KR101559096B1 - 나노포어 폴리뉴클레오티드 서열분석용 보상 패치-클램프 증폭기 및 기타 용도 - Google Patents

나노포어 폴리뉴클레오티드 서열분석용 보상 패치-클램프 증폭기 및 기타 용도 Download PDF

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Abstract

패치-클램프 시스템은, 폴리뉴클레오타이드 서열분석 및 다른 응용을 위한 보상 패치-클램프 시스템으로서, 타이밍 신호를 발생시키는 회로; 비-반전 입력부, 기생 커패시턴스를 갖고 전극 저항에 연결된 반전 입력부, 및 출력부를 구비한 차동 증폭기 회로; 상기 출력부와 상기 반전 입력부 사이에 연결된 피드백 저항기; 타이밍 신호를 수신하며, 상기 타이밍 신호에 응답하여 상기 출력부를 상기 반전 입력부에 선택적으로 연결시키는 재설정 스위치; 타이밍 신호 및 커맨드 전압을 수신하여, 상기 타이밍 신호에 응답하여 상기 비-반전 입력부에 스텝 커맨드 전압(stepped command voltage)을 인가하는 커맨드 전압 회로; 및 입력 커패시턴스 및 직렬 저항을 구비하고, 상기 반전 입력부에 작동가능하게 연결되는 센서를 포함한다.

Description

나노포어 폴리뉴클레오티드 서열분석용 보상 패치-클램프 증폭기 및 기타 용도 {COMPENSATED PATCH-CLAMP AMPLIFIER FOR NANOPORE POLYNUCLEOTIDE SEQUENCING AND OTHER APPLICATIONS}
본 발명은 국립과학재단으로부터 NSF 커리어 연구 번호 ECCS-0845766 하에 자금을 일부 지원받아 이루어졌다. 미국 연방정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 가진다.
본 출원은, 법적으로 허용가능한 범위내에서, 2011년 7월 20일자 미국 가출원번호 61/572,829의 "고상 나노포어 상에서 DNA 서열분석용 스위치형 전압 패치-클램프 증폭기"에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원과 본원에 인용된 모든 간행물들은 법적으로 허용가능한 최대의 범위로 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명은 DNA 서열분석에 사용하기 적합하며, 폴리뉴클레오티드에서 개개의 뉴클레오타이드를 검출 및 정량화하는데 적합한, 전기 디바이스 및 시스템에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 DNA 서열분석 시스템 및 방법과 유사 용도에 있어서의 보상 패치-클램프 증폭기 및 이의 사용에 관한 것이다.
DNA는 1896년에 스위스 과학자인 프리드리히 미셔에 의해 세포에서 최초로 분리되었다. 1944년에, 데옥시리보뉴클레산이 살아있는 세포에서 소형 유전자 백과사전을 구성하는 화합물인 것으로 확인되었다. 1953년에, 미국 과학자인 제임스 왓슨과 영국 연구자인 프란시스 크릭은 영국 캠브리지 대학에서 DNA의 현재 유명한 "이중 나선" 분자 구조를 밝혀냈으며, 이들은 이것으로 1962년 노벨상을 받았다.
나노포어 서열분석에서, 서열분석 대상인 DNA 가닥은 전압이 센서 전체에 적용되는 동안에 소형 포어를 구비한 이온 유체로 가득찬 센서를 통과하여 이동한다. DNA 가닥의 구조에 따라 센서 전류가 발생된다. 이 센서 전류를 분석함으로써, DNA 가닥을 서열분석할 수 있다. 나노포어 서열분석의 이론적인 프래임워크는 충분히 이해되고 있지만, 종래의 나노포어 서열분석 시스템과 디바이스는 충분히 개발되지 않았다. 나노포어 서열분석 전류가 매우 작고, 임의의 실질적인 나노포어 서열분석 시스템에는 매우 많은 수의 게인(gain)이 필요하다. 매우 많은 수의 게인은 광범위한 저항 및 커패시턴스 뿐만 아니라 내부 및 외부 노이즈에 의해 유발되는 판독 불안정성(reading instability)을 창출하는 경향이 있다.
이러한 문제들에도 불구하고, 나노포어 서열분석의 유망성은 폴리뉴클레오티드에서 개개 뉴클레오티드를 검출 및 정량하는 전기 디바이스와 시스템을 개발하는 동기가 된다. 실제, 나노포어 센서는 시스 및 트랜스 챔버로서 지칭되는 챔버 2개를 구비한다. 이들 챔버는 완충화된 이온 전도 용액(예, KCl)으로 충전되며, 전압이 나노포어 챔버 전체에 인가된다. 그 결과, 처음에 시스 챔버에 위치된 대전된 DNA가 트랜스 쪽으로 이동하기 시작한다. 나노포어를 지나감에 따라, 이온 전류는 즉각적으로 감소한다. 이온 전류는 전형적으로 10 내지 수백 피코암페어 범위이다. 발생되는 전기 전류는 나노포어 내 이온의 수(전하/순전하)와 나노포어 크기에 따라 결정된다. 이온의 수와 전하는 나노포어를 통과하는 (또는 나노포어 개구부에 접근하는) DNA 뉴클레오티드 가닥의 결과이다. 발생되는 전류를 모니터링함으로써 DNA 뉴클레오티드를 서열분석할 수 있다.
극저 전류 변화를 정확하게 측정하는데에는 본원에서 패치-클램프로서 지칭되는 매우 특수한 증폭기가 요구된다. 실용적인 패치-클램프는 입력 헤드스테지(headstage) 전류-전압 변환기와 헤드스테지로부터 전압을 증폭시키는 차동 증폭기를 포함한다. 패치-클램프는 매우 도전적인 설계 요건 2가지를 충족시켜야 한다. 첫째, 헤드스테지의 입력 오프셋 전압(VOS)이 최소화되어야 한다. 보다 최상의 이용가능한 고-게인 증폭기(high-gain amplifier)는 일부의 VOS를 가진다. VOS의 원인은 랜덤 프로세스 미스매치와 불가피한 시스템적인 차이이다. VOS가 얼마이든 간에, 차동 증폭기에 의해 증폭된다. 사실상, VOS가 동적 출력 범위를 한정한다.
두 번째로, 헤드스테지 포화(headstage saturation)를 방지하지 위해 패치-클램프 입력 기생 커패시턴스(parasitic capacitance)를 낮추어야 한다. 동작 전류(operating current)를 발생시키기 위해 나노포어 센서에 커맨드 전압이 인가되는 경우, 커맨드 전압 VCMD은 저항을 통해 연산 증폭기(op-amp)의 반전 입력부에 실제로 인가된다. 즉, 커맨드 전압 VCMD 변화는 불가피한 누설 시스템 커패시턴스(stray system capacitance)로 인한 시간 지연이다. 이는 반전 입력과 비-반전 입력 간의 일시적인 차이를 야기하여, 기생 커패시턴스가 충전되고 반전 입력이 다시 VCMD와 동일해질 때까지 출력 포화가 이루어진다. "데드-타임(dead-time)"이라고 하는 이러한 기간 동안에 모든 수신 데이터는 상실된다. VOS의 최소화와 입력 기생 커패시턴스 및 저항에 대한 보상이 나노포어 서열분석에 있어 주된 설계 문제이다.
현재 패치-클램프는 오히려 저항성 피드백 또는 용량성 피드백을 이용하는 특수화된 고 게인성의 차동 연산 트랜스임피던스 증폭기(high gain, differential op-amp transimpedance amplifier)이다. 도 1(a) 및 1(b)는 2개의 기본적인 패치-클램프 구조를 보여준다. 임의의 경우에, 기본적인 패치-클램프는, 증폭기(10)와, 도 1(a)에 나타낸 저항성 피드백 패치-클램프 회로(6)를 참조하는 경우 저항기(12)나 또는 도 1(b)에 나타낸 용량성 피드백 패치-클램프 회로(8)를 참조하는 경우 재설정 스위치(16)와 병렬된 콘덴서(14)를 포함하는 보상 시스템으로 구성된다. 이들 두 가지 회로에서, 커맨드 전압 VCMD이 증폭기(10)의 비-반전 입력부(17)에 인가되고, 나노포어 센서(302) 전체의 전위(예를 들어, 도 6 참조)는 반전 입력부(18)으로 인가된다.
도 1(a)에서, 반전 입력부(18)의 입력 전류 Iin가 피드백 저항기(12)의 값(Rf)에 따라 증폭된다. 발생되는 트랜스임피던스 게인은 간단하게 Vout = Rf x Iin이다. 도 1(b)에서, 용량성 피드백은 적분기로서 작동하며, 따라서 증폭기(10) 다음에는 실제 미분기가 뒤따라야 한다.
이론상 기본 패치-클램프(6 및 8)가 적절하다. 실제적으로는 잘 되지 않는다. 도 1(a)에서 저항성 피드백을 이용하는 트랜스임피던스 패치-클램프 증폭기는, 커맨드 전압 VCMD 변화 다음에 상당한 시간 지연을 겪는다. 도 6에 나타낸 나노포어 센서(302)를 참조하면, 이러한 시간 지연은 극-영점(pole-zero) 특징들, 비교적 큰 피드백 저항기(12)(도 1(a) 참조), 불가피한 직렬 저항 RS(303), 나노센서(302)의 커패시턴스 CN(305) 및 나노포어 센서(302)의 저항 RN(307)의 결과이다. 도 1(a)에 도시된 저항성 피드백 패치-클램프 회로(6)는 커맨드 전압 VCMD 변화 직후 (1+CN/CP)의 게인을 갖는 비-반전 증폭기로서 작동한다. CN이 항상 CP 보다 크기 때문에, 증폭기(10)의 출력은 포화되게 되며, 증폭기(10)가 정상 작동으로 회귀가능할 만큼 충분한 전하를 커패시터에 공급하는 시간을 가질 때까지, 데이터는 상실된다. '데드-타임'은 매우 부적절하다.
종래 기술에서는, 데드-타임을 방지하거나, 단축시키거나 또는 적어도 최소화하기 위한 시도로 복잡한 보상 회로를 사용하였다. 이러한 종래의 보상 회로는 기본적인 패치-클램프의 복잡성을 높일 뿐만 아니라 저항성 피드백 패치-클램프 회로(6) 등의 저항성 피드백 패치-클램프 회로의 대역폭을 제한하며, 통상적으로 스텝 입력에 응답하여 출력 전압 "링잉(ringing)"을 발생시킨다.
도 1(b)에 도시된 용량성 피드백 패치-클램프 회로(8)는 적어도 부분적으로는 저항성 피드백 패치-클램프 회로(6)의 데드-시간 및 시스템 복잡성을 방지하기 위해 개발되었다(도 1(a) 참조). 용량성 피드백 패치-클램프 회로(8)는 광의의 대역폭을 가지며, 재설정 스위치(16)가 닫혔을 때 순간적으로 단위 게인(unity gain)을 사실상 가진다. 커패시턴스 Cf를 가진 커패시터(14)에 걸친 재설정 스위치(16)를 적절한 타이밍으로 닫으면, 비-반전단(17)에서의 커맨드 전압 VCMD의 변화는 원래 증폭기(10)의 출력에 영향을 미치지 않으며, 출력 포화가 방지된다.
공교롭게도, 재설정 스위치(16)가 열리면, 반전 입력부(18)에서의 입력 커패시턴스는 공지의 밀러의 정리에 따르면 Cfx(l+A0)로 증가하게 되는데, 이때 A0는 증폭기(10)의 게인이다. 오히려 급격한 입력 커패시턴스 변화는 후속하여 용량성 피드백 패치-클램프 회로(8)의 대역폭을 제한하게 된다. 따라서, 용량성 피드백 트랜스임피던스 증폭기를 이용하는 경우, 재설정 주파수(fRST)가 Iin/(Cf×ΔV)(이때, ΔV는 반전 입력(18)과 출력 전압 V0 사이의 전압 차임)로 결정되기 때문에, 임의 커맨드 전압 VCMD을 인가하기 매우 어려워진다. 상기 주파수는 커맨드 전압 VCMD의 변화와 반드시 동조되는 것은 아니다.
재설정 주파수-커맨드 전압 VCMD 변화를 해결하기 위한 한가지 방안은 재설정 주파수가 커맨드 전압 VCMD의 변화와 호환가능하도록 커패시터(14)의 커패시턴스 Cf를 줄임으로써 재설정 주파수(fRST)를 단순히 높이는 것이다. 이를 위해서는 복수의 커패시터와, 여러가지 과도기를 가진 파형이 커맨드 전압 VCMD의 변화에 따라 인가될 때마다 피드백 커패시터(14) 커패시턴스로서의 적절한 선택이 요구된다. 그 결과, 패치-클램프 증폭기는 훨씬 더 크고 보다 복잡해진다.
직렬 저항(Rs)과 기생 커패시턴스(CP)를 추산하기 위해 추가적인 증폭기를 사용한 종래의 보상 패치-클램프 증폭기의 경우, 오히려 회로가 복잡해졌다.
따라서, 종래 기술의 전술한 문제점들과 기타 제한들을 해결한 새로운 패치-클램프 증폭기 회로가 바람직할 것이다. 개개 적용에 맞는 보상이 결합된 새로운 패치-클램프 증폭기 시스템이 보다 더 바람직할 것이다. 또한, 디지털 제어 가능한 새로운 보상형의 패치-클램프 시스템이 보다 더 유용할 것이다.
본 발명의 원리는 보상이 결합되고 개개 적용에 맞출 수 있는 패치-클램프 증폭기 회로 기술을 제공하는 것이다. 새로운 패치-클램프 회로는 디지털로 제어되는 보상을 이용하며, 폴리뉴클레오티드 서열분석을 위한 나노포어 서열분석기에 이용될 수 있다.
이러한 원리는 타이밍 신호를 발생시키는 클록을 갖는 패치-클램프 회로에 결합된다. 패치-클램프 회로는 비-반전 입력부, 기생 커패시턴스 및 전극 저항을 갖는 반전 입력부, 및 출력부를 구비한 차동 증폭기 회로를 더 포함한다. 상기 출력부와 반전 입력부 사이에 피드백 저항기가 연결된다. 재설정 스위치는 타이밍 신호를 수신하며, 그에 응답하여 선택적으로 출력부를 반전 입력부와 연결시킨다. 커맨드 전압 회로는 커맨드 전압과 타이밍 신호를 수신한다. 상기 커맨드 전압 회로는 타이밍 신호에 응답하여 비-반전 입력부에 인가되는 스텝 커맨드 전압(stepped command voltage)을 발생시킨다. 입력 커패시턴스와 직렬 저항을 구비한 센서는 반전 입력부에 작동가능하게 연결된다. 재설정 스위치가 스텝 커맨드 전압의 스텝 변화에 동기하여 시간 TR 동안 닫히고, 그 후 열린다. 시간 TR은 스텝 전압의 블랭크 아웃(blank out) 없이 스텝 변화 동안에 차동 증폭기 회로의 포화를 방지하는데 충분한 시간이다. 스텝 커맨드 전압은 직렬 저항과 전극 저항을 보상하여 센서에 미리결정된 전압을 발생시키도록 선택된다.
실제, 패치-클램프 시스템은 나노포어 센서를 이용하며, 동시에 차동 증폭기 회로는 전류 전압 변환기 및 차동 증폭기를 가질 수 있다. 커맨드 전압 회로는 단순할 수 있으며, 회로, 디지털-아날로그 변환기 또는 잘 규정된 스텝들을 발생시키는 일부 다른 타입의 회로를 유지할 수 있다. 실제, 출력이 센서에서 전류의 증폭된 디지털 버전을 발생시키는 아날로그-디지털 변환기에 인가될 수 있다. 상기 디지털 버전은 필드 프로그래밍형 어레이(field programmable array)에 적용될 수 있거나, 또는 컴퓨터에 입력될 수 있다. 바람직하게는, 상기 컴퓨터가 커맨드 전압으로 하여금 커맨드 전압 회로에 인가되도록 한다.
또한, 본 발명의 원리는 패치-클램프 시스템에 사용되는 센서에 대한 보상 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 전극의 제1 단부를 패치-클램프 시스템의 반전 입력부에 연결하는 단계, 상기 전극의 제2 단부를 접지(ground)에 연결하는 단계, 및 상기 반전 입력부와 패치-클램프 시스템의 출력부 사이에 피드백 저항기 RF를 연결하는 단계를 포함한다. 이로써, 패치-클램프 시스템으로부터 정지 상태 출력(steady state output)을 달성할 수 있다. 그 후, 스텝 전압을 패치-클램프 시스템의 비-반전 입력부에 인가한다. 그 후, 스텝 전압에 응답하여 패치-클램프 시스템 변환기의 출력 전압 변이가 이루어지며, 이러한 출력 전압 변이로부터, 전극의 직렬 저항 RE을 결정할 수 있다. 직렬 저항 결정 후, 센서를 전극의 제2 단부와 접지 사이에 연결시킨다. 패치-클램프 시스템의 정지 상태 출력을 확인하고, 센서 전류를 측정한다. 그 후, 센서의 직렬 저항 Rs을 측정된 센서 전류 i, 직렬 저항 RE 및 정지 상태 출력으로부터 결정할 수 있다. 일단 직렬 저항 RE을 인지하게 되면, 보상 전압을 비-반전 입력부에 인가함으로써 센서 전체에 미리결정된 전압을 인가할 수 있으며, 이때 보상 전압은 [미리결정된 전압 + 센서 전류 i × 직렬 저항 Rs]이다.
본 발명은 또한 저항에 대한 보상 외에도 기생 커패시턴스를 결정하는데 이용될 수 있다. 이를 위해, 센서 직렬 저항 Rs이 결정된 후, 패치-클램프 시스템은 정지 상태 응답을 발생하도록 설정된다. 그런 후, 보상 스텝 전압이 패치-클램프 시스템의 비-반전 입력부에 인가된다. 그 후, 출력부의 시정수(time constant)를 확인한다. 그 후, 입력 기생 커패시턴스를 사전에 입수한 센서 직렬 저항 Rs와 시정수를 이용하여 결정한다.
본 발명의 원리는 새롭고, 유용하고, 비-자명한 나노포어 서열분석기를 추가로 가능하게 한다. 이러한 나노포어 서열분석기는 입력 저항 RN 및 입력 커패시턴스 CN을 갖는 나노포어 센서를 포함한다. 나노포어 서열분석기는 추가적으로 비-반전 입력부, 기생 커패시턴스 CP를 가진 반전 입력부 및 출력부를 구비한 패치-클램프 회로를 더 포함한다. 전극 직렬 저항 RE를 갖는 전극이 나노포어 센서를 반전 입력부에 연결한다. 값 RF를 갖는 피드백 저항기가 출력부와 반전 입력부 사이에 연결된다. 출력부를 반전 입력부에 선택적으로 접속하게 하도록 재설정 스위치는 타이밍 신호를 수신한다. 디지털 아날로그 회로는 정기의 디지털 커맨드 전압(timed digital command voltage)을 수신하고, 정기의 디지털 커맨드 전압에 응답하여 비-반전 입력부에 스텝 커맨드 전압을 인가한다. 재설정 스위치는 스텝 커맨드 전압의 스텝 변화와 동기하여 시간 TR 동안 닫히고, 그 후 열린다. TR는 스텝 전압을 블랭크 아웃하지 않고 패치-클램프 회로의 포화를 방지하기에 충분하도록 선택된다. 스텝 커맨드 전압은 나노포어 저항 RN과 전극 직렬 저항 RE를 보상하도록 선택되어, 나노포어 센서에 미리결정된 전압을 발생한다.
나노포어 센서는 반도체 물질을 포함하거나, 세포막(cell membrane)일 수 있다. 패치-클램프 회로는 전류-전압 변환기 및 차동 증폭기를 포함할 수 있다. 출력부는 나노포어 센서에서 전류의 증폭된 디지털 버전을 발생시키는 아날로그-디지털 변환기에 유익하게 적용된다. 이러한 증폭된 디지털 버전은 필드 프로그래밍형 어레이로 및/또는 컴퓨터에 입력으로서 입력될 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터가 타이밍 신호 및 정기의 디지털 커멘드 전압을 작동가능하게 발생시킨다.
본원의 장점 및 특징이 수반되는 도면과 함께 이하의 상세한 설명과 특허청구범위를 참조하여 더 잘 이해될 것이며, 도면에서 각 요소들은 부호로서 식별될 것이다.
도 1(a)는 종래의 저항의 피드백 패치-클램프 회로의 개략도이다.
도 1(b)는 종래의 저항의 피드백 패치-클램프 회로를 도시하고 있다.
도 2는 본원의 원리에 따른 단순화된 보상 패치-클램프 회로의 개략도이다.
도 3(a)는 재설정 스위치(16)가 닫힌 경우에 도 2에 도시된 보상 패치-클램프 회로의 동작에 대한 개략도이다.
도 3(b)는 재설정 스위치(16)가 열린 경우에 도 2에 도시된 보상 패치-클램프 회로의 동작에 대한 개략도이다.
도 4는 디지털-아날로그 변환기(DAC)를 사용하는 본원의 원리에 따른 보상 패치-클램프 회로의 개략도이다.
도 5는 종래의 패치-클램프 시스템 및 나노포어 센서의 개략도를 도시하고 있다.
도 6은 바람직한 실시예인 보상 패치-클램프 회로의 개략도이다.
도 7은 초기 저항기 보상 동작 동안 도 6에 도시된 보상 패치-클램프 회로의 단순화 버전의 개략도이다.
도 8은 후기 저항기 보상 동작 동안 도 6에 도시된 보상 패치-클램프 회로의 단순화 버전의 개략도이다.
도 9는 나노포어 센서 저항에 대한 가동상의 흐름도이다.
도 10은 나노포어 센서 커패시턴스에 대한 가동상의 흐름도이다.
도 11은 커패시터 보상 동안 단순화된 바람직한 실시예의 보상 패치-클램프 회로의 개략도이다.
도 12는 단순화된 바람직한 실시예의 보상 커패시터 패치-클램프 회로의 개략도이다.
도 13은 본원을 실행하기 위한 3개의 단자 나노포어 센서 전면 후면을 도시하고 있다.
본원에 개시된 발명의 대상은 실시예가 도시된 수반되는 도면을 참조하여 더 자세히 기재될 것이다. 그러나, 본 발명이 다양한 형태를 취할 수 있으며, 따라서 본 명세서에 기재된 실시예에 한정되는 것으로 해석되서는 안된다는 것을 이해해야 할 것이다.
법이 허용하는 한도로 모든 목적을 참조로 본 명세서에 기재된 모든 공개 내용이 포함된다. 게다가, 도면에서 부호는 각 요소를 가리키며, 추가적으로, 본 명세서에 사용된 용어 "하나의"는 수량의 한정을 나타내지 않으며, 다만 참조되는 항목의 적어도 하나가 존재함을 나타낸다.
일반적인 나노포어 센서(302)를 따르는 것(도 6)이 기재되고, 사용되고, 보상된다. 나노포어 센서(302)가 활성(living) 세포막을 포함하거나 고상-형태 나노포어를 포함할 수 있음을 이해해야 할 것이다. 게다가, 모든 회로가 후속하여 기재되지는 않으나, 회로 동작을 더 잘 나타내도록 특히 나노포어 센서(302)가 도시되며, 따라서, 나노포어 센서(302)는 다양하게 도시되고 기재된 회로에 접속되거나 접속될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 또한, 전극 직렬 저항이 언급되며, 센서 직렬 저항이 일부 실시예에 때때로 사용될 수 있다.
본원과 사용에 적합한 디바이스가 예컨대, 미국특허 제5,795,782호, 미국특허 제6,015,714호, 미국특허 제6,267,872호, 미국특허 제6,627,067호, 미국특허 제6,746,594호, 미국특허 제6,428,959호, 미국특허 제6,617,113호, 및 국제특허공개 WO 2006/028508에 개시되어 있으며, 각 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. 필수적으로 본 명세서에 기재된 임의의 각각의 디바이스가 신규하지 않다 할지라도, 개별의 디바이스의 조합은 신규하고, 유용하며, 비-자명한 나노포어 패치-클램프 시스템, DNA 서열분석기, 및 트랜스임피던스 증폭기 또는 전류-전압 변환기를 사용하여 측정될 수 있는 생화학 분석 농도, 예컨대 글루코스, 산소, 신경 전달 물질 및 병원균을 측정하기 위한 전기 화학 응용의 결과를 낳을 수 있다.
특히 고상-상태 나노포어의 경우에, 나노포어 민감도는 포어 크기와 두께에 의해 결정된다. 나노포어 센서에서 단일-가닥 DNA의 단일 뉴클레오타이드(~ 0.35nm)를 식별하기 위해, 나노포어 센서가 약 0.35nm 이하 정도의 직경을 가질 수 있다. 이로써, 나노포어 커패시턴스는 다음과 같다:
Figure 112013075329217-pct00001
이때, εr, ε0, A 및 d는 비투전율(relative permittivity), 전기 상수(8.854xl0~12 Fm-1), 노출된 영역 및 두께를 각각 나타낸다. 원자층, 즉 A1203 및 그래핀(graphene)이 나노포어 센서에 사용되는 경우, 나노포어 커패시턴스가 더 커져서, 커맨드 전압이 변화할 때 더 긴 데드-타임(이하 설명함)을 야기한다. 특히 본원의 원리에 의해 그러한 원자층 센서가 유용하다.
도 2는 본원에 따른 기본적인 보상 패치-클램프 회로(100)를 도시하고 있다. 기본적인 보상 패치-클램프 회로(100)는, 피드백 저항기(12)를 선택적으로 단락시키도록(short out) 재설정 스위치(16)가 포함되고, 비-반전 입력부(18)와 샘플 및 홀드 회로(102)의 입력부(104)에 인가된 커맨드 전압 VCMD 사이에 위치하는 샘플 및 홀드 회로(102)가 포함되는 것에 의해, 저항성 피드백 패치-클램프 회로(6)(도 1(a) 참조)와 하드웨어 면에서 상이하다.
동작 동안, 재설정 스위치(16)는 샘플 및 홀드 회로(102)의 출력부의 스텝 전이(transient)와 동기하여 닫힌다. 실제로, 이러한 전이와 재설정 스위치(16) 동기화는 클록(31)으로부터 타이밍 펄스에 의해 제어된다. 명확한 설명의 목적으로, 이러한 타이밍 펄스와 클록(31)이 다음의 도면에서 제외된다. 그러나, 재설정 스위치(16)가 샘플 및 홀드 회로, 디지털-아날로그 변환기, 또는 일부 다른 회로로부터 커맨드 전압 VCMD 변화와 동기하여 동작하고, 동기화된 타이밍의 일부 형태가 요구됨을 이해해야 한다.
기본적인 보상 패치-클램프 회로(100)는 동작에 있어서 두 모드, 즉 도 3(a)의 커맨드 전압 VCMD이 변화하는 전이 모드, 및 도 3(b)의 커맨드 전압 VCMD이 안정적인 정지 상태 모드를 가진다. 두 작동 모드에서, 커맨드 전압 VCMD이 별개의 단계로 디지털화된다는 것이 이해되어야 한다. 전이 모드 동작 동안, 재설정 스위치(16)을 닫게 함으로써 증폭기(10)의 포화 및 연관된 데드-타임이 방지된다. 보상 패치-클램프 회로(100)의 동작은 그 후 도 1(b)의 용량성 피드백 펄스 클램프 회로와 유사하며, 증폭기(10)는 단위 게인 증폭기로서 동작한다. 정지-상태 모드에서, 재설정 스위치(16)가 턴오프 되고, 기본적인 보상 패치-클램프 회로(100)는 도 1(a)에 도시된 저항성 피드백 패치-클램프처럼 동작한다.
피드백 커패시터(14)가 기본적인 보상 패치-클램프 회로(100)에 사용되지 않기 때문에, 주기적인 재설정 펄스가 빌트업 전하(built up charge)를 제거하도록 요구되진 않는다. 게다가, 저항성 피드백이 사용되기 때문에, 복잡한 보상 회로도 요구되지 않는다. 기본적인 보상 패치-클램프 회로(100) 아키텍처는 하드웨어 복합성을 제거하면서, 복잡한 커맨드 전압 VCMD 파형을 사용하고 다양한 지속 시간(dwell time)을 사용할 수 있게 한다.
기본적인 보상 패치-클램프 회로(100) 및 그것의 샘플 및 홀드 회로(102)는 나노포어 패치-클램프 회로에서 주요 변화를 나타낸다. 기본적인 보상 패치-클램프 회로(100)의 한가지 장점이 도 4의 개선된 보상 패치-클램프 회로(200)에 도시된다. 개선된 보상 패치-클램프 회로(200)가 도 2에 도시된 샘플 및 홀드 회로(102)를 대신해서 저역 통과 필터된 디지털-아날로그 변환기(202)를 사용한다. 디저털-아날로그 변환기(202)는 퍼스널 컴퓨터와 같은 컴퓨터화 시스템에 의해 제어되고 직접적으로 연결될 수 있기 때문에 장점을 가진다. 이러한 컴퓨터화 시스템이 도 6 및 관련 설명에서 후속하여 기재된다. 게다가, 재설정 스위치(16)는 필드 프로그램형 게이트 어레이에 의해 또는 컴퓨터에 의해 제어될 수 있다. 그러나, 도 2의 단순 클록(31)이 컴퓨터의 출력부로부터 유도된 타이밍 또는 신호를 타이밍하는 클록 디지털-아날로그 변환기(202)로 대체된다 할지라도, 재설정 스위치(16) 동작의 타이밍 동기화와 커맨드 전압 VCMD 변화가 여전히 요구된다.
패치-클램프는 종래의 DNA 서열분석기에 사용되어 왔다. 도 5는 종래의 DNA 서열분석기(270)를 도시한다. 이것은 두 개의 "채널", 즉 이온의(KCl) 유체-충전 컨테이너에 보유되고, 반도체 물질을 통해 나노포어(274)에 의해 분리되는 시스 채널과 트랜스 채널을 구비한 나노포어 센서(272)를 포함한다. 시스 채널과 트랜스 채널 사이에 흐르는 전류는 제1 증폭기에 의해 전압으로 변환(I-V 변환)되고, 그 후 차동 증폭기에 의해 증폭된다. 기본적인 패치-클램프 증폭기(도 1의 6 및 8)는 실제로 I-V 변환 단계 및 차동 증폭 단계를 갖는 두-단계 패치-클램프 증폭기(278)에 의해 대체된다.
기본적인 패치-클램프 회로(100 및 200)가 신규하고, 유익하고, 유용하며, 본원의 바람직한 일실시예는 도 6의 컴퓨터화 보상 DNA 서열분석기(300) 시스템이다. DNA 서열분석기(300)는, 나노포어 센서(302)가 세포막 나노포어 또는 반도체 나노포어를 포함할 수 있다는 것을 제외하고, 도 5의 나노포어 센서(272)에 직접적으로 대응하는 나노포어 센서(302)를 포함한다. 명확한 이해를 위해, 도 6은 그것의 물리적 배열이 나노포어 센서(272)의 전기 모델 또는 그것의 세포막 카운터파트일 것이라는 이해와 함께 나노포어 센서(302)의 전기 모델을 나타낸다. 전기 모델은 나노포어 커패시턴스(304)(CN), 나노포어 저항(RN)(306), 전극 직렬 저항(Rs)(308), 및 입력 기생 커패시턴스(CP)(310)를 포함한다.
나노포어 센서(302)는 입력 (I-V) 변환기(314) 헤드스테이지 및 차동 증폭기(316)로 구성된 패치-클램프 회로의 반전 입력부(18)에 연결되며, 이는 도 5에 도시된 것과 유사하다. 패치-클램프 회로의 출력은 그것의 아날로그 전압 입력을 디지털화하여 필드 프로그래밍형 게이트 어레이(324)에 입력으로서 그것의 디지털화된 출력 버전을 적용하는 아날로그-디지털 변환기(320)에 입력된다. 필드 프로그래밍형 게이트 어레이(324)는 그것의 수신된 디지털화된 전압 판독의 적절히 처리된 버전을 퍼스널 컴퓨터(326)(또는 또다른 적합한 컴퓨터화 시스템)에 전송한다.
퍼스널 컴퓨터(326)는 나노포어 센서(302) 판독에서 데이터 분석을 수행한다. 게다가, 퍼스널 컴퓨터(PC)(326)는 디지털-아날로그 변환기(330)의 작동을 제어하도록 후속하여 사용되는 필드 프로그래밍형 게이트 어레이(324)에 제어 신호를 적용한다. 디지털-아날로그 변환기(330)는 입력 (I-V) 변환기(314) 헤드스테이지 및 차동 증폭기(316)의 비-반전 입력부(17)에 커맨드 전압(VCMD)을 제공한다. 따라서, DNA 서열분석기(300)의 작동이 컴퓨터 제어되고, 그 출력은 데이터 분석에 이용되며, 패치-클램프 보상이 이하 기재되는 바와 같이 제공된다.
DNA 서열분석기(300)는 자동화 보상에 적합하다. 보상 동작(450)은 도 9의 흐름도에 도시되어 있다. 동작(450)은 정지 상태 모드인 단계(452)에서 입력 (I-V) 변환기(314) 헤드스테이지 및 차동 증폭기(316)를 활성화시킴으로서 시작되고 진행된다. 정지 상태 모드의 획득은 도 6의 단순화된 패치-클램프 회로(360)(입력 (I-V) 변환기(314) 헤드스테이지 및 차동 증폭기(316))로 설명된다. 단순화된 패치-클램프 회로(360)는 나노포어 센서(302) 없이, 접지된 입력 기생 커패시턴스(CP)(310) 및 전극 직렬 저항(Rs)(308)과 함께 도시된다. 직렬 저항(Rs)(308) 및 기생 커패시턴스(Cp)(310)가 분포되며, 불가피하다. 커맨드 전압(VCMD)이 미리결정된 전압(명목상 접지)으로 설정된다. 이는 출력 단자(325) 상의 출력 전압 V0이 안정화되도록 하며, 패치-클램프 회로(360)는 정지 상태 모드에 놓인다. 다양한 구현예에서, 나노포어는 센서 직렬 저항을 가지지 않음을 유의한다.
일정 시간 후에, VCMD 전압 스텝이 인가된다(단계 454). 일정 시간 지연 후에, 직렬 저항(Rs)(308) 및 기생 커패시턴스(CP)(310)를 걸쳐 전압 VP를 VCMD로 설정한다(단계 456 참조). 다음으로, 출력 전압 변이가 측정된다(단계 458). 출력 전압이 디지털화되어 PC(326)에 적용됨에 유의한다. 출력 전압 변이로부터, 그리고 밝혀진 RF(12)로부터, 전극 직렬 저항(Rs)의 값이 정확하게 측정(결정)될 수 있다(단계 460). 출력 전압 변이 및 Rs에 대한 공식이 단계 458에 도시된다.
다음으로, 나노포어 센서(302)가 패치-클램프 증폭기(360)에 적용되고, 그 결과로 초래되는 나노포어 전류(i)가 측정된다(단계 462)(도 8 참조). 전류(i)가 측정된 후, PC(326)는 필드 프로그래밍형 게이트 어레이(324)를 통해 디지털-아날로그 변환기(330)로 하여금 또다른, 상이한 커맨드 전압 V'CMD(V'CMD = VCMD+i×Rs)을 생성하도록 한다(단계 464). 이는 Rs를 이미 알고 있기 때문에(단계 450 내지 460) 가능하다. 나노포어 센서(302) 저항(RN)(307) 역시 출력 V0 변화로부터 결정될 수 있다. 직렬 저항 보상이 종료된다(단계 466). 모든 나노포어 관련 저항이 결정되었기 때문에, 나노포어 센서(302)를 통해 인가된 실제 전압이 직렬 저항(Rs)(308), 기생 커패시턴스(CP)(310) 및 나노포어 저항(307)에도 불구하고 정확히 밝혀질 수 있다. 그러므로, 나노포어 센서(302) 저항성 환경이 정확히 보상된다.
저항기 보상에 더하여, 커패시턴스에 대해 보상이 가능하다. 도 10은 커패시턴스 보상의 동작(500)을 도시하고 있다. 동작(500)이 시작되면(단계 502), 전이 모드에 들어감으로써 진행된다(단계 504). 도 11은 반전 입력부를 출력 단자(325)에 단락시키기 위해 재설정 스위치(16)를 닫아서 시작되는 전이 모드를 보여주며, 이로써 피드백 저항(RF)(12)(도 1(a) 참조) 및 충전되는 모든 커패시턴스가 단락된다. 그 다음, 커맨드 전압 VCMD 스텝이 인가된다(단계 506). 출력 단자(325) 상의 출력 전압 V0이 모니터링되고, V0의 시정수가 측정되고(단계 508), 메모리에 저장된다(단계 510). 전극 직렬 저항(Rs) 및 시정수가 결정되었기 때문에, 나노포어 전극 커패시턴스(CN)보다 더 작은 기생 커패시터(CP)의 값이 정확히 계산될 것이다(단계 512). 계상된 CP의 값으로부터, 최적의 재설정 펄스폭(Tt)의 결정이 정해질 수 있다(단계 514). 재설정 펄스폭은 단계 506에서 밝혀진 시정수보다 어느정도 더 길어야 하나, 전압 스텝을 블랭크 아웃하는 한 더 이상 길어서는 안된다. 블랭크 아웃에 의해, 재설정 펄스폭이 너무 길어서 전압 스텝으로의 패치-클램프 회로의 응답이 또다른 단계가 발생하기 전에 시스템에 의해 결정될 수 없음을 의미한다. 재설정 펄스폭 지연은 반전 입력 전극, 연결 케이블, 및 나노포어 센서를 포함하는 입력 기생 커패시턴스를 보상하고, 커패시터 보상이 종료된다(단계 516).
이상으로 신규의 저항성 피드백 패치-클램프 시스템, DNA 서열분석에서의 그것의 사용, 및 저항성 패치-클램프 회로를 기초로 하는 자동화 보상을 설명하였으며, 본원의 원리가 또한 용량성 패치-클램프 회로에 유용하다. 도 12는 본원의 보상 기술이 용량성 피드백 트랜스임피던스 증폭기에 적용될 수 있는 방법을 도시하고 있다. 불가피한 누출로 인해 유발되는 고 임피던스 Zi(610)로 인해 기생 재설정 펄스가 요구되지 않는다. 기생 재설정을 제거함으로써, 전하 및 클록 피드-스루(feed-through)로 인한 입력부에서의 글리치(glitch)를 방지한다. 그러나, Zi는 기생 입력 커패시턴스(CP) 및 전극 직렬 저항(Rs)이기 때문에 여전히 보상을 요구한다. Zi 및 Cf(14)에 병렬로 재설정 스위치(16)를 추가함으로써, 용량성-피드백 TIA에 대한 보상 절차가 이미 전술한 바와 동일하다.
추가의 실시예 및 개시 내용은 이하와 같다.
본 명세서에 개시된 발명은 폴리뉴클레오타이드의 개별의 뉴클레오타이드를 검출하고 수량화하는 디바이스 및 방법을 제공한다. 디바이스는 고상 상태 나노포어 또는 규정된 사이트, 예컨대 기질 및/또는 표면에 위치한 나노포어일 수 있다.
본 명세서에 개시된 디바이스는 나노포어 시스템에 한정되지는 않으나, 이를 포함하는 다양한 응용에 사용될 수 있다. 이 시스템은 저항성 피드백으로 종래의 트랜스임피던스 증폭기에 스위치를 위치함으로써 '데드-타임'을 방지할 수 있다. 다양한 개별의 파형이 생성되고 커맨드 전압 제어를 위한 DAC 또는 샘플/홀드 회로에 의해 전압 커맨드에 적용된다. 전압 패치-클램프 증폭기는 컴퓨터 인터페이스 시스템에 의해 완전히 제어될 수 있다.
또한, 본 발명은 이미 개시한 바와 같이 피드백 저항기를 보상하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 본 발명은 프로브(probe) 입력 커패시턴스를 보상하는 방법을 개시한다.
본 발명은 위치를 검출하고 규정된 사이트에 대해 분자의 양을 측정하도록 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 규정된 사이트는 나노포어이다. 나노포어의 일측에서 전위차를 변화시킴으로서 분자가 위치할 수 있다. 분자는 고분자일 수 있고, 또한 다중이온(polyion), 예컨대 다중음이온(polyanion) 및/또는 다중양이온(polycation)을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리이온은 폴리뉴클레오타이드이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 폴리이온은 폴리펩타이드이다. 기질 및/또는 표면은 두 개의 챔버의 범위를 정할 수 있고, 또한 기질 또는 표면에 위치하는 포어를 포함할 수 있다. 챔버 중 하나는 포어로의 시스이고, 다른 하나는 포어로의 트랜스이다. 분자는 챔버 사이의 전위차를 변화시킴으로서 위치할 수 있다. 바람직하게는, 분자는 처음에 시스 챔버에 존재한다. 분자 조성에서 존재 및/또는 부재 및/또는 변화가 포어를 통해 전기 전류를 측정함으로서 검출될 수 있다. 본 발명은 분자를 검출하는 센서로서 사용될 수 있다. 본 발명은 분자 생물, 구조 생물, 세포 생물, 분자 스위치, 분자 회로, 및 분자 전산 디바이스(molecular computational device), 및 그 제조의 분야에서 특정하게 사용된다.
본 발명은 이를 사용하기 위한 디바이스 및 방법을 제공한다. 상기 장치는 나노포어 디바이스 시스템 또는 또다른 적합한 시스템에서 사용될 수 있다. 일실시의 구현예에서, 상기 디바이스는 전압 패치-클램프 회로이며, 상기 전압 패치-클램프 회로는: 클록 전이를 갖는 클록 신호를 발생하는 클록; 비-반전 입력부, 반전 입력부 및 출력부를 구비하는 차동 증폭기; 상기 출력부 및 상기 반전 입력부 사이에 연결되는 피드백 저항기; 상기 클록 신호를 수신하는 재설정 스위치로서, 클록 신호에 응답하여 상기 반전 입력부에 상기 출력부를 선택적으로 연결하기 위한 재설정 스위치; 및 클록 신호 및 커맨드 전압을 수신하는 샘플 및 홀드 회로로서, 클록 신호에 응답하여 커맨드 전압을 디지털화하고 상기 비-반전 입력부에 디지털화된 커맨드 전압을 인가하기 위한 샘플 및 홀드 회로를 포함하고, 상기 재설정 스위치는, 상기 차동 증폭기의 게인을 감소시키기 위해 클록 전이 동안 닫히고, 상기 차동 증폭기의 게인을 증가시키기 위해 클록 전이 이후에 열린다.
또다른 실시의 구현예에서, 상기 시스템은, 센서에서 소 전류 변이를 증폭시키는 방법에 사용될 수 있고, 이때, 클록 신호와 일치하여 커맨드 전압을 디지털화하는 단계; 디지털화된 커맨드 전압으로부터 유도된 전압을 센서에 인가하여 센서 전류의 변이를 유도하는 단계; 센서 전류의 변이를 증폭하여 출력을 발생하는 단계; 클록 신호가 변화하여 포화가 제한되는 경우에 센서 전류의 변이에 적용된 증폭을 감소시키는 단계; 및 클록 신호가 변하지 않는 경우에 센서 전류의 변이에 적용된 증폭을 증가시키는 단계를 포함한다.
또다른 실시의 구현예에서, 상기 시스템은, 나노포어 센서의 직렬 저항을 보상하는 방법에 사용될 수 있고, 이때, 전류-전압 변환기를 활성화하여 정지 상태 응답을 달성하는 단계; 전류-전압 변환기의 반전 입력부에 인가된 결과의 전압이 스텝 전압과 실질적으로 동일하도록, 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 스텝 전압을 인가하는 단계; 전류-전압 변환기의 출력 전압 변이를 상기 스텝 전압으로 결정하는 단계; 나노포어 센서의 직렬 저항을 측정하는 단계; 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 나노포어 센서를 연결하는 단계; 나노포어 센서 전류를 측정하는 단계; 및 [스텝 전압 + 나노포어 센서 전류 × 직렬 저항]인 전압을 전류-전압 변환기의 반전 입력부에 인가함으로써, 나노포어 센서를 보상하는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서, 상기 시스템은, 세포막 센서의 직렬 저항을 보상하는 방법에 사용될 수 있고, 이때, 전류-전압 변환기를 활성화하여 정지 상태 응답을 달성하는 단계; 전류-전압 변환기의 반전 입력부에 인가된 결과의 전압이 스텝 전압과 실질적으로 동일하도록, 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 스텝 전압을 인가하는 단계; 전류-전압 변환기의 출력 전압 변이를 상기 스텝 전압으로 결정하는 단계; 세포막 센서의 직렬 저항을 측정하는 단계; 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 세포막 센서를 연결하는 단계; 세포막 센서 전류를 측정하는 단계; 및 [스텝 전압 + 세포막 센서 전류 × 직렬 저항]인 전압을 전류-전압 변환기의 반전 입력부에 인가함으로써, 세포막 센서를 보상하는 단계를 포함한다.
추가로, 상기 시스템은, 또한 나노포어 센서의 입력 기생 커패시턴스를 보상하는 방법에 사용될 수 있고, 이때, 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 나노포어 센서를 연결하는 단계; 나노포어 센서의 직렬 저항을 획득하는 단계; 전류-전압 변환기를 활성화시켜 정지 상태 응답을 달성하는 단계; 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 스텝 전압을 인가하는 단계; 전류-전압 변환기의 시정수를 상기 스텝 전압으로 결정하는 단계; 및 나노포어 센서의 직렬 저항 및 결정된 시정수로부터 나노포어 센서의 입력 기생 커패시턴스를 결정하는 단계를 포함한다.
대안의 구현예에서, 상기 시스템은, 세포막의 입력 기생 커패시턴스를 보상하는 방법에 사용될 수 있고, 이때, 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 세포막 센서를 연결하는 단계; 세포막 센서의 직렬 저항을 획득하는 단계; 전류-전압 변환기를 활성화시켜 정지 상태 응답을 달성하는 단계; 전류-전압 변환기의 비-반전 입력부에 스텝 전압을 인가하는 단계; 전류-전압 변환기의 시정수를 상기 스텝 전압으로 결정하는 단계; 및 세포막 센서의 직렬 저항 및 결정된 시정수로부터 세포막 센서의 입력 기생 커패시턴스를 결정하는 단계를 포함한다.
나노포어 디바이스 시스템은 전기 통신 수단에 의해 연결되는 '시스' 및 '트랜스' 챔버를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 챔버는 수성 매질, 비수성 매질, 유기 매질 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매질을 포함한다. 일 구현예에서, 매질은 유체이다. 대안의 구현예에서, 매질은 가스이다. 일 구현예에서, 전기 통신 수단은, 예컨대 질화규소, 이작용성 알킬 술파이드, 및/또는 금 또는 그외 금속 또는 합금을 포함하는 고상 상태 포어이다. 대안의 구현예에서, 시스 및 트랜스 챔버는 하나 이상의 포어 또는 채널을 포함하는 박막으로 분리된다. 바람직한 일 구현예에서, 박막은 소수성 영역 및 친수성 영역을 가지는 화합물을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 박막은 인지질을 포함한다. 디바이스는 시스 및 트랜스 챔버 사이에 전계를 인가하는 수단을 더 포함한다. 일 구현예에서, 포어 또는 채널은 다중이온의 일부를 수용한다. 또다른 구현예에서, 포어 또는 채널은 분자의 일부를 수용한다. 바람직한 일 구현예에서, 분자는 고분자이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 다중이온이 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 인지질, 다당류 및 폴리케티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 상기 화합물은 효소 활성을 가진다. 효소 활성은, 이들에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 프로테아제, 키나제, 포스파타제, 가수분해효소, 옥시도리덕타제, 이성질화 효소, 전이효소, 메틸라제, 아세틸라제, 리가제, 리아제, 리보자임 등의 효소 활성일 수 있다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소 활성은 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 엔도뉴클라제, 엑소뉴클라제, DNA 리가제, DNA 분해효소, 유라실-DNA 글리코시다제, 키나제, 포스파타제, 메틸라제, 아세틸라제, 글루코스 옥시다제, 리보자임 등의 효소 활성일 수 있다.
추가의 구현예에서, 포어는 활성자의 통과가 가능하게 하는 크기 및 모양을 가지는데, 이때, 활성자는 ATP, NAD+, NADP+, 디아실글리세롤, 포스파티딜세린, 아이코시노이드, 레티노산, 칼시페롤, 아스코르브산, 뉴로펩티드, 엔케팔린, 엔돌핀, 4-아미노뷰티레이트(GABA), 5-히드록시트립타민(5-HT), 카테콜아민, 아세틸 CoA, S-아데노실메티오닌, 6탄당, 5탄당, 인지질, 지질, 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI), 및 임의의 기타 생물학적 활성자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 포어는 단량체가 통과하는 것을 가능하게 하는 크기 및 모양을 가지는데, 이때 단량체는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, UTP, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 라이신, 루신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 알기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 타이로신, 6탄당, 5탄당, 인지질, 지질, 및 임의의 기탄 생물학적 단량체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 포어는 보조 인자가 통과하는 것을 가능하게 하는 크기 및 모양을 가지는데, 이때 보조 인자는 Mg2 +, Mn2 +, Ca2 +, ATP, NAD+, NADP+, 및 임의의 기타 생물학적 보조 인자로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 가지 중요한 구현예에서, 포어 또는 채널은 생물학적 분자, 또는 합성에 의해 개질 또는 변형된 생물학적 분자를 포함한다. 이러한 생물학적 분자는, 이들에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 이온 채널, 예컨데 a-헤모라이신, 뉴클레오사이드 채널, 펩티드 채널, 당수송체, 시냅스 채널, 막관통 수용체, 예컨대 GPCR, 수용체 타이로신 키나제 등, T-세포 수용체, MHC 수용체, 핵 수용체, 예컨대, 스테로이드 호르몬 수용체, 핵 포어 등일 수 있다.
대안 구현예에서, 화합물은 비-효소 생물학적 활성을 가진다. 비-효소 생물학적 활성을 가지는 화합물은, 이들에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 항체, 항원, 핵산, 펩티드핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모르폴리노, 당, 지질, 글리코실 포스파티딜 이노시톨, 글리코포스포이노시톨, 지질다당류 등일 수 있다. 화합물은 항원 활성을 가질 수 있다. 화합물은 리보자임 활성을 가질 수 있다. 화합물은 선택적 결합 특성을 가져 중합체가 특정 조절된 환경 조건 하에서 화합물에 결합될 수 있지만, 환경 조건이 변할 경우는 그렇지 않다. 이러한 조건은, 이들에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, H+ 농도의 변화, 환경 온도의 변화, 충실성(stringency)의 변화, 소수성의 변화, 친수성의 변화 등일 수 있다.
일 구현예에서, 거대분자는 효소 활성을 가진다. 효소 활성은, 이들에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 프로테아제, 키나제, 포스파타제, 가수분해효소, 옥시도리덕타제, 이성질화 효소, 전이효소, 메틸라제, 아세틸라제, 리가제, 리아제 등의 효소 활성일 수 있다. 더 바람직한 구현예에서, 효소 활성은 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 엔도뉴클라제, 엑소뉴클라제, DNA 리가제, DNA 분해효소, 유라실-DNA 글리코시다제, 키나제, 포스파타제, 메틸라제, 아세틸라제, 글루코스 옥시다제 등의 효소 활성일 수 있다. 대안의 구현예에서, 거대 분자는 하나 이상의 효소 활성, 예를 들면, 사이토크롬 P450 효소의 효소 활성을 가질 수 있다. 또다른 대안의 구현예에서, 거대 분자는 하나 이상의 유형의 효소 활성, 예를 들면, 포유류 지방산 합성 효소를 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, 거대 분자는 리보자임 활성을 가질 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 티올기, 술파이드기, 포스페이트기, 술페이트기, 시아노기, 피페리딘기, Fmoc기 및 Boc기로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결 분자를 추가로 가지는 화합물을 제공한다. 다른 구현예에서, 화합물은 이작용성 알킬 술파이드 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 장치는, 예를 들면, 미국특허 제5,795,782호, 미국특허 제6,015,714호, 미국특허 제6,267,872호, 미국특허 제6,627,067호, 미국특허 제6,746,594호, 미국특허 제6,428,959호, 미국특허 제6,617,113호 및 국제특허공개 WO 2006/028508에 개시되어 있으며, 각 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
앞서 패치-클램프의 진보된 보상 기술이 설명되었으며, 이는 과도한 데드-타임이 방지되어야 하는 응용에 또한 이용될 수 있다. 정확한 재설정 펄스폭이 데드-타임을 감소시킬 수 있다.
도면 및 상기 기재내용은 본원 발명을 설명하는 것이지만, 이들이 예시적일 뿐이라는 점이 이해된다. 그것들이 하나도 빠트리지 않은 것들이라거나 본 발명을 개시된 유형에 한정시키려는 의도는 없으며, 본 발명의 개시에 기초하여 다양한 변형 및 변경이 가능하다는 점은 자명하다. 통상의 기술자라면 예시된 구현예의 수많은 변형 및 변화가 본 발명의 원리 안에서 가능할 것이라는 점을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
앞서 종래의 두 전극 나노포어 센서를 사용하는 본 발명이 설명되었으나, 본 발명의 원리는 유연하여 다른 아키텍처와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 13은 세 전극 나노포어 센서(690) 전단 회로(700)를 나타낸다. 단위-게인 버퍼 증폭기(702)는 그것의 비-반전 입력부 상의 커맨드 전압 VCMD을 버퍼링한다. 버퍼링된 출력이 스위치 SI(706)를 통해 시스 챔버에 연결된다. 커맨드 전압 VCMD이 변경되는 경우, 스위치 SI(706)가 시스 챔버(710) 전위가 VCMD와 동일할 때까지 나노포어 센서의 커패시턴스 CN을 변화시키도록 주입 전류로 턴온된다. 이는 데드 타임을 보상하는데 도움이 된다. 본 명세서 상의 보상 기술은, 트랜스임피던스 증폭기 또는 전류-전압 변환기를 사용하여 측정될 수 있는 글루코스, 산소, 신경 전달 물질 및 병원균과 같은 생화학 분석 농도를 측정하기 위해 나노포어 응용, 패치-클램프 응용 및 전기화학 응용에 적용될 수 있다.

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  10. 패치-클램프 시스템에서 센서를 보상하는 방법으로서,
    a) 전극의 제1 단부를 패치-클램프 시스템의 반전 입력부에 연결하는 단계;
    b) 상기 전극의 제2 단부를 접지(ground)에 연결하는 단계;
    c) 상기 패치-클램프 시스템의 출력부와 상기 반전 입력부 사이에 피드백 저항기 RF를 연결하는 단계;
    d) 비-반전 입력부 상의 전압을 기준 전압으로 설정함으로써 패치-클램프 시스템의 정지 상태 출력(steady state output)을 획득하는 단계;
    e) 스텝 전압을 상기 비-반전 입력부에 인가하는 단계;
    f) 상기 스텝 전압에 응답하여 패치-클램프 시스템 변환기의 출력 전압 변이를 결정하는 단계;
    g) 상기 단계 f)에서 결정된 출력 전압 변이를 사용하여 전극 직렬 저항(RE)을 계산하는 단계;
    h) 전극의 제2 단부와 접지 사이에 센서를 연결하는 단계;
    i) 상기 비-반전 입력부에 기준 전압으로 설정함으로써 상기 패치-클램프 시스템의 정지 상태 출력을 획득하는 단계;
    j) 상기 정지 상태 출력이 달성된 후에, 센서 전류(i)를 측정하는 단계;
    k) 측정된 센서 전류(i), 상기 전극 직렬 저항(RE) 및 상기 정지 상태 출력으로부터 센서 직렬 저항(Rs)을 결정하는 단계;
    l) 보상 전압을 상기 비-반전 입력부에 인가하여 상기 센서에 미리결정된 전압을 획득함으로써 상기 센서를 사용하는 단계로서, 상기 보상 전압은 [상기 미리결정된 전압 + 상기 센서 전류(i) × 상기 센서 직렬 저항(Rs)]인, 단계
    를 포함하는,
    패치-클램프 시스템에서 센서를 보상하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 센서 직렬 저항(Rs)이 결정된 후에, 상기 패치-클램프 시스템이 정지 상태 응답을 달성하도록 활성화시키는 단계;
    보상 스텝 전압을 상기 패치-클램프 시스템의 비-반전 입력부에 인가하는 단계;
    상기 패치-클램프 시스템의 출력부의 시정수(time constant)를 상기 보상 스텝 전압으로 결정하는 단계; 및
    상기 센서 직렬 저항(Rs)과 결정된 시정수로부터 상기 센서의 입력 기생(parasitic) 커패시턴스를 결정하는 단계
    를 더 포함하는, 패치-클램프 시스템에서 센서를 보상하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    결정된 입력 기생 커패시턴스에 기초하여 재설정 펄스폭을 결정하는 단계를 더 포함하는, 패치-클램프 시스템에서 센서를 보상하는 방법.
  13. 나노포어 서열분석기로서,
    입력 저항(RN) 및 입력 커패시턴스(CN)를 갖는 나노포어 센서;
    비-반전 입력부, 기생 커패시턴스(Cp)를 가진 반전 입력부, 및 출력부를 구비한 패치-클램프 회로;
    상기 나노포어 센서를 상기 반전 입력부에 연결하는, 전극 직렬 저항(RE)을 갖는 전극;
    상기 출력부와 상기 반전 입력부 사이에 연결되는 피드백 저항기;
    타이밍 신호를 수신하고, 상기 타이밍 신호에 응답하여 상기 반전 입력부에 상기 출력부를 선택적으로 연결시키는 재설정 스위치;
    정기의 디지털 커맨드 전압(timed digital command voltage)을 수신하고, 상기 정기의 디지털 커맨드 전압에 응답하여 상기 비-반전 입력부에 스텝 커맨드 전압을 인가하는 디지털-아날로그 회로
    를 포함하고,
    상기 재설정 스위치는, 상기 스텝 커맨드 전압의 스텝 변화와 동기하여 시간 TR 동안 닫히고, 상기 시간 TR 이후에 열리고,
    상기 시간 TR은 스텝 전압을 블랭킹(blanking)하지 않고 상기 패치-클램프 회로의 포화를 방지하기에 충분하며,
    상기 스텝 커맨드 전압은 상기 입력 저항(RN) 및 상기 전극 직렬 저항(RE)을 보상하여 상기 나노포어 센서에 미리결정된 전압을 발생시키도록 선택되는,
    나노포어 서열분석기.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 나노포어 센서는 반도체 물질을 포함하는, 나노포어 서열분석기.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 나노포어 센서는 세포막(cell membrane)을 포함하는, 나노포어 서열분석기.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 패치-클램프 회로는 전류-전압 변환기 및 차동 증폭기를 포함하는, 나노포어 서열분석기.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 나노포어 센서에서 출력된 전류로부터 증폭된 디지털 신호를 발생시키도록 아날로그-디지털 변환기에 상기 출력부의 출력 전압이 인가되는, 나노포어 서열분석기.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 증폭된 디지털 신호가 필드 프로그래밍형 어레이에 적용되는, 나노포어 서열분석기.
  19. 삭제
  20. 제17항에 있어서,
    상기 증폭된 디지털 신호가 컴퓨터에 입력되고, 상기 컴퓨터가 상기 타이밍 신호 및 상기 정기의 디지털 커멘드 전압을 작동가능하게 발생시키는, 나노포어 서열분석기.
  21. 제13항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는데 적용되는, 나노포어 서열분석기.
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