CN1216282C - 检测表面等离子体共振的方法及其使用的传感器 - Google Patents

Abstract

提出了一种具有高分辨率和快响应时间的检测表面等离子共振的设备和方法，用于检测分子或分子中的构造变化。光源(14)发出的光通过棱镜聚焦到一个金属薄膜(15)上，在该膜上要检测的样本分子被吸收。激光/入射光的总内部反射是使用一个差分位置或强度敏感的光电检测设备，而不是在以前工厂中广泛使用的一个单单元或一个光电检测器阵列(12)来收集。差分位置或强度敏感的光电检测设备(12)的差信号与和信号之比提供了对由分子吸收到金属膜(15)上或吸收分子中构造变化而导致的表面等离子体共振角度偏移的测量。本发明不需要数字拟合来计算振荡角度，同时装置结构紧凑，不受背景光的影响。本发明的方法和传感器可以用在众多的生物、生物化学和化学应用之中，例如可以研究对分子中细微构造变化和电子转移反应的测量。

Description

检测表面等离子体共振的方法及其 使用的传感器

相关申请参照

本申请要求获得1999，5，17申请的美国临时专利应用序列号60/134,482的权益。

本发明是在NSF授予的CHE-9818073和NIH授予的GM-08205之下由政府支持完成的。

技术领域

本发明一般涉及用在生物学、生物化学和化学检测中的方法和测量仪器，特别是涉及使用具有超高分辨率和超快响应时间的表面等离子体振子共振(SPR)检测分子或监视分子中结构和电子变化的方法、仪器和仪器的用法。

背景技术

表面等离子体振子共振(SPR)是存在于金属边缘的自由电子的等离子振荡。这些振荡受临近金属表面的材料的折射率影响。这种现象被用来检测表面折射率的细微变化，是形成各种传感器机制的基础。在近些年来，表面等离子共振光谱学已经成为很多研究领域和工业应用中用于化学和生物检测和分析的有效技术，例如表面科学、生物技术、环境、药品与食物检测、医药。在生物传感器中，使用SPR检测抗体及其对抗原的反应是生物医学诊断中主要关心的问题，其中与细菌或病毒有关的抗体的存在是重要的感染指示。SPR还可用于基因探测器，其中可以使用联结成目标分析物中规定序列的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。另外，SPR已经发现在用于环境保护或化学/生物战争警报的毒性剂痕量的检测中有应用。最后，基于SPR的传感器有望在食品工业用于检测食品中的化学和生物污染物。在所有这些应用中，提高PSR检测的分辨率和响应时间是至关重要的。

表面等离子体共振可以通过使用p-偏振光束在介质边界处总内部反射时所产生的损耗波来得到，其中介质具有高介质常数，例如玻璃棱镜。讲述该技术的论文名为“用于气体检测和生物检测的表面等离子体共振”，由Lieberg、Nylander和Lundstrom发表在“检测器和激励器”Vol.4第299页。为检测SPR而广泛使用的方法以入射到玻璃体上的校准激光束的衰减总反射(ATR)为基础，其中玻璃体通常是棱镜，其上覆有薄金属膜。当入射光达到适当的角度时，反射急剧减小到最小，对应于薄膜中表面等离子体共振波的激励。使用光电检测器检测到的总内部反射是通过旋转棱镜而产生变化的入射角的函数。为了获得反射光也要旋转光电检测器。当入射光达到适当角度时，反射急剧减小到最小值，最小值是反射率—入射角曲线的倾角。受角度位置错误和反射光强度中噪声的限制，通过这种旋转棱镜的方法所能达到的角度分辨率典型是10^-2-10^-3度。为了比较不同的SPR检测技术，SPR分辨率通常用术语分析物反射率最小可测变化(反射率单位(RIU))来描述。上面的角度分辨率在波长630nm处的对应值是10^-5-10^-6RIU。为了获得更高的角度分辨率，需要加大棱镜和光电检测器之间的距离，这不仅会使装置庞大，还更容易受机械噪声和热漂移的影响。由于装置中的机械移动，所以响应时间慢。

通过将光电检测器固定在接近共振的角度以及检测由于SPR角度漂移而产生的折射强度变化可以避免机械移动。这种方法的主要优点是响应时间只受光电检测器及相关电子的限制，能够达到纳秒级。但是缺点是共振角测量的强度与灵敏度之间的关系依赖于固定光电检测器的角度。这种解决方法的主要限制来自激光强度的波动和装置中的热漂移和机械漂移。

另一种广泛使用的、基于ATR的方法也是固定棱镜的位置，并用覆盖入射角范围的固定会聚光束来替代上述装置中的校准入射光。这种方法主要是在E.Kretschmann的“具有聚焦的光的ATR方法—在一个光栅上的引导波的应用”，Vol.26，数字1，光学通信，1978，和Finaln等人的美国专利号4,997,278中提出的。不同入射角的反射使用线性二极管阵列(LDA)或电荷耦合装置(CCD)检测器同时收集在一起。这种方法不包括机械移动，但是多信道(例如，在典型的LDA中有1024个)的同时检测降低了响应时间。典型的角度分辨率是10^-2-10^-3deg或10^-5-10^-6RIU。与在使用旋转棱镜的方法中一样，这种方法的高角度分辨率需要棱镜和光电检测器之间有大的距离。

上述的装置包括作为入射角函数的反射强度(角度扫描系统)；SPR还可通过调整入射光的波长来检测，如Caruso F.等人所述(J.Appl.Phys.，1998，83，1023)。波长的调整引起反射强度的调整——这使用锁定同步放大器来监测，并提供了对SPR倾角位置的准确测量。使用声光可调滤波器(AOTF)，经证明可检测到0.0005nm的波长变化，对应于波长630nm处的5×10^-7RIU。当在金子上应用DNA-SH吸收时，AOTF SPR的信噪比比角度扫描系统所能达到的要好六倍。

如上所述，这些方法有两个主要缺陷：响应时间低和角度分辨率有限。前一个缺陷使方法不能检测快速过程，例如分子到表面的初始吸收过程、气体相互作用、溶液中表面束缚分子和分子之间的反作用和被吸收的蛋白质中的快速构造变化。后一个缺陷限制了SPR检测少量分子和分子中小结构或构造变化的灵敏度。在第一个方法中，响应慢是因为方法中包括的机械移动。第二个方法没有机械移动，但是同时检测多个信道(例如，在典型线性二极管阵列中有1024个)减低了响应时间。对于两个方法，角度分辨率典型小于10^-3度(典型是大约10^-2)。为了获得更高的角度分辨率，两种方法都需要在样本和检测器之间有大的距离，这使装置更容易受机械噪声和热漂移的影响。但是大距离降低了检测到光束的质量，使得SPR变得庞大。对于给定的样本与检测器间的距离，第一种方法的解决方案受限于测量棱镜角度位置的精确性。第二种方法的解决方案受限于光电检测器阵列的信道(像素)数量以及每个信道中测到强度的噪声级别。通过使用软件程序来拟合由第一或第二种方法得到的数据可以获得改进的解决方案，但是这种拟合过程需要额外的时间，而且其可靠性取决于测量的每个数据点的准确性。第二种方法还有一个问题，就是光束强度扩展到多个信道之中，降低了信噪比，因此限制了该解决方案。

本发明提出了一种新的SPR检测方法，该方法可获得大约10^-5度(或10^-8RIU)的角度分辨率和1μs范围内的响应时间。该方法还有其它几个特性，包括简单性、良好的线性、紧凑性和抗环境光干扰。该方法使用聚焦到薄金属膜上的会聚光束，但是总内部反射是通过一个差分位置或强度敏感的光电检测设备，而不是通过CCD或LDA得到的。首先平衡落在差分位置或强度敏感的光电检测设备单元上的反射光，以使SPR倾角定位在差分位置或强度敏感的光电检测设备的中心附近。因为差信号与SPR角度中的漂移成线性比例，而且可以在不产生饱和问题的情况下轻松放大，所以它提供了准确的SPR检测。我们注意到，Alexander，S.等人(J.应用物理1989，65，164)在原子力显微镜(AFM)中使用了双单元差分位置敏感的光电检测设备，在AFM中测量了由于AFM悬臂弯曲而产生的激光束偏移。在本应用中，测量的是由于SPR角度漂移，而不是由于激光束的物理移动而造成的强度分布。

发明内容

本方法通过将一个二极管激光器通过一个棱镜聚焦到覆有薄金属膜的透明板上来实现的。透明板由一个折射率与物质相匹配的光学棱镜支撑。调整入射光和差分位置或强度敏感的光电检测设备，使总内部反射的SPR倾角定位在光电检测系统光电单元的中央，对应于来自单元的零差分信号。在金属膜上，将带有控制金属膜电化学电压的必需电极的样本单元安装到其分子要被检测或研究或注入的物质之中。金属膜上分子的存在或分子中的变化会在SPR倾角中引起小的漂移，在差分位置或强度敏感的光电检测设备的差信号中产生易于放大和检测的变化，使放大差信号可以达到完全没有饱和问题发生的程度。

本发明的一个方面是得到一种用于在生物、生物化学和化学应用中检测SPR、具有更高的角度分辨率和更快的响应时间的方法和传感器。通过精确定位一个差分位置或强度敏感的光电检测设备，使其被对正中心并检测对应于表面等离子体共振的精确倾角，这样就提高了角度分辨率和响应速度。因此检测设备可以以几微秒的响应时间和大约10^-5度的角度分辨率来监视变化，其数量级优于以前的方法。

本发明的另外一个方面是得到一种不受环境光、光源强度波动、光电检测器和电子设备中噪声影响的SPR传感器和检测方法。

本发明的第三个方面是使用金属膜的电化学电压来调整SPR信号，例如使用锁定同步技术来提高信噪比。

本发明的另一个方面是将电化学测量，例如电流、电容及类似的测量，集成到SPR测量之中，以提供关于检测分子的重要补充信息并提高传感器及其应用中的专一性。例如，因为差信号与和信号之比与SPR角度的漂移成正比，所以这种方法提供了对SPR角度的精确测量。

本发明还有另外一个方面是能够将SPR仪器和基于SPR的传感器小型化，这对于提高仪器和传感器的热稳定性和机械稳定性及在环境领域中使用仪器和传感器的便利性都是重要的。基于本发明的SPR传感器由于只包括一个聚焦光源、一个棱镜和一个光电检测器，而且获得高角度分辨率不需要大的样本与光电检测器间距离，所以结构紧凑。

通过下面优选实施方案的详细描述，本发明的上述和其它方面、新特性和优点会变得明显。

附图说明

为了更好的理解本发明，现在将只通过例子的方式，并参考附图来讲述几个实施方案，其中，

图1是根据本发明一个例子的SPR传感器截面示意图。

图2是SPR中漂移之前和之后差分位置或强度敏感的光电检测设备两个单元的强度曲线图。首先两个单元的强度A、B是平衡的(实线下面的区域)。SPR中的漂移导致了两个单元的强度失衡(虚线)，这是光电检测器以差信号检测出的。

图3是显示差分位置或强度敏感的光电检测设备的差信号与和/总信号之比，(A-B)/(A+B)，与跨越大角度范围的实际SPR倾角位置之间的正比/线性关系的理论仿真。

图4-10说明了根据本发明的仪器的性能是可行的。明确的说：

图4是这种方法测量的磷酸盐缓冲液中的金膜在不同电压处的SPR倾角位置的试验校正—使用传统二极管阵列装置测量的同一样本的倾角位置，显示了两种方法极好的一致性。

图5是基于本发明的原型装置中由于热漂移和机械振动而产生的典型SPR偏移。

图6是当电极电压0.1V/s的速度在-0.2V(vs.Ag/AgCl参考电极)和0.3V之间扫描时的50mM磷酸溶液中覆有mercaptoproprionic核酸(MPA)的金电极的SPR倾角偏移。插图显示了同时记录的循环voltammogram。

图7是细胞色素c放入到溶液单元中之前、期间和之后SPR倾角偏移的时间函数。两个箭头分别标出了放入细胞色素和使用缓冲液替换细胞色素的时刻。

图8(a)是当电极电压以0.1V/s的速度在-0.2v与0.3V之间扫描时，50mM磷酸盐溶液中固定在覆有MPA的金电极表面上的细胞色素c的循环的voltammogram，其中箭头指向蛋白质的氧化和还原，对应于蛋白质的电子转移反应。图8(b)是SPR角度中由于氧化和还原而产生的相应的倾角偏移。

图9(a)是还原后的(实线)和氧化后的(虚线)细胞色素c的吸收光谱。图9(b)是当细胞色素c从氧化转换到还原状态时的实验SPR偏移(空心圆和实心圆)。纽结发生在吸收波峰550nm和520nm处。纯磷酸盐缓冲液中的偏移(空心方框)。图9(c)是基于吸收波峰和Kramers-Kronig关系的理论SPR偏移。

图10给出了50mM磷酸盐缓冲液中在固定在覆有MPA的金电极上的细胞色素c中引起构造变化的电子转移运动。当电压由0.3V步进到-0.2V并在-0.2V处停留10ms之后返回到0.3V时得到了SPR倾角位置响应。虚线符合简单的指数函数。

具体实施方式

请参看图1a，在一实施方案中，传感器包括一个来自源14的电磁放射会聚输入光束16，源14包括一个带有适当滤波器和平行光管的普通光源，或优选是一个二极管激光器，或类似的源。放射频率必须是能够产生表面等离子体振荡波这样的频率，而且虽然其它频率也是可以的，但实际上是在可见区之内或附近。合适的源包括一个5mW二极管激光器(λ＝635nm)，例如生产的日立牌激光器。当使用了激光器时，要通过合适的激光器控制器21来控制它。输入光束16通过半圆柱形(直角或等边)聚焦透镜13聚焦，棱镜13由玻璃或石英一类的透明材料制成，聚焦长度为f1。这束光束可以选择性的通过其它改变光束属性的设备，例如偏光器、狭缝、附加透镜或类似的设备。聚焦透镜将光线聚焦到透光组件——一般显示为1和3——与金属覆盖层或金属膜形式的反射层15之间接触面上的点17。

在此例中，透光/透明组件包括一个具有第一平面(其上带有或覆盖有反射层)的薄支撑板或支撑片3和一个具有弯曲的、球心位于点17处的第二球面的半圆柱形透镜或棱镜1。透光组件通常由玻璃制成。由于这个组件所产生的任何折射都可以忽略或补偿，所以该透光组件可以使用任何其它的几何结构、形状和尺寸。优选装置是透镜13发出的会聚光束的所有光线放射状的通过透光组件1和3，因此没有折射并中央聚焦于点17。透光组件1和3由支撑框架2连接。金属膜的材料一般是银或金，通常是通过蒸发作用加上的。为了照顾入射光束入射点处的细微运动，膜需要尽可能的一致。假定结构化的金属膜将提供最佳共振，在技术中有各种已知的方法，其中可以对透光组件进行预处理以提高金属膜的性能，特别是要控制此类膜形成不连续孤立区的自然趋势。在优选实施方案中，金属膜15是在放置在棱镜上的玻璃片3上形成的，并光学耦合到具有与液体薄膜或油膜相当的适合系数的棱镜，该棱镜位于板3和棱镜1相对面之间，如图19处所示。在本发明的实际实现中，金属层15可以以任何方式应用到上述片3的表面上。

传感器可以包括一个将要分析的样本引入到金属材料层之上的装置，其中包括参考电极和计数器电极。传感器还可包括一个将差信号在测量之前就近似为零的装置，使差信号可以放大到没有饱和问题发生的程度。该传感器在一尺度上小于2英寸。

在点17处从金属膜内部反射的光穿出滑片，以发散的、平面的、扇状光束形式传播，可以使用对放射敏感的差分位置或对强度敏感的光电检测设备12进行检测。放大从差分位置或强度敏感的光电检测设备接收到的差信号，放大差信号可以达到完全没有饱和问题发生的程度。差分检测设备可以包括一个大或小区域检测器，一个检测器组或类似的，例如单或双单元光敏检测器或类似的。出于费用、紧凑性和快速响应时间的原因，优选使用双单元光敏检测器。差分检测器产生带有穿过光束16位置的光强度变化的电输出信号指示；SPR效应指出在测试样本中由材料确定的特定角处会发生强烈的吸收。这些点信号被采样，数字化，并通过相关电路(没有必要给出)反馈到合适的分析装置(全体，22)，分析装置可以包括一个微处理器或大一些的计算机。

在一实施方案中，单元6由一种适合的惰性材料制造，例如聚四氟乙烯，放置在其中的要测试的分子样本附在金属膜之上。玻璃窗口7提供了一个观看聚焦激光点的窗口，并将溶液密封，与周围环境隔离，这对于对气体敏感的分子是重要的。单元有一个口5用于将溶液用氮气净化，两个口用于计数器9和参考电极11，这对于金属表面的电化学控制是必需的。它还有另外两个口4和10，其尺寸允许要测试的、包含分子的样本流入单元，与金属层接触并流出单元，因此使样本在测试过程期间能得到持续的补充，这确保了最大的灵敏性。其它供给样本的方法也是可用的。任何反射率会变化的材料都可以用作样本，例如一个分子或多个分子。

随着样本流过金属层15，层15的反射率变化/改变，在测试期间可随意的、持续不断的监测到。假设点17处的入射角是正确的，光束的应用会导致等离子振荡波的产生，因此会从入射光束释放能量并在特定入射角处导致输出光束强度衰减或急剧下降。检测差分检测设备输出的反馈电路能够检测到反射率下降的角度。这提供了一个高敏感度的输出。

在一实施方案中，差分检测设备的初始位置或入射角通过可移动框架20来调整，例如精确平移台或旋转台。初始位置设置如下：由差分检测设备12接收到的光信号之差(A-B)，A-B为零。这通常是在任何样本通过单元之前或当要与样本化合在一起的一些中性溶液、对照液或缓冲液通过单元或当测试样本通过单元时，但在任何反应发生之前产生的反射倾角的实际角度。即使是当样本开始流过金属层时，仍有足够的时间在折射率改变之前进行读数，这可以被用来调整和旋转差分检测设备12的正确位置。当A-B调整到零时，折射角位于差分检测设备中心附近。检测器的位置可以通过多种方法来操纵，优选是步进电机，这可以是22的一个组件。在另外一个实施中，差分检测可以在时间基线，而不是位置或空间基线上完成。

在进一步的实施方案中，使用电压控制或调整器单元和/或稳压器23来控制和调整金属膜电极的电化学电压。使用22一部分的锁定同步放大器检测对电化学电压交流调整的差信号响应或(A-B)/(A+B)，放大器极大的提高了信噪比，从而提高了角度分辨率。锁定同步放大器的幅度信息提供了SPR角度的信息，同时调整信号和差信号之间的相位提供了关于对电极电压的吸收分子响应的辅助信息。在金属膜和计数器一个电极之间流动的对应电流的直流和交流部分同时使用SPR信号进行测量。直流部分提供了吸收到电极之上的分子的普通电化学特性。交流部分被用来释放面间电容，这提供了关于被吸收分子的辅助信息。

图3是理论仿真，显示了光电检测器的差信号与和信号之比(A-B)/(A+B)和跨越大角度范围的实际SPR倾角之间的线性关系。仿真是使用矩阵方法(W.N.Hansen于美国的光学杂志，1969)来完成的。斜率为1.5左右。假设跨越小角度范围的倾角位置附近的反射率是抛物线，差信号(A-B)与和信号(A+B)之比表示为(A-B)/(A+B)，与斜率为2，角度范围为3度的SPR倾角位置的偏移成正比。斜率稍高于1.5是因为倾角形状不完全是抛物线。

图4使用本发明的方法，由本发明传感器测量的电压处磷酸盐缓冲液中金膜SPR倾角位置的实验校正—使用传统二极管阵列装置测量的同一样本的倾角位置，显示了两种方法之间良好的一致性。

如前述所令人赞赏的是，本发明传感器的响应时间和本发明方法只受限于差分检测设备及其相关样本和计算电路的特性。原型装置可以达到几μs范围的响应时间，只受限于非集成的前置放大器的带宽。商业可用的集成前置放大器提供了几皮秒范围内的响应时间。这些超快的响应时间使得能够监测和顾及在测试或分析期间可能发生的初始瞬变过程和其它的偏移，还可以进行快速的校准检查。本发明能够在如此短的时间级上测定反射率特性，使得它少于在样本相关成分和反射层之间完成化学链接所消耗的时间。

本发明传感器可以制造得非常紧凑，这有利的造成了由于热漂移和机械振动而产生的噪声的急剧减少。相反，现有技术传感器的高分辨率需要在光电检测器和样本之间有大的距离。具有1.8度角度范围和100Hz带宽的原型装置获得了10^-5度数量级的角度分辨率(图5)。使用二极管阵列或CCD检测器装置要获得同样的分辨率，样本和检测器之间的距离要达到几百米的数量级。因为分辨率与角度范围成反比，所以使用较小的角度范围可获得较高的分辨率。使用3mW激光器和具有10^-14W/Hz^1/2噪声等效功率(NEP)的民用光电检测器，对于角度范围3度，100Hz带宽，分辨率可期望达到10^-8度范围之内。本发明的高分辨率、快响应时间和紧凑的设计使得它在生物、生物化学和化学领域有着广泛的应用。

除了高分辨率、快响应时间和紧凑的设计，本发明的差分检测方法使系统不受如室内光这一类的外部光线扰动效应的影响，还将由于不可避免的光源强度波动和其它普通噪声而产生的问题减到最小。这避免了遮蔽装置的整个或部分组件、调整光源和将检测器和/或处理电路调整到特定响应的费用和不便。

下面的例子是用来进一步说明本发明的特定方面和实践的。这些例子描述了本发明的特定实施方案，但是不要把这看作是限制了本发明或附加权利要求的范围。

例1

SPR装置1

在一SPR装置中，一个BK7平圆柱透镜(Melles Griot)被用作棱镜。棱镜是闭合的，但不是完全的半圆柱体。在棱镜上，在超高真空中沉淀在BK7玻璃片上的50nm厚的金膜具有与液体相匹配的系数。为了减少表面污染，在每次实验之前都要在氢焰中对金膜进行热处理。5mW二极管激光器(l＝635nm，日立牌)使用国产的激光器控制器驱动，校准后使用14mm局部长度(局部长度)透镜通过棱镜聚焦到金膜上。由金膜反射的光使用安装在精确平移台的双单元光电二极管检测器(Hamamatsu公司，S2721-02型)来检测。来自两个单元(A和B)的光电流使用国产电路转换成电压。电路还计算差信号A-B和和信号A+B，然后将这两个信号发送到装配有16位数据获取板的PC计算机(国家仪器)。对于快速运动研究，将差信号和和信号发送到150MHZ数字示波器(Yokogawa，DL1520L)。在每次测量之前旋转棱镜，使得有一条黑线定位在激光器光束中心。黑线是由于表面等离子体振子在共振角度处发生光吸收而形成的。然后通过使用平移台来将光电检测器的位置调整到A-B等于零，以此来平衡落在光电检测器两个单元上的反射光。因为本方法敏感度高，所以由于机械压力而产生的A-B信号中的漂移在对准之后立刻清晰可见，但是典型在过了15-30分钟的一段时间后当适当的拧紧所有的螺丝时它会稳定下来。差信号与和信号之比与SPR角度偏移成线性比例，通过将A-B除以A+B得到数值。

在金膜上将聚四氟乙烯样本单元放置在容纳样本的溶液之中。单元有两个用于样本溶液流入和流出的口，和一个用于使用氮气或其它适合的惰性气体将氧气净化出溶液的口，这对于很多实验是必需的。为了控制金膜电极的电化学电压，分别使用铂和银作为计数器电极和准参考电极。其中参考电极和计数器电极是一个将要分析的样本引入到金属材料层之上的装置的元件。准参考电极对照着Ag/AgCl参考电极来校准。金膜的电化学电压使用EG&G 283型稳压器来控制。

例2

SPR装置2

另一个SPR装置将一个BK7平圆柱透镜(Melles Griot)用作棱镜。棱镜上的BK7玻璃片使用真空镀膜机镀上了一层45nm厚的银膜或金膜，其系数与液体相匹配。150W氙灯(凸肚窗)发出的白光发送到一个单色光镜。单色光镜发出的0.5nm带宽的单色光校准后由14mm局部长度透镜通过棱镜聚焦到银膜上。由银膜反射的光使用安装在精确平移台的双单元光电二极管检测器(Hamamatsu公司，S2721-02型)来检测。在每次测量中旋转棱镜，使得对应于SPR倾角的一条黑线定位在激光器光束中心。然后通过使用平移台将光电检测器的位置调整到A-B等于零，以此来平衡落在光电检测器两个单元上的反射光。SPR角度偏移与精确测量的差动角成正比。对电极电压调整的差信号响应是1的函数，使用锁定同步放大器(普林斯顿应用研究院，5110型)记录。通过光电检测器的和信号归一化的锁定同步放大器的输出与Δθ(λ)/ΔV成正比，Δθ(λ)/ΔV被用来根据Kramers-Kronig关系计算Stark频谱Δε/ΔV。

在银膜上将聚四氟乙烯样本单元放置在容纳样本的溶液之中。为了控制电极电压，分别使用铂和银作为带有一个稳压器(松树仪器)的计数器电极和准参考电极。准参考电极对照着(3M KCl中的)Ag/AgCl参考电极来校准。金膜的电化学电压使用EG&G 283型稳压器来控制。试验使用保持在0.2V、对电压在200Hz施以约10mV调整的电极进行引导。选择的电压要使银膜上不发生电化学反应。

例3

SPR上电子密度的影响

图6显示了随电极电压由-0.2V线性变化到0.3V(对照Ag/AgCl)，50mM磷酸盐缓冲液中覆有单层有机物(硫基丙酸或MPA)的金膜(电极)的SPR倾角位置。倾角位置每100mV的偏移大约0.0008度，这个偏移太小，使用传统SPR装置不容易检测。人们已经知道，通过改变金属膜中的电子密度，电极电压可以改变SPR倾角位置。由于MPA的存在减小了表面电容，所以这里测到的偏移远远小于对于裸露的金电极而言的偏移，因此对于一给定的电压改变，电子密度会改变。

例4

自组织单层上的蛋白质吸收

图7显示了由SPR检测到的，到覆有3-硫基丙酸的金电极之上的细胞色素蛋白质的吸收过程。测量由在不存在蛋白质的缓冲液中检测SPR倾角作为开始。然后通过单元的溶液注入口将20μL 20μM马心脏的细胞色素c(Cytc，从Fluka没有进一步净化就购买和使用)+50mM磷酸盐注入到溶液之中，随后连续的监测SPR倾角位置。倾角位置增加，在大约15分钟之后达到一个稳定值。用缓冲液替换Cytc溶液，倾角位置没有变回去，显示了吸收的蛋白质在表面上相当的稳定。

例5

氧化还原蛋白质中引起电子转移的构造变化

电极表面上存在吸收的Cytc时，电极电压的改变会导致在电极和吸收蛋白质之间通过氧化和还原作用进行电子转移。这种电子转移在同时测量的循环的voltammogram中显示为一对波峰(图8a)。当蛋白质由氧化状态转换到还原状态时，测量的SPR倾角位置显示出一个S形增长(图8b)。这个变化大约为0.006到0.01度，当将蛋白质转换回氧化状态时，它是可逆的。注意，变化中的错误主要是来自确定背景SPR偏移的不确定性，而不是SPR装置。SPR偏移可以归诸于蛋白质由于电子转移反应而引起的构造改变。这种改变会影响蛋白质层的厚度和折射率。根据洛伦兹-洛伦兹关系，蛋白质层折射率的变化(Δn)与厚度(Δd)的关系式是Δn/n＝-(1/6)(1-1/n²)(2+n²)Δd/d，其中n和d分别是蛋白质层的折射率和厚度。使用这种关系，我们可以估算，随着Cytc从氧化状态转换到还原状态，倾角0.006°-0.01°的增长对应于厚度约0.3A的降低。

例6

多波长SPR

使用多波长的入射光可以将吸收光谱法的能力集成到SPR之中。工作原理是以Kramers-Kronig关系为基础的，该关系将SPR测量的分子折射率与吸收光谱法测量的吸收系数联系了起来。使用这里提出的差分方法，可以将多波长SPR应用于细胞色素c的电子转移反应。因为还原的细胞色素c(实线)在520nm和550nm处有两个明确的吸收波峰，而氧化的细胞色素c(虚线)在波长窗口中相对较平(图9a)，所以要扫描500nm到700nm之间的波长。图9b中绘制了测量的共振角偏移—波长曲线。偏移远离吸收波峰，不是很依靠波长，它测量了蛋白质中的构造变化。但是，当波长接近吸收波峰时，如Kramers-Kronig关系所示，出现了两个有趣的、中心在520nm和550nm的纽结。在输入处使用吸收光谱，我们使用Kramers-Kronig关系已经计算了SPR倾角偏移(图9c)，发现在理论和实验数据之间有量级一致性(图9b)。

例7

蛋白质中构造变化的运动

借助于本SPR装置响应时间快的优点，已经检测到引起构造变化的电子转移运动。图10显示了由于电压由蛋白质处于氧化状态的0.3V突然步进到蛋白质转换到还原状态的-0.2V而得到的SPR倾角位置的响应。在步进0.3V之前，对于各个时间间隔，电压保持在-0.2V。可以研究的最短时间受限于电化学单元的响应时间，而不是SPR装置。在超过图10显示的时间窗口之上，对于还原，SPR响应可以使用时间常数约2.1ms的指数函数粗略的拟合，对于氧化则是时间常数为约2.5ms的指数函数。

上面的例子说明了本发明高分辨率SPR传感器和方法的新颖性和实用性。特此这里引用的每一个参考资料是由其整体参考资料合成的。前面对本发明优选实施方案的详细描述只是出于清楚理解的目的而给出的，从中不应该推断出不必要的限制，而对那些在本领域中的熟练人员来说修改是显而易见的。在上文中提出的本发明的变化可以在不脱离其范围的情况下进行，因此，只可以施加如附加权利要求中指出的限制。

Claims (38)

1.一种检测表面等离子体共振的方法，包括下列步骤：

(a)将电磁发射光束聚焦到金属材料层上，选择的样本材料放置在该层上；

(b)使用差分位置或强度敏感的光电检测设备来检测由金属材料层反射的电磁放射束；

(c)记录差分位置或强度敏感的光电检测设备得到的第一个A位置或强度信号的强度和第一个B位置或强度信号的强度；

(d)定位差分位置或强度敏感的光电检测设备，使其表面等离子体共振强度最小值接近差分位置或强度敏感的光电检测设备的中心，使A位置或强度信号与B位置或强度信号的差近似为零；以及

(e)随后检测由于表面等离子体共振角度偏移而产生的强度分布的变化。

2.根据权利要求1的检测表面等离子体共振的方法，其中差分位置或强度敏感的光电检测设备是双单元光电检测器，其中一个单元产生A位置或强度信号，另外一个单元产生B位置或强度信号。

3.根据权利要求1的检测表面等离子体共振的方法，其中差分位置或强度敏感的光电检测设备是单单元光电检测器，该检测器通过在交替的时间点上采样强度来产生A和B位置或强度信号。

4.根据权利要求1的方法，还包括在步骤(b)之前放大从差分位置或强度敏感的光电检测设备接收到的差信号的步骤。

5.根据权利要求4的方法，其中放大差信号是可以调整或变化的。

6.根据权利要求4的方法，还包括接着确定差信号、和信号和差信号与和信号比值的步骤。

7.根据权利要求6的方法，其中放大差信号和确定差信号、和信号和差信号与和信号比值是由一个电子单元完成的。

8.根据权利要求6的方法，还包括接着调整/控制金属材料层电化学电压的步骤。

9.根据权利要求8的方法，其中调整金属材料层电化学电压是由至少一个参考电极和至少一个计数器电极来完成的。

10.根据权利要求9的方法，其中参考电极和计数器电极是一个将要分析的样本引入到金属材料层之上的装置的元件。

11.根据权利要求4的方法，其中放大差信号可以达到完全没有饱和问题发生的程度。

12.根据权利要求8方法，还包括接着检测表面等离子体振子共振角度和电化学电流的步骤。

13.根据权利要求12的方法，其中检测表面等离子体振子共振角度和电化学电流是由至少一个锁定同步放大器完成的。

14.根据权利要求8的方法，其中检测表面等离子体振子共振角度和电化学电流与金属材料层的电化学电压的调整同时进行。

15.根据权利要求1的方法，还包括在步骤(e)之后计算面间电容的步骤。

16.根据权利要求15的方法，其中计算面间电容包括同时记录电化学电流的直流和交流部分。

17.根据权利要求15的方法，还包括同时记录差信号幅度和相位的步骤。

18.一种传感器，包括：

(a)一个传感器主体，由一种可透过电磁放射光的材料制造；

(b)一个金属材料层，覆盖该主体第一表面的至少一部分；

(c)一个装置，将要分析的样本引入到金属材料层之上；

(d)一个聚焦到该金属材料层上的电磁放射光束源；以及

(e)一个由金属材料层反射的电磁放射光束的差分位置或强度敏感的光电检测设备，差分位置或强度敏感的光电检测设备放置被定位以接收光束。

19.根据权利要求18的传感器，其中差分位置或强度敏感的光电检测设备包括至少一个光电单元。

20.根据权利要求18的传感器，其中将要分析的样本引入到金属材料层之上的装置是一个样本单元，包括：

(a)一个样本单元主体，其材料将样本与周围的空气隔离开来；

(b)一个样本单元主体中的窗口，其材料是可透过电磁放射光的；以及

(c)至少一个口，用于引入和移除样本。

21.根据权利要求18的传感器，还包括一个放大从差分位置或强度敏感的光电检测设备接收到的差信号的装置。

22.根据权利要求21的传感器，其中用于放大差信号的装置是可以调整或变化的。

23.根据权利要求21的传感器，还包括一个计算差信号、和信号和差信号与和信号比值的装置。

24.根据权利要求23的传感器，其中用于放大差信号的装置和用于计算差信号、和信号和差信号与和信号比值的装置是一个电子单元。

25.根据权利要求23的传感器，还包括一个调整/控制金属材料层电化学电压的装置。

26.根据权利要求25的传感器，其中用于调整金属材料层电化学电压的装置包括至少一个参考电极和至少一个计数器电极。

27.根据权利要求26的传感器，其中一个将要分析的样本引入到金属材料层之上的装置包括参考电极和计数器电极。

28.根据权利要求21的传感器，还包括一个将差信号在测量之前就近似为零的装置，使差信号可以放大到没有饱和问题发生的程度。

29.根据权利要求28的传感器，其中将差信号在测量之前就近似为零的装置包括将差分位置或强度敏感的光电检测设备安装在一个可以定位的移动部分之上，这样差分位置或强度敏感的光电检测设备检测到的差信号在测量之前就近似为零。

30.根据权利要求18的传感器，还包括一个检测表面等离子体振子共振角度和电化学电流的装置。

31.根据权利要求30的传感器，其中用于检测表面等离子体振子共振角度和电化学电流的装置包括至少一个锁定同步放大器。

32.根据权利要求25的传感器，其中用于检测表面等离子体振子共振角度和电化学电流的装置与调整/控制金属材料层电化学电压的装置同时起作用。

33.根据权利要求18的传感器，还包括一个计算面间电容的装置。

34.根据权利要求33的传感器，其中计算面间电容的装置包括一个同时记录电化学电流的直流和交流部分的装置。

35.根据权利要求32的传感器，还包括一个同时记录差信号幅度和相位的装置。

36.根据权利要求18-35之一的传感器，该传感器在一尺度上小于2英寸。

37.根据权利要求18-36之一的传感器在生物、生物化学或化学测试中的使用。

38.根据权利要求18的传感器，该传感器用于通过下列步骤确定表面等离子共振角度：

(a)计算差信号；

(b)计算和信号；

(c)计算校正曲线；

(d)基于校正曲线计算差信号与和信号之比。

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