CN102944672A - 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 - Google Patents
采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102944672A CN102944672A CN2012104615256A CN201210461525A CN102944672A CN 102944672 A CN102944672 A CN 102944672A CN 2012104615256 A CN2012104615256 A CN 2012104615256A CN 201210461525 A CN201210461525 A CN 201210461525A CN 102944672 A CN102944672 A CN 102944672A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- target material
- lica
- serum
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的靶物质进行定性与定量检测的方法,包括向待测标本中加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素包被靶物质抗体、链亲和素(SA)包被的感光微球进行第一次免疫反应和检测的步骤,还包括向反应体系中加入抗He试剂发生靶物质免疫叠加反应,并进行第二次光激发化学发光免疫检测的步骤。本发明通过对两次LiCA检测结果的综合分析达到全方位纠正Hooks效应的目标,分析过程包括根据其在一次LiCA与二次LiCA检测的信号特征将被检标本区分为阴、低阳、中阳,高阳与超高阳等五个浓度区间;根据第一次LiCA对低阳与超高阳浓度区段的标本进行定量分析。本发明具有结果准确,操作简便,适用范围广等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域中的标记免疫分析方法,具体涉及一种采用光激发化学发光(Light initiatd Chemiluminescence Assay, LiCA)免疫分析对血清中的靶物质进行定性与定量检测的方法。
背景技术
均相免疫指全部的反应与结果的观察均在均一的液相界面进行的免疫学检测方法,操作简洁是均相免疫的主要特征。光激发化学发光(LiCA)免疫分析是这类方法的主要代表,亦是目前已经商品化的主要均相免疫技术之一,与酶联免疫分析(ELISA)、电化学发光免疫分析等固相免疫分析相比,LiCA免疫分析涉及时间分辨荧光,纳米微球研究,受体(生物素与亲和素)固定,特殊的能量转递方式及均相免疫反应等多种前沿科学成果,其技术含量最高,实验操作最简洁,但因Hooks效应的影响妨碍了其市场推广。
Hooks效应即钩状效应,其表现为当反应体系中待测物质(包括抗原或抗体)的浓度升高到一定程度后,检测信号反而下降或显著下降,甚至出现假阴性结果,由此造成的后果首先是个别靶物质含量极高的强阳性标本表现出假阴性,其次为阳性标本中大约10~30%左右强阳性标本,被误判为弱阳或低浓度阳性。
这种存在于多种血清学检测中的量(待测物浓度)效(检测信号)分离现象的产生虽可能与待测免疫分子的结构相关,但反应体系中靶物质与对应免疫物质比例的高度失调是其最主要的原因。这一效应如果发生于某些特殊临床检测如血清HBsAg的筛选,则可造成大量临床标本的定量检测结果偏离真值,部分强阳性标本测值降低或显著降低,甚至导致个别具有高度传染性的强阳性标本出现假阴性结果。如果这种漏检发生在献血员筛选,则势必导致受血者发生输血相关性肝炎的严重临床事件。鉴于血清HBsAg检测的范围及其社会影响面极大,我国已明令禁止“一步法”检测在献血员HBV感染者筛选中的应用。
通过近十余年的努力,对Hooks效应干扰的认识已有很大提高,针对固相免疫实验中的Hooks效应纠正方法不断出现。但由于反应方式的大相径庭,这些方法都不能用于均相免疫 实验,而有效拮抗均相免疫中Hooks效应影响的方法迄今尚未见报道与公布。
均相与固相免疫的主要差别,还在于全部的固相免疫试验在操作上均存在一次甚至多次已反应物与未反应物质的分离,而均相免疫在整个的实验过程中,尤其是实验信号的采集完成后,试剂体系中的未反应物单独或与反应后物质一道存在于同一反应孔(管)中,并很好地保留着与随后加入靶物质结合的能力,这一差别,为“靶物质叠加反应”在均相免疫实验中的实施提供了契机。
此外,免疫学检测方法的定量检测范围通常均较为局限,敏感性越高的试验方法其定量范围通常越窄,发光分析虽然在一定程度上能纠正这一现象,然而在兼顾方法敏感性,特异性,稳定性及试剂成本的前提下,其定量检测范围亦仅在1000ng/ml左右。如何采用单一检测对多数靶物质实施全程或亚全程定量分析已经成为制约免疫学技术发展的重要技术瓶颈。
血清学免疫检测技术至少包括固相与均相免疫两类,能接受本专利措施的血清免疫学检测实验方法须具备以下前提。①不发生试剂系统对靶物质的结合能力的自消耗;②不发生已反应物与未反应物间的相互分离与清除;③ “未参与反应的试剂”能在系统中较长时期保留与靶物质反应并生成检测信号的能力。符合上述条件的实验方法多集中在均相免疫实验,光激发化学发光免疫分析(LiCA)是其中的重要代表。
现有血清免疫学试验尽管存在上述缺点,但在技术发展上均达到或基本达到在当前物质与技术条件下该技术可具备的最佳的状态。包括合理的实验步骤与反应条件,完善的试验操作与检测系统(仪器),稳定的试剂质量,以及良好地检测品质(高度的特异性敏感性与稳定性)等。部分还预留进一步完善与发展的技术方向。本专利发明以上述各实验方法的最新技术成果为基础,全盘接受上述试验技术发展所取得的优良技术特征,不排斥正在或将要进行的适合本专利技术实施的任何技术革新与改造,为适应本专利实施所进行的相关改造(包括试剂改造与实验仪器改造)亦以不妨碍原有试验的操作以及技术特征的充分发挥为前提。
发明内容
本发明的目的是对现有的光激发化学发光免疫分析方法进行改进,提供一种能纠正Hooks效应并扩大定量检测范围的光激发化学发光免疫分析方法。
上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性或定量检测的方法,包括如下步骤:向血清中依次加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球,混匀后温育以发生免疫反应;然后用激发光激发上述免疫反应后 的反应体系,并第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度,检测出的光子信号强度依据靶物质浓度与发光信号强度的标准曲线关系,第一次确定靶物质含量;在第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度后,向免疫反应后的反应体系中加入抗He试剂,混匀后温育发生免疫叠加反应;然后用激发光激发上述免疫叠加反应后的反应体系,并第二次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度;
根据第一次和第二次的光子信号强度推导新的靶物质含量与信号强度的关系,并据此计算待测标本中的靶物质浓度:
所述的反应体系与抗He试剂的体积比为5-50:1,
当所述待测靶物质为抗原时,所述的抗He试剂中靶物质的浓度为10-200000ng/ml;
当所述待测靶物质为抗体时,所述的抗He试剂中靶物质的浓度为1.0-20000IU/ml。
当所述待测靶物质为抗原(如血清HBsAg)时,优选的抗He试剂中靶物质的浓度为2000ng/ml。
当所述待测靶物质为抗体(如血清抗HBc)时,优选的抗He试剂中靶物质的浓度为1000IU/ml。
优选的,所述的反应体系与抗He试剂的体积比为10:1。
优选的,所述激发光波长为680nm,发射光波长为610-615nm。
所述包被靶物质抗体的发光微球的浓度为10-100μg/ml,所述生物素标记的靶物质抗体浓度为1.0-10μg/ml,所述链亲和素包被的感光微球浓度为10-100μg/ml,所述血清与包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球的体积比依次为1:1:1:7。
所述室温下温育的时间为5-60分钟。
所述上述各项试验条件,以能产生足以可供分析的试验信号,并以不发生对试验效果的干扰为前提,由于本专利主要发明点为抗He介入及其靶物质叠加免疫反应,现阶段LiCA检测部分的主要实验条件(即优选实验条件)的选择依据市售试剂的规定,并接受可能出现的适宜本专利实施的改进;
所述的方法在血清HBsAg、抗HBc、AFP定性和定量检测中的应用。
在LiCA检测中,当第一次LiCA反应及其检测完毕后,包括标本在内的全部的反应体系仍旧存在于反应孔中。阴性,及其低浓度阳性孔中的抗体或包被了抗体与亲和素的发光微球未经或仅部分与靶物质(如抗原)发生反应,全部或多数抗体或包被了抗体的发光微球得以保留并具备与后续加入的靶物质发生反应的能力,其反应强度足以使第二次LiCA检测所获得的信号(单独或与一次LiCA反应信号叠加)达到饱和或过饱和状态。在“靶物质叠加反应” 过程中能与随后加入的靶物质(其浓度以能产生可供识别与分析的试验信号为度,通常以产生饱和LiCA信号的靶物质的2倍为佳)发生反应并产生新的实验信号,这一信号与第一次LiCA检测的信号有机叠合,可使第二次LiCA所检测出的信号强于或显著强于该类标本所产生的第一次LiCA检测信号。通过对其信号增强幅度的分析,可提示被检测标本中的靶物质为阴性,或低浓度阳性状态。
而靶物质强阳性与超强阳性(即假阴性)孔中的抗体或包被了抗体的发光微球体系已经与靶物质充分反应并为其饱和与过饱和,在一次LiCA检测中已表现出试验信号强度与靶物质浓度的负相关关系(不同程度Hooks效应所致)。不仅不具备与后续加入的靶物质继续反应的能力,其信号强度并可能存在受再次加入抗原的负面影响而出现降低的趋势。在“靶物质叠加反应”后的LiCA反应中, 所检测到的信号(第二次LiCA信号)基本由第一次LiCA反应产生,其强度与一次LiCA相当,略低或略强于(因测试原因)一次LiCA检测的信号。
如图1所示,受Hooks效应影响,高与超高浓度靶物质区段标本一次LiCA检测信号的强度与靶物质的浓度呈负相关,这种因浓度升高而造成的检测信号渐进性降低,其原理与竞争抑制法(如竞争抑制性ELISA)类似,其表现呈检测信号的渐进性降低,两者的改变亦具有良好地剂量相关性。
综合上述靶物质叠加LiCA所体现的种种实验信号内涵,可将被测标本划分为如下5类即:①阴性;②LiCA常规定量范围内的低阳性;③饱和信号的阳性;④信号因Hooks效应降低的高阳性;⑤信号接近或低于域值的超高阳性(即假阴性)。表1为对上述5类标本实施靶物质叠加反应前后两次LiCA检测试验信号特征的分析。
表1 靶物质叠加免疫反应LiCA检测实验标本浓度区间评估方法
从表1可以看出,通过靶物质免疫叠加反应及对第一次LiCA检测信号和第二次LiCA检测信号进行对比分析,便可消除Hooks效应所致的假阴性,并大幅提升定量分析能力。从而实现对靶物质在更高层面上的定性和定量分析。
所述的方法同时可用于血清HBsAg、抗HBc、AFP等以外的其它抗原与抗体的定性和定量检测。
当然,本发明的原理也可用于其它均相免疫分析,如酶联均相免疫分析与免疫凝集试验分析等,能接受此改进措施的方法如前所述。这类方法通过引入“靶物质叠加反应”,亦可达到消除Hooks效应影响并提升定量检测范围的目的。
附图说明
图1是受Hooks效应影响的LiCA检测分段曲线图。
图2是低浓度组标本HBsAg浓度与LiCA信号之间的线性关系曲线图。
图3是高浓度标本HBsAg浓度与第一次LICA检测信号之间的线性关系曲线图。
图4是高浓度标本HBsAg浓度与第二次LiCA检测信号之间的线性关系曲线图。
图5是高浓度标本HBsAg浓度与第二次LiCA检测信号饱和度之间的线性关系曲线图。
图6是低浓度组标本抗HBc浓度与LiCA信号之间的线性关系曲线图。
图7是高浓度标本抗HBc浓度与第一次LICA检测信号之间的线性关系曲线图。
图8是高浓度标本抗HBc浓度与第二次LiCA检测信号之间的线性关系曲线图。
图9是高浓度标本抗HBc浓度与第二次LiCA检测信号饱和度之间的线性关系曲线图。
图5、图9中,横坐标为待测靶物质浓度,纵坐标为第一/第二次LiCA检测光子数比率(%)。其余各图中,横坐标为待测靶物质浓度,纵坐标为检测到的光子数。
具体实施方式
实施例1 检测HBsAg的方法
一、检测方法:
方法名称:HBsAg检测靶抗原叠加LiCA;
原有方法名称: HBsAg检测LiCA;
敏 感 性:0.05-1.0ng/ml;
定量范围:0.1-500至1000ng/ml内;
Hooks效应起点(即反应信号呈浓度依赖性降低起点):约50 000ng/ml左右;
假阴性出现浓度(反应信号接近cut off值):大于1 000μg/ml;
二、材料:
1、仪器与耗材
检测仪器:LiCA HT光激化学发光检测仪;由中国博阳生物(上海)科技有限公司制造;
2、试剂
(1)血清HBsAg检测光激化学发光试剂盒:由博阳生物(上海)科技有限公司制造,市售获得。包括下述试剂:
试剂1:Anti-HBs包被发光微球,浓度为40μg/ml;
试剂2:生物素化Anti-HBs,浓度为4.0μg/ml;
试剂3:链亲和素(SA)包被感光微球(通用微球),浓度为50μg/ml。
(2)抗He试剂(全称:抗Hooks效应试剂,Anti Hooks Effect Agent,抗He):主要成分为HBsAg,浓度范围10-200 000ng/ml;本实施例选用三种不同HBsAg浓度的抗He,分别为: 2000ng/ml、10.0ng/ml、200 000ng/ml。
(3)标准血清,含已知浓度HBsAg的血清,或纯化HBsAg溶液。
窄幅标准血清:自制,或由上述LiCA试剂盒配备;用于低靶物质浓度标本的计量分析(通常6个,浓度范围在1000ng/ml以内);
宽幅标准血清:自制,浓度经卫生部生物制品检定所标定。用于高及超高靶物质浓度组的计量分析(通常6个,浓度范围在2000μg/ml以内);
本次使用的自制参比血清系纯化自然表达HBsAg,紫外光谱吸收检测其浓度;免疫活性未与市售标准品作严格比对。
(4)阴性对照与阳性对照血清:自制或市售试剂配备;用于域值确认,反应性评价,以及饱和信号强度的确认(现阶段主要用自制阳性对照血清);
(5)待检标本:血清,血浆或其它体液;其它标本(如基因重组表达产物)。
三、操作步骤
1.试验准备:
取出所有试剂与标本,并恢复至室温。
2.实验操作
(1)取待测标本,阴、阳性对照,及其HBsAg定量标准血清系列各25μl,分别加至LiCA 板各反应孔中,每份标本加一孔(或根据需要的任意孔);
(2)旋即加入试剂1,每一反应孔加入各25μl。
(3)旋即加入试剂2,每一反应孔加入各25μl,37℃温育15分钟,
(4)加入试剂3,每一反应孔加入各175μl,混匀,37℃温育15分钟;
(5)置LICA发光检测仪上,采用680nm波长激发,610nm波长检测各孔信号, 初步评价检测标本的信号强度,并绘制标准曲线;
(6)每一反应孔加入抗He试剂各25μl,混匀,37℃温育20分钟;
(7)再次置LiCA发光检测仪上,采用680nm波长激发,610nm波长检测各孔信号,并初步评价各反应孔信号强度;
根据第一,第二次LiCA检测结果,将待测标本分别归类为5个靶物质浓度区间,归类方式见表1。
四、结果分析
根据阴性对照结果按常规确定检测域值;
根据阳性对照孔(既定浓度靶物质)均值确定饱和信号强度;
根据饱和信号强度计算各实验孔二次LiCA信号饱和度;
根据一,二次LiCA测值计算各实验孔(两者)信号比值;
根据第一及第二次检测结果及其上述分析指标对被检测标本进行靶物质浓度分类,分类方式见下表。
表2 受检标本中靶物质表达浓度状态分类表
(1)根据各标本的检测数据以及前述分析,自上表中确定各自的靶物质浓度状态,并对 阴性,中等程度阳性,及其假阴性(即第1、3、5类标本)作出定性报告;
(2)采用前述制备的低及高浓度标准品系列孔检测数据绘制的标准曲线,分别对归类于低阳与高阳组(即第2、4类标本)的标本以回归法判读定量检测数据。
五、检测效果
(一)采用抗He((2000 ng/ml)检测
1、域值与饱和信号值
域值: 697.5(阴性对照均值)×2.1﹦1464.8
饱和信号值: 862478(两孔阳性对照均值)。
2、低浓度靶物质的检测效果
对一组系列稀释的低浓度靶物质(参比法标定)进行检测,结果见表3。
表3 低浓度组HBsAg含量与LiCA信号之间的剂量相关性
*:阳性对照替代品;两者均值为饱和信号强度值862478。
#:二次LiCA信号饱和度的计算方法为:二次LiCA信号值/饱和信号强度值。
低浓度组标本HBsAg浓度与LiCA信号之间的关系见图2,图中X轴:HBsAg浓度(2n),Y轴:光子数。
结果表明:本发明LiCA检测的信号强度与血清HBsAg浓度之间有很好的量效关系。
3、高浓度靶物质的检测效果
对一组系列稀释的高浓度靶物质(浓度经参比法标定)进行检测,结果见表4。
表4 高浓度组HBsAg含量与LiCA信号之间的剂量相关性
高浓度标本血清HBsAg含量与第一次LICA检测信号之间的剂量相关性见图3,与第二次LICA检测信号之间的剂量相关性见图4,图中X轴:HBsAg浓度(2n),Y轴:光子数。经过比较,第一次与第二次检测信号强度大致相当,两者之间差值在±10%范围内。
图5是高浓度标本HBsAg浓度与第二次LiCA检测信号饱和度(%)之间的线性关系曲线图。
结果表明:该组标本靶物质浓度与检测信号之间呈较好地剂量相关关系(负相关关系)。
采用靶物质叠加—LiCA对部分特殊选定标本进行检测,检测及分析结果如表5。
表5 靶物质叠加免疫实验受检标本中靶物质表达浓度状态分类表
*:阳性对照替代品;两者均值为饱和信号强度值862478。 #:假阴性,设定浓度为4200 μg/ml。
(二)采用抗He((10.0ng/ml)检测
1、检测目标:因抗He试剂选择的不同,由全面纠正Hooks效应改为避免因Hooks效应所致的假阴性结果,检测结果的分析方式亦发生相应的改变。
2、检测方法
1)与抗He((2000ng/ml)时的检测方法相同,其试验操作,标准曲线的制备,检测结果的分析严格遵照试剂盒拟定的方法。根据检测结果对各被检标本中靶物质(HBsAg)阳性者出具检测报告。
2)第一次LiCA检测及报告完成后,在呈阴性反应的各反应孔中加入抗He(10.0 ng/ml),混合,同前作第二次LiCA检测,并对检测结果进行分析。表6结果显示,在一次LiCA呈阴性(包括信号P/N值小于5的检测灰区标本)的检测标本中,二次LiCA检测P/N呈显著升高(P/N<10)者为HBsAg阴性,基本不升高,或升高幅度小于P/N5.0者为超高浓度阳性。在试剂与检测方法无误的前提下,两者的区别十分鲜明。
3)根据表6分析再次报告经核定的阴性结果。如分析结果证实有假阴性存在,则应报告为超高浓度阳性。HBsAg浓度通常超过1.0mg/ml。
4)检测结果显示:HBsAg浓度在10.0ng/ml以下的阳性标本在二次LiCA检测测值可升高或略升高,这一改变无助于对此浓度受试标本检测结果的定性与定量评价,但有助于对个别特别高浓度标本的识别(原理前已述及)。
表6 采用抗He(10 ng/ml)检测阴性与假阴性标本信号表达特征与鉴别
抗He试剂对照*:抗He(低浓度,HBsAg10.0ng/ml)
(三)采用抗He(200 000ng/ml)检测
1、检测目标:因抗He试剂选择的不同而异,由全面纠正Hooks效应改为避免产生由Hooks效应所致的假阴性,检测结果的分析亦发生相应的改变。
2、检测方法
1)与抗He((2000ng/ml)时的检测方法相同,其试验操作,标准曲线的制备,检测结果的分析严格遵照LiCA试剂盒规定,根据一次LiCA检测结果对被检标本中靶物质(HBsAg)阳性者作出定性与定量报告。
2)第一次LiCA检测呈阴性反应的各反应孔中加入抗He(200 000ng/ml),混合,同前作第二次LiCA检测。并对检测结果进行分析,结果见表7。
表7 采用抗He(200 000ng/ml)检测阴性与假阴性标本信号表达特征与鉴别
抗He对照*:抗He(高浓度,HBsAg 200 000 ng/ml)。
3)表7结果显示,在一次LiCA呈阴性的检测标本中,二次LiCA检测P/N呈显著升高(P/N值差大于10)者为HBsAg阴性,基本不升高,或升高幅度小于5.0者为假阴性或称超高浓度HBsAg阳性。在试剂与检测方法无误的前提下,两者差别十分鲜明。根据表7结果可作出核定为阴性的检测报告。如分析结果发现有假阴性存在,则此类标本HBsAg浓度通常超过1000μg/ml。
4)一次LiCA检测HBsAg阳性标本,在采用此抗He做二次LICA检测的实验数据亦表现出如某种特征性的改变,这些改变为:①一次LiCA中测值大于单纯抗He检测孔测值:二次LiCA检测信号降低或稍降低,提示检测标本中HBsAg处于中高浓度状态。其浓度范围约在一次LICA低浓度曲线测值的中上段至接近抗He中的HBsAg浓度值;②一次LiCA测值小于单纯抗He孔检测值:二次LiCA信号降低或稍降低提示受检标本HBsAg浓度高于抗He试剂;③二次LiCA信号升高提示受检标本中HBsAg浓度为处于域值以上的低表达状态。由于采用此浓度 抗He的目标旨在避免Hooks效应所致的假阴性结果,上述改变特征仅供试验分析参考。
六.评价:
采用本方法进行血清HBsAg检测,圆满达成全方位纠正Hooks效应干扰的实验目标,主要技术特征如下。
1、靶物质免疫叠加反应是指在第一次LICA检测结束后,加入含既定浓度靶物质试剂再次进行LiCA检测。前后两步LiCA检测都在同一个反应孔进行,共用第一次加入的反应体系,通过对两次LiCA检测结果的综合分析达到全方位纠正Hooks效应的目标。由于操作简便是LiCA的主要特点,因此即便增加一道反应步骤,本方法亦显著较现有多种固相免疫检测技术明显简捷。
2、本方法不仅能避免因浓度过高而出现的假阴性,而且能根据靶物质浓度将标本区分为阴、低阳、中阳,高阳与超高阳五个浓度区间,并对低阳与高阳浓度区段的标本进行定量分析,将定量检测的能力提升到一个新的阶段。
3、LiCA免疫分析检测方法为当前用于血清HBsAg检测最先进的方法之一,具有很好的特异性,敏感性与稳定性,操作简便是其最重要的技术特征,因而本发明在对低浓度阳性样本检测时获得与LiCA完全一致的敏感性,特异性与稳定性,低浓度区间的定量检测范围亦与LiCA相同。
4、现有的LiCA检测方法由于受Hooks效应的影响,不能区分“阴性”与“超高阳性”两种靶物质浓度状态,采用本发明的LiCA检测能将上述两种状态加以区别。
5、现有的LiCA检测方法只能将检测到饱和信号的标本笼统认定为高浓度或高信号靶物质表达,而本发明不仅将其浓度定量到中等浓度表达区间,并能给出明确的浓度区段。
6、现有的LiCA检测方法将高浓度标本因Hooks效应影响而表现出的试验信号降低混同于低浓度靶物质的低强度信号表达,并给出错误的定量检测结果。而本发明不仅能纠正这一缺点,并能利用在此状态下靶物质浓度与信号强度的负相关对其作出定量评价。
7、本法中用到的抗He试剂制备简单,来源广泛,成本低廉,不同浓度的抗He对Hooks效应的纠正效果虽有参差,但它们均能完全避免因Hooks效应产生的假阴性。与几种当今针对固相免疫的Hooks效应拮抗措施(如二步法,一道洗涤法,排溢法等)相比,其效果显著优越。
实施例2 检测血清抗HBc的方法
一、检测方法:
方法名称:抗HBc检测靶抗原叠加LiCA;
原有方法名称:抗HBc检测LiCA;
敏 感 性:0.10 IU/ml;
定量范围:250 IU/ml内;
Hooks效应起点(即反应信号呈浓度依赖性降低起点):2 500 IU/ml左右;
假阴性出现浓度(反应信号接近cut off值):大于200 000 IU/ml;
二、仪器与材料:
1、仪器与耗材
同实施例1。
2试剂
(1)血清抗HBc检测光激发化学发光试剂盒:由博阳生物(上海)科技有限公司制造,市售获得,包括下述试剂:
试剂1:HBcAg包被发光微球,浓度为10μg/ml;
试剂2:生物素标记HBcAg,浓度为1.0μg/ml;
试剂3:链亲和素(SA)包被感光微球(通用微球),浓度为10μg/ml。
(2)抗Hooks效应试剂(Anti Hooks effect Agent,抗He):主要成份为抗HBc。本实施例采用三个不同浓度分别为:抗HBc 1000 IU/ml,抗HBc 1.0 IU/ml,抗HBc 20 000 IU/ml三种。其中前一种抗He为优先实施浓度;
(3)标准品与对照血清
窄幅标准血清:采用LiCA试剂盒随带标准品,用于低抗HBc浓度标本的计量分析;
宽幅标准血清:自制,用于高及超高抗HBc浓度标本的计量分析。
此两类标准品及其抗He中的靶物质浓度均经相关单位核对与标定;
参比血清:自制,由相关单位标定抗HBc活性,未与市售标准品作严格比对。
阳性与阴性对照血清:自制、试剂盒配备。用于域值及饱和信号值的设定。
(4)待检标本:血清(血浆或其它液体标本)。
三、检测步骤
1.取出所有试剂与标本,并恢复至室温。
2.操作步骤
(1)取待测标本,阴、阳性对照,及抗HBc定量标准血清系列各25μl,分别加至LiCA板各反应孔中,每份标本加一孔(或根据需要的任意孔);
(2)旋即加入试剂1,每一实验孔加入25μl;
(2)旋即加入试剂2,每一实验孔加入25μl,混匀,温育15分钟以完成免疫反应;
(3)加入试剂3,每一实验孔加入175μl,混匀,温育60min以完成配受体结合反应;
(4)置LiCA发光检测仪上,680 nm波长激发,610nm波长检测各孔实验信号,绘制标准曲线,并初步评价检测标本的信号强度;
(5)每一反应孔加入抗He试剂各25μl。混匀,37℃同上温育以使抗HBc与实验体系中的相关物质发生反应并生成可被检测的LiCA信号;
(6)再次置LiCA发光检测仪上,610nm波长下检测各孔实验信号,并初步评价各反应孔信号强度;
四.检测结果
1、采用抗He 1000IU/ml试验结果
1)低浓度靶物质的检测效果
对一组系列稀释的低浓度靶物质(参比法标定)进行检测,实验结果见表8及图6。
表8 低浓度组抗HBc含量与LiCA信号之间的剂量相关性
表注: *:指定域值(922×2.1=1936.2);#:指定饱和信号值;805955.0
低浓度组标本抗HBc浓度与LiCA信号之间的关系见图6,图中X轴:抗HBc浓度(0.2 IU/ml×2n),Y轴:光子数。
结果表明:本发明LiCA检测的信号强度与血清抗HBc浓度之间有很好的量效关系。
2)高浓度靶物质的检测效果
采用本发明对一组系列稀释的高浓度抗HBc(浓度经参比法标定)血清进行检测,实验结果见表9。
表9 高浓度组抗HBc含量与LiCA信号之间的剂量相关性
*:抗HBc设定浓度:IU值×103
高浓度标本血清抗HBc含量与第一次LICA检测信号之间的剂量相关性见图7,图8是与第二次LICA检测信号之间的剂量相关性,图中X轴:抗HBc浓度(103 IU×2n),Y轴:光子数。
图9是高浓度标本抗HBc浓度与第二次LiCA检测信号饱和度(%)之间的线性关系曲线图。
该组标本靶物质浓度与检测信号之间呈较好地剂量相关关系(负相关关系)。
2、采用抗HBc 1.0 IU/ml及抗HBc 20000 IU/ml浓度抗He
采用含低及高浓度抗HBc的抗He进行检测,二次LiCA检测结果只能有规律地提升低浓度阳性标本的试验信号,因而主要用于鉴别并避免产生超高浓度标本在一次LICA试验中所产生的假阴性结果。采用此两类抗He检测其实验试剂及实验方法等与采用抗He1000 IU/ml相同,实验结果的分析参照实施例1的有关章节。主要实验结果见表10和11。
表10 抗HBc检测(抗He 1.0 IU/ml)阴性与假阴性信号表达特征与鉴别
表11 抗HBc检测(抗He 20 000 IU/ml)阴性与假阴性信号表达特征与鉴别
实施例3 检测血清AFP的方法
一.检测方法:
专利方法名称:血清AFP检测靶抗原叠加LiCA;
原有方法名称:血清AFP检测LiCA;
敏 感 性:1.0 ng/ml;
定量范围:1000ng/ml内;
Hooks效应起点(即反应信号呈浓度依赖性降低起点):50 000ng/ml左右;
假阴性出现浓度(反应信号接近cut off值):大于1 000 000ng/ml;
仪器与材料:
1、试剂
(1)血清AFP检测光激发化学发光试剂盒:由博阳生物(上海)科技有限公司制造,市售获得。包括下述试剂:
试剂1:抗AFP包被发光微球,浓度为100μg/ml;
试剂2:生物素标记抗AFP,浓度为10.μg/ml;
试剂3:链亲和素(SA)包被感光微球,浓度为100μg/ml;
(2)抗Hooks效应试剂(Anti Hooks effect Agent,抗He试剂):主要成份为含既定浓度的AFP;
(3)标准品与对照血清
窄幅标准血清:自制,用于低浓度AFP标本的计量分析;
宽幅标准血清:自制 ,用于高及超高浓度AFP标本的计量分析;
参比血清:自制,系纯化自然表达之AFP,紫外光谱吸收检测其浓度;免疫活性未与市售标准品作严格比对。
阳性与阴性对照血清:自制、试剂盒配备。用于域值确定,以及饱和信号值的设定。
(4)待检标本:血清(血浆或其它体液标本)。
二、检测方法
1.试验准备
(1)取出所有试剂与标本,并恢复至室温。
(2)取等体积的试剂2及试剂3,混匀,室温下放置20分钟,4℃放置当天使用。
2.操作步骤
(1)取待测标本,阴、阳性对照,及AFP定量标准血清系列各50μl,分别加至LiCA板各反应孔中,每份标本加一孔(或根据需要的任意孔),
(2)加入试剂1,每一反应孔加入50μl;
(3)旋即加入试剂2、3混合液,每一反应孔加100μl,混匀,温育5min以完成免疫反应;
(4)置LiCA发光检测仪上,680 nm波长激发,610nm波长检测各孔检测信号,绘制标准曲线,并初步评价各标本的检测状况;
(5)每一反应孔加入抗He试剂各50μl,混匀,37℃温育15min以使被加入的AFP与反应体系中的相关物质发生反应并生成可被检测的LiCA信号;
(6)再次置LiCA发光检测仪上,680nm激发,610nm波长下检测各孔检测信号,并初步评价各反应孔信号强度;
三、检测结果
1、域值及饱和信号值
域值:阴性均值×2.1=1132.7×2.1=2378.7
阳性信号饱和值: 阳性对照孔(3孔)均值=976249.2
2、低浓度靶物质的检测效果
对一组系列稀释的低浓度靶物质(参比法标定)进行检测,结果见表12。
表12 低浓度组LiCA信号的表达特征及其与AFP浓度之间的剂量相关性
3、高浓度靶物质的检测效果
对一组系列稀释的高浓度AFP进行检测,结果见表13。
表13 高浓度组与LiCA信号的表达特征及其与AFP含量之间的剂量相关性
Claims (10)
1.一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性或定量检测的方法,包括如下步骤:向血清中依次加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球,混匀后温育以发生免疫反应;然后用激发光激发上述免疫反应后的反应体系,并第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度,检测出的光子信号强度依据靶物质浓度与发光信号强度的标准曲线关系,第一次确定靶物质含量;其特征在于:在第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度后,向免疫反应后的反应体系中加入抗He试剂,混匀后温育发生免疫叠加反应;然后用激发光激发上述免疫叠加反应后的反应体系,并第二次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度;
根据第一次和第二次的光子信号强度推导新的靶物质含量与信号强度的关系,并据此计算待测标本中的靶物质浓度:
所述的反应体系与抗He试剂的体积比为5-50:1;
所述待测靶物质为抗原时,所述的抗He试剂中靶物质的浓度为10-200000ng/ml;
所述待测靶物质为抗体时,所述的抗He试剂中靶物质的浓度为1-20000IU/ml。
2.如权利要求1所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法,其特征在于:所述待测靶物质为抗原,所述的抗He试剂中靶物质的浓度为2000ng/ml。
3.如权利要求1所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法,其特征在于:所述待测靶物质为抗体,所述的抗He试剂中靶物质的浓度为1000IU/ml。
4.如权利要求1所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法,其特征在于:所述的反应体系与抗He试剂的体积比为10:1。
5.如权利要求1所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法,其特征在于:所述激发光波长为680nm,发射光波长为610-615nm。
6.如权利要求1所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法,其特征在于:所述包被靶物质抗体的发光微球的浓度为10-100μg/ml,所述生物素标记的靶物质抗体浓度为1.0-10μg/ml,所述链亲和素包被的感光微球浓度为10-100μg/ml,所述血清与包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球的体积比依次为1:1:1:7。
7.如权利要求1所述的采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法,其特征在于:所述温育的时间为5~60分钟。
8.权利要求 1所述的方法在血清HBsAg定性和定量检测中的应用。
9.权利要求 1所述的方法在血清抗HBc定性和定量检测中的应用。
10.权利要求 1所述的方法在血清AFP定性和定量检测中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210461525.6A CN102944672B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210461525.6A CN102944672B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102944672A true CN102944672A (zh) | 2013-02-27 |
CN102944672B CN102944672B (zh) | 2015-05-20 |
Family
ID=47727633
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210461525.6A Expired - Fee Related CN102944672B (zh) | 2012-11-16 | 2012-11-16 | 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102944672B (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104714017A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-06-17 | 北京豪迈生物工程有限公司 | 一种定量检测降钙素原的方法 |
CN108132344A (zh) * | 2016-11-22 | 2018-06-08 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN108152505A (zh) * | 2016-11-22 | 2018-06-12 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109991405A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种免疫检测试剂盒及其应用 |
CN109991411A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种检测待测样本中目标抗体的免疫测定方法及其应用 |
CN110470854A (zh) * | 2018-05-11 | 2019-11-19 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 全自动免疫分析仪 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0635976B2 (ja) * | 1988-09-24 | 1994-05-11 | 株式会社島津製作所 | 免疫反応におけるプロゾーン判定方法 |
CN1484032A (zh) * | 2001-09-14 | 2004-03-24 | ���µ�����ҵ��ʽ���� | 特异结合分析方法 |
WO2007058129A1 (ja) * | 2005-11-18 | 2007-05-24 | Nitto Boseki Co., Ltd. | 抗原の測定法およびそれに用いるキット |
CN101620229A (zh) * | 2008-07-02 | 2010-01-06 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒及检测方法 |
CN102914643A (zh) * | 2012-11-16 | 2013-02-06 | 李方和 | 利用免疫层叠法进行可溶性靶物质的检测方法 |
-
2012
- 2012-11-16 CN CN201210461525.6A patent/CN102944672B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0635976B2 (ja) * | 1988-09-24 | 1994-05-11 | 株式会社島津製作所 | 免疫反応におけるプロゾーン判定方法 |
CN1484032A (zh) * | 2001-09-14 | 2004-03-24 | ���µ�����ҵ��ʽ���� | 特异结合分析方法 |
WO2007058129A1 (ja) * | 2005-11-18 | 2007-05-24 | Nitto Boseki Co., Ltd. | 抗原の測定法およびそれに用いるキット |
CN101620229A (zh) * | 2008-07-02 | 2010-01-06 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 乙型肝炎病毒e抗体检测试剂盒及检测方法 |
CN102914643A (zh) * | 2012-11-16 | 2013-02-06 | 李方和 | 利用免疫层叠法进行可溶性靶物质的检测方法 |
Cited By (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104714017A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-06-17 | 北京豪迈生物工程有限公司 | 一种定量检测降钙素原的方法 |
CN109470857A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470874A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470864A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470870A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470865B (zh) * | 2016-11-22 | 2022-04-15 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470862A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470865A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470870B (zh) * | 2016-11-22 | 2022-04-15 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 一种免疫测定方法 |
CN109470868A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-03-15 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN108152505A (zh) * | 2016-11-22 | 2018-06-12 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN108132344A (zh) * | 2016-11-22 | 2018-06-08 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470868B (zh) * | 2016-11-22 | 2022-04-15 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 一种丙型肝炎病毒抗体的免疫测定方法及其系统 |
CN109470862B (zh) * | 2016-11-22 | 2021-12-03 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109470857B (zh) * | 2016-11-22 | 2021-12-17 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 |
CN109991411A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种检测待测样本中目标抗体的免疫测定方法及其应用 |
CN109991405A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种免疫检测试剂盒及其应用 |
CN110470854A (zh) * | 2018-05-11 | 2019-11-19 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 全自动免疫分析仪 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102944672B (zh) | 2015-05-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102944672B (zh) | 采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法 | |
CN103837675B (zh) | 多组分同时定量分析的均相发光免疫分析方法及其所使用的试剂盒 | |
CN101609090A (zh) | 一种采用吖啶酯标记抗原或抗体分析方法 | |
CN105308458A (zh) | 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统 | |
CN103033619B (zh) | 一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法 | |
CN101144815A (zh) | 一种液相蛋白芯片的制备方法 | |
CN102914646B (zh) | 基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法 | |
US20220137036A1 (en) | Controls for implementing multiplex analysis methods | |
CN103898203B (zh) | 微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒 | |
CN112940114A (zh) | 一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体及其应用 | |
CN102721813A (zh) | 前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法 | |
CN104849251A (zh) | 一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒 | |
CN108152505B (zh) | 免疫测定方法、用于鉴定免疫测定的系统和试剂盒 | |
CN108291909A (zh) | 分析物检测及其方法 | |
CN102401832A (zh) | 黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒及其制法 | |
CN103308687A (zh) | 一种同时检测玉米和花生中四种真菌毒素的悬浮芯片检测方法 | |
CN106460056A (zh) | 新型试样内检测对象物的检测方法及利用其的检测试剂盒 | |
CN102914643B (zh) | 利用免疫层叠法进行可溶性靶物质的检测方法 | |
CN101078730A (zh) | 一种可原位同时检测多种常见小分子药物的酶标芯片法 | |
CN106771264A (zh) | 促甲状腺激素测定试剂盒及制作方法 | |
Xu et al. | Latest advancement for detection methods of mycotoxins in traditional Chinese medicine | |
CN1474185A (zh) | 心肌肌钙蛋白鲁米诺化学发光免疫分析检测方法 | |
Wang et al. | Individually addressable electrode array for multianalyte electrochemiluminescent immunoassay based on a sequential triggering strategy | |
CN102662057A (zh) | CEDIA ImmunoChip毒品检测试剂盒 | |
CN214953571U (zh) | 利用红色荧光微球标记的登革热病毒抗体快速检测芯片 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150520 Termination date: 20191116 |