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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur ortsaufgelösten Messung
chemischphysikalischer Eigenschaftsänderungen dünner, auf einen – vorzugsweise
metallbeschichteten – transparenten
Träger aufgebrachter
Schichten. Die Messung wird hierbei mittels eines aufgeweiteten
Laserstrahls vorgenommen, der aus verschiedenen Winkeln durch den transparenten
Träger
auf den Metallfilm gerichtet wird. Unter bestimmten Einstrahlwinkeln
werden bei geeigneten Metallschichtdicken Oberflächenplasmonen angeregt, die
mit dem einfallenden elektromagnetischen Feld Wechselwirken und
die reflektierte Strahlung teilweise auslöschen. Der Einstrahlwinkel unter
dem dieses Reflektionsminimum – das
sogenannte SPR Minimum – auftritt,
hängt vom
Brechungsindex des dem Metallfilm unmittelbar benachbarten Mediums
ab. Mit Brechnungsindexänderungen
auf der Metalloberfläche
einhergehende Adsorptions- oder Desorptionsprozesse lassen sich
somit hochempfindlich in Echtzeit detektieren.
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Sensorbasierende
bioanalytische Verfahren und Instrumente nehmen seit einigen Jahren
einen immer höheren
Stellenwert in der biotechnologisch/medizinischen Grundlagenforschung
und in der Pharmaentwicklung ein. Der Grund für diese rapide Entwicklung
liegt vor allem im steigenden Bedarf nach schnellen Analysenverfahren,
die quantitative Daten über
biomolekulare Wechselwirkungen liefern. Optische Affinitätssensoren
kommen diesem Bedarf auf ideale Weise entgegen, da sie biomolekulare
Bindungsereignisse verzögerungsfrei
in Echtzeit und ohne die Verwendung interferierender Label zu detektieren
vermögen.
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Mit
dem Aufkommen hochparalleler Ansätze zur
Analyse komplexer Nukleinsäure-(Genomics) oder
auch Proteingemische (Proteomics) sowie der steigenden Verwendung
kombinatorischer Syntheseverfahren bei der pharmazeutischen Wirkstoffsuche wird
darüber
hinaus die Hochdurchsatzfähigkeit nachgeordneter
Analyseverfahren zu einem zentralen Kriterium. Dieser Bedarf ließe sich
vorteilhaft durch optische Sensoren decken, mit denen eine Vielzahl
von Bindungsreaktionen parallel gemessen werden können. Im
Unterschied zu den heute erhältlichen
Geräten
müßten derartige
Sensoren jedoch nicht mehr nur wenige einzelne Meßpunkte
erfassen, sondern das Bild eines ganzen Sensorarrays analysieren
können.
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Aus
dem Stand der Technik sind eine Reihe verschiedener optische Detektionsprinzipien
bekannt, die zur Echtzeitanalyse von biomolekularen Wechselwirkungen
eingesetzt werden können.
Die meisten Verfahren nutzen hierfür durch Bindungsreaktionen
an der Sensoroberfläche
auftretende Brechungsindexänderungen.
Am verbreitetsten ist wohl die weiter oben bereits erläuterte Oberflächenplasmonenresonanz – SPR (engl.
,Surface Plasmon Resonance'),
die sich apparativ relativ einfach realisieren läßt. Die Verschiebung des SPR
Minimums wird üblicherweise
entweder spektral oder – häufiger – winkelaufgelöst vermessen.
Die spektral aufgelöste Detektion,
die in der Regel nicht so empfindlich wie die winkelaufgelöste Methode
ist, wird mit Vorteil dort angewendet, wo aus apparativen Gründen eine
winkelaufgelöste
Detektion nicht möglich
ist. Ein Beispiel stellt die faseroptische SPR dar (
WO 94/16312 A1 ), in der
man Licht einer breitbandigen Lichtquelle in eine goldbeschichtete
optische Faser einkoppelt und die Verschiebung der Resonanzwellenlänge mißt.
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Die
winkelaufgelöste
Detektion wird zum Beispiel in
WO
90/05305 beschrieben. In diesem Aufbau wird der Metallfilm
mit konvergenten Lichtstrahlen beleuchtet, und die Winkelverschiebung
mittels einer Diodenarray/Linsensystemkombination verfolgt. Ein
solches Gerät
verlangt einen relativ großen, mechanisch
sehr massiv ausgebildeten Meßkopf, der
einen derartigen Aufbau aufwendig macht. Eine apparativ einfachere
Variante, wie in
DE 19817472 dargestellt,
bedient sich zur Ermittlung der SPR Minimumsverschiebung lediglich
zweier Photodioden und ist damit etwas einfacher im Aufbau. Ein
grundsätzlich
anderes Prinzip wird von Kooyman et al. beschrieben (R.P.H. Kooyman,
A.T.M. Lenferink, R.G. Eenink und J. Greve (1990) Anal. Chem., 63,
pp. 83–85).
Hier wird der Winkel des einfallenden Laserstrahls mit einem Scannerspiegel über die
Zeit variiert und die korrespondierende Intensitätsänderung des reflektierten Lichts
mittels einer Photozelle detektiert. Das dort beschriebene System
liefert gute Ergebnisse für
wenige Messpunkte und ist relativ unaufwendig.
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Andere
Detektionsprinzipien umfassen beispielsweise den Resonant Mirror
(Cush, R., Cronin, J.M., Goddard, N.J., Maule, C. H., Molloy, J.
und Stewart, W.J. (1993) Biosensors & Bioelectronics, 8, pp. 347–353), das
integriert optische Interferometer (
DE 4033357 ),
das Differenzinterferometer (Fattinger, Ch., Koller, H., Schlatter,
D. und Wehrli, P. (1993) Biosensors & Bioelectronics, 8, pp. 99–107), den
Gitterkoppler (Tiefenthaler, K. (1992) Advances in Biosensors, Vol.
2, pp. 261–289)
oder das reflektometrische Interferenzspektrometer (
DE 19615366 A1 ). Bei allen hier
genannten Techniken ist jedoch die Herstellung des austauschbaren
Sensors deutlich aufwendiger als bei der SPR, so daß diese
Verfahren – neben
anderen Nachteilen – vor
allem aus wirtschaftlich-produktionstechnischen Gründen der
SPR unterlegen sind.
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Allen
oben aufgeführten
Verfahren ist gemein, daß sie
nicht ortsaufgelöst
arbeiten und somit nicht multianalytfähig sind. Es wurden deshalb
in den vergangenen Jahren mehrere Ansätze entwickelt, die paralleles
Messen auf verschiedenen Teilflächen des
Sensorchips ermöglichen.
Eine diesbezügliche Weiterentwicklung
des oben bereits erwähnten
Gitterkopplers wird beispielsweise in
WO
95/03538 oder
EP
1031828 A1 beschrieben; aus
DE 19828547 A1 ist ein ortsaufgelöstes reflektometrisches
Interferenzspektrometer bekannt. Neben dem Nachteil der aufwendigen
Fertigung der austauschbaren Sensoren, haben diese Systeme zudem
den Nachteil, daß sie die
Sensorfläche
in diskrete und relativ große
Bereiche aufteilen und die Geräte
folglich entweder recht groß werden
oder eine eingeschränkte
Kapazität
aufweisen.
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Da
sich SPR Sensoren technisch leichter realisieren lassen und eine
freie, theoretisch fast beliebig kleine Aufteilung der Sensorfläche ermöglichen,
existieren hier deutlich mehr Lösungsansätze. So
wurde bereits 1988 das erste bildgebende SPM (engl. ,Surface Plasmon
Microscope') entwickelt (Knoll,
W. und Rothenhäusler,
B. (1988) Nature, 332, pp. 615–617).
Bei diesem und anderen bekannten Verfahren (
DE 19829086 , sowie Frutos, A.G. und Corn,
R.M. (1998) Anal. Chem., July 1, pp 449A–455A) wird ein aufgeweiteter
Laserstrahl unter einem festen Winkel auf eine Metallfläche gestrahlt und
die Intensitätsänderungen
des auf eine CCD Kamera reflektierten Bildes ausgewertet. Hauptnachteil dieser
Methode ist, daß für die einzelnen
Bildpunkte lediglich Graustufenänderungen
und nicht die Winkel der SPR Minima erfaßt werden. Hieraus resultiert eine
deutlich schlechtere Empfindlichkeit und ein stark eingeschränkter dynamischer
Bereich. Hinzu kommt, daß die Änderung
einzelner Helligkeitswerte unter manchen Bedingungen nicht eindeutig
ist – es läßt sich
dann nicht feststellen, in welche Richtung das SPR Minimum verschoben
wird.
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Eine
Verbesserung der beschriebenen SPM Technik ist in
DE 3909144 offengelegt. Hier wird
unter verschiedenen Einstrahlwinkeln ein Bild der Sensoroberfläche aufgezeichnet
und mit einer nachgeschalteten Bildauswertung der SPR Minimumswinkel für bis zu
5 × 5 μm kleine
Flächenabschnitte
bestimmt. Obwohl mit diesem Verfahren prinzipiell eine recht hohe
Genauigkeit erzielt werden kann, müssen zur Bilderzeugung sowohl
Einstrahl- als auch Reflektionswinkel verändert werden, was mechanisch
aufwendig ist und sich nur mit einer niedrigen Datenaufnahmefrequenz
realisieren läßt. Eine
zweidimensionale schnelle Echtzeitanalyse von Bindungsreaktionen
auf der Chipoberfläche
ist mit dieser Anordnung deshalb nicht möglich.
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Aus
WO 00/22419 ist ein ortsauflösender SPR
Sensor mit spektraler Detektion bekannt. Dieser bedient sich jedoch
beweglicher Loch- oder Schlitzblenden, um sukzessiv verschiedene
Bereiche der Sensoroberfläche
zu beleuchten, wodurch der apparative Aufwand steigt, die Datenaufnahmefrequenz verlangsamt
wird und die Größe der einzelnen
Meßpunkte
von vorneherein festgelegt ist.
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In
WO 99/30135 wird ein SPR
Gerät mit
winkelauflösender
und spektraler Detektion beschrieben. Für die Ausführung als bildgebender Sensor wird
die Verwendung einer Maske oder eines Linsenarrays vorgeschlagen.
Die Nachteile dieser Anordnung entsprechen weitestgehend denen des
im vorhergehenden Abschnitt erwähnten
Sensors.
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Ein
System mit mechanischer Veränderung des
Einstrahlwinkels und ebenfalls mechanischer Änderung der xy Position des
Meßpunktes
auf dem Sensorchip ist aus
WO
00/46589 bekannt. Nachteilig sind hier vor allem der aufwendige
Aufbau und die großen
beweglichen Baugruppen, die eine niedrige Datenaufnahmefrequenz
zur Folge haben.
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Des
weiteren beschreibt
EP 0973023 einen kompakten
SPR Transducer mit winkelauflösender Detektion.
Hier wird der Meßbereich
und das Detektorarray in mehrere Teilbereiche unterteilt, für die jeweils
ein separates SPR Signal aufgenommen wird. Auch bei diesem Ansatz
ist die Größe des Meßbereichs
durch den Transducer determiniert und verhältnismäßig groß. Eine echte Hochdurchsatzfähigkeit
dürfte
deshalb nur begrenzt gegeben sein. Außerdem kann der Metallfilm
(Sensorchip) nicht ausgetauscht werden, was die Einsatzmöglichkeit
als Biosensor stark einschränkt.
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WO 98/34098 beschreibt einen
ortsauflösenden
SPR Sensor bei dem mit Hilfe eines komplexen Linsen- und Spiegelsystems
der SPR Minimumswinkel für
eine Vielzahl von Bildpunkten synchron bestimmt wird. Mit diesem
Aufbau läßt sich
zwar eine relativ hohe Meßfrequenz
realisieren, jedoch ist er apparativ sehr aufwendig.
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Zusammenfassend
kann gesagt werden, daß ein
hochauflösender
SPR Transducer mit schneller Erfassung des SPR Minimumswinkels für jeden
Bildpunkt bis heute nur in einer sehr aufwendigen Bauweise entwickelt
wurde. Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges,
apparativ einfach zu realisierendes Gerät zur Verfügung zu stellen.
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Die
Aufgabe wird durch die Vorrichtung gemäß unabhängigen Anspruch 1 und das Verfahren gemäß unabhängigen Anspruch
19 gelöst.
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Die
Erfindung offenbart eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung
dünner
Schichten mittels Oberflächenplasmonenresonanz,
mit
einem transparenten Träger
(4) mit einer Fläche
(5) auf welcher die Schichten angeordnet werden können;
einer
Vorrichtung zur Beleuchtung der Fläche des Trägers durch den transparenten
Träger
unter verschiedenen Einfallswinkeln mit parallel verlaufendem Licht,
wobei die Veränderung
des Einstrahlwinkels über
die Zeit ausschließlich
mit Hilfe eines einzigen beweglichen Spiegels, erfolgt und gleiche
Teilstrahlen des einfallenden Strahlenbündels für unterschiedliche Einstrahlwinkel
verschiedene Punkte der Trägeroberseite
bestrahlen;
einem Detektor (6) zur ortsaufgelösten Erfassung
der Intensität
des von der Fläche
des Trägers
(4) reflektierten Strahlung für verschiedene Einfallswinkel,
wobei das von einem beliebigen Punkt der Fläche des Trägers reflektierte Licht für unterschiedliche
Einfallswinkel auf unterschiedliche Punkte des Detektors trifft,
und der Detektor (6) zur Erfassung der reflektierten Strahlung
für verschiedene
Einfallswinkel der reflektierten Strahlung nicht nachgeführt werden
muss; und einer Auswertungseinheit, zur ortsaufgelösten Ermittlung
der Abhängigkeit
der Intensität
des reflektierten Lichts vom Einstrahlwinkel anhand der für verschiedene
Einfallswinkel ortsaufgelöst
erfassten Intensität,
wobei
die Auswertungseinheit geeignet ist, vor der ortsaufgelösten Ermittlung
von Eigenschaften der zu untersuchenden Schichten für Punkte
(a, b, c) der Schichten die in Abhängigkeit des Einfallswinkels
an Positionen (i, k) des Detektors erfassten Intensitäten des reflektierten
Lichts den winkelabhängig
verschiedenen Punkten (a, b, c) der Schichten zuzuordnen.
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Der
Träger
umfaßt
zur Einkopplung des eingestrahlten Lichts beispielsweise ein dreieckiges oder
trapezförmiges
Prisma oder eine Platte mit einzelnen Prismen, wobei die Basis des
Prismas bzw. der Prismen entweder die Trägeroberseite bzw. die Fläche ist,
von der das eingestrahlte Licht reflektiert wird, oder als Fläche dient,
auf der eine vorzugsweise in optischer Hinsicht planparallele Platte
aufgesetzt wird. In diesem Fall erfolgt die Reflexion von der Oberfläche dieser
planparallelen Platte, die dann die Trägeroberseite bildet.
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Bei
Vorrichtungen zur Durchführung
der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie
ist die Trägeroberseite
mit einem Metallfilm beschichtet, der die Ausbildung einer möglichst
scharfen Plasmonenresonanz ermöglicht.
Hierzu sind insbesondere Ag- oder Au-Filme geeignet, wobei deren
Dicke bevorzugt etwa 45 bis 55 nm beträgt.
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In
einer weiteren Ausgestaltung befindet sich die Goldschicht auf einem
Gitter bzw. auf einer Vielzahl parallel angeordneter kleiner Prismen.
Diese Anordnung hat den Vorteil, daß sie sich kostengünstig durch
Spritzguß in
Kunststoff realisieren läßt und der
Träger
und das Prisma eine Einheit bilden, die leicht ausgewechselt werden
kann.
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Der
Detektor der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist geeignet die reflektierte Strahlung von einem Abschnitt der
Fläche
des Trägers über einen hinreichend
großen
Winkelbereich zu erfassen. Der Winkelbereich beträgt vorzugsweise
mindestens ± 1,5° um einen
mittleren Winkel, wobei der mittlere Winkel insbesondere etwa dem
Resonanzwinkel einer Plasmonenresonanz entsprechen kann. Der mittlere
Winkel ist in der derzeit bevorzugten Ausführungsform einstellbar, um
die Position des Detektors den aktuellen experimentellen Bedingungen
anzupassen. Während
der des Betriebs der erfindungsgemäßen Vorrichtung, d.h. während der
ortsaufgelösten
Erfassung der von dem Träger
reflektierten Strahlung braucht der Detektor dem geänderten
Winkel allerdings nicht mehr nachgeführt zu werden, da die Detektorfläche hinreichend
groß ausgelegt
ist, die reflektierte Strahlung über
den gesamten Winkelbereich zu erfassen.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
ermöglicht
somit eine schnelle Erfassung der reflektierten Intensität für verschiedene
Winkel, da auf eine mechanische Nachführung des Detektors verzichtet werden
kann, und somit auf die bei solchen Bewegungen auftretenden Beschleunigskräfte keine
Rücksicht
genommen werden muß.
Dies führt
zudem zu einem vereinfachten mechanischen und optischen Aufbau,
der die Herstellungskosten der erfindungsgemäßen Vorrichtung erheblich reduziert.
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Der
von dem Detektor erfassbare Winkelbereich um einen mittleren Winkel
beträgt
weiter bevorzugt mindestens ± 2,5°, und besonders
bevorzugt mindestens ± 5°. Der erfassbare
Winkelbereich um den mittleren Winkel ist vorzugsweise nicht größer als ± 20°, weiter
bevorzugt nicht größer als ± 15°, und besonders
bevorzugt nicht größer als ± 10°.
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Der
Detektor zur ortsaufgelösten
Erfassung der Intensität
der von der Trägeroberseite
reflektierten Strahlung, ist bevorzugt ein Photodiodenarray oder
eine CCD Kamera.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
ist als Plasmonenresonanzspektrometer ausgestaltet.
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Die
Abhängigkeit
der Intensität
des reflektierten Lichts vom Einfallswinkel kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ortsaufgelöst
erfasst werden, wobei gleiche Punkte der bestrahlten Fläche des
Trägers
bzw. der Trägeroberseite während der Veränderung
des Einstrahlwinkels auf verschiedenene Punkte des Detektors abgebildet
werden.
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Bei
der derzeit bevorzugten Ausgestaltung wird der Einfallswinkel mit
einem Drehspiegel bzw. Scannerspiegel variiert. Bei dieser Ausgestaltung
fallen gleiche Teilstrahlen des einfallenden Strahlenbündels durch
die Veränderung
des Einstrahlwinkels auf verschiedenene Punkte der Fläche des
Trägers bzw.
Trägeroberseite.
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Der
Scannerspiegel ist bevorzugt ein Galvanoscanner, dessen Steuerspannung
ausreichend ist, den aktuellen Einstrahlwinkel zu ermitteln. In
einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Teilstrahl des
von dem Spiegel reflektierten Lichts direkt auf einen zweiten Detektor
reflektiert, wobei sich aus der Position dieses Teilstrahls auf
dem zweiten Detektor der Einfallswinkel ermitteln läßt. In einer
weiteren Alternative ist an der Achse des Scannerspiegels ein Winkelgeber
angeordnet, der direkt ein winkelabhängiges Signal ausgibt.
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Die
Auswertungseinheit kann beispielsweise einen Computer umfassen,
mit vorzugsweise einem Speichermittel zum Speichern der für verschiedenen Winkel
gemessenen ortsaufgelösten
Intensitätsverteilung
des von der Fläche
reflektierten Lichtes; und einer Datenverarbeitungseinheit, welche
anhand der für
verschiedene Winkel gemessenen ortsaufgelösten Intensitätsverteilungen,
für verschiedene
Punkte der Fläche
des Trägers
die Intensität
als Funktion des Einfallswinkels ermittelt. Von dieser Datenverarbeitungseinheit
oder einer anderen Datenverarbeitungseinheit kann dann anhand der
winkelabhängigen
Intensität
für die
verschiedenen Punkte der Fläche
des Trägers
mindestens eine Eigenschaft einer auf dem Träger präparierten Schicht bestimmt
werden. Diese Eigenschaft kann insbesondere die Schichtdicke oder
die dielektrischen Eigenschaften der Schicht sein. Einzelheiten
zur Ermittlung der Schichtdicke bzw. der dielektrischen Eigenschaften
einer Schicht anhand der Winkelabhängigen Intensitätsverteilung sind
beispielsweise dem Fachmann auf dem Gebiet der Plasmonenresonanzspektroskopie
bekannt und brauchen hier nicht im einzelnen erörtert zu werden.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
ist vorzugsweise geeignet die beschriebene ortsaufgelöste winkelabhängige Intensitätsmessung
und die Ermittlung der mindestens einen Schichteigenschaft fortlaufend
durchzuführen.
D.h., die winkelabhängige
Intensitätsmessung über den
fraglichen Winkelbereich und die nachfolgende Auswertung wird wiederholt durchgeführt.
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Der
Einfallswinkel wird bevorzugt von dem Computer der Auswerteeinheit
gesteuert. Hierbei ist der zu überstreichende
Winkelbereich vorzugsweise variabel einstellbar, um der jeweiligen
experimentellen Fragestellung Rechnung zu tragen. Gleichermaßen ist
bei einer bevorzugten Ausführungsform
die Schrittweite zwischen den einzelnen Winkeln, bei denen eine
Messung der Intensität
erfolgt, variabel. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen,
daß die
Schrittweite nicht äquidistant
ist, sondern dem Informationsgehalt der einzelnen Winkelbereiche
entsprechend angepaßt
werden kann, d.h. die Schrittweite kann beispielsweise um das Minimum
der Plasmonenresonanz kleiner gewählt werden, als in Winkelbereichen
die außerhalb
der Resonanz liegen. In einer weiteren Ausführungsform ist außerdem die
automatische Ermittlung der Schrittweite möglich. Hierbei wird in einem
Initialisierungsmodus zunächst
die Intensitätskurve
grob erfaßt,
und anhand des ermittelten Kurvenverlaufs wird einerseits die Schrittweite für die einzelnen
Winkelbereiche festgelegt und/oder der gesamte Winkelbereich wird
auf die relevanten Bereiche, beispielsweise den ermittelten Plasmonenresonanzwinkel ± 1,25° oder ± 2,5° bzw. ± 5° verkleinert.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Untersuchung dünner
Schichten mittels Oberflächenplasmonenresonanz,
in dem die Schichten unter verschiedenen Einstrahlwinkeln derart
mit parallel verlaufendem Licht bestrahlt werden, dass das Licht
auf einen zweidimensionalen Detektor reflektiert wird und dann anhand
der winkelabhängig
unterschiedlichen Intensitäten
des reflektierten Lichts die Schichtdicke berechnet wird, ist dadurch
gekennzeichnet, dass durch die Winkeländerung bedingte Bildverschiebungen
auf dem Detektor vor der Ermittlung der Schichteigenschaften elektronisch
korrigiert werden, indem vor der ortsaufgelösten Ermittlung von Eigenschaften
der zu untersuchenden Schichten für Punkte (a, b, c) der Schichten
die in Abhängigkeit
des Einfallswinkels an Positionen (i, k) des Detektors erfassten
Intensitäten
des reflektierten Lichts den winkelabhängig verschiedenen Punkten
(a, b, c) der Schichten zugeordnet werden.
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Die
Korrektur erfolgt insbesondere durch elektronische Datenverarbeitung.
Bevorzugt erfolgt vor der Ermittlung der Schichteigenschaften noch eine
Korrektur der Helligkeitsschwankungen, die nicht durch Eigenschaften
der zu untersuchenden Probe bedingt sind. Hierzu kann beispielsweise
eine Korrektur für
die unterschiedlichen Intensitäten
der verschiedenen Teilstrahlen des eingestrahlten Lichts gehören, und/oder
eine Korrektur für
die winkelabhängige
Transmissionsfunktion der gesamten optischen Anordnung und/oder
eine Korrektur für örtliche Inhomogenitäten des
Detektors zur ortsaufgelösten Erfassung
der winkelabhängigen
Intensitätsverteilung
des reflektierten Lichts.
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Weitere
Vorteile und Gesichtspunkte ergeben sich aus den Unteransprüchen, der
Beschreibung und den Zeichnungen.
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Es
zeigt:
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1 eine
schematische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
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2 die
Winkelabhängigkeit
der Intensität der
reflektierten Strahlung für
verschiedene Probenpositionen ohne das Vorliegen einer Plasmonenresonanz;
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3a die
Winkelabhängigkeit
der Intensität der
reflektierten Strahlung für
verschiedene Probenpositionen bei Vorliegen einer Plasmonenresonanz;
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3b eine
vergrößerte Darstellung
des Resonanzminimums der Intensität der reflektierten Strahlung
für verschiedene
Probenpositionen; und
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4 die
Winkelabhängigkeit
der Signalposition auf dem Detektor für verschiedene Probenpunkte.
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Die
Erfindung soll nachstehend anhand eines in 1 schematisch
wiedergegebenen Ausführungsbeispiels
näher erläutert werden.
Gezeigt ist ein beispielhafter optischer Aufbau eines erfindungsgemäßen Oberflächenplasmonenresonanzsensors bzw.
SPR Sensors (nach dem Englischen Surface Plasmon Resonance) sowie
eines während
des Meßprozesses
auftretenden Strahlengangs.
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Das
optische System besteht aus einer bevorzugt monochromatischen Lichtquelle 1,
vorzugsweise einem Laser oder einer Laserdiode geeigneter Wellenlänge, deren
Strahlung mittels eines (nicht gezeigten) Polarisationsfilters parallel
zur Einfallsebene des nachgeschalteten Sensorchips 4, der
hier als Träger
dient, polarisiert wird. Der Durchmesser des Laserstrahls wird zunächst mit
einem handelsüblichen
Beam Expander 11 vergrößert und
mit einem Scannerspiegel 2 unter verschiedenen Einfallswinkeln
auf die Eintrittsfläche
eines Prismas 3 gelenkt. Ein Teilbereich des aufgeweiteten
Strahls trifft unter verschiedenen Einfallswinkeln auf die Unterseite
eines auf dem Prisma 3 befindlichen Sensorchips 4, der
auf seiner Oberseite 5 mit einer SPR fähigen Goldschicht bedampft
ist. Der Sensorchip 4 ist mittels Immersionsöl oder eines
geeigneten Kunststoffs mit dem Prisma 3 optisch verbunden.
Optional kann die Goldschicht auch direkt auf die Oberseite des
Prismas 3 aufgedampft sein, jedoch ist der sensitive Bereich
dann nicht mehr austauschbar.
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Die
Beleuchtung des Sensorchips unter verschiedenen Einfallswinkeln
erfolgt derart, daß das parallele
Strahlenbündel
während
der Messung über die
Oberfläche
hinwegstreicht, diese dabei aber zu jedem Zeitpunkt vollständig ausleuchtet;
ein bestimmter Punkt a, b, c des Sensorchips wird also je nach Einfallswinkel
von unterschiedlichen Teilstrahlen beleuchtet. In einer bevorzugten
Anordnung wird der Einstrahlwinkel bei einer Lichtwellenlänge von 660
nm in einem Bereich von ± 5° um einen
mittleren Winkel von etwa 75° gescannt.
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Das
von der mit Gold beschichteten Oberfläche 5 reflektierte
Licht tritt aus dem Prisma aus und fällt auf einen abbildenden Detektor 6,
vorzugsweise einen CCD Detektor oder ein Photodiodenarray.
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2 zeigt
beispielsweise wie sich die unterschiedliche Intensität der verschiedenen
eingestrahlten Teilstrahlen auf die Intensität des von den Punkten a, b,
c der Oberfläche 5 reflektierten
Lichts auswirken kann, welches bei dem Detektor 6 ankommt. In
diesem Fall weist die Oberfläche 5 keine
SPR-fähige
Goldschicht auf. Alle Kurven zeigen die charakteristische Totalreflexionskante,
und ansonsten das durch die Transmissionseigenschaften der Grenzflächen vorgegebene
Verhalten. Die Kurven weichen jedoch insoweit voneinander ab, als
die Punkte a, b, c bei unterschiedlichen Winkeln mit maximaler Intensität beleuchtet
werden.
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3a zeigt,
wie sich die zuvor beschriebenen unterschiedlichen Einstrahlintensitäten auf
das vom Detektor empfangene Signal einer Plasmonenresonanz auswirken.
Das eigentliche Resonanzverhalten ist in Kurve d gezeigt, wobei
das vom Detektor 6 empfangene Signal von den Punkten a,
b, c den mit den entsprechenden Buchstaben gekennzeichneten Verlauf
hat. Durch Normierung mit den Kurven der 2 kann ggf.
der eigentliche Resonanzverlauf d für die jeweiligen Punkte a,
b, c gefunden werden.
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Erschwerend
kommt noch hinzu, daß die Punkte
a, b, c des Sensorchips 4 je nach Einfallswinkel auf unterschiedliche
Bereiche i, k des Arrays 6 abgebildet werden. Die winkelabhängige Bildverschiebung
des Signals von den Punkten a, b, c ist schematisch in 4 dargestellt.
Es ist deshalb notwendig, mittels einer zweckmäßigen Auswertungsvorrichtung und
eines Korrekturalgorithmus die einzelnen Bildpunkte i, k des CCD
Arrays 6 je nach Einstrahlwinkel (Position des Scannerspiegels 2)
einem bestimmten Punkt a, b, c auf der Sensorchipoberfläche 5 zuzuordnen.
Gleichzeitig oder sequentiell können
hierbei die oben erörterten
beispielsweise durch Strahlinhomogenitäten verursachte Helligkeitsschwankungen der
reflektierten Teilstrahlen korrigiert werden.
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Die
Auswirkung der beschriebenen Bildverschiebung und der Intensitätsinhomogenenitäten ist nochmals
in 3b für
den Bereich um den Plasmonenresonanzwinkel dargestellt. Ein erstes
Pixel i empfängt
mit anwachsendem Winkel zunächst
von dem Punkt a, dann von dem Punkt b, und schließlich von
dem Punkt c reflektiertes Licht vor dem Resonanzminimum. Zufällig erfaßt das gewählte erste
Pixel i für
diese Punkte bei den unterschiedlichen Winkeln etwa die gleiche
Intensität.
Ein zweites Pixel k empfängt
die Signale von den Punkten a, b, c nach dem Durchgang durch das
Resonanzminimum. Hier zeigt sich dagegen mit wachsendem Winkel ein
dramatischer Anstieg der erfaßten
Intensität
für das
Signal von den Punkten a, b, und c. Dieses Beispiel verdeutlicht,
daß es
für den
Erfolg des beschriebenen Verfahrens daher von höchster Bedeutung ist, die von
einem Pixel i, k erfaßten
Signale dem richtigen Winkel und dem richtigen Punkt a, b, c der
Chipoberfläche 5 zuzuordnen.
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Nach
den obigen Prinzipien läßt sich
nun für die
einzelnen Punkte a, b, c der Chipoberfläche 5 ortsaufgelöst die Intensität des reflektierten
Signals in Abhängigkeit
vom jeweiligen Winkel messen. Die so gemessene SPR Kurve kann zur
Steigerung der Genauigkeit noch mit Hilfe der Fresnel-Theorie (vgl. H.
Wolter in ,Handbuch der Physik',
ed. S. Flügge, Springer)
an simulierte Kurven gefittet werden. Der Einstrahlwinkel, unter
dem die Intensität
des reflektierten Lichts ein Minimum durchläuft, ist der sogenannte SPR
Winkel.
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Die
zur Errechnung des SPR Winkels benötigte Position des Scannerspiegels 2 wird
bei der derzeit bevorzugten Ausführungsform
mit ausreichender Genauigkeit aus der jeweils anliegenden Steuerspannung
des Galvoscanners errechnet.
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Unter
der Voraussetzung einer guten Auflösung der eingesetzten CCD Kamera
und hinreichender Kapazität
der nachgeschalteten Bildverarbeitungshard- und software lassen
sich so die SPR Minimumswinkel für
mehrere Millionen Pixel mit einer Frequenz von über 10 Hz gleichzeitig bestimmen. Dies
ist ausreichend, um eine schnelle Echtzeitdetektion von Bindungsreaktionen
an der Sensoroberfläche 5 zu
gewährleisten.
Durch diese elektronische Korrektur der während des Winkelscans auftretenden
Bildverzerrungen und Intensitätsschwankungen ist
es möglich,
auf aufwendige und teure optische Komponenten weitestgehend zu verzichten.
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Es
sei an dieser Stelle erwähnt,
daß das oben
mit SPR beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen,
verwandten Techniken durchgeführt
werden kann. Hierzu zählen
insbesondere Brewsterwinkelspektrometrie und Ellipsometrie. Die
von einem Fachmann mit entsprechender Sachkenntnis leicht zu konstruierenden
entsprechenden Meßaufbauten
sind jedoch apparativ aufwendiger als SPR Geräte, weshalb hier nicht näher auf
sie eingegangen wird.
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Zur
Messung der Wechselwirkung resp. Adsorption von biologischen oder
chemischen Molekülen
kann das oben beschriebene optische Detektorsystem mit einer Vorrichtung
zur Beaufschlagung mit Flüssigkeiten
oder Gasen gekoppelt werden. Diese Vorrichtung wird auf die Oberfläche 5 des
Chips 4 aufgesetzt. Je nach Verwendungszweck kann eine Probe
mit der gesamten Fläche
des Sensorchips 4 oder eine Vielzahl von Proben unabhängig voneinander
mit verschiedenen Stellen des Sensorchips in Kontakt gebracht werden.
Es ist dann möglich,
Tausende von verschiedenen Proben innerhalb kurzer Zeit zu untersuchen.
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Für bestimmte
Anwendungsfälle
ist es sinnvoll, die bei einem Winkel gemessenen Intensitäten von
verschiedenen Pixeln in einem sogenannten „binning" zusammenzufassen. Dies ist bevorzugt dann
der Fall, wenn diese Pixel alle Licht auffangen, welches von einem
einheitlichen Bereich des Trägers reflektiert
wird. Binning ist insbesondere dann anzuwenden, wenn der Träger bzw.
der Sensorchip eine große
Anzahl von diskreten Meßzellen
aufweist, in denen ggf. unterschiedliche Proben vorliegen. Das Binning
ordnet in diesem Falle für
die verschiedenen Winkel die Pixel des Detektorarrays den Meßzellen des
Sensorchips zu. Der jeweilige winkelabhängige Intensitätswert für eine Meßzelle ergibt
sich dann durch Mittelung über
die Intensitäten
der zugeordneten Pixel. Die Mittelung kann selbstverständlich auch gewichtet
erfolgen, so daß die
peripheren Bereiche einer jeden Meßzelle geringer zum Signal
beitragen als deren Zentrum.