DE19817472A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Detektion der Verschiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz - Google Patents

Abstract

Vorrichtung zur Detektion der Verschiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz mit einer Lichtquelle, einem Oberflächenplasmonenresonanztransducer, einer Detektoranordnung und einer Auswerteeinrichtung, wobei die Detektoranordnung mindestens ein Detektorabschnittpaar mit einem ersten Detektorabschnitt und einem zweiten Detektorabschnitt aufweist, wobei der erste Detektorabschnitt in einem Abstand von dem zweiten Detektorabschnitt angeordnet ist, jeder Detektorabschnitt ein Detektorsignal ausgibt, wobei die Lage der Detektoranordnung bezogen auf das von dem Oberflächenplasmonenresonanztransducer reflektierte Licht so gewählt wird, daß die Auswerteeinrichtung aus der Kombination der Detektorsignale von beiden Detektorabschnitten die Position und die Verschiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz bestimmen kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion der Verschiebung einer Oberflächen­ plasmonenresonanz mit optimaler Auflösung insbesondere für die zeitaufgelöste Messung von Bindungsreaktionen in biolo­ gischen Sensorsystemen.

Die Oberflächenplasmonenresonanz, engl. Surface Plasmon Re­ sonanz (SPR) ist ein physikalischer Effekt, der die Wechsel­ wirkung eines elektromagnetischen Feldes mit den freien Elektronen an der Oberfläche eines Metalles beschreibt (Raether Lit. 1). Speziell können Oberflächenplasmonen an der Oberfläche eines dünnen Metallfilms von Photonen geeig­ neter Energie und geeigneten Impulses angeregt Werden. Die Anregung der SPR durch Licht erfolgt dabei entweder in der Kretschmann- (Kretschmann Lit. 2) oder in der Ottokonfigura­ tion (Otto Lit. 3).

In SPR-Sensoren, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, wird die Resonanz entweder spektral- oder winkelaufge­ löst vermessen. Dabei ist das eingestrahlte Licht entweder schmalbandig bzw. parallel und es wird die eingestrahlte Wellenlänge bzw. der Reflektionswinkel variiert, oder das eingestrahlte Licht deckt die gesamte interessierende spek­ trale bzw. Reflektionswinkelbreite ab und wird spektral- bzw. winkelaufgelöst detektiert.

Der Einsatz der SPR für sensorische Zwecke beruht darauf, daß die Position der Resonanz im Winkel- bzw. Wellenlängen­ raum von den optischen Eigenschaften des an die SPR-tragende Oberfläche angrenzenden Volumens abhängt. Der Brechungsindex n des angrenzenden Volumens beeinflußt die Lage der SPR. Wird das angrenzende Volumen durch ein System aus unter­ schiedlichen (bezgl. ihrer optischen Eigenschaften) Schich­ ten gebildet, ist die Lage der SPR auch von der Dicke der Schichten abhängig. In einem solchen System ist die Lage der SPR vom Produkt n.d abhängig. Ein SPR-Sensor ist geeignet, die Lage der Resonanz zu vermessen und in kinetischen Senso­ ren, deren Verschiebung als Funktion der Zeit zu bestimmen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Detektion der Verschiebung einer Ober­ flächenplasmonenresonanz sowie ein zugehöriges Verfahren be­ reitzustellen, das sich durch einen einfachen und preiswer­ ten Aufbau und eine optimale Auflösung mit hoher Meßgenauig­ keit auszeichnet.

Diese Aufgabe wird gelöst mit den Merkmalen der Patentan­ sprüche.

Die vorliegende Erfindung betrifft einen SPR-Sensor, der auf der winkelaufgelösten Vermessung der SPR beruht (Fig. 1).

Der beschriebene SPR-Sensor verwendet eine Lichtquelle (1) die von einem Linsensystem (1a) mit einem angepaßten Öff­ nungswinkel α auf die SPR erzeugende Oberfläche (2b) im SPR- Transducer (2) fokussiert wird. Bei den entsprechenden im Stand der Technik beschriebenen Geräten wird das reflek­ tierte Licht mit Hilfe eines ortsauflösenden Photodetektors (3) - beispielsweise einer CCD-Kamera oder einem CCD-Array oder einem Photodiodenarray - detektiert. Die Auswertung des Kamerabildes mit einer Auswerteeinheit (4) - in der Regel unter Nutzung der Pixelinformation und interpolativer Tech­ niken - gestattet die Bestimmung der Lage der SPR und damit bei zeitaufgelöster Messung ihrer Verschiebung als Funktion der Zeit. Oft wird die Lage der SPR durch einen Parameter, nämlich die Lage des Minimums der Reflektion beschrieben. Die Kamerainformation wird mit Hilfe entsprechender Anpas­ sungsalgorithmen dementsprechend ausgewertet. Führen nun Än­ derungen der Eigenschaften des an die SPR tragende Oberflä­ che (2) angrenzenden Volumens und/oder dieser Oberfläche selbst zu einer Änderung der Lage der SPR, so kann diese Än­ derung gemessen werden. Auf diese Art können Sensoren für den Brechungsindex n eines Mediums, die Dicke d einer an­ grenzenden Schicht, bei konstantem Brechungsindex n in die­ ser Schicht, oder auch Sensoren für bestimmte Spezies aufge­ baut werden, wenn entweder die Dicke d einer angrenzenden Schicht oder ihr Brechungsindex n oder beide Größen durch spezifische Anlagerung der genannten Spezies verändert wer­ den. Diese Art Sensor wird als Affinitätssensor in der Bio­ technologie eingesetzt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird, ein SPR-Sensor be­ reitgestellt, der mit Hilfe einer optimalen Winkelauflösung des Detektors (3) dazu in der Lage ist, Verschiebungen der Oberflächenplasmonenresonanz zu vermessen. Dabei soll gleichzeitig ein möglichst großer Bereich der möglichen Ver­ schiebung der SPR abgedeckt werden - d. h. es soll mit opti­ maler Auflösung größtmögliche Dynamik erzielt werden.

Ein Meßsystem zur Bestimmung der Verschiebung der Oberflä­ chenplasmonenresonanz, das diese Forderungen erfüllt, kann in einer ersten Ausführungsform der Erfindung auf der Basis von kommerziell erhältlichen Standard-Photodetektoren aufge­ baut sein.

Eine zweite Ausführungsform der Erfindung verwendet spe­ zielle an die Meßaufgabe angepasste Photodetektoren, die eine Erhöhung der Sensitivität der Messung ohne Verlust an dynamischem Bereich ermöglichen.

In einer dritten Ausführungsform wird mit Hilfe einer ange­ paßten Einkopplungsoptik die Sensitivität optimiert, indem der integrale Charakter der Ausführungsformen 1 und 2 aufge­ löst wird.

Mit einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird die Auflösung digitaler Intensitätsmessungen verbessert. Dabei wird die Auflösung der Intensitätsmessung soweit erhöht, daß das Rauschen der Lichtquelle bzw. das Schrotrauschen des im Detektor erzeugten Photostroms die bestimmenden Größen sind.

Eine fünfte Ausführungsform des beschriebenen Sensors inte­ griert die hochsensitive winkelaufgelöste, eine sechste Aus­ führungsform die hochsensitive wellenlängenaufgelöste Mes­ sung der SPR-Verschiebung mit der integralen Methode die in den Ausführungsformen 1, 2 beschrieben wird.

In einer siebten Ausführungsform wird das gefundene Prinzip auf die wellenlängenauflöste Bestimmung der Verschiebung der Oberflächenplasmonenresonanz übertragen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen und der Zeichnungen näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Anordnung eines SPR-Senscrs,

Fig. 2a-h Diagramme, die die Abhängigkeit der Intensität in Bezug auf die Lage des Plasmons bzw. der Lage des Minimums der Resonanz für verschiedene Detektor­ breiten und Startwinkel,

Fig. 3 ein Diagramm mit der Abhängigkeit der Sensitivität in Bezug zum Minimumwinkel,

Fig. 4a ein Diagramm mit der Abhängigkeit des dynamischen Bereichs bei Mindestsensitivität in Bezug auf die Breite des Detektors,

Fig. 4b ein Diagramm mit der Abhängigkeit der Max-Min-Sen­ sitivität von der Breite des Detektors,

Fig. 5a-c Diagramme mit dem Intensitätsverlauf bei einer An­ ordnung mit zwei Detektorsegmenten sowie der zuge­ hörigen Sensitivität,

Fig. 6 ein Diagramm mit dem Intensitätsverlauf bei einem System, bei dem zwei in sich parallele Lichtstrah­ len verwendet werden,

Fig. 7 eine schematische Darstellung eines Transducers,

Fig. 8 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform eines SPR-Sensors,

Fig. 9 ein Blockschaltbild einer Auswerteeinrichtung,

Fig. 10 eine schematische Darstellung einer verbesserten Ausführungsform der Erfindung,

Fig. 11 eine schematische Darstellung einer alternativen Ausführungsform der Erfindung,

Fig. 12 ein Diagramm mit dem Intensitätsverlauf bei einer Anordnung mit zwei Lichtstrahlen verschiedener Wellenlänge, und

Fig. 13 eine schematische Darstellung einer weiteren be­ vorzugten Ausführungsform der Erfindung.

Ein Detektor minimaler Winkelauflösung weist ein photosensi­ tives Element auf, das Licht aus einem bestimmten Winkelbe­ reich empfängt. Der Winkelbereich wird charakterisiert durch seine absolute Lage und die Ausdehnung. Der Photosensor be­ stimmt die Intensität (W/m²) als Integral über die Strahldichte (W/m².sr).

Wird ein Oberflächenplasmon über diesen Bereich verschoben, ergibt sich eine Abhängigkeit dieses Integrals von der Lage des Plasmons bzw. von der Lage des Minimums der Resonanz (Fig. 2a-h). Die in Fig. 2b, d, f, h gezeigten Funktionen sind nahezu konstant solange das Plasmon außerhalb des Detek­ tionsbereiches des Photosensors liegt, streben dann einem Minimum zu, steigen dann wieder an und werden wieder nahezu konstant. Sie ergeben sich als Faltungsintegral zwischen der Funktion der Oberflächenplasmonenresonanz und der Apparate­ funktion - in diesem Fall der Rechteckfunktion (idealisiert) die Form und Sensitivität des Detektors wiedergibt. Für die entsprechenden Berechnungen wurden die Fresnel'schen Formeln für die Reflektion von Licht an Systemen dünner Schichten in einem Matrixformalismus (Johnston Lit. 4) zur Berechnung der reflektierten Intensität in einem Oberflächenplasmonenreso­ nanzsensor verwendet. Die Schärfe des Minimums kann durch Änderung der Breite des Integrationsbereiches, d. h. der Ausdehnung des Detektors variiert werden. Optimal ist die Schärfe des Minimums dann, wenn die Breite des Detektors möglichst schmal gewählt wird, die Apparatefunktion also eine δ-Funktion ist. Dies ist auch dasjenige System, das op­ timale Sensitivität bei der Bestimmung der Verschiebung der SPR gestattet. Sensitivität ist hier definiert als Verhält­ nis der Änderung des Detektorsignals zur Verschiebung der Plasmonenresonanz (Fig. 3). Dabei wird die Verschiebung der Plasmonenresonanz durch die Änderung des Minimumswinkels be­ schrieben.

In realen Meßsystemen, die die SPR-Verschiebung bestimmen sollen, ist jedoch nicht allein die Sensitivität des Systems von Interesse, sondern auch der dynamische Bereich des Meß­ systems. Der dynamische Bereich soll im folgenden als derje­ nige Bereich definiert sein, der eine eindeutige Zuordnung von Signaländerung zu Plasmonenresonanz-Verschiebung mit ei­ ner Mindestsensitivität S_min gestattet. Eindeutige Bestimmung der Verschiebung bedeutet ausdrücklich, daß sowohl der Be­ trag, als auch die Richtung der Verschiebung der Plasmonen­ resonanz aus dem Meßsignal ermittelt werden kann.

Aus den Fig. 2a-f und 3 wird deutlich, daß die Funktion keine eindeutige Bestimmung der Lage des Plasmons über den gesamten gezeigten Bereich gestattet. Vielmehr ist der nutz­ bare Bereich lediglich derjenige, in dem die erste Ableitung des gezeigten Signals (Fig. 3) nicht ihr Vorzeichen wechselt und mindestens einen absoluten Wert größer einer Grenze S_min hat, die von der Meßauflösung des Systems und der gewünsch­ ten Auflösung in der Bestimmung der SPR-Verschiebung, letz­ lich also vom gewünschten Signal/Rauschen-Verhältnis ab­ hängt. In Fig. 4a, b sind der dynamische Bereich (Fig. 4a) und die maximale Sensitivität (Fig. 4b) des Meßsystems ab­ hängig von der Breite des vom Detektor erfaßten Winkelberei­ ches bei einem Startwinkel - kleinster vom Detektor erfaß­ ter Reflexionswinkel - von 71° dargestellt. Maximale Sensi­ tivität und maximaler dynamischer Bereich werden bei einer Detektorbreite von ca. 2° erreicht. Da das Signal als Fal­ tungsintegral zwischen Resonanzkurve und Detektor aufgefaßt werden muß, ist der dynamische Bereiche immer direkt von der Breite der Resonanz selbst abhängig. In realen Meßsystemen reicht die vom beschriebenen System zur Verfügung gestellte Dynamik nicht aus. Die maximale Ausdehnung des dynamischen Bereiches bei einer geforderten Mindestsensitivität von ca. 0,1/° beträgt in dem beschriebenen System ca. 3,5° Minimums­ verschiebung.

Für den Einsatz in realen Sensoren ist dieser Bereich zu klein. Er kann durch den Einsatz eines zweiten benachbarten unabhängigen Sensors um ca. einen Faktor 3 erweitert werden. Eine erste Ausführungsform der Erfindung verwendet 2 unmit­ telbar benachbarten Photosensoren - sogenannte 2-Segment Photodioden - als Detektoren. Hier sind 2 Photodioden derart angeordnet, daß sie nur durch einen sehr kleinen Bereich - das so genannte Gap - getrennt sind. Bei gängigen 2-Segment Photodioden ist das Gap ca. 10 µm-100 µm breit. Die beiden Photodioden arbeiten nahezu unabhängig, d. h. ohne Überspre­ chen, voneinander. Entsprechende Sensoren werden in der Re­ gel für Zentrierungsaufgaben verwendet. Z.B. werden sie zur Beobachtung eines Lichtzeigers in der Rasterkraftmikroskopie (engl. Atomic Force Mikroskopy - AFM) eingesetzt, um die Auslenkung der Mikroskopspitze zu messen. Bei diesen Aufga­ ben ist die Arbeitsweise derart, daß die Position des Zen­ trums eines Lichtstrahls, d. h. des Maximums der Intensität bestimmt wird. Oft werden im Rahmen dieser Anwendung nicht 2-Segment sondern 4-Segment-Photodioden eingesetzt, die es gestatten, die Position des Lichtzeigers entlang zweier un­ abhängiger Achsen zu bestimmen. Im Falle der vorliegenden Erfindung wird nicht wie im Stand der Technik beschrieben, die Position eines Beleuchtungsmaximums, sondern die eines Beleuchtungsminimums bestimmt. Überraschenderweise kann mit Hilfe eines 2-Segment Photodetektors die Position und die Verschiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz bestimmt werden. Diese Aufgabe erfordert die Einführung neuer Verfah­ ren und unterscheidet sich grundsätzlich von der im Stand der Technik beschriebenen Anwendung von 2- oder Mehrsegment Photodioden. Die von einer Verschiebung einer SPR (Fig. 5a) herrührenden Signalverläufe (Fig. 5b), der beiden unabhängigen Photodiodenströme eines 2-Segment Photodiodensensors und die resultierenden Sensitivitäten (Fig. 5c) werden in Fig. 5a-c gezeigt. In Fig. 5b wird deutlich, daß beide Signale phasen­ verschoben um genau die Breite eines Segmentes plus des hal­ ben Gaps auftreten. Bei geeigneter Wahl der Breite des ge­ samten Detektors - genauer, der Breite des vom Detektor er­ faßten Winkelbereiches - kann gewährleistet werden, daß min­ destens die Sensitivität eines Detektorsignals dem Betrage nach größer ist, als die oben geforderte Mindestsensitivi­ tät. Diese Tatsache, und die Möglichkeit der Kombination der Informationen beider Detektoren, ermöglichen eine eindeutige Bestimmung der Verschiebung der Plasmonenresonanz über einen Bereich, der ca. die dreifache Ausdehnung des entsprechenden dynamischen Bereiches eines einzelnen Detektors hat. Dies wird in Fig. 5c deutlich. Durch Kombination der Information beider Signale erhält man eine eindeutige Beschreibung der Verschiebung der Position der SPR, solange sich die SPR der­ art innerhalb des Meßbereiches mindestens einer der beiden Photodioden befindet, daß ein Änderung der Lage der SPR mit der oben bereits erläuterten gewünschten Genauigkeit be­ stimmt werden kann. Im hier gezeigten System ergibt sich jetzt der dynamische Bereich zu ca. 10° Minimumsverschiebung der Plasmonenresonanz. Das Gap innerhalb der 2-Segment Pho­ todiode spielt keine signifikante Rolle, da es sehr klein gegenüber der Ausdehnung der einzelnen Photodioden in der interessierenden Richtung ist (10 µm-100 µm/ca. 1 mm).

Überraschenderweise erreicht man durch Verwendung eines grö­ ßeren Gaps bei Beibehaltung der äußeren Grenzen des Meßbe­ reiches eine Schärfung der betrachteten Signale, als eine Erhöhung der Sensitivität ohne Informationsverlust. Die zweite Ausführungsform der Erfindung enthält entsprechend einen angepaßten Photodetektor - genauer eine Anordnung von zwei Photodioden, die durch ein an die Meßaufgabe angepass­ tes Gap voneinander getrennt sind. Dabei kann das Gap ca. die doppelte Größe eines einzelnen Detektors erreichen. Ge­ nauer muß die Ausdehnung des Gaps entsprechend der Form und Ausdehnung der untersuchten Plasmonenresonanz gewählt wer­ den. Die Sensitivität kann bis um den Faktor 2 vergrößert werden. Bei gleichem optischen Aufbau, d. h. bei Verwendung des gleichen Strahlprofils erhält man so eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit um den Faktor 2^0,5, wenn das Meßsystem schrotrauschbegrenzt arbeitet. Ändert man den optischen Auf­ bau so, daß das Strahlprofil derart ist, daß die volle In­ tensität auf die empfindlichen Photodetektoren fällt, ist der Gewinn an Nachweisempfindlichkeit der volle Faktor 2.

In den Ausführungsformen 1, 2 wird zur Einkopplung des Lich­ tes auf die SPR-tragende Oberfläche eine fokussierende Optik verwendet. Das auf die Transduceroberfläche eingestrahlte Licht überdeckt einen Winkelbereich entsprechend der Apertur des auf die fokussierende Optik fallenden Lichtes und deren Fokallänge. Damit ist der Charakter der Signale der verwen­ deten Photodetektoren immer ein integraler. Die Apparate­ funktion ist in den beschriebenen System in Bezug auf die SPR ausgedehnt. Wird statt dessen zur Einkopplung kein fokus­ sierendes System, sondern ein System verwendet, das zwei in sich parallele Strahlen unter entsprechend der obigen Aus­ führungen angepaßten Einfallswinkeln in den Transducer ein­ koppelt, ist die jeweilige Apparatefunktion δ-förmig. Die entsprechenden Signale der Photodetektoren repräsentieren die SPR an der Position der jeweiligen δ-Funktion (Fig. 6). Verschiebungen der SPR können dann mit größtmöglicher Sensi­ tivität bestimmt werden. Die in dieser Ausführungsform 3 verwendete Einkopplungsoptik bzw. deren Funktion kann di­ rekt vom Transducerprisma übernommen werden. Besonders vor­ zuziehen, ist die Verwendung eines Transducers (2) (Fig. 7), der sowohl die Funktionalität für die Einkopplung der Strah­ lung und die plasmonentragende Oberfläche zur Verfügung stellt und insgesamt als austauschbare Verbrauchskomponente in einem Biosensorsystem verwendet werden kann. Ein entspre­ chender Transducer kann auch in fokussierenden Systemen ver­ wendet werden.

Die drei in den Ausführungsformen 1-3 beschriebenen Sy­ steme gestatten mit einem dynamischen Bereich von ca. 10° Minimumsverschiebung in den betrachteten SPR-Systemen einen ausreichenden dynamischen Bereich zu überdecken. Die er­ reichbare Sensitivität ist mindestens so groß, wie die von den im Stand der Technik beschriebenen Systemen. Die Nach­ weisempfindlichkeit kann, sofern sie von der schrotrauschbe­ grenzten Detektion des reflektierten Lichtes bestimmt wird, prinzipiell nur durch den Einsatz von Lichtquellen höherer Leistung verbessert werden. Insofern beschreibt die Erfin­ dung das System, mit prinzipiell der größtmöglichen Sensiti­ vität und gleichzeitig minimaler Auflösung zur Erreichung eines größtmöglichen dynamischen Bereiches bei der Detektion von Winkelverschiebungen resonanter Strukturen. Allgemeiner ausgedrückt, ist das beschriebene System dasjenige, das dazu in der Lage ist, Verschiebungen einer ausgedehnten Hell/Dunkel-Struktur im Ortsraum mit maximaler Dynamik und optimaler Auflösung zu ermitteln.

Ist der dynamische Bereich des beschriebenen Systems nicht ausreichend, kann das System um eine bestimmte Anzahl Gap/Photodioden Kombinationen und im Ausführungsbeispiel 3 mit einer angepaßten Einkopplungsoptik oder einem entspre­ chenden Transducer erweitert werden, um den letztlich inter­ essierenden dynamischen Bereich zu überdecken.

Ist das Meßsystem nicht schrotrauschbegrenzt, so läßt sich durch Nutzung der Differenzinformation i1-i2 in einer vier­ ten, erweiterten Ausführungsform des Sensors (Fig. 8 und 9), die im System gewonnene Information über die SPR-Verschie­ bung schrotrauschbegrenzt interpolieren, sofern die Rausch­ terme im System, die über das Schrotrauschen hinausgehen auf der Lichtquellenseite zu suchen sind. Lichtquelle ist hier insbesondere bei kohärenten Lichtquellen der gesamte Licht­ weg bis zum Detektor. Über das Schrotrauschen hinausgehende Rauschanteile sind sowohl im Licht des auf den ersten als auch den zweiten Detektor fallenden Teils der Strahlung vor­ handen. Die Bildung der Differenz beider Signale insbeson­ dere mit Hilfe einer analog-elektronischen Einheit, ist dazu in der Lage, ein rauschreduziertes - im Idealfall schrotrauschbegrenztes - Signal zur Verfügung zu stellen, das in dem oben beschriebenen Meßsystem zur schrotrauschbe­ grenzten Interpolation des Verlaufs des Verschiebungssignals dienen kann. Eine solche schrotrauschbegrenzte Interpolation ist dann möglich, wenn die gemessenen Daten derart weiter­ verarbeitet werden, daß eine mathematische Funktion mit nu­ merischen Methoden an die Verschiebungsfunktion angepaßt wird. Dies geschieht in biologischen SPR-Sensoren zur Er­ mittlung von kinetischer Information über den beobachteten Bindungsprozeß. Durch Verwendung der Differenzinformation kann die Genauigkeit der ermittelten kinetischen Konstanten verbessert werden. Der prinzipielle Aufbau eines entspre­ chenden Systems ist in Fig. 9 gezeigt. Die Ausführungsform 4 der beschriebenen Erfindung kann derart modifiziert werden, daß die Differenzbildung der beiden Photodetektorsignale mit einer Gewichtung erfolgt, wobei die Gewichte aus dem Betrag der beiden einzelnen Signale ermittelt werden. Die Rückkopp­ lung der Gewichte kann mit Hilfe einer elektronischen Schal­ tung erfolgen.

In einer fünften Ausführungsform wird das in den Ausfüh­ rungsformen 1 und 2 beschriebene System auf direkte einfache Art und Weise mit einem System höchster Auflösung zur Erhö­ hung der Sensitivität verbunden (Fig. 10). Kern dieser Kom­ bination ist die Integration eines weiteren Detektors im Gap zwischen den beiden Detektoren des oben beschriebenen Sy­ stems und Formung des einfallenden Lichtstrahls derart, das der mittlere Teil des einfallenden Lichtstrahls ein paralle­ les Lichtbündel mit einem Einfallswinkel entsprechend der Winkelhalbierenden zwischen den von den beiden äußeren De­ tektoren gemessenen Teilstrahlen bildet. Das Signal des mittleren Detektors läßt sich dann im Rahmen der obigen Ter­ minologie entsprechend Ausführungsbeispiel 3 als Faltung zwischen der SPR und einer δ-Funktion beschreiben. Es reprä­ sentiert dementsprechend die SPR selbst und ermöglicht damit die Bestimmung der Verschiebung der SPR mit größtmöglicher Sensitivität.

In einer sechsten Ausführungsform (Fig. 11) gestattet das System außerdem die Kombination mit einer wellenlängenaufge­ lösten Bestimmung der Oberflächenplasmonenresonanz. Hier kann das System entsprechend der fünften Ausführungsform mit der hochsensitiven, auf der Durchstimmung der Wellenlänge des einfallenden Lichtes beruhenden Meßtechnik, die in der eigenen Anmeldung DE 196 50 899.1 beschrieben wird, kombiniert werden. Die Durchstimmung der Wellenlänge führt zu einer geringfügigen Verbreiterung der Apparatefunktion der beiden äußeren Detektoren. Die Verbreiterung hängt von der Größe des Intervalls ab, über das die Wellenlänge des einfallenden Lichtstrahls variiert wird. Wird als Lichtquelle ein durchstimmbarer Diodenlaser mit einer Emissionswellenlänge von ca. 780 nm verwendet, ist die Breite des Durchstimmintervalles im Wellenlängenraum auf ca. 10 nm-15 nm beschränkt. Soll die Wellenlänge schnell verän­ dert werden - ca. 1 kHz-1 GHz Modulationsfrequenz mit Hilfe des Injektionsstromes des Diodenlasers - ist der Durchstimmbereich deutlich kleiner (ca. 100 pm). Die Modu­ lation der Wellenlänge wird entsprechend im wesentlich vom mittleren Detektor aufgelöst und eine entsprechende Signal­ verarbeitung gestattet die Nutzung des vollen dynamischen Bereiches und gleichzeitig eine signifikante Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit des Systems.

In allen beschriebenen Ausführungsformen können die Detekto­ ren planare Detektoren sein, wie sie üblicherweise als Pho­ todetektoren eingesetzt werden. In diesem Fall wird die Win­ kelachse auf eine ebene räumliche Achse abgebildet. Werden die Detektoren nicht planar sondern auf einem Kreisbogen an­ geordnet, dessen Krümmung der Winkelachse angepaßt ist, ent­ sprechen die Meßsignale in den entsprechenden Ausführungs­ formen exakt den gezeigten berechneten Signalen.

In allen beschriebenen Ausführungsformen kann eine Erweite­ rung auf mehrere Meßflecken erfolgen. Dies geschieht durch Anordnung der entsprechenden Detektoren entlang einer Achse senkrecht zur beschriebenen Verbindungsachse der verschiede­ nen Detektorgeometrien und Verwendung einer entsprechend an­ gepassten Strahlformungsoptik. Insbesondere ist die Verwen­ dung einer Zylinderlinse oder einer an die Ausführungsformen 4 und 5 angepaßten zylindrischen Optik zur Strahlformung möglich.

Insbesondere die Ausführungsformen 1-3 gestatten eine di­ rekte Übertragung der bisher beschriebenen "Detektion der Verschiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz mit optima­ ler Auflösung" von winkelauflösenden Messungen der SPR-Ver­ schiebung auf entsprechende wellenlängenauflösenden Messun­ gen, die zwei Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlänge verwenden (Fig. 12). Die Lichtquellen, bzw. die Wellenlängen des von ihnen emittierten Lichtes werden derart ausgewählt, daß die Wellenlängen analog der Winkel in den entsprechenden winkelauflösenden Ausführungsformen bestimmt werden (Fig. 13). Z.B. ist die Verwendung einer Laserdiode mit einer kommerziell erhältlichen Wellenlänge von ca. 760 nm-780 nm und einer Laserdiode mit einer Wellenlänge von ca. 830 nm möglich. Ebenso ist die Verwendung entsprechender Leucht­ dioden möglich. Ebenfalls können breitbandige Lichtquellen mit entsprechenden spektralen Filtern verwendet werden. Die Strahlung der beiden Lichtquellen, allgemeiner die beiden verschiedenen Farben können zur Detektion entweder direkt durch entsprechende Einstrahlung oder durch Verwendung dis­ persiver Elemente räumlich getrennt von zwei verschiedenen Detektoren gemessen werden, oder beide Farben können bei­ spielsweise durch Lichtzerhacker oder bei Verwendung von LED oder Laserdioden durch Modulation der Injektionsströme mit unterschiedlichen Trägerfrequenzen versehen werden. Beide Farben können dann mit einem Detektor gemessen und anschlie­ ßend beispielsweise mit einem Lock-In Verstärker getrennt werden. Die weitere Signalverarbeitung erfolgt analog der oben beschriebenen Verfahren.

Bei den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen werden jeweils aufgrund von zwei Signalen Wertepaare ermittelt, mit denen das Produkt aus n × d eindeutig bestimmbar ist.

Als typisches Beispiel einer Basis-Oberflächenplasmonenreso­ nanz in einem Biosensor-System wird eine Messung herangezo­ gen, bei der das Transducerprisma mit einem Freielektronen­ metall (Gold) beschichtet ist und als Probenlösung reines Wasser (Brechungsindex = 1,33) verwendet wird.

Claims (30)

1. Vorrichtung zur Detektion der Verschiebung einer Ober­ flächenplasmonenresonanz mit einer Lichtquelle, einem Oberflächenplasmonenresonanztransducer, einer Detektor­ anordnung und einer Auswerteeinrichtung, wobei die De­ tektoranordnung mindestens ein Detektorabschnittpaar mit einem ersten Detektorabschnitt und einem zweiten De­ tektorabschnitt aufweist, wobei der erste Detektorab­ schnitt in einem Abstand von dem zweiten Detektorab­ schnitt angeordnet ist, jeder Detektorabschnitt ein De­ tektorsignal ausgibt, wobei die Lage der Detekto­ ranordnung bezogen auf das von dem Oberflächenplasmo­ nenresonanztransducer reflektierte Licht so gewählt wird, daß die Auswerteeinrichtung aus der Kombination der Detektorsignale von beiden Detektorabschnitten die Position und die Verschiebung einer Oberflächenplasmo­ nenresonanz bestimmen kann.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei jeder Detektorab­ schnitt das von dem Transducer reflektierte Licht in ei­ nem bestimmten Winkelbereich empfängt und das Detek­ torsignal jedes Detektorabschnitts jeweils der Intensi­ tät als Integral über die Strahldichte für den zu­ gehörigen Winkelbereich entspricht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Breite ei­ nes Detektorabschnitts so gewählt wird, daß der Detek­ torabschnitt reflektiertes Licht aus einem Winkelbereich empfängt, dessen Größe in Bezug auf die Winkeldifferenz Wd zwischen dem Resonanzwinkel beim Minimum und dem grö­ ßeren Winkel beim Mittelwert einer Basis-Oberflächen­ plasmonenresonanz, im Bereich von 0,25 Wd bis 2 Wd, vor­ zugsweise 0,25 Wd bis 1 Wd und besonders bevorzugt 0,25 Wd bis 0,5 Wd liegt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, wobei der von einem Detektorabschnitt erfaßte Winkelbereich 1 bis 8°, vor­ zugsweise 1 bis 4° und besonders bevorzugt 1 bis 2° be­ trägt.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Detektorab­ schnitt einem Winkelbereich entspricht, dessen Größe im Verhältnis zur Größe des von einem Detektorabschnitt er­ faßten Winkelbereichs im Bereich von 1 : 250 bis 10 : 1, vorzugsweise 1 : 10 bis 2 : 1, besonders bevorzugt 1 : 2 bis 1 : 1 liegt.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Lage und die Breite jedes Detektorabschnitts und des Ab­ stands so gewählt wird, daß in einem für eine Messung bestimmten Winkelbereich das Detektorsignal des ersten und/oder des zweiten Detektorabschnitts eine normierte Sensitivität hat, die dem Betrag nach größer ist als eine normierte Mindestsensitivität, wobei die normierte Sensitivität das Verhältnis der Änderung des normierten Detektorsignals eines Detektorabschnitts zu einer Ver­ schiebung der Plasmonenresonanz (in Grad) ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die normierte Min­ destsensitivität mindestens 0,05 pro Grad, vorzugsweise mindestens 0,1 pro Grad beträgt.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit einem dritten Detektorabschnitt, der mit dem zweiten Detektor­ abschnitt ein zweites Detektorabschnittpaar bildet.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei je­ der Detektorabschnitt einen Photosensor, vorzugsweise eine Photodiode aufweist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei zwi­ schen der Lichtquelle und dem Oberflächenplasmonenreso­ nanztransducer eine optische Einrichtung angeordnet ist, die das Licht - vorzugsweise in der Einfallsebene - auf die Oberfläche des Transducers fokussiert, wobei vor­ zugsweise ein Winkelbereich überdeckt wird, der ent­ sprechend der Appertur der fokussierenden optischen Ein­ richtung und der Fokallänge wählbar ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die optische Einrichtung ein Linsensystem aufweist, das den auf den Transducer einfallenden Lichtstrahl derart formt, daß ein mittlerer Teil des einfallenden Lichtstrahls - vorzugsweise in der Einfallsebene - ein paralleles Lichtbündel bildet, wobei die Detektoranordnung einen weiteren Detektorabschnitt aufweist, der zwischen den Detektorabschnitten eines Detektorabschnittpaars angeordnet ist, wobei der weitere Detektorabschnitt das parallele Lichtbündel empfängt und die beiden äußeren Detektorabschnitte die Teilstrahlen empfangen.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der Einfallswinkel des mittleren Teils des einfallenden Lichtstrahls der Winkelhalbierenden zwischen den von den beiden äußeren Detektorabschnitten gemessenen Teilstrahlen entspricht.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Licht­ quelle wellenlängenmoduliert wird und das Detektorsignal des weiteren Detektorabschnitts einem Demodulator zuge­ führt wird, dessen Ausgangssignal an die Auswerteeinheit geliefert wird.

14. Vorrichtung zur Detektion der Verschiebung einer Ober­ flächenplasmonenresonanz mit einer Lichtquelle, mit ei­ ner optischen Einrichtung, einem Oberflächenplasmonen­ resonanztransducer, einer Detektoranordnung und einer Auswerteeinrichtung, wobei mindestens ein Lichtstrahl­ paar auf die Transduceroberfläche gerichtet wird, das einen ersten und einen zweiten in sich parallelen Licht­ strahl aufweist, und daß der erste und der zweite Licht­ strahl miteinander einen Winkel einschließen, und die reflektierten Lichtstrahlen von der Detektoranordnung empfangen werden, wobei die Lage des Lichtstrahlenpaars bezogen auf das von dem Oberflächenplasmonenresonanz­ transducer reflektierte Licht so gewählt wird, daß die Auswerteeinrichtung aus der Kombination der Detektorsi­ gnale entsprechend den beiden Lichtstrahlen die Position und die Verschiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz bestimmen kann.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei die Detektoranord­ nung einen ersten Detektorabschnitt aufweist, der das reflektierte Licht des ersten Lichtstrahls empfängt und einen zweiten Detektorabschnitt aufweist, der das re­ flektierte Licht von dem zweiten Lichtstrahl empfängt.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei beide Lichtstrahlen eine jeweils modulierte Intensität aufweisen, und das Detektorsignal der Detektoranordnung einem Demodulator zugeführt wird, dessen Ausgangssignale den beiden re­ flektierten Lichtstrahlen entsprechen.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Detektorsignal bezogen auf den ersten bzw. zweiten Lichtstrahl der Intensität des reflektierten Lichts für den zugehörigen Winkel entspricht.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei der Winkel in dem der erste Lichtstrahl auf die Trans­ duceroberfläche gerichtet ist bezogen auf die Basis- Oberflächenplasmonenresonanz um einen Abstand größer ist als der Resonanzwinkel beim Minimum und dieser Abstand im Bereich von 0,25 Wd bis 2 Wd, vorzugsweise 0,5 Wd bis 1,5 Wd, besonders bevorzugt 1 Wd, liegt, und wobei der Winkelunterschied zum zweiten Teilstrahl im Bereich von 0,25 Wd bis 2 Wd, vorzugsweise 0,25 Wd bis 1 Wd, beson­ ders bevorzugt bei 0,25 bis 0,5 Wd, liegt, wobei Wd die Winkeldifferenz zwischen dem Resonanzwinkel und dem größeren Winkel für den Mittelwert bezogen auf eine Ba­ sis-Oberflächenplasmonenresonanz ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei ein dritter Lichtstrahl auf die Transduceroberfläche ge­ richtet wird, und der dritte Lichtstrahl zusammen mit dem zweiten Lichtstrahl ein zweites Lichtstrahlpaar bil­ det.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei der Oberflächenplasmonenresonanztransducer ein Prisma aufweist, an dessen Grundfläche eine oberflächenplasmo­ nenresonanzerzeugende Schichtstruktur angeordnet ist und wobei das Prisma in Bezug auf eine zur Schichtstruktur senkrechte Ebene eine Form aufweist, die an jeder Seite zwei oder drei im unterschiedlichen Winkel hierzu ver­ laufende Flächen aufweist.

21. Vorrichtung zur Detektion der Verschiebung einer Ober­ flächenplasmonenresonanz mit einem Lichtquellenpaar, ei­ nem Oberflächenplasmonenresonanztransducer, einer De­ tektoranordnung und einer Auswerteeinrichtung, wobei eine erste Lichtquelle einen Lichtstrahl mit einer er­ sten Wellenlänge und eine zweite Lichtquelle einen Lichtstrahl mit einer zweiten Wellenlänge auf den Ober­ flächenplasmonenresonanztransducer ausgibt, wobei der Unterschied zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge bezogen auf das von dem Oberflächen­ plasmonenresonanztransducer reflektierte Licht so ge­ wählt wird, daß die Detektoranordnung jeweils Detektor­ signale entsprechend der ersten bzw. zweiten Wellenlänge ausgibt, und daß die Auswerteeinrichtung aus der Kombi­ nation der Detektorsignale die Position und die Ver­ schiebung einer Oberflächenplasmonenresonanz bestimmen kann.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Detektorsignal jeweils der Intensität des reflektierten Lichts für die zugehörige Wellenlänge entspricht.

23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Detek­ toranordnung einen ersten Detektorabschnitt aufweist, der das reflektierte Licht des ersten Lichtstrahls emp­ fängt und einen zweiten Detektorabschnitt aufweist, der das reflektierte Licht von dem zweiten Lichtstrahl empfängt.

24. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Wellenlänge und/oder die Intensitäten des Lichts jeweils moduliert werden, und die Detektoranordnung einen oder zwei Detektorabschnitt(e) aufweist, dessen (deren) Detektorsignal(e) jeweils einem Demodulator zugeführt wird (werden), dessen Ausgangssignal(e) der Auswerteeinrichtung zugeführt wird (werden).

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die erste Wellenlänge bezogen auf die Basis-Oberflächen­ plasmonenresonanz um einen Abstand von der Resonanzwel­ lenlänge beim Minimum größer ist und dieser Abstand im Bereich von 0,25 Ad bis 2 Ad, vorzugsweise 0,5 Ad bis 1,5 Ad, besonders bevorzugt 1 Ad, liegt, und wobei der Wellenlängenunterschied zur zweiten Wellenlänge im Be­ reich von 0,25 Ad bis 2 Ad, vorzugsweise 0,25 Ad bis 1 Ad, besonders bevorzugt bei 0,25 bis 0,5 Ad, liegt, wo­ bei Ad die Wellenlängendifferenz zwischen der Resonanz­ wellenlänge und der größeren Wellenlänge für den Mittel­ wert bezogen auf eine Basis-Oberflächenplasmonenresonanz ist.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei eine dritte Lichtquelle Licht mit einer dritten Wellen­ länge auf die Transduceroberfläche ausgibt, und die dritte Lichtquelle zusammen mit dem zweiten Lichtstrahl ein zweites Lichtquellenpaar bildet.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Auswerteeinrichtung jeweils einen Verstärker aufweist, der ein zugehöriges Detektorsignal empfängt, und jeweils einen Multiplizierer aufweist, der ein Detektorsignal mit einem zugehörigen Gewichtungsfaktor, der von dem verstärkten Ausgangssignal abgeleitet werden kann, multipliziert und einen Differenzbildner aufweist, der die Differenz der gewichteten Detektorsignale bildet.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei die Intensität der ersten Lichtquelle mit einer ersten Fre­ quenz moduliert wird und/oder die Intensität der zweiten Lichtquelle mit einer zweiten Frequenz moduliert wird und wobei die Auswerteeinrichtung einen Lock-In-Ver­ stärker aufweist, der frequenzselektiv aus dem kombi­ nierten Signal ein erstes und ein zweites Signal er­ zeugt.

29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei die Lichtquellen zwei oder drei Laserdioden aufweisen, die Licht bei verschiedenen Wellenlängen ausgeben und vorzugsweise ein Strahlkombinierer die Lichtstrahlen der Laserdioden kombiniert und auf den Oberflächenplasmonen­ resonanztransducer leitet.

30. Verfahren zur Detektion der Verschiebung einer Oberflä­ chenplasmonenresonanz unter Verwendung insbesondere ei­ ner Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 29.