EP1342071A1 - Procede de caracterisation d'une surface, et dispositif pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Procede de caracterisation d'une surface, et dispositif pour sa mise en oeuvre

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EP1342071A1
EP1342071A1 EP01270759A EP01270759A EP1342071A1 EP 1342071 A1 EP1342071 A1 EP 1342071A1 EP 01270759 A EP01270759 A EP 01270759A EP 01270759 A EP01270759 A EP 01270759A EP 1342071 A1 EP1342071 A1 EP 1342071A1
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EP
European Patent Office
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prism
angle
incidence
reflectivity
optical
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01270759A
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German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Guedon
Yves Levy
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Genoptics SA
Original Assignee
Institut d'Optique Theorique et Appliquee
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Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0016248A external-priority patent/FR2817962B1/fr
Priority claimed from FR0016247A external-priority patent/FR2817963B1/fr
Application filed by Institut d'Optique Theorique et Appliquee filed Critical Institut d'Optique Theorique et Appliquee
Publication of EP1342071A1 publication Critical patent/EP1342071A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/552—Attenuated total reflection

Definitions

  • the present invention relates to a method for characterizing a surface, and to a device making it possible to implement this method. This process allows in particular a qualitative and / or quantitative measurement of interactions which can be physical, chemical, biochemical or biological.
  • the method of the invention allows the characterization of the surface of a sensitive layer, deposited on the basis of an optical prism, according to a technique based on the analysis of the variation of the reflectivity of the prism - sensitive layer interface. .
  • This reflectivity is likely to vary with the angle of incidence of a light beam moving in the prism towards a part of the interface corresponding to a part to be characterized of said surface.
  • This reflectivity also varies as a function of the optical thickness of the sensitive layer, so that the method of the invention makes it possible in particular to characterize the evolution of zones of the sensitive layer whose optical thickness is likely to vary over time .
  • the part of the interface "corresponding" to the part to be characterized is of course the part which is opposite the part of the surface to be characterized.
  • the method of the invention can be used in particular either in techniques based on the resonance of surface plasmons, or in techniques based on interferometry and using the coupling between a prism and a waveguide.
  • the invention particularly relates to a method for characterizing the surface of a sensitive layer, said surface comprising active areas whose optical thickness is likely to vary over time, said sensitive layer being deposited on the basis of a optical prism, said method using a technique based on the analysis of the variation of the reflectivity of the prism-sensitive layer interface, in which; a) a light beam is brought into the prism through an entry face collimated with an angle of incidence allowing total reflection on the basis of the prism, said beam illuminating a fixed part of the interface corresponding to a part to be characterized, called useful part, of said surface, and the reflected beam emerging as an emerging beam by the exit surface of the prism, b) the useful part is scanned at an angle, by varying the angle of incidence of said beam, so as to identify an incidence for which the reflectivity of at least one part, or all of the active areas is minimum, c) an optimal angle of incidence is determined, for which the detection sensitivity of the active areas is maximum, d) the incidence is adjusted to the
  • the prism is used, in the method and the device of the invention, as a coupling prism, which uses the phenomenon of total reflection on an interface.
  • the surface to be characterized of the sensitive layer is that of the external face of the sensitive layer, in contact with the external medium.
  • the sensitive thin layer can be deposited either on the base of the prism, or on a flat transparent blade with parallel faces, having the same index or an index close to that of the prism, and fixed, or capable of being fixed, on the base of the prism, with the sensitive layer deposited on the external face, which is not in contact with the base of the prism.
  • This external face can be considered as the true base of the prism in such a case, when it is fixed to the prism.
  • the sensitive layer can be a thin metallic layer, and in this case the method of the invention uses the phenomenon of surface plasmon resonance.
  • the metals used mention may in particular be made of gold and silver.
  • An intermediate metallic thin layer, for example chromium, can be used to improve the adhesion of the gold layer to the glass of the prism.
  • the metallic sensitive layer can be deposited on the base of the prism, or on a thin layer, deposited on the base of the prism, with a dielectric of low index (index equal to or close to that of the prism).
  • the sensitive layer can also be a thin, transparent layer with a high index dielectric capable of serving as a waveguide.
  • two thin dielectric layers are deposited on the base of the prism, first a thin layer (for example of silica) serving as a spacer medium, of intermediate index between that of the prism and that of the guiding layer, then the guiding layer, of high index.
  • the guiding layer can be made for example with titanium or osmium oxides, stoichiometric or non-stoichiometric.
  • the guide layer can itself be covered with a thin metallic layer.
  • the method of the invention makes it possible in particular to use the waveguide as a resonant mirror system which requires a coherent light source.
  • the principle and the applications of the resonant mirror are known; see for example R. Cush et al, Biosensors & Bioelectronics 8, 347-353 (1993); P. E. Buckle et al, Biosensors & Bioelectronics 8, 355-363 (1993); S. F Bier, Sensors & Actuators B, 29, 37-50 (1995); C. Stamm et al, Sensors & Actuators B, 31, 203-207 (1996); A. Bernard et al, Eur. J. Biochem., 230, 416-423 (1995).
  • the content of these literature documents, as well as the documents mentioned below, is incorporated by reference into the present description.
  • the thin layers used in the implementation of the process of the invention can be deposited according to known methods, for example by vacuum evaporation, sputtering, CND, MOCVD, etc.
  • the method of the invention can be used in particular by exploiting the known phenomenon of surface plasmon resonance (RPS). This phenomenon is observed when a light beam undergoes a reflection at the glass-metal interface of a thin metallic layer, deposited on the base of the prism.
  • RPS surface plasmon resonance
  • optical phenomenon of surface plasmon resonance was discovered around thirty years ago (E. KRETSCHMA N & H. RAETHER; Z.Natiirforsch., 23a (1968), 615-617) and was used first place for the quantitative characterization of non-organic thin layers (WP CHEN & JM CHEN, J. Opt.Soc.Am, 71 (1981), 189-191).
  • the optical principle is based on access to the variation of the optical thickness (product of the refractive index by the geometric thickness) via the measurement of the variation of reflectivity on a metal / dielectric interface generated by the fixing of material. on the external face of a metallic layer.
  • An advantage of the method and the device of the invention lies in the fact that it is possible to locally deposit different ligands, on a regular basis, on the sensitive layer, according to an ordered system (for example, matrix or hexagonal) in which each deposit confined to a small area, or spot, is spatially identifiable (so-called “addressed” ligands).
  • an ordered system for example, matrix or hexagonal
  • each deposit confined to a small area, or spot is spatially identifiable (so-called “addressed” ligands).
  • the method of the invention can still have the characteristics, taken individually or, where appropriate, in combination, as defined in the claims.
  • the reflectivity as a function of time is measured, either continuously or at predetermined intervals.
  • the variation in reflectivity is proportional to the number of molecules which are fixed on the studs, this fixing corresponding to an increase in thickness on the stud considered.
  • the useful part of the sensitive layer can be fixed, for example: - antigens (for the search for specific antibodies),
  • the method of the invention can also be used to study any interactions between the immobilized molecules and the analytes, including cells.
  • the process of the invention can also be used for the screening of small molecules which are immobilized on the active layer (for example oligosaccharides) which can inhibit the signaling or enzymatic role of a protein.
  • the active layer for example oligosaccharides
  • the analyte is then the protein.
  • Small molecules are selected by biological or biochemical affinity for proteins or cells.
  • the invention also relates to an imaging device making it possible to implement the method of the invention.
  • This device can be used in particular for imaging the surface of a sensitive layer carrying multiple organic sensors, that is to say a surface on which immobilized one or more populations of ligands.
  • These sensors can be deposited on the sensitive layer in the form of pads (or spots) forming a matrix of addressed ligands. These spots can be formed either by deposits on the surface of the sensitive layer, or by filling wells made on the surface of the sensitive layer (for example by laser abrasion).
  • the device of the invention comprises an imaging device, making it possible to implement the method of any one of the preceding claims, including:
  • an optical prism having an entry face, an exit face and a base provided with a sensitive layer, said prism being characterized by its angle at the top and by the refractive index of the material which constitutes it, - a first afocal optical conjugation system, disposed on the side of the entry face of the prism, and whose optical axis, fixed relative to the prism, is oriented so that a collimated incident light beam having passed through it goes towards said entry face, refracts then strikes the base of the prism where it undergoes a total reflection and emerges after refraction on the exit face by forming an emerging beam, said first conjugation system having an orientation and an opening such that said incident beam refracted on the entrance face comes to illuminate the totality of at least a part called useful of said sensitive layer, and to undergo a total reflection therein when the direction of the incident beam varies, on both sides tre of said optical axis, over an angular range of at least 10 ° in total, said useful part containing active areas
  • a second afocal optical conjugation system arranged on the side of the exit face of the prism and whose optical axis, fixed relative to the prism, is oriented so that an incident beam parallel to the optical axis of the first conjugation gives an emerging beam parallel to the optical axis of the second conjugation system
  • a detection system having a plane sensitive surface which is capable of receiving and analyzing the light having passed through said second conjugation system, and which is perpendicular to the optical axis thereof, in which: (i) said second the conjugation system has an opening such that all of the light from the useful area passes through it when the direction of the incident beam varies over said angular range, and the second conjugation system is such that all of the light from of the useful area illuminates the sensitive surface of the detection system, and (ii) the apex angle and the prism index are such that when the direction of the incident beam is parallel to the optical axis of the first conjugation system, the intermediate image of the useful part, through the exit face of the prism, which constitutes the object for the second detection system, is perpendicular to the optical axis of it.
  • the angular scanning which must be carried out in order to be able to observe the resonance at various points in the active zone, and its displacement during the evolution of the system over time, varies in particular as a function of the metal, of the glass, of the length of wave, etc. It is generally at least around 10 °.
  • the resonance for gold is broken, on all the parts of the sensitive layer bearing a stud, and the resonance then shifts towards the decreasing external angles of incidence.
  • the resonance shifts by about 2 degrees. If the sensitive layer is then brought into contact with a fluid containing analytes capable of interacting with the biological species immobilized on the pads, a new shift in resonance can be observed which can go up to approximately 4 degrees.
  • the light source is a coherent or non-coherent source. It is necessarily consistent in the case of a waveguide device.
  • the collimation system can be any conventional optical system making it possible to transform a divergent light beam into a parallel beam.
  • the deflector optical system comprises for example a rotating plane mirror, which can be mounted on a stepping motor or a direct current motor.
  • a rotating plane mirror which can be mounted on a stepping motor or a direct current motor.
  • One can also use a galvanometric type mirror. It is known that when a rotating mirror rotates by a given angle, the reflected ray from a fixed incident ray is deviated by an angle twice from said given angle.
  • the rotating plane mirror can in particular be able to pivot about an axis parallel to an edge of the prism. The line of intersection of the two planes containing the entry and exit faces of the prism respectively is called the edge of the prism.
  • the device of the invention may comprise a polarizing system, arranged for example between the collimation system and the rotating mirror, and making it possible to polarize the light parallel to the edge of the prism.
  • the polarizing system is for example composed of a simple polarizer or a polarization splitter cube.
  • a second polarizer is of course necessary after the prism.
  • the device of the invention may also have the characteristics, taken in isolation or, where appropriate, in combination, as defined in the claims.
  • the term “dioptric system” denotes a lens or a doublet.
  • the device of the invention makes it possible to perform the detection at the best angle of incidence of the variation in optical thickness (product of the geometric thickness by the refractive index of the material) on the metal-external environment interface, without having to modify the position of the elements of the device which are all fixed with respect to each other, with the exception of the rotating mirror. It is thus very easy to vary the angle of incidence during a preliminary study, by actuating the only rotating mirror, to determine for each angle of incidence the reflectivity of the sensitive area, and we can then carry out the measurements. proper by immobilizing the rotating mirror in the - position corresponding to this predetermined optimum angle of incidence.
  • the optical imaging device of the invention is such that the image of the useful area of the thin layer metal occupies a maximum surface of the CCD detection matrix, so that it is the entire surface of the useful area of the metal layer which can be analyzed simultaneously using the CCD matrix.
  • the detection device can receive all the light rays coming from the image of the useful surface of the metallic thin layer, although the imaging system and the detection system are fixed relative to the prism, is that the device of the invention comprises an optical conjugation system such as the beam which, after entering the prism, strikes the thin metallic layer, illuminates the entire useful surface of the CCD matrix, and this whatever the angle of incidence of said beam on said angular range up to at least about 16 °.
  • an optical conjugation system such as the beam which, after entering the prism, strikes the thin metallic layer, illuminates the entire useful surface of the CCD matrix, and this whatever the angle of incidence of said beam on said angular range up to at least about 16 °.
  • the conjugation system can for example consist of a first focal lens 80 mm and diameter 31.5 mm and a second focal lens 65 mm and diameter 25 mm (the assembly having an opening of 2, 6), said lenses being arranged in such a way that the image of the useful part by the exit face of the prism is approximately in the focal plane object of the first lens, that the focal plane image of the first lens is coincident with the object focal plane of the second lens and finally that the CCD matrix is located in the image focal plane of the second lens; in this way, an afocal device has been created which combines.
  • field lens a third lens
  • the angle at the top and the index of the prism are chosen to be so that the intermediate image of the useful area formed in the prism (i.e. the image of the useful surface through the plane diopter formed by the exit face of the prism, and which constitutes the object for the optical imaging system receiving the beam emergent) provides in the optical imaging system an image coinciding with the focal plane of the detection system (CCD matrix), or an image very close to this plane and parallel to it, or having an inclination relative to this plane low enough to avoid blurring the image over the entire surface.
  • CCD matrix focal plane of the detection system
  • any optical imaging system has a certain depth of field, that is to say a longitudinal range, along the optical axis defined by the detector (this optical axis being perpendicular to the plane of the detector) for which the the image will appear sharp on the detector.
  • the depth of field depends directly on the focal length of the optical system and its aperture.
  • the depth of field increases with the number of apertures (ratio of the focal length to the diameter of an optic).
  • the number of openings must also be as small as possible to allow a maximum of rays to pass through the system, and thus allow significant angular acceptance.
  • the inclination of the image of the useful area by the exit face of the prism relative to a plane perpendicular to the optical axis must be sufficiently small so that it is not not outside the depth of field defined by the detection system.
  • the inclination of the incident beam in this system makes it necessary to straighten the image by an appropriate optical device, which can be achieved either by tilting the optics of the imaging system, or by tilting the detection system ( CCD camera) in order to have the image of the entire net surface on the CCD detector.
  • the problem of the inclination of the optic implies that said optic is very open to let all the rays pass through this optic, since the angles involved can be relatively large; for example, for an isosceles prism with an index 1.515 and an angle at the apex 60 °, this requires an opening number of the detection system of 0.55, which is prohibitive because such a system has many aberrations and very shallow depth of field.
  • the tilt of the camera would cause a loss of sharpness due to the fact that the system would no longer work under good imaging conditions, because we can no longer speak of planarism.
  • the originality of the prism and of the optics used in an embodiment of the device of the present application resides in the fact that, whatever the angle beam incidence at the prism / sensitive layer interface (within the variation limits indicated for the angle of incidence on the entry face of the prism), the inclination of the intermediate image by the face output from the prism varies little and remains almost perpendicular to the optical axis of the detection system.
  • a completely reflected ray starting from the center of the useful area will present at the exit of the prism a small angle compared to the optical axis of the imaging system, while the corresponding image point on the detector will remain approximately in the limits of the depth of field defined by this system.
  • a major advantage of the device of the invention is that all of the optical elements are fixed (with the exception of the rotating mirror) and the optics are not very open.
  • FIG. 1 represents a diagram of the device according to the invention
  • FIG. 1 shows a diagram of the reaction cell according to the invention.
  • the device according to the invention comprises:
  • reaction cell 3 comprising at least one prism 4, - an imaging and detection system 5 of the beam reflected by the base of the prism.
  • the non-coherent light source 1 is for example a light emitting diode of narrow spectral width. It may for example be a light-emitting diode with a wavelength of 660 nanometers and a spectral width of 30 nanometers.
  • the beam emitted by the light source 1 is collimated by a collimation system 2.
  • This collimation system 2 is for example a system of two microscope objectives making it possible to make the light beam parallel.
  • the light is then polarized by a polarizer 6 in order to be able to excite the surface plasmon.
  • This polarized light illuminates the entry face of a glass prism 4 of the reaction cell 3.
  • the polarized light is reflected by an oscillating galvanometric mirror 7 towards the entry face of the prism 4 such as shown in FIG. 1.
  • the oscillating mirror 7 is conjugated on the base of the prism using two lenses 8 and 9. It is thus possible to vary the angle of incidence of the beam on the prism by the rotation of the mirror oscillating 7 around an axis 7a perpendicular to the plane of the drawing.
  • the oscillating mirror 7 undergoes a partial rotation, controlled for example by a low frequency generator.
  • the rotational movement of the oscillating mirror rotation device 7 can be discretized using a continuous component in order to be able to fix the angle at which one wishes to carry out the experiments.
  • the diameter of the mirror 7 is such that it allows the entire incident beam to be reflected on the prism 4.
  • the diameter is at least 10 mm.
  • the total travel of the mirror 7 is 16 ° for a frequency of 300 megahertz.
  • the oscillating mirror 7 has a continuous stroke with a fixed equivalence.
  • Figure 1 there is shown in solid lines the limits of the light beam for the position of the mirror 7 shown, and in broken lines the extreme limits of this beam when the mirror 7 occupies the extreme positions of its angular travel.
  • the angle of incidence of the beam reflected by the mirror 7 on the prism 4 can be determined in two different ways.
  • the part of the beam reflected by the entry face of the prism is collected by a strip of CCD charge coupled circuits 10 of sufficient length.
  • This CCD strip 10 makes it possible to detect the incidence of the beam.
  • the beam thus reflected by the entry face of the prism is focused on the CCD strip 10 using a lens 11 whose focal length is chosen so as to use the entire surface of the strip 10.
  • the rotation of the oscillating mirror 7 is ensured by a motor making it possible to determine the position of incidence for each position of the mirror.
  • a motor making it possible to determine the position of incidence for each position of the mirror.
  • the reaction cell 3 comprises at least one glass prism 4 whose geometry and index are such that the intermediate image of the object plane in the prism 4 is almost parallel to the detection plane of the imaging and detection system 5 .
  • the prism is made of glass of index 1.8 and has the characteristic of an apex angle of 40 °, a base of 10 mm in width and 25 mm in height. The distance between the two parallel faces of the prism is 8 mm.
  • a glass slide of 12 with the same index as the prism 4 is fixed to the base of the prism by means of an index adaptation oil.
  • a thin layer of chromium 13, a thin layer of gold 14, and a layer to be characterized 15 are successively deposited.
  • the layer of chromium 13 ensures the adhesion of the gold layer 14 on the glass slide 12 in the presence of an aqueous medium.
  • the thickness of the thin layer of chromium 13 is for example between 1.5 and 2 nanometers.
  • the thickness of the thin layer of gold 14 is for example between 40 and 50 nanometers and preferably of the order of 45 nanometers.
  • the layer to be characterized is, for example, an organic layer 15.
  • the organic layer 15 can be deposited in the form of a continuous layer or in the form of spots or studs, as indicated above.
  • a continuous layer containing a single kind of ligand (for example an antibody), it solutions of analytes (for example peptides for the search for minotopes) should be deposited from time to time in the form of spots, then rinsed to remove the analytes which are not specifically bound.
  • analytes for example peptides for the search for minotopes
  • the sensitive layer in contact with a fluid containing an analyte to be studied.
  • the ligands are immobilized on the gold layer in a known manner.
  • This polymer has the advantage of being very stable, which makes it possible to reuse the organic layer 15 comprising the probes (immobilized oligonucleotides) several times.
  • the production and deposition of such a layer of polypyrrole grafted onto a layer of gold are for example described in patents EP 0 691 978 and FR 2 789 401.
  • This tank 16 is for example made of Teflon and makes it possible to pass solutions of analytes using one or more pipes 17.
  • a peristaltic pump 18 with variable flow rate can then be used to circulate these solutions.
  • the peristaltic pump 18 meets the following criteria:
  • the entire reaction cell 3 (prism 4 and tank 16) can be enclosed in an adiabatic enclosure 19 shown in FIG. 2, in order to control and fix the temperature of the system and of the products injected.
  • the temperature will for example be maintained at 37 ° in order to allow the detection of any type of biological molecules.
  • the adiabatic enclosure 19 preferably comprises an opening (not shown) allowing easy access to the detection cell 3.
  • a heating base 20 such as for example a copper resistor, to which the Teflon reaction vessel 16 will be fixed.
  • This base 20 is covered with a cover 21 encompassing the entire detection cell 3.
  • Side portholes 22, 23 are provided in the cover 21 in order to allow the light beams to pass on either side of the prism. They are for example made of glass or any other material allowing light beams to pass through without disturbing them.
  • a winding (not shown) wound around the pipe 17 of the tank 16 keeps the products injected at the temperature of the cell.
  • An imaging and detection system 5 is arranged on the side of the outlet face of the prism 4 in order to recover the beam reflected by the base of the latter.
  • This system includes an afocal conjugation and magnification system 24 and a CCD camera 25.
  • the afocal magnification system 24 makes it possible here to enlarge the image of the useful area of the gold blade 14 on the entire CCD camera 25.
  • the useful area of the gold strip 14 is for example of the order of approximately 25 mm 2.
  • the lens 26 is arranged so that the image of the useful part of the active layer after refraction on the exit face of the prism is located in the object focal plane of 26. As a result, the image is formed in the focal plane image of the lens 27.
  • the conjugation system can also consist, for example, of a first focal lens 80 mm and of diameter 31.5 mm, and of a second focal lens 65 mm and of diameter 25 mm (the assembly having an opening of 2.6).
  • a first focal lens 80 mm and of diameter 31.5 mm and of a second focal lens 65 mm and of diameter 25 mm (the assembly having an opening of 2.6).
  • commercial optical calculation software such as CODE V (Optical Research Associates) can be used.
  • the CCD camera 25 (or simply a CCD matrix) can for example have a sensitive surface of 6.4 mm x 5.8 mm composed of 768 x 576 pixels.
  • the CCD detector can also be, for example, a 1.5 inch format remote head camera, with a 6.4 x 4.8 mm 2 sensitive surface, comprising 751 x 582 active pixels, with a signal sampled on 8 bits, or else a compact camera 2/3 inch format, sensitive surface 8.57 x 6.86 mm 2 , comprising 1280 x 1024 active pixels with a 12-bit sampled signal. These are commercial cameras.
  • the method of using said device comprises the following steps:
  • the device is then used to characterize the surface of the active areas to be characterized of layer 15.
  • the device can be applied to the study of molecular interactions.
  • the step of measuring the reflectivity is carried out simultaneously with the introduction into the reaction cell 3 of (unlabeled) analytes, including the interactions with the ligands of the organic layer 15 are to be analyzed. The evolution of the interactions between the organic layer 15 and the analytes introduced is thus measured.
  • the imaging and detection system 5 makes it possible to measure the optical thickness, product of the geometric thickness and the refractive index of the medium, at all points of the useful part of the gold layer 14.
  • the system 5 makes it possible to determine the geometric thickness of each point of the layer 14 and therefore to check the state of surface of it.
  • the contrast measured during scanning also serves as a reference level for real-time measurement.
  • the imaging and detection system 5 measures the variation of the reflectivity relative to the reference level recorded during the angular scanning. This measurement of the variation of the reflectivity is carried out at every point of the useful part of the gold layer 14.
  • the reflectivity varying according to the molecular species present on the surface allows a qualitative analysis by determining the different interactions between the organic layer 15, the gold layer 14 and the molecules introduced.
  • a positive variation in the reflectivity signifies the presence of analytes interacting with the ligands of the organic layer 15, a null variation signifying the absence of interacting analyte.
  • a negative variation then represents on the contrary a loss of material, that is to say a degradation of the layer 15.
  • Measuring the amplitude of the variation in reflectivity in real time allows access to the number of analyte molecules per unit area and therefore to the concentration at each point (on each spot) of the layer d or 14 of the analyte molecules introduced.
  • the device according to the invention therefore also allows a quantitative analysis of the molecules having interacted with the ligands of layer 15.
  • the number of probes (ligands) per spot is sufficiently high to be distinguished from the background noise of the measured signal, without the probes being too close to each other. Indeed, a large number of probes results in a large steric hindrance and hinders the interaction of molecules with neighboring probes.
  • the interactions are studied under non-selective hybridization conditions, for example at a temperature of the order of 37 ° C., so that all of the interactions between the reagents can be observed simultaneously.
  • the device makes it possible to follow several hundreds of molecular interactions at the same time and without markers. In particular, it is capable of discriminating the presence of a point mutation within a DNA fragment.
  • the discrimination technique is based on the fact that the molecular association can either be total if the DNA sequence is strictly complementary to that of the oligonucleotide, or partial if the DNA sequence has a mutated base.
  • thermodynamics applied to DNA shows that depending on the type of mutation, for a fixed location in the sequence, the optical thickness varies. It follows that the device can precisely determine the type of mutation. Under non-selective conditions, if a normal sequence and the three sequences carrying the mutation of one of the bases of said sequence, that is to say the four sequences of which one of the bases has been mutated, are deposited in the form of four different pads on the gold layer 14, the device can measure a different signal for each of the immobilized sequences. Indeed, whatever the sequence of the fragment to be analyzed, the device measures a total interaction and three partial interactions.
  • the device according to the invention following in real time and directly the molecular interactions, it is not necessary to carry out the measurement at a temperature promoting a single interaction as in the case of the methods using fluorescent markers.
  • lithium niobate LiNbO (supplier: CRYSTAL TECHNOLGY, Inc., Palo Alto CA).
  • GaAs GaAs (supplier: AXT, Inc., Palo Alto CA).
  • the dimensioning of the prisms was carried out using the MATLAB software (MATH WORKS company), which makes it possible to establish appropriate algorithms, according to known methods. For a given index n, there is at least an angle at the top allowing the intermediate image of the base of the prism across the exit face to be perpendicular to the optical axis of the second afocal conjugation system. We then seek in the same way the couples (index - angle at the top) which give a minimum angular clearance for this intermediate image.
  • the prisms can also be produced using single crystals such as lithium tantalate (LiTaO 3 ), lithium niobate (LiNbO 3 ).
  • birefringent materials that is to say that they may have a different index depending on the state of light polymerization.
  • This drawback can be overcome for example by orienting the axes of the crystal so that the effective refractive index, in transverse magnetic polarization, is the same regardless of the angle of incidence of the beam on the useful area.
  • Another solution is to use semiconductor materials such as gallium arsenide, germanium (index of the order of 4) or even silicon (index of approximately 3.9).
  • the first step is to study the reflectivity of the sensitive area as a function of the external incidence, to determine the angle where to stand to observe the hybridizations with maximum sensitivity.
  • the complementary sequence of CP is injected into a hybridization buffer at 22 ° C (BPS, 137 mM NaCl), in order to demonstrate that only the CP pad reacts, which is the case.
  • BPS 137 mM NaCl
  • the experiment having guaranteed by the preceding stage that the system is selective, one injects then, after having regenerated the system with a 50 mM sodium hydroxide solution, the complementary sequence of WT, which reacts very well with the WT plot, little with the two plots corresponding to the mutated sequences and not at all with the CP plot.
  • bovine serum albumin is injected, which limits the passive adsorption of molecules not specifically recognized, until saturation.
  • the hCG is then injected into a PBS buffer.
  • the stud carrying only polymer has zero kinetics (no change in reflectivity as a function of time).
  • the pad carrying the anti-rabbit antibody has a decreasing kinetics; this means that the antibodies, weakly bound to the polymers, are desorbed and evacuated from the reaction vessel.
  • the two other studs each have an exponential kinetics, a sign of the recognition of hCG by the antibodies.
  • the two anti-hCG antibodies being different, there is a difference in the slope at the origin of the interaction kinetics. Indeed, their affinity for hCG is not the same. For one of the antibodies, it has been deduced from the reflectivity results that the affinity is 8 ⁇ 10 ⁇ 10 , ie the same value as that measured. independently by an ELISA technique.
  • the invention also relates to the application of the method described above to the qualitative and quantitative measurement of molecular interaction as described in the present application.

Abstract

Procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible déposée sur la base d'un prisme optique, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel on fait entrer dans le prisme un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, on effectue un balayage en angle de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité des zones actives est minimum, on détermine un angle d'incidence optimal pour la sensibilité de détection des zones actives, on règle l'incidence à la valeur optimale, et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie; et dispositif pour mettre en oeuvre ce procédé.

Description

Procédé de caractérisation d'une surface, et dispositif pour sa mise en oeuyre La présente invention se rapporte à un procédé de caractérisation d'une surface, et à un dispositif permettant de mettre en œuvre ce procédé. Ce procédé permet notamment une mesure qualitative et/ou quantitative d'interactions qui peuvent être physiques, chimiques, biochimiques ou biologiques.
La plupart des procédés existants, dans ce domaine, utilisent des marqueurs fluorescents pour révéler les interactions moléculaires et nécessitent de travailler dans des conditions spécifiques. Ces conditions spécifiques ne permettent pas d'analyser plusieurs types d'interaction simultanément. Au contraire, le procédé de l'invention permet notamment de suivre en temps réel, et sans marqueurs, jusqu'à plusieurs centaines d'interactions moléculaires, à la fois qualitativement et quantitativement.
Le procédé de l'invention permet la caractérisation de la surface d'une couche sensible, déposée sur la base d'un prisme optique, selon une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible. Cette réflectivité est susceptible de varier avec l'angle d'incidence d'un faisceau lumineux se dirigeant dans le prisme vers une partie de l'interface correspondant à une partie à caractériser de ladite surface. Cette réflectivité varie également en fonction de l'épaisseur optique de la couche sensible, de sorte que le procédé de l'invention permet notamment de caractériser l'évolution de zones de la couche sensible dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps. La partie de l'interface « correspondant » à la partie à caractériser est bien entendu la partie qui est en regard de la partie de la surface à caractériser.
Le procédé de l'invention peut être utilisé notamment soit dans les techniques fondées sur la résonance des plasmons de surface, soit dans les techniques fondées sur Pinterférométrie et utilisant le couplage entre un prisme et un guide d'ondes.
L'invention a notamment pour objet un procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ladite couche sensible étant déposée sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel ; a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, appelée partie utile, de ladite surface, et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la surface de sortie du prisme, b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins une partie, ou de la totalité, des zones actives, est minimum, c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la sensibilité de détection des zones actives est maximale, d) on règle l'incidence à la valeur optimale déterminée à l'étape précédente, et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du faisceau émergent provenant de la partie utile. Un faisceau collimaté est un faisceau dont tous les rayons sont parallèles.
Le prisme est utilisé, dans le procédé et le dispositif de l'invention, comme un prisme de couplage, qui utilise le phénomène de réflexion totale sur une interface.
La surface à caractériser de la couche sensible est celle de la face externe de la couche sensible, en contact avec le milieu extérieur. En pratique, la couche mince sensible peut être déposée soit sur la base du prisme, soit sur une lame transparente plane à faces parallèles, ayant le même indice ou un indice voisin de celui du prisme, et fixée, ou apte à être fixée, sur la base du prisme, avec la couche sensible déposée sur la face externe, qui n'est pas en contact avec la base du prisme. Cette face externe peut être considérée comme la véritable base du prisme dans un tel cas, lorsqu'elle est fixée au prisme.
La couche sensible peut être une couche mince métallique, et dans ce cas le procédé de l'invention utilise le phénomène de résonance des plasmons de surface. Parmi les métaux utilisés, on peut citer notamment l'or et l'argent. On peut utiliser une couche mince métallique intermédiaire, par exemple de chrome, pour améliorer l'accrochage de la couche d'or sur le verre du prisme. On peut aussi déposer sur le prisme une couche d'argent elle-même recouverte d'une couche d'or, ce qui permet de protéger l'argent contre l'oxydation.
La couche sensible métallique peut être déposée sur la base du prisme, ou sur une couche mince, déposée sur la base du prisme, d'un diélectrique de faible indice (indice égal ou voisin de celui du prisme).
La couche sensible peut aussi être une couche mince, transparente, d'un diélectrique d'indice élevé capable de servir de guide d'onde. Dans ce cas, on dépose sur la base du prisme deux couches minces de diélectriques, d'abord une couche mince (par exemple de silice) servant de milieu espaceur, d'indice intermédiaire entre celui du prisme et celui de la couche guidante, puis la couche guidante, d'indice élevé. La couche guidante peur être réalisée par exemple avec des oxydes de titane ou d'osmium, stoechiométriques ou non stoechiométriques. La couche guidante peut elle-même être recouverte d'une couche mince métallique.
Lorsque la couche sensible est une couche de diélectrique servant de guide d'onde, le procédé de l'invention permet notamment d'utiliser le guide d'onde comme un système à miroir résonant qui nécessite une source lumineuse cohérente. Le principe et les applications du miroir résonant sont connus ; voir par exemple R. Cush et al, Biosensors & Bioelectronics 8, 347-353 (1993) ; P. E. Buckle et al, Biosensors & Bioelectronics 8, 355-363 (1993) ; S. F Bier, Sensors & Actuators B, 29, 37-50 (1995) ; C. Stamm et al, Sensors & Actuators B, 31, 203-207 (1996) ; A. Bernard et al, Eur. J. Biochem., 230, 416-423 (1995). Le contenu de ces documents de la littérature, ainsi que des documents mentionnés ci-dessous, est incorporé par référence à la présente description.
Les couches minces utilisées dans la mise en œuvre du procédé de l'invention peuvent être déposées selon les méthodes connues, par exemple par évaporation sous vide, pulvérisation cathodique, CND, MOCVD, etc.
Dans ce qui suit, on fera le plus souvent référence au phénomène de résonance des plasmons de surface, pour simplifier la description, mais les spécialistes comprendront aisément que le procédé de l'invention peut s'appliquer sans difficultés à un dispositif utilisant un système à miroir résonant.
Comme indiqué ci-dessus, le procédé de l'invention peut être utilisé notamment en exploitant le phénomène connu de résonance des plasmons de surface (RPS). Ce phénomène est observé lorsqu'un faisceau lumineux subit une réflexion à l'interface verre-métal d'une couche mince métallique, déposée sur la base du prisme. Lorsqu'un ligand pour un analyte d'intérêt est fixé sur la face externe de la couche métallique, et lorsque la couche métallique est mise en contact avec un milieu, liquide ou gazeux, susceptible de contenir l'analyte, celui-ci, s'il est présent, va se fixer, par affinité, sur le ligand et il en résulte une modification de l' épaisseur des couches moléculaires fixées sur la surface métallique, et donc de l'épaisseur optique, ce qui se traduit, notamment en raison du phénomène RPS, par une variation de la réflectivité de l'interface.
Le phénomène optique de résonance des plasmons de surface a été découvert il y a une trentaine d'année (E. KRETSCHMA N & H. RAETHER ; Z.Natiirforsch., 23a (1968), 615-617) et a été utilisé en premier lieu pour la caractérisation quantitative de couches minces non-organiques (W. P. CHEN & J. M. CHEN, J.Opt.Soc.Am, 71 (1981), 189-191). Le principe optique repose sur l'accès à la variation de l'épaisseur optique (produit de l'indice de réfraction par l'épaisseur géométrique) via la mesure de la variation de réflectivité sur une interface métal/diélectrique engendrée par la fixation de matière sur la face externe d'une couche métallique. Depuis les années 80, le phénomène de résonance des plasmons de surface est utilisé dans les applications biologiques, notamment dans la caractérisation quantitative d'interactions biologiques. Ainsi, il est possible, au travers de la connaissance de la variation d'indice de réfraction, de remonter jusqu'au nombre de molécules biologiques ayant interagi (J. A. DE FEIJTERet al, Biopolymers, 17 (1978), 1759-1772 ; A. BERNARD et al, Eur. J. Biochem. , 230 (1995), 416-423 ; J. PIEHLER et al, J. of Immunol Methods, 201 (1997), 189-206 ; P. GUEDON et al, Anal. Chem., (2000) 6003-6009), à leur concentration ainsi qu'aux cinétiques en temps réel caractérisant l'interaction d'analytes avec des ligands préalablement immobilisés sur une couche mince métallique.
Un intérêt du procédé et du dispositif de l'invention réside dans le fait qu'il est possible de déposer localement des ligands différents, de façon régulière, sur la couche sensible, selon un système ordonné (par exemple, matriciel ou bien hexagonal) dans lequel chaque dépôt cantonné sur une faible surface, ou spot, est repérable spatialement (ligands dits « adressés »).
On sait que la variation de la réflectivité liée au phénomène de RPS dépend de l'angle d'incidence du faisceau lumineux subissant la réflexion totale. Le phénomène de réflexion totale sur une interface a lieu lorsqu'une onde lumineuse traversant un milieu d'indice de réfraction nt rencontre un milieu d'indice de réfraction ni rencontre un milieu d'indice de réfraction n2 (avec n2 < ni) avec une incidence α telle que α > αc = Arcsin^/n . Lorsque l'épaisseur de la couche sensible augmente (notamment lorsqu'un analyte vient se fixer sur des ligands immobilisés sur la couche métallique), l'intensité de la lumière réfléchie décroît, puis passe par un minimum, puis croît à nouveau, ce phénomène étant observé pour une variation de l'angle d'incidence de plusieurs degrés. Il est donc souhaitable de repérer, préalablement à la mise en contact avec l'analyte, l'angle d'incidence pour lequel l'intensité de la lumière réfléchie est minimum sur les spots, ce qui se traduit par un contraste notable entre les spots et les zones nues du substrat. La connaissance précise de cet angle pour chaque spot permet la caractérisation de leur état de surface. Il en résulte que, en fonction de la masse molaire de l'analyte ou des analytes, on peut déterminer un angle optimisant la sensibilité de détection pour chaque spot sur lequel un analyte s'est fixé (ou s'est fixé en plus grande quantité).
Lorsque l'épaisseur optique de la couche sensible augmente, par exemple lorsqu'un analyte vient se fixer sur les spots contenant des ligands immobilisés, cela provoque un déplacement du pic de résonance (minimum de réflectivité) vers les angles d'incidence externe décroissants (on appelle ici « angle d'incidence externe » l'angle d'incidence du faisceau lumineux dans le milieu extérieur, avant l'entrée dans le prisme). En choisissant un angle d'incidence externe voisin de l'angle d'incidence initial du pic, mais légèrement supérieur (correspondant à une réflectivité proche du minimum), ce déplacement du pic va entraîner, pour l'angle d'incidence ainsi choisi, une augmentation de la réflectivité, ce qui se traduira sur l'image par l'apparition d'une tache plus lumineuse (ou par la variation du niveau de gris vers les gris plus clairs) tandis que les spots dont l'épaisseur optique n'a pas varié resteront sombres. On peut donc aisément déterminer l'angle d'incidence optimal utilisé conformément au procédé de l'invention, pour lequel la sensibilité de détection est maximale pour l'ensemble des spots dont l'épaisseur optique est susceptible de varier. En effet, à l'état initial, ces spots ont la plupart du temps des pics de résonance très voisins. En outre, comme le balayage angulaire a permis de repérer avec précision l'angle d'incidence du pic de résonance pour chaque spot, à l'état initial, il est possible de déterminer, pour chaque spot, par des moyens informatiques, la valeur exacte du déplacement du pic pour ce spot, et donc de normaliser les résultats recueillis par le détecteur du système d'imagerie qui détecte le flux de photons provenant de chacun des spots.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé de l'invention peut encore présenter les caractéristiques, prises isolément ou, le cas échéant, en combinaison, telles que définies dans les revendications.
Pour pouvoir caractériser l'évolution des zones actives de la partie utile, on mesure la réflectivité en fonction du temps, soit de façon continue, soit à des intervalles prédéterminés.
La variation de réflectivité est proportionnelle au nombre de molécules qui se fixent sur les plots, cette fixation correspondant à une augmentation de l'épaisseur sur le plot considéré.
On peut fixer sur la partie utile de la couche sensible, par exemple : - des antigènes (pour la recherche d'anticorps spécifiques),
- des peptides aléatoires, pour la recherche de mimotopes spécifiques d'un anticorps donné,
- des anticorps anti-tumeurs, pour la recherche d'antigènes tumoraux dans des broyats de cellule, - tous les ligands spécifiques de cellules particulières, pour le tri cellulaire.
Le procédé de l'invention peut également être utilisé pour étudier toutes interactions entre les molécules immobilisées et les analytes, y compris des cellules.
On peut également utiliser le procédé de l'invention pour le criblage de petites molécules qu'on immobilise sur la couche active (par exemple des oligosaccharides) pouvant inhiber le rôle signalétique ou enzymatique d'une protéine
(l'analyte est alors la protéine). On sélectionne les petites molécules par l'affinité biologique ou biochimique pour des protéines ou des cellules.
L'invention a également pour objet un dispositif d'imagerie permettant de mettre en œuvre le procédé de l'invention. Ce dispositif peut être utilisé notamment pour l'imagerie de la surface d'une couche sensible portant de multiples capteurs organiques, c'est-à-dire une surface sur laquelle immobilisées une ou plusieurs populations de ligands. Ces capteurs peuvent être déposés sur la couche sensible sous la forme de plots (ou spots) formant une matrice de ligands adressés. Ces spots peuvent être formés soit par dépôts sur la surface de la couche sensible, soit par remplissage de puits réalisés sur la surface de la couche sensible (par exemple par abrasion laser).
Le dispositif de l'invention comprend un dispositif d'imagerie, permettant de mettre en œuvre le procédé de l'une quelconque des revendication précédentes, comprenant :
- un prisme optique ayant une face d'entrée, une face de sortie et une base munie d'une couche sensible, ledit prisme étant caractérisé par son angle au sommet et par l'indice de réfraction du matériau qui le constitue, - un premier système afocal de conjugaison optique, disposé du côté de la face d'entrée du prisme, et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau lumineux incident collimaté l'ayant traversé se dirige vers ladite face d'entrée, se réfracte puis frappe la base du prisme où il subit une réflexion totale et ressort après réfraction sur la face de sortie en formant un faisceau émergent, ledit premier système de conjugaison ayant une orientation et une ouverture telles que ledit faisceau incident réfracté sur la face d'entrée vienne éclairer la totalité d'au moins une partie dite utile de ladite couche sensible, et y subir une réflexion totale lorsque la direction du faisceau incident varie, de part et d'autre dudit axe optique, sur une plage angulaire d'au moins 10° au total, ladite partie utile contenant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps,
- un second système afocal de conjugaison optique disposé du côté de la face de sortie du prisme et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau incident parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison donne un faisceau émergent parallèle à l'axe optique du second système de conjugaison,
- un système de détection ayant une surface sensible plane qui est apte à recevoir et à analyser la lumière ayant traversé ledit second système de conjugaison, et qui est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci, dans lequel : (i) ledit second système de conjugaison a une ouverture telle qu'il est traversé par la totalité de la lumière provenant de la zone utile lorsque la direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, et le second système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la surface sensible du système de détection, et (ii) l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceau incident est parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison, l'image intermédiaire de la partie utile, à travers la face de sortie du prisme, qui constitue l'objet pour le second système de détection, est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci.
Le balayage angulaire qu'il faut effectuer pour pouvoir observer la résonance en divers points de la zone active, et son déplacement lors de l'évolution du système dans le temps, varie en fonction notamment du métal, du verre, de la longueur d'onde, etc. Il est généralement d'au moins 10° environ.
L'étude de la réflectivité, en fonction de l'angle d'incidence externe, d'une interface métal-diélectrique, nécessite un balayage angulaire généralement compris entre 4 et 10 degrés, environ, suivant la longueur d'onde utilisée et la nature du diélectrique et du métal. Par exemple, avec une interface verre-métal à la base d'un prisme d'angle au sommet 30,6 degrés, d'indice 1,776 et d'une couche mince d'or de 45 nm d'épaisseur, et une source lumineuse de longueur d'onde 660 nm, il faut, pour décrire totalement la résonance des plasmons de surface, balayer une plage de 8 degrés environ.
En outre, dans le cas où la couche mince métallique est munie d'une pluralité de plots constitués, par exemple, de polymères portant des espèces biologiques immobilisées, la résonance pour l'or est brisée, sur toutes les parties de la couche sensible portant un plot, et la résonance se décale alors vers les angles d'incidence externes décroissants. Par exemple, pour un plot de 3 nm d'épaisseur et d'indice 1,7 à 660 nm, la résonance se décale de 2 degrés environ. Si on met alors en contact la couche sensible avec un fluide contenant des analytes capables d' interagir avec les espèces biologiques immobilisées sur les plots, on observera un nouveau décalage de la résonance pouvant aller jusqu'à 4 degrés environ.
La somme des étendues angulaire à parcourir si l'on veut observer les résonances de l'or, des plots de polymères portant des espèces biologiques, et de certains de ces plots après qu'ils ont interagi avec les analytes, nécessite alors un balayage angulaire total de 14 degrés. Il est souhaiter de pouvoir utiliser un balayage angulaire de 16 degrés, afin de pouvoir travailler avec un certain confort et de pouvoir modifier à loisir les matériaux précités, notamment en termes d'indice et d'épaisseur. Dans certaines applications et avec certains matériaux et certaines longueurs d'onde, la possibilité d'utiliser un balayage angulaire de 10° peut suffire. Mais. le dispositif de l'invention permet d'utiliser un balayage angulaire pouvant aller jusqu'à 16°.
La source lumineuse est une source cohérente ou non cohérente. Elle est nécessairement cohérente dans le cas d'un dispositif à guide d'onde. Le système de collimation peut être tout système optique classique permettant de transformer un faisceau lumineux divergent en faisceau parallèle.
Le système optique déflecteur comprend par exemple un miroir plan tournant, qui peut être monté sur un moteur pas-à-pas ou un moteur à courant continu. On peut également utiliser un miroir de type galvanométrique. On sait que lorsqu'un miroir tournant tourne d'un angle donné, le rayon réfléchi issu d'un rayon incident fixe est dévié d'un angle double dudit angle donné. Le miroir plan tournant peut être notamment apte à pivoter autour d'un axe parallèle à une arête du prisme. On appelle arête du prisme la droite d'intersection des deux plans contenant respectivement les faces d'entrée et de sortie du prisme.
Le dispositif de l'invention peut comprendre un système polarisant, disposé par exemple entre le système de collimation et le miroir tournant, et permettant de polariser la lumière parallèlement à l'arête du prisme. Le système polarisant est par exemple composé d'un simple polariseur ou d'un cube séparateur de polarisation. Dans le cas du système à miroir résonant, un second polariseur est bien entendu nécessaire à la suite du prisme.
Dans des modes de réalisation particuliers, le dispositif de l'invention peut encore présenter les caractéristiques, prises isolément ou, le cas échéant, en combinaison, telles que définies dans les revendications. Dans la présente invention, on désigne par « système dioptrique » une lentille ou un doublet.
Le dispositif de l'invention permet d'effectuer la détection au meilleur angle d'incidence de la variation d'épaisseur optique (produit de l'épaisseur géométrique par l'indice de réfraction du matériau) sur l'interface métal-milieu extérieur, sans avoir à modifier la position des éléments du dispositif qui sont tous fixes les uns par rapport aux autres, à l'exception du miroir tournant. Il est ainsi très facile de faire varier l'angle d'incidence lors d'une étude préliminaire, en actionnant le seul miroir tournant, pour déterminer pour chaque angle d'incidence la réflectivité de la zone sensible, et on peut ensuite effectuer les mesures proprement dites en immobilisant le miroir tournant sur la - position correspondant à cet angle d'incidence optimal prédéterminé.
En effet, selon un mode de réalisation particulier, le dispositif optique d'imagerie de l'invention est tel que l'image de la zone utile de la couche mince métallique occupe une surface maximale de la matrice de détection CCD, de sorte que c'est l'ensemble de la surface de la zone utile de la couche métallique qui peut être analysée simultanément grâce à la matrice CCD.
Une caractéristique importante pour que le dispositif de détection puisse recevoir tous les rayons lumineux provenant de l'image de la surface utile de la couche mince métallique, bien que le système d'imagerie et le système de détection soient fixes par rapport au prisme, est que le dispositif de l'invention comprend un système de conjugaison optique tel que le faisceau qui, après entrée dans le prisme, vient frapper la couche mince métallique, éclaire la totalité de la surface utile de la matrice CCD, et cela quel que soit l'angle d'incidence dudit faisceau sur ladite plage angulaire pouvant atteindre jusqu'au moins 16° environ. Un tel système de conjugaison optique peut être mis au point, par exemple, de façon connue, en utilisant un dispositif dont le nombre d'ouverture, c'est-à-dire le rapport de la focale sur le diamètre utile de l'optique, est inférieur à N = l/(2*sin(16°/2)) = 3,6 pour accepter tous les faisceaux réfléchis par la zone sensible, sur la plage angulaire d'au moins 16°. Le système de conjugaison peut par exemple être constitué d'une première lentille de focale 80 mm et de diamètre 31,5 mm et d'une deuxième lentille de focale 65 mm et de diamètre 25 mm (l'ensemble présentant une ouverture de 2,6), lesdites lentilles étant disposées de telle façon que l'image de la partie utile par la face de sortie du prisme soit à peu près dans le plan focal objet de la première lentille, que le plan focal image de la première lentille soit confondu avec le plan focal objet de la deuxième lentille et enfin que la matrice CCD se situe dans le plan focal image de la deuxième lentille ; de cette manière, on a constitué un dispositif afocal qui conjugue. On peut aussi par exemple utiliser une troisième lentille, communément appelée "lentille de champ" qui permet de ramener les faisceaux vers l'axe optique, augmentant ainsi l'ouverture du système par rapport à un système afocal à deux lentilles (voir M. BORN & E. WOLF, Principles of Optics, Chapter VI, Pergamon Press, 1959).
Une autre caractéristique importante d'un mode de réalisation particulier du dispositif de l'invention, qui permet une analyse de chaque spot de la partie utile avec une sensibilité satisfaisante, est que l'angle au sommet et l'indice du prisme sont choisis de façon que l'image intermédiaire de la zone utile formée dans le prisme (c'est-à-dire l'image de la surface utile à travers le dioptre plan formé par la face de sortie du prisme, et qui constitue l'objet pour le système optique d'imagerie recevant le faisceau émergent) fournit dans le système optique d'imagerie une image coïncidant avec le plan focal du système de détection (matrice CCD), ou une image très voisine de ce plan et parallèle à celui-ci, ou ayant par rapport à ce plan une inclinaison suffisamment faible pour éviter, sur la totalité de la surface, le flou de l'image. On sait que tout système optique d'imagerie présente une certaine profondeur de champ, c'est-à-dire une plage longitudinale, suivant l'axe optique défini par le détecteur (cet axe optique étant perpendiculaire au plan du détecteur) pour laquelle l'image apparaîtra nette sur le détecteur. La profondeur de champ dépend directement de la focale du système optique et de son ouverture. Ainsi, pour une focale donnée, la profondeur de champ augmente avec le nombre d'ouverture (rapport de la focale au diamètre d'une optique). Mais il faut par ailleurs que le nombre d'ouverture soit le plus faible possible pour laisser passer un maximum de rayons à travers le système, et permettre ainsi une acceptance angulaire importante. Ces deux conditions étant contradictoires, il est nécessaire de trouver un compromis. Pour obtenir une image nette sur le détecteur, il faut que l'inclinaison de l'image de la zone utile par la face de sortie du prisme par rapport à un plan perpendiculaire à l'axe optique soit suffisamment faible pour qu'il ne soit pas en dehors de la profondeur de champ définie par le système de détection. Or, l'inclinaison du faisceau incident dans ce système rend nécessaire un redressement de l'image par un dispositif optique approprié, ce qui peut se réaliser soit en inclinant l'optique du système d'imagerie, soit en inclinant le système de détection (caméra CCD) afin d'avoir l'image de toute la surface nette sur le détecteur CCD.
Le problème de l'inclinaison de l'optique implique que ladite optique soit très ouverte pour laisser passer tous les rayons à travers cette optique, car les angles mis en jeu peuvent être relativement importants ; par exemple, pour un prisme isocèle d'indice 1,515 et d'angle au sommet 60°, cela impose un nombre d'ouverture du système de détection de 0,55, ce qui est rédhibitoire car un tel système présente beaucoup d'aberrations et une profondeur de champ très faible. De manière similaire, l'inclinaison de la caméra engendrerait une perte de netteté due au fait que le système ne travaillerait plus dans de bonnes conditions d'imagerie, car on ne peut plus parler alors d'aplanétisme.
L'originalité du prisme et des optiques utilisés dans un mode de réalisation du dispositif de la présente demande réside dans le fait que, quel que soit l'angle d'incidence du faisceau au niveau de l'interface prisme/couche sensible (dans les limites de variation indiquées pour l'angle d'incidence sur la face d'entrée du prisme), l'inclinaison de l'image intermédiaire par la face de sortie du prisme varie peu et reste quasiment perpendiculaire à l'axe optique du système de détection. Ainsi, un rayon totalement réfléchi partant du centre de la zone utile présentera à la sortie du prisme un angle faible par rapport à l'axe optique du système d'imagerie, tandis que le point image correspondant sur le détecteur restera à peu près dans les limites de la profondeur de champ définie par ce système.
Un intérêt majeur du dispositif de l'invention est que la totalité des éléments optiques sont fixes (à l'exception du miroir tournant) et les optiques sont peu ouvertes
(elles présentent de ce fait moins d'aberrations et autorisent une profondeur de champ importante), et cela sans altérer les performances de mise au point et d'acceptance angulaire, pouvant aller notamment jusqu'à 16°, du système.
D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description suivante en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple non limitatif, dans lesquels :
- la figure 1 représente un schéma du dispositif selon l'invention,
- la figure 2 représente un schéma de la cellule de réaction selon l'invention. Le dispositif selon l'invention comprend :
- une source lumineuse 1,
- un premier système de collimation 2 du faisceau lumineux incident émis par la source lumineuse,
- une cellule de réaction 3 comprenant au moins un prisme 4, - un système d'imagerie et de détection 5 du faisceau réfléchi par la base du prisme.
La source lumineuse 1, non cohérente, est par exemple une diode électroluminescente de largeur spectrale étroite. Il peut s'agir par exemple d'une diode électroluminescente de longueur d'onde 660 nanomètres et de largeur spectrale 30 nanomètres.
Le faisceau émis par la source lumineuse 1 est collimaté par un système de collimation 2. Ce système de collimation 2 est par exemple un système de deux objectifs de microscope permettant de rendre le faisceau lumineux parallèle. La lumière est ensuite polarisée par un polarisateur 6 afin de pouvoir exciter le plasmon de surface.
Cette lumière polarisée éclaire la face d'entrée d'un prisme en verre 4 de la cellule de réaction 3. Dans un mode de réalisation, la lumière polarisée est réfléchie par un miroir galvanométrique oscillant 7 vers la face d'entrée du prisme 4 tel que représenté sur la figure 1. Le miroir oscillant 7 est conjugué sur la base du prisme à l'aide de deux lentilles 8 et 9. On peut ainsi faire varier l'angle d'incidence du faisceau sur le prisme par la rotation du miroir oscillant 7 autour d'un axe 7a perpendiculaire au plan du dessin. Le miroir oscillant 7 subit une rotation partielle, contrôlée par exemple par un générateur basse fréquence.
Le mouvement de rotation du dispositif de rotation du miroir oscillant 7 peut être discrétisé à l'aide d'une composante continue afin de pouvoir fixer l'angle auquel on souhaite réaliser les expériences. Le diamètre du miroir 7 est tel qu'il permet de réfléchir la totalité du faisceau incident sur le prisme 4.
Dans le mode de réalisation considéré, le diamètre est au moins de 10 mm. La course totale du miroir 7 est de 16° pour une fréquence de 300 mégahertz. Lors de sa rotation, le miroir oscillant 7 a une course continue à f équence fixe. Les lentilles 8, 9 utilisées pour conjuguer le miroir 7 avec le prisme 4 peuvent être par exemple des lentilles de focale F' = 75 mm avec un diamètre de 35 mm pour une excursion de 19°, ou des lentilles de focale F' = 50 mm avec un diamètre de 25 mm pour une excursion de 17°.
Dans la figure 1, on a représenté en traits pleins les limites du faisceau lumineux pour la position du miroir 7 représentée, et en traits interrompus les limites extrêmes de ce faisceau lorsque le miroir 7 occupe les positions extrêmes de sa course angulaire.
L'angle d'incidence du faisceau réfléchi par le miroir 7 sur le prisme 4 peut être déterminé de deux manières différentes. Dans un premier mode de réalisation, la partie du faisceau réfléchie par la face d'entrée du prisme est recueillie par une barrette de circuits à couplage de charge CCD 10 de longueur suffisante.
Cette barrette CCD 10 permet de détecter l'incidence du faisceau. Le faisceau ainsi réfléchi par la face d'entrée du prisme est focalisé sur la barrette CCD 10 à l'aide d'une lentille 11 dont la focale est choisie de façon à utiliser toute la surface de la barrette 10.
Pour une barrette CCD 10 de longueur L = 12,7 mm composée de 512 pixels, on peut par exemple utiliser une lentille 11 de focale F' = 48 mm et de diamètre 30 mm.
Dans un autre mode de réalisation, non représenté, la rotation du miroir oscillant 7 est assurée par un moteur permettant de déterminer la position d'incidence pour chaque position du miroir. On peut par exemple utiliser un moteur à pas variable. La cellule de réaction 3 comprend au moins un prisme 4 en verre dont la géométrie et l'indice sont tels que l'image intermédiaire du plan objet dans le prisme 4 est quasiment parallèle au plan de détection du système d'imagerie et de détection 5.
Dans un mode de réalisation, le prisme est en verre d'indice 1,8 et a pour caractéristique un angle au sommer de 40°, une base de 10 mm de largeur et 25 mm de hauteur. La distance entre les deux faces parallèles du prisme est de 8 mm.
Une lame de verre de 12 de même indice que le prisme 4 est fixée sur la base du prisme au moyen d'une huile d'adaptation d'indice.
Sur cette lame de verre 12, sont déposées successivement une couche mince de chrome 13, une couche mince d'or 14, et une couche à caractériser 15. La couche de chrome 13 permet d'assurer l'adhésion de la couche d'or 14 sur la lame de verre 12 en présence d'un milieu aqueux. L'épaisseur de la couche mince de chrome 13 est comprise par exemple entre 1,5 et 2 nanomètres.
L'épaisseur de la couche mince d'or 14 est par exemple comprise entre 40 et 50 nanomètres et de préférence de l'ordre de 45 nanomètres. Pour une application à une mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires, la couche à caractériser est, par exemple, une couche organique 15.
La couche organique 15 peut être déposée sous forme d'une couche continue ou sous forme de spots ou plots, comme indiqué ci-dessus Dans le cas d'une couche continue, contenant une seule sorte de ligand (par exemple un anticorps), il convient de déposer ponctuellement des solutions d' analytes (par exemple peptides pour la recherche de minotopes) sous forme de spots, puis on rince pour éliminer les analytes non fixés spécifiquement.
Dans le cas d'une couche organique sous forme de spots, on peut mettre la couche sensible en contact avec un fluide contenant un analyte à étudier.
Les ligands sont immobilisés sur la couche d'or de façon connue.
Par exemple, pour l'étude d'interactions entre des oligonucléotides et des fragments d'ADN simple-brin à étudier, la couche organique 15 utilisée pour la fixation d'oligonucléotides sur la couche d'or 14 par l'intermédiaire est un polymère tel que par exemple le polypyrrole, les oligonucléotides étant greffés sur le polypyrrole. Ce polymère présente l'avantage d'être très stable, ce qui permet de réutiliser plusieurs fois la couche organique 15 comprenant les sondes (oligonucléotides immobilisés). La réalisation et le dépôt d'une telle couche de polypyrrole greffé sur une couche d'or sont par exemple décrits dans les brevets EP 0 691 978 et FR 2 789 401.
Une fois la lame de verre 12 fixée sur la base du prisme 4, elle est recouverte hermétiquement d'une cuve 16.
Cette cuve 16 est par exemple en Téflon et permet de faire passer des solutions d'analytes à l'aide d'un ou plusieurs tuyaux 17. Une pompe péristaltique 18 à débit variable peut alors être utilisée pour faire circuler ces solutions.
Afin d'optimiser l'introduction des solutions, la pompe péristaltique 18 répond aux critères suivants :
- être commandable à distance ;
- être capable de générer des débits compris entre quelques micro litres par minute et quelques centaines de micro litres par minute (de l'ordre de 300 à 400 micro litres/min) ;
- permettre une commande entrée/sortie de la vitesse de rotation du début et de la fin de l'injection.
L'ensemble de la cellule de réaction 3 (prisme 4 et cuve 16) peut être enfermé dans une enceinte adiabatique 19 représentée figure 2, afin de contrôler et de fixer la température du système et des produits injectés.
La température sera par exemple maintenue à 37° afin de permettre la détection de tout type de molécules biologiques.
L'enceinte adiabatique 19 comprend de préférence une ouverture (non représentée) permettant d'accéder facilement à la cellule de détection 3.
Elle peut comporter notamment un socle 20 chauffant, tel que par exemple une résistance en cuivre, sur laquelle sera fixée la cuve de réaction en Téflon 16. Ce socle 20 est recouvert d'un couvercle 21 englobant l'ensemble de la cellule de détection 3.
Des hublots latéraux 22, 23 sont prévus dans le couvercle 21 afin de laisser passer les faisceaux lumineux de part et d'autre du prisme. Ils sont par exemple en verre ou tout autre matériau laissant passer les faisceaux lumineux sans les perturber. Un bobinage non représenté enroulé autour du tuyau 17 de la cuve 16 permet de maintenir les produits injectés à la température de la cellule.
Un système d'imagerie et de détection 5 est disposé du côté de la face de sortie du prisme 4 afin de récupérer le faisceau réfléchi par la base de ce dernier.
Ce système comprend un système afocal de conjugaison et de grandissement 24 et une caméra CCD 25.
Le système afocal de grandissement 24 permet ici d'agrandir l'image de la zone utile de la lame d'or 14 sur l'ensemble de la caméra CCD 25.
La zone utile de la lame d'or 14 est par exemple de l'ordre de 25 mm2 environ. Dans le mode de réalisation représenté, un agrandissement G=l,6 est réalisé et un système d'ouverture numérique O.N. = 1,6 est utilisé pour conjuguer l'image sur le plan de la caméra CCD 25.
Le système afocal 24 peut par exemple comprendre une lentille 26de focale F' = 50mm et de diamètre 35 mm, puis une autre lentille 27 de focale F' = 80 mm et de diamètre 40 mm.
La lentille 26 est disposée de façon telle que l'image de la partie utile de la couche active après réfraction sur la face de sortie du prisme est située dans le plan focal objet de 26. Il en résulte que l'image se forme dans le plan focal image de la lentille 27.
Le système de conjugaison peut aussi être constitué par exemple d'une première lentille de focale 80 mm et de diamètre 31,5 mm, et d'une seconde lentille de focale 65 mm et de diamètre 25 mm (l'ensemble présentant une ouverture de 2,6). Pour concevoir ce système optique, on peut utiliser des logiciels de calculs optiques commerciaux tels que CODE V (Optical Research Associates).
La caméra CCD 25 (ou simplement une matrice CCD) peut par exemple présenter une surface sensible de 6,4mm x 5,8mm composée de 768 x 576 pixels.
Le détecteur CCD peut également être par exemple une caméra à tête déportée de format 1,5 pouce, de surface sensible 6,4 x 4,8 mm2, comprenant 751 x 582 pixels actifs, avec un signal échantillonné sur 8 bits, ou bien une caméra compacte de format 2/3 pouce, de surface sensible 8,57 x 6,86 mm2, comprenant 1280 x 1024 pixels actifs avec un signal échantillonné sur 12 bits. Il s'agit de caméras commerciales.
Tous les éléments du dispositif selon l'invention sont contrôlés automatiquement au moyen d'une chaîne informatique non représentée. Le procédé d'utilisation dudit dispositif comprend les étapes suivantes :
- balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 recouverte de la couche d'or 14 et de la couche à caractériser 15 ;
- détermination de l'angle d'incidence pour lequel la sensibilité du système d'imagerie et de détection 5 est maximale pour l'ensemble de la lame 12 ; - positionnement du miroir oscillant 7 pour obtenir cet angle d'incidence ;
- mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection 5 en fonction du temps.
Le dispositif est alors utilisé pour caractériser la surface des zones actives à caractériser de la couche 15. Le dispositif peut être appliqué à l'étude d'interactions moléculaires.
Afin de mesurer les interactions entre la couche organique 15 et des analytes, l'étape de mesure de la réflectivité est réalisée simultanément à l'introduction dans la cellule de réaction 3 d' analytes (non marqués) dont les interactions avec les ligands de la couche organique 15 sont à analyser. On mesure ainsi l'évolution des interactions entre la couche organique 15 et les analytes introduits.
Ces mesures peuvent être réalisées dans des conditions non sélectives, de sorte que toutes les interactions peuvent se produire et être étudiées.
Le système d'imagerie et de détection 5 permet de mesurer l'épaisseur optique, produit de l'épaisseur géométrique et de l'indice de réfraction du milieu, en tout point de la partie utile de la couche d'or 14.
Il est ainsi possible de visualiser topologiquement les zones d'égale épaisseur optique et de caractériser la surface.
Ainsi, lors du balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 couverte de la couche d'or 14, le système 5 permet de déterminer l'épaisseur géométrique de chaque point de la couche 14 et donc de vérifier l'état de surface de celle-ci.
Le contraste mesuré lors du balayage sert par ailleurs de niveau de référence pour la mesure en temps réel.
Lors de la mesure en temps réel, le système d'imagerie et de détection 5 mesure la variation de la réflectivité par rapport au niveau de référence enregistré lors du balayage angulaire. Cette mesure de la variation de la réflectivité est réalisée en tout point de la partie utile de la couche d'or 14.
La réflectivité variant en fonction des espèces moléculaires présentes en surface, cette mesure permet une analyse qualitative en déterminant les différentes interactions entre la couche organique 15, la couche d'or 14 et les molécules introduites. Ainsi, lorsque l'on se place à l'angle optimisant la sensibilité du dispositif, une variation positive de la réflectivité signifie la présence d' analytes en interaction avec les ligands de la couche organique 15, une variation nulle signifiant l'absence d' analyte interagissant.
Une variation négative représente alors au contraire une perte de matière, c' est-à-dire une dégradation de la couche 15.
La mesure de l'amplitude de la variation de la réflectivité en temps réel permet quant à elle d'accéder au nombre de molécules d' analytes par unité de surface et donc à la concentration en chaque point (sur chaque spot) de la couche d'or 14 des molécules d' analyte introduites. Le dispositif selon l'invention permet donc également une analyse quantitative des molécules ayant interagi avec les ligands de la couche 15.
Selon la force de la liaison entre la couche 15 et la couche d'or 14 et la nature des interactions étudiées, il sera possible en fin de mesure de régénérer la couche organique 15 en éliminant toutes les molécules d' analyte ayant réagi avec elle. II est alors possible de réutiliser la couche 15 pour étudier des interactions avec de nouvelles molécules d' analytes.
Afin d'optimiser la sensibilité de la mesure, on peut également optimiser la répartition des spots fixés sur la couche 15. Il est en effet nécessaire que le nombre de sondes (ligands) par spot soit suffisamment élevé pour se distinguer du bruit de fond du signal mesuré, sans pour autant que les sondes soient trop proches les uns des autres. En effet, un nombre important de sondes entraîne un encombrement stérique important et gêne l'interaction de molécules avec des sondes voisines. Dans le cadre de l'étude d'interactions entre oligonucléotides et des fragments d'ADN simple-brin à étudier le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages. Les interactions sont étudiées dans des conditions d'hybridation non sélectives, par exemple à une température de l'ordre de 37°C, de sorte que toutes les interactions entre les réactifs pourront être observées simultanément. Le dispositif permet de suivre en même temps et sans marqueurs plusieurs centaines d'interactions moléculaires à la fois. Il est capable notamment de discriminer la présence d'une mutation ponctuelle au sein d'un fragment d'ADN.
La technique de discrimination repose sur le fait que l'association moléculaire peut être soit totale si la séquence de l' ADN est strictement complémentaire de celle de l'oligonucléotide, soit partielle si la séquence d'ADN possède une base mutée.
La thermodynamique appliquée à l'ADN montre que suivant le type de mutation, pour une localisation fixe dans la séquence, l'épaisseur optique varie. Il s'ensuit que le dispositif peut déterminer précisément le type de mutation. Dans des conditions non sélectives, si une séquence normale et les trois séquences portant la mutation d'une des bases de ladite séquence, c'est-à-dire les quatre séquences dont l'une des bases a été mutée, sont déposées sous forme de quatre plots différents sur la couche d'or 14, le dispositif peut mesurer un signal différent pour chacune des séquences immobilisées. En effet, quelle que soit la séquence du fragment à analyser, le dispositif mesure une interaction totale et trois interactions partielles.
En fonction des séquences immobilisées, il suffit alors de se reporter aux tables existant donnant la force d'interaction entre bases pour remonter à la nature exacte de la séquence d'ADN. Dès lors, si le système de détection est calibré, par exemple par rapport à la valeur d'un signal totalement complémentaire, il n'est plus nécessaire d'immobiliser la séquence normale et les trois séquences mutées : l'immobilisation d'une seule séquence est suffisante.
La capacité d'adresser des séquences d'ADN sur un substrat solide est donc multipliée par quatre.
Le dispositif selon l'invention suivant en temps réel et directement les interactions moléculaires, il n'est pas nécessaire de réaliser la mesure à une température favorisant une seule interaction comme dans le cas des méthodes utilisant des marqueurs fluorescents.
En effet, ces méthodes ne permettent de révéler qu'une seule interaction visible à une température donnée. Si ces méthodes étaient employées à température ambiante, tous les marqueurs émettraient de la fluorescence en même temps et ne pourraient donc être différenciés.
Les exemples suivants illustrent l'invention. Exemples de configuration de prismes
1) Données pour un verre d'indice n=l ,776 : - Matériau : SF11 (fournisseur : SCHOTT).
- Angle au somme optimal : 30,6°.
- Coefficient d'anamorphose : 0,479.
- Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 4,17 %.
2) Données pour un verre d'indice n=2,20 :
- Matériau : niobate de lithium LiNbO (fournisseur : CRYSTAL TECHNOLGY, Inc., Palo Alto CA).
- Angle au sommet optimal : 77,4°.
- Coefficient d'anamorphose : 0,7. - Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 1 ,57 %.
3) Données pour un verre d'indice n=3,33 :
- Matériau : GaAs (fournisseur : AXT, Inc., Palo Alto CA).
- Angle au sommet optimal : 123,7°. - Coefficient d'anamorphose : 0,89.
- Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 0,5 %.
Le dimensionnement des prismes a été réalisé à l'aide du logiciel MATLAB (société MATH WORKS), qui permet d'établir des algorithmes appropriés, selon des méthodes connues. Pour un indice n donné, il existe au moins un angle au sommet permettant que l'image intermédiaire de la base du prisme à travers de la face de sortie soit perpendiculaire à l'axe optique du second système afocal de conjugaison. On recherche ensuite de la même façon les couples (indice - angle au sommet) qui donnent un débattement angulaire minimum pour cette image intermédiaire. Les prismes peuvent être également réalisés à l'aide de monocristaux tels que le tantalate de lithium (LiTaO3), le niobate de lithium (LiNbO3).
Il s'agit de matériaux biréfringents, c'est-à-dire qu'ils peuvent présenter un indice différent suivant l'état de polérisation de la lumière. Cet inconvénient peut être surmonté par exemple en orientant les axes du cristal de façon que l'indice de réfraction effectif, en polarisation transverse magnétique, soit le même quel que soit l'angle d'incidence du faisceau sur la zone utile.
Une autre solution est d'utiliser des matériaux semi-conducteurs tels que rarséniure de gallium, le germanium (indice de l'ordre de 4) ou encore le silicium (indice d'environ 3,9).
Tous ces matériaux présentent une bonne transmission dans l'infrarouge, ce qui est favorable compte tenu des caractéristiques intéressantes des plasmons de surface à des longueurs d'onde élevées.
Exemples d'applications :
1) Discriminations de mutations ponctuelles
On dispose d'une zone sensible munie de quatre séquences d'ADN de 25 bases de long, une séquence normale ou native (WT) du gène K-ras, une séquence test (CP) qui servira de témoin négatif et deux séquences mutées, Ml et M5 qui ne diffèrent de la séquence native que d'une seule base sur le même codon.
On sait que les mutations du gène K-ras engendrent presque systématiquement un cancer, d'où la nécessité d'identifier les individus possédant une mutation. Ces quatre séquences ont été immobilisées, sous la forme de quatre plots, de façon covalente, par un procédé électrochimique décrit dans les demandes de brevet WO 94/22889 et WO 00/47317.
La première étape consiste à étudier la réflectivité de la zone sensible en fonction de l'incidence externe, pour déterminer l'angle où se placer pour observer les hybridations avec un maximum de sensibilité. Ensuite, on injecte la séquence complémentaire de CP, dans un tampon d'hybridation à 22 °C (BPS, NaCl 137 mM), afin de démontrer que seul le plot CP réagit, ce qui est le cas. L'expérience ayant garanti par l'étape précédente que le système est sélectif, on injecte ensuite, après avoir régénéré le système avec une solution d'hydroxyde de sodium 50 mM, la séquence complémentaire de WT, qui réagit très bien avec le plot WT, peu avec les deux plots correspondants aux séquences mutées et pas du tout avec le plot CP. Puis on régénère et on injecte la séquence complémentaire de Ml, qui réagit très bien avec le plot Ml, peu avec WT et M5 et pas du tout avec CP. La dernière injection donne les résultats attendus : le complémentaire de M5 réagit très bien avec M5, peu avec WT et Ml et pas avec CP.
On peut mesurer les affinités pour chacune de ces hybridations et affirmer que suivant le nombre de molécules ayant interagi sur les plots natifs ou mutés, et suivant la valeur de l' affinité, on peut discriminer de cette manière une mutation ponctuelle et même identifier le type de mutation.
Après établissement des courbes de réflectivité étalons, en fonction du temps, pour les quatre types d'hybridation, on peut détecter, par comparaison, une mutation ponctuelle avec seulement deux sondes, comme indiqué dans la description.
2) Analyse d'interactions protéine-protéine
On dispose d'une zone sensible munie de quatre plots dont trois portent des anticorps. Deux anticorps sont dirigés contre l'hCG, hormone de grossesse humaine qui, quand elle est détectée chez l'homme, est très souvent indicatrice d'un cancer des testicules. Le troisième anticorps est un anticorps anti-lapin, qui ne croise pas avec l'homme. Il a été simplement absorbé sur un plot de polymère. Le dernier plot ne contient que du polymère, sans anticorps.
On injecte d'abord de l'albumine sérique bovine, qui limite l'adsorption passive de molécules non spécifiquement reconnues, jusqu'à saturation. On injecte ensuite l'hCG dans un tampon PBS. Le plot ne portant que du polymère a une cinétique nulle (aucune évolution de la réflectivité en fonction du temps). Le plot portant l'anticorps anti-lapin a une cinétique qui décroît ; cela signifie que les anticorps, faiblement liés aux polymères, sont désorbés et évacués de la cuve de réaction. Les deux autres plots ont chacun une cinétique de forme exponentielle, signe de la reconnaissance de l'hCG par les anticorps. Toutefois, les deux anticorps anti-hCG étant différents, on note une différence de la pente à l'origine des cinétiques d'interaction. En effet, leur affinité pour l'hCG n'est pas la même . Pour l'un des anticorps, on a déduit des résultats de réflectivité que l'afFinité est de 8.10"10, soit la même valeur que celle mesurée indépendamment par une technique ELISA.
L'invention a également pour objet l'application du procédé décrit ci-dessus à la mesure qualitative et quantitative d'interaction moléculaire telles que décrites dans la présente demande.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ladite couche sensible étant déposée sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel : a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, appelée partie utile, de ladite surface, et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la surface de sortie du prisme, b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins une partie, ou de la totalité, des zones actives, est minimum, c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la sensibilité de détection des zones actives est maximale, d) on règle l'incidence à la valeur optimale déterminée à l'étape précédente, e) et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du faisceau émergent provenant de la partie utile.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, après l'étape d), on met en contact avec ladite couche sensible un fluide contenant ou susceptible de contenir au moins un analyte capable de se lier avec une population de ligands immobilisés sur les zones actives.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on mesure, à l'étape e), la variation de la réflectivité des zones actives en fonction du temps.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on utilise les résultats desdites mesures pour caractériser de façon quantitative les interactions d'au moins un couple ligand/analyte correspondant, l'analyte correspondant étant celui auquel le ligand est capable de se lier.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel les ligands et/ou les analytes sont choisis parmi des oligonucléotides de type sauvage ou muté, des protéines de type sauvage ou mutée, des fragment de protéine, des oligopeptides de séquence aléatoire, des anticorps ou fragments d'anticorps, des antigènes non protéiques, des haptènes, des agonistes ou antagonistes de ligands naturels, des cellules, des récepteurs biologiques et des oligosaccharides.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on utilise comme ligands un oligonucléotide de type sauvage et un oligonucléotide muté ayant une mutation ponctuelle quelconque dans une position donnée, et on utilise comme analyte un fragment d'ADN dans lequel on recherche une mutation dans ladite position donnée, on compare les courbes de réflectivité obtenues avec des courbes de réflectivité pré-établies pour le type sauvage et les 3 mutations possibles à ladite position, et on en déduit la mutation présente dans l'analyte, dans le cas où il présente une mutation à ladite position.
7. Dispositif d'imagerie, permettant de mettre en œuvre le procédé de l'une quelconque des revendication précédentes, comprenant :
- un prisme optique ayant une face d'entrée, une face de sortie et une base munie d'une couche sensible, ledit prisme étant caractérisé par son angle au sommet et par l'indice de réfraction du matériau qui le constitue,
- un premier système afocal de conjugaison optique, disposé du côté de la face d'entrée du prisme, et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau lumineux incident collimaté l'ayant traversé se dirige vers ladite face d'entrée, se réfracte puis frappe la base du prisme où il subit une réflexion totale et ressort après réfraction sur la face de sortie en formant un faisceau émergent, ledit premier système de conjugaison ayant une orientation et une ouverture telles que ledit faisceau incident réfracté sur la face d'entrée vienne éclairer la totalité d'au moins une partie dite utile de ladite couche sensible, et y subir une réflexion totale lorsque la direction du faisceau incident varie, de part et d'autre dudit axe optique, sur une plage angulaire d'au moins 10° au total, ladite partie utile contenant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, - un second système afocal de conjugaison optique disposé du côté de la face de sortie du prisme et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau incident parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison donne un faisceau émergent parallèle à l'axe optique du second système de conjugaison,
- un système de détection ayant une surface sensible plane qui est apte à recevoir et à analyser la lumière ayant traversé ledit second système de conjugaison, et qui est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci, dans lequel :
(iii) ledit second système de conjugaison a une ouverture telle qu'il est traversé par la totalité de la lumière provenant de la zone utile lorsque la direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, et le second système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la surface sensible du système de détection, et
(iv) l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceau incident est parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison, l'image intermédiaire de la partie utile, à travers la face de sortie du prisme, qui constitue l'objet pour le second système de détection, est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci.
8. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, le débattement angulaire de l'image intermédiaire de la zone utile formée à travers la face de sortie ne dépasse pas les limites de la profondeur de champ du second système de conjugaison.
9. Dispositif selon la revendication 7 ou 8, dans lequel ladite plage angulaire est d'au moins 12°, ou d'au moins 14°, ou d'au moins 16°.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel le grandissement du second système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la totalité de la surface sensible du système de détection.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel ledit second système afocal comprend un premier système dioptrique, par lequel le faisceau émergent entre, et un second système dioptrique par lequel la lumière ressort pour se diriger vers la surface sensible du système de détection, et dans lequel ladite image intermédiaire à travers la face de sortie du prisme est dans le plan objet dudit premier système dioptrique.
12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans lequel ledit système optique déflecteur comprend un miroir plan tournant apte à pivoter autour d'un axe parallèle à une arête du prisme.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, dans lequel le dispositif de détection est apte à analyser la lumière de façon à mesurer et/ou comparer la réflectivité de toute région ponctuelle de la partie utile.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, dans lequel le dispositif de détection comprend une matrice CCD ou C-MOS.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 14, dans lequel la couche mince métallique comporte, sur les zones actives, au moins une population de ligands immobilisés.
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