WO2002097405A2 - Ortsaufgelöstes ellipsometrie-verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen bestimmung von probenänderungen, biochip und messanordnung - Google Patents

Ortsaufgelöstes ellipsometrie-verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen bestimmung von probenänderungen, biochip und messanordnung Download PDF

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biochip
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Matthias Eberhardt
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    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative and / or qualitative determination of sample changes based on chemical, biological, biochemical or physical effects, which are based on a change in the refractive index and / or the change in layer thickness of the sample.
  • the invention also relates to uses this method and to a corresponding measuring arrangement according to the preamble of patent claim 28.
  • the invention relates to a biochip according to the preamble of patent claim 11.
  • the resonance of the free electrons in the metal is excited in metal layers with a thickness of approximately 50-60 nm, in particular made of gold or silver (see E. Gedig, D. Trau and M. Orban, "real-time analysis of biomolecular interactions” , Laborpraxis, February 1998, pp. 26-28 and 30).
  • This excitation of the free electrons only occurs when polarized light is irradiated parallel to the plane of incidence.
  • either the angle of incidence or the light frequency used must be run through, which means that the outlay on equipment is relatively great.
  • the reflected intensity as a function of the wavelength at a fixed angle or the angle of incidence at a fixed wavelength shows a minimum in the resonance range.
  • the electromagnetic radiation in the reflection is not limited to the thin metal film, but acts via the so-called evanescent field with the first approximately 100 to 300 nm thick layer of the medium above it, the resonance angle or the resonance wavelength becomes strongly from the refractive index of the immediately above the layer lying on the metal layer is influenced. If the resonance conditions change because, for example, small amounts of water are replaced by biological or chemical reactions with the formation of an additional layer, the minimum of the reflected intensity shifts. From the shift, the growth of the layer can only be recognized qualitatively, but not its absolute thickness, because the knowledge of the refractive index of the growing layer should also be known. In addition to the considerable expenditure on equipment, the measurement result is therefore also not particularly meaningful.
  • a corresponding measuring device is described, for example, in WO 90/05295.
  • the second method is ellipsometry, in which the light is radiated in such a way that it passes through a gaseous or liquid surrounding medium and then strikes the biological or chemical layer to be detected (see H. Arwin, "Spectroscopic ellipsometry and biology: recent developments and challenges” , Thin Solid Films 313-314, 1998, pp. 764-774).
  • ⁇ and ⁇ are determined, for which the following applies:
  • ⁇ essentially includes the change in intensity due to reflection of the light.
  • ⁇ essentially contains the phase shift due to the reflection of the light, this parameter being very sensitive to layer thicknesses.
  • EP 0 067 921 describes a biological test method for determining bioactive substances by means of ellipsometric measurements.
  • a thin dielectric substrate is coated with an immobilization layer made of a first biologically active substance, which interacts with a second bioactive substance.
  • the optical changes in the biological layer are detected by means of ellipsometric measurements.
  • the evaluation takes place in that the ellipsometric parameters are time-dependent are plotted and these curves are compared with reference curves from measurements on biological material of known concentrations. Irradiation through the back of the substrate was also considered, but the sensitivity of the measurement when irradiated from behind was 30 times worse than when irradiated from the front.
  • this known method has the disadvantage that special cuvettes have to be used and titer plates cannot be used at all.
  • At least one ellipsometric measurement is carried out during or after the deposition and at least the associated cos ⁇ value is evaluated to determine the change in thickness of the layer to be determined.
  • This method has the disadvantage that only single samples can be examined.
  • the examination of a larger number of samples is time-consuming because the individual samples have to be brought into the beam path of the measuring arrangement one after the other. With this method it is not possible to examine several samples at the same time.
  • DNA and RNA are of central importance are particularly promising in this context.
  • the function of individual DNA stocks must first be determined. For this it is necessary, among other things, to recognize differences between the DNA stocks of healthy and sick living beings.
  • the DNA strands can, for example, be spotted using piezoelectric methods or synthesized directly on the chip surface using photolithographic methods.
  • So-called hybridization reactions two individual, complementary DNA or RNA strands form a double strand
  • DNA or RNA fragments and proteins since protein production in cells is controlled by the DNA and RNA, which is also referred to as transcription and translation.
  • So-called cDNA arrays investigate the question of which DNA is translated into mRNA.
  • the height per base pair is between approximately 0.2 nm and 0.4 nm, depending on the helix type.
  • the common number of base pairs on DNA chips is 8 to 25, which gives the strands a height of about 2 to 8 nm.
  • the helix diameter is approx. 1.8 to 2.6 nm.
  • the average layer thickness can also be significantly less than 1 nm, which requires a correspondingly sensitive detection method.
  • a few hundred to a few thousand different base sequences are typically applied to a DNA chip.
  • a so-called spot contains a certain number of DNA strands with an identical base sequence. Even with a comparatively small number of eight bases per strand, thousands of spots have to be applied in order to take into account all possible base sequences. The detection of the hybridization therefore requires a sensitive measuring method with which as many spots as possible can be analyzed at the same time.
  • the coupling reactions considered here lead to an increase in mass on a surface, which is accompanied by a change in the refractive index in the immediate vicinity of the surface. This change in refractive index can in principle be measured.
  • fluorescence readers are mainly used to detect the above-mentioned biochemical reactions.
  • fluorescence readers are not able to measure an increase in mass directly, but require the molecules to be labeled with a fluorescence label.
  • fluorescence labels have the disadvantage that they fade after a short time, which makes quantitative evaluations difficult.
  • extremely sensitive so-called low-noise CCD cameras are required for detection, which accordingly have to be cooled to low temperatures.
  • DNA chips are described in Graham Ramsey "DNA Chips: State of the Art", Nature Biotechnology, Vol. 16, Jan. 98, pages 40 to 44 described.
  • the base plate of such DNA chips consists, for example, of silicon, wherein these chips can also have microelectrodes to accelerate the hybridization process of labeled samples.
  • This object is achieved with a method for the quantitative and / or qualitative determination of sample changes based on chemical, biological, biochemical or physical effects, which are based on a change in the refractive index of the sample, the sample being located on a sample carrier provided with at least one metal layer , by means of ellipsometric measurements, in which the ellipsometric parameters and ⁇ are determined, where
  • SPR Surface plasmon resonance
  • the invention is suitable for the detection of all physical, chemical, biological or biochemical processes in which the refractive index changes sufficiently strongly in the vicinity of a surface, but in particular for the coupling reactions described above on a flat biochip, as will be explained in detail below.
  • Sample changes are understood to mean, in particular, the growth of layers of biological or chemical molecules that separate from a fluid on an immobilization layer, in particular the changes explained above due to biochemical interactions, but also physical changes, such as e.g. shrinking or swelling of polymer layers.
  • the ellipsometric parameter ⁇ is strongly influenced by the surface plasmon excitation. If the wavelength and / or the angle of incidence of the electromagnetic radiation used with respect to the metal used is set such that surface plasmon excitation occurs, the detection sensitivity increases considerably and is of an order of magnitude those that can be achieved with conventional ellipsometry, ie without excitation of the surface plasmomas. This makes it possible, for example, to detect significantly smaller changes in layer thickness or to recognize the growth caused by biological or chemical interactions at an earlier point in time.
  • ellipsometry provides yet another parameter, namely, it is not necessary to know the refractive index associated with the sample change in order to be able to determine absolute values. With the method according to the invention, more information can thus be obtained with greater accuracy. If e.g. the absolute thickness of the grown layer is to be determined, the tan is evaluated in addition to the cos ⁇ .
  • the signal level and thus the detection sensitivity can be further increased by the method according to the invention if the thickness of the metal layer is optimized.
  • the thickness of the metal layer By adjusting the thickness of the metal layer, it is possible to increase the slope of the cos ⁇ curve and to increase the ratio ⁇ cos ⁇ to the sample change. This may restrict the dynamic range with regard to the maximum measurable sample changes, since the total cos ⁇ change can fundamentally not be greater than 2, but this is not a disadvantage in this respect because at If required, the cos ⁇ change can also be reduced again by choosing the layer thickness or the light wavelength.
  • the spectral shift of the tan and cos ⁇ curves is preferably determined.
  • the change in layer thickness or the refractive index can be calculated relatively and absolutely.
  • measurements can also be carried out at only one wavelength, so that it is not the spectral shift of the tan and cos ⁇ curves that is determined, but the change in the tan and cos ⁇ curves. Values at a fixed wavelength. However, this presupposes that the layer thickness increase or the change in refractive index is not too large, since the dynamic range of the cos ⁇ value is limited to -1 to +1.
  • the advantage of the method according to the invention is that after the parameters for the surface plasmon excitation have been set, neither the wavelength nor the angle of incidence necessarily has to be varied. This is a considerable advantage with regard to the outlay in terms of apparatus over measuring methods in which one of these parameters has to be varied. With the method, more samples can be examined per unit of time than was previously the case because the systematic traversing of the angle of incidence and the wavelength can be dispensed with.
  • the advantage is achieved that ellipsometric measurements generally provide more information because they are two Determine quantities at the same time (and ⁇ ). This enables more precise quantitative statements to be made about changes in layer thickness or changes in the refractive index. Therefore, a coarse spectral resolution is sufficient in the method according to the invention, whereas the exact position of a narrow reflection minimum must be found in spectral SPR measurements.
  • the measuring arrangement according to the invention is moreover insensitive to temporal intensity fluctuations of the light source and the ambient light, since normalization by the s-polarized light always takes place.
  • SPR measurements with angle variations are in principle not suitable for two-dimensional, spatially resolved simultaneous measurements, because a spatial dimension is already required for determining the angle-dependent minimum reflectivity.
  • the ellipsometric characterizability of all layers involved is an inherent advantage of the invention over all non-ellipsometric SPR measurement methods.
  • the invention Compared to fluorescence-based measurement methods, the invention has the considerable advantage of label-free detection, which makes biochemical preparation easier and cheaper.
  • the biological interactions are not falsified by a fluorescence label.
  • Another significant advantage of the invention is that there are no bleaching effects as in fluorescence-based processes. This fading of the fluorescent dye is known to be a major problem in quantitative analyzes of coupling reactions.
  • a highly sensitive camera is not required for the method according to the invention, since a much larger proportion of the intensity of the incident light is available for the detection.
  • Compared to measurement methods that are based on radioactive labeling there are comparable advantages as compared to fluorescent labeling. Handling radioactive substances can also be avoided.
  • the main advantage is that the device requires less technical equipment, since no vacuum technology is necessary. Mass spectroscopic methods provide other experimental data and are therefore a supplement to optical methods.
  • a biochip Due to the relatively small area of a biochip to be measured, usually a few cm 2 , the entire chip can be easily detected with a single spatially resolved measurement.
  • the method is particularly suitable for the simultaneous detection of a large number of biochemical binding events.
  • a flat biochip which is provided with a metal coating, is loaded with numerous different capture molecules.
  • the capture molecules immobilized on the metal layer possibly with a so-called spacer (molecules to achieve favorable steric conditions), are able to bind very specific molecules to themselves from a solution.
  • the resulting increase in mass on the surface can be measured via the associated change in the refractive index.
  • the capture molecules can be, for example, the DNA pieces (oligonucleotides), antibodies, amino acid chains (peptides), but also viruses or bacteria.
  • the capture molecules can be immobilized, for example, via streptavidin-biotin bonds, methods of thiol chemistry or other wet-chemical methods.
  • Another suitable method is the immobilization of capture molecules on the cuvette bases of titer plates provided with a suitable metal layer.
  • all cuvettes are usually provided with similar catcher molecules, while subsequently in each cuvette different solutions are given.
  • the entire titer plate can also be measured here with an image of the imaging sensor.
  • Kinetic (time-resolved) binding measurements are also possible, as is the measurement of steady-state conditions (usually initial and final states). The latter type of measurement is often used to examine hits. These are pharmaceutically relevant binding events that exceed a predetermined affinity threshold.
  • the simultaneous, spatially resolved ellipsometric measurements are preferably carried out during and before and / or after the sample changes.
  • the measurements before the sample change serve as a reference measurement, which are compared with the measurement or measurements during or after the sample change. From the change in cos ⁇ , a statement can be made about the magnitude of the sample change.
  • the reference measurements can also be used for different samples.
  • Another preferred embodiment provides that continuous ellipsometric measurements are carried out at least during a time period of the sample changes and at least the time change of the associated cos ⁇ values is evaluated.
  • the measurements can be used, for example, to track the growth of the layer to be detected.
  • a metal layer made of a metal is preferably used which has a refractive index (real part) of ⁇ 1 in the wavelength range of the electromagnetic radiation used.
  • a metal layer made of copper, gold, silver or aluminum or an alloy containing these metals is advantageously used. While metal layers> 50 nm are used in prior art surface plasmon resonance spectroscopy, it has been found that thicknesses between 10 and 45 nm, preferably between 10 and 40 nm, are far more suitable for the method according to the invention. With layer thicknesses ⁇ 50 nm, the cos ⁇ curve is significantly flatter depending on the irradiated light frequency and the dynamic range between - 1 and + 1 is not exhausted. If the thickness of the metal layer is ⁇ 10 nm, the sensitivity is too low.
  • the preferred thickness of the functional sublayer between 20 nm and 40 nm ensures that the dip in reflectivity in the surface plasmon resonance is reduced and spectrally broadened.
  • This physical behavior is called damped surface plasmon resonance (damped SPR).
  • the damped surface plasmon resonance means that the course of the ellipsometric quantities tan and cos ⁇ is not abrupt in the case of wavelength variations. This has the advantage that the spectral resolution of the entire measuring arrangement can be relatively low, which saves costs and measuring time.
  • the measurement at some discrete wavelengths is usually sufficient to characterize the spectral curve of tan and cos ⁇ with sufficient accuracy. This characterization is particularly necessary if the layers involved (functional metal layer, mediation layer, biochemical layers, etc.) are not yet precisely known.
  • the ellipsometric characterizability of the layers involved is an inherent advantage over non-ellipsometric SPR measuring devices. All measurements are preferably carried out in the vicinity of the zero crossing of the cos ⁇ on the wavelength scale, since this is where the detection sensitivity is greatest.
  • Lasers can be used as radiation sources. However, it is also possible to use lamps such as To use xenon lamps with a broad spectral distribution as the radiation source, in which case spectral filtering is advantageously to be carried out before the detection.
  • the method is preferably carried out on a biochip provided with several spots or on several microreaction vessels of a titer plate.
  • a preferred use of the method is the investigation of biochemical interactions based on DNA or RNA hybridization, DNA or RNA-protein interactions, DNA or RNA-antibody interactions or antibody-antigen interaction.
  • the method can be used for antibody characterization, development of immunoassays, Elisa optimization (ELISA: enzyme-linked immunoabsorbent assay), concentration determination of small amounts of analyte, membrane studies or for the research of signal transduction chains.
  • ELISA enzyme-linked immunoabsorbent assay
  • the method is also suitable for the investigation of physical or chemical sample changes, in which the properties (complex refractive index, layer thickness, optical anisotropy, etc.) of thin layers are determined in a spatially resolved manner.
  • the properties complex refractive index, layer thickness, optical anisotropy, etc.
  • the shrinking or swelling of polymer layers can be examined.
  • the complex refractive index of liquids or polymerized solids Substances are determined.
  • the changes in the concentration of ions, glucose or other ingredients in a liquid can also be determined.
  • the temporal development of the diffusion process of soluble substances can be followed two-dimensionally in a spatially resolved manner.
  • a biochip that can be used in the method has a sample carrier made of a base plate provided with at least one metal layer, in which the sample carrier consists of a material that has a transmission of at least at least in a wavelength section of at least 10 nm width in the electromagnetic wavelength range between 100 nm and 10 ⁇ m Has 20% and in which the metal layer of copper, silver, gold or aluminum consists of an alloy which contains at least one of these metals to at least 5 wt .-%, the thickness of the metal layer or the total thickness of several metal layers between 10 and 45 nm , in particular between 20 and 40 nm.
  • Biochips are understood to mean DNA chips, RNA chips, electrophoresis chips and protein chips.
  • the DNA or RNA chips include the so-called DNA arrays, which have a large number of spots. This also includes DNA chips with only one sample substance.
  • the base plate of the sample carrier preferably consists of one of the materials BK7, SF10, SF11, ZrO 2 , fused silica, CrO 2 , Si 3 N 4 , quartz and / or a transparent plastic.
  • An adhesion-promoting layer is preferably arranged between the metal layer and the base plate.
  • the adhesion of the functional metal layer on the transparent carrier is improved by this adhesion-promoting layer.
  • This can be a act sufficiently thin layer, for example made of titanium or chrome.
  • the adhesion-promoting layer is chosen so thin that it has no disruptive influence on the surface plasmon resonance excitation. The thickness is therefore preferably 1 nm to 20 nm.
  • a non-metallic cover layer can be applied to the metal layer, which can consist, for example, of glass, metal oxide, semiconductor oxide and / or plastic, the layer thickness is preferably at most 500 nm.
  • the cover layer preferably has a transmission of ⁇ 10% in the wavelength range from 100 nm to 10 ⁇ m in at least one wavelength section of the width of 10 nm with perpendicular incidence.
  • a hydrophilic or hydrophobic surface of the cover layer or the metal layer can be set.
  • a biochemical immobilization layer is preferably applied to the metal layer or the top layer.
  • DNA spots are applied to the metal layer or the top layer.
  • the underside of the base plate carries a device for coupling and uncoupling electromagnetic radiation.
  • a device for coupling and uncoupling electromagnetic radiation can be a prism, for example.
  • a trapezoidal prism can consist of one or more sections, which can be glued together if necessary.
  • the angle of incidence of the light changes depending on the refractive index of the material used for the prisms. This can affect the beam guidance, luminance and optical resolution of the egg lipometer can be influenced.
  • the refractive index of the prism should largely match that of the transparent base plate.
  • a medium should be introduced between the prism and the base plate, which also has a refractive index that is as similar as possible. This can be an oil, another suitable liquid or a flexible solid. If a liquid or viscous medium is used, this can be applied manually or using a pump device.
  • the metal layer or layers can be connected to a voltage source.
  • the metal layer also serves as an electrode.
  • the migration of charged particles in a liquid can be influenced, ie accelerated or hindered.
  • a counterelectrode can be located elsewhere in the liquid containing the charged particles.
  • the electrodes can have electrical contact with the liquid or be electrically insulated by non-conductive protective layers, for example made of SiO 2 .
  • the metal layer can also be partially applied to form a matrix-like structure.
  • the metallic matrix elements can each be connected to their own voltage source.
  • the electronic structure can be designed in a matrix in such a way that it is adapted to the matrix-like distribution of DNA spots on a biochip. It is possible to arrange the individual matrix-shaped electrodes with individual leads and individual ones To supply tensions. However, electrodes can also be electrically connected to one another so that only one voltage has to be applied.
  • the measuring arrangement comprises an egg lipometer which has a radiation source, a polarizer, an analyzer and a detector as well as an evaluation device connected to the detector. Furthermore, the measuring arrangement comprises a sample carrier for the sample / samples to be measured, the base plate of which has at least one metal layer on the side facing the sample.
  • An optical coupling and decoupling device is arranged on the sample carrier between the analyzer and the polarizer, the coupling and decoupling device being designed such that the electromagnetic radiation is directed onto the metal layer at such an angle of incidence that a damped surface plasmon resonance is excited.
  • a lens system is arranged in the beam path in front of and behind the coupling and decoupling device for the area illumination of the coupling and decoupling device and the detection surface of the detector.
  • the detector is an imaging sensor and in this way enables simultaneous, spatially resolved measurement of the measurement signals.
  • the evaluation device is designed for spatially resolved simultaneous processing of the measurement signals and at least for spatially resolved simultaneous evaluation of the ( ⁇ cos ⁇ ) values.
  • the egg ellipsometer can be a null ellipsometer, as described, for example, in Analytical Chemistry Volume 62, No. 17, Sept. 1, 1990, page 889. It can also be an egg lipometer with a rotating polarizer or an egg lipometer with a rotating analyzer or a phase-modulating egg lipometer.
  • the imaging sensor is preferably a CCD camera or a matrix-like arrangement of photodiodes or phototransistors.
  • the radiation source can be polychromatic, with a monochromator with a variable wavelength or a filter wheel with optical bandpass filters of different wavelengths being arranged between the radiation source and the imaging sensor.
  • the radiation source can also be a largely monochromatic light source or consist of several largely monochromatic individual light sources with different light wavelengths.
  • the lens system for planar irradiation is preferably Scheimpflug optics.
  • Scheimpflug optics are advantageous for the sharp imaging of planes that are not parallel to the detection plane.
  • the coupling and decoupling device can be a prism made of BK7, SFIO, SFl 1, ZrO 2 , fused silica, quartz or a transparent plastic.
  • the sample holder can form the bottom of a reaction chamber.
  • the reaction chamber can have a temperature control device and / or a humidification device.
  • FIG. 1 shows a measuring arrangement according to the invention with a biochip
  • FIG. 2 shows a measuring arrangement according to a further embodiment
  • FIG. 3 shows a measuring arrangement according to a further embodiment with a titer plate
  • FIG. 4 shows an enlarged section of a biochip
  • 5a shows the enlarged illustration of a microreaction vessel
  • Figure 5b shows the enlarged view of a microreaction vessel
  • FIG. 6 shows two diagrams to explain the setting of both
  • Figure 7 shows the measurement of the changes in ⁇ cos ⁇ depending on the
  • FIG. 8 the ⁇ cos ⁇ as a function of the measuring time without a metal layer
  • Figure 10 is a diagram in which ⁇ cos ⁇ against the measurement time at
  • Hybridization process is shown using a gold layer
  • FIG. 11 shows a three-dimensional bar diagram to explain the spatially resolved measurements.
  • a measuring arrangement 1 is shown schematically in FIG.
  • the electromagnetic radiation 11 from a monochromatic light source for example a halogen lamp 2
  • a lens system 3 to the entrance window of an optical monochromator 4 (filter wheel or scanning monochromator).
  • the radiation 11 leaving the monochromator 4 is parallelized with a further lens system 5 and expanded if necessary.
  • the monochromatic radiation is linearly polarized with a polarizer 6 and falls perpendicularly onto the entry surface 21 of a coupling and decoupling device 20 in the form of a prism.
  • the radiation passes through the entrance surface 21 with low reflection losses and negligible refraction and falls on a further prism surface.
  • a thin oil layer for refractive index adjustment is located between this prism surface and the transparent sample carrier 30 lying thereon.
  • the transparent carrier 30 consists of a homogeneous glass or plastic material and has a refractive index that is as similar as possible to that of the coupling and decoupling device 20.
  • the radiation After the radiation has penetrated the base plate 31 of the sample carrier 30, it is reflected on the metallic layer 33, whereby its intensity is weakened due to the excitation of a damped surface plasmon resonance and its phase or polarization is changed.
  • the reflected radiation strikes a rotating analyzer 7, with the aid of which the reflection-related changes in intensity and phase for the S and P components (components polarized perpendicularly and parallel to the plane of incidence) of the radiation can be determined.
  • the radiation then passes through a lens system 8, which can preferably be a Scheimpflug optic, with which it is imaged on the imaging sensor 9 in the form of a CCD camera.
  • the imaging sensor 9 forwards its signals to an evaluation and control device 10, which processes the signals further and also coordinates the course of the entire measurement.
  • the ellipsometric measuring arrangement is used to analyze a biochip 40 on which DNA spots 41 with different base sequences are applied in matrix form.
  • the DNA spots 41 are immobilized on the metal layer 33 and surrounded by an aqueous solution.
  • the aqueous solution can be exchanged via an inlet 61 and an outlet 62.
  • a stirrer 65 with an associated drive is provided in order to accelerate hybridization processes or other biological interactions.
  • the aqueous liquid can be adjusted to a fixed temperature with a temperature control device 63 or can be cooled or heated during the measurement.
  • the ellipsometric parameters tan and ⁇ cos ⁇ are determined in a spatially resolved manner.
  • the strength of the biological interactions at the different DNA spots 41 is determined from the ellipsometric measurement data.
  • FIG. 2 shows a measuring arrangement according to a further embodiment, which differs from the arrangement of FIG. 1 in that the DNA spots 41 located on the biochip 40 are not from an aqueous but from a gaseous medium, e.g. Air, nitrogen or argon are surrounded. Due to the low refractive index of gaseous media compared to aqueous media, a smaller angle of incidence is provided for the electromagnetic radiation, so that a damped surface plasmon resonance can be excited with the same spectral range. Biochemicals are generally more stable in a gaseous environment when there is high humidity. Therefore, in addition to the temperature control, a humidification device 66 is also provided.
  • a humidification device 66 is also provided.
  • FIG. 3 shows a further embodiment of a measuring arrangement 1, which differs from the measuring arrangement according to FIG. 1 in that, instead of a biochip 40, a titer plate 50 with a Matrix-shaped arrangement of wells (cuvettes 55) is analyzed. Due to the large dimensions on the titer plate, the prism and all other components are chosen to be correspondingly larger.
  • the cuvettes 55 are filled with liquid.
  • the rest of the temperature-controlled room is filled with a gaseous medium.
  • a humidification device 66 is also provided here in addition to the temperature control.
  • FIG. 4 shows an enlarged representation of a region of a biochip 40 in the region of a spot 41.
  • the layer structure of the biochip 40 consists of a base plate 31, an adhesion-promoting layer 32, a metal layer 33, a cover layer 34, an immobilization layer 51 and one or more spots 41 attached thereon.
  • the base plate 31 can e.g. an ordinary microscope slide.
  • the base plate 31 is typically approximately 1 mm thick.
  • the refractive index of the base plate is matched to that of the prism of the coupling and decoupling device 20.
  • the adhesive layer 32 for example made of titanium or chrome, has a thickness between 1.5 and 15 nm.
  • the metal layer 33 made of gold with a thickness between 20 nm and 30 nm is located on the adhesion-promoting layer 32.
  • the thickness of the gold layer 33 represents a special feature which distinguishes this biochip from other gold-coated biochips.
  • Conventional gold-coated biochips usually have a gold layer of 50 nm and more.
  • a gold layer thickness between 20 and 30 nm is optimal for the method according to the invention.
  • the metal layer / layers are preferably applied by vapor deposition or sputtering.
  • a matrix-like arrangement of DNA spots 41 with different base sequences is located on the metal layer 33.
  • the number of DNA Spots 41 per cm 2 can be up to 500,000.
  • the DNA strands are immobilized on the chip, for example, by bombardment with droplets (spotting), photolithographically or using the phosphoramidide method.
  • the DNA spots can be provided with a soluble biochemical protective layer that protects them from denaturation.
  • a titer plate 50 or an enlarged section in the area of a microreaction vessel 55 is shown enlarged in FIG. 5a.
  • the titer plate 50 differs from a conventional, commercially available titer plate in that the base plate 31 has a gold layer 33 within the microreaction vessels 55, which is applied to an adhesion-promoting layer 32.
  • the adhesive layer has a thickness of 1.5 nm to 15 nm and the gold layer has a thickness of 20 nm to 30 nm.
  • the transparent bottoms of the microreaction vessels can be made of plastic or glass.
  • the thickness of the base plate 31 is usually between 0.1 mm and 1 mm.
  • the bottoms can be an integral part of a titer plate molded from plastic or they are parts of a glass or plastic plate that is glued to a bottomless titer plate.
  • the refractive index of the bottoms is matched to that of the prism of the coupling and decoupling device.
  • the underside of the titer plate, which is placed on the coupling and decoupling device, is unstructured and smooth.
  • biochemical layer 51 with capture molecules which can be immobilized on the gold, for example with biotin-streptavidin compounds or by means of thiol chemistry.
  • Layer 51 is thus an immobilization layer.
  • Different or different capture molecules can be located in different microreaction vessels.
  • the capture molecules can be, for example, antibodies, single-stranded DNA, proteins, peptides or more complex structures such as viruses or bacteria.
  • the capture molecules can be mixed with a soluble be provided with a biochemical protective layer which protects it against denaturation. There is a liquid in the microreaction vessels during the measurement.
  • the unpolarized light is directed at an angle of incidence of, for example, 70 ° onto the underside of the bottom wall of a cuvette, as is shown, for example, in FIG. 5b.
  • the excitation of the surface plasmon resonance in the metal layer 5 results in a pronounced minimum at a certain wavelength at tan ⁇ , which goes along with a steep flank of the corresponding cos ⁇ curve.
  • layer thicknesses of the metal layer ⁇ 10 nm, however, sensitivities tend to be too low.
  • Layer thicknesses of the metal layer> 50 nm are less suitable for the method according to the invention due to the small dynamic range. Only the curves for the thicknesses 20 to 40 nm show a steep increase and thus a high detection sensitivity, whereby the entire dynamic range between -1 and +1 is exhausted. After the optimization of the wavelength, the angle of incidence and the thickness of the metal layer was set, measurements were carried out on samples which are shown in FIGS. 7 to 9 are shown.
  • a "single-wavelength" measurement is carried out, for example at 680 nm, an increase in the thickness of the antibody layer can be measured depending on the incubation time of the antibody solution, which is approximately proportional to the change in the amount of the is the cos ⁇ value. After an increase in the antibody layer by 2.5 nm, the cos ⁇ value has changed by approximately 0.2. The resulting detection sensitivity (
  • the scatter of the measuring points is considerable and it is shown that by using a silver or a gold layer on the inside of the bottom wall, significantly better results are achieved, as is shown in FIG. 9.
  • the value range of the cos ⁇ is run from 0.05 to -0.95, while the value range according to FIG. 8 only extends from -0.57 to -0.595. It becomes clear that the provision of the metal layer and the setting of the surface plasmon resonance can achieve significantly higher signal levels and not only an improvement in the signal / noise ratio, which can be easily achieved by longer measuring times.
  • FIG. 10 shows a diagram to explain the detection of DNA hybridizations.
  • the detected single strands of the DNA molecules have a mass of about 6 k Daltons and are therefore significantly smaller and more difficult to detect than, for example, antibodies (typically 150 k Daltons).
  • the determined thickness of the hybridized DNA layer of approximately 2 nm leads to a cos ⁇ change of 0.2.
  • Such a large ratio of change in cos ⁇ to change in layer thickness is not achieved with any other known ellipsometric arrangement.
  • the cos ⁇ change of 0.2 for the ellipsometer used was about a factor of 100 above the detection limit. With an optimized ellipsometer, even lower detection limits and thus higher sensitivity can be achieved. The value 0.25 was subtracted from the tan ⁇ scale for technical reasons.
  • FIG. 11 is a three-dimensional representation of a simultaneous, spatially resolved measurement.
  • a simultaneous, spatially resolved measurement was carried out on a titer plate (1536 format). The number of cuvettes measured simultaneously was 12.
  • the mediation layer consisted of 10 nm thick titanium.
  • the metal layer consisted of 25 nm gold.
  • the bar chart shows a difference measurement when the ion concentration changes:
  • the bar height corresponds to cos ⁇ ] - cos ⁇ 2 .
  • the corresponding change in refractive index in the solution was 0.004.
  • the wavelength used was 680 nm and the angle of incidence was 70 °.
  • the individual bars in the diagrams are assigned to individual cuvettes on the titer plate.
  • the measurement shows that small changes in the refractive index (in this case a liquid) can be measured simultaneously in a spatially resolved manner using the method according to the invention.

Abstract

Es wird ein ortsaufgelöstes Ellipsometrieverfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Probenänderungen beschrieben. Die Probe befindet sich auf einem mit mindestens einer Metallschicht versehenen Probenträger. Mittels der ellipsometrischen Messung werden die Parameter Ψ und Δ ermittelt, wobei der Einfallswinkel und/oder die Frequenz der für die ellipsometrischen Messungen verwendeten elektromagnetischen Strahlung derart eingestellt wird, dass in der Metallschicht eine gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz angeregt wird. Die Detektionsempfindlichkeit (δcosΔ)/(Einheit der Probenänderung) wird über die Dicke der Metallschicht eingestellt. Die elektromagnetische Strahlung wird auf der der Probe abgewandten Seite des Probenträgers flächig eingestrahlt und bei mindestens einem Einfallswinkel und mindestens einer Frequenz werden mindestens zwei zeitlich versetzte, simultane, ortsaufgelöste ellipsometrische Messungen an der Probe/den Proben durchgeführt und wenigstens die jeweils dazugehörigen Δ bzw. cosΔ-Werte zur Ermittlung der Probenänderung ausgewertet.

Description

Ortsaufgelöstes Ellipsometrie- Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Probenänderungen,
Biochip und Meßanordnung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von auf chemischen, biologischen, biochemischen oder physikalischen Effekten beruhenden Probenänderungen, die auf einer Änderung des Brechungsindexes und/oder der Schichtdickenänderung der Probe basieren gemäß Patentanspruch 1. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verwendungen dieses Verfahrens sowie auf eine entsprechende Meßanordnung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 28. Ferner bezieht sich die Erfindung auf einen Biochip gemäß des Oberbegriffs des Patentanspruchs 11.
Biologische und chemische Interaktionen, die in flüssigkeitsgefüllten Küvetten unter Bildung dünner Schichten stattfinden, wurden bisher unter anderem durch die Markierung der beteiligten Substanzen durch z.B. fluoreszierende oder radioaktive Moleküle nachgewiesen. Dies wird beispielsweise in S.S. Deshpande, "Enzyme Immunoassays - From Concept to Product Development", Verlag Chapman & Hall, 1996 beschrieben. Dem Vorteil der relativ einfachen Durchführbarkeit steht eine Reihe von Nachteilen gegenüber. So müssen die relevanten Moleküle zunächst markiert bzw. in markierter Form zugekauft werden. Außer dieser zeitaufwendigen Vorbereitungen können durch die Markierung die biologischen oder chemischen Interaktionen beeinflußt werden, was wiederum die Meßergebnisse beeinträchtigt. Die beim Umgang mit radioaktivem Material auftretenden Probleme stellen weitere Nachteile dar. Aus diesem Grund wurde zunehmend auf direkte Meßmethoden übergegangen, die ohne jegliche Markierung auskommen. Hierbei haben sich zwei Verfahren als geeignet herausgestellt.
Bei der Oberflächenplasmonenresonanzmessung wird in Metallschichten der Dicke von etwa 50 - 60 nm, insbesondere aus Gold oder Silber, die Resonanz der im Metall befindlichen freien Elektronen angeregt (s. E. Gedig, D. Trau und M. Orban, "Echtzeitanalyse biomolekularer Wechselwirkungen", Laborpraxis, Februar 1998, S. 26-28 und 30). Diese Anregung der freien Elektronen tritt nur dann auf, wenn parallel zur Einfallsebene polarisiertes Licht eingestrahlt wird. Für jede Messung muß entweder der Einfallswinkel oder die verwendete Lichtfrequenz durchgefahren werden, wodurch der apparative Aufwand relativ groß ist. Die reflektierte Intensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge bei festem Winkel oder des Einfallswinkels bei fester Wellenlänge zeigt im Resonanzbereich ein Minimum.
Da die elektromagnetische Strahlung bei der Reflexion nicht auf den dünnen Metallfilm beschränkt bleibt, sondern über das sogenannte evaneszente Feld mit der ersten etwa 100 bis 300 nm dicken Schicht des darüberliegenden Mediums Wechsel wirkt, wird der Resonanzwinkel bzw. die Resonanzwellenlänge stark vom Brechungsindex der unmittelbar über der Metallschicht liegenden Schicht beeinflußt. Verändern sich die Resonanzbedingungen, weil z.B. geringe Mengen Wasser durch biologische oder chemische Reaktionen unter Ausbildung einer zusätzlichen Schicht ersetzt werden, verschiebt sich das Minimum der reflektierten Intensität. Aus der Verschiebung läßt sich nur qualitativ das Aufwachsen der Schicht erkennen, nicht aber dessen absolute Dicke, weil dazu noch die Kenntnis des Brechungsindex der aufwachsenden Schicht bekannt sein müßte. Neben dem erheblichen apparativen Aufwand ist daher auch das Meßergebnis nicht allzu aussagefähig. Eine entsprechende Meßvorrichtung wird beispielsweise in der WO 90/05295 beschrieben. Das zweite Verfahren ist die Ellipsometrie, wobei das Licht derart eingestrahlt wird, daß es ein gasförmiges oder flüssiges Umgebungsmedium durchläuft und anschließend auf die nachzuweisende biologische oder chemische Schicht auftrifft (s. H. Arwin, "Spectroscopic ellipsometry and biology: recent developments and challenges", Thin Solid Films 313-314, 1998, S. 764-774).
Bei ellipsometrischen Messungen werden die ellipsometrischen Parameter Ψ und Δ bestimmt, für die gilt:
rp/rs = (Erp/Eep)/(E,_/Ees) = tan • exp (iΔ)
rp, rs: komplexe Reflektivitäten
E: komplexe elektrische Feldamplitude
Indizes: p: parallel zur Einfallsebene s: senkrecht zur Einfallsebene e: eingestrahlt r: reflektiert
Ψ beinhaltet im wesentlichen die Intensitätsänderung durch Reflexion des Lichts. Δ beinhaltet im wesentlichen die Phasenverschiebung durch die Reflexion des Lichts, wobei dieser Parameter sehr empfindlich auf Schichtdicken reagiert.
In der EP 0 067 921 wird ein biologisches Testverfahren zur Bestimmung bioaktiver Substanzen mittels ellipsometrischer Messungen beschrieben. Ein dünnes dielektrisches Substrat wird mit einer Immobilisierungsschicht aus einer ersten biologisch aktiven Substanz beschichtet, die mit einer zweiten bioaktiven Substanz wechselwirkt. Mittels ellipsometrischer Messungen werden die optischen Veränderungen in der biologischen Schicht detektiert. Die Auswertung erfolgt dadurch, daß die ellipsometrischen Parameter zeitabhängig aufgetragen werden und diese Kurven mit Referenzkurven aus Messungen an biologischem Material bekannter Konzentrationen verglichen werden. Eine Einstrahlung durch die Rückseite des Substrates wurde zwar auch in Betracht gezogen, die Empfindlichkeit der Messung bei rückwärtiger Einstrahlung war jedoch 30x schlechter als bei vorderseitiger Einstrahlung. Daraus resultiert, daß dieses bekannte Verfahren den Nachteil hat, daß spezielle Küvetten verwendet werden müssen, und Titerplatten gar nicht eingesetzt werden können.
In Sensors and Actuators B 30 (1996), S. 77-80 wird zum Nachweis von DNA-Proben, die auf einer Metallschicht immobilisiert sind, vorgeschlagen, den Polarisationszustand des reflektierten Lichtes zu untersuchen. Als Referenz wird eine Metallschicht ohne DNA-Moleküle untersucht. Hierbei wird sowohl das P- als auch das S-polarisierte Licht eingestrahlt und die Phasenverschiebung zwischen den Proben und dem Referenzsignal ausgewertet. Anstatt die Winkelabhängigkeit der Intensität, wie bei bekannten Oberflächenplasmonen-Messungen, zu untersuchen, wird hier die Winkelabhängigkeit des Polarisationszustandes betrachtet. Bei einer praktischen Realisierung wäre auch hier aufgrund der durchzuführenden Änderungen des Einstrahlwinkels ein komplexer Aufbau notwendig.
In der unveröffentlichten DE 100 06 083.8 wird ein Verfahren beschrieben zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Schichtdicken von sich auf einer, mit einer Immobilisierungsschicht versehenen Metallschicht aufgrund von Interaktionen aus einem gasförmigen oder flüssigen Medium abscheidender biologischer oder chemischer Moleküle mittels ellipsometrischer Messung, bei denen die ellipsometrische Parameter und Δ ermittelt werden. Hierbei wird der Einfallswinkel und/oder die Frequenz der für die ellipsometrischen Messungen verwendeten elektromagnetischen Strahlung derart eingestellt, daß in der Metallschicht eine Oberflächenplasmonenresonanz erzeugt wird. Die Detektionsempfindlichkeit (δcosΔ/Dicke der zu bestimmenden Schicht) wird über die Dicke der Metallschicht eingestellt. Die elektromagnetische Strahlung wird auf der der Immobilisierungsschicht abgewandten Seite der Metallschicht eingestrahlt.
Mindestens eine ellipsometrische Messung wird während oder nach der Abscheidung durchgeführt und wenigstens der dazugehörige cosΔ-Wert wird zur Ermittlung der Dickenänderung der zu bestimmenden Schicht ausgewertet.
Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß lediglich Einzelproben untersucht werden können. Die Untersuchung einer größeren Anzahl von Proben ist zeitaufwendig, weil die einzelnen Proben nacheinander in den Strahlengang der Meßanordnung gebracht werden müssen. Es ist mit diesem Verfahren nicht möglich, gleichzeitig mehrere Proben zu untersuchen.
Im biologischen Bereich ist es jedoch notwendig, in kurzer Zeit eine Vielzahl von Proben zu untersuchen, insbesondere bei biologischen Vorgängen, die auf intermolekularen Kopplungsreaktionen beruhen, die auch biomolekulare Interaktionen genannt werden. Beispielsweise beruht die heilsame Wirkung von Antikörpern im menschlichen Körper darauf, daß diese Antikörper schädliche Objekte (Proteine, Viren, Bakterien, Pollen etc.) erkennen und dafür sorgen, daß diese unschädlich gemacht werden. In der Regel erfolgt die Erkennungsreaktion nach einem Schlüssel-Schloß-Prinzip, d.h. der Antikörper heftet sich gezielt an das schädliche Objekt. Ähnlich verhält es sich mit vielen Medikamenten, deren Bestandteil sich an bestimmten Stellen des Körpers anlagern und dort wirken. Je gezielter sich das Medikament anlagert, desto spezifischer kann es wirken. Die Suche nach neuen Medikamenten ist daher eng mit der Aufgabe verknüpft, die molekularen Interaktionen von vielen verschiedenen Substanzen zu ermitteln (drug screening). Besonders vielversprechend sind in diesem Zusammenhang gentechnische Ansätze, bei denen die DNA und die RNA von zentraler Bedeutung sind. Um das Wissen beispielsweise des menschlichen Genoms nutzbar machen zu können, muß die Funktion einzelner DNA-Bestände zunächst ermittelt werden. Hierzu ist es u.a. notwendig, Unterschiede zwischen den DNA-Beständen gesunder und kranker Lebewesen zu erkennen. Es existieren bereits Methoden, um gezielt unterschiedliche DNA-Stränge bestimmter Länge und Basenpaaren auf Oberflächen zu immobilisieren. Hierzu werden sogenannte DNA-Arrays oder DNA-Chips mit matrixartiger Anordnung von DNA-Spots verwendet. Die DNA-Stränge können beispielsweise mit piezoelektrischen Verfahren aufgespottet oder direkt auf der Chipoberfläche mittels photolithographischer Verfahren synthetisiert werden.
Über sogenannte Hybridisierungsreaktionen (zwei einzelne, zueinander komplementäre DNA- bzw. RNA-Stränge bilden einen Doppelstrang) läßt sich beispielsweise ermitteln, wo Unterschiede zwischen gesunden und krankheitsfördernden DNA-Fragmenten auftreten. Des weiteren gibt es auch Interaktionen zwischen DNA- bzw. RNA-Fragmenten und Proteinen, da die Proteinproduktion in Zellen durch die DNA und RNA gesteuert wird, was auch als Transkription und Translation bezeichnet wird. Bei sogenannten cDNA-Arrays wird der Frage nachgegangen, welche DNA in mRNA übersetzt wird.
Immobilisiert man eine DNA-Helix derart auf einer Oberfläche, daß die Helixachse annähernd senkrecht auf der Oberfläche steht, so beträgt die Höhe pro Basenpaar zwischen etwa 0,2 nm und 0,4 nm, je nach Helixtyp. Die gängige Anzahl von Basenpaaren auf DNA-Chips liegt bei 8 bis 25, womit man eine Höhe der Stränge von etwa 2 bis 8 nm erhält. Der Helixdurchmesser liegt bei ca. 1,8 bis 2,6 nm. Je nach DNA-Belegungsdichte kann die mittlere Schichtdicke auch deutlich unter 1 nm liegen, was ein entsprechend empfindliches Detektionsverfahren erforderlich macht. Typischerweise werden auf einem DNA-Chip einige hundert bis einige tausend verschiedene Basensequenzen aufgebracht. Ein sogenannter Spot enthält eine gewisse Anzahl von DNA-Strängen mit identischer Basensequenz. Selbst bei einer vergleichsweise kleinen Anzahl von acht Basen pro Strang müssen tausende von Spots aufgebracht werden, um alle möglichen Basensequenzen zu berücksichtigen. Die Detektion der Hybridisierung erfordert somit ein empfindliches Meßverfahren, mit dem möglichst viele Spots gleichzeitig analysiert werden können.
Auch bei anderen biochemischen Interaktionen, wie z.B. Antikörper- Antigenreaktionen, ist es von großem Interesse die Kopplungsstärke zu bestimmen, da sich hieraus Ansätze für neue pharmazeutische Produkte ergeben können.
Die hier betrachteten Kopplungsreaktionen führen zu einer Massenzunahme auf einer Oberfläche, die mit einer Änderung des Brechungsindexes in unmittelbarer Nähe der Oberfläche einhergeht. Diese Brechungsindexänderung ist prinzipiell meßbar. Derzeit werden jedoch hauptsächlich sogenannte Fluoreszenzreader eingesetzt, um die oben genannten biochemischen Reaktionen zu detektieren. Fluoreszenzreader sind allerdings nicht in der Lage, direkt eine Massenzunahme zu messen, sondern erfordern eine Markierung der Moleküle mit einem Fluoreszenzlabel.
Fluoreszenzlabel haben jedoch den Nachteil, daß sie nach kurzer Zeit ausbleichen, was die quantitativen Auswertungen erschwert. Zur Detektion werden in der Regel extrem empfindliche sogenannte rauscharme CCD- Kameras benötigt, die dementsprechend auf tiefe Temperaturen gekühlt werden müssen.
In Graham Ramsey "DNA-Chips: State of the Art", Nature Biotechnology, Vol. 16, Jan. 98, Seite 40 bis 44 werden verschiedene DNA-Chips beschrieben. Die Grundplatte solcher DNA-Chips besteht beispielsweise aus Silizium, wobei diese Chips zur Beschleunigung des Hybridisierungsvorgangs gelabelter Proben auch Mikroelektroden aufweisen können.
In Steel et al. "Electrochemical Quantitation of DNA-Immobilize on Gold", Analytical Chemistry, Vol. 70, Nr. 22, Nov. 15, 1998 werden auf Glaskörper aufgesputterte Goldschichten beschrieben, die als Elektroden dienen. DNA-Chips, die für den Einsatz in empfindlichen optischen Meßverfahren geeignet sind, werden nicht beschrieben.
Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, daß eine schnelle und simulatane Messung einer Vielzahl von Proben bei gleichzeitig größerer Nachweisempfindlichkeit gewährleistet, wobei nicht nur der qualitative sondern auch der quantitative Nachweis von Probenveränderungen möglich sein soll. Es ist auch Aufgabe der Erfindung, eine entsprechende Meßanordnung für die Durchführung des Verfahrens zur Verfügung zu stellen. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Biochips bereitzustellen, die zum Einsatz in diesem Verfahren bzw. der Meßanordnung geeignet sind.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von auf chemischen, biologischen, biochemischen oder physikalischen Effekte beruhenden Probenänderungen gelöst, die auf einer Änderung des Brechungsindex der Probe basieren, wobei sich die Probe auf einem mit mindestens einer Metallschicht versehenen Probenträger befindet, mittels ellipsometrischer Messungen, bei denen die ellipsometrischen Parameter und Δ ermittelt werden, wobei
der Einfallswinkel und/oder die Frequenz der für die ellipsometrischen Messungen verwendeten elektromagnetischen Strahlung derart eingestellt wird, daß in der Metallschicht eine gedämpfte Oberflächenplasonenresonanz (SPR = Surface Plasmon Resonance) angeregt wird, die Detektionsempfindlichkeit (<5cosΔ)/(Einheit der Probenänderung) über die Dicke der Metallschicht eingestellt wird, die elektromagnetische Strahlung auf der der Probe abgewandten Seite des Probenträgers flächig eingestrahlt wird und bei mindestens einem Einfallswinkel und mindestens einer Frequenz mindestens zwei zeitlich versetzte, simultane, ortsaufgelöste ellipsometrische Messungen an der Probe/den Proben durchgeführt werden und wenigstens die jeweils dazugehörigen Δ- bzw. cosΔ- Werte zur Ermittlung der Probenänderung ausgewertet werden.
Die Erfindung eignet sich zum Nachweis aller physikalischen, chemischen, biologischen oder biochemischen Vorgängen, bei denen sich der Brechungsindex in der Nähe einer Oberfläche hinreichend stark ändert, insbesondere aber für die oben beschriebenen Kopplungsreaktionen auf einem flachen Biochip, wie nachfolgend noch im einzelnen erläutert wird.
Unter Probenänderungen werden insbesondere das Aufwachsen von Schichten aus biologischen oder chemischen Molekülen verstanden, die sich auf einer Immobilisierungsschicht aus einem Fluid abscheiden, insbesondere die eingangs erläuterten Veränderungen aufgrund biochemischer Interaktionen, aber auch physikalische Veränderungen, wie z.B. das Schrumpfen oder Quellen von Polymerschichten .
Es hat sich gezeigt, daß der ellipsometrische Parameter Δ durch die Oberflächenplasmonenanregung stark beeinflußt wird. Wenn die Wellenlänge und/oder der Einfallswinkel der verwendeten elektromagnetischen Strahlung bezüglich des verwendeten Metalls so eingestellt wird, daß eine Oberflächenplasmonenanregung auftritt, erhöht sich die Detektionsempfindlichkeit erheblich und liegt in einer Größenordnung über diejenigen, die bei der konventionellen Ellipsometrie, d.h. ohne Anregung der Oberflächenplasmomen, erreicht werden kann. Dadurch ist es möglich, z.B. deutlich geringere Schichtdickenänderungen zu detektieren bzw. das Aufwachsen durch biologische oder chemische Interaktionen bewirkter Schichten bereits zu einem früheren Zeitpunkt zu erkennen.
Während beim Stand der Technik die rückwärtige Einstrahlung ohne metallische Beschichtung schlechte ellipsometrische Meßergebnisse liefert, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dieser Nachteil nicht festgestellt. Dies ist darauf zurückzuführen, daß gemäß der Erfindung eine signalverstärkende Metallschicht verwendet wird. Es wird dadurch möglich, z.B. mit einer solchen Metallschicht versehene, ansonsten jedoch herkömmliche Küvetten zu verwenden und die Messung an der Bodenwand der Küvetten durchzuführen.
Da die Ellipsometrie noch einen weiteren Parameter, nämlich liefert, ist es nicht notwendig, den mit der Probenänderung verknüpften Brechungsindex zu kennen, um Absolutwerte bestimmen zu können. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können somit mehr Informationen bei größerer Genauigkeit erhalten werden. Wenn z.B. die absolute Dicke der aufgewachsenen Schicht bestimmt werden soll, wird zusätzlich zum cosΔ noch der tan ausgewertet.
Im Gegensatz zur konventionellen Ellipsometrie kann durch das erfindungsgemäße Verfahren die Signalhöhe und damit die Detektionsempfindlichkeit zusätzlich noch weiter vergrößert werden, wenn die Dicke der Metallschicht optimiert wird. Durch die Einstellung der Dicke der Metallschicht ist es möglich, die Steigung der cosΔ-Kurve zu vergrößern und das Verhältnis δcosΔ zur Probenänderung anzuheben. Dadurch wird zwar der Dynamikbereich hinsichtlich der maximal meßbaren Probenänderungen möglicherweise eingeschränkt, da die gesamte cosΔ-Änderung grundsätzlich nicht größer als 2 sein kann, dies ist jedoch insofern kein Nachteil, weil bei Bedarf über die Wahl der Schichtdicke oder die Lichtwellenlänge die cosΔ- Änderung auch wieder reduziert werden kann.
Zur Ermittlung von Schichtdickenänderungen oder Brechungsindexänderungen wird vorzugsweise die spektrale Verschiebung der tan und cosΔ-Kurven ermittelt. Mittels eines Simulationsprogramms kann daraus die Änderung der Schichtdicke oder des Brechungsindex relativ und absolut berechnet werden.
Ist beispielsweise das zu untersuchende Schichtsystem hinreichend genau bekannt und homogen über die gesamte Detektionsfläche, kann auch bei nur einer Wellenlänge gemessen werden, so daß nicht die spektrale Verschiebung der tan - und cosΔ-Kurven ermittelt wird, sondern die Änderung der tan - und cosΔ- Werte bei einer festen Wellenlänge. Dies setzt allerdings voraus, daß der Schichtdickenzuwachs bzw. die Brechungsindexänderung nicht zu groß ist, da der Dynamikbereich des cosΔ- Wertes auf - 1 bis + 1 beschränkt ist.
Unter Umständen genügt dort die Auswertung einer der beiden ellipsometrischen Meßgrößen. Meist erweist sich der cosΔ-Wert als der sensitivere Wert.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß nach der Einstellung der Parameter für die Oberflächenplasmonenanregung weder die Wellenlänge noch der Einfallswinkel unbedingt variiert werden muß. Dies ist ein erheblicher Vorteil hinsichtlich des apparativen Aufwandes gegenüber Meßverfahren, bei denen einer dieser Parameter variiert werden muß. Mit dem Verfahren lassen sich mehr Proben pro Zeiteinheit untersuchen als es bisher der Fall war, weil auf das systematische Durchfahren des Einstrahlwinkels und der Wellenlänge verzichtet werden kann.
Gegenüber konventionellen SPR-Meßanordnungen erzielt man den Vorteil, daß ellipsometrische Messungen prinzipiell mehr Informationen liefern, da sie zwei Größen gleichzeitig ermitteln ( und Δ). Dadurch können präzisere quantitative Aussagen zu Schichtdicken-Änderungen oder Brechungsindexänderungen gemacht werden. Deswegen genügt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine grobe spektrale Auflösung, wohingegen bei spektralen SPR-Messungen die genaue Lage eines schmalen Reflektionsminimums gefunden werden muß. Die erfindungsgemäße Meßanordnung ist darüber hinaus unempfindlicher gegenüber zeitlichen Intensitätsschwankungen der Lichtquelle und des Umgebungslichtes, da stets eine Normierung durch das s-polarisierte Licht stattfindet. SPR-Messungen mit Winkelvariationen sind im Gegensatz zum erfindungsgemäßen Verfahren prinzipiell nicht für zweidimensionale ortsaufgelöste Simultanmessungen geeignet, weil eine räumliche Dimension bereits für die Bestimmung des winkelabhängigen Reflektiyitätsminimums benötigt wird.
Die ellipsometrische Charakterisierbarkeit aller beteiligten Schichten ist ein immanenter Vorteil der Erfindung gegenüber allen nicht-ellipsometrischen SPR-Meßverfahren.
Gegenüber fluoreszenzbasierten Meßverfahren weist die Erfindung den beträchtlichen Vorteil der markierungsfreien Detektion auf, was die biochemische Präparation erleichtert und preiswerter macht. Die biologischen Interaktionen werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht durch ein Fluoreszenzlabel verfälscht. Ein erheblicher Vorteil der Erfindung ist auch, daß es keine Ausbleicheffekte wie bei fluroreszenzbasierten Verfahren gibt. Dieses Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs stellt bekanntermaßen ein großes Problem bei quantitativen Analysen von Kopplungsreaktionen dar. Im Gegensatz zu Fluoreszenzdetektoren wird für das erfindungsgemäße Verfahren keine hochempfindliche Kamera benötigt, da ein wesentlich größerer Intensitätsanteil des eingestrahlten Lichtes für die Detektion zur Verfügung steht. Gegenüber Meßmethoden, die auf radioaktiver Markierung beruhen, ergeben sich vergleichbare Vorteile wie gegenüber der Fluoreszenzmarkierung. Zudem kann das Hantieren mit radioaktiven Substanzen vermieden werden.
Gegenüber massenspektroskopischen Verfahren ergibt sich hauptsächlich der Vorteil des wesentlichen geringeren gerätetechnischen Aufwandes, da keine Vakuumtechnik notwendig ist. Massenspektroskopische Verfahren liefern andere experimentelle Daten und stellen daher eine Ergänzung optischer Methoden dar.
Aufgrund der relativ kleinen auszumessenden Fläche eines Biochips von in der Regel wenigen cm2 kann der gesamte Chip leicht mit einer einzigen ortsaufgelösten Messung erfaßt werden. Besonders geeignet ist das Verfahren, eine Vielzahl von biochemischen Bindungsereignissen simultan nachzuweisen. Hierzu wird ein flacher Biochip, der mit einer Metallbeschichtung versehen ist, mit zahlreichen unterschiedlichen Fängermolekülen beladen. Die auf der Metallschicht ggf. mit einem sogenannten Spacer (Moleküle zur Erzielung günstiger sterischer Bedingungen) immobilisierten Fängermoleküle sind in der Lage, sehr spezifische Moleküle aus einer Lösung heraus an sich zu binden. Die dadurch hervorgerufene Massenzunahme auf der Oberfläche, kann über die damit einhergehende Änderung des Brechungsindex gemessen werden. Bei den Fängermolekülen kann es sich beispielsweise um die DNA-Stücke (Oligonucleotide), Antikörper, Aminosäureketten (Peptide), aber auch um Viren oder Bakterien handeln. Die Immobilisierung der Fängermoleküle kann z.B. über Streptavidin-Biotin-Bindungen, Verfahren der Thiolchemie oder andere naßchemische Verfahren erreicht werden.
Ein anderes geeignetes Verfahren ist die Immobilisierung von Fängermolekülen auf den mit einer geeigneten Metallschicht versehenen Küvettenböden von Titerplatten. Hier werden meist alle Küvetten mit gleichartigen Fängermolekülen versehen, während anschließend in jede Küvette unterschiedliche Lösungen gegeben werden. Bei entsprechender Auslegung der Erfindung kann auch hier die gesamte Titerplatte mit einer Aufnahme des bildgebenden Sensors vermessen werden.
Ferner sind kinetische (zeitaufgelöste) Bindungsmessungen möglich sowie auch die Messung von stationären Zuständen (in der Regel Anfangs- und Endzustände). Die letztere Art der Messung wird oft eingesetzt, um sogenannte Hits zu untersuchen. Dabei handelt es sich um pharmazeutisch relevante Bindungsereignisse, die eine vorgegebene Affinitätsschwelle überschreiten.
Vorzugsweise werden die simultan, ortsaufgelösten ellipsometrischen Messungen während sowie vor und/oder nach der Probenveränderungen durchgeführt. Die Messungen vor der Probenveränderung dienen als Referenzmessung, die mit der oder den Messungen während oder nach der Probenänderung verglichen werden. Aus der Änderung des cosΔ läßt sich eine Aussage über die Stärke der Probenveränderung machen. Die Referenzmessungen können auch für unterschiedliche Proben verwendet werden.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform sieht vor, daß kontinuierliche ellipsometrische Messungen mindestens während eines Zeitabschnitts der Probenänderungen durchgeführt werden und wenigstens die zeitliche Änderung der dazugehörigen cosΔ-Werte ausgewertet wird. Mit den Messungen läßt sich beispielsweise das Aufwachsen der nachzuweisenden Schicht verfolgen.
Vorzugsweise wird eine Metallschicht aus einem Metall verwendet, das im Wellenlängenbereich der verwendeten elektromagnetischen Strahlung einen Brechungsindex (Realteil) von < 1 aufweist. Vorteilhafterweise wird eine Metallschicht aus Kupfer, Gold, Silber oder Aluminium oder eine Legierung verwendet, die diese Metalle enthält. Während bei der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie nach dem Stand der Technik Metallschichten > 50 nm verwendet werden, hat es sich herausgestellt, daß für das erfindungsgemäße Verfahren Dicken zwischen 10 und 45 nm, vorzugsweise zwischen 10 und 40 nm weitaus besser geeignet sind. Bei Schichtdicken ≥ 50 nm verläuft die cosΔ-Kurve in Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtfrequenz deutlich flacher und der Dynamikbereich zwischen - 1 und + 1 wird nicht ausgeschöpft. Bei Dicken der Metallschicht von < 10 nm ergeben sich jedoch zu geringe Sensitivitäten.
Die bevorzugte Dicke der funktioneilen Teilschicht zwischen 20 nm und 40 nm sorgt dafür, daß der Reflektivitätseinbruch bei der Oberflächenplasmonen- resonanz verringert und spektral verbreitert ist. Dieses physikalische Verhalten wird als gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz (gedämpfte SPR) bezeichnet. Die gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz führt dazu, daß der Verlauf der ellipsometrischen Meßrößen tan und cosΔ bei Wellenlängenvariationen nicht sprungartig ist. Dies beinhaltet den Vorteil, daß die spektrale Auflösung der gesamten Meßanordnung relativ gering sein kann, was Kosten und Meßzeit einspart. Die Messung bei einigen diskreten Wellenlängen genügt in der Regel, um den spektralen Verlauf von tan und cosΔ hinreichend genau zu charakterisieren. Diese Charakterisierung ist insbesondere dann notwendig, wenn die beteiligten Schichten (funktioneile Metallschicht, Vermittlungsschicht, biochemische Schichten etc.) noch nicht genau bekannt sind. Die ellipsometrische Charakterisierbarkeit der beteiligten Schichten ist ein immanenter Vorteil gegenüber nicht-ellipsometrischen SPR- Meß Vorrichtungen. Vorzugsweise werden alle Messungen in der Nähe des Nulldurchgangs des cosΔ auf der Wellenlängeskala durchgeführt, da hier die Detektionsempfindlichkeit am größten ist.
Es ist auch möglich, die ellipsometrischen Messungen an ruhenden oder fließenden Medien durchzuführen. Vorzugsweise wird elektromagnetische Strahlung im Wellenlängenbereich von 100 nm bis 10μm, vorzugsweise von 300 nm bis 3μm verwendet. Vorzugsweise wird monochromatische Strahlung, insbesondere Licht eingesetzt. Der Vorteil der monochromatischen Strahlung besteht darin, daß die Strahlung vor der Detektion nicht spektral gefiltert werden muß.
Als Strahlungsquellen können Laser eingesetzt werden. Es ist aber auch möglich, Lampen, wie z.B. Xenonlampen mit breiter Spektralverteilung als Strahlungsquelle zu verwenden, wobei dann vorteilhafterweise vor der Detektion eine spektrale Filterung durchzuführen ist.
Das Verfahren wird vorzugsweise an einem mit mehreren Spots versehenen Biochip durchgeführt oder an mehreren Mikroreaktionsgefäßen einer Titerplatte durchgeführt.
Eine bevorzugte Verwendung des Verfahrens ist die Untersuchung biochemischer Interaktionen auf der Basis von DNA- oder RNA- Hybridisierung, DNA- oder RNA-Protein- Wechselwirkungen, DNA- oder RNA-Antikörper- Wechselwirkungen oder Antikörper-Antigen- Wechselwirkung.
Das Verfahren kann zu Antikörpercharakterisierung, Entwicklung von Immonoassays, Elisaoptimierung (ELISA: enzyme-linked immunoabsorbent assay), Konzentrationsbestimmungen kleiner Analytmengen, Membranstudien oder für die Erforschung von Signaltransduktionsketten eingesetzt werden.
Das Verfahren ist auch zur Untersuchung von physikalischen oder chemische Probenänderungen geeignet, bei denen die Eigenschaften (komplexer Brechungsindex, Schichtdicke, optische Anisotropie, etc.) von dünnen Schichten ortsaufgelöst bestimmt werden. Beispielsweise kann das Schrumpfen oder Quellen von Polymerschichten untersucht werden. Des weiteren kann der komplexe Brechungsindex von Flüssigkeiten oder polymerisierten festen Stoffen ermittelt werden. Ferner sind auch die Konzentrationsänderungen von Ionen, Glukose oder anderen Inhaltsstoffen in einer Flüssigkeit bestimmbar. Es kann beispielsweise der Diffisionsprozeß von löslichen Substanzen zweidimensional ortsaufgelöst in seiner zeitlichen Entwicklung verfolgt werden.
Ein in dem Verfahren einsetzbarer Biochip besitzt einen Probenträger aus einer mit mindestens einer Metallschicht versehenen Grundplatte, bei dem der Probenträger aus einem Material besteht, das im elektromagnetischen Wellenlängenbereich zwischen 100 nm und 10 μm mindestens in einem Wellenlängenabschnitt von mindestens 10 nm Breite eine Transmission von mindestens 20% aufweist und bei dem die Metallschicht aus Kupfer, Silber, Gold oder Aluminium aus einer Legierung besteht, die wenigstens eines dieser Metalle zu mindestens 5 Gew.-% enthält, wobei die Dicke der Metallschicht oder die Gesamtdicke mehrerer Metallschichten zwischen 10 und 45 nm, insbesondere zwischen 20 und 40 nm liegt.
Unter Biochips werden DNA-Chips, RNA-Chips, Elektrophoresechips und Proteinchips verstanden. Zu den DNA- bzw. RNA-Chips gehören die sogenannten DNA-Arrays, die eine Vielzahl von Spots aufweisen. Auch DNA- Chips mit lediglich einer Probensubstanz zählen hierzu.
Vorzugsweise besteht die Grundplatte des Probenträgers aus einem der Materialien BK7, SF10, SF11, ZrO2, fused Silica, CrO2, Si3N4, Quarz und/oder einem transparenten Kunststoff.
Vorzugsweise ist zwischen der Metallschicht und der Grundplatte eine Haftvermittlungsschicht angeordnet .
Die Haftung der funktionellen Metallschicht auf dem transparenten Träger wird durch diese Haftvermittlungsschicht verbessert. Hierbei kann es sich um eine hinreichend dünne Schicht, z.B. aus Titan oder Chrom handeln. Die Haft- Vermittlungsschicht wird so dünn gewählt, daß sie keinen störenden Einfluß auf die Oberflächenplasmonenresonanzanregung hat. Die Dicke liegt daher vorzugsweise bei 1 nm bis 20 nm.
Auf der Metallschicht kann eine nicht-metallische Deckschicht aufgebracht sein, die beispielsweise aus Glas, Metalloxyd, Halbleiteroxyd und/oder Kunststoff bestehen kann, die Schichtdicke liegt vorzugsweise bei maximal 500 nm.
Vorzugsweise weist die Deckschicht im Wellenlängenbereich von 100 nm bis lOμm mindestens in einem Wellenlängenabschnitt der Breite von 10 nm bei senkrechtem Einfall eine Transmission von < 10% auf.
Durch eine Oberflächenbehandlung, z.B. mit chemischen Lösungen und/oder Plasmen kann eine hydrophile oder hydrophobe Oberfläche der Deckschicht oder der Metallschicht eingestellt werden.
Vorzugsweise ist auf der Metallschicht oder der Deckschicht eine biochemische Immobilisierungsschicht aufgebracht .
Vörteilhafterweise sind auf der Metallschicht oder der Deckschicht DNA-Spots aufgebracht.
Vorteilhafterweise trägt die Unterseite der Grundplatte eine Einrichtung zur flächigen Einkopplung und Auskopplung von elektromagnetischer Strahlung. Eine derartige Einrichtung kann beispielsweise ein Prisma sein. Ein trapezförmiges Prisma kann aus einem oder mehreren Teilstücken bestehen, die bei Bedarf zusammengeklebt sein können. In Abhängigkeit von der Brechzahl des verwendeten Materials für die Prismen ändert sich der Einfallswinkel des Lichts. Dadurch kann auf die Strahlführung, Leuchtdichte und optisches Auflösungsvermögen des Eilipsometers Einfluß genommen werden.
Der Brechungsindex des Prismas sollte weitgehend mit dem der transparenten Grundplatte übereinstimmen. Zwischen Prisma und Grundplatte sollte ein Medium eingebracht werden, das ebenfalls einen möglichst ähnlichen Brechungsindex aufweist. Hierbei kann es sich um ein Öl, eine andere geeignete Flüssigkeit oder einen flexiblen Festkörper handeln. Wenn ein flüssiges oder zähflüssiges Medium verwendet wird, kann dies manuell oder mit Hilfe einer Pumpvorrichtung aufgetragen werden.
Die Metallschicht oder Schichten können an eine Spannungsquelle angeschlossen sein. In diesem Fall dient die Metallschicht zusätzlich als Elektrode.
Wenn die Metallschicht auf dem transparenten Träger gleichzeitig als Elektrode verwendet wird, kann die Wanderung von geladenen Teilchen in einer Flüssigkeit beeinflußt, d.h. beschleunigt oder behindert werden. Zu diesem Zweck kann sich an einer anderen Stelle in der Flüssigkeit, die die geladenen Teilchen enthält, eine Gegenelektrode befinden. Die Elektroden können elektrischen Kontakt zur Flüssigkeit haben oder durch nichtleitende Schutzschichten, z.B. aus SiO2, elektrisch isoliert sein.
Die Metallschicht kann auch partiell unter Ausbildung einer matrixförmigen Struktur aufgebracht sein. Hierbei können die metallischen Matrixelemente jeweils an eine eigene Spannungsquelle angeschlossen sein.
Beispielsweise kann die elektronische Struktur matrixförmig derart ausgeführt sein, daß sie an die matrixförmige Verteilung von DNA-Spots auf einem Biochip angepaßt ist. Dabei ist es möglich, die einzelnen matrixförmigen angeordneten Elektroden mit individuellen Zuleitungen und invididuellen Spannungen zu versorgen. Elektroden können aber auch elektrisch miteinander verbunden sein, so daß nur eine Spannung anzulegen ist.
Die erfindungsgemäße Meßanordnung umfaßt ein Eilipsometer, das eine Strahlungsquelle, einen Polarisator, einen Analysator und einen Detektor sowie eine an den Detektor angeschlossene Auswerteeinrichtung aufweist. Ferner umfaßt die Meßanordnung einen Probenträger für die zu vermessende Probe/vermessenden Proben, deren Grundplatte auf der der Probe zugewandten Seite mindestens eine Metallschicht aufweist. Zwischen dem Analysator und dem Polarisaktor ist eine optische Ein- und Auskoppeleinrichtung am Probenträger angeordnet, wobei die Ein- und Auskoppeleinrichtung derart ausgebildet ist, daß die elektromagnetische Strahlung in einem solchen Einfallswinkel auf die Metallschicht gelenkt wird, daß eine gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz angeregt wird. Im Strahlengang vor und hinter der Ein- und Auskoppeleinrichtung ist jeweils ein Linsensystem zur flächigen Ausleuchtung der Ein- und Auskoppeleinrichtung und der Nachweisfläche des Detektors angeordnet. Der Detektor ist ein bildgebender Sensor und ermöglicht auf diese Weise die simultane ortsaufgelöste Messung der Meßsignale. Die Auswerteeinrichtung ist zur ortsaufgelösten simultanen Verarbeitung der Meß Signale und mindestens zur ortsaufgelösten simultanen Auswerten der (δcosΔ)-Werte ausgebildet.
Das Eilipsometer kann ein Nullellipsometer sein, wie dies beispielsweise in Analytical Chemistry Volume 62, Nr. 17, Sept. 1, 1990, Seite 889 beschrieben wird. Es kann sich auch um ein Eilipsometer mit rotierenden Polarisator oder um eine Eilipsometer mit rotierendem Analysator oder um ein phasenmodulierendes Eilipsometer handeln.
Vorzugsweise ist der bildgebende Sensor eine CCD-Kamera oder eine matrixartige Anordnung von Photodioden oder Phototransistoren. Die Strahlungsquelle kann polychromatisch sein, wobei zwischen Strahlungsquelle und bildgebendem Sensor ein Monochromator mit variabler Wellenlänge oder ein Filterrad mit optischen Bandpaßfiltern verschiedener Wellenlänge angeordnet ist.
Ferner kann die Strahlungsquelle auch eine weitgehend monochromatische Lichtquelle sein oder aus mehreren weitgehend monochromatischen Einzellichtquellen mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen bestehen.
Vorzugsweise ist das Linsensystem für die flächige Einstrahlung eine Scheimpflugoptik. Eine Scheimpflugoptik ist vorteilhaft bei der scharfen Abbildung von Ebenen, die nicht parallel zur Detektionsebene liegen.
Die Ein- und Auskoppeleinrichtung kann ein Prisma aus BK7, SFIO, SFl l, ZrO2, fused Silica, Quarz oder einem transparenten Kunststoff sein.
Der Probenträger kann den Boden einer Reaktionskammer bilden. Die Reaktionskammer kann eine Temperiereinrichtung und/oder eine Befeuchtungseinrichtung aufweisen.
Sämtliche Ausführungen zu Biochips und Probenträgern sind auch auf Titerplatten übertragbar.
Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 eine erfindungsgemäße Meßanordnung mit einem Biochip,
Figur 2 eine Meßanordnung gemäß einer weiteren Ausführungsform, Figur 3 eine Meßanordnung gemäß einer weiteren Ausführungsform mit einer Titerplatte,
Figur 4 ein vergrößerter Ausschnitt eines Biochips,
Figur 5a die vergrößerte Darstellung eines Mikroreaktionsgefäßes einer
Titerplatte,
Figur 5b die vergrößerte Darstellung eines Mikroreaktionsgefäßes einer
Titerplatte,
Figur 6 zwei Diagramme zur Erläuterung der Einstellung sowohl der
Oberflächenplasmonenresonanz als auch der Dicken der Metallschicht,
Figur 7 die Messung der Änderungen des δcosΔ in Abhängigkeit der
Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes,
Figur 8 der δcosΔ in Abhängigkeit der Meßzeit ohne Metallschicht,
Figur 9 der δcosΔ in Abhängigkeit der Meßzeit unter Verwendung einer
Silberschicht,
Figur 10 ein Diagramm, in dem δcosΔ gegen die Meßzeit beim
Hybridisierungsvorgang dargestellt ist unter Verwendung einer Goldschicht, und
Figur 11 ein dreidimensionales Balkendiagramm zur Erläuterung der ortsaufgelösten Messungen. In der Figur 1 ist eine Meßanordnung 1 schematisch dargestellt. Die elektromagnetische Strahlung 11 einer monochromatischen Lichtquelle, z.B. einer Halogenlampe 2 wird mit einem Linsensystem 3 dem Eintrittsfenster eines optischen Monochromators 4, (Filterad oder scannender Monochromator) angepaßt. Die den Monochromator 4 verlassende Strahlung 11 wird mit einem weiteren Linsensystem 5 parallelisiert und bei Bedarf aufgeweitet.
Die monochromatische Strahlung wird mit einem Polarisator 6 linear polarisiert und fällt senkrecht auf die Eintrittsfläche 21 einer Ein- und Auskoppeleinrichtung 20 in Form eines Prismas. Die Strahlung passiert mit gering Reflexionsverlusten und vernachlässigbarer Brechung die Eintrittsfläche 21 und fällt auf eine weitere Prismenoberfläche. Zwischen dieser Prismenoberfläche und dem darauf liegenden transparenten Probenträger 30 befindet sich eine dünne Ölschicht zur Brechungsindexanpassung. Der transparente Träger 30 besteht aus einem homogenen Glas- oder Kunststoffmaterial und weist einen möglichst ähnlichen Brechungsindex auf wie die Ein- und Auskoppeleinrichtung 20.
Nachdem die Strahlung die Grundplatte 31 des Probenträgers 30 durchdrungen hat, wird sie an der metallischen Schicht 33 reflektiert, wobei sie aufgrund der Anregung einer gedämpften Oberflächenplasmonenresonanz in ihrer Intensität abgeschwächt und hinsichtlich der Phase bzw. Polarisation verändert wird. Die reflektierte Strahlung trifft auf einen rotierenden Analysator 7, mit dessen Hilfe die reflektionsbedingten Intensitäts- und Phasenänderungen für die S- und P- Komponenten (senkrecht und parallel zur Einfallsebene polarisierte Anteile) der Strahlung bestimmt werden können. Die Strahlung passiert dann ein Linsensystem 8, das vorzugsweise eine Scheimpflugoptik sein kann, mit dem sie auf den bildgebenden Sensor 9 in Form einer CCD-Kamera abgebildet wird. Der bildgebende Sensor 9 leitet seine Signale an eine Auswerte- und Steuereinrichtung 10 weiter, die die Signale weiterverarbeitet und auch den Ablauf der gesamten Messung koordiniert. In dem hier gezeigten Beispiel, dient die ellipsometrische Meßanordnung zur Analyse eines Biochips 40, auf dem matrixartig DNA-Spots 41 mit unterschiedlichen Basensequenzen aufgebracht sind. Die DNA-Spots 41 sind auf der Metallschicht 33 immobilisiert und von einer wässrigen Lösung umgeben. Die wässrige Lösung kann über einen Zufluß 61 und einen Abfluß 62 ausgetauscht werden. Um Hybndisierungsvorgänge oder andere biologische Interaktionen zu beschleunigen ist ein Rührer 65 mit einem dazugehörigen Antrieb vorgesehen. Die wässrige Flüssigkeit kann mit einer Temperierungsvorrichtung 63 auf eine feste Temperatur eingestellt werden oder während der Messung abgekühlt oder aufgeheizt werden. Für mehrere Strahlungswellenlängen, die sich im Bereich der gedämpften Oberflächenplasmonenresonanz befinden, werden die ellipsometrische Meßgrößen tan und δcosΔ ortsaufgelöst bestimmt. Mit einer geeigneten Auswerte-Software wird aus den ellipsometrischen Meßdaten die Stärke der biologischen Interaktionen an den verschiedenen DNA-Spots 41 bestimmt.
In der Figur 2 ist eine Meßanordnung gemäß einer weiteren Ausführungsform dargestellt, die sich von der Anordnung der Figur 1 dadurch unterscheidet, daß die auf dem Biochip 40 befindlichen DNA-Spots 41 nicht von einem wässrigen sondern von einem gasförmigen Medium, z.B. Luft, Stickstoff or Argon umgeben sind. Aufgrund des geringen Brechungsindex gasförmiger Medien gegenüber wässrigen Medien ist ein kleinerer Einfallswinkel für die elektromagnetische Strahlung vorgesehen, damit bei gleichem spektralen Bereich eine gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz angeregt werden kann. Biochemische Substanzen sind im allgemeinen in gasförmiger Umgebung stabiler, wenn eine hohe Luftfeuchtigkeit vorliegt. Daher ist neben der Temperierung- auch eine Befeuchtungseinrichtung 66 vorgesehen.
In der Figur 3 ist eine weitere Ausführungsform einer Meßanordnung 1 dargestellt, die sich von der Meßanordnung gemäß der Figur 1 dadurch unterscheidet, daß anstatt eines Biochips 40 eine Titerplatte 50 mit einer matrixförmigen Anordnung von Vertiefungen (Küvetten 55) analysiert wird. Aufgrund der großen Abmessungen an der Titerplatte werden auch das Prisma und alle übrigen Komponenten entsprechend größer gewählt. Die Küvetten 55 sind mit Flüssigkeit gefüllt. Der übrige temperierte Raum ist jedoch mit einem gasförmigen Medium angefüllt. Zum Schutz von Verdunstungen ist auch hier neben der Temperierung eine Befeuchtungseinrichtung 66 vorgesehen.
In der Figur 4 ist eine vergrößerte Darstellung eines Bereiches eines Biochips 40 im Bereich eines Spots 41 dargestellt. Der Schichtaufbau des Biochips 40 besteht aus einer Grundplatte 31, eine Haftvermittlungsschicht 32, einer Metallschicht 33, einer Deckschicht 34, einer Immobilisierungsschicht 51 und einem bzw. mehreren darauf angebrachten Spots 41.
Die Grundplatte 31 kann z.B. ein gewöhnlicher Objekträger für Mikroskope sein. Typischerweise ist die Grundplatte 31 etwa 1 mm dick. Der Brechungsindex der Grundplatte ist dem des Prismas der Ein- und Auskoppeleinrichtung 20 angepaßt. Die Haftvermittlungsschicht 32, beispielsweise aus Titan oder Chrom, weist eine Dicke zwischen 1,5 und 15 nm auf.
Auf der Haftvermittlungsschicht 32 befindet sich die Metallschicht 33 aus Gold mit der Dicke zwischen 20 nm und 30 nm. Die Dicke der Goldschicht 33 stellt ein besonderes Merkmal dar, das diesen Biochip von anderen goldbeschichteten Biochips unterscheidet. Konventionelle goldbeschichtete Biochips weisen in der Regel ein Goldschicht von 50 nm und mehr auf. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist hingegen eine Goldschichtdicke zwischen 20 und 30 nm optimal. Die Metallschicht/Metallschichten werden vorzugsweise durch Aufdampfen oder Aufsputtern aufgebracht.
Auf der Metallschicht 33 befindet sich eine matrixförmige Anordnung von DNA-Spots 41 mit unterschiedlichen Basensequenzen. Die Anzahl der DNA- Spots 41 pro cm2 kann bis zu 500 000 betragen. Die DNA-Stränge sind beispielsweise über Beschüß mit Tröpfchen (Aufspotten), photolithographisch oder mit der Phosphoramididmethode auf dem Chip immobilisiert. Zur Lagerung können die DNA-Spots mit einer löslichen biochemischen Schutzschicht versehen sein, die sie vor Denaturierung schützt.
In der Figur 5a ist eine Titerplatte 50 bzw. ein vergrößerter Ausschnitt im Bereich eines Mikroreaktionsgefäßes 55 vergrößert dargestellt. Die Titerplatte 50 unterscheidet sich von einer konventionellen, handelsüblichen Titerplatte dadurch, daß die Grundplatte 31 innerhalb der Mikroreaktionsgefäße 55 eine Goldschicht 33 aufweist, die auf einer Haftvermittlungsschicht 32 aufgebracht ist. Die Haftvermittlungsschicht besitzt eine Dicke von 1,5 nm bis 15 nm und die Goldschicht eine Dicke von 20 nm bis 30 nm. Die transparenten Böden der Mikroreaktionsgefäße können aus Kunststoff oder Glas bestehen. Die Dicke der Grundplatte 31 liegt üblicherweise zwischen 0,1 mm und 1 mm. Die Böden können fester Bestandteil einer aus Kunststoff abgeformten Titerplatte sein oder sie sind Teile einer Glas- oder Kunststoflplatte, die mit einer bodenlosen Titerplatte verklebt ist. Der Brechungsindex der Böden ist dem des Prismas der Ein- und Auskoppeleinrichtung angepaßt. Die Unterseite der Titerplatte, die auf die Ein- und Auskoppeleinrichtung gelegt wird, ist unstrukturiert und glatt.
Auf der Goldschicht 33 befindet sich eine biochemische Schicht 51 mit Fängermolekülen, welche beispielsweise mit Biotin-Streptavidin- Verbindungen oder mittels Verfahren der Thiolchemie auf dem Gold immobilisiert sein können. Es handelt sich bei der Schicht 51 somit um eine Immobilisierungsschicht. In verschiedenen Mikroreaktionsgefäßen können sich gleichartige oder unterschiedliche Fängermoleküle befinden. Bei den Fängermolekülen kann es sich beispielsweise um Antikörper, Einzelstrang- DNA, Proteine, Peptide oder komplexere Strukturen wie Viren oder Bakterien handeln. Zur Lagerung können die Fängermoleküle mit einer löslichen biochemischen Schutzschicht versehen sein, die sie vor Denaturierung schützt. Während der Messung befindet sich in den Mikroreaktionsgefäßen eine Flüssigkeit.
In der Fig. 6 ist im oberen Teil der tanΨ und im unteren Teil der cosΔ jeweils in Abhängigkeit von der eingestrahlten Wellenlänge dargestellt. Zur Einstellung der Oberflächenplasmonenresonanz wird das unpolarisierte Licht unter einem Einfallswinkel von beispielsweise 70° auf die Unterseite der Bodenwand einer Küvette gelenkt, wie sie beispielsweise in der Fig. 5b dargestellt ist. Durch die Anregung der Oberflächenplasmonenresonanz in der Metallschicht 5 stellt sich beim tanΨ bei einer bestimmten Wellenlänge ein ausgeprägtes Minimum ein, das mit einer steilen Flanke der entsprechenden cosΔ-Kurve einhergeht.
Nachdem auf diese Art und Weise die Wellenlänge für die Anregung der Oberflächenplasmonenresonanz ermittelt worden ist, erfolgt die weitere Optimierung über die Einstellung der Dicke der Metallschicht. Sowohl für tanΨ als auch für cosΔ sind 5 Kurven für die Dicken 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm und 50 nm aufgetragen. Die Kurven gelten für eine Metallschicht aus Silber; ähnliche Werte ergeben sich für eine Goldschicht. Es ist deutlich zu sehen, daß bei Schichtdicken von 10 nm und 50 nm die cosΔ-Kurven flach verlaufen und die Minima des tan nicht so deutlich ausgeprägt sind. Dünnere Metallschichten eignen sich vorzugsweise zur Bestimmung biologischer Schichten größerer Dicke. Bei Schichtdicken der Metallschicht < 10 nm ergeben sich jedoch eher zu geringe Sensitivitäten. Schichtdicken der Metallschicht > 50 nm eignen sich aufgrund des geringen Dynamikbereichs weniger für das erfindungsgemäße Verfahren. Lediglich die Kurven für die Dicken 20 bis 40 nm zeigen einen steilen Anstieg und somit eine hohe Detektionsempfindlichkeit, wobei der gesamte Dynamikbereich zwischen -1 und + 1 ausgeschöpft wird. Nachdem die Optimierung der Wellenlänge, des Einfallswinkels und der Dicke der Metallschicht eingestellt worden ist, wurden Messungen an Proben durchgeführt, die in den Fign. 7 bis 9 dargestellt sind.
In der Fig. 7 ist der cosΔ in Abhängigkeit der Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes dargestellt, wobei die linke durchgezogene Kurve Messungen ohne Antikörper und die punktierte Kurve Messungen mit Antikörpern zeigen. Die Messungen wurden an Küvetten mit Böden aus Glas durchgeführt, deren Bodenwand mit einer 12 nm dicken Titanschicht, einer 27 nm dicken Silberschicht und einer 17 nm dicken Streptavidinschicht als Immobilisierungsschicht versehen ist. Der Einfallswinkel des Lichtes liegt bei 70° . Nach einer Interaktionszeit von 10 min wächst eine 2,5 nm dicke Antikörperschicht auf, die durch die Verschiebung der cosΔ-Kurve nachgewiesen wird. Die spektralen Messungen dienen dazu, die optimale Wellenlänge hinsichtlich der Detektionsempfindlichkeiten des Dynamikbereiches zu ermitteln. Im vorliegenden Fall ergab sich ein optimaler Wellenlängenbereich von 640 bis 700 nm. Führt man eine "single- wavelength" -Messung mit beispielsweise 680 nm durch, so läßt sich in Abhängigkeit von der Inkubationszeit der Antikörperlösung ein Antikörperschichtdickenzuwachs messen, der näherungsweise proportional zur Betragsänderung des cosΔ- Wertes ist. Nach einer Zunahme der Antikörperschicht um 2,5 nm hat sich der cosΔ-Wert um etwa 0,2 geändert. Die sich ergebende Detektionsempfindlichkeit ( | δcosΔ | /Schichtdicke) beträgt 0,08/nm. Diese Detektionsempfindlichkeit liegt um mehr als eine Größenordnung über derjenigen, die bei "konventioneller Ellipsometrie" (beispielsweise mit einem metallischen Substrat) erreichbar ist.
In der Fig. 8 ist der cosΔ in Abhängigkeit von der Meßzeit dargestellt. Es handelt sich hierbei um eine Vergleichsmessung, bei der auf der Bodenwand der Küvette die Metallschicht fehlte. Die Pfeile markieren die Zeitpunkte, an denen entweder mit einer wässrigen Pufferlösung oder mit Antikörper-haltigen wässrigen Lösungen in der Konzentration von 66 pmol/ml bzw. 223 pmol/ml (s. Fig. 8) gearbeitet wurde. Sobald die Antikörper zugesetzt wurden, steigt die cosΔ-Kurve in Abhängigkeit von der Meßzeit an. Der Anstieg ist jedoch kaum zu unterscheiden von cos Δ-Änderungen, die bei Abwesenheit von Antikörpern (nur Pufferlösung) aufgrund thermischer Driften auftreten.
Die Streuung der Meßpunkte ist erheblich und es zeigt sich, daß durch die Verwendung einer Silber- bzw. einer Goldschicht auf der Innenseite der Bodenwand deutlich bessere Ergebnisse erzielt werden, wie dies in der Figur 9 dargestellt ist. Der Wertebereich des cosΔ wird hierbei von 0,05 bis -0,95 durchlaufen, während der Wertebereich gemäß der Fig. 8 sich nur von -0,57 bis -0,595 erstreckt. Es wird deutlich, daß durch das Vorsehen der Metallschicht und die Einstellung der Oberflächenplasmonenresonanz deutlich größere Signalhöhen erzielt werden können und nicht nur eine Verbesserung des Signal-/Rauschverhältnisses, was einfach durch längere Meßzeiten zu erreichen ist.
In der Figur 10 ist ein Diagramm zur Erläuterung des Nachweises von DNA- Hybridisierungen dargestellt. Die nachgewiesenen Einzelstränge der DNA- Moleküle besitzen eine Masse von etwa 6 k Dalton und sind damit deutlich kleiner und schwieriger nachzuweisen als beispielsweise Antikörper (typischerweise 150 k Dalton). Die ermittelte Dicke der hybridisierten DNA- Schicht von etwa 2 nm führt zu einer cosΔ-Änderung von 0,2. Ein derart großes Verhältnis von cosΔ-Änderung zu Schichtdickenänderung wird mit keiner anderen bekannten ellipsometrischen Anordnung erreicht. Die cosΔ- Änderung von 0,2 lag bei dem verwendeten Ellipsometer etwa um den Faktor 100 über dem Detektionslimit. Mit einem optimierten Ellipsometer lassen sich noch geringere Detektionslimits und damit höhere Empfindlichkeit erreichen. Von der tanΨ-Skala wurde der Wert 0,25 aus darstellungstechnischen Gründen abgezogen. Der Figur 11 ist eine dreidimensionale Darstellung einer simultanen, ortsaufgelösten Messung. Es wurde eine simultane, ortsaufgelöste Messung an einer Titerplatte (1536' er Format) durchgeführt. Die Anzahl der simultan gemessenen Küvetten betrug 12. Die Vermittlungsschicht bestand aus 10 nm dickem Titan. Die Metallschicht bestand aus 25 nm Gold. Das Balkendiagramm zeigt eine Differenzmessung bei Änderung der Ionenkonzentration:
Messung 1: NACL-Lösung 0,25 molar Messung 2: NACL-Lösung 0,63 molar
Die Balkenhöhe entspricht cosΔ] - cosΔ2. Die entsprechende Brechungsindexänderung in der Lösung betrug 0,004. Die verwendete Wellenlänge lag bei 680 nm und der Einfallswinkel bei 70°.
Die einzelnen Balken in den Diagrammen sind einzelnen Küvetten der Titerplatte zugeordnet. Die Messung zeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kleine Brechungsindexänderungen (hier einer Flüssigkeit) simultan, ortsaufgelöst gemessen werden können.
Bezugszeichen
Meßanordnung
Strahlungsquelle
Linsensystem
Monochromator
Linsensystem
Polarisator
Analysator
Linsensystem
Detektor
Auswerteeinrichtung
Lichtstrahl
Ein- und Auskoppeleimichtung
Eintrittsfläche
Austrittsfläche
Prisma
Probenträger
Grundplatte
Haftvermittlungsschicht
Metallschicht
Deckschicht biochemische Schicht
Biochip
DNA-Spot
Titerplatte
Immobilisierungsschicht
Seitenwand
Flüssigkeit
M ikroreaktionsgef äß
Reaktionskammer Zufluß
Abfluß
Temperiervorrichtung
Rührer
Rührantrieb
Befeuchtigungseinrichtung

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von auf chemischen, biologischen, biochemischen oder physikalischen Effekten beruhenden Probenänderungen, die auf einer Änderung des Brechungsindexes und/oder der Schichtdickenänderung der Probe basieren, wobei sich die Probe auf einem mit mindestens einer Metallschicht versehenen Probenträger befindet, mittels ellipsometrischer Messungen, bei denen die ellipsometrischen Parameter und Δ ermittelt werden, wobei
der Einfallswinkel und/oder die Frequenz der für die ellipsometrischen Messungen verwendeten elektromagnetischen Strahlung derart eingestellt wird, daß in der Metallschicht eine gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz angeregt wird,
die Detektionsempfindlichkeit (δcosΔ)/(Einheit der Probenänderung) über die Dicke der Metallschicht eingestellt wird,
die elektromagnetische Strahlung auf der der Probe abgewandten Seite des Probenträgers flächig eingestrahlt wird und
bei mindestens einem Einfallswinkel und mindestens einer Frequenz mindestens zwei zeitlich versetzte, simultane, ortsaufgelöste ellipsometrische Messungen an der Probe/den Proben durchgeführt werden und wenigstens die jeweils dazugehörigen Δ- bzw. cosΔ- Werte zur Ermittlung der Probenänderung ausgewertet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die simultanen, ortaufgelösten ellipsometrischen Messungen während sowie vor und/oder nach der Probenänderung durchgeführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß kontinuierlich simultane, ortsaufgelöste ellipsometrische Messungen mindestens während eines Zeitabschnitts der Probenänderungen durchgeführt werden und wenigstens die zeitliche Änderung der dazugehörigen örtlichen cosΔ Werte ausgewertet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Metallschicht zwischen 10 und 45 nm, insbesondere zwischen 20 und 40 nm eingestellt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die ellipsometrischen Messungen an einem ruhenden oder fließenden Medium durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß elektromagnetische Strahlung im Wellenlängenbereich von 100 nm bis 10μm, vorzugsweise von 300 nm bis 3μm verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die simultan ortsaufgelösten ellipsometrischen Messungen an einem mit mehreren Spots versehenen Biochip durchgeführt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die simultan ortsaufgelösten ellipsometrischen Messungen an mehreren Mikroreaktionsgefäßen einer Titerplatte durchgeführt werden.
9. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Untersuchung biochemischer Interaktionen auf der Basis von DNA- oder RNA-Hybridisierung, DNA- oder RNA-Protein- Wechselwirkungen, DNA- oder RNA-Antikörper- Wechselwirkungen oder Antikörper-Antigen- Wechselwirkungen .
10. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, zur Messung des Schrumpfens oder Quellens von Polymerschichten.
11. Biochip mit einem Probenträger aus einer mit mindestens einer Metallschicht versehenen Grundplatte, dadurch gekennzeichnet, daß der Probenträger (30) aus einem Material besteht, das im elektromagnetischen Wellenlängenbereich zwischen 100 nm und lOμm mindestens in einem Wellenlängenabschnitt von mindestens 10 nm Breite eine Transmission von mindestens 20% aufweist, und
daß die Metallschicht (33) aus Kupfer, Silber, Gold oder Aluminium oder aus einer Legierung besteht, die wenigstens eines dieser Metalle zu mindestens 5 Gew.-% enthält, wobei die Dicke der Metallschicht (33) oder die Gesamtdicke mehrerer Metallschichten zwischen 10 und 45 nm, insbesondere zwischen 20 und 40 nm liegt.
12. Biochip nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Grundplatte (31) aus einem der Materialien BK7, SF10, SFll, ZrO2, fused Silica, Quarz und/oder einem transparenten Kunststoff besteht.
13. Biochip nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Metallschicht (33) und der Grundplatte (31) eine Haftvermittlungsschicht (32) angeordnet ist.
14. Biochip nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Haftvermittlungsschicht (32) aus Titan oder Chrom mit einer Dicke von 1 nm bis 20 nm besteht.
15. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Metallschicht (33) eine nicht- metallische Deckschicht aufgebracht ist.
16. Biochip nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die nichtmetallische Deckschicht (34) aus Glas, Metalloxid, Halbleiteroxid und/oder Kunststoff besteht.
17. Biochip nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der nicht-metallischen Deckschicht (34) maximal 500 nm beträgt.
18. Biochip nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckschicht (34) im Wellenlängenbereich von 100 nm bis lOμm mindestens in einem Wellenlängenabschnitt von 10 nm Breite bei senkrechtem Einfall eine Transmission größer als 10% aufweist.
19. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht (33) oder die Deckschicht (34) eine hydrophile oder hydrophobe Oberfläche aufweist.
20. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Metallschicht (33) oder der Deckschicht (34) eine biochemische Immobilisierungsschicht (51) aufgebracht ist.
21. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Metallschicht (33) oder der Deckschicht (34) DNA-Spots (41) aufgebracht sind.
22. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterseite der Grundplatte (31) eine Einrichtung (20) zur flächigen Einkopplung und Auskopplung von elektromagnetischer Strahlung trägt.
23. Biochip nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Ein- oder Auskoppeleinrichtung (20) und der Grundplatte (31) eine Immersionsflüssigkeit vorgesehen ist.
24. Biochip nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Grundplatte (31) und der Ein- und Auskoppeleinrichtung (20) eine flexible Schicht zur Brechungsindexanpassung angeordnet ist.
25. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht (33) an eine Spannungsquelle angeschlossen ist.
26. Biochip nach einem der Ansprüche 11 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht (33) partiell unter Ausbildung einer matrixförmigen Struktur aufgebracht ist.
27. Biochip nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß jedes metallische Matrixelement an eine eigene Spannungsquelle angeschlossen ist.
28. Meßanordnung mit einem Ellipsometer, das eine Strahlungsquelle, einen Polarisator, einen Analysator und einen Detektor sowie eine an den Detektor angeschlossene Auswerteeinrichtung aufweist, mit einem Probenträger für die zu vermessende/n Probe/n, deren Grundplatte auf der der Probe zugewandten Seite mindestens eine Metallschicht aufweist, und mit einer zwischen dem Analysator und Polarisator am Probenträger angeordneten optischen Ein- und Auskoppeleinrichtung, wobei die Ein- und Auskoppeleinrichtung derart ausgebildet ist, daß die elektromagnetische. Strahlung unter einem solchen Einfallswinkel auf die Metallschicht gelenkt wird, daß eine gedämpfte Oberflächenplasmonenresonanz angeregt wird, dadurch gekennzeichnet, daß im Strahlengang vor und hinter der Ein- und Auskoppeleinrichtung (20) jeweils ein Linsensystem (5,8) zur flächigen Ausleuchtung der Ein- und Auskoppeleinrichtung (20) und der Nachweisfläche des Detektors (9) angeordnet ist,
daß der Detektor (9) ein bildgebender Sensor ist und
daß die Auswerteeinheit (10) zur ortsaufgelösten Simultanverarbeitung der Meßsignale und mindestens zur ortsaufgelösten Simultanauswertung der (δcosΔ)-Werte ausgebildet ist.
29. Meßanordnung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Ellipsometer ein Null-Ellipsometer, ein Ellipsometer mit rotierendem Polarisator, ein Ellipsometer mit rotierendem Analysator oder ein phasenmodulierendes Ellipsometer ist.
30. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß der bildgebende Sensor eine CCD-Kamera oder eine matrixartige Anordnung von Photodioden oder Phototransistoren ist.
31. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsquelle (2) polychromatisch ist und daß zwischen Strahlungsquelle (2) und bildgebendem Sensor ein Monochromator (4) mit variabler Wellenlänge oder ein Filterrad mit optischen Bandpassfiltern verschiedener Wellenlänge angeordnet ist.
32. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsquelle (2) eine weitgehend monochromatische Lichtquelle ist oder aus mehreren weitgehend monochromatischen Einzellichtquellen mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen besteht.
33. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Linsensystem (8) eine Scheimpflugoptik ist.
34. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 28 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Ein- oder Auskoppeleinrichtung (20) ein Prisma aus BK7, SF10, SFl l, ZrO2, fused Silica, CrO2, Si3N4, Quarz oder einem transparenten Kunststoff ist.
35. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 28 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Probenträger (30) den Boden einer Reaktionskammer (60) bildet.
36. Meßanordnung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer (60) eine Temperiereinrichtung (63) aufweist.
7. Meßanordnung nach einem der Ansprüche 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer (60) eine Befeuchtungseinrichtung (66) aufweist.
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