CN107290422B - 一种基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统及方法，本发明方法首先进行电化学检测系统和反射光谱检测系统的搭建；紧接着进行金纳米锥阵列传感器的制备；然后通过循环伏安法完成银纳米颗粒在传感器表面的还原和沉积；其次通过金属‑硫共价键的结合，将含有巯基的受体分子修饰到传感器表面，用于特异性检测目标物质，建立浓度依赖曲线；最后对待测浓度的物质进行分析。本发明实现了从反射光谱和电化学两个角度测量和分析目标物质的作用，具有灵敏度高、无需标记、实时、快速检测等优点，能够满足生化检测的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统及方法。
背景技术
金属纳米材料由于具有良好的导电性、小尺寸效应、量子隧道效应和高的比表面积，使其在生化传感器领域具有很好的研究和实用价值。纳米光学传感器通过分析界面透射率或折射率的变化，实现对特定物质的检测，具有实时、快速、灵敏度高、无需标记等优点。然而在实际生物流体检测中会出现被测物扩散不充分、非特异性吸附等问题。为了增加信号的强度和检测的特异性，一方面可以通过表面强化处理和特异性修饰。另一方面也可以通过引入定向牵引信号，如电化学信号。解决被测物质扩散不充分的问题，从而提高系统灵敏度。由于基于局部表面等离子共振(LSPR)的纳米光学传感器所使用的纳米材料为贵金属，具有良好的导电性，使得电化学传感技术与基于LSPR的纳米光学传感器的结合成为可能。
发明内容
本发明的目的在于针对现有检测技术的局限性，提供一种基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统及方法，实现了对带电分子的定性、定量分析。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统，包括电化学检测系统和反射光谱检测系统；所述电化学检测系统包括三电极体系测量系统和电化学工作站，所述三电极体系测量系统包括银/氯化银参比电极、铂丝对电极、作为工作电极的金纳米锥阵列传感器和电极支架，三个电极分别与电化学工作站的参比电极接口、对电极接口和工作电极接口相连，且三个电极均与样品池中的液体充分接触；所述反射光谱检测系统包括光谱仪和反射检测探头，所述光谱仪包括激光器和CCD相机，所述反射检测探头包括发射探头和接收探头，分别与光源接口和CCD相机接口相连；激光器发出的光通过发射探头照射到纳米锥阵列传感器表面，在纳米锥阵列传感器表面发生局部表面等离子共振(LSPR)，通过接收探头将金纳米锥阵列传感器的反射光谱传输给CCD相机；CCD相机和电化学工作站均通过数据线与PC端相连，分别将反射光谱信号和电化学信号传输给PC端。
进一步地，所述反射检测探头固定在光学支架上，将其竖直放置在离样品池5mm的位置。
一种利用基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统进行生化检测的方法，包括以下步骤：
(1)电极的处理，具体包括以下子步骤：
(1.1)前置液的配置：配置浓度为10mmol/L的硝酸钾溶液1mL，浓度为0.1mmol/L的硝酸银溶液1mL，溶剂均为PBS；
(1.2)电极预处理：通过施加正向偏置电压在PBS溶液中活化三个电极，电压扫描范围：+0.2V至+2V，扫描速率：50mV/s；然后，用超纯水漂洗电极，改善电极的伏安特性；
(1.3)工作电极的修饰：向反应槽中加入900μL硝酸钾和100μL硝酸银，通过循环伏安法进行银纳米颗粒的电化学还原和沉积，循环伏安法的电压扫描范围：-1V至+1V，扫描速率：50mV/s，扫描次数：20次，实现在工作电极表面银纳米颗粒的修饰；
(2)拟合方程的建立，具体包括以下子步骤：
(2.1)通过金属-硫共价键的结合将待检测生化分子的受体分子修饰到金纳米锥阵列传感器的表面；
(2.2)标准溶液制配：配制不同浓度梯度的生化分子标准溶液；
(2.3)利用光谱仪监测反射光谱信号，反射光谱的波长范围为400nm至650nm，每隔一定时间保存一次光谱；通过电化学工作站监测电化学信号，与单次反射光谱信号的采集时间保持一致；
(2.4)在光学检测中，根据反射光谱中生化分子浓度C与特征峰偏移量Δλ之间的关系，建立Δλ-lgC拟合方程；在电化学检测中，根据伏安特性曲线得出生化分子浓度C与电流强度I的关系，建立I-lgC拟合方程；
(3)生化分子浓度检测：将待测浓度的生化分子通过生化检测系统得到反射光谱信号，通过反射光谱信号中的特征峰偏移量Δλ，结合Δλ-lgC拟合方程得到待测生化分子浓度；并通过电化学检测得到的峰电流强度I，结合I-lgC拟合方程对上述得到的待测生化分子浓度进行修正。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过一步法同步实现银纳米颗粒在电极表面的还原与沉积，利用电化学沉积的方法，具体是通过循环伏安技术，具有无毒、绿色等优点，而且在还原过程中无需还原剂，同时由于还原和沉积过程是连续进行的，修饰过程不会产生其他的废弃物和干扰物质。通过银纳米颗粒的修饰，极大地提高了传感器的导电性和反射光谱响应。从而提高系统的灵敏度。
2、金银纳米颗粒可以通过金属-硫共价键与含巯基的物质稳定结合，从而可以广泛应用于生化检测，金纳米颗粒具有好的生物亲和性，银纳米颗粒的LSPR响应和导电性优于金纳米颗粒，将两者结合，可以同时具有金银纳米颗粒的优点，克服各自存在的缺陷。
3、利用待测生化分子带电的特性，通过引入特定的电场，不仅可以使待测分子与纳米传感器的表面更好地结合，提高系统的灵敏度；而且可以实现从不同角度分析的目的，通过电化学检测结果对反射光谱得出的结果进行修正，以减少由于操作失误或系统故障带来的影响。
4、利用金属纳米颗粒具有良好的导电性，该系统将基于LSPR的传感器与电化学检测技术相结合，解决基于LSPR的传感器扩散不充分和非特异性吸附的问题与电化学检测技术中背景电流的干扰，使其同时具有灵敏度高、实时、快速、无需标记等优势。
5、该系统采用反射光谱检测光学信号，与透射系统相比，可以有效地减小液相环境的干扰，提高系统的信噪比。
附图说明
图1是本发明基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统的结构图；
图2是本发明基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统的装置图；
图3是金纳米锥阵列传感器的制作过程；
图4是银纳米颗粒修饰工作电极的过程图；
图5是银纳米颗粒修饰前工作电极的扫描电镜结果图；
图6是银纳米颗粒修饰后工作电极的扫描电镜结果图；
图7是不同纳米颗粒修饰的工作电极的反射光谱响应图；
图8是生化检测系统对目标物质检测的反射光谱响应图；
图9是生化检测系统对目标物质检测的电化学响应图；
图10是施加电化学信号前后左侧特征峰偏移量与唾液酸浓度的关系图；
图11是施加电化学信号前后特征谷偏移量与唾液酸浓度的关系图；
图12是施加电化学信号前后右侧特征峰偏移量与唾液酸浓度的关系图；
图13是电化学响应中峰电流强度与唾液酸浓度的关系图；
图中，三电极体系测量系统1、反射检测探头2、光学支架3、银/氯化银参比电极4、铂丝对电极5、电极支架6、作为工作电极的纳米锥阵列传感器7、样品池8、光谱仪9、CCD相机接口10、CCD相机11、光源接口12、激光器13、数据线14、对电极接口15、工作电极接口16、参比电极接口17、电化学工作站18、PC端19。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
本发明的优势在于可以同时捕获反应进程中的光学和电学信息，其关键在于，系统的设计和搭建，本发明基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统主要包括电化学检测系统和反射光谱检测系统两大部分，如图1、2所示。所述电化学检测系统包括：三电极体系测量系统1、电化学工作站18，所述三电极体系测量系统1包括银/氯化银参比电极4、铂丝对电极5、作为工作电极的纳米锥阵列传感器7、电极支架6；三个电极分别与电化学工作站18的参比电极接口17、对电极接口15和工作电极接口16相连，且三个电极均与样品池8中的液体充分接触；所述反射光谱检测系统包括光学支架3、光谱仪9和反射检测探头2，所述光谱仪9包括激光器13和CCD相机11，所述反射检测探头2包括发射探头和接收探头，分别与光源接口12和CCD相机接口10相连。将反射检测探头2固定在光学支架3上，将其竖直放置在离样品池5mm的位置；激光器13发出的光通过发射探头照射到纳米锥阵列传感器7表面，在纳米锥阵列传感器7表面发生局部表面等离子共振(LSPR)，通过接收探头将金纳米锥阵列传感器7的反射光谱传输给CCD相机11；CCD相机11和电化学工作站18均通过数据线14与PC端19相连，分别将反射光谱信号和电化学信号传输给PC端19。
该系统的制作、搭建及生化检测过程包括以下步骤：
(1)系统的搭建，具体包括以下子步骤：
(1.1)反射光谱检测系统：反射检测探头2包括发射探头和接收探头，发射探头向纳米传感器发出入射光；接收探头将反射的光传输到CCD相机。反射检测探头2固定在光学支架3上，将其竖直放置在离样品池5mm的位置；
(1.2)电化学检测系统：通过电化学工作站18上的线性扫描伏安法实现。在检测过程中使用标准的三电极系统1，将上述制备好的纳米锥传感器7作为工作电极，铂电极用作对电极5，银/氯化银电极用作参比电极4。
(2)制备金纳米锥阵列传感器7，具体包括以下子步骤(图3)：
(2.1)选择柔性聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为传感器基底，通过激光干涉光刻和离子蚀刻技术制得纳米锥阵列结构；
(2.2)使用K J Lesker PVD 75系统通过物理气相沉积的方法将厚度为100nm的二氧化硅固定在纳米锥阵列表面，用于提高纳米锥阵列的亲水性能，有利于水溶液接触纳米锥阵列的表面及被测物质的吸附；
(2.3)使用电子束蒸发系统将金纳米颗粒沉积到纳米锥阵列上；
(2.4)将金纳米锥阵列传感器在二甲基二氯硅烷溶液中钝化30分钟，并用乙醇和去离子水清洗，从而得到具有紧密堆积的金纳米颗粒的纳米锥传感器。
(3)电极的处理，具体包括以下子步骤：
(3.1)前置液的配置：配置浓度为10mmol/L的硝酸钾溶液1mL，浓度为0.1mmol/L的硝酸银溶液1mL，溶剂均为PBS；
(3.2)电极预处理：通过施加正向偏置电压在PBS溶液中活化三个电极，电压扫描范围：+0.2V至+2V，扫描速率：50mV/s；然后，用超纯水漂洗电极，改善电极的伏安特性；
(3.3)工作电极的修饰：向反应槽中加入900μL硝酸钾和100μL硝酸银，通过循环伏安法进行银纳米颗粒的电化学还原和沉积，循环伏安法的电压扫描范围：-1V至+1V，扫描速率：50mV/s，扫描次数：20次，实现在工作电极表面银纳米颗粒的修饰，修饰过程如图4所示，随着扫描次数的增加，峰电流的强度逐渐增大，这是由于导电性更好的银纳米颗粒修饰到电极表面造成的；
(3.4)工作电极的表征：图5与图6表示银纳米颗粒修饰工作电极前后的扫描电镜表征。在修饰前，电极为表面光滑、排列整齐的阵列结构，而修饰后电极表面附着一些大小不一的颗粒状物质，表面变得相对粗糙，说明有纳米银颗粒修饰到电极表面。图7表示不同纳米颗粒修饰的电极的光学响应，可以看出修饰银纳米颗粒之后传感器的LSPR响应明显增强，而且特征峰位置出现左移，这是由于银纳米颗粒的LSPR响应优于金纳米颗粒，且特征峰对应的波长更短。
(4)拟合方程的建立，具体包括以下子步骤：
(4.1)标准溶液制配：配制浓度为10mmol/L的4-巯基苯硼酸溶液5mL，浓度分别为50μM,100μM,200μM,500μM,1mM,2mM和5mM的唾液酸标准溶液2mL，溶剂为PBS；
(4.2)4-巯基苯硼酸是一种含巯基的硼酸，其可以通过巯基的硫原子与金、银纳米颗粒形成稳定的金属-硫共价键，从而稳定地结合到纳米传感器的表面，具体处理过程为：将4-巯基苯硼酸与上述制备的传感器一同置于反应槽中，放置24小时，用于形成稳定的共价键。然后，用超纯水冲洗掉未结合的4-巯基苯硼酸；
(4.3)利用光谱仪9监测反射光谱信息，反射光谱的波长范围为400nm至650nm，间隔为0.38nm，每隔6秒保存一次光谱。通过电化学工作站18中的线性扫描伏安法监测电化学响应，电压范围为0至+0.3V，扫描速率为0.05V/s，即每隔6秒形成一幅完整的伏安特性曲线，即两者的开始时间和采集频率保持一致。目标物质检测的光学响应如图8所示，随着唾液酸浓度的增加，特征峰、特征谷的位置发生右移和下移，发生右移是由于交界面折射率逐渐增大，下移是由于系统反射率下降。图9描述了不同浓度唾液酸所对应的线性扫描伏安特性曲线，随着唾液酸浓度增加，导电性逐渐变差，导致峰电流的强度逐渐减小。
(4.4)在光学检测中，根据反射光谱中生化分子浓度C与特征峰偏移量Δλ之间的关系，建立Δλ-lgC拟合方程，图10、11、12分别表示施加电场前后，左侧特征峰、特征谷、右侧特征峰的偏移量与浓度的关系，可以看出特征峰、特征谷的偏移量与唾液酸浓度的对数两者基本呈现线性关系，当施加电场后，将带负电的唾液酸分子吸附到带正电的电极表面，特征峰、特征谷的偏移量增大，灵敏度得以提高，线性度得以提高，拟合方程分别为：Δλ＝3.764lgC-5.425、Δλ＝4.207lgC-5.853、Δλ＝2.462lgC-4.078。在电化学检测中，根据伏安特性曲线得出生化分子浓度C与电流强度I的关系，建立I-lgC拟合方程，如图13所示，峰电流的强度与唾液酸浓度的对数之间也存在一定的线性关系，拟合方程为：I＝0.8263lgC-6.486。
(5)生化分子浓度检测：将待测浓度的生化分子通过生化检测系统得到反射光谱信号，通过反射光谱信号中的特征峰偏移量Δλ，结合Δλ-lgC拟合方程得到待测生化分子浓度；并通过电化学检测得到的峰电流强度I，结合I-lgC拟合方程对上述得到的待测生化分子浓度进行修正。
Claims (2)
1.一种利用基于电化学增强反射光谱信号的生化检测系统进行生化检测的方法，其特征在于，该方法在生化检测系统上实现，所述生化检测系统包括电化学检测系统和反射光谱检测系统；所述电化学检测系统包括三电极体系测量系统(1)和电化学工作站(18)，所述三电极体系测量系统(1)包括银/氯化银参比电极(4)、铂丝对电极(5)、作为工作电极的金纳米锥阵列传感器(7)和电极支架(6)，三个电极分别与电化学工作站(18)的参比电极接口(17)、对电极接口(15)和工作电极接口(16)相连，且三个电极均与样品池(8)中的液体充分接触；所述反射光谱检测系统包括光谱仪(9)和反射检测探头(2)，所述光谱仪(9)包括激光器(13)和CCD相机(11)，所述反射检测探头(2)包括发射探头和接收探头，分别与光源接口(12)和CCD相机接口(10)相连；激光器(13)发出的光通过发射探头照射到纳米锥阵列传感器(7)表面，在纳米锥阵列传感器(7)表面发生局部表面等离子共振，通过接收探头将金纳米锥阵列传感器(7)的反射光谱传输给CCD相机(11)；CCD相机(11)和电化学工作站(18)均通过数据线(14)与PC端(19)相连，分别将反射光谱信号和电化学信号传输给PC端(19)；该方法包括以下步骤：
(1)电极的处理，具体包括以下子步骤：
(1.1)前置液的配置：配置浓度为10mmol/L的硝酸钾溶液1mL，浓度为0.1mmol/L的硝酸银溶液1mL，溶剂均为PBS；
(1.2)电极预处理：通过施加正向偏置电压在PBS溶液中活化三个电极，电压扫描范围：+0.2V至+2V，扫描速率：50mV/s；然后，用超纯水漂洗电极，改善电极的伏安特性；
(1.3)工作电极的修饰：向反应槽中加入900μL硝酸钾和100μL硝酸银，通过循环伏安法进行银纳米颗粒的电化学还原和沉积，循环伏安法的电压扫描范围：-1V至+1V，扫描速率：50mV/s，扫描次数：20次，实现在工作电极表面银纳米颗粒的修饰；
(2)拟合方程的建立，具体包括以下子步骤：
(2.1)金银纳米颗粒通过金属-硫共价键与含巯基的物质稳定结合，通过巯基的硫原子与金、银纳米颗粒形成稳定的金属-硫共价键，从而将待检测生化分子的受体分子稳定地修饰到金纳米锥阵列传感器(7)的表面；
(2.2)标准溶液制配：配制不同浓度梯度的生化分子标准溶液；
(2.3)利用光谱仪(9)监测反射光谱信号，反射光谱的波长范围为400nm至650nm，每隔一定时间保存一次光谱；通过电化学工作站(18)监测电化学信号，与单次反射光谱信号的采集时间保持一致；
(2.4)在光学检测中，根据反射光谱中生化分子浓度C与特征峰偏移量△λ之间的关系，建立△λ-lgC拟合方程；在电化学检测中，根据伏安特性曲线得出生化分子浓度C与电流强度I的关系，建立I-lgC拟合方程；
(3)生化分子浓度检测：将待测浓度的生化分子通过生化检测系统得到反射光谱信号，通过反射光谱信号中的特征峰偏移量△λ，结合△λ-lgC拟合方程得到待测生化分子浓度；并通过电化学检测得到的峰电流强度I，结合I-lgC拟合方程对上述得到的待测生化分子浓度进行修正。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反射检测探头(2)固定在光学支架(3)上，将其竖直放置在离样品池(8)5mm的位置。
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