CN103278548B

CN103278548B - 一种固态纳米孔dna测序的电信号校准方法

Info

Publication number: CN103278548B
Application number: CN201310158082.8A
Authority: CN
Inventors: 张�浩; 曹忠升; 瞿安连; 蔡子龙
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2033-05-02
Also published as: CN103278548A

Abstract

本发明公开了一种固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法，包括S1设置程控放大电路中各个放大器的增益初始基值；S2通过各个通道的模数转换器并行采集，获得与各个增益初始基值对应的碱基采集电压数据；S3依次判断各个通道的碱基采集电压数据是否小于满量程数据，若是，则进入S5；若否，则进入S4；S4丢弃满量程通道的碱基采集电压数据；S5选择分辨率最大的碱基采集电压数据并根据分辨率最大的碱基采集电压数据计算最佳增益值；S6判断当前通道增益初始基值是否等于最佳增益值，若是，则结束；若否，则进入S7；S7将当前通道增益初始基值修正为最佳增益值。本发明在核酸测序过程中针对不同的碱基特征电流，通过设置不同的增益以提高识别的分辨率。

Description

一种固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法

技术领域

本发明属于遗传学和分子生物学领域，更具体地，涉及一种固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法。

背景技术

纳米孔DNA测序技术是一种新兴的快速无损检测技术。由于其电子检测方式和方便的样品制备等特点，纳米孔DNA测序在廉价测序领域极具潜力，是目前为止最有望实现全基因“1000美元”DNA测序计划的技术。

纳米孔核酸测序大多采用电泳的方法，碱基在外加恒定电场的驱动下穿过纳米级的小孔时会引发电流的变化。由于不同碱基存在尺寸和分子结构的差异，会产生不同幅度和脉宽的特征电流，而不同碱基特征电流出现的先后顺序反映了碱基的顺序信息，因此通过检测特征电流就能达到测定DNA核酸碱基的目的。

在利用传统膜片钳系统检测碱基在外加恒定电场的驱动下穿过纳米级小孔引发的电流变化时，均采用相同的增益检测四种碱基的特征电流。对于固态纳米孔而言，各种碱基的电流变化幅度可能相差100倍以上。若采用相同的放大倍数，则对于特征电流小的碱基而言，可能存在检测波形分辨率严重不足的问题；而对于特征电流大的碱基，则可能存在超出模数变换器量程的问题。因此，为了解决这个问题以提高碱基识别的准确率和分辨率，在纳米孔核酸测序应用中，应该采用不同的增益放大四种碱基的特征电流，这就需要针对不同材料的固态纳米孔的碱基特征电流数量级，进行增益校准。

发明内容

针对现有纳米孔测序校准的缺陷，本发明提供了一种对不同碱基的检测增益进行校准的方法，其目的在于在核酸测序过程中，针对不同的碱基特征电流，通过设置不同的增益以提高识别的分辨率。

本发明提供的固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法包括下述步骤：

S1：设置程控放大电路中各个放大器的增益初始基值；

S2：通过各个通道的模数转换器并行采集，获得与各个增益初始基值对应的碱基采集电压数据；

S3：依次判断各个通道的碱基采集电压数据是否小于满量程数据，若是，则进入步骤S5；若否，则进入步骤S4；

S4：丢弃满量程通道的碱基采集电压数据；

S5：选择分辨率最大的碱基采集电压数据并根据分辨率最大的碱基采集电压数据计算最佳增益值；

S6：判断当前通道增益初始基值是否等于所述最佳增益值，若是，则结束；若否，则进入步骤S7；

S7：将当前通道增益初始基值修正为最佳增益值。

更进一步地，所述分辨率最大是指在小于满量程的数据中，与满量程数据最接近的采集电压数据；所述满量程数据是指模数转换器实际量程的75%～85%；所述最佳增益值是指针对未满量程的通道数据，按照波动的最大值将其微调至满量程值所需的增益。

更进一步地，还包括下述步骤：对各个通道的碱基采集电压数据分别进行时间序列的统计处理，并提取各个通道的碱基统计特征数据；所述碱基统计特征数据包括脉冲幅值均值、波动范围、基线值、脉冲个数。

更进一步地，根据碱基统计特征数据和增益初始基值获得修正系数，所述最佳增益值等于增益初始基值乘以修正系数。

更进一步地，还包括下述步骤：将碱基采集电压数据转换为特征电压信号，并根据所述特征电压信号计算阈值比较电路各个比较器的参考电压。

更进一步地，还包括下述步骤：根据阈值比较电路的输出识别碱基种类。

本发明在核酸测序过程中针对不同的碱基特征电流，通过设置不同的增益以提高识别的分辨率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统的原理框图；

图2是本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统中碱基特征信号数据采集电路的一种结构示意图；

图3是本发明实施例提供的固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法实现流程图；

图4是本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统中碱基特征信号数据采集电路的另一种结构示意图；

图5是本发明实施例提供的基于固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法可以实现碱基种类识别的流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明中需要用到的技术术语的定义如下：

（1）满量程数据：考虑碱基信号的波动，满量程数据定义为模数转换器实际量程的75%～85%。该值可根据实际情况调整；

（2）最佳增益值：根据增益基值下采集的碱基采集电压数据，提取其时间序列的统计特征数据后，对于未满量程的通道数据，考虑其信号波动后，按照波动的最大值，将其微调至满量程值所需的增益；

（3）碱基特征电流：碱基穿越纳米孔引发的电流；

（4）碱基特征电压：碱基特征电流经电流电压变换电路和调理电路后输出的信号；

（5）碱基程控电压：碱基特征电压信号经程控放大电路后的输出信号；

（6）碱基采集电压数据：碱基程控电压经模数转换器采集的数据。

图1示出了本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统的原理；用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统1包括：依次连接的电流电压变换电路11、调理电路12和碱基特征信号数据采集电路14；电流电压变换电路11的输入端用于连接电泳池的正电极，碱基特征信号数据采集电路14的输出端用于连接计算机；电泳池中被核酸外切酶切下的带负电荷的碱基在外加恒定电场的驱动下通过固态纳米孔产生特征电流，电流电压变换电路11用于将特征电流信号转换为电压信号并同时提供驱动电压，调理电路12用于将电压信号进行放大和滤波处理后输出，碱基特征信号数据采集电路14用于长时连续采集调理电路12输出的特征电压信号，并将采集数据输出到计算机上用于显示和分析。

如图2所示，碱基特征信号数据采集电路14包括：依次连接的程控放大电路141、同步多通道数据转换电路142、数据比较选择单元144、数据缓冲单元145和USB接口电路146，以及连接在数据缓冲单元145的反馈输出端与程控放大电路141的反馈控制端之间的校准增益控制单元140；程控放大电路141用于对四种不同碱基的特征电压信号进行不同倍数的放大；同步多通道数据转换电路142用于将放大后的四路特征电压信号（即碱基程控电压）同步转换成数字信号；数据比较选择单元144将四路数字信号进行比较分析，选择出最大分辨率且不超量程的转换数据；数据缓冲单元145用于缓冲数据比较选择单元144输入的数据和USB接口电路输入的反方向数据；USB接口电路146通过USB总线实现数据缓冲单元145与计算机的数据交换。

程控放大电路141包括四路并行的放大器，四个放大器的放大倍数分别为k1、k2、k3、k4，分别针对四种不同碱基（DNA为A、T、G、C，RNA为A、U、G、C）的特征信号同时进行不同倍数的放大；程控放大功能采用数字可调的电位器和低噪声运算放大器实现，根据不同材料纳米孔的校准结果，可以通过校准增益控制单元140对放大倍数k1、k2、k3、k4进行调节。

同步数据转换电路142包括四个分别连接在上述四个放大器的输出端的模数转换器，用于将程控放大后的电压信号同步转换成数字信号。通过同步数据转换电路142可以保证在不降低采样率的情况下分别获得最大或最小信号的电压值，并且都能保证采集的信号有足够的分辨率且更小的相对误差。

数据比较选择单元144的输入端连接至上述四个模数转换器的输出端，用于通过阈值比较判断的方法选择出分辨率最高且不超量程的转换数据，对于16位模数转换器就是选择数值最大，且不超过量程最大数值的数据。

数据缓冲单元145的输入端连接至数据比较选择单元144的输出端，用于缓存数据。数据缓冲单元145能将数据缓存起来，避免数据丢失；该单元既可用于测序时缓存测序实验数据，又可缓存校准时的校准实验数据和校准控制数据。

USB接口电路146用于实现数据缓冲单元145与计算机之间双向数据通信，USB接口电路用于读写USB总线上的数据，实现数据缓冲单元与计算机的数据交换。

校准增益控制单元140用于接收数据缓冲单元145中的校准控制数据并控制程控放大电路141中四个放大器的放大倍数；校准增益控制单元通过发送数字信号给数字可调的电位器实现模拟放大器放大倍数的调节。由于不同材料固态纳米孔四种碱基的电流幅度大小不同，在采集信号之前，需要根据固态纳米孔的电流特征进行校准：

结合图2和图3详述一种固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法具体包括：

S1：设置程控放大电路中各个放大器的增益初始基值；

S4：丢弃满量程通道的碱基采集电压数据；

S7：将当前通道增益初始基值修正为最佳增益值，然后结束。

其中，分辨率最大是指在小于满量程数据中，与满量程数据最接近的采集电压数据；所述满量程数据是指模数转换器实际量程的75%～85%；所述最佳增益值是指针对未满量程的通道数据，按照波动的最大值将其微调至满量程值所需的增益。

在本发明实施例中，该固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法还包括下述步骤：对各个通道的碱基采集电压数据分别进行时间序列的统计处理，并提取各个通道的碱基统计特征数据；所述碱基统计特征数据包括脉冲幅值均值、波动范围、基线值、脉冲个数。

根据碱基统计特征数据和增益初始基值获得修正系数，所述最佳增益值等于增益初始基值乘以修正系数。

在本发明实施例中，校准是针对不同纯碱基来获取最佳的程控增益以提高分辨率。为了更进一步的说明上述固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法，下以校准“A碱基”为例具体说明程控增益校准的方法，其他碱基的校准过程与此相同，只存在参数的差异。

校准时，需先将四路程控放大器的增益分别设为增益基值，即k_A0、k_T0、k_C0、k_G0，其中k_A0、k_T0、k_C0、k_G0为根据经验估计的增益初始值，可根据四种碱基特征电流幅度的差别程度进行设置。在电泳池中放入数量一定的单一碱基（如100个A碱基），碱基在外加电场作用下逐个通过纳米孔；产生的碱基特征电流信号经电流电压变换电路11和调理电路12转换为碱基特征电压信号，碱基特征信号数据采集电路14先将碱基特征电压信号程控放大为碱基程控电压信号，再进行采集，然后将碱基采集电压数据传递给计算机。将校准时获得的数据称为校准实验数据，以区别测序实验获得的实验数据。

根据校准实验数据计算“A碱基”对应的增益设置数值，再将增益设置数值通过USB总线发送给USB接口电路146，经数据缓冲单元145缓冲后，将增益设置数值传递给校准增益控制单元140；最后由校准增益控制单元140发送数据给程控放大电路141以设置“A碱基”的增益。

具体校准步骤如下：

（1）将程控放大电路141中各放大器的增益分别设置为增益基值k_A0、k_T0、k_C0、k_G0；

其具体过程如下：计算机先将各增益基值转换成增益设置值（即增益校准控制数据），再将增益设置数值通过USB总线发送给USB接口电路146，经数据缓冲单元145缓冲后，然后将增益设置数值传递给校准增益控制单元140；最后由校准增益控制单元140发送增益校准控制数据给程控放大电路141以设置四个程控放大器的增益基值；

（2）四路模数转换器同时采集，得到A碱基对应不同增益基值的碱基采集电压数据；

（3）对四个通道的碱基采集电压数据分别进行时间序列的统计分析，并提取各个通道的碱基统计特征数据，如脉冲幅值均值、波动范围、基线值、脉冲个数等；

（4）将各通道的碱基采集电压数据依次与满量程数据进行比较，若达满量程，则进入步骤（5）；若小于满量程，则直接进入步骤（6）；

（5）选择出现满量程的AD通道并丢弃满量程通道的数据，然后转入步骤（6）；

（6）选择分辨率最大的碱基采集电压数据；分辨率最大是指在小于满量程的数据中，与满量程数据最接近的采集电压数据。

（7）根据分辨率最大的碱基采集电压数据计算最佳增益值，并将当前通道增益基值与最佳增益值进行比较，若小于，则进入步骤（8）；若相等，则进入步骤（9）；

（8）根据碱基采集电压数据的统计特征数据计算最佳增益值，然后转入步骤（9）；

（9）计算与最佳增益值相对应的增益校准控制数据；

（10）根据校准控制数据，设置程控放大电路141中标记为“A碱基”通道的程控增益值，其中校准控制数据的发送过程与步骤（1）相同；

“A碱基”的增益校准过程结束。

不同种类碱基穿越固态纳米孔时引发的特征电流幅值相差可达百倍以上甚至更高，若采用相同放大倍数对幅度差别悬殊的特征电流进行放大，有可能导致幅度最小的特征电流由于放大倍数不足而难以与噪声信号相区别，导致无法提取信号或分辨率过低；而幅度最大的特征电流则可能由于放大倍数过高而超出模数转换器的量程，同样也影响对碱基特征电流细节的识别。由于本发明针对不同幅度的特征电流采用不同的放大倍数，可以同时解决上述问题，而且还可以减小软件处理数据的负担，达到提高速度和精度，进而达到提高碱基识别准确率的目的。

为了更清楚地说明本发明的思想，通过以下数据对本发明中增益校准方法进行详细说明，实际实验中可能因为纳米孔的材料不同而导致数据不同，但处理方法相同。假定利用纯碱基校准实验后得到的四种碱基对应的电流幅度范围的统计结果如表一所示，膜片钳放大器调理电路12的放大倍数为10倍，16位模数转换器的量程为-10V～+10V，对应的电流量程为20nA。采用表一数据的最大值，根据下述满量程定义，取80%作为满量程标准，即16nA特征电流或-8V～+8V碱基程控电压进行计算，其最佳增益值的计算结果为：

碱基类型	电流大小±误差(pA)	最佳增益值
			dAMP	172.08±25.49	8.10
dTMP	356.81±42.90	4.00
			dCMP	1437.47±66.49	1.06
dGMP	13.73±0.92	109.22

表一

在本发明实施例中，碱基特征信号数据采集电路14的另一种结构如图4所示，碱基特征信号数据采集电路14包括：依次连接的程控放大电路141、同步多通道数据转换电路142、通道选择控制单元143、数据缓冲单元145和USB接口电路146，连接在数据缓冲单元145的反馈输出端与程控放大电路141的反馈控制端之间的校准增益控制和阈值设置单元148，以及连接在程控放大电路141的输入端与通道选择控制单元143的控制端之间的阈值比较电路147；校准增益控制和阈值设置单元148的输出端还与阈值比较电路147的控制端连接；程控放大电路141用于对四种不同碱基的特征电压信号进行不同倍数的放大；同步多通道数据转换电路142用于将放大后的特征电压信号同步转换成数字信号；阈值比较电路147用于将特征电压信号与参考电压进行比较并根据比较结果输出控制信号；通道选择控制单元143用于根据控制信号进行通道选择；数据缓冲单元145用于缓冲数据；USB接口电路146用于实现数据缓冲单元与计算机的数据交换。校准增益控制和阈值设置单元148是在校准增益控制单元140的基础上增加了阈值设置功能，用于设置阈值比较电路147的四个比较器参考电压V_REF1、V_REF2、V_REF3、V_REF4；阈值比较电路147用于根据比较器的输出结果输出控制信号给通道选择控制单元143。

程控放大电路141、同步多通道数据转换电路142、数据缓冲单元145和USB接口电路146的结构功能与上述结构相同，为了节省篇幅，在此不在赘述。

通道选择控制单元143接收阈值比较电路147的输出控制信号，控制信号选择当前碱基对应的通道数据，而忽略其他通道的数据。

阈值比较电路147包括四个比较器，每个比较器都有两个输入端，其中的一个输入端作为阈值比较电路147的输入端，均连接至程控放大电路141的输入端，每个比较器的另一个输入端均分别连接四个参考电压V_REF1、V_REF2、V_REF3、V_REF4；四个比较器的输出端均连接至通道选择控制单元143的控制端；阈值比较电路147用于根据比较器的输出结果输出控制信号；四个参考电压V_REF1、V_REF2、V_REF3、V_REF4可以通过下述的校准过程获取。

校准增益控制和阈值设置单元148是在校准增益控制单元140的基础上增加了阈值设置功能。

结合图4和图5详述固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法具体包括：

S1：设置程控放大电路中各个放大器的增益初始基值；

S4：丢弃满量程通道的碱基采集电压数据；

S7：将当前通道增益初始基值修正为最佳增益值；

S8：将碱基采集电压数据转换为特征电压信号，并根据所述特征电压信号计算参考电压；

S9：根据阈值比较电路的输出识别碱基种类。

在本发明实施例中，校准是针对不同纯碱基设置不同的程控增益和比较器阈值（即参考电压）。在电泳池中放入数量一定的单一碱基（如100个A碱基），碱基在外加电场作用下逐个通过纳米孔；产生的碱基特征电流信号经电流电压变换电路11和调理电路12转换为碱基特征电压信号，碱基特征信号数据采集电路14先将碱基特征电压信号程控放大为碱基程控电压信号，再进行采集，然后将碱基采集电压数据传递给计算机。将校准时获得的数据称为校准实验数据，以区别测序实验获得的实验数据。

校准包括两个步骤：即程控放大电路141的增益设置和阈值比较电路147的参考电压设置。其中程控放大电路141的增益设置方法与图3所示实施例中的方法原理相同。

校准方法的具体步骤如下：

（1）断开阈值比较电路147；

（2）按照图3实施例中提供的方法设置当前碱基的最佳增益值；但增益校准数据的发送方式略有不同：计算机先将增益（可以是增益基值也可以是最佳增益）转换成增益设置值（即增益校准控制数据），再将增益校准控制数据通过USB总线发送给USB接口电路146，经数据缓冲单元145缓冲后，然后将增益校准控制数据传递给校准增益控制和阈值设置单元148；最后由校准增益控制和阈值设置单元148发送增益校准控制数据给程控放大电路141以设置“A碱基”的增益。

（3）将碱基采集电压数据按照最佳增益折算为碱基特征电压并提取其时间序列的各统计特征参数；

（4）以碱基特征电压数据的均值为基准，并以考虑波动后的下限值为依据，计算与当前碱基相对应的阈值比较电路147的参考电压值；

（5）根据参考电压值计算参考电压设置值，即阈值校准控制数据；

（6）接通阈值比较电路；

（7）根据参考电压设置值设置阈值比较电路147的参考电压；其具体过程如下：计算机将阈值校准控制数据通过USB总线发送给USB接口电路146，经数据缓冲单元145缓冲后，然后将阈值校准控制数据传递给校准增益控制和阈值设置单元148；最后由校准增益控制和阈值设置单元148发送阈值校准控制数据给阈值比较电路147以设置“A碱基”的参考电压。

在设置了最佳增益和参考电压后，校准结束。

实验时，通过同时记录阈值比较电路147的输出即可以达到区别碱基种类的目的。

本方法不仅具有图3所示的实施例1的优点，而且由于采用硬件辅助判别碱基种类的方法，软件数据处理的花销更小，故具有更高的速度。

为了更清楚地说明本发明的思想，通过以下数据对本发明中增益校准方法进行详细说明，实际实验中可能因为纳米孔的材料不同而导致数据不同，但处理方法相同。假定利用纯碱基进行校准实验后得到的四种碱基对应的电流幅度范围的统计结果如表二所示，膜片钳放大器调理电路12的放大倍数为10倍，16位模数转换器的量程为-10V～+10V，对应的电流量程为20nA。根据下述满量程定义，取80%作为满量程标准，即16nA特征电流或-8V～+8V采集电压数据进行计算：采用表二数据的最大值，其最佳增益的计算结果如表一所示；采用表二数据的最小值，其阈值比较电路147的参考电压（绝对值）为：

碱基类型	电流大小±误差(pA)	参考电压值(V)
			dAMP	172.08±25.49	0.916188

dTMP	356.81±42.90	1.961938
			dCMP	1437.47±66.49	8.568625
dGMP	13.73±0.92	0.080063

表二

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种固态纳米孔DNA测序的电信号校准方法，其特征在于，包括下述步骤：

S1：设置程控放大电路中各个放大器的增益初始基值；

S4：丢弃满量程通道的碱基采集电压数据；

S7：将当前通道增益初始基值修正为最佳增益值；

所述分辨率最大是指在小于满量程的数据中，与满量程数据最接近的采集电压数据；所述满量程数据是指模数转换器实际量程的75％～85％；所述最佳增益值是指针对未满量程的通道数据，按照波动的最大值将其微调至满量程值所需的增益。

2.如权利要求1所述的校准方法，其特征在于，还包括下述步骤：

对各个通道的碱基采集电压数据分别进行时间序列的统计处理，并提取各个通道的碱基统计特征数据；所述碱基统计特征数据包括脉冲幅值均值、波动范围、基线值、脉冲个数。

3.如权利要求2所述的校准方法，其特征在于，根据碱基统计特征数据和增益初始基值获得修正系数，所述最佳增益值等于增益初始基值乘以修正系数。

4.如权利要求1所述的校准方法，其特征在于，还包括下述步骤：

将碱基采集电压数据转换为特征电压信号，并根据所述特征电压信号计算阈值比较电路各个比较器的参考电压。

5.如权利要求4所述的校准方法，其特征在于，还包括下述步骤：

根据阈值比较电路的输出识别碱基种类。