SE512994C2 - Biosensorcellanordning och dess användning - Google Patents

Description

llll 10 15 20 25 30 512 994 2 (Jmf t ex Wang J. et al, Mismatch-Sensitive Hybridization Detection by Peptide Nucleic Acids Immobilized on a Quartz Crystal Microbalance, Anal.Chem.l997,69,5200-5202).

Det är uppenbart att tillämpningen vid rutinanalys med tillgängliga QCA system är komplicerad på grund av det faktum att de inte kan stabiliseras på korta tidsintervaller och därtill att tillgängliga QCA system inte är lämpliga för bärbara detektionssystem.

Kort beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning är inriktad på en ny QCA anordning eller system som är tillförlitlig, stabil, snabb och känslig. Den nya anordningen eller systemet enligt uppfinningen omfattar en sluten testkammarkavitet som är fylld med lösningsmedel/vatten eller buffertlösning, med eller utan analyt, och den är särskilt lämplig för tillämpningar där testkaminarens läge kan variera, såsom vid bärbara detektionssystem.

Biosensorcellanordningen enligt uppfinningen omfattar en testkammarkavitet och en piezoelektrisk kristall som är belagd, på den yta som vetter mot testkarnmarkaviteten, med en interaktionspartner till en analyt, varvid kristallen är ansluten till en oscillationsenhet och signalbearbetnlngselektronik, vilken anordning ytterligare omfattar en inloppsnål för införande av analyten, vilken nål slutar på ett litet avstånd från änden av, och innanför, en inloppsärm för införande av buffertlösning, vilken slutar i närheten av kristallens aktiva yta, varvid inloppsärmen är ansluten till ett inlopp för buffertlösning, och ett utlopp för överskottsvätska. lnloppsnålen kan vara en automatisk inj ektor eller injektionsspruta.

Därtill kan den piezoelektriska kristallen vara belagd med två eller flera olika interaktionspartners som var och en interagerar med en olik analyt.

I ett exempel är interaktionspartnern en antikropp som specifikt binder till analyten (antigen), t ex vald bland narkotika och sprängämnen, såsom 2,4,6-trinitrotoluen (TNT).

I ett annat exempel är interaktionspartnem en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer och analyten är en polynukleotid, eller vice versa. Polynukleotiden kan väljas från den grupp som består av RNA, DNA och PNA och PNA polymerer som är kornplementära till PNA oligomeren.

Biosensorcellanordningen enligt uppfinningen kan användas för både kvalitativ och kvantitativ analys av åtminstone en analyt och/eller dess interaktionspartner.

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Fig. 1. visar en sidovy av de delar av en biosensor som omfattar en tlödescell/test- kammarkavitet.

T:\PATENT\29-\29454\svenskmt.doc _ 10 15 20 25 30 512 994 3 Fig. 2. visar delvis ett tvärsnitt av cellen där flödet (pilar) är anordnat att passera över kristallens yta för både inlopp av buffert och testprover.

Fig. 3. A. Analys av 1 pg av 21-mer oligodeoxinukleotiden som är komplementär till 2 l -mer PNA.

B. Analys av 1 pg av 21-mer oligodeoxinukleotiden med blandad PNA 21-mer.

Fig. 4. Analys av 1 pg av pRK8-hGaIRl med komplementären till hGaIRI sekvens PNA 21-mer.

Fig. 5. Analys av totalt RNA från human melanom-cellinje Bowes med PNA 21-mer komplementär till hGaIRI cDNA.

A: 18 pg RNA.

B: 80 pg RNA.

Fig. 6. Analys av dsDNA (348 pg) från human melanom-cellinje Bowes med komplementär till hGaIRI PNA 21-mer.

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Biosensorcellanordningen enligt uppfinningen används vid piezoelektrisk bestämning av en analyt, och den omfattar en flödescell, i vilken lösningsmedlet/vattnet eller buffert- lösningen, med eller utan analyt, passerar över en oscillerande kvartskristallsyta, vilken är belagd med en skiktad struktur som exponerar för lösningen en interaktionspartner till en analyt, t ex ett antikroppkomplex som är aktivt mot analyten, såsom TNT. Interaktions- partnem interagerar med analyten, t ex antikroppar binder till analyten, i lösningen, och viktskillnaden, vid kristallens yta, ger en liten förändring av resonansfrekvensen i den elektroniska kretsen som infórlivar kristallen.

När antalet interaktionspartners, t ex antikroppar, som är tillgängliga för interaktion med eller binder till analyten minskas på grund av komplexbildningen med analyten i testlösningen, kommer känsligheten att sjunka och cellen upphör att fungera. Då ersätts kvartskristallen med en annan som har en ny beläggning.

I en automatiserad utföringsfonn detekteras denna situation av en signalbearbetnings- enhet, och ett automatiskt eller manuellt utbyte till en ny flödescell äger rum.

Avtappningsröret från en biosensorflödescell kan direkt anslutas till inloppet hos en annan, varigenom känslighet för en arman analyt tillförs, såsom ett sprängämne eller ett narkotikum, eller kan ett multisensorsystem av parallella biosensorer arrangeras genom delning av inloppet till ett antal flödesceller.

T:\PATEN1\29-\29454\svenskbtt.doc 10 15 20 25 30 '512 994 4 Uppñnningen kommer nu att belysas med hänvisning till åtföljande ritningar, utföringsformer och exempel. Uppfinningen, är inte avsedd att begränsas till dessa specifika uppgifter.

Bottendelen (40) är anpassad till den faktiska kristallens (41) utformning. Kristallen hålls på plats av en övre del som omfattar testkammarkaviteten (42), två gummiringar (43) och en förskjutbar yttre låshylsa (44). Den övre delen av cellen bringas i sitt korrekta läge av en styrpinne (46) och två skruvar (45). Cellen har ett inlopp för buffertlösning (47), ett utlopp för överskottsvätska (48) och ett testprovinlopp (49). Testprovinloppet visas med en injektionsspruta för manuell injektion.

De väsentliga detaljerna hos biosensorcellanordningen enligt uppfinningen visas i Fig. 1 och Fig. 2. Bottendelen 40 är anpassad till utformningen av en faktisk piezoelektrisk kristall 41. Kristallen hålls på plats av den övre delen som omfattar en testkammarkavitet 42, två gummiringar 43 och en förskjutbar yttre låshylsa 44. Den övre delen av cellen bringas i sitt korrekta läge av en styrpinne 46 och två skruvar 45. Cellen har ett inlopp för buffertlösning 47, ett utlopp för överskottsvätska 48 och ett testprovinlopp 49. Testprovinloppet visas med en inj ektionsspruta för manuell injektion.

Den piezoelektriska kristallen 41 är belagd på ytan som vetter mot testkammar- kaviteten 42 med en interaktionspartner till en analyt, och kristallen 41 är ansluten till en oscillationsenhet och signalbearbetningselektronik. Inloppsnålen 49 för införande av analyten slutar på ett litet avstånd från änden av och på insidan om en inloppsärm 50 för införande av buffertlösning vilken slutar i närheten av kristallens 41 aktiva yta. Inloppsärmen är ansluten till ett inlopp 47 för buffertlösning. Anordningen omfattar också ett utlopp 48 för överskottsvätska.

I föredragna utföringsfonner av biosensorcellanordningen enligt uppfinningen är inloppsnålen 49 en automatisk injektor eller en injektionsspruta.

Exempel på olika utföringsfonner av uppfinningen är biosensorcellanordningar där den piezoelektriska kristallen 41 är belagd med två eller flera olika interaktionspartners som var och en interagerar med en olik analyt; interationspartner är en antikropp som specifikt binder till analyten (antigen); analyten (analytema) är vald(a) bland narkotika och sprängämnen; sprängämnet är 2,4,6-trinitrotoluen (TNT); interaktionspartnem är en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer och analyten är en polynukleotid; interaktionspartnern är en polynukleotid och analyten är en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer; och polynukleotiden väljs från den grupp som består av RNA, DNA och PNA polymerer som är komplementära till PNA oligomeren.

Tï\PATEN'l'\29-\294S4\svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 5 En annan aspekt av biosensorcellanordningen enligt uppfinningen är inriktad på dess användning för kvalitativ och kvantitativ analys av åtminstone en analyt och/eller dess interaktionspartner.

Exemgel på analyter Som föredragna utföringsforrner av detektionsmål for biosensorcellanordningen enligt uppfinningen har två klasser av analyter valts, nämligen sprängämnen och polynukleotider.

Dessa två stora klasser av analyter består i sin tur av många olika substanser. Detektion av dessa med hög känslighet är av enorm betydelse idag, både för välfärden i värden (sprängämnen) och vid biomedícinsk analys (polynukleotider).

TNT analys åstadkommes genom användning av antikroppar som är specifika för TNT fasta på PZ guld(Au) elektroder.

Analys av polynukleotider baseras på bindning av RNA eller DNA polymerer till specifika PNA modifierade PZ elektroder foljt av QCA detektion. RNA/DNA polymerer extraheras från humana vävnadsprover och påtöres på Cys-PNA-elektroden. När massan ökar minskar frekvensen hos PZ elektrodens resonansoscillering. Resultaten erhålls i form av ett diagram där tiden är en funktion av frekvensen. Detekteringen av interaktionen erhålles på några sekunder. Här visar vi detektion av polynukleotider och deras interaktioner med biosensor QCA metoden där interaktionen mellan relativt korta (1 8- till 21-merer) peptidnukleinsyror, PNA, och några komplementära polynukleotider tillämpas. PNA-PNA, PNA-DNA och PNA-RNA interaktioner detekteras med piezoelektriska (PZ) kristaller som analytiska sensoreri kvartskrístallanalys, QCA, systemet.

T rinitrotoluen, TNT; som analyt Antikroppar som känner igen TNT användes i exemplen på analyser med användning av biosensorcellanordningen enligt uppfinningen för detektering av pikograrri av ett litet antigen som TNT. v Polynukleotider som analyter eller interaktíonspartners till analyter Detektion av polynukleotider saint deras interaktioner är av avgörande betydelse för biomedícinsk analys och läkemedelsanalys såväl som för forskning. Ett bredare mål för detekteringen är närvaro och interaktioner mellan polynukleotider och PNA oligomerer är att detektera olika genetiskt kopplade sjukdomar/rubbningar. Det är väl känt att många allvarliga sjukdomar såsom tuberkulos, malaria, Alzheimers sjukdom, HIV, cancer, cystisk fibros etc är kopplade till expression av muterade gener eller överexpression av vissa gener vilket leder till överexpression av karakteristiska proteiner. I fråga om förekomsten av till sjukdomar kopplade mutationer eller överexpression när det gäller patienter, kommer de att detekteras T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc l0 15 20 25 30 512 994 6 genom interaktion med komplementära till mutationerna eller överuttryckta produkt PNA oligomerer kopplade till PZ kristallerna. Tillämpningen av korta PNA polymerer som är komplementära till sjukdomsassocierade mutanta gener kommer att möjliggöra analys av någon mutation av intresse genom enkel design och syntes av en kort komplementär PNA sekvens. En sådan analysmetod kommer att vara mycket flexibel och billig jämfört med de metoder som är tillgängliga idag, särskilt med användning av det snabba och känsliga QCA systemet enligt föreliggande uppfinning.

Peptidnukleinsyror, PNA, som analyter eller interaktionspartners till analyter.

Nyligen introducerades peptidnukleinsyror (PNA) av Nielsen et al.(Nielsen P.E., Egholm, M., Berg, RH., and Buchardt, O. 1991, Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254:l497-1500) som en ersättning för hela ribos-fosfodiesterryggraden i oligonukleotider med N-(2-aminoetyl)glycin- enheter, till vilka lämpliga nukleobaser är kopplade via karbonylmetylenlinkers. Upptäckten av PNA har gett möjligheten till radikalt olika syntetiska versioner av DNA och RNA.

Fördelarna med denna kemiska strategi är många. PNA monomererna kan polymeriseras med användning av standardpeptidkopplingskemi, som är flexibel, högt utvecklad och effektiv.

Hybrider mellan sådana PNA-oligomerer och deras komplementära enkelsträngade DNA- oligomerer har visat anmärkningsvärt hög stabilitet (afñnitet) i jämförelse med naturligt förekommande DNA/DNA- och RNA/DNA-hybrider. Sålunda erbjuder PNA-oligomerer stora fördelar i både antisens och antigen tillvägagångssätt för reglering av genexpression.

Därtill är PNA-oligomerema avsevärt stabilare gentemot nukleaser (jämfört med naturliga polynukleotider) på grund av avsaknaden av (deoxihibosryggrad.

Dessa egenskaper hos PNA kan effektivt utnyttjas för vilket som helst tillväga- gångssätt som kräver icke-nedbrytande högaffinitetspolymerer för RNA/DNA-igenkänning.

Hybridisering av PNA-oligonukleotider till komplementära RNA/DNA-sekvenser genom specifik basparning (A-T och G-C) sker genom interaktion med vätebindning. Denna enkla baspaming medger design av PNA-oligonukleotider som målsöker någon gen eller RNA med en känd sekvens. Huvudfördelen med denna strategi är den potentiella speciñciteten hos denna mekanism. Hög specificitet och affinitet hos interaktionema leder till känsligare detekteringsmetoder vid DNA/RNA värderingar.

Oscillatíonsenhet, signalbearbetningselektronik och elektroder Kristallen i biosensom exciteras i en modifierad Pierce oscillator. Standard Pierce oscillatom modifieras med: Tz\PATEN'l\29-\29454\svenskott.doc 10 15 20 25 30 512 994 7 - ett extra buffertsteg i den oscillerande slingan för att kompensera för den höga fuktningen av kristallen med vätskan, _ - en likströmsblockerande kondensator för att eliminera elektrolys av läckström genom buffertvätskesystemet, - ett buffertsteg och en si gnalomvandlare för att galvaniskt separera mätningskretsama från frekvensräknaren och analysdatorn.

Signalbearbetningselektroniken innehåller elektroniken för drivande av kristallen, mätning av olika parametrar och beslutalgoritmer för utvärdering av resultaten. Elektroniken för drivning av kristallen och mätning av frekvensskift består av en oscillator (Colpitt eller Pierce typ) med kristallen följt av en buffertförstärkare och en snabb precisionsräknare med interpolation. Resultaten från frekvensmätningarna matas till kontrolldatom för utvärdering.

Elektrodema som används i exemplen är AT-cut 9 - 10 MHZ piezoelektriska kristaller med guldelektroder, levererade av Quartz Probe, Sverige eller Seiko, Japan.

EXEMPEL PÅ ANALYSER MED ANVÄNDNING AV BIOSENSORCELLANORDNINGEN Reagens och biokemiska metoder Allmänna reagens Bl :Na-HEPES buffert: 0,01 M, pH 7,4.

HEPES : Fluka 54466, MW 260,30; justera pH med 0,01 M HCl B2 : 0,01 M Na-fosfatbuffert, 0,1 M NaCl, pH 7,4, består av Na;HPO4.l2H2O: 3,58 g/l; NaH2P04.H2O : 1,38 g/l ; NaCl 5,85 g/l. Justera pH med salter Vatten: Avjoniserat kranvatten Tiol- eller disulfidinnehållande modifikationsreagens kan användas med Au-elektrod TN! analys Elektrod-bundna TNT-antikroppar användes. I N I-antikroppama är kommersiellt tillgängliga.

Polygukleotidanalys 1. ea ens PNA monomerer : kommersiella, PerSeptive Biosystems, Framingharn, USA Peptidsyntesreagens : beskrivna i Design of chimeric peptide ligands to galanin receptors and substance P receptors. Int. J. Pept. Protein Res. 39, 516-522. (1992) Langel, Ülo., Land, T., and Bartfai, T. i T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 8 2. Kovalent imrnobilisering avggQys-PNA-oligomerer på elektroder. Preparering av elektroden för mätning Etanol-tvättad och torr elektrod inkuberades i 1 uM lösning av läinplig Cys-PNA 21- mer lösning i B2 under 14-16 h vid rumstemperatur i mörker och i tättslutet rör. Elektroden tvättades med vatten, inkuberades under 5 min i vatten.

Den PNA-modifierade elektroden placerades i cellen och tvättades med B2, 100 ml/h, 10 ml, elektroden stabiliserades (förändring är mindre än 2 Hz/ 10 min) under 20 - 60 min. 3. Analys av polgukleotider 30-50 pl av utspädd analyt (21-mer av oligonukleotider, plasmider, RNA eller DNA från celler) injicerades i cellen med PNA-modifierad och preparerad elektrod, och frekvens- förändringen registrerades. 4. PNA-sygtes Syntes av PNA-polymerer utfördes manuellt såsom beskrivits vid användning av t- Boc kemi och monomerer från PerSeptive Biosystems (F ramingham, MA, USA). Tiolenheten infördes i PNA-polymeren som aminosyran Cys i Sïposition hos PNA-oligomerer.

Sekvenser av PNA-oligomerer presenteras i enlighet med peptidnomenklaturen (N- terrninalen hos PNA-oligomeren ligger till vänster). 21-mer cPNA, komplementär till regionen 18-38 hos den humana galaninreceptor typ 1: GC GTT GCC CTC GCT GAG GTT C amid 21 -mer blandad PNA: GGC ATG GCT GCT CTC CGT CTG amid 1 -mer cPNA, komplementär till regionen 18-38 hos galaninreceptom typ 1 hos råtta: CC ATT CCC TTC ACT GAG GTT C arnid 5. Separation av DNA Celler återsuspenderades i l vol av digestionsbuffert. Proverna inkuberades under skakning vid 50°C i 12-18 h och extraherades med lika volym av fenol/kloroforrn/isopropanol följt av centrifugering i 10 min vid 1700 x g i en rotor med svängande provhållare.

Det vattenhaltiga (topp) skiktet överfördes till ett nytt rör och V2 vol av 7,5 M ammoniumacetat samt 2 vol av 100% etanol tillsattes. Pelleten sköljdes med 75% etanol, etanolen dekanterades och pelleten torkades. DNA återsuspenderades i TE buffert tills den var löst.

T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc 10 15 20 25 30 512 994 6. e aration av RNA Celler lyserades genom tillsats av UltraspecTM RNA. 0,2 ml kloroforrn per l ml UltraspecTM RNA tillsattes och skakades vid 4°C i 5 min. Homogenatet centrifugerades vid 12000 x g (4°C) i 15 min. Den vattenhaltiga fasen överfördes försiktigt och en lika volym isopropanol tillsattes; proverna inkuberades under 10 min vid 4°C. Supematanten avlägsnades och RNA-pelleten tvättades två gånger med 75% etanol genom virvling och efterföljande centrifi1gering i 5 min vid 7500 x g vid 4°C. Pelleten torkades under vakuum i 5-10 min.

RNA-pelleten löstes i 50-100 pl UltraspecTM DEPC behandlat vatten. 7. Plasrnid Mammalievektorn pRK8, som härstammar från vektorn pRK5, användes som en hGaIR1 cDNA-sekvensinnehållande konstruktion. Den humana galaninreceptor cDNA, hGalR1, från den humana melanom Bowes-cellinjen, PCR-klonades och infördes i EcoRl och Notl klyvd pRK8. Den insatta receptom som har 21-mer homolog region med iPNA-proben, användes i preliminära experiment för att visa speciñcitet och selektivitet hos PNA-biosensor genom interaktion med PNA-elektrod. 8. Oligonukleotidgr Sekvenser av komplementära DNA-oligomerer GIBCOBRL, Bl958Bl1, MW 6834 pg/pmol användes till den 21-mer homologa regionen med 21-mer cPNA komplementär till region 18-38 hos galaninreceptor typ 1 hos råtta.

Sekvens hos 21-mer CR DNA: GAACCTCAGTGAAGGGAATGG Sekvens hos 21-mer cPNA: CTTGGAGTCACTTCCCTTACC 9. Regenerering av elektroden för vidare användning Regenerering av elektroden åstadkommes genom tillsättning av RNAser eller DNAser som bryter ned de specifikt bundna RNA respektive DNA. Ett annat sätt att preparera den en gång använda PNA-elektroden vid nästa tillämpning är att tvätta de specifikt bundna polynukleotiderna genom tvättningen av cellen med buffertar av olika jonstyrka och vatten.

IQ. Kinetik hos duplex- eller gjplexbjldning Jämvikten av bindningar av oligonukleotider till PNA-elektroder uppnås inom 100- 200 s, den tid som är lämplig för bestämning av interaktionskinetiken utan ytterligare utrustning. Följaktligen är metoden användbar för mätning av kinetiken hos interaktionen mellan PNA och analyserade RNA eller DNA monomerer eller dimerer.

Tz\PATE"N'l'\29-\29454\svcnskbct.doc 10 15 20 25 30 .512 994 10 11. Immobilisegng av biotigyl-PNA-polflier till strgptavidinbelagd elektrod Det är möjligt att helt enkelt koppla biotinylenhet till den lämpliga sekvensen hos PNA-polymeren. Det är också möjligt att belägga QCA-elektroden med avidin eller streptavidin, och att använda den belagda elektroden till att binda biotinyl-PNA. Denna metod är ett altemativ till kopplingen av PNA-polymerer till elektrodema genom reaktion mellan SH-grupper och guldyta (jmf. ovan). 12. Cellkulturer Rin m5F-celler från råtta odlades i RPMI 1640 (Gibco 041-01870), utökat med 5% fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 ng/ml streptomycin.

Cellema odlades under 3 dagar till ca 50% sammanflytning i vävnadsodlingskolvar.

SHSY-celler från råtta odlades i minimalt essentiellt medium med Earles salter (MEM), utökat med 10% fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 ng/ml streptomycin, 1% icke-essentiella aminosyror. Cellema odlades under 3 dagar till ca 50% sarnmanflytning i vävnadsodlingskolvar.

RESULTAT A. TNT analys Användning av piezoelektriska (PZ) kristaller som analytiska sensorer, i kvartskristall mikrovåg (QCM), har beskrivits i vår patentansökan PCT/EP98/03531, vars innehåll här införlivas genom referens, vid detektering av små mängder av TNT i lufiprover uppsamlade från jord som antagligen innehåller minor, följt av koncentrering.

I den allmänna metoden i dessa studier användes 9-10 MHz, elektroden, QA-A9M- Au, Seiko eller Quartz Probe, Sverige som hade elektrodbundna TNT-antikroppar. Frekvens- förändringen hos elektroden på grund av antikropp-antigen interaktion registreras i tid.

Drift av QCA med kommersiell mätenhet är mycket känslig för elektriska och fysikaliska störningar, t ex rekommenderas att inte använda radio i samma rum med QCA; pumpvibrationerna stör mätningarna signifikant. Därför är det starkt rekommenderat att betingelserna för mätningarna definieras väl. Systemets stabilitet varierar från dag till dag och till och med från elektrod till elektrod, och ibland beter sig till och med olika sidor av elektroderna olika.

I tre olika experiment har vi använt samma elektrod (båda sidor) i både ett kommersiellt system och i systemet enligt uppfinningen på följ ande sätt. Effekten av TNT mättes först i ett kommersiellt, Seikos, system och ingen effekt av TNT erhölls. En annan sida av elektroden användes i systemet enligt uppfinningen och effekten av TNT erhölls. I två olika experiment har vi använt samma elektrod (båda sidoma) i båda systemen på motsatt sätt.

Tz\PATEN'l\29-\29454\svenskbtt.doc 10 15 20 25 30 512 994 ll Effekten av TNT mättes i systemet enligt uppfinningen först och effekten av TNT erhölls. En annan sida av elektroden användes i Seikos system och effekten av TNT erhölls inte. Seikos elektronik kunde värma upp elektroden under mätningarna och därför förorsaka försvinnande av effekten av TNT.

Konstruktionen hos biosensorcellen enligt uppfinningen tillåter Stabilisering av systemet på 1-2 min eller snabbare. Metoden med TNT-detekteringen genom användning av specifika antikroppar på QCA resulterade i detektering av TNT vid den låga nivån av 10 pg TNT.

B. Polynukleotídanalys De ursprungliga analogema av olika PNA hör till de komplementära cDNA- härstarnrnande sekvenserna av human- och rått-hjämgalaninreceptor (jmf. ovan). 21-meren från human galaninreceptor cDNA tjänstgör som vägledande sekvenser på grund av deras visade höga speciñcitet i preliminära experiment.

I preliminära experiment kopplades dessa 21-merer av PNA till PZ-elektroder, varpå kopplingen följdes av förändring av 500-1000 Hz i frekvens. De modifierade elektrodema exponerades sedan för följande källor av oligonukleotider och polynukleotider. l. Komplementära DNA 21-merer, sekvenser jfr. ovan. 2. Plasmid med komplementära DNA-regioner införlivade. 3. Totalt cellulärt RNA från cellinjer som uttrycker respektive galaninreceptorer. 4. Dubbelsträngat DNA från cellinj er som uttrycker respektive galaninreceptorer.

Genom registrering av förändringen i frekvens registrerades interaktionen av immobiliserat PNA med cellulärt RNA eller DNA. Resultaten visas i Fig. 3 till Fig. 6. Som en kontrollinj ektion till varje analys injicerades 30-50pl buffertlösning.

Som negativa kontroller utnyttjades två olika angreppssätt. 1. Elektroder immobiliserades med rått- och human-PNA 21-merer exponerades för RNA från cellinjer som inte uttrycker galaninreceptorema, SHSY. 2. En elektrod-irnmobiliserad blandad PNA 21 -mer sekvens (järniört med komplementära sekvenser) exponerades för galaninreceptor som uttrycker cellulära RNA och DNA.

I samtliga fall registrerades ingen förändring av frekvens vid kontrollanalys.

Känslighet Data beträffande analys av DNA, RNA, DNA 21-merer och plasmider presenteras i Tabell 1. Man kan se att relativt små mängder av polynukleotidema kunde analyseras.

Mängden av 30-50 ng av 21-mer DNA, 160-200 pg plasmid, 1 pg RNA och 12-18 pg DNA analyserades effektivt med PNA-QCA-metoden. Den lägre gränsen beträffande mängd för Tz\PATEN'l\29-\29454\svenskut.doc 512 994 12 RNA- och plasmidanalys kunde vara till och med lägre, men denna analys har emellertid inte ännu utförts.

Kemiska modifikationer av Au-PZ-elektroder med olika Cys-PNA för att analysera med QCA specifikt bindande RNA eller DNA polymerer extraherade från humana vävnadsprover, är en relativt enkel metod. PZ 9-10 MHz-elektroder är kommersiellt tillgängliga. QCA-utrustningen som presenteras i föreliggande ansökan är mycket känsligare och tillfórlitligare än de kommersiella systemen.

T:\PATEN'l\29-\29454\svenskmt.doc 20 512 994 13 Tabell 1. Analys med PNA-QCA av olika mängder av olika polynukleotider Interaktion mellan PNA Frekvensfórändring Frekvensfórändring och (Högre koncentration) (Lägre koncentration) Totalt DNA -103 Hz (18 Hg) -8 Hz (1,2 pg) -230 Hz (12 pg) Totalt RNA -134 Hz (3,2 pg) -37 Hz (1 pg) -69 Hz (3,2 pg) 21-mer oligonukleotid -l7 Hz (30 ng) -2 Hz (15 ng) -13 Hz (50 ng) -1 Hz (10 ng) Plasmid _36 Hz (200 ng) _31 Hz (ss ng) -34 Hz (160 pg) Förkortningar t-Boc: tert-butyloxikarbonyl cDNA: komplementär DNA DEPC : dietylpyrokarbonat DNA: deoxiribonukleinsyra DNT: dinitrotoluen EcoRl : ett restriktionsendonukleas från E. coli RYl3 hGal R1 : human galaninreceptor typ 1 Notl : ett restriktionsendonukleas från Nocardia otítidis-cavarium PCR: polymeras kedjereaktion PNA: pRK8: mammalievektor som härstammar från vektom pRKS PZ : piezoelektrisk QCA : (quartz crystal analysis) kvartskristallanalys RNA: ribonukleinsyra TE: tris-EDTA TNT: trinitrotoluen peptidnukleinsyra UltraspecTM : DNA och RNA isoleringsreagens, innehåll : fenol, guanidinsalter, urea, buffertmedel, detergent and stabiliseríngsmedel.

T:\PATENT\29-\29454\svensktxt.doc

Claims (11)

10 15 20 25 30 512 994 14 Patentkrav

1. Biosensorcellanordning omfattande en testkarnmarkavitet (42) och en piezoelektrisk kristall (41) belagd på ytan som vetter mot testkammarkaviteten (42) med en interaktionspartner till en analyt, varvid kristallen (41) är ansluten till en oscillationsenhet och signalbearbetningselektronik, k ä n n e t e c k n a d därav, att anordningen ytterligare omfattar en inloppsnål (49) för införande av analyten vilken slutar på ett litet avstånd från änden av, och på insidan om, en inloppsärm (50) for införande av buffenlösning vilken slutar i närheten av kristallens (41) aktiva yta, varvid inloppsärmen är ansluten till ett inlopp (47) for buffertlösning, och ett utlopp (48) for överskottsvätska.

2. Biosensorcellanordning enligt kravet 1, vari inkoppsnålen (49) är en automatisk injektor.

3. Biosensorcellanordning enligt kravet 1, vari inloppsnålen (49) är en injektionsspruta.

4. Biosensorcellanordning enligt något av kraven 1-3, vari den piezoelektriska kristallen (41) är belagd med två eller flera olika interaktionspartners som var och en interagerar med en olik analyt.

5. Biosensorcellanordning enligt något av kraven 1-3, vari interaktionspartnem är en antikropp som specifikt binder till analyten (antigen).

6. Biosensorcellanordning enligt kravet 4 eller 5, vari analyten eller analytema är vald(a) bland narkotika och sprängämnen.

7. Biosensorcellanordning enligt kravet 6, vari sprängämnet är 2,4,6-trinitrotoluen (TNT).

8. Biosensorcellanordning enligt något av kraven 1-4, vari interaktionspartnern är en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer och analyten är en polynukleotid.

9. Biosensorcellanordning enligt något av kraven 1-4, vari interaktionspartnem är en polynukleotid och analyten är en peptidnukleinsyra (PNA) oligomer.

10. Biosensorcellanordning enligt kravet 8 eller 9, vari polynukleotiden är vald från den grupp som består av RNA, DNA och PNA polymerer som är komplementära till PNA- oligomeren.

11. Användning av en biosensorcellanordning enligt något av kraven 1-8 för kvalitativ och kvantitativ analys av åtminstone en analyt och/eller dess interaktionspartner. \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29454\kravsv.doc