CN104407150B - 用于2,4,6-tnt检测的生物纳米传感器制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于2,4,6-TNT检测的生物纳米传感器制备方法，该方法采用标准化学合成方法合成2,4,6-三硝基甲苯（2,4,6-TNT）特异性敏感的巯基化多肽（WHWQRPLMPVSID-SH），并利用其巯基与纳米金属颗粒的共价连接将其固定于纳米传感器件表面；检测时，目标分子2,4,6-三硝基甲苯与巯基化多肽的特异性结合引起纳米传感器表面的光学折射特性的改变，导致传感器透过的透射光光谱的相应变化，实现对目标分子2,4,6-三硝基甲苯的检测；较已有用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物传感器，本发明由于巯基化多肽修饰具有灵敏度高、生物结构稳定性好和成本低廉的优点。

Description

用于2,4,6-TNT检测的生物纳米传感器制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物传感器的制备技术，尤其涉及一种用于爆炸物2,4,6-三硝基甲苯（2,4,6-TNT）检测的生物纳米传感器的制备方法。
背景技术
爆炸物2,4,6-三硝基甲苯的快速敏感检测技术在公共安全领域具有十分重要的需求。对其现场检测，一般采用训练动物如警犬进行检查，或使用基于传统物理化学方法的快速检测仪器。但是，动物训练成本非常高，并带有很强的不可控制性。而完全的电子检测装置，其物理或化学传感作用同发生在生物嗅觉系统的生物化学感受过程存在一定的差距，以致传感器在敏感性、特异性等方面尚有所不足。多肽是一种能够人工设计特异性、化学合成的蛋白小分子，其具有结构简单、功能稳定和成本低廉的特点。它能够与特定的目标分子特异性结合，作为生物敏感元件与纳米传感器相结合，构建用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物纳米传感器。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物纳米传感器制备方法。
发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物纳米传感器制备方法，包括以下步骤：
（1）合成2,4,6-三硝基甲苯特异性敏感的多肽序列：采用标准Fmoc固相合成法从羧基端（C端）向氨基端（N端）依据多肽序列WHWQRPLMPVSID合成，以100μg/ml多肽溶液形式保存，溶剂为0.1MPBS缓冲液；
（2）特异性敏感多肽序列的巯基化：将5ml浓度为8mg/ml的EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液和5ml浓度为12mg/ml的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液加入10ml浓度为100μg/ml的多肽溶液中，活化多肽序列C端羧基；EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1MMES缓冲液；20min后，加入NaHCO3溶液调节pH至7.2-7.4，再加入10ml浓度为1mg/ml的2-硫基乙胺水溶液，室温下静止2h，使得多肽序列C端羧基与2-硫基乙胺的氨基作用形成稳定的酰胺键，进而完成多肽序列巯基化，得到巯基化多肽（WHWQRPLMPVSID-SH）；
（3）固定巯基化多肽于传感器表面：首先依次使用无水乙醇和超纯水超声清洗纳米杯阵列传感器各5min；所述纳米杯阵列传感器具有在PET基底材料上构建的尺寸为纳米级的杯状结构，所述杯状结构成阵列排布，并在其表面沉积纳米金颗粒；将清洗后的纳米杯阵列传感器浸泡在100μg/ml的巯基化多肽溶液中，巯基化多肽溶液的溶剂为PBS缓冲液；纳米杯阵列传感器在4℃温度下浸泡12h，巯基化多肽一端巯基与传感器金表面形成金-硫键，然后，取出后用PBS缓冲液反复清洗，洗去纳米结构表面的多余的巯基化多肽，用氮气吹干，最终获得用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物纳米传感器，放在4℃条件下保存备用。
本发明的有益效果是，本发明采用标准生物合成方法合成对2,4,6-三硝基甲苯特异性敏感的巯基化多肽（WHWQRPLMPVSID-SH），并利用纳米金属颗粒与巯基的共价连接将其固定于纳米杯阵列传感器表面；检测时，目标分子2,4,6-三硝基甲苯与巯基化多肽的特异性结合引起纳米杯阵列传感器表面的光学折射特性的改变，导致传感器透过的透射光光谱的相应变化，实现对目标分子2,4,6-三硝基甲苯的检测；较已有用于爆炸物检测的生物传感器，本发明由于巯基化多肽修饰具有灵敏度高、生物结构稳定性好和成本低廉的优点。本发明所述的生物纳米传感器检测下限为3.16×10-9M。
附图说明
图1为本发明巯基化多肽质谱表征图；
图2为本发明生物纳米传感器的制备图；
图3为本发明生物纳米传感器结构示意图；
图4为本发明纳米杯阵列传感器固定巯基化多肽前后电化学表征结果图；
图5为本发明生物纳米传感器件光学检测方法示意图；
图6为本发明生物纳米传感器对空白对照无水甲醇和2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液的光谱扫描结果图；
图7为本发明生物纳米传感器分别检测不同浓度的2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液后，离子共振峰偏移波长与2,4,6-三硝基甲苯浓度的对数之间的线性关系图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
本发明用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物纳米传感器制备方法，包括以下步骤：
1、合成2,4,6-三硝基甲苯特异性敏感的多肽序列：采用标准Fmoc固相合成法从羧基端（C端）向氨基端（N端）依据多肽序列WHWQRPLMPVSID重复脱保护、活化、偶联3步循环添加氨基酸，纯化提取为100μg/ml多肽溶液保存（溶剂为0.1MPBS缓冲液，pH=7.2，0.1M指的是PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度，本发明中使用的PBS缓冲液均是指0.1M，pH=7.2的PBS缓冲液）。
2、通过缩合作用的特异性敏感多肽序列的巯基化修饰：将5ml浓度为8mg/ml的EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液和5ml浓度为12mg/ml的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）溶液加入10ml浓度为100μg/ml多肽溶液中，活化多肽序列C端羧基。EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1MMES缓冲液（含0.1MKCl，pH=6，0.1MMES指的是MES缓冲液中2-吗啉乙磺酸的摩尔浓度，0.1MKCl是指MES缓冲溶液氯化钾的摩尔浓度，本发明中使用的MES缓冲液均是指0.1M，pH=6的MES缓冲液）。20min后，加入NaHCO3溶液调节pH至7.2-7.4，再加入10ml浓度为1mg/ml2-硫基乙胺，室温下静止2h，使得多肽序列C端羧基与2-硫基乙胺的氨基作用形成稳定的酰胺键，进而完成多肽序列巯基化，得到巯基化多肽1（WHWQRPLMPVSID-SH），分离提纯以冻干粉形式保存，其质谱表征如图1所示。
3、固定巯基化多肽1于传感器表面：如图2所示，首先，依次使用无水乙醇和超纯水超声清洗纳米杯阵列传感器2各5min。所述纳米杯阵列传感器2具有在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基底材料上构建的尺寸为纳米级的杯状结构，所述杯状结构成阵列排布，并在其表面沉积直径为10nm的纳米金颗粒。将清洗后的纳米杯阵列传感器2浸泡在100μg/ml的巯基化多肽1溶液中，巯基化多肽1溶液的溶剂为PBS缓冲液。纳米杯阵列传感器2在4℃温度下浸泡12h，巯基化多肽1一端巯基与传感器金表面形成金-硫键。然后，取出后用PBS缓冲液反复清洗，洗去纳米结构表面的多余的巯基化多肽1，用氮气吹干，获得所述的用于2,4,6-三硝基甲苯检测检测的生物纳米传感器，如图3所示，放在4℃条件下保存备用，其固定前后特性的表征采用交流阻抗方法扫描，得到表征其传感器表面阻抗的能奎斯特图，如图4所示，传感器表面阻抗明显增大，说明纳米杯阵列传感器2表面已成功地固定了巯基化多肽1。
本发明的方法制备的生物纳米传感器可用于检测爆炸物2,4,6-三硝基甲苯，该应用具体如下：
（1）配制待测2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液：采用浓度为0.1M待测的2,4,6-三硝基甲苯的标准贮备溶液稀释配制5种浓度梯度为10-8M、10-7M、10-6M、10-5M和10-4M的标准样品溶液；稀释液为无水甲醇。
（2）检测2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液，得到2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液作用下生物纳米传感器的透射光谱图和等离子共振峰偏移波长：采用光学透射的模式对生物纳米传感器进行检测，如图5所示，电荷耦合元件（CCD）镜头3、纳米杯阵列传感器件2与氙灯光源6被依次从上到下置于一条直线上。光束由氙灯光源6透过纳米杯阵列传感器2发生改变，最终由CCD镜头3采集接收，检测时，首先在生物纳米传感器表面添加50μl无水甲醇溶液，而后在传感器表面上覆盖2cm×2cm大小的盖玻片4在生物纳米传感器表面形成薄层液体5以减少液体本身对光学透射的影响，所述CCD镜头3采用美国海洋光学USB2000+采集模块，所述氙灯光源6采用美国海洋光学PX-02光源；CCD镜头3和氙灯光源6通过光纤连接，从而实现对生物纳米传感器的光谱扫描，得到透射光谱图和等离子共振峰偏移波长。具体测试参数为：光谱扫描范围为320nm-1000nm，扫描步进为1nm。测量结束后吸出传感器表面上测量残留的溶液，然后加满0.1MPBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗生物纳米传感器，再进行2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液的光学透射谱测量，在传感器表面加入2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液，进行透射光谱的测量，得到浓度为10-8M的2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液对应的透射光谱图和等离子共振峰偏移波长，如图6所示，插图中显示透射光谱在550nm左右的透射峰会向左发生明显偏移，测量结束后吸除传感器表面上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1MPBS缓冲液，静置15min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗生物纳米传感器表面。
（3）建立2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液浓度-偏移波长的标准曲线：重复上述步骤2中空白对照无水甲醇溶液和2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液的透射光谱的测量过程，直至完成5种浓度梯度分别为10-8M、10-7M、10-6M、10-5M和10-4M的2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液的测量，得到不同浓度下的透射光谱图，每个浓度重复测量10次，计算等离子共振峰偏移波长（标准样品溶液与空白对照无水甲醇溶液透射峰波长位置差值），得到2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液浓度与共振峰偏移波长的关系曲线y=1.018log(x)+9.459，如图7所示，其中，x为2,4,6-三硝基甲苯标准样品溶液浓度，y为共振峰偏移波长，实现对2,4,6-三硝基甲苯的检测，其具有超灵敏的特点，经计算检测下限为3.16×10-9M。

Claims (1)

1.一种用于2,4,6-TNT检测的生物纳米传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成2,4,6-三硝基甲苯(2,4,6-TNT)特异性敏感的多肽序列：采用标准Fmoc固相合成法从羧基端(C端)向氨基端(N端)依据多肽序列WHWQRPLMPVSID合成，以100μg/ml多肽溶液形式保存，溶剂为0.1MPBS缓冲液；
(2)特异性敏感多肽序列的巯基化：将5ml浓度为8mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和5ml浓度为12mg/ml的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液加入10ml浓度为100μg/ml的多肽溶液中，活化多肽序列C端羧基；EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1MMES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液；20min后，加入NaHCO3溶液调节pH至7.2-7.4，再加入10ml浓度为1mg/ml的2-硫基乙胺水溶液，室温下静止2h，使得多肽序列C端羧基与2-硫基乙胺的氨基作用形成稳定的酰胺键，进而完成多肽序列巯基化，得到巯基化多肽(WHWQRPLMPVSID-SH)；
(3)固定巯基化多肽于传感器表面：首先依次使用无水乙醇和超纯水超声清洗纳米杯阵列传感器各5min；所述纳米杯阵列传感器具有在PET基底材料上构建的尺寸为纳米级的杯状结构，所述杯状结构成阵列排布，并在其表面沉积纳米金颗粒；将清洗后的纳米杯阵列传感器浸泡在100μg/ml的巯基化多肽溶液中，巯基化多肽溶液的溶剂为PBS缓冲液；纳米杯阵列传感器在4℃温度下浸泡12h，巯基化多肽一端巯基与传感器金表面形成金-硫键，然后，取出后用PBS缓冲液反复清洗，洗去纳米结构表面的多余的巯基化多肽，用氮气吹干，最终获得用于2,4,6-三硝基甲苯检测的生物纳米传感器，放在4℃条件下保存备用。
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