CA2431399C - Procede de caracterisation d'une surface, et dispositif pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

Procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible déposée sur la base d'un prisme optique, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel on fait entrer dans le prisme un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, on effectue un balayage en angle de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité des zones actives est minimum, on détermine un angle d'incidence optimal pour la sensibilité de détection des zones actives, on règle l'incidence à la valeur optimale, et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie; et dispositif pour mettre en oeuvre ce procédé.

Description

Procédé de caractérisation d'une surface, et dispositif pour sa mise en oruvre La présente invention se rapporte à un procédé de caractérisation d'une surface, et à un dispositif permettant de mettre en oeuvre ce procédé. Ce procédé permet notamment une mesure qualitative et/ou quantitative d'interactions qui peuvent être physiques, chimiques, biochimiques ou biologiques.
La plupart des procédés existants, dans ce domaine, utilisent des marqueurs fluorescents pour révéler les interactions moléculaires et nécessitent de travailler dans des conditions spécifiques. Ces conditions spécifiques ne permettent pas d'analyser plusieurs types d'interaction simultanément. Au contraire, le procédé de l'invention permet notamment de suivre en temps réel, et sans marqueurs, jusqu'à plusieurs centaines d'interactions moléculaires, à la fois qualitativement et quantitativement.
Le procédé de l'invention permet la caractérisation de la surface d'une couche sensible, déposée sur la base d'un prisme optique, selon une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme -couche sensible.
Cette réflectivité est susceptible de varier avec-l'angle d'incidence d'un faisceau lumineux se dirigeant dans le prisme vers une partie de l'interface correspondant à une partie à caractériser de ladite surface. Cette réflectivité varie également en fonction de l'épaisseur optique de la couche sensible, de sorte que le procédé de l'invention permet notamment de caractériser l'évolution de zones de la couche sensible dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps. La partie de l'interface correspondant à la partie à caractériser est bien entendu la partie qui est en regard de la partie de la surface à caractériser.
Le procédé de l'invention peut être utilisé notamment soit dans les techniques fondées sur la résonance des plasmons de surface, soit dans les techniques fondées sur l'interférométrie et utilisant le couplage entre un prisme et un guide d'ondes.
L'invention a notamment pour objet un procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ladite couche sensible étant déposée sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme -couche sensible, dans lequel :
a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un faisceau lumineux

2 collirnaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à
caractériser, appelée partie utile, de ladite surface, et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la face de sortie du prisme, b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins ime partie, ou de la totalité, des zones actives, 'est niinimum, c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la sensibilité de détection des zones actives est maximale, d) on règle l'incidence à la valeur optimale détenninée à l'étape précédente, et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'irnagerie et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du faisceau émergent provenant de la partie utile.
Un faisceau collimaté est un faisceau dont tous les rayons sont parallèles.
Le prisme est utilisé, dans le procédé et le dispositif de l'invention, conune un prisme de couplage, qui utilise le phénomène de réflexion totale sur une interface.
La surface à caractériser de la couche sensible est celle de la face externe de la couche sensible, en contact avec le milieu extérieur.
En pratique, la couche mince sensible peut être déposée soit sur la base du prisme, soit sur une lame transparente plane à faces parallèles, ayant le même indice ou un indice voisin de celui du prisme, et fixée, ou apte à être fixée, sur la base du prisme, avec la couche sensible déposée sur la face externe, qui n'est pas en contact avec la base du prisme. Cette face externe peut être considérée comme la véritable base du prisme dans un tel cas, lorsqu'elle est fixée au prisme.
La couche sensible peut être une couche mi.nce métallique, et dans ce cas le procédé de l'invention utilise le phénomène de résonance des plasmons de surface.
Parmi les métaux utilisés, on peut citer notarnment l'or et l'argent. On peut utiliser tine couche mince métallique intermédiaire, par exemple de chrome, pour améliorer l'accrochage de la couche d'or sur le verre du prisme. On peut aussi déposer sur le prisme une couche d'argent elle-même recouverte d'une couche d'or, ce qui permet. de protéger l'argent contre I'oxydation.

La couche sensible métallique peut être déposée sur la base du prisme, ou

3 sur une couche mince, déposée sur la base du prisme, d'un diélectrique de fàible indice (indice égal ou voisin de celui du prisine).

La couche sensible peut aussi être une couche mince, traiisparente, d'un diélectrique d'indice élevé capable de servir de guide d'onde. Dans ce cas, on dépose stir la base du prisme deux couches minces de diélectriques, d'abord une couche mince (par exemple de silice) servant de milieu espaceur, d'iiidice intermédiaire entre celui du prisme et celui de la couche guidante, puis la couche guidante, d'indice élevé. La couche guidante peur être réalisée par exemple avec des oxydes de titane ou d'osmium, stoechiométriques ou non stoecliiométriques. La couche guidante peut elle-même être recouverte d'une couche mince métalliqùe.
Lorsque la couche sensible est une couche de diélectrique seivant de guide d'onde, le procédé de l'invention permet notamment d'utiliser le guide d'onde comme un système à miroir résonant qui, nécessite une source lumineuse cohérente. Le principe et les applications du miroir résonant sont connus ; voir pâr exemple R. Cush et al., Biosensors & Bioelectronics 8, 347-353 (1993) ; P. E. Buckle et al., Biosensors &
Bioelectronics 8, 355-363 (1993) ; S. F Bier, Sensors & Actuators B, 29, 37-50 (1995) ;
C. Stamm et al., Sensors & Actuators B, 31, 203-207 (1996) ; A. Bernard et al., Eur. J.
Biochem., 230, 416-423 (1995).

Les couches minces utilisées dans la mise en ceuvre du procédé de l'invention peuvent être déposées selon les méthodes connues, par exemple par évaporation sous vide, pulvérisation cathodique, CVD, MOCVD, etc.
Dans. ce qui sûit, on fera le plus souvent référence au phénomène de résonance des plasmons de surface, pour simplifier la description, mais les spécialistes comprendront aisément que le prôcédé de l'invention peut s'appliquer sans difficultés à
un dispositif utilisant un système à miroir résonant.
Conune indiqué ci-dessus, le procédé de l'invention peut être utilisé
notamment en exploitant le phénomène connu de résonance des plasmons de surface (RPS). Ce phénomène est observé lorsqu'tu-- faisceau lumineux subit une réflexion à
l'interface verre-métal d'tme couche m.i.ncé métallique, déposée stir la base du prisme.
Lorsqu'un ligand pour un analyte d'intérêt est fixé sur la face externe 'de la couclte métallique, et lorsque la couche métallique est nlise en contact avec un milieu, liquide

4 ou gazeux, susceptible de contenir l'analyte, celui-ci, s'il est présent, va se fixer, par affinité, sur le ligand et il en résulte une modification de l'épaisseur des couches nloléculaires fixées sur la surface nzétallique, et donc de l'épaisseur optique, ce qui se traduit, notanunent en raison du phénomène RPS, par une variation de la réflectivité de l'interface.
Le phénomène optique de résonance des plasmons de surface a été
découyert il y a une trentaine d'année (E. KRETSCFFVIANN & H. RAETHER ;
Z.Natiirfor=sclT., 23a (1968), 615-617) et a été utilisé en premier lieu pour la caractérisation quantitative de couches minces non-organiques (W. P. CHEN & J.
M.
CHEN, J.Opt.Soc.Anz, 71 (1981), 189-191). Le principe optique repose sur l'accès à la variation de l'épaisseur optique (produit de l'indice de réfraction par l'épaisseur géométrique) via la mesure de la variation de réflectivité sur une interface métaltdiélectrique engendrée par la fixation de matière sur la face externe d'une couche métallique. Depuis les années 80, le phénomène de résonance des plasmons de surface est utilisé dans les applications biologiques, notanunent dans la caractérisation quantitative d'interactions biologiques. Ainsi, il est possible, au travers de la connaissance de la variation d'indice de réfraction, de remonter jusqu'au nombre de molécules biologiques ayant interagi (J. A. DE FEIJTER et al., Biopolytners, 17 (1978), 1759-1772; A. BERNARD et al., Eur. J Biochem. , 230 (1995), 416-423; J.
PIEHLER et al., J. of Immzinol. hlethods, 201 (1997), 199-206 ; P. GUEDON et al., Anal. Chem., (2000) 6003-6009), à leur concentration ainsi qu'aux cinétiques en temps réel caractérisant l'interaction d'analytes avec des ligands préalablement immobilisés sur une couche mince métallique.
Un intérêt du procédé et du dispositif de l'invention réside dans le fai:t qu'il est possible de déposer localement des ligands différents, de façon régulière, sur.la couche sensible, selon un système ordonné (par exemple, matriciel ou bien hexagonal) dans lequel chaque dépôt cantonné sur une faible surface, ou spot, est repérable spatialement (ligands dits adressés ).
On sait que la variation de la réflectivité liée au phénomène de RPS dépend de l'angle d'incidence du faisceau lum.ineux subissant la réflexion totale. Le phénomène de réfleYion totale sur une interface a lieu lorsqu'une onde lumineuse traversant un milieu d'indice de réfraction ni rencontre un milieu d'indice de réfraction n--) (avec n2 < nl) avec une incidence a telle que a> cx,~ =

Arcsin(n2/ni). Lorsque l'épaisseur de la couche sensible augmente (notamment lorsqu'un analyte vient se fixer sur des ligands immobilisés sur la couche métallique), l'intensité de la lumière réfléchie décroît, puis passe par un minimum, puis croît à
nouveau, ce phénomène étant observé pour une variation de l'angle d'incidence de

5 plusieurs degrés. Il est donc souhaitable de repérer, préalablement à la mise en contact avec l'analyte, l'angle d'incidence pour lequel l'intensité de la liunière réfléchie est minimum sur les spots, ce qui se traduit par un contraste notable entre les spots et les zones nues du substrat. La connaissance précise de cet angle pour chaque spot permet la caractérisation de leur état de surface. Il en résulte que, en fonction de la masse molaire de l'analyte ou des analytes, on peut déterminer un angle optimisant la sensibilité de détection pour chaque spot sur lequel un analyte s'est fixé (ou s'est fixé en plus grande quantité).
Lorsque l'épaisseur optique de la couche sensible augmente, par exemple lorsqu'un analyte vient se fixer sur les spots contenant des ligands immobilisés, cela provoque un déplacement du pic de résonance (minimum de réflectivité) vers les angles d'incidence externe décroissants (on appelle ici angle d'incidence externe l'angle d'incidence du faisceau lumineux dans le milieu extérieur, avant l'entrée dans le prisme). En choisissant un angle d'incidence externe voisin de l'angle d'incidence initial du pic, mais légèrement supérieur (correspondant à une réflectivité
proche du minimum), ce déplacement du pic va entraîner, pour l'angle d'incidence ainsi choisi, une augmentation de la réflectivité, ce qui se traduira sur l'image par l'apparition d'une tache plus lumineuse (ou par la variation du niveau de gris vers les gris plus clairs) tandis que les spots dont l'épaisseur optique n'a pas varié resteront sombres.
On peut donc aisément déterminer l'angle d'incidence optimal utilisé conformément au procédé
de l'invention, pour lequel la sensibilité de détection est maximale pour l'ensemble des spots dont l'épaisseur optique est susceptible de varier. En effet, à l'état initial, ces spots ont la plupart du temps des pics de résonance très voisins. En outre, comme le balayage angulaire a permis de repérer avec précision l'angle d'incidence du pic de résonance .pour chaque spot, à l'état initial, il est possible de déterminer, pour chaque spot, par des moyens informatiques, la valeur exacte du déplacement du pic pôur ce spot, et donc de normaliser les résultats recueillis par le détecteur du système d'imagerie qui détecte le flux de photons provenant de chacun des spots.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé de l'invention peut

6 encore présenter les caractéristiques décrites, prises isolément ou, le cas échéant, en combinaison.

Pour pouvoir caractériser l'évolution des zones actives de la partie utile, on mesure la réflectivité en fonction du temps, soit de façon continue, soit à
des intervalles prédétemiinés.

La variation de réflectivité est proportionnelle au nombre de molécules qui se fixent sur les plots, cette fixation correspondant à une augmentation de l'épaisseur sur le plot considéré.

On peut fixer sur la partie utile de la couche sensible, par exemple - des antigènes (pour la recherche d'anticorps spécifiques), - des peptides aléatoires, pour la recherche de mimotopes spécifiques d'un anticorps donné, - des anticorps anti-tumeurs, pour la recherche d'antigènes tumoraux dans des broyats de cellule, - tous les ligands spécifiques de cellules particulières, pour le tri cellulaire.
Le procédé de l'invention peut également être utilisé pour étudier toutes interactions entre les molécules immobilisées et les analytes, y compris des cellules.
On peut également utiliser le procédé de l'invention pour le criblage de petites molécules qu'on irninobilise sur la couche active (par exemple des oligosaccharides) pouvant inbiber le rôle signalétique ou enzymatique d'une protéine (l'analyte est alors la protéine). On sélectionne les petites molécules par l'affnlité
biologique ou biochimique pour des protéines ou des cellules.
L'invention a également pour objet un dispositif d'imagerie permettant de mettre en oruvre le procédé de l'invention. Ce dispositif peut être utilisé
notamment pour l'imagerie de la surfâce d'une couche sensible portant de multiples capteurs organiques, c'est-à-dire une surface sur laquelle irnmobilisées une ou plusieurs populations de ligands. Ces capteurs peuvent être déposés sur la couche sensible sous la forme de plots (ou spots) formant une matrice de ligands adressés. Ces spots peuvent être formés soit par dépôts sur la surface de la couche sensible, soit par remplissage de puits réalisés sur la surface de la couche seiisible (par exemple par abrasion laser).

Le dispositif de l'invention comprend un dispositif d'imagerie, permettant 6a de mettre en oeuvre un procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ladite couche sensible étant déposée sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel:
a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, appelée partie utile, de ladite surface, et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la face de sortie du prisme, b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins une partie, ou de la totalité, des zones actives, est minimum, c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la sensibilité de détection des zones actives est maximale, d) on règle l'incidence à la valeur optimale déterminée à
l'étape précédente, e) et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du faisceau émergent provenant de la partie utile, le dispositif comprenant:

7 - un prisme optique ayant une face d'entrée, tme face de sortie et une base munie d'une couche sensible, ledit prisme étant caractérisé par son angle au sommet et par l'indice de réfraction du matériau qui le constitue, - un preinier système afocal de conjugaison optique, disposé du côté de la face d'entrée du prisme, et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qû un faisceau lumineux incident collimaté l'ayant traversé se dirige vers ladite face d'entrée, se réfracte puis frappe la base du prisme où il subit une réflexion totale et ressort après réfraction sur la face de sortie en fonnant un faisceau émergent, ledit premier système de conjugaison ayant une orientation et une ouverture telles que ledit faisceau incident réfracté sur la face d'entrée vienne éclairer la totalité
d'au moins une partie dite utile de ladite couche sensible, et y subir tme réflexion totale lorsque la direction du faisceau incident varie, de part et d'autre dudit axe optique, sur une plage angulaire d'au moins 10 au total, ladite partie utile contenant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, - un second système afocal de conjugaison optique disposé du côté de la face de sortie du prisme et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau incident parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison donne un faisceau émergent parallèle à l'axe optique du second système de conjugaison, - un système de détection ayant une surface sensible plane qui est apte à
recevoir et à analyser la lumière ayant traversé ledit second système de conjugaison, et qui est perpendiculaire à l'axe optique de ceiui-ci, dans lequel :
(i) ledit second système de conjugaison a une ouverture telle qu'il est traversé par la totalité de la lumière provenant de la zone utile lorsque la direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, et le second système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la surface sensible du sy~tème de détection, et (ii) l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceaû incident est parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison, l'image intermédiaire de la partie utile, à travers la face de sortie du prisme, qui constitue l'objet pour le second système de détection, est perpendiculaire à

ô
l'axe optique de celui-ci.
Le balayage angulaire qu'il faut effectuer pour pouvoir observer la résonaiice en divers points de la zone active, et son déplacement lors de l'évolution du système dans le tenips, varie en fonction notanu-nent du métal, du verre, de la longueur d'onde, etc. Il est généraleinent d'au moins 10 environ.
L'étude de la réflectivité, en fonction de l'angle d'incidence externe, d'une interface métal-diélectrique, nécessite un balayage angulaire généralement compris entre 4 et 10 degrés, environ, suivant la Iongueur d'onde utilisée et la nature du diélectrique et du métal. Par exemple, avec une interface verre-métal à la base d'un prisme d'angle au soinmet 30,6 degrés, d'indice 1,776 et d'une couche mince d'or de 45 nm d'épaisseur, et une source lumineuse de longueur d'onde 660 nm, il faut, pour décrire totalement la résonance des plasmons de surface, balayer une plage de

8 degrés environ.
En outre, dans le cas où la couche mince métallique est munie d'une pluralité de plots constitués, par exémple, de polymères portant des espèces biologiques immobilisées, la résonance pour l'or est brisée, sur toutes les parties de la couche sensible portant un plot, et la résonance se décale alors vers les angles d'incidence .e;cternes décroissants. Par exemple, pour un plot de 3 nm d'épaisseur et d'indice 1,7 à
660 nm, la résonance se décale de 2 degrés environ. Si on met alors en contact la couche sensible avec un fluide contenant des analytes capables d'interagir avec les espèces biologiques immobilisées sur les plots, on observera un nouveau décalage de la résonance pouvant aller jusqu'à 4 degrés environ.
La somme des étendues angulaire.s à parcourir si l'on veut observer les résonances de l'or, des plots de polymères portant des espèces biologiques, et de certains de ces plots après qu'ils ont interagi avec les analytes, nécessite alors un balayage anb ilaire total de 14 degrés. Il est souhaitë de pouvoir utiliser un balayage angulaire de 16 degrés, afm de pouvoir travailler avec un certain confort et de pouvoir modifier à loisir les matériaux précités, notamment en termes d'indice et d'épaisseur.
Dans certaines applications et avec certains matériaux et certaines longueurs d'onde, la possibilité d'utiliser un balayage angulaire de 10 peut suffire. Mais.lé
dispositif de l'invention permet d'utiliser un balayage angulaire pouvant aller jusqu'à 16 .
La source lumineuse est une source cohérente ou nôn 'cohérente. Elle est nécessairement côhérente datls le cas d'un dispositif à guide d'onde.

9 Le système de collimation peut être tout système optique classique permettant de transformer un faisceau luniine x divergent en faisceau parallèle.
Le système optique déflecteur comprend par exemple un miroir plan totnnant, qui peut être monté sur tm moteur pas-à-pas ou un moteur à courant continu.
On peut également utiliser un miroir de type galvanométrique. On sait que lorsqu'un miroir tournant tourne d'un angle donné, le rayon réfléchi issu d'un rayon incident fixe est dévié d'un angle double dudit angle donné. Le miroir plan tournant peut être notan7ment apte à pivoter autour d'un axe parallèle à une arête du prisnie. On appelle arête du prisme la droite d'intersection des deux plans contenant respectivement les faces d'entrée et de sortie du prisme.
Le dispositif de l'invention peut comprendre un système polarisant, disposé
par exemple entre le système de collimation et le miroir tournant, et permettant de polariser la lumière parallèlement à l'arête du prisme. Le système polarisant est par exemple composé d'un simple polariseur ou d'un cube séparateur de polarisation. Dans le cas du système à miroir résonant, un second polariseur est bien entendu nécessaire à
la suite du prisme.
Dans des modes de réalisation particuliers, le dispositif de l'invention peut encore présenter les caractéristiques décrites, prises isolément ou, lecas échéant, en combinaison.

Dans la présente invention, on désigne par système dioptriqûe une lentille ou un doublet.
Le dispositif de l'invention permet d'effectuer la détection au meilleur angle d'incidence de la variation d'épaisseur optique (produit de l'épaisseur géométrique par l'indice de réfraction du matériau) sur l'interface métal-milieu extérietu, sans avoir à modifier la position des éléments du dispositif qui sont tous fixes les uns par rapport aux autres, à l'exception du miroir tournant. Il est ainsi très facile de faire varier l'angle d'incidence lors d'une étude préliminaire, en actionnant le seul miroir tournant, pour déterminer pour chaque angle d'incidence la réflectivité de la zone sensible, et on peut ensuite effectuer les mesures proprenient dites en immobilisant le miroir tournant sur la - position correspondant à cet angle d'incidence optimal prédéterminé.
En effet, selon un mode de réalisation particulier, le dispositif optique d'imagerie de l'invention est tel que l'image de la zone utile de la couche mince métallique occupe une surface maximale de la matrice de détection CCD, de sorte que c'est l'enseinble de la surface de la zone utile de la couche métallique qui peut être analysée simultanément grâce à la matrice CCD.

Une caractéristique importante pour que le dispositif de détection puisse 5 recevoir tous les rayons lumineux provenant de l'image de la surface utile de la couche mince métallique, bien que le système d'imagerie et le système de détection soient fixes par rapport au prisme, est que le dispositif de l'invention comprend un système de conjugaison optique tel que le faisceau qui, après entrée dans le prisme, vient frapper la couche inince métallique, éclaire la totalité de la surface utile de la matrice CCD, et cela

10 quel que soit l'angle d'incidence dudit faisceau sur ladite plage angulaire pouvant atteindre jusqu'au moins 16 environ. Un tel système de conjugaison optique peut être mis au point, par exemple, de façon connue, en utilisant un dispositif dont le nombre d'ouverture, c'est-à-dire le rapport de la focale sur le diamètre utile de l'optique, est inférieur à N= 1/(2*sin(16 /2)) = 3,6 pour accepter tous les faisceaux réfléchis par la zone sensible sur la plage angulaire d'au moins 16 . Le système de conjugaison peut par exemple être constitué d'une première lentille de focale 80 mm et de diamètre 31,5 mm et d'ime deuxième lentille de focale 65 mm et de diamètre 25 mm (l'ensemble présentant une ouverture de 2,6), lesdites lentilles étant disposées de telle façon que l'image de la partie utile par la face de sortie du prisme soit à peu près dans le plan focal objet de la première lentille, que le plan focal image de la première lentille soit confondu avec le plan focai_ objet de la deuxième lentille et enfin que la matrice CCD se situe dans le plan focal image de la deuxième lentille ; de cette manière, on a constitué
un dispositif afocal qui conjugue. On peut aussi par exemple utiliser une troisième lentille, com.mt.mément appelée "lentille de champ" qui permet de ramener les faisceauY
vers l'axe optique, augmentant ainsi l'ouverture du système par rapport à tm système afocal à deux lentilles (voir M. BORN & E. WOLF, Principles of Optics, Chapter VI, Pergamon Press, 1959).
Une autre caractéristique importante d'un mode de réalisation particulier du dispositif de l'invention, qui pennet une analyse de chaque spot de la partie utile avec une sensibilité satisfaisante, est que l'angle au sommet et l'indice du prisme sont choisis de façon que l'image intermédiaire de la zone utile formée dans le prisme (c'est-à-dire l'iinage de la surface utile à travers le dioptre plan formé par la face de sortie du prisme, et qui constitue l'objet pour le système optique d'imagerie recevant le faisceau

11 émergent) fournit dans le système optique d'imagerie une image coïncidant avec le plan focal du système de détection (matrice CCD), ou une image très voisine de ce plan et parallèle à celui-ci, ou ayant par rapport à ce plan une inclinaison suffisamment faible pour éviter, sur la totalité de la surface, le flou de l'image.
On sait que tout système optique d'imagerie présente une certaine profondeur de champ, c'est-à-dire une plage longitudinale, suivant l'axe optique défini par le détecteur (cet axe optique étant perpendiculaire au plan du détecteur) pour laquelle l'image apparaîtra nette sur le détecteur. La profondeur de champ dépend directement de la focale du système optique et de son ouverture. Ainsi, pour une focale donnée, la profondeur de champ augmente avec le nombre d'ouverture (rapport de la focale au diamètre d'une optique). Mais il faut par ailleurs que le nombre d'ouverture soit le plus faible possible pour laisser passer un maximum de rayons à
travers le système, et permettre ainsi une acceptance angulaire importante. Ces deux conditions étant contradictoires, il est nécessaire de trouver un compromis.
Pour obtenir une image nette sur le détecteur, il faut que l'inclinaison de l'image de la zone utile par la face de sortie du prisme par rapport à un plan perpendiculaire à l'axe optique soit suffisamment faible pour qu'il ne soit pas en dehors de la profondeur de champ définie par le système de détection. Or, l'inclinaison du faisceau incident dans ce système rend nécessaire un redressement de l'image par un dispositif optique approprié, ce qui peut se réaliser soit en inclinant l'optique du système d'imagerie, soit en inclinant le système de détection (caméra CCD) afin d'avoir l'image de toute la surface nette sur le détecteur CCD.
Le problème de l'inclinaison de l'optique implique que ladite optique soit très ouverte pour laisser passer tous les rayons à travers cette optique, car les angles mis en jeu peuvent être relativement importants ; par exemple, pour un prisme isocèle d'indice 1,515 et d'angle au sommet 60 , cela impose un nombre d'ouverture du système de détection de 0,55, ce qui est rédhibitoire car un tel système présente beaucoup d'aberrations et une profondeur de champ très faible. De manière similaire, l'inclinaison de la caméra engendrerait une perte de netteté due au fait que le système ne travaillerait plus dans de bonnes conditions d'imagerie, car on ne peut plus parler alors d' aplanétisme.
L'originalité du prisme et des optiques utilisés dans un mode de réalisation du dispositif de la présente demande - réside dans le fait que, quel que soit l'angle

12 d'incidence du faisceau au niveau de l'interface prisme/couche sensible (dans les limites de variation indiquées pour l'angle d'incidence sur la face d'entrée du prisme), l'inclinaison de l'image intermédiaire par la face de sortie du prisme varie peu et reste quasiment perpendiculaire à l'axe optique du système de détection. Ainsi, un rayon totalement réfléchi partant du centre de la zone utile présentera à la sortie du prisme un angle faible par rapport à l'axe optique du système d'imagerie, tandis que le point image correspondant sur le détecteur restera à peu près dans les limites de la profondeur de champ définie par ce système.
Un intérêt majeur du dispositif de l'invention est que la totalité des éléments optiques sont fixes (à l'exception du miroir tournant) et les optiques sont peu ouvertes (elles présentent de ce fait moins d'aberrations et autorisent une profondeur de champ importante), et cela sans altérer les performances de mise au point et d'acceptance angulaire, pouvant aller notamment jusqu'à 16 , du système.
D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description suivante en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple non limitatif, dans lesquels :
- la figure 1 représente un schéma du dispositif selon l'invention, - la figure 2 représente un schéma de la cellule de réaction selon l'invention.
Le dispositif selon l'invention comprend :
-- une source lumineuse 1, - un premier système de collimation 2 du faisceau lumineux incident émis par la source lumineuse, - une cellule de réaction 3 comprenant au moins un prisme 4, - un système d'imagerie et de détection 5 du faisceau réfléchi par la base du prisme.
La source lumineuse 1, non cohérente, est par exemple une diode électroluminescente de largeur spectrale étroite. Il peut s'agir par exemple d'une diode électroluminescente de longueur d'onde 660 nanomètres et de largeur spectrale nanomètres.
Le faisceau émis par la source lumineuse 1 est collimaté par un système de collimation 2. Ce système de collimation 2 est par exemple un système de deux objectifs de microscope permettant de rendre le faisceau lumineux parallèle.

13 La lumière est ensuite polarisée par un polarisateur 6 afin de pouvoir exciter le plasmon de surface.
Cette lumière polarisée éclaire la face d'entrée d'un prisme en verre 4 de la cellule de réaction 3.
Dans un mode de réalisation, la lumière polarisée est réfléchie par un miroir galvanométrique oscillant 7 vers la face d'entrée du prisme 4 tel que représenté sur la figure 1. Le miroir oscillant 7 est conjugué sur la base du prisme à l'aide de deux lentilles 8 et 9. On peut ainsi faire varier l'angle d'incidence du faisceau sur le prisme par la rotation du miroir oscillant 7 autour d'un axe 7a perpendiculaire au plan du dessin. Le miroir oscillant 7 subit une rotation partielle, contrôlée par exemple par un générateur basse fréquence.
Le mouvement de rotation du dispositif de rotation du miroir oscillant 7 peut être discrétisé à l'aide d'une composante continue afin de pouvoir fixer l'angle auquel on souhaite réaliser les expériences.
Le diamètre du miroir 7 est tel qu'il permet de réfléchir la totalité du faisceau incident sur le prisme 4.
Dans le mode de réalisation considéré, le diamètre est au moins de 10 mm.
La course totale du miroir 7 est de 16 pour une fréquence de 300 mégahertz.
Lors de sa rotation, le miroir oscillant 7 a une course continue à fréquence fixe.
Les lentilles 8, 9 u:tilisées pour conjuguer le miroir 7 avec le prisme 4 peuvent être par exemple des lentilles de focale F' = 75 mm avec un diamètre de 35 mm pour une excursion de 19 , ou des lentilles de focale F' = 50 mm avec un diamètre de 25 mm pour une excursion de 17 .
Dans la figure 1, on a représenté en traits pleins les limites du faisceau lumineux pour la position du miroir 7 représentée, et en traits interrompus les limites extrêmes de ce faisceau lorsque le miroir 7 occupe les positions extrêmes de sa course angulaire.
L'angle d'incidence du faisceau réfléchi par le miroir 7 sur le prisme 4 peut être déterminé de deux manières différentes.
Dans un premier mode de réalisation, la partie du faisceau réfléchie par la face d'entrée du prisme est recueillie par une barrette de circuits à couplage de châ.rge CCD 10 de longueur suffisante.
Cette barrette CCD 10 permet de détecter l'incidence du faisceau.

14 Le faisceau ainsi réfléchi par la face d'entrée du prisme est focalisé stir la barrette CCD 10 à l'aide d'une lentille 11 dont la focale est choisie de façon à utiliser toute la surface de la barrette 10.
Pour tme barrette CCD 10 de longueur L= 12,7 mm coniposée de 512 pixels, on peut par exemple utiliser une lentille 11 de focale F' = 48 nun et de diamètre 30mm.
Dans un autre mode de réalisation, non représenté, la rotation du miroir oscillant 7 est assurée par un moteur permettant de déterminer la position d'incidence pour chaque position du miroir. On peut par exemple utiliser un moteur à pas variable.
La cellule de réaction 3 comprend au moins un prisme 4 en verre dont la géonlétrie et l'indice sont tels que l'image intermédiaire du plan objet dans le prisme 4 est quasiment parallèle au plan de détection du système d'imagerie et de détection 5.
Dans un mode de réalisation, le prisme est en verre d'indice 1,8 et a pour caractéristique un angle au sommet de 40 , une base de 10 mm de largeur et 25 mm de hauteur. La distance entre les deux faces parallèles du prisme est de 8 mm.
Une lame de verre 12 de même indice que le prisme 4 est fixée sur la base du prisme au moyen d'une huile d'adaptation d'indice.
Sur cette lame de verre 12, sont déposées successivement une couche mince de chrome 13, une couche mince d'or 14, et une couche à caractériser 15.
La couche de chrome 13 permét d'assurer l'adhésion de la couche d'or 14 sur la lame de verre 12 en présence d'un milieu aqueux. L'épaisseur de la couche mince de chrome 13 est comprise par exemple entre 1,5 et 2 nanomètres.
L'épaisseur de la couche mince d'or 14 est par exemple comprise entre 40 et 50 nanomètres et de préférence de l'ordre de 45 nanomètres.
Potir une application à une mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires, la couche à caractériser est, par exemple, une couche organique

15.
La couche organique 15 peut être déposée sous forme d'une couche continue ou sous forme de spots ou plots, comme indiqué ci-dessus. Dans le cas d'une couche continue, contenant tme seule sorte de ligand (par exemple un anticorps), il convient de déposer ponctuellement des solutions d'analytes (par exemple peptides pour la recherche de nmimotopes) sous forme de spots, puis on rince pour élinliner les analytes non fixés spécifiquement.
Dans le cas d'une couche organique sous fornle de spôts, on peut mettre la coucllc sunsible cii contact avec un fluicle contenant uii analyte à étuclicr.

Les llüallds sont illlmobillses sllr la cotlC.lle d'or cle façon conlltlC.

Par exemple, pour l'étucle d'intcractions cntre des olibonticléotides et des fragnZents Cl'A.I~I\T slnlple-brin à étudier, la cotlelle orgZnlClile 15 tlt(lisec potlr la fl\Iltion 5 d'oliboinicléotides sur la couche ci'or 14 est un polymère tel que par exemple le polypyrrole, les oligonucléoticles étant crcffés sur Ic polypyrrole. Ce polynière présent:: l'avantage cl'être très stable, ce qui permet cle réutiliser plusieurs fois la couclle orbanique 15 comprenant lcs sottclcs (oligonucléotidcs inlluobilisés). La réalisation et le dépôt d'une telle couclie de polypyrrole Dreffé sur une couche d'or sollt 10 par e~emple décrits dails les brcvets EI' 0 691 978 et FR 2 789 401.
Une fois la laine de verre 12 fixée sur la base du prisnle 4, elle est recouverte hermztiquement d'une cuve 16.
Cette cuve 16 est par exenlple en Téflon et permet dc faire passer des solutions d' analytcs à I'aide d'tin ou pltisictrrs tuyaux 17. Une ponipe péristaltique 19 à
15 débit variable p4tit alors être utilisée pour faire circuler ces solutions.
Alin d'optimiser l'introduc.tioli des solutions, la ponlpe péristaltiqtte 18 répond atLx critères suivants :
- être cornrnandabl:, à distance ;

- être capable de générer des débits coinpris entre quelques micro litres par miiiute et quelques centaines de uiicro litres par rninute (de l'ordre de 300 à 400 micro litreslniiri) ;
- permettrc tine coiniziande entrée!sortie de la vitesse de rotation clu débtit et de la fin de l'injection.
L'ensenible de la celltile cle réaction 3(prisnie 4 et cuve 16) peut être enCernté dans une enceiute adiabatique 19 représentée fi~ure 2, afin de contrôler et de fixer la tenlpérattire du systèrne et des produits injectés.

La tenlpérature scra par e.lenlple inaintenue à 37`C afin de perntettre la détectiou dc tout type dc illolc:cUles biolo~~T,iClt.Ies.

L'enccLnte 1diablticlue 19 coinprZn(1 de préférc.nce une otiverture (non représetltée) hernlettant d'accéder facilcineilt à la cellttle de détection 3.

Llle pcut comporter notantntent tm socle 20 chauffiult, tel qtte par etiemple tinc résistance etl cuivre, sur l:iquelle sera fixée la c.uve de réaction en Téflon 16. Cc socle 20 est rccouvert cl'tin couvercle 21 englobant l'ensemble cle la cellule cle détection

16 3.
Des hublots latéraux 22, 23 sont prévus dans le couvercle 21 afin de laisser passer les faisceaux lumineux de part et d'autre du prisme. Ils sont par exemple en verre ou tout autre matériau laissant passer les faisceaux lumineux sans les perturber.
Un bobinage non représenté enroulé autour du tuyau 17 de la cuve 16 permet de maintenir les produits injectés à la température de la cellule.
Un système d'imagerie et de détection 5 est disposé du côté de la face de sortie du prisme 4 afin de récupérer le faisceau réfléchi par la base de ce dernier.
Ce système comprend un système afocal de conjugaison et de grandissement 24 et une caméra CCD 25.
Le système afocal de grandissement 24 permet ici d'agrandir l'image de la zone utile de la lame d'or 14 sur l'ensemble de la caméra CCD 25.
La zone utile de la lame d'or 14 est par exemple de l'ordre de 25 mm2 environ.
Dans le mode de réalisation représenté, un agrandissement G=1,6 est réalisé
et un système d'ouverture numérique O.N. = 1,6 est utilisé pour conjuguer l'image sur le plan de la caméra CCD 25.
Le système afoca124 peut par exemple comprendre une lentillé 26de focale F' = 50mm et de diamètre 35 mm, puis une autre lentille 27 de focale F' = 80 mm et de diamètre 40 mm.
La lentille 26 est disposée de façon telle que l'image de la partie utile de la couche active après réfraction sur la face de sortie du prisme est située dans le plan focal objet de 26. Il en résulte que l'image se forme dans le plan focal image de la lentille 27.
Le système de conjugaison peut aussi être constitué par exemple d'une première lentille de focale 80 mm et de diamètre 31,5 mm, et d'une seconde lentille de focale 65 mm et de diamètre 25 mm (l'ensemble présentant une ouverture de 2,6). Pour concevoir ce système optique, on peut utiliser des logiciels de calculs optiques commerciaux tels que CODE V (Optical Research Associates).
La caméra CCD 25 (ou simplement une matrice CCD) peut par exemple présenter une surface sensible de 6,4mm x 5,8mm composée de 768 x 576 pixels.
Le détecteur CCD peut également être par exemple une caméra à tête déportée de format 1,5 pouce, de surface sensible 6,4 x 4,8 mm2, comprenant 751 x 582 pixels actifs, avec un signal échantillonné sur 8 bits, ou bien une caméra compacte de

17 format 2/3 pouce, de surface sensible 8,57 x 6,86 mm2, comprenant 1280 x 1024 pixels actifs avec un signal échantillonné sur 12 bits. Il s'agit de caméras commerciales.
Tous les éléments du dispositif selon l'invention sont contrôlés automatiquement au moyen d'une chaîne informatique non représentée.
Le procédé d'utilisation dudit dispositif comprend les étapes suivantes :
- balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 recouverte de la couche d'or 14 et de la couche à caractériser 15 ;
- détermination de l'angle d'incidence pour lequel la sensibilité du système d'imagerie et de détection 5 est maximale pour l'ensemble de la lame 12 ;
- positionnement du miroir oscillant 7 pour obtenir cet angle d'incidence ;
- mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection 5 en fonction du temps.
Le dispositif est alors utilisé pour caractériser la surface des zones actives à
caractériser de la couche 15.
Le dispositif peut être appliqué à l'étude d'interactions moléculaires.
Afin de mesurer les interactions entre la couche organique 15 et des analytes, l'étape de mesure de la réflectivité est réalisée simultanément à
l'introduction dans la cellule de réaction 3 d'analytes (non marqués) dont les interactions avec les ligands de la couche organique 15 sont à analyser.
On mesure ainsi l'évolution des interactions entre la couche organique 15 et les analytes introduits.
Ces mesures peuvent être réalisées dans des conditions non sélectives, de sorte que toutes les interactions peuvent se produire et être étudiées.
Le système d'imagerie et de détection 5 permet de mesurer l'épaisseur optique, produit de l'épaisseur géométrique et de l'indice de réfraction du milieu, en tout point de la partie utile de la couche d'or 14.
Il est ainsi possible de visualiser topologiquement les zones d'égale épaisseur optique et de caractériser la surface.
Ainsi, lors du balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 couverte de la couche d'or 14, le système 5 permet de déterminer l'épaisseur géométrique de chaque point de la couche 14 et donc de vérifier l'état de surface de celle-ci.
Le contraste mesuré lors du balayage sert par ailleurs de niveau de référence

18 pour la mesure en temps réel.
Lors de la mesure en temps réel, le système d'imagerie et de détection 5 mesure la variation de la réflectivité par rapport au niveau de référence enregistré lors du balayage angulaire.
Cette mesure de la variation de la réflectivité est réalisée en tout point de la partie utile de la couche d'or 14.
La réflectivité variant en fonction des espèces moléculaires présentes en surface, cette mesure permet une analyse qualitative en déterminant les différentes interactions entre la côuche organique 15, la couche d'or 14 et les molécules introduites.
Ainsi, lorsque l'on se place à l'angle optimisant la sensibilité du dispositif, une variation positive de la réflectivité signifie la présence d'analytes en interaction avec les ligands de la couche organique 15, une variation nulle signifiant l'absence d'analyte interagissant.
Une variation négative représente alors au contraire une perte de matière, c'est-à-dire une dégradation de la couche 15.
La mesure de l'amplitude de la variation de la réflectivité en temps réel permet quant à elle d'accéder au nombre de molécules d'analytes par unité de surface et donc à la concentration en chaque point (sur chaque spot) de la couche d'or 14 des molécules d'analyte introduites.
Le dispositif selon l'invention permel donc également une analyse quantitative des molécules ayant interagi avec les ligands de la couche 15.
Selon la force de la liaison entre la couche 15 et la couche d'or 14 et la nature des interactions étudiées, il sera possible en fin de mesure de régénérer la couche organique 15 en éliminant toutes les molécules d'analyte ayant réagi avec elle.
Il est alors possible de réutiliser la couche 15 pour étudier des interactions avec de nouvelles molécules d'analytes.
Afm d'optimiser la sensibilité de la mesure, on peut également optimiser la répartition des spots fixés sur la couche 15. Il est en effet nécessaire que le nombre de sondes (ligands) par spot soit suffisamment élevé pour se distinguer du bruit de fond du signal mesuré, sans pour autant que les sondes soient trop proches les uns des autres. En effet, un nombre important de sondes entraîne un encombrement stérique important et gêne l'interaction de molécules avec des sondes voisines. Dans le cadre de l'étude d'interactions entre oligonucléotides et des fragments d'ADN simple-brin à
étudier le

19 procédé selon l'invention présente de nombreux avantages. Les interactions sont étudiées dans des conditions d'hybridation non sélectives, par exemple à une température de l'ordre de 37 C, de sorte que toutes les interactions entre les réactifs pourront être observées simultanément.
Le dispositif permet de suivre en même temps et sans marqueurs plusieurs centaines d'interactions moléculaires à la fois. Il est capable notamment de discriminer la présence d'une mutation ponctuelle au sein d'un fragment d'ADN.
La technique de discrimination repose sur le fait que l'association moléculaire peut être soit totale si la séquence de l'ADN est strictement complémentaire de celle de l'oligonucléotide, soit partielle si la séquence d'ADN possède une base mutée.
La thermodynamique appliquée à l'ADN montre que suivant le type de mutation, pour une localisation fixe dans la séquence, l'épaisseur optique varie. Il s'ensuit que le dispositif peut déterminer précisément le type de mutation.
Dans des conditions non sélectives, si une séquence normale et les trois séquences portant la mutation d'une des bases de ladite séquence, c'est-à-dire les quatre séquences dont l'une des bases a été mutée, sont déposées sous forme de quatre plots différents sur la couche d'or 14, le dispositif peut mesurer un signal différent pour chacune des séquences immobilisées.
En effet, quelle que soit la séquence du fragment à analyser, le dispositif mesure une interaction totale et trois interactions partielles.
En fonction des séquences immobilisées, il suffit alors de se reporter aux tables existant donnant la force d'interaction entre bases pour remonter à la nature exacte de la séquence d'ADN.
Dès lors, si le système de détection est calibré, par exemple par rapport à la valeur d'un signal totalement complémentaire, il n'est plus nécessaire d'immobiliser la séquence normale et les trois séquences mutées : l'immobilisation d'une seule séquence est suffisante.
La capacité d'adresser des séquences d'ADN sur un substrat solide est donc multipliée par quatre.
Le dispositif selon l'invention suivant en temps réel et directement les interactions moléculaires, il n'est pas nécessaire de réalisér la mesure à une température favorisant une seule interaction comme dans le cas des méthodes utilisant des marqueurs fluorescents.
En effet, ces niétliodes ne permettent de révéler qu'une seule interaction visible à une température donnée. Si ces méthodes étaient employées à
température ambiante, tous les marqueurs émettraient de la fluorescence en même temps et ne 5 pourraient donc être différenciés.
Les exemples suivaiits illustrent l'invention.
Exemples de configuration de prismes 1) Données pour un verre d'indice n=1,776 :
10 - Matériau : SF11 (fournisseur : SCHOTT).
- Angle au sommet optimal : 30,6 .
- Coefficient d'anamorpliose : 0,479.
- Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 4,17 %.
15 2) Données pour un verre d'indice n=2,20 :
- Matériau : niobate de lithiuni LiNbO3 (fournisseur : CRYSTAL
TECHNOLGY, Inc., Palo Alto CA).
- Angle au sommet optimal : 77,4 .
- Coefficient d'anamorphose : 0,7.

20 - Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image: 1,57 %.
3) Données pour un verre d'indice n=3,33 :
- Matériau : GaAs (fournisseur : AXT, Inc., Palo Alto CA).
- Angle au sommet optimal : 123,7 .
- Coefficient d'anamorphose : 0,89.
- Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 0,5 %.
Le dimensionnement des prismes a été réalisé à l'aide du logiciel MATLAB
(société MATH WORKS), qui permet d'établir des algorithmes appropriés, selon des méthodes connues. Pour un indice n donné, il existe au moins un angle au sommet permettant que l'image intermédiaire de la base du prisme à travers de la face de sortie soit perpendiculaire à l'axe optique du second système afocal de conjugaison.
On recherche ensuite de la mêmé façon les couples (indice - angle au sommet) qui donnent un débattement angulaire mininltmi pour cette image intermédiaire.

21 Les prismes peuvent être également réalisés à l'aide de monocristatuc tels que le tantalate de litliiuin (LiTaO3), le niobate de lithium (LiNbO3).

Il s'agit de matériaux biréfringents, c'est-à-dire qu'ils peuvent présenter un indice différent suivant l'état de polarisation de la lumière. Cet inconvénient peut être surmonté par exemple en orientant les axes du cristal de façon que l'indice de réfraction effectif, en polarisation transverse magnétique, soit le même quel que soit l'angle d'incidence du faisceau sur la zone utile.
Une autre solution est d'utiliser des matériaux semi-conducteurs tels que l'arséniure de gallitun, le germanitun (indice de l'ordre de 4) ou encore le silicium (indice d'environ 3,9).
Tous ces matériaux présentent une bonne transmission dans l'infrarouge, ce qui est favorable compte tenu des caractéristiques intéressantes des plasm.ons de surface à des longueurs d'onde élevées.

Exemples d'applications :

1) Discriminations de mutations ponctuelles On dispose d'une zone sensible munie de quatre séquences d'ADN de 25 bases de long, une séquence normale ou native (WT) du gène K-ras, tme séquence test (CP) qui servira de témoin négatif et deux séquences mutées, M1 et M5 qui ne diffèrent de la séquence native que d'une seule base sur le même codon.
On sait que les mutations du gène K-ras engendrent presque systématiquement un cancer, d'où la nécessité d'identifier les ir.dividus pbssédant u.ne mutation.
Ces quatre séquences ont été immobilisées, sous la forme de quatre plots, de façon covalente, par tul procédé électrochim.ique décrit dans les demandes de brevet WO 94/22889 et WO 00/47317.
La première étape consiste à étudier la réflectivité de la zone sensible en fonction de l'incidence externe, pour déterminer l'angle où se placer pour observer les hybridations avec un maximtun de sensibilité. Ensuite, on injecte la séquence complémentaire de CP, dans un tampon d'hybridation à 22 C (BPS, NaCI 137 mM), afm de démontrer que seul le plot CP réagit, ce qui est le cas. L'expérience ayant garanti par l'étape précédente que le' système est sélectif, on injecte ensuite, après avoir

22 régénéré le système avec une solution d'hydroxyde de sodium 50 mM, la séquence complémentaire de WT, qui réagit très bien avec le plot WT, peu avec les deux plots correspondants aux séquences mutées et pas du tout avec le plot CP. Puis on régénère et on injecte la séquence complémentaire de Ml, qui réagit très bien avec le plot Ml, peu avec WT et M5 et pas du tout avec CP. La dernière injection donne les résultats attendus : le complémentaire de M5 réagit très bien avec M5, peu avec WT et M1 et pas avec CP.
On peut mesurer les affmités pour chacune de ces hybridations et affirmer que suivant le nombre de molécules ayant interagi sur les plots natifs ou mutés, et suivant la valeur de l'affinité, on peut discriminer de cette manière une mutation ponctuelle et même identifier le type de mutation.
Après établissement des courbes de réflectivité étalons, en fonction du temps, pour les quatre types d'hybridation, on peut détecter, par comparaison, une mutation ponctuelle avec seulement deux sondes, comme indiqué dans la description.
2) Analyse d'interactions protéine-protéine On dispose d'une zone sensible munie de quatre plots dont trois portent des anticorps. Deux anticorps sont dirigés contre l'hCG, hormone de grossesse humaine qui, quand elle est détectée chez l'homme, est très souvent indicatrice d'un cancer des testicules. Le troisième anticorps est un anticorps anti-lapin, qui ne croise pas avec l'homme. Il a été simplement absorbé sur un plot de polymère. Le dernier plot ne contient que du polymère, sans anticorps.
On injecte d'abord de l'albumine sérique bovine, qui limite l'adsorption passive de molécules non spécifiquement reconnues, jusqu'à saturation. On injecte ensuite l'hCG dans un tampon PBS. Le plot ne portant que du polymère a une cinétique nulle (aucune évolution de la réflectivité en fonction du temps). Le plot portant l'anticorps anti-lapin a une cinétique qui décroît ; cela signifie que les anticorps, faiblement liés aux polymères, sont désorbés et évacués de la cuve de réaction. Les deux autres plots ont chacun une cinétique de forme exponentielle, signe de la reconnaissance de l'hCG par les anticorps. Toutefois, les deux anticorps anti-hCG étant différents, on note une différence de la pente à l'origine des cinétiques d'interaction. En effet, leur affinité pour l'hCG n'est pas la même . Pour l'un des anticorps, on a déduit des résultats de réflectivité que l'affinité est de 8.10-10, soit la même valeur que celle mesurée

23 indépendamment par une technique ELISA.
L'invention a également pour objet l'application du procédé décrit ci-dessus à la mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires telles que décrites dans la présente demande.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Dispositif d'imagerie, permettant de mettre en oeuvre un procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ladite couche sensible étant déposée sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel:
a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, appelée partie utile, de ladite surface, et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la face de sortie du prisme, b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins une partie, ou de la totalité, des zones actives, est minimum, c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la sensibilité de détection des zones actives est maximale, d) on règle l'incidence à la valeur optimale déterminée à
l'étape précédente, e) et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du faisceau émergent provenant de la partie utile, le dispositif comprenant:
- un prisme (14) optique ayant une face d'entrée, une face de sortie et une base munie d'une couche sensible, ledit prisme étant caractérisé par son angle au sommet et par l'indice de réfraction du matériau qui le constitue, - un premier système afocal de conjugaison optique, disposé du côté

de la face d'entrée du prisme, et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau lumineux incident collimaté l'ayant traversé
se dirige vers ladite face d'entrée, se réfracte puis frappe la base du prisme où il subit une réflexion totale et ressort après réfraction sur la face de sortie en formant un faisceau émergent, ledit premier système de conjugaison ayant une orientation et une ouverture telles que ledit faisceau incident réfracté sur la face d'entrée vienne éclairer la totalité d'au moins une partie dite utile de ladite couche sensible, et y subir une réflexion totale lorsque la direction du faisceau incident varie, de part et d'autre dudit axe optique, sur une plage angulaire d'au moins 100 au total, ladite partie utile contenant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, - un second système afocal de conjugaison optique (15) disposé du côté de la face de sortie du prisme et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est orienté de façon qu'un faisceau incident parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison donne un faisceau émergent parallèle à l'axe optique du second système de conjugaison, - un système de détection ayant une surface sensible plane qui est apte à recevoir et à analyser la lumière ayant traversé ledit second système de conjugaison, et qui est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci, dans lequel:
(i) ledit second système de conjugaison a une ouverture telle qu'il est traversé par la totalité de la lumière provenant de la zone utile lorsque la direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, et le second système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la surface sensible du système de détection, et (ii) l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceau incident est parallèle à l'axe optique du premier système de conjugaison, l'image intermédiaire de la partie utile, à travers la face de sortie du prisme, qui constitue l'objet pour le second système de détection, est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci.

2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel, l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, le débattement angulaire de l'image intermédiaire de la zone utile formée à travers la face de sortie ne dépasse pas les limites de la profondeur de champ du second système de conjugaison.

3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel ladite plage angulaire est d'au moins 12°, ou d'au moins 14°, ou d'au moins 16°.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le grandissement du second système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la totalité de la surface sensible du système de détection.

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit second système afocal comprend un premier système dioptrique, par lequel le faisceau émergent entre, et un second système dioptrique par lequel la lumière ressort pour se diriger vers la surface sensible du système de détection, et dans lequel ladite image intermédiaire à travers la face de sortie du prisme est dans le plan objet dudit premier système dioptrique.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ledit système optique déflecteur comprend un miroir plan tournant (7) apte à pivoter autour d'un axe parallèle à une arête du prisme, ledit miroir étant le seul élément mobile du dispositif.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le dispositif de détection est apte à analyser la lumière de façon à
mesurer et/ou comparer la réflectivité de toute région ponctuelle de la partie utile.

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le dispositif de détection comprend une matrice CCD ou C-MOS.

9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la couche mince métallique comporte, sur les zones actives, au moins une population de ligands immobilisés.