JP2002544516A

JP2002544516A - 高角度分解能及び高速応答時間による表面プラズモン共鳴の検出方法

Info

Publication number: JP2002544516A
Application number: JP2000618715A
Authority: JP
Inventors: ノンジアンタオ，; サラボウサード，; ウェンリューフワン，
Original assignee: ザフロリダインターナショナルユニバーシティボードオブトラスティーズ
Priority date: 1999-05-17
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2002-12-24
Also published as: ES2177473T1; IL146207A0; DE1194763T1; EP1194763A4; RU2226684C2; AU5134100A; HK1044041A1; CN1216282C; CA2373343A1; EP1194763A1; WO2000070328A1; CN1364233A; IL146207A

Abstract

(57)【要約】分子または分子の立体配座を高分解能かつ高速応答時間で感知するための表面プラズモン共鳴を検出するデバイス及び方法が開示されている。光源（１４）からの光はプリズムを介して金属薄膜（１５）上に集束され、金属薄膜（１５）上には検出されるサンプル分子が吸着されている。レーザ／入射光の内面反射は全て、先行する研究では広く使用されている単体セルまたは光検出器アレイ（１２）の代わりに差分位置または強度を感知する光検出デバイスによって集められる。差分部分または強度を感知する光検出デバイス（１２）の加算信号に対する差分信号の割合は、金属フィルム（１５）への分子の吸着によって、もしくは吸着される分子の配座の変化によって発生する表面プラズモン共鳴角度のシフトの正確な測定値を供給する。本発明は、共鳴角度の決定に際して数値的な手直しを必要とせず、セットアップはコンパクトで背景光を感受しない。本発明による方法及びセンサは、分子内の微妙な配座変化の測定のような数多くの生物学的、生化学的及び化学的用途における使用が可能であり、電子移動反応を研究することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本出願は、１９９９年５月１７日に提出された米国仮特許出願第６０／１３４
，４８２号の特典を請求するものである。

【０００２】本発明は、ＮＳＦから与えられた許可ＣＨＥ−９８１８０７３及びＮＩＨから
与えられた許可ＧＭ−０８２０５に基づいて政府の支援によって行われたもので
ある。

【０００３】本発明は、概して生物学的、生化学的及び化学的試験において使用するための
方法及び測定機器またはセンサに関し、具体的には超高分解能及び超高速応答時
間で分子を検出する、または分子の構造的および電子的変化を監視するために表
面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する方法、機器、および機械の使用に関する
。

【０００４】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、金属境界に存在する自由電子のプラズマの
発振である。これらの発振は、金属表面に隣接する物質の屈折率に影響される。
表面の屈折率の僅かな変化の検出に使用され、および様々なセンサ機構の基礎を
成すのは本現象である。

【０００５】表面プラズモン共鳴分光学は近年、表面科学、バイオテクノロジー、環境、薬
物及び食品のモニター及び医薬といった多くの研究分野及び産業上の利用分野に
おける、化学及び生物学的物質の検出及び分析のための強力な技術として出現し
てきた。

【０００６】生物学的センサでは、ＳＰＲを使用する抗体及び抗原抗体反応の検出が、細菌
またはウィルスに関連づけられる抗体の存在を感染の重要な指針とする生物医学
的診断学における主要な関心事である。

【０００７】ＳＰＲはまた、対象検体において定義された列で結合しているデオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）が使用される遺伝子プローブにも適用さ
れている。さらにＳＰＲは、環境保護または化学／生物学的戦争の警告のため空
気中または水中の極微量の毒性物質の検出における用途も発見されている。最後
にＳＰＲを基礎とするセンサは、食品産業においても食品中の化学的または生物
学的汚染物を検出するのに有望である。

【０００８】これら全てのアプリケーションにおいては、ＳＰＲ検出の分解能及び時間応答
を向上させることが極めて重要である。

【０００９】表面プラズモン共鳴は、平行偏光ビームが高い誘電率を有する媒体、例えばガ
ラスプリズムの境界で完全に内面反射される際に発生する減衰波動を利用するこ
とによって達成できる。この技術に関する記述としては、「センサとアクチュエ
ータ」第４巻２９９ページにＬｉｅｂｅｒｇ、Ｎｙｌａｎｄｅｒ、Ｌｕｎｄｓｔ
ｒｏｍにより「気体の検出及び生物化学検知のための表面プラズモン共鳴」と題
する論文が掲載されている。

【００１０】ＳＰＲの検出に広く使用されている方法は、金属薄膜で被覆されたガラス本体
、通常プリズムに入射する平行レーザビームの全減衰反射（ＡＴＲ）に基づいて
いる。入射光が適正角度に到達すると、反射は薄膜における表面プラズモン波動
の励起に対応して最小値へと急激に低減する。総内面反射は、プリズムの回転に
よって変化する入射角の関数として光検出器により検出される。

【００１１】また、光検出器は回転され、反射光を捕捉する。入射ビームが適正角度に到達
すると、反射は、反射率対入射角プロットにおいてディップとして現れる最小値
へと急激に低減する。このプリズムを回転させる方法によって達成される角度分
解能は、代表的には１０^-2〜１０^-3度であり、角度位置の誤差及び反射光強度に
おけるノイズによって制限される。

【００１２】異なるＳＰＲ検出法を比較する場合、ＳＰＲ分解能は、しばしば検体の屈折率
変化[屈折率単位（ＲＩＵ）]における最小の検出可能な変化という言葉で説明さ
れる。上述の角度分解能は、波長６３０ｎｍにおいて１０^-5〜１０^-6ＲＩＵに相
当する。角度分解能がより高くするためには、プリズムと光検出器との距離は大
きくする必要があり、このためセットアップは大型になる上に機械的ノイズ及び
熱ドリフトをより受けやすくなる。応答時間は、セットアップの機械的な動きに
起因して遅い。

【００１３】機械的な動きは、光検出器を共鳴に近い角度で固定し、かつＳＰＲの角度変化
による反射の強度変化を測定することによって回避することができる。この方法
の主要な優位点は、応答時間が光検出器及びナノ秒単位の高速である光検出器お
よび関連の電子機器によって制限されることであるだけだという。

【００１４】しかしながら欠点は、反射強度と共鳴角度測定感度の関係は光検出器の固定さ
れる角度に依存することである。当該方法分解能の主要な制限は、レーザ強度の
変動から、及びセットアップにおける熱的及び機械的ドリフトからもたらされる
。

【００１５】広く使用されている他のＡＴＲをベースとする方法は、またプリズムの位置を
固定し、上述のセットアップにおける平行入射光を、入射角範囲をカバーする固
定収束ビームと置き換えている。この方法は、Ｅ．Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ著「
収束光によるＡＴＲ法−格子上の導波への適用」光学通信、第２６巻第１号、１
９７８年、及びＦｉｎａｌｎ等による米国特許第４，９９７，２７８号に概説さ
れている。

【００１６】異なる入射角からの反射は、直線ダイオードアレイ（ＬＤＡ）または電荷結合
素子（ＣＣＤ）検出器によって同時に集められる。この方法は機械的な動きを含
まないが、多くのチャンネル（例えば、代表的なＬＤＡでは１０２４）の同時検
出は応答時間を遅らせる。

【００１７】代表的な角度分解能は、１０^-2〜１０^-3度または１０^-5〜１０^-6ＲＩＵである
。回転プリズムによる方法と同様に、この方法の高い角度分解能は、プリズムと
光検出器間で大きい距離を必要とする。

【００１８】上述のセットアップは、反射強度対入射角との関係を包含している（角度走査
システム）。すなわち、ＳＰＲはまた、Ｆ．Ｃａｒｕｓｏ等が説明しているよう
に（「応用物理ジャーナル」第８３巻第１０２３号、１９９８年）、入射光の波
長を変調することによっても検出されている。波長変調は、ロックイン増幅器で
モニターされる反射強度において変調を引き起こし、ＳＰＲのディップ位置の正
確な測定をもたらす。

【００１９】音響光学調整フィルタ（ＡＯＴＦ）を使って、波長６３０ｎｍで５×１０^-7Ｒ
ＩＵに相当する０．０００５ｎｍの波長変化を検出できることが実証された。ゴ
ールド上でのＤＮＡ−ＳＨ吸着に適用されると、ＡＯＴＦＳＰＲのＳ／Ｎ比は
角度走査システムによって達成されるものに比べて６倍も改善される。

【００２０】上述のように、これらの方法は、遅い反応時間及び限定された角度分解能とい
う２つの主要な欠点がある。前者により、これらの方法では、表面への分子の初
期吸着プロセス、気体の相互作用、表面の結合分子と溶液中の分子との反応及び
吸着された蛋白質の配座変化といった高速反応を検出することができない。後者
により、少量の分子または分子のごく僅かな構造上または配座上の変化を検出す
るＳＰＲの感度を制限する。

【００２１】第１の方法では、当該方法に関わる機械的な動きのために反応が遅い。第２の
方法では機械的な動きを伴わないが、チャンネルの同時検出により（例えば代表
的な直線ダイオードアレイでは１０２４チャンネル）応答時間が遅くなる。

【００２２】両方法に対し、角度分解能が代表的には１０^-3度よりも低い（代表的には約１
０^-2度のオーダー）。高い角度分解能を得るためには、両方法は、サンプルと検
出器との距離を大きくする必要があり、これによりセットアップは機械的ノイズ
及び熱的ドリフトをさらに受けやすくなる。

【００２３】しかしながら長い距離は、検出ビームの品質を低下させ、ＳＰＲ機器を大型に
する。所定のサンプル−検出器間距離に対して、第１の方法による分解能はプリ
ズムの角度位置の測定精度によって制限される。第２の方法による分解能は、光
検出器アレイにおけるチャンネル（ピクセル）数及び各チャンネルで測定された
強度における雑音レベルによって制限される。

【００２４】分解能の向上は、第１または第２の方法の何れかによって集められたデータに
適合するソフトウェアルーチンを使って得られるが、この適合手順は余分な時間
を必要とし、その信頼性は測定された各データポイントの精度に依存する。第２
の方法には、ビームの強度が多数のチャンネルに渡って拡散されるというもう一
つの欠点があり、これにより、Ｓ／Ｎ比は低下し、よって分解能は制限される。

【００２５】本発明は、約１０^-5度（または１０^-8ＲＩＵ）の角度分解能及び約１マイクロ
秒の範囲の応答時間を達成する新しいＳＰＲ検出方法を開示する。

【００２６】本方法は、簡便さ、良好な直線性、小型であること及び周囲光に対して非感度
非感応性を含む幾つかの追加的な特性を有している。本方法は金属薄膜の上に集
められる収束ビームを使用するが、総内面反射は、ＣＣＤまたはＬＤＡではなく
差分位置または強度感応性光検出デバイスによって集められる。

【００２７】差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスのセル上に当
たる反射光は、まず、ＳＰＲディップが差分位置感応性光検出デバイスまたは強
度感応性光検出デバイスの中央付近に位置づけられるようにバランスがとられる
。差分信号はＳＰＲ角度の変化に対し直線的に比例し、飽和の問題なく簡単に増
幅可能であるため、ＳＰＲの正確な検出がもたらされる。

【００２８】バイセルの差分位置感知の光検出デバイスは、Ｓ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等によ
って原子の力顕微鏡（ＡＦＭ）において使用されている（応用物理ジャーナル、
第６５巻第１６４号、１９８９年）が、そこでは、ＡＦＭ片持ち梁の曲りによる
レーザビームの偏向が測定される。本出願では、測定されるのはレーザビームの
物理的移動ではなくＳＰＲ角度シフトによる強度の分布である。

【００２９】

【課題を解決するための手段】

本方法は、ダイオードレーザをプリズムを介して金属薄膜で被覆された透明プ
レート上に集めることによって実行される。透明プレートは、屈折率が一致する
物質で光学プリズム上に支持される。

【００３０】入射光および差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイス
は、総内面反射におけるＳＰＲが、セルからのゼロ差信号に対応して、光検出シ
ステムのフォトセルの中央に位置づけられるよう調整される。

【００３１】金属フィルムの上には、金属フィルムの電気化学的電位を制御するのに必要な
電極を有するサンプルセルが取り付けられ、そこでは分子が検出、調査または導
入される。金属フィルム上の分子の存在または分子の変化により、ＳＰＲディッ
プは僅かにシフトされ、容易に増幅されて検出される差分位置感応性光検出デバ
イスまたは強度感応性光検出デバイスの差分信号が結果として変化する。

【００３２】本発明の１つの態様は、生物学的、生化学的及び化学的アプリケーションに対
するＳＰＲをより高い角度分解能及びより速い応答時間で検出するための方法及
びセンサを生み出すことである。

【００３３】角度分解能及び応答速度は、差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性
光検出デバイスを、それが中央に位置づけられて表面プラズモン共鳴に対応して
正確なディップを検出するように、正確に位置づけることによって改善される。

【００３４】この様にして、本検出デバイスは、数マイクロ秒の応答時間及び先の方法より
何桁分良いオーダーである約１０^-5度のオーダーの角度分解能で変化をモニター
できる。

【００３５】本発明の２つ目の態様は、周囲光、光源の強度の変動及び光検出器及び電子機
器におけるノイズに影響されないＳＰＲのセンサ及び検出方法を生み出すことで
ある。

【００３６】本発明の第３の態様は、例えばロックイン技術を使用して金属フィルムの電気
化学的電位によりＳＰＲ信号を変調し、Ｓ／Ｎ比を改善するものである。

【００３７】本発明の他の態様は、電流、キャパシタンス及びこれらに類似するような電気
化学的測定値をＳＰＲ測定値に統合し、検出分子に関する重要な補足情報を供給
および、センサ及びその用途における特殊性を向上させることである。

【００３８】例えば、加算信号に対する差分信号の割合はＳＰＲ角度の変化に比例すること
から、本方法はＳＰＲ角度の正確な測定値を与える。

【００３９】しかも本発明のさらなる他の態様は、ＳＰＲ機器及びＳＰＲをベースとするセ
ンサを小型化できるということであり、このことは機器及びセンサの熱的及び機
械的安定性の向上、及び外部環境で機器及びセンサ使用の便宜性の双方にとって
重要である。

【００４０】本発明をベースとするＳＰＲセンサは、これらが集光源、プリズム及び光検出
器のみで構成されるため、小型であり、かつサンプルと光検出器を大きくはなす
必要なしに高い角度分解能が達成される。

【００４１】本発明の上述及び他の態様、新規特徴及び優位点は、好適な実施形態に関する
以下の詳細な説明によって明白になるであろう。

【００４２】以下、本発明がより良く理解され得るように、本発明の幾つかの実施形態につ
いて単に例示を用いて、および以下に示す添付の図面を参照しながら説明する。

【００４３】

【発明の実施の形態】

１つの実施形態において図１を参照すると、センサは、ビーム源１４からの電
磁放射線の平行入力ビーム１６を備え、ビーム源１４は、適当なフィルタ及びコ
リメータまたは好ましくはダイオードレーザもしくはこれに類似するものを有す
る通常の光源を都合よく備えていてもよい。放射の周波数は、結果的に表面プラ
ズモン波を発生させるようなものでなければならず、実際には可視領域内または
可視領域に近いものとなるが、他の周波数も可能である。適正なビーム源には、
日立製造のような５ｍＷダイオードレーザ（λ＝６３５ｎｍ）が含まれる。レー
ザが使用される場合、レーザは適正なレーザ制御装置２１で制御される。

【００４４】入力ビーム１６は、ガラス又は石英等の透明な物質で造られた、焦点距離ｆ₁
を有する半円柱状（直角または等面）の焦点レンズ１３を介して集束される。こ
のビームは、選択的に、ビームの性質を変える偏光器、スリット、追加レンズま
たはその同等品等のような他のデバイスを任意通過することができる。

【００４５】焦点レンズは、一般に１及び３に示されるように光透過性のコンポーネントと
金属コーティングまたは膜の形状である反射層１５との間のインタフェース１８
上の点１７上に光を集める。

【００４６】光透過性／透明コンポーネントは、本例では、第１の表面（この上に反射層が
成長または被覆される）を有する薄い支持プレートまたはスライド３と、点１７
をその曲率中心とする第２の曲がった球面を有する半球形のレンズまたはプリズ
ム１とで構成されている。光透過性コンポーネントは、通常はガラス製である。

【００４７】このコンポーネントが導入するどんな屈折も無視されるまたは補償されること
ができるので、光透過性コンポーネントとしては、他の幾何学的配置、形状及び
サイズが可能である。

【００４８】本配置は、好ましくは、レンズ１３から出現する収束ビームにおける光線が全
て光透過性のコンポーネント１及び３の半径方向に進み、従って屈折されること
がなく中央の点１７上に集束されるというようなものである。光透過性コンポー
ネント１及び３は、支持フレーム２によって取り付けられている。

【００４９】金属フィルムの材料は一般に銀または金であり、通常は蒸着によって付けられ
る。フィルムは、入射ビームの入射点の僅かな移動に対応するために、できるだ
け一様でなければならない。構造化された金属フィルムは最良の共鳴を与え、及
び光透過性のコンポーネントを事前処理して金属フィルムの性能を向上させ、及
び特にそのようなフィルムの元々の傾向を制御して不連続アイランドを形成させ
る技術上周知の方法は様々に存在することが想定される。

【００５０】好適な実施形態では、金属フィルム１５は、プレート３及びプリズム１の対面
する表面間において、１９で示されるようにプリズム上に配置され、かつ適正な
指数が整合する液体またはオイルフィルムによってプリズムに光学的に結合され
たガラス製スライド３上にエピタキシャル成長が行われる。本発明の実際の実現
において、金属層１５は任意の方法で上述のスライド３の表面に応用されること
ができる。

【００５１】点１７で金属フィルムから内部反射された光は、スライドを通って放射感応性
差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイス１２によって検
出される発散状、面状、または扇状のビームとして進行する。

【００５２】差分検出デバイスは、広い面積または狭い面積の検出器、検出器アレイまたは
同等品、例えばモノセルまたはバイセル感光性検出器または同等品から構成され
ることができる。コスト、小型化及び高速応答性の理由から、バイセル感光性検
出器の使用が好ましい。

【００５３】差分検出器は、ビーム１６を横切る位置と共に光の強さの変動を表す電気出力
信号を発生させる。すなわち、強力な吸収に影響するＳＰＲ効果は、試験される
サンプル内の材料によって定まる特定の角度で生じる。これらの電気信号は、サ
ンプリングされ、デジタル化され、関連回路（必ずしも図示はされていない）を
介してマイクロプロセッサまたはより大型のコンピュータを含む可能性のある適
当な（集合的に２２で指示されている）分析装置へ供給される。

【００５４】一つの実施形態では、分子サンプルが試験される、たとえばテフロン（Ｒ）等
の適当な不活性材料からなるセル６が配置され、金属フィルム上に取り付けられ
る。ガラス窓７は、収束されたレーザスポットを見ることが可能であり、空気感
応性分子にとって重要である溶液を周辺環境から密封している。

【００５５】上記セル６は、溶液をＮ₂ので浄化するポート５と、対極電極９及び基準電極
１１のための２つのポートとを有し、これらは、金属表面の電気化学的制御にと
って必要とされる。それはまた、試験される分子を含むサンプルをセル６内に流
し込め、金属層に接しさせ、セル６から流れ出せる程度の大きさの２つの付加的
なポート４，１０を有し、それによって、サンプルを最大感度を保証する試験の
間連続的に補充させる。

【００５６】その他のサンプルを供給する方法も可能である。屈折率が変化するいかなる材
料もサンプルとして使用可能である。例えば、１つまたは複数の分子を使用する
ことができる。

【００５７】サンプルが金属層１５を通過するとき、層１５の屈折率は変化する。それは、
選択的に且つ継続的に試験進行の間監視される。点１７における入射角が正確で
あるなら、光ビームの適用により、プラズモン波が発生し、それ故、入力ビーム
からエネルギーが抽出され、ある特定の入射角で出力ビームの強度の減衰または
ディップが発生する。

【００５８】差分検出デバイスの出力を監視するフィードバック回路は、反射率ディップが
得られる角度を明確化することができる。このことにより、高感度の出力が生み
出される。

【００５９】ある実施形態では、差分検出デバイスの初期の位置または入射角は、例えば可
動フレーム２０を介して、例えば精密変換または回転段階で調整される。初期位
置は、差分検出デバイス１２から受信される光信号の差（Ａ−Ｂ）がゼロである
ように設定される。これは、通常いかなるサンプルもセルを通過する以前、また
はサンプルと結合する中性、制御または緩衝溶液の幾分かがセルを通過した際、
または試験中のサンプルがセルを通過した際、但しそのいかなる反応も起きる前
に結果として起こる反射ディップの実際の角度である。

【００６０】サンプルが金属層を通過して流れ始めても、屈折率が変わるまでに読取りをお
こなう時間は十分にあり、それは差分検出デバイス１２の正しい位置を調整し、
選択するために利用することができる。Ａ−Ｂがゼロに調整されると、反射ディ
ップは差分検出デバイスの中央付近に位置づけられる。検出器の位置は、色々な
方法によって、好ましくは２２のコンポーネントであるステッピングモータによ
って操作できる。

【００６１】他の実施形態では、差分検出は、位置または空間ベースよりもむしろ時間ベー
スで達成することができる。

【００６２】さらなる実施形態では、金属フィルム電極の電気化学的電位は、電位制御また
は変調ユニット及び／またはポテンシオスタット２３によって制御され、変調さ
れる。差分信号の応答、または電気化学的電位のＡＣ変調に対する（Ａ−Ｂ）／
（Ａ＋Ｂ）は、ロックイン増幅器によって２２の一部として検出され、それはＳ
／Ｎ比を飛躍的に改善し、それ故角度分解能が向上する。ロックイン増幅器から
の振幅情報はＳＰＲ角度に関する情報を与える一方、変調及び差分信号間の位相
は電極電位に対する吸着された分子の応答に関する追加情報を与える。

【００６３】金属フィルムと対電極との間を流れる対応電流のＤＣ及びＡＣコンポーネント
は共に、ＳＰＲ信号で同時に測定される。ＤＣコンポーネントは、電極上に吸着
される分子の一般的な電気化学的特性化を与える。ＡＣコンポーネントは界面キ
ャパシタンスの抽出に使用され、これにより、吸着された分子に関する補足情報
が提供される。

【００６４】図３は、光検出器の加算信号に対する差分信号の割合（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）
と、広範な角度範囲にわたる実際のＳＰＲディップ位置との直線関係を示す理論
上のシミュレーションである。

【００６５】本シミュレーションは、マトリクス法（Ｗ．Ｎ．Ｈａｎｓｅｎ著、米光学学会
ジャーナル、１９６９年）を使用して実行された。勾配は、約１．５である。デ
ィップ位置付近のある狭い角度範囲にわたる反射率を放物線であると仮定すると
、（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）として表わされる加算信号（Ａ＋Ｂ）に対する差分信
号（Ａ−Ｂ）の割合は、３度の角度範囲に対してこの勾配２でＳＰＲディップ位
置の移動に比例する。勾配は、ディップ形状が正確には放物線でないために１．
５より幾分大きい。

【００６６】図４は、本発明による方法による本発明のセンサで測定された電位間のリン酸
緩衝液における金フィルムのＳＰＲディップ位置と、従来型のダイオードアレイ
・セットアップで測定された同じサンプルのディップ位置との実験による較正を
示したものであり、これによりこの２つの方法間ですぐれた一致を示している。

【００６７】上記の説明から分かるように、本発明のセンサ及び本発明の方法による応答時
間は、差分検出デバイスの特性及びその関連のサンプリング及び演算回路によっ
てしか制限されない。プロトタイプ・セットアップは、非統合型の前段増幅器の
帯域幅によってのみ制限される、数マイクロ秒範囲の応答時間を達成した。

【００６８】市販の統合型前段増幅器は、数ピコ秒範囲の応答時間を与える。これらの超高
速応答時間は、試験または解析中に発生する最初の変移および他のシフトが監視
されかつ考慮されることを可能にし、また高速較正チェックの実行を可能にする
。

【００６９】本発明は、望ましい反射特性の決定を極めて短い時間スケールで可能にするた
め、これは、サンプルの関連成分と反射層間でなされる化学結合の時間よりも短
い。

【００７０】本発明によるセンサは極めて小型に作ることが可能であり、そのことは結果的
に熱的ドリフト及び機械の振動によるノイズが大幅に下がるという効果がある。
これに対して、先行技術によるセンサにおける高分解能は、光検出器とサンプル
間で長い距離を必要とする。１．８度の角度範囲及び１００Ｈｚの帯域幅を有す
るプレートタイプのセットアップは、約１０^-5度のオーダーの角度分解能を達成
した（図５）。

【００７１】ダイオードアレイまたはＣＣＤ検出器のセットアップで同じ分解能を達成する
ためには、サンプルと検出器間の距離はほぼ何百メートルのオーダーでなければ
ならないだろう。分解能は角度範囲に反比例するので、より小さい角度範囲でよ
り高い分解能を達成することができる。

【００７２】３ｍＷレーザと、１０^-14Ｗ／Ｈｚ^1/2のノイズ等化電力（ＮＥＰ）を有する市
販の光検出器とを使用すれば、分解能は、３度の角度範囲で帯域幅１００Ｈｚに
つき１０^-8度範囲となることが期待される。本発明の高分解能、高速応答時間及
びコンパクト設計により、生物学、生化学及び化学の諸分野における多種多様な
用途に使うことができる。

【００７３】高分解能、高速応答時間及びコンパクト設計に加えて、本発明における差分検
出方法は、システムを室内灯等の外来光線による妨害効果に対して非感受性にし
、また光源強度の避けがたい変動及び他の一般的なノイズに起因する問題を最小
にしている。これにより、装置の全体または特定のコンポーネントを被覆し、光
源を変調し、または検出器及び／または処理回路を特定の応答に同調させる費用
及び不都合さが回避される。

【００７４】以下の例は、本発明の具体的な態様及び実施をさらに説明するために提示され
ている。これらの例は、本発明の特定の実施形態について説明したものであるが
、本発明または添付の請求の範囲を制限するものとして解釈されるものではない
。＜実施例１＞ＳＰＲセットアップ１あるＳＰＲセットアップでは、ＢＫ７平円筒面レンズ（ＭｅｌｌｅｓＧｒｉ
ｏｔ）がプリズムとして使用された。このプリズムは、ほぼ半円筒形であるが正
確には半円筒形ではない。プリズム上には、超高真空においてＢＫ７ガラススラ
イド上に蒸着された５０ｎｍ厚さの金フィルムが屈指率マッチング流体により配
置された。

【００７５】この金フィルムは、表面の汚染を低減するために各実験の直前に水素炎でアニ
ルされた。自製のレーザ制御器で駆動される５ｍＷダイオードレーザ（ｌ＝６３
５ｎｍ、日立製）が平行にされ、次いで、焦点距離１４ｍｍのレンズによりプリ
ズムを介して金フィルム上に集光された。

【００７６】金フィルムからの反射光は、正確な並進段階で取り付けられたバイセルフォト
ダイオード検出器（浜松コーポレーション製、モデルＳ２７２１−０２）で検出
された。

【００７７】２つのセル（Ａ及びＢ）からの光電流は、自製回路で電圧に変換された。本回
路はまた、差分Ａ−Ｂ信号及び加算Ａ＋Ｂ信号を計算し、これらの信号は次いで
１６ビットのデータ収集ボード（ナショナル製機器）を装備したパーソナルコン
ピュータに送信された。

【００７８】高速の運動論研究のために、差分信号及び加算信号は１５０ＭＨＺのデジタル
・オシロスコープ（横河製、ＤＬ１５２０Ｌ）に送られた。各測定の前には、
レーザビームの中心に暗線が位置づけられるように、プリズムが回転された。暗
線は、共鳴の角度で発生する表面プラズモンによる光の吸着に起因する。

【００７９】光検出器の２つのセル上に当たる反射光は、それからＡ−Ｂがゼロに近づくま
で変換段階で光検出器の位置を調整することにより平衡にされた。本方法の高い
感度のため、機械的応力に起因するＡ−Ｂ信号のドリフトは、アラインメント直
後には明確に見えるが、ドリフトは全てのねじが適切に締めらた時、典型的には
１５〜３０分の間で落ち着く。ＳＰＲ角度シフトに正比例する加算信号に対する
差分信号の割合は、Ａ−ＢをＡ＋Ｂで除して数値として得られた。

【００８０】金フィルムの上に、サンプル溶液を保持するためテフロン（Ｒ）製のサンプル
用セルが設置された。このセルは、サンプル溶液を流入、流出されるための２つ
のポートと、Ｏ₂をＮ₂または多くの実験に必要な他の適当な不活性ガスで溶液か
らパージするための１つのポートとを有している。

【００８１】金フィルム電極の電気化学的電位を制御するために、対極電極及び準基準電極
としてＰｔ及びＡｇワイヤがそれぞれ使用された。準基準電極は、Ａｇ／ＡｇＣ
ｌ基準電極に対して較正された。金フィルムの電気化学的電位が、ＥＧ＆Ｇモデ
ル２８３のポテンシオスタットで制御された。＜実施例２＞ＳＰＲセットアップ２もう一つのＳＰＲセットアップでは、ＢＫ７平円筒面レンズ（Ｍｅｌｌｅｓ
Ｇｒｉｏｔ）がプリズムとして使用された。プリズム上に、スパッタ式塗布機に
よって４５ｎｍ厚さの銀または金のフィルムで被覆されたＢＫ７ガラススライド
指数整合流体により配置された。

【００８２】１５０Ｗのキセノン灯から、白色光がモノクロメータに送られた。モノクロメ
ータからの約０．５ｎｍの帯域幅を有する単色光が照準され、次に焦点距離１４
ｍｍのレンズによりプリズムを介して銀フィルム上に集光された。

【００８３】銀フィルムからの反射光は、正確な変換ステージ上に取り付けられたバイセル
フォトダイオード検出器（浜松コーポレーション製、モデルＳ２７２１−０２）
で検出された。

【００８４】各測定において、プリズムはＳＰＲディップに対応する暗線がレーザビームの
中央に位置づけられるように回転された。

【００８５】光検出器の２つのセル上に当たる反射光は、次に差分信号がゼロになるまで変
換ステージで光検出器の位置を調整することにより平衡がとられた。ＳＰＲ角度
の移動は差分角度に比例しており、この移動が精密に測定された。

【００８６】電極電位の変調に対する差分信号の応答が、１の関数としてロックイン増幅器
（プリンストン応用研究所、モデル５１１０）により記録された。光検出器の加
算信号で正規化されたロックイン増幅器からの出力はΔθ（λ）／ΔＶに比例す
るが、これはクラマース・クローニヒの関係式によりスターク・スペクトルΔε
／ΔＶを計算するために使われた。

【００８７】銀フィルムの上に、サンプル溶液を保持するためテフロン（Ｒ）製のサンプル
用セルが設置された。電極電位を制御するために、対極電極及び準基準電極とし
てＰｔ及びＡｇワイヤがポテンシオスタット（パイン製機器）と共にそれぞれ使
用された。

【００８８】準基準電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（３ＭＫＣｌ内）基準電極に対して較正され
た。実験は、電極が０．２Ｖに保持された状態で実行され、２００Ｈｚで約１０
ｍＶの変調が電位に印加された。電位は、銀フィルム上に電気化学的反応が発生
しないように選択された。＜実施例３＞ＳＰＲに関する電子密度の効果図６は、−０．２Ｖから０．３Ｖまでの（Ａｇ／ＡｇＣｌに対する）電極電位
の線形変化に伴う、５０ｍＭリン酸緩衝液における有機単層（メルカプトプロピ
オン酸またはＭＰＡ）で被覆された金フィルム（電極）のＳＰＲディップ位置を
示している。

【００８９】ディップ位置は１００ｍＶ当たり約０．０００８度で変化しており、小さすぎ
て従来型のＳＰＲセットアップでは容易に検出することができない。電極電位は
、金属フィルムにおける電子密度の変化を介してＳＰＲディップ位置を変更でき
ることは認識された。

【００９０】ＭＰＡの存在は表面のキャパシタンスを減少させるため、ここで観測されるシ
フトは裸の金電極の場合よりもはるかに小さく、所定の電位変化に対する電子密
度の変化を低下させる。＜実施例４＞自己集合型単層上への蛋白質吸着図７は、ＳＰＲによってモニターされる３メルカプトプロピオン酸で被覆され
た金電極上へのチトクロム蛋白の吸着プロセスを示す。測定は、蛋白質の存在し
ない緩衝液におけるＳＰＲディップ位置を監視することから開始された。

【００９１】次に、２０μＬ２７μＭの馬の心臓のチトクロムｃ（Ｃｙｔｃ：Ｆｌｕｋａよ
り購入し、さらなる精製なしに使用された）＋５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．４
）がセル内の溶液ポートを介して溶液セルへと注入され、その結果としてのＳＰ
Ｒディップ位置が引き続き監視された。

【００９２】ディップ位置は約１５分で増大し、安定値に到達した。Ｃｙｔｃ溶液を緩衝液
で置換しても、ディップ位置は元に戻らず、吸着された蛋白質は表面上でかなり
安定していることを示した。＜実施例５＞レドックス蛋白質の電子移動で誘導された配座変化電極表面上に吸着されたＣｙｔｃが存在すると、電極電位の変化は、酸化及び
還元を介して、電極と吸着された蛋白質との間の電子移動をトリガーすることが
できる。この電子移動は、同時的に測定されたサイクリック・ボルタモノグラム
においてピーク対として示されている（図８ａ）。

【００９３】測定されたＳＰＲディップ位置は、蛋白質を酸化状態から還元状態へ変換する
際に、Ｓ字状の増加を示す（図８ｂ）。約０．００６度から約０．０１度である
この変化は、蛋白質を酸化状態に戻す際には逆にできる。変化の誤差は、ＳＰＲ
のセットアップよりもむしろ、主としてバックグラウンドＳＰＲシフトの決定の
際の不確定さからきていることに留意する。

【００９４】ＳＰＲシフトは、電子移動反応によって誘導された蛋白質の配座変化によるも
のだということができる。この変化は、蛋白層の厚さ及び屈折率の双方に影響を
与える。

【００９５】ローレンツ・ローレンツの関係式により、蛋白層の屈折率の変化（Δｎ）は、
Δｎ／ｎ＝−（１／６）（１−１／ｎ²）（２＋ｎ²）Δｄ／ｄによって厚さΔｄ
に関係づけられる。但し、ここでｎ及びｄは各々蛋白層の屈折率及び厚さである
。この関係式を使って我々は酸化状態から還元状態へのＣｙｔｃの転換により、
０．００６゜〜０．０１゜のディップ角度の増大は、厚さ約０．３Ａの低減に相
当することを予測した。＜実施例６＞多重波長ＳＰＲ吸収分光法の能力は、多重波長入射光の使用によってＳＰＲに統合できる。こ
の作動原理は、ＳＰＲによって測定された分子の屈折率を吸収分光法による吸収
係数に関係づけるクラマース・クローニヒの関係式を基礎としている。

【００９６】本明細書に開示された差分法を使用すれば、多重波長ＳＰＲはチトクロームｃ
の電子移動反応に適用することができる。５００ｎｍ及び７００ｎｍ間の波長は
、還元されたチトクロームｃ（実線）が５２０ｎｍと５５０ｎｍとで２つの明白
なピークを保有するので、走査されたが、一方酸化されたチトクロームｃ（破線
）は波長ウィンドウにおいて比較的平坦である（図９ａ）。

【００９７】波長に対する共鳴角度の測定されたシフトは、図９ｂにプロットされている。
当該シフトは吸収ピークから遠くにあって波長にはさほど依存せず、蛋白質の配
座変化を測定する。しかしながら波長が吸収ピークに近づくと、クラマース・ク
ローニヒの関係式から予測されるように、５２０ｎｍ及び５５０ｎｍに集中する
２つの興味深いキンクが出現している。

【００９８】入力で吸収スペクトルを使用することにより、我々はクラマース・クローニヒ
の関係式によりＳＰＲディップシフトを計算し（図９ｃ）、そして理論と実験デ
ータ間の定量的一致を発見した。＜実施例７＞蛋白質の配座変化の運動論上述の電子移動誘導型配座変化の運動論が、本ＳＰＲセットアップの高速応答
時間を利用して調べられた。図１０は、電位が、蛋白質が酸化状態にあった０．
３Ｖから蛋白質が還元状態へと転換された−０．２Ｖへと急激に進んだ際のＳＰ
Ｒディップ位置の応答を示している。

【００９９】電位は、０．３Ｖへと戻される前に様々な時間間隔で−０．２Ｖに保持された
。研究されることが可能な最短時間は、ＳＰＲセットアップによってではなくむ
しろ、電気化学的セルの応答時間によって制限された。図１０に示される時間枠
にわたって、ＳＰＲ応答は指数関数により、還元の場合は約２．１ｍｓ、かつ酸
化の場合は約２．５ｍｓの時間定数で大まかに適合される。

【０１００】還元に起因する変化は、酸化の場合よりも速い。還元状態にあるＣｙｔｃは酸
化状態にあるＣｙｔｃよりも安定している、というこの観測は、この前の研究に
一致する。

【０１０１】上述の実施諸例は、本発明による高分解能ＳＰＲセンサ及び方法の新規性及び
有用性を実証している。本明細書で引用された参照事項はすべて参照としてその
まま本明細書に組み入れる。

【０１０２】本発明の好適な実施形態に関する上記の詳細な説明は、理解を明確にするため
にのみ行われたものであり、当業者にとっては自明となることから、こうした説
明によって不必要な制限が推測されてはならない。

【０１０３】先に述べた本発明の変形は、本発明の範囲から逸脱することなく行われること
が可能であり、それ故にこうした制限は、添付の請求の範囲において指示されて
いる通りに課せられるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の一例によるＳＰＲセンサの断面概略図である。

【図２】図２は、差分位置の２つのセル、またはＳＰＲにおけるシフト前後の強度感応
性光検出デバイスの輝度プロフィールである。２つのセル、Ａ及びＢの輝度は、
最初は平衡化されている（実線より下の部分）。ＳＰＲのシフトは、光検出器に
より差分信号として検出される２つのセルの輝度の不均衡（点線）を発生させる
結果となる。

【図３】図３は、差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスの和
／加算信号に対する差分信号の割合（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）と、広範な角度範囲
にわたる実際のＳＰＲディップ位置との正比例／線形的関係を示す理論上のシミ
ュレーションである。

【図４】図４−１０は、本発明による装置が実行可能な性能を示す。特に、図４は、本方法によって測定された様々な電位におけるリン酸緩衝液内の金薄
膜のＳＰＲディップ位置の、従来のダイオードアレイ・セットアップによって測
定された同一サンプルのディップ位置に対する実験的較正であり、２つの方法は
非常によく一致していることを示す。

【図５】図５は、本方法を基礎とするフォトタイプ・セットアップにおける熱的ドリフ
ト及び機械的振動に起因する代表的なＳＰＲシフトを示す。

【図６】図６は、電極電位の（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して）−０．２Ｖ及び０．
３Ｖ間の速度０／１Ｖ／秒による走査に伴う、５０ｍＭリン酸溶液におけるメル
カプトプロピオン酸（ＭＰＡ）で被覆された金電極のＳＰＲディップシフトを示
す。挿入図は、同時に記録されたサイクリック・ボルタンモグラムを示している
。

【図７】図７は、レドックス蛋白質であるチトクロムｃが溶液セルに導入される前、中
、後のＳＰＲディップシフトを時間の関数として示したものである。２つの矢印
は各々、チトクロムｃが導入された時点とチトクロムｃが緩衝液で置換された時
点を示している。

【図８】図８（ａ）は、電極電位の−０．２Ｖ及び０．３Ｖ間の速度０．１Ｖ／秒によ
る走査に伴う、５０ｍＭリン酸溶液におけるＭＰＡで被覆された金電極の表面に
固定されたチトクロムｃのサイクリック・ボルタモグラムであり、矢印は、蛋白
質の電子移動反応に対応する蛋白質の酸化及び還元を指している。図８（ｂ）は
、酸化及び還元による対応するＳＰＲ角度のディップシフトである。

【図９】図９（ａ）は、還元された（実線）チトクロムｃと酸化された（点線）チトク
ロムｃの吸収スペクトルである。図９（ｂ）は、酸化状態から還元状態への転換
に伴うチトクロムｃの実験的ＳＰＲシフト（中空円及び中実円）を示している。
吸収のピーク、５５０ｎｍ及び５２０ｎｍではキンクが発生している。中空の正
方形は、純粋なリン酸緩衝液におけるシフトを示している。図９（ｃ）は、吸収
のピーク及びクラマース・クローニヒの関係式を基礎とする理論上のＳＰＲシフ
トを示す。

【図１０】図１０は、電子移動によって導入される、５０ｍＭリン酸緩衝液におけるＭＰ
Ａで被覆されている金電極上に固定されたチトクロムｃの配座変化の速度論を示
している。ＳＰＲディップ位置の応答は、電位を０．３Ｖから−０．２Ｖへと進
め、−０．２Ｖで１０マイクロ秒留まった後に０．３Ｖまで戻った時得られた。
点線は、単純な指数関数を使用した修正である。

【符号の説明】

１プリズム３スライド４ポート６セル７ガラス窓９対極電極１０ポート１１基準電極１２デバイス１３焦点レンズ１４ビーム源１５反射層１６入力ビーム１７点１８インターフェイス２０可動フレーム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ボウサード，サラアメリカ合衆国 33143 フロリダマイアミエスダブリュー 72 アベニューイー312 8107 (72)発明者フワン，ウェンリューアメリカ合衆国 33185 フロリダマイアミエスダブリュー 50 テラス 14730 Ｆターム(参考） 2G059 AA05 BB04 BB12 CC12 CC16 EE02 EE04 GG02 GG10 HH02 JJ01 JJ11 JJ12 KK01 KK04 MM01 MM09 MM10 MM14 NN02 NN03 NN05 NN10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】選択的にサンプル材料であり得る金属材料層上に電磁放射の
ビームを集束させるステップと、上記金属材料層から反射された上記電磁放射のビームを、差分位置感応性光検
出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスで検出するステップと、上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスにより生
成された、第１のＡ位置信号または第１のＡ強度信号の強度と、第１のＢ位置信
号または第１のＢ強度信号とを記録するステップと、最小表面プラズモン共鳴強度が上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度
感応性光検出デバイスの中央付近にあるように且つ上記Ａ位置信号または上記Ａ
強度信号と上記Ｂ位置信号または上記Ｂ強度信号との差がほぼゼロとなるように
上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスを位置決め
するステップと、表面プラズモン共鳴の角度シフトに起因する強度分布の連続的変化を検出する
ステップとを含む表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項２】上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出
デバイスは、バイセル光検出器であり、一方のセルは上記Ａ位置信号または上記Ａ強度信号を生成し、もう一方のセル
は上記Ｂ位置信号または上記Ｂ強度信号を生成する請求項１記載の表面プラズモ
ン共鳴の検出方法。
【請求項３】上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出
デバイスは、交互の時間ポイントで強度をサンプリングすることによって上記Ａ及およびＢ
位置信号の双方またはＡおよびＢ強度信号の双方を生成するモノセル光検出器で
ある請求項１記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項４】上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出
デバイスから受けた差分信号を増幅するステップをさらに含む請求項１記載の表
面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項５】上記差分信号を増幅するステップは、調整または変更される
ことが可能となっている請求項４記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項６】上記差分信号と、加算信号と、上記加算信号に対する上記差
分信号の割合とを決定するステップをさらに含む請求項４記載の表面プラズモン
共鳴の検出方法。
【請求項７】上記差分信号を増幅するステップおよび上記差分信号と、加
算信号と、加算信号に対する差分信号の割合とを決定するステップは、電子装置
によって実行される請求項６記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項８】上記金属材料層の電気化学的電位を変調／制御するステップ
をさらに含む請求項６記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項９】上記金属材料層の電気化学的電位を変調するステップは、少
なくとも１つの基準電極と少なくとも１つの対極電極とによって実行される請求
項８記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１０】上記基準電極と対極電極とは、上記金属材料層の上に解析
されるべきサンプルを導入する手段の要素である請求項９記載の表面プラズモン
共鳴の検出方法。
【請求項１１】上記差分信号を増幅するステップは、実質的に飽和の問題
が生じない程度に実行されることが可能な請求項４記載の表面プラズモン共鳴の
検出方法。
【請求項１２】ＳＰＲ角度と電気化学的電流とを検出するステップをさら
に含む請求項８記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１３】上記ＳＰＲ角度と電気化学的電流とを検出するステップは
、少なくとも１つのロックイン増幅器によって実行される請求項１２記載の表面
プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１４】上記ＳＰＲ角度と電気化学的電流とを検出するステップは
、、金属材料層の電気化学的電位の変調と同時的に機能する請求項８記載の表面
プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１５】界面容量を決定するステップをさらに含む請求項１記載の
表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１６】上記界面キャパシタンスを決定するステップは、電気化学
的電流のＤＣおよびＡＣ成分を同時に記録することより成る請求項１５記載の表
面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１７】差分信号の振幅と位相とを同時に記録するステップをさら
に含む請求項１５記載の表面プラズモン共鳴の検出方法。
【請求項１８】電磁放射線を透過させる材料からなるセンサ本体と、上記本体の第１の表面の少なくとも一部に配置された金属材料層と、上記金属材料層の上に分析されるサンプルを導入する手段と、上記金属材料層上に集束される電磁放射ビーム源と、上記金属材料層から反射された上記電磁放射ビームの差分位置感応性光検出デ
バイスまたは強度感応性光検出デバイスとを備え、上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスは、上記
ビームを受けるように配置されているセンサ。
【請求項１９】上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検
出デバイスは、少なくとも１つのフォトセルより成る請求項１８記載のセンサ。
【請求項２０】上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検
出デバイスは、少なくとも１つのフォトセルより成る請求項１８記載のセンサ。
【請求項２１】上記金属材料層の上に解析されるべきサンプルを導入する
手段は、サンプルセルであり、上記サンプルを周囲空気から隔離する材料で造られたサンプルセル本体と、電磁放射線を透過させる材料で造られた上記サンプルセル本体内のウィンドウ
と、上記サンプルを導入し且つ除去するための少なくとも１つのポートとを備える
請求項１８記載のセンサ。
【請求項２２】上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検
出デバイスから受けた差分信号を増幅させるための手段をさらに備える請求項１
８記載のセンサ。
【請求項２３】上記差分信号を増幅する手段は、調整または変更されるこ
とが可能な請求項２２記載のセンサ。
【請求項２４】上記差分信号と、加算信号と、上記加算信号に対する上記
差分信号の割合とを決定するための手段をさらに備える請求項２２記載のセンサ
。
【請求項２５】上記差分信号を増幅するための手段と、上記差分信号と、
加算信号と、加算信号に対する差分信号の割合とを決定するための手段は電子装
置である請求項２４記載のセンサ。
【請求項２６】上記金属材料層の電気化学的電位を変調／制御するための
手段をさらに備える請求項２４記載のセンサ。
【請求項２７】上記金属材料層の電気化学的電位を変調する手段は、少な
くとも１つの基準電極と、少なくとも１つの対極電極とにより構成される請求項
２６記載のセンサ。
【請求項２８】上記金属材料層の上に解析されるべきサンプルを導入する
手段は、上記基準電極と対極電極とを有する請求項２７記載のセンサ。
【請求項２９】実質的に飽和の問題が生じない程度まで差分信号が増幅さ
れ得るように、測定に先だって上記差分信号をゼロにする手段をさらに備える請
求項２２記載のセンサ。
【請求項３０】上記測定に先だって上記差分信号をゼロにする手段は、上記差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスを、上記
差分位置感応性光検出デバイスまたは強度感応性光検出デバイスが検出する差分
信号が測定に先だってゼロとなるように配置可能な可動部品の上に取り付けるも
のである請求項２９記載のセンサ。
【請求項３１】ＳＰＲ角度と電気化学的電流とを検出するための手段をさ
らに備える請求項１８記載のセンサ。
【請求項３２】上記ＳＰＲ角度と電気化学的電流とを検出するための手段
は、少なくとも１つのロックイン増幅器からなる請求項３１記載のセンサ。
【請求項３３】上記ＳＰＲ角度と電気化学的電流とを検出するための手段
は、金属材料層の電気化学的電位の変調と同時的に機能する請求項３１記載のセ
ンサ。
【請求項３４】界面キャパシタンスを決定する手段をさらに備える請求項
１８記載のセンサ。
【請求項３５】上記界面キャパシタンスを決定する手段は、電気化学的電
流のＤＣ及びＡＣ成分を同時に記録するための手段からなる請求項３４記載のセ
ンサ。
【請求項３６】差分信号の振幅と位相とを同時に記録する手段をさらに備
える請求項３３記載のセンサ。
【請求項３７】１つの寸法が２インチ未満である請求項１８ないし３６記
載のセンサ。
【請求項３８】生物学的、生化学的または化学的試験に使用される請求項
１８ないし３７記載のセンサ。
【請求項３９】請求項１８ないし３７記載のセンサを使用して表面プラズ
モン共鳴の角度を決定する方法であって、差分信号を決定するステップと、加算信号を決定するステップと、較正曲線を決定するステップと、較正曲線に基づいて差分信号の加算信号に対する割合を決定するステップとを
含む方法。