CN102971422B - Psa结合适体和前列腺癌的诊断方法 - Google Patents
Psa结合适体和前列腺癌的诊断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102971422B CN102971422B CN201080067716.3A CN201080067716A CN102971422B CN 102971422 B CN102971422 B CN 102971422B CN 201080067716 A CN201080067716 A CN 201080067716A CN 102971422 B CN102971422 B CN 102971422B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- psa
- fit
- sequence
- polynucleotide
- district
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Abstract
本发明提供了一种结合前列腺特异性抗原(PSA)的适体,所述适体包含:具有由1至10个核苷酸组成的随机多核苷酸序列的前区;位于所述前区的3'端的由nnnnCT组成的第一区,其中各n独立选自A、T、G和C;由nnCTTT组成的第二区,其中各n独立选自A、T、G和C,并且所述第二区的至少一部分与所述第一区互补;和位于所述第一区和所述第二区之间并且由具有3至30个核苷酸的随机多核苷酸序列组成的第三区。
Description
技术领域
本发明涉及可结合前列腺特异性抗原(PSA)的适体,和利用所述适体诊断前列腺癌的方法。
背景技术
前列腺特异性抗原(PSA)是主要由前列腺上皮细胞产生的33kDa至34kDa的糖蛋白,已知其为用于诊断前列腺癌的最常见血清标志物。前列腺癌通常导致高浓度的PSA释放到循环系统中,并导致血清PSA水平升高多达105倍。因此,对血清PSA的测量广泛用于前列腺癌患者的早期检测和监测。高于限定值(cut-off value)(4.0ng/mL)的血清PSA测量结果通常被认为是阳性,可能提示需要进行活检。
适体是能够以可与单克隆抗体相当的高亲和力和特异性识别诸如蛋白和小分子等各种靶标分子的核酸配体。适体,特别是DNA适体易于廉价合成并进行化学修饰。此外,可以将它们设计为在结合靶标时发生结构变化。这些特征使得DNA适体成为生物传感器中理想的分子识别元件。利用适体的优点,已经构建了基于适体的高灵敏性检测体系。
在适体对生物传感器的应用中,靶标结合能力是最重要的特征。在体外通常利用基于靶标结合能力的称为SELEX(指数富集的配体系统性进化)的方法来从随机序列库中选择适体。由于可利用聚合酶链式反应(PCR)进行迭代的选择循环,SELEX是高效的筛选方法。
在这些情况下,已知各种适体可作为检测工具,例如用于朊病毒特异性蛋白(JPNo.2006-42645A1)、血管内皮生长因子(JP 2008-237042)和胰岛素(JP No.2009-183192A1)的检测工具。
特别是,WO2006/096754描述了能够结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的稳定化的适体及其作为前列腺癌治疗剂的应用,并且公开了通过最小化和优化获得的适体所具有的Kd(解离常数)=2~10(nM)。
另一方面,已知SELEX有时不能筛选出对靶标分子具有高亲和力的适体,并且其中通过SELEX筛选适体的序列空间的实际尺寸和复杂度小于预期。为了获得具有更高亲和力的适体,已知有各种通过SELEX进行筛选的变化方法,例如利用遗传算法(GA)的DNA适体的选择方法(例如,见Nucleic Acids Res.,2005,第33卷(12),e108,JP No.2007-14292A)。为了利用GA基于靶标结合能力来选择适体,对候选寡核苷酸首先通过SELEX进行预选。随后利用GA对他们的寡核苷酸序列在计算机上进行扩增、交叉和突变。在进行GA运算后,在体外合成并测试新的序列组。随后,选取具有高结合亲和力的序列用于下一轮GA循环。通过重复GA运算的过程,可以覆盖仅通过SELEX不能被完全筛选的序列空间。
然而,由于适体的结合能力通常低于抗体,适体通常不作为实用的诊断工具,并且,例如,上述PSMA结合适体由于同样的理由不足以用于诊断前列腺癌。
发明内容
本发明鉴于以上情况而完成,并提供了适体、前列腺癌的诊断方法和适体的制备方法。
本发明的第一方面提供了结合前列腺特异性抗原(PSA)的适体,所述适体包含:具有由1至10个核苷酸组成的随机多核苷酸序列的前区;位于所述前区的3'端的由nnnnCT组成的第一区,其中各n独立选自A、T、G和C;由nnCTTT组成的第二区,其中各n独立选自A、T、G和C,并且所述第二区的至少一部分与所述第一区互补;和位于所述第一区和所述第二区之间并且由具有3至30个核苷酸的随机多核苷酸序列组成的第三区。
本发明的第二方面提供了前列腺癌的诊断方法,所述方法包括使上述适体接触受试者的体液样品。
在一些实施方式中,上述适体是以下(1)至(3)中的一种:
(1)SEQ ID No.1至7的多核苷酸;
(2)除了分别在第三区和前区中的每个区中有1至5个核苷酸不同之外,序列分别与SEQ ID No.1至7相同的多核苷酸;或
(3)除了分别在第一区和第二区中总共有1至5个核苷酸不同并且第三区和前区中的每个区中有1至5个核苷酸不同之外,序列与SEQ ID No.1至7相同的多核苷酸。
附图说明
图1是显示本发明的适体的预测二级结构的图。
图2显示了通过适体印迹进行的在硝酸纤维素膜上对PSA的各轮SELEX的DNA文库的结合测试结果。
图3A是显示GA进化的亲代中的寡核苷酸的PSA结合能力的图。
图3B是显示GA进化的第一代中的寡核苷酸的PSA结合能力的图。
图3C是显示GA进化的第二代中的寡核苷酸的PSA结合能力的图。
图3D是显示GA进化的第三代中的寡核苷酸的PSA结合能力的图。
图3E是显示GA进化的第四代中的寡核苷酸的PSA结合能力的图。
图3F是显示GA进化的第五代中的寡核苷酸的PSA结合能力的图。
图4是显示利用经过GA运算选择的ΔPSap4#5通过平板测试得到的对PSA传感的结果。
具体实施方式
本发明的适体是结合前列腺特异性抗原(PSA)的适体,所述适体包含:具有由1至10个核苷酸组成的随机多核苷酸序列的前区;位于所述前区的3'端的由nnnnCT组成的第一区,其中各n独立选自A、T、G和C;由nnCTTT组成的第二区,其中各n独立选自A、T、G和C,并且所述第二区的至少一部分与所述第一区互补;和位于所述第一区和所述第二区之间并且由具有3至30个核苷酸的随机多核苷酸序列组成的第三区。
根据本发明,由于本发明的适体具有通过位于所述前区的3'端的由特殊序列组成的第一区和由特殊序列组成的第二区,且第一区和第二区由随机多核苷酸序列组成的第三区而连接,因此所述适体具有特殊的二级结构,以及比其他与PSA结合的适体更高的对PSA的亲和力,并且本发明的适体的结合能力几乎等于抗体的结合能力。
在本发明中,与方法相关的术语“步骤”不仅可表示独立步骤,也可表示不能与其它步骤清楚区分的步骤,只要可以获得该步骤的预计效果即可。
另外,本发明中任何表示数值范围的表现形式均表示由最小值和最大值限定的范围,并且包括该最小值和最大值。
除非另外指出,本发明的组合物中各成分的含量,在组合物中包含与本发明所定义的各成分对应的成分中的一种时,是指一种成分的量,并且在包含两种以上成分时是指其总量。
下面将描述本发明。
如上所述,本发明的适体由前区、第一区、第二区和第三区组成,并且具有由第一区和第二区形成的茎部分(双链区域)和分别由前区和第三区形成的环部分(单链区域),从而使本发明的适体的二级结构为发卡结构。
本说明书中术语“茎部分”是指两条多核苷酸可根据其互补性而形成整体双链区域。因此,该术语不仅可以包括该区域由完全互补的两条多核苷酸序列构成的情况,还可以包括该区域由不完全互补(只要所述多核苷酸的至少一部分互补即可)的两条多核苷酸序列构成并且可形成整体双链区域的情况。
可以选择第二区的序列,从而使得能够形成双链区域(即,茎部分)并且第二区的至少一部分由与第一区互补的核苷酸构成。第三区由具有3至30个核苷酸的随机多核苷酸序列构成,并且形成单链环。虽然其具体理由仍然不明,不过据认为本发明适体对PSA的高亲和力是由于这种结构所至(见图1)。
第一区位于前区的3'端,并与第二区一起形成双链区域。考虑到对PSA的结合亲和力,第一区优选为(A或C)A(A或G)GCT,更优选第一区为AAAGCT、AAGGCT或CAGGCT。
考虑到对PSA的结合亲和力,第二区优选为(A或C)(A或G)CTTT,进而更优选第二区为A(A或G)CTTT,甚至更优选为AGCTTT或AACTTT。
适体的前区具有由1至10个核苷酸构成的随机多核苷酸序列,用于稳定适体的二级结构。考虑到对PSA的结合亲和力,前区优选由Tm(A或T)(A或C)T(T或G)构成,并且m是1至10的整数,优选是1至5的整数。更优选前区可以具有TTTTTAATT或TTTTTAATG,或与其有1或2个碱基不同的多核苷酸序列,例如TTTTTTATT或TTTTTACTG等。
第三区具有3至30个随机多核苷酸序列并且形成环结构。考虑到环的稳定性,所述随机多核苷酸序列优选包括3至20个核苷酸,更优选5至15个核苷酸,进而更优选7至13个核苷酸。构成该随机多核苷酸序列的核苷酸的种类没有限制,本领域技术人员可以制备用于第三区的随机多核苷酸序列。考虑到对PSA的结合亲和力,第三区最优选可以为CGCCATCAAAT(SEQ ID No.12)或与其有1至5个碱基不同的多核苷酸序列,例如CGCCATCAGAT(SEQ ID No.13)或CGCCATCAAAG(SEQ IDNo.14)等。
特别是,本发明的结合PSA的适体优选为以下多核苷酸之一:
(1)SEQ ID No.1至7的多核苷酸,
(2)除了分别在第三区和前区中的每个区中有1至5个核苷酸不同之外序列与SEQ ID No.1至7相同的多核苷酸;或
(3)除了分别在第一区和第二区中总共有1至5个核苷酸不同并且第三区和前区中的每个区中有1至5个核苷酸不同之外,序列与SEQ ID No.1至7相同的多核苷酸。
以上(3)中所述多核苷酸与SEQ ID No.1至7有1至15个核苷酸不同,这是因为具有在该范围内的差异的多核苷酸可以具有相似的对PSA的结合能力。优选的以上(3)或(2)中所述的多核苷酸选自对于第一区、第二区、第三区和前区的上述优选多核苷酸的组合。
由于本发明的适体可以利用自动化学合成仪来制备,因此其制备比特异性抗体容易和廉价得多。
表1
虽然可以通过已知的SELEX法获得包括上述适体在内的与PSA结合的适体,但优选可以使用改变的SELEX法。制备与PSA结合的适体的优选方法可以是包括以下步骤的方法:
利用固定在固相上的PSA进行SELEX选择处理,以获得由单链多核苷酸构成的备选序列;
进行不同备选序列之间的交叉和各备选序列的随机点突变来修饰所述备选序列,从而获得经修饰的备选序列;和
基于PSA结合能力来分选经修饰的备选序列,从而获得适体。
适体制备方法中的SELEX选择是本领域技术人员已知的,并可通过已知方法进行SELEX选择。该方法中,靶标分子(PSA)固定在固相上,向其上添加包含具有很多种随机碱基序列的多核苷酸的多核苷酸文库,并收集与靶标分子结合的多核苷酸,随后对所述多核苷酸通过PCR扩增,之后再次将所扩增的多核苷酸添加到其上固定有靶标分子的载体中。通过重复该过程约10次,富集了对靶标分子具有高结合能力的适体,并确定其序列从而获得识别靶标分子的适体。
在SELEX选择中,可以简单通过物理吸附(如空气干燥)或通过利用PSA的羧基或氨基使PSA与固相共价键合(采用公知的氨基偶联剂等),从而进行PSA的固定。用于固定PSA的固相可以为(但不限于)可吸附PSA的硝酸纤维素膜、尼龙膜、滤纸或聚苯乙烯微量滴定板的孔等。
由于适体的大小通常为约30聚体至100聚体,用于SELEX选择的多核苷酸文库中的多核苷酸具有约30聚体至100聚体的随机碱基序列,并通过自动核酸合成仪合成。在该情况下,虽然多核苷酸的全长可以为随机碱基序列,但多核苷酸两端区域还可以是已知的碱基序列,以便在进行SELEX时简化PCR。在该情况下,PCR引物可以分别与这些已知序列的区域杂交。位于多核苷酸两端区域的区域的大小没有限制,但通常为约10聚体至25聚体。
接下来,将以上述方式产生的多核苷酸文库与固定的测试物质反应。文库和PSA之间的反应优选可在室温进行。反应时间通常可以为但不限于约1分钟至30分钟,优选约10分钟至20分钟。在与PSA反应时,可结合PSA的适体与PSA结合并固定在固相上。另一方面,不与测试物质结合的多核苷酸不能结合在固相上,因此通过洗涤而被去除。
在将未结合在固相上的多核苷酸通过洗涤去除之后,将结合在PSA上的适体洗脱。例如可通过以约6M至8M的高浓度尿素处理所述固相,从而进行洗脱。可通过常规方法例如酚抽提和/或酚-氯仿抽提和乙醇沉淀来收集洗脱的多核苷酸。所收集的所有适体是那些与固定的测试物质结合的适体。
接下来,用所收集的适体作为模板进行PCR,从而扩增适体。在自动合成的多核苷酸在两端区域具有上述引物结合区域的情况下,利用那些引物进行PCR。在未提供所述引物结合区域的情况下,确定所收集的适体的多核苷酸序列,并合成与各末端区域互补的PCR引物对,所述引物用于进行PCR。通过进行非对称PCR(PCR所用的引物对中的一个引物以过量使用),可以扩增主要的单链多核苷酸。作为另一种选择,利用生物素标记的引物作为PCR所用的引物对中的一个引物进行PCR;使所扩增的双链多核苷酸与抗生物素珠结合;利用NaOH等将该状态的多核苷酸变性;并收集从所述珠分离的多核苷酸,从而可以从所扩增的双链多核苷酸中收集单链多核苷酸(该链没有被生物素标记)。通过这种方式,由于只有与固定的PSA结合的适体被扩增,并且与固定的PSA结合良好并作为PCR中的模板的适体的分子的数量很大,其在扩增的多核苷酸文库中的百分比变得较高。
接下来,利用所扩增的适体的文库作为上述多核苷酸文库,将上述一组步骤的循环重复约数次至十余次,所述步骤即:与固定的测试物质的反应;洗涤;洗脱和收集适体;和通过PCR扩增。由此,富集了与测试物质结合良好的适体,并可获得与测试物质结合能力高的适体。
在SELEX选择后,利用遗传算法(GA)进行备选序列的修饰,从而获得经修饰的备选序列。在修饰过程中,使备选序列在计算机上进化。通过采用计算机上的进化,可以增加所需适体产生的效率。例如,Nucleic Acids Research,2005,33(12),e108和Angew.Chem.Int.,Ed.2005,33,1061-1065等中描述了利用GA的修饰。在这些方法中,在完成第一轮的上述SELEX之后,确定了所获得的适体的多核苷酸序列(备选序列或SELEX前序列),测定了其与PSA的结合能力,并按照结合能力的次序对所测定的能力进行分选。迄今为止对适体的研究已表明,适体的基本结构可分为4种类型―即,发卡型、凸出型、假结型和鸟嘌呤四方型——并且何种结构由具有何种碱基序列的适体获得、何种核苷酸是保持基本结构所必需的核苷酸可容易地通过计算机分析确定。在利用计算机进化的方法中,应用了交叉、点突变或其组合。在交叉中,随机选择备选序列对,并且在各所得适体的各相应区域中的至少一个区域(例如,约三聚体至五聚体的区域)相互交换。之后,对于交换之后的上述各区域,引入随机单碱基替换。这些交换和单碱基替换的引入在计算机上进行。具有由计算机生成的新多核苷酸序列的适体通过化学合成,从而获得第二多核苷酸文库,随后将第二多核苷酸文库用于上述循环。当制备了第二多核苷酸文库时,具有就结合能力而言分级最高的适体所来源的区域的适体的含量最大,随着分级变低其比例降低。因此,通过在计算机上由交叉和随机单碱基替换而人工引入各种改变,可以增加SELEX的进化效率。
在修饰中交叉和随机单突变优选可以组合,从而获得第二多核苷酸文库,该第二多核苷酸文库包括与PSA的结合能力更高的经修饰的备选序列。在该情况中,经修饰的备选序列可以是通过下述方法而获得的经多次修饰的备选序列:进行交叉修饰或随机点突变修饰,基于PSA结合能力从经修饰的序列中选择首次经修饰的备选序列,通过进行在最初获得经修饰的序列时没有进行的交叉修饰或随机点突变修饰中那一种来修饰首次经修饰的备选序列,和基于PSA结合能力从经多次修饰的备选序列(是已经通过进行在最初获得经修饰的序列时没有进行的交叉修饰或随机点突变修饰中那一种而得到修饰的首次经修饰的备选序列)中进行选择。
为了高效地获得以高结合能力与PSA结合的适体,制备适体的方法优选可利用一些多核苷酸序列(这些多核苷酸序列在实际用作SELEX前备选序列时,具有经证实的可导致产生具有高结合能力的适体的历史),并且可以是包括以下步骤的方法:对于四种初始序列(该四种初始序列包括具有SEQ ID No.8至11的多核苷酸序列)进行选自由序列之间的交叉和各序列的随机点突变组成的组的至少一种修饰;和从通过至少一种修饰而获得的经修饰的序列中选择靶标序列,所述靶标序列的PSA结合能力高于初始序列的PSA结合能力。SEQ ID.No.8至11的多核苷酸序列的结合能力如本说明书所述得到了证实,并且结合能力高于只通过SELEX选择而获得的多核苷酸。因此,由于随后对利用SEQ ID.No.8至11的多核苷酸序列由修饰而获得的序列根据这些多核苷酸序列对PSA的结合能力进行了分选,从而能够确保获得与PSA结合的适体。
表2
作为另一种选择,为了有效地获得以高结合能力与PSA结合的适体,制备适体的方法优选可利用其它多核苷酸序列(这些多核苷酸序列具有经证实的可导致产生具有高结合能力的适体的历史),并且是包括以下步骤的方法:对于包括具有SEQ ID No.10的多核苷酸序列的基础序列进行选自由序列之间的交叉和各序列的随机点突变组成的组的至少一种修饰;和从通过至少一种修饰而获得的经修饰的序列中分选靶标序列,所述靶标序列的PSA结合能力高于具有SEQ ID No.10的标准序列的PSA结合能力。由于本说明书中证实SEQ ID No.10的多核苷酸序列的结合PSA的能力与PSA的抗体一样高,因此通过利用SEQ ID:No.10的多核苷酸序列而获得的适体可有利地用作前列腺癌的诊断工具。
优选可重复上述方法中包括交叉或点突变的利用GA的修饰,从而有效地获得靶标序列。修饰的重复可以简单涉及上述步骤的实施。
本发明的前列腺癌的诊断方法是包括将上述适体与受试者的体液样品接触的方法。根据所述前列腺癌的诊断方法,由于使用以高结合能力与PSA结合的至少一种适体作为检测工具,该诊断与利用抗PSA的抗体的诊断一样可靠。此外,由于本发明的适体可通过自动化学合成仪来制备,其制备比抗体更容易并更廉价。因此,进行本发明的对前列腺癌的诊断可以比传统方法更廉价。
可通过检测或确定样品中作为靶标物质的PSA,来进行前列腺癌的诊断方法。因此,所述方法优选包括使上述适体接触受试者的体液样品和检测适体与PSA的复合物,或确定适体与PSA的复合物的量。
体液样品可包括但不限于血清、血浆或其稀释液等。使受试者的体液样品与上述适体接触。这可以通过将样品与适体溶液混合、并温育所得的混合物来进行。样品中PSA的检测或确定可通过已知的普通方法进行。例如,可以利用适体替代抗体进行免疫测试,如免疫色谱或ELISA。另外,可以将利用SPR(表面等离子体共振)的检测方法或适体印迹方法等改造以用于本发明的诊断。作为另一种选择,在利用本发明的适体时,可使用WO2005/049826和WO2007/086403中所述的检测或测试方法。
可以采用自动检测装置以机械方式进行利用上述适体的前列腺癌诊断。在该实施方式中,可以提供具有下述各部的检测装置:样品保持部,其保持有包含受试者的体液样品和适体的检测样品;检测部,其能够检测所述检测样品中的PSA和适体的复合物;和显示部,其显示来自检测部的检测结果。通过所述检测装置,可以更容易地进行前列腺癌的诊断。
样品保持部可以具有任何可保持检测样品的形式。由于检测样品在供应到检测部时可包含受试者的体液和与PSA结合的适体,可以将检测样品作为受试者的体液与适体的混合物提供至检测部;或可以将检测样品作为包含体液或适体的分开的液体提供,并在由样品保持部供应后在检测装置中相互混合。
检测部具有能够检测PSA与适体之间的结合的构造,并且可以根据对PSA和适体的具体检测方法来进行选择。检测方法的实例可以包括但不限于免疫测试,例如免疫色谱、ELISA或上述SPR等,并且检测部的实例可以包括但不限于荧光计或SPR装置等。此外,检测部具有将检测结果装换为检测数据的计算部。因此,检测结果可以转换为数据。
显示部将通过检测部获得的结果所产生的检测数据输出到显示器上。显示器可以是任何已知可用于所述目的的显示器。
通过使用检测装置,受试者体液中的PSA的检测可通过自动检测来进行。在该实施方式中,检测方法包括:收集受试者的体液的步骤;利用上述适体产生检测结果数据从而计算体液样品中PSA的量的步骤;和将检测结果数据输出至显示部的步骤。因此,可以容易地检测PSA,并且可根据所述结果进行前列腺癌的诊断。
由于本发明的适体可以可靠地检测受试者的体液样品中的PSA,因此该适体可用作PSA检测试剂盒的一个组分。在该实施方式中,可提供PSA检测试剂盒,该试剂盒包括:第一容器,其包含含有上述适体的适体溶液;可选的第二容器,其包含可用于稀释适体溶液或受试者的体液样品的稀释剂;和说明利用适体检测PSA的程序的文件。因此,PSA的检测可以容易地进行。
保持部件的构造没有特别限制,只要其能够保持适体即可,并且可以根据试剂盒中所含适体的形式适当选择。例如,当试剂盒含有溶液形式的适体时,保持部件可以为能够保持液体的容器。另外,当试剂盒含有作为固定的固相的适体时,保持部件可以为能够保持固定的固相的板或容器。
另外,试剂盒可以包含不具有与PSA的结合能力的其他适体,作为PSA检测方法的阴性对照。
实施例
下面将描述本发明的实施例,但本发明不限于这些实施例。除非另外指出,否则实施例中“%”表示重量(质量)百分比。
材料
纯化自人精液的PSA购自Sigma-Aldrich和Scipac。合成的寡核苷酸购自Invitrogen、Greiner Bio-One和Operon Biotechnologies。硝酸纤维素膜购自GEHealthcare。人血清购自Nissui。KAPA2G快速PCR试剂盒购自KAPA Biosystems。AmpliTaq Gold购自Applied Biosystems。pGEM载体购自Promega。抗生物素蛋白-固定化凝胶珠购自Pierce。HRP偶联的抗FITC抗体购自Dako。止动剂蛋白质印迹化学发光HRP底物购自Millipore。PolySorp 96孔聚苯乙烯板购自Nunc。封闭试剂N102购自Nof。BM化学发光ELISA底物购自Roche。SA传感器芯片购自Biacore。其他试剂为分析纯级别。
通过SELEX进行的对PSA结合适体的选择
使用FITC标记的单链DNA文库,该文库包含与20聚体引物结合序列在两端通过三聚体胸腺嘧啶-(T3-)接头连接的24聚体随机区域(5'-CATGCTTACCTATAGTGAACTTT(N24)TTTCTTTGAGAACTGACTCATAC-3':SEQ ID:No.15)。该文库利用正向引物(5'-CATGCTTACCTATAGTGAAC-3':SEQ ID:No.16)和反向引物(5'-GTATGAGTCAGTTCTCAAAG-3':SEQ ID:No.17)扩增。DNA文库在95℃加热10分钟,然后在TBS缓冲液(10mM Tris/HCl,150mM NaCl,5mMKCl,5mM MgCl2,pH 7.4)中在30分钟时间内逐渐冷却至25℃,形成折叠结构。将PSA(1μg)点印在硝酸纤维素膜上,并空气干燥。将PSA点印的膜与含0.5%Tween 20(TBST)的TBS缓冲液中的10%(体积/体积)人血清温育1小时,以减少DNA与硝酸纤维素膜的非特异性结合。以TBST缓冲液洗涤后,将膜与TBST缓冲液中的DNA文库于室温温育1小时。洗涤后,将膜上点印PSA的区域切下,通过苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化结合PSA的寡核苷酸。利用FITC标记的正向引物、生物素标记的反向引物和KAPA2G快速PCR试剂盒,将所收集的寡核苷酸通过PCR扩增。利用固定抗生物素蛋白的凝胶珠制备了用于下一轮筛选的单链DNA文库。第3轮后,将所选择的DNA文库利用AmpliTaq Gold通过PCR扩增,并亚克隆到pGEM载体中,然后分析各克隆物的序列。
通过此前描述的适体印迹方法(Hasegawa等2008;Yoshida等2009),评价各轮筛选的DNA文库的PSA结合能力。对此将在以下部分中简述。
适体与PSA的结合测试
(1)适体印迹测试
FITC标记的适体如上所述进行折叠。将PSA点印的膜以TBST缓冲液中4%(体积/体积)脱脂乳封闭,并与FITC标记的适体于室温温育1小时。洗涤后,将膜与HRP偶联的抗FITC抗体于室温温育1小时,然后通过止动剂蛋白质印迹化学发光HRP底物使其中PSA与DNA文库结合的点可视化,并通过Typhoon 8600(GE lifesciences)检测。
(2)平板测试
为了使用平板测试,将24聚体DNA寡核苷酸在其5’端通过T5-接头进行FITC标记,并在其3’端添加T3,从而得到32聚体的总长度。将100μL量的处于PBS缓冲液(pH 7.4)中的PSA(最终浓度为5μg/mL)添加到96孔聚苯乙烯板中。于37℃通过温和振荡温育2小时后,去除上清液,并以TBST缓冲液洗涤各孔。向各孔中添加100μL的5倍稀释的封闭剂N102,并在室温温和振荡1小时,然后洗涤3次。将FITC标记的适体在上述TBS缓冲液中加热处理,以进行折叠。向各孔中添加100μL量的处于TBST缓冲液中的FITC标记的适体(5μM),并在室温温育1小时。洗涤3次后,向各孔中添加HRP偶联的抗FITC抗体,并通过室温温和振荡1小时从而进行温育。将各孔洗涤5次,加入BM化学发光HRP底物,然后通过多标记平板计数器Wallac1420 ARVO MX(Perkin Elmer)测定HRP活性。
利用GA对PSA结合能力的改善
在通过GA的第一轮序列控制中,通过SELEX获得的5种适体的寡核苷酸序列在计算机中以相同的表观速率复制,并与不同序列随机配对从而形成10对。每对的序列在一个随机点交叉,并且每个序列随机引入2个碱基突变以产生20条新序列的组。通过上述平板测试评价了这20条新序列的PSA结合能力,并将序列根据其PSA结合能力进行分级。为了产生下一代,选择显示出较高PSA结合能力的序列,并且它们根据分级以不同的表观速率复制。三轮GA运算后,发现了显示最高PSA结合能力的寡核苷酸。然后,在用于产生下一代的寡核苷酸序列中引入随机的单碱基突变。
通过平板测试来传感PSA
以下述变化形式来进行如上所述的用于PSA检测的平板测试。将具有10nM至500nM的各种终浓度的在处于PBS缓冲液(pH 7.4)中的100μL量的PSA加入到96孔聚苯乙烯平板中,并在37℃通过温和振荡温育2小时。在用封闭试剂N102封闭后,在各孔中加入预先通过热处理而折叠的100μL量的处于TBST缓冲液中的4μMFITC标记的ΔPSap4#5,并在室温通过温和振荡温育1小时。在与HRP偶联抗FITC抗体温育后,测定HRP的化学发光。
结果
1.通过SELEX选择PSA结合适体
进行SELEX,以便发现作为利用GA的后选择的备选物的PSA结合适体。PSA固定在硝酸纤维素膜上,并纯化与PSA结合的DNA文库以及利用FITC标记的正向引物和生物素标记的反向引物通过PCR进行扩增。DNA文库与膜在第一轮以1μM的浓度温育,在第二轮以400nM的浓度温育,在第三轮以390nM的浓度温育。在第三轮SELEX中,确认出表明DNA文库与PSA结合的硝酸纤维素膜上的小点(图2)。由此,分析了DNA文库中的寡核苷酸序列。对第三个文库的12个不同克隆物进行了测序,获得了11种不同序列(表3)。通过适体印迹方法研究了所获得的寡核苷酸序列的PSA结合能力。结果,名为PSap#4-3(SEQ.ID:No.20)、PSap#4-4(SEQ.ID:No.21)、PSap#4-6(SEQ.ID:No.23)、PSap#4-9(SEQ.ID:No.25)和PSap#4-11(SEQ.ID:No.27)的五个克隆物显示出与膜上的PSA结合。在表3中,引物结合位点以下划线字母显示。
表3
利用GA改善PSA结合能力
虽然需要具有高PSA结合能力的适体以便将其用作PSA传感中的识别元件,但由于文库中序列多样性的限制和上述PCR偏差,SELEX可能不能筛选出高亲和力适体。
为了对备选物利用GA进行适体的SELEX后筛选,利用GA将通过SELEX预先选择出的5个序列作为用于产生20个寡核苷酸序列的组的“亲代”。将这些寡核苷酸合成,并通过平板测试评价PSA结合能力。通过检测HRP偶联的抗FITC抗体的化学发光(表示针对固定在聚苯乙烯板的孔上的PSA的寡核苷酸(n=2)的结合),从而测定PSA结合能力。通过第一代中最高(top)的寡核苷酸的信号强度,将信号强度标准化。然后,根据PSA结合能力将寡核苷酸进行分级,并选择分级前4位的序列来产生下一组寡核苷酸序列。将寡核苷酸合成、平板测试和寡核苷酸序列评价的利用GA的循环重复3次,当设定该过程为计算机中的PSA结合适体的进化时,每一循环对应于一代。在一轮GA运算后,获得了4条第二代序列SEQ ID:No.8至11。在总共3轮GA运算后,在第三代的显示出最高PSA结合能力的序列中引入随机单碱基突变,从而产生第四代。用于产生下一代的分级靠前的序列的数量、以及用于复制以配对的寡核苷酸序列的表观速率在各代中不同(表4)。
表4.
各代中各寡核苷酸的PSA结合能力如表5和图3所示。随着各轮GA运算的进行,寡核苷酸的PSA结合能力得到改善。这表明利用GA对适体的PSA结合能力的改善。第1代寡核苷酸显示出比通过SELEX获得的亲代寡核苷酸高出可达10倍的PSA结合能力。在对这些寡核苷酸分级后,选择前7位的寡核苷酸序列用于产生第2代。所述前7位的寡核苷酸序列根据PSA结合能力以5:4:3:2:2:2:2:2的不同的表观速率在计算机中复制,与配对的不同序列交叉,随后在每一条序列中随机地添加2个碱基的突变。第2代寡核苷酸显示的PSA结合能力比第1代寡核苷酸高出可达1.6倍,比通过SELEX获得的亲代寡核苷酸高出可达16倍。
并且,从第2代中选择前4位的寡核苷酸序列SEQ ID.No.8至11用于产生第3代。所述前4位序列复制的表观速率固定为6:5:5:4,以产生第3代。所复制的序列与随机配对的不同序列交叉。随后,在每个序列中引入随机的单碱基突变,以产生作为第3代的20个寡核苷酸序列的组。结果,利用ΔPSap2#2(SEQ.ID.No.8)、ΔPSap2#18(SEQ.ID.No.9)、ΔPSap2#16(SEQ.ID.No.10)和ΔPSap2#1(SEQ.ID.No.11)获得了第3代中的名为ΔPSap3’#4(SEQ ID:No.2)的一个序列。名为ΔPSap3’#4的序列显示出比第2代寡核苷酸更高的PSA结合能力。其显示出非常高的PSA结合能力,并且比通过SELEX获得的亲代寡核苷酸高出40倍。因此,通过在ΔPSap3’#4的序列中引入随机单碱基突变并且没有进行任何交叉,而产生了作为第4代的20个不同寡核苷酸序列的组。在第4代中,ΔPSap4#5(TTTTTAATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTTT:SEQ ID:No.1)显示出最高的PSA结合能力,并且比亲代寡核苷酸高48倍。见表5。
表5
通过平板测试感受PSA
将利用GA选择的ΔPSap4#5作为第4代的第1位寡核苷酸,进行平板测试来测定PSA浓度。在测试中,将各种浓度的处于PBS缓冲液中的PSA加入到聚苯乙烯板的各孔中,以固定PSA。然后,通过检测HRP偶联的抗FITC抗体的化学发光(表示针对固定在聚苯乙烯板的孔上的PSA的ΔPSap4#5(n=2)的结合),从而测定PSA浓度。结果,表示ΔPSap4#5与PSA结合的HRP化学发光信号根据以0.3μg/mL至6μg/mL的各种浓度固定在聚苯乙烯板上的PSA浓度而产生,所述PSA浓度对应于10nM至200nM(图4)。ΔPSap4#5与PSA相互作用的结合解离常数(KD)估计为54nM。该KD值几乎与结合PSA的抗体相同。
常用抗体的KD值据信为1×10-6至1×10-8。根据利用HRP的测试结合的结果,表5所示的从ΔPSap4#5至ΔPSap2#16的超过1000CPS的HRP的测定值明确展示出与抗体相同的结合能力。
此外,ΔPSap4#5具有最高的结合能力。通过比较ΔPSap4#5(Tm:57.2℃,ΔG=-4.74kcal/mol)和ΔPSap3'#04(Tm:39.6℃,ΔG=-1.63kcal/mol)的结构,表明适体的结合能力可通过在第一茎区(但不限于该位置)引入一个点突变来得到改善。
根据本发明,提供了结合PSA的适体。利用所述适体可以可靠并容易地进行前列腺癌的诊断方法。
本说明书中所述的所有文件、专利申请和技术标准均通过引用方式并入本文,其程度相当于每篇文件、专利申请或技术标准均具体且单独地通过引用并入而得到描述。
Claims (4)
1.一种适体,所述适体包含:
具有由1至10个核苷酸组成的随机多核苷酸序列的前区;
位于所述前区的3'端的由AAAGCT、AAGGCT或CAGGCT中任一种组成的第一区;
由AGCTTT或AACTTT中任一种组成的第二区;和
位于所述第一区和所述第二区之间并且由具有3至30个核苷酸的随机多核苷酸序列组成的第三区,
其中所述适体能够结合前列腺特异性抗原(PSA),
其中所述适体是以下(1)至(2)中的一种:
(1)SEQ ID No.1至7的多核苷酸;或
(2)除了与所述前区中的TTTTTAATT有1或2个碱基不同之外,序列与SEQ IDNo.1至7相同的多核苷酸。
2.权利要求1所述的适体在制备用于诊断前列腺癌的试剂盒中的应用,所述试剂盒通过使所述适体接触受试者的体液样品来使用。
3.如权利要求2所述的应用,所述适体与PSA形成复合物。
4.如权利要求2所述的应用,其中,所述试剂盒还通过确定所述适体与PSA的复合物的量来使用。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2010/061652 WO2012001820A1 (en) | 2010-07-02 | 2010-07-02 | Psa binding aptamer and method for diagnosis of prostate cancer |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102971422A CN102971422A (zh) | 2013-03-13 |
CN102971422B true CN102971422B (zh) | 2015-07-22 |
Family
ID=45401573
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201080067716.3A Active CN102971422B (zh) | 2010-07-02 | 2010-07-02 | Psa结合适体和前列腺癌的诊断方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8981075B2 (zh) |
EP (1) | EP2588608B1 (zh) |
JP (1) | JP5835778B2 (zh) |
CN (1) | CN102971422B (zh) |
WO (1) | WO2012001820A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104797937A (zh) * | 2012-10-12 | 2015-07-22 | 国立大学法人弘前大学 | 用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法及试剂盒 |
CN108956991B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-04-27 | 南通大学 | 一种荧光共振能量转移生物传感器及其应用 |
US11649460B2 (en) | 2020-03-20 | 2023-05-16 | Joao Francisco Peinado Pereira | DNA aptamers, method for inhibiting human galectin-1 and method of treating a mammal in need thereof |
CN112858431B (zh) * | 2021-01-08 | 2023-06-20 | 上海工程技术大学 | 一种用于检测psa的生物传感器及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009053691A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Pronota Nv | Method of selecting aptamers |
CN101534865A (zh) * | 2005-10-19 | 2009-09-16 | Ibc药品公司 | 生物活性装配体的制备方法及其用途 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4671148B2 (ja) | 2004-08-02 | 2011-04-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | プリオン蛋白質に特異的に結合する核酸分子 |
US20090105172A1 (en) | 2005-03-07 | 2009-04-23 | Diener John L | Stabilized Aptamers to PSMA and Their Use as Prostate Cancer Therapeutics |
JP4706019B2 (ja) | 2005-07-08 | 2011-06-22 | 国立大学法人東京農工大学 | アプタマーの同定方法 |
US20110038865A1 (en) * | 2007-06-26 | 2011-02-17 | University Of Miami | Antibody- endostatin fusion protein and its variants |
JP5596903B2 (ja) | 2008-02-05 | 2014-09-24 | 国立大学法人東京農工大学 | インスリン結合性アプタマー |
EP2589657A4 (en) * | 2010-07-01 | 2014-04-23 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | METHOD FOR DETECTING TARGET MOLECULE |
-
2010
- 2010-07-02 EP EP10854117.8A patent/EP2588608B1/en active Active
- 2010-07-02 JP JP2012557352A patent/JP5835778B2/ja active Active
- 2010-07-02 CN CN201080067716.3A patent/CN102971422B/zh active Active
- 2010-07-02 US US13/806,998 patent/US8981075B2/en active Active
- 2010-07-02 WO PCT/JP2010/061652 patent/WO2012001820A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101534865A (zh) * | 2005-10-19 | 2009-09-16 | Ibc药品公司 | 生物活性装配体的制备方法及其用途 |
WO2009053691A1 (en) * | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Pronota Nv | Method of selecting aptamers |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Selection of RNA aptamers specific to active prostate-specific antigen;Sujin Jeong等;《Biotechnol.Lett.》;20100331;第32卷(第3期);379,380,382-385 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102971422A (zh) | 2013-03-13 |
EP2588608A4 (en) | 2013-12-11 |
JP5835778B2 (ja) | 2015-12-24 |
EP2588608A1 (en) | 2013-05-08 |
JP2013531969A (ja) | 2013-08-15 |
WO2012001820A1 (en) | 2012-01-05 |
US20140011207A1 (en) | 2014-01-09 |
EP2588608B1 (en) | 2016-10-05 |
US8981075B2 (en) | 2015-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kalra et al. | Simple methods and rational design for enhancing aptamer sensitivity and specificity | |
Mehan et al. | Highly multiplexed proteomic platform for biomarker discovery, diagnostics, and therapeutics | |
Wilson et al. | Functional requirements for specific ligand recognition by a biotin-binding RNA pseudoknot | |
EP2083269A1 (en) | Method of assaying target substance in sample, aptamer molecule and method of constructing the same | |
US8785132B2 (en) | Aptamer sandwich assays | |
EP2812453B1 (en) | Nucleic acid aptamers against plasmodium lactate dehydrogenase and histidine-rich protein ii and uses thereof for malaria diagnosis | |
JP2007525661A5 (zh) | ||
CN102971422B (zh) | Psa结合适体和前列腺癌的诊断方法 | |
CA2935138C (en) | Marker for generating binding information on biomolecules and nucleic acids, preparation method therefor, and method and apparatus for analyzing biomolecule by using same | |
WO2007086403A1 (ja) | 試料中の被検物質の測定方法及び装置 | |
CN102965378B (zh) | 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法 | |
US7195875B2 (en) | Oligonucleotide pairs for multiplexed binding assays | |
CN101782570A (zh) | 一种生物分子竞争分析方法及其应用 | |
CN102944672A (zh) | 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 | |
JP2021535409A (ja) | 核酸に基づく検出方法 | |
CN102435730A (zh) | 基于核酸地址编码的高通量检测方法及生物芯片 | |
CN103898240B (zh) | 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法 | |
CA2686537A1 (en) | Nucleic acid chip for obtaining bind profile of single strand nucleic acid and unknown biomolecule, manufacturing method thereof and analysis method of unknown biomolecule using nucleic acid chip | |
CN104164436B (zh) | 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法 | |
CN104109674A (zh) | 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法 | |
CN104109675A (zh) | 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法 | |
CN108486119A (zh) | 一种与罗丹明B特异性结合的核酸适配体RhB-F02及其应用 | |
JP7405400B2 (ja) | 核酸分子およびその用途 | |
Walker et al. | Slow off-rate modified aptamer arrays for biomarker discovery and diagnostic applications | |
CN201473549U (zh) | 适配子型生物芯片 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |