multiplex genetic analysis using dna reporter tags
CN113433038B (zh) * 2021-05-31 2022-11-01 昆明理工大学 一种新的混合纳米流体粒子组合的选择方法
CN113481525B (zh) * 2021-06-08 2022-11-15 中国空间技术研究院 电化学反应器及电化学反应系统
CN113691162B (zh) * 2021-09-09 2023-09-19 西南交通大学 一种基于纳流体二极管的水伏器件及其制备方法
CN115329798B (zh) * 2022-06-30 2024-04-19 北京市腾河电子技术有限公司 从弱周期性噪声中提取阶跃信号的方法及系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6790671B1 (en) * 1998-08-13 2004-09-14 Princeton University Optically characterizing polymers
CN1797013A (zh) * 2004-12-24 2006-07-05 伊索普射流技术股份有限公司 绝缘流体中用于微粒的电荷传感器

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US6123819A (en) 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
AU5763000A (en) 1999-06-22 2001-01-09 President And Fellows Of Harvard College Molecular and atomic scale evaluation of biopolymers
WO2001018246A1 (en) * 1999-08-26 2001-03-15 The Trustees Of Princeton University Microfluidic and nanofluidic electronic devices for detecting changes in capacitance of fluids and methods of using
US6616895B2 (en) 2000-03-23 2003-09-09 Advanced Research Corporation Solid state membrane channel device for the measurement and characterization of atomic and molecular sized samples
US6413792B1 (en) 2000-04-24 2002-07-02 Eagle Research Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
AU2002229046B2 (en) * 2000-12-11 2006-05-18 President And Fellows Of Harvard College Nanosensors
US6905586B2 (en) * 2002-01-28 2005-06-14 Ut-Battelle, Llc DNA and RNA sequencing by nanoscale reading through programmable electrophoresis and nanoelectrode-gated tunneling and dielectric detection
US6953958B2 (en) * 2002-03-19 2005-10-11 Cornell Research Foundation, Inc. Electronic gain cell based charge sensor
WO2008039579A2 (en) * 2006-06-15 2008-04-03 The Regents Of The University Of California Inorganic nanotubes and devices fabricated therefrom
US7416911B2 (en) 2003-06-24 2008-08-26 California Institute Of Technology Electrochemical method for attaching molecular and biomolecular structures to semiconductor microstructures and nanostructures
US7279337B2 (en) 2004-03-10 2007-10-09 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for sequencing polymers through tunneling conductance variation detection
JP2005285822A (ja) * 2004-03-26 2005-10-13 Fujitsu Ltd 半導体装置および半導体センサ
WO2006107312A1 (en) 2004-06-15 2006-10-12 President And Fellows Of Harvard College Nanosensors
US7511285B2 (en) 2004-07-16 2009-03-31 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Methods and apparatus for biomolecule identification
US20070054276A1 (en) 2004-08-12 2007-03-08 Sampson Jeffrey R Polynucleotide analysis and methods of using nanopores
WO2006025481A1 (ja) * 2004-09-03 2006-03-09 Japan Science And Technology Agency センサユニット及び反応場セルユニット並びに分析装置
US20080025875A1 (en) * 2004-09-29 2008-01-31 Martin Charles R Chemical, Particle, and Biosensing with Nanotechnology
WO2006042276A2 (en) * 2004-10-12 2006-04-20 The Regents Of The University Of California Electrochemically fabricated conducting polymer nanowire sensors
CA2603352C (en) 2005-04-06 2013-10-01 Jene Golovchenko Molecular characterization with carbon nanotube control
WO2006110846A2 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Abeygunaratne Thusara Sugat Ch Method and device for probing changes in a membrane by applying an in-plane electric field
TWI287041B (en) 2005-04-27 2007-09-21 Jung-Tang Huang An ultra-rapid DNA sequencing method with nano-transistors array based devices
US7947485B2 (en) * 2005-06-03 2011-05-24 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Method and apparatus for molecular analysis using nanoelectronic circuits
US20060275779A1 (en) 2005-06-03 2006-12-07 Zhiyong Li Method and apparatus for molecular analysis using nanowires
JP2009501930A (ja) * 2005-07-21 2009-01-22 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ バイオセンサのためのセンサチップ
EP1954838B1 (en) 2005-11-14 2014-02-26 Life Technologies Corporation Coded molecules for detecting target analytes
US7960105B2 (en) 2005-11-29 2011-06-14 National Institutes Of Health Method of DNA analysis using micro/nanochannel
US20070122313A1 (en) * 2005-11-30 2007-05-31 Zhiyong Li Nanochannel apparatus and method of fabricating
US20070178507A1 (en) 2006-01-31 2007-08-02 Wei Wu Method and apparatus for detection of molecules using nanopores
US7964347B2 (en) 2006-06-15 2011-06-21 Krassen Dimitrov Labels for electronic detection of individual molecules and methods for their detection
US20080032290A1 (en) 2006-08-03 2008-02-07 Young James E Nanopore flow cells
WO2008127314A1 (en) * 2006-11-22 2008-10-23 President And Fellows Of Harvard College High-sensitivity nanoscale wire sensors
KR100902517B1 (ko) * 2007-01-15 2009-06-15 한국과학기술원 유전율-변화 전계효과 트랜지스터 및 그 제조 방법
US8722327B2 (en) * 2007-03-28 2014-05-13 Bionano Genomics, Inc. Methods of macromolecular analysis using nanochannel arrays
EP2205765B1 (en) 2007-10-02 2012-09-12 President and Fellows of Harvard College Capture, recapture, and trapping of molecules with a nanopore
US8882980B2 (en) * 2008-09-03 2014-11-11 Nabsys, Inc. Use of longitudinally displaced nanoscale electrodes for voltage sensing of biomolecules and other analytes in fluidic channels

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6790671B1 (en) * 1998-08-13 2004-09-14 Princeton University Optically characterizing polymers
CN1797013A (zh) * 2004-12-24 2006-07-05 伊索普射流技术股份有限公司 绝缘流体中用于微粒的电荷传感器

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010044932A3 (en) 2010-08-12
US20110227558A1 (en) 2011-09-22
WO2010044932A2 (en) 2010-04-22
US10670559B2 (en) 2020-06-02
WO2010044932A9 (en) 2010-06-17
CN102150037A (zh) 2011-08-10

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Publication Publication Date Title
CN102150037B (zh) 集成电荷传感器的纳米流体通道及基于该纳米流体通道的方法
Albrecht Single-molecule analysis with solid-state nanopores
Balan et al. Improving signal-to-noise performance for DNA translocation in solid-state nanopores at MHz bandwidths
McNally et al. Electromechanical unzipping of individual DNA molecules using synthetic sub-2 nm pores
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