CN111065917A

CN111065917A - 双孔－控制和传感器设备

Info

Publication number: CN111065917A
Application number: CN201880050897.5A
Authority: CN
Inventors: R·斯塔姆; M·萨默斯; E·索恩; W·B·邓巴
Original assignee: Altela Inc
Current assignee: Norma biology
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2018-06-14
Publication date: 2020-04-24
Also published as: KR20210129726A; US20210405020A1; EP3642607A1; KR102315815B1; KR102377508B1; JP2022088415A; US11099169B2; CA3067993A1; MX2019015156A; WO2018236673A1; CA3067993C; US20180372713A1; KR20200042894A; JP2020524801A; JP7038147B2; EP3642607A4

Abstract

描述了两孔设备和用于测序的方法。一种两孔设备可以包括：第一腔室、第二腔室和第三腔室，其中所述第一腔室通过第一纳米孔与所述第二腔室连通，并且其中所述第二腔室通过第二纳米孔与所述第三腔室连通。所述设备还可以包括：感测电路系统，用于测量与在纳米孔处的目标相关联的电信号；以及控制电路系统，用于控制所述目标在纳米孔处的运动。所述设备可以包括针对所述第一纳米孔和所述第二纳米孔中的每一个的感测模式和控制模式和/或在所述感测模式和所述控制模式之间进行切换。测序方法可以实施两孔设备，涉及：目标易位穿过一个或者多个纳米孔，根据需要在感测模式和控制模式之间进行切换，以及通过在所述感测模式下使用来测量所述目标的各个方面。

Description

双孔－控制和传感器设备

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年6月21日提交的美国临时申请序列号62/523,228的权益，其通过引用的方式全部并入本文。

背景技术

纳米孔是是一种纳米级导管，其自然形成为脂质膜中的蛋白质通道(生物孔)，或者通过对固态基板中的开口进行钻孔或者蚀刻来进行设计(固态孔)。当将这种纳米孔并入包括由纳米孔隔开的两个腔室的纳米设备时，可以使用感测设备(诸如膜片钳系统或者电压钳系统)来施加跨膜电压，并且测量穿过孔的离子电流。

纳米孔为廉价的全基因组DNA测序提供了广阔的前景。纳米孔测序的两个障碍是：(1)缺乏足够的灵敏度来针对从头测序准确地确定核酸中的每个核苷酸的身份(缺乏单核苷酸灵敏度)，以及(2)在感测期间调节和控制每个核苷酸单元穿过纳米孔的传递速率的能力。这两个障碍通常是相互关联的，因为无法调节传递速率是可能与缺乏单核苷酸灵敏度相关联的潜在问题之一。换句话说，如果DNA正过快地穿过传感器，则会损害传感器的功能。没有解决障碍2的、不涉及使用酶或者光学器件的现有方法，酶和光学器件都只能在专门的纳米孔技术中起作用，并且与电气方法相比较，酶和光学器件引起更高的复杂度和成本。

附图说明

所公开的实施例具有优点和特征，这些优点和特征将通过详细描述、所附权利要求书和附图(或者图示)而更加清楚。对图的简要介绍如下。

图1描绘了根据一个实施例的具有两个纳米孔的示例纳米孔设备。

图2A至图2B分别描绘了根据两个实施例的包含示例纳米孔设备的两个纳米孔的示例电路系统。

图3描绘了根据一个实施例的示例两纳米孔设备，该示例两纳米孔设备具有针对每个孔的感测电路系统和控制电路系统选项以及在针对每个孔的两个选项之间的开关。

图4A描绘了根据一个实施例的处于第一配置的示例两纳米孔设备。

图4B描绘了根据一个实施例的处于第二配置的示例两纳米孔设备。

图5描绘了根据实施例的对分子(诸如多核苷酸)进行测序的流程。

具体实施方式

概述

本公开描述了一种两纳米孔设备，其中两个纳米孔中的每一个被包含在可切换的两个电路选项内。包含纳米孔的第一电路系统(circuitry)(以下称为传感器电路系统)包括感测电压钳或者膜片钳放大器电路。当使用包含纳米孔的第一电路系统时，纳米孔用作“离子电流感测”纳米孔。第二电路系统(以下称为控制电路系统)包括定制电路系统，该定制电路系统控制跨被包含在第二电路系统内的纳米孔的场力的大小和方向。在各个实施例中，控制电路系统包括锁相环(PLL)或者某一其他周期性的电压控制波形。控制电路系统还具有来自第一电路系统的信息(例如测得的电流)的访问权限，该信息可以被用于反馈电压控制。在该配置中，向第一纳米孔应用感测电路系统，而向第二纳米孔应用被设计用于最佳跨孔电压控制的控制电路系统。可以随时进行在两种电路类型之间的切换。换句话说，可以向第二纳米孔应用传感器电路系统，而向第一纳米孔应用控制电路系统。通常，使用在一个纳米孔处的控制电路系统来影响分子穿过另一纳米孔的运动，从而使得能够通过使用相对的纳米孔的感测电路系统来对分子进行多次重读。在各个实施例中，通过在受控传递和感测期间在分子易位穿过纳米孔时使分子减慢，在两个不同的纳米孔处操作的控制电路系统和感测电路系统的组合可以被用来解决上面描述的障碍2。

可以使用示例两纳米孔设备来一次将单独的分子捕获到两个纳米孔中，并且使用感测电路来测量分子穿过一个纳米孔的易位。描述两孔设备的这种实施例可以包括：第一膜层，包括将第一腔室与第二腔室流体连接的第一纳米孔；以及第二膜层，包括将第二腔室流体地连接至第三腔室的第二纳米孔，其中第一纳米孔被连接在传感器电路系统内，该传感器电路系统跨第一纳米孔施加恒定电压，并且测量穿过第一纳米孔的电流，并且其中第二纳米孔被连接在控制电路系统内，该控制电路系统跨第二纳米孔施加动态电压。在备选实施例中，第一个孔被连接至控制电路系统，并且第二个孔被连接至感测电路系统。

参照每个纳米孔的第一电路系统，所包含的电路系统可以是膜片钳(patchclamp)放大器或者电压钳放大器中的一种。当电压被设置为恒定的时，第一电路系统的TIA跨纳米孔提供恒定的场力，其中穿过纳米孔的所测得的电流充当检测分子(诸如DNA、RNA、蛋白质)以及这些分子的任何组合(大分子)的存在和通过的感测信号。在这方面，TIA(膜片钳、电压钳)是被用于纳米孔试验的“感测电路”电路的示例。电压在感测期间被设置为恒定的，并且因此，无法直接控制纳米孔中的任何通过的分子，但是在场力影响的范围内在纳米孔传输之前、期间和之后施加对分子起作用的场力。在各个实施例中，膜片钳被设计用于最佳感测，而不是作为电压致动机构。

参照每个纳米孔的第二电路系统，针对DNA运动控制被优化的控制电路系统选项可以被实施在每个纳米孔处，并且可以将来自第一电路的测量值(例如测得的电流)用作对捕获到的分子的反馈运动控制的反馈信号。在各个实施例中，由控制电路系统施加的电压是依赖于来自第一电路的反馈信号的振荡电压信号。例如，当需要时，可以根据由传感器电路系统收集到的反馈数据，来调制由控制电路系统施加的电压。数据包括频率、幅度、相位、事件持续时间、数量以及与易位事件或者易位事件序列或者在易位事件内的模式(例如表现为在事件内的信号深度变化的序列特异性签名)有关的其他比较关系。作为示例，在各个实施例中，控制电路系统通过使用直流偏置的交流信号源来施加动态电压。动态电压可以由控制电路系统以可能在0.001Hz与100MHz之间的、较宽的频率范围和在0.001V与10V之间的、变化的幅度范围来施加。在其他实施例中，所施加的电压和频率可以在其他范围内。

在各个实施例中，由感测电路检测到的、测得的电流受由控制电路施加的电压变化的影响，例如因为电压变化引发在孔之间的任何共享电容，包括膜的电容，这些膜包括每个孔。因此，可以设计或者共同设计滤波器和估计器(包括扩展卡尔曼滤波器实施方式)，以估计电流的被叠加在感测信号上的、分子引起的变化。

本文还提供了用于确定分子(诸如带电的多肽、多核苷酸、磷脂、多糖和聚酮化合物中的一种或者另一种分子)的顺序的方法。对分子进行测序的方法包括：a)在上述实施例中的任何实施例中的设备的第一或者第二腔室中的一个中装载包括多核苷酸的样品，其中设备被连接至传感器电路系统(诸如电压钳系统或者膜片钳系统)，用于跨位于第一腔室与中间层之间的第一纳米孔提供第一电压，并且跨位于中间层与第二腔室之间的第二纳米孔提供第二电压；(b)设置初始第一电压和初始第二电压，使得多核苷酸移动穿过腔室，从而使多核苷酸位于成跨第一和第二纳米孔；(c)在受控条件下调整第一电压和第二电压(其中两个电压的大小不同)，使得多核苷酸沿一个方向并且以受控方式移动穿过第一和第二纳米孔；(d)在第一个孔或者第二个孔处从感测电路系统切换为控制电路系统，并且在所述孔处采用控制电路系统以仍然通过使用感测电路系统(“感测纳米孔”)来增强多核苷酸穿过另一个孔的受控传递；(e)标识多核苷酸中穿过感测纳米孔的每个核苷酸。

示例纳米孔设备

在各个实施例中，用于采用两纳米孔、一个传感器配置的示例纳米孔设备100是多腔室、两孔设备。参照图1，示例纳米孔设备100包括第一腔室105、第二腔室110和第三腔室115。在各个实施例中，第一腔室105位于盖170内，该盖170可以由绝缘材料(诸如玻璃)组成。在由绝缘材料(诸如玻璃)组成的绝缘层160的表面上产生第三腔室115。腔室由两个膜(120a和120b)隔开，在各个实施例中，这两个膜由选自若干选项的材料组成。在固态制造工艺中，膜材料可以是氮化硅、二氧化硅、氧化铝、石墨烯、这些的任何组合或者本领域中已知的任何其他固态材料。备选选择将是插入了生物纳米孔的聚合物膜。每个膜层120a和120b包括单独的纳米孔，以下称为第一纳米孔125和第二纳米孔130。第一纳米孔125可以是固态纳米孔、生物纳米孔或者场效应纳米孔晶体管(FENT)。第二纳米孔130可以是那些系统中的任何系统，或者甚至可以是更大的微孔(μm级)。第一纳米孔125与第一腔室105流体连接，并且第二纳米孔130与第三腔室115流体连接。

图1对第一腔室、第二腔室和第三腔室的描绘作为一个示例被示出，而不表示例如，第一腔室位于第二腔室或者第三腔室之上，反之亦然。两个纳米孔125和130可以被布置在任何位置中，只要它们允许腔室之间的流体连通。仍然，在一个方面中，纳米孔如在图1中图示的那样对准。

在各个实施例中，用于采用两纳米孔、一个传感器配置的示例纳米孔设备100是两室、两孔设备。作为示例，两腔室、两孔设备可以包括分别与第一纳米孔125和第二纳米孔130流体连通的第一腔室和第二腔室。多个层可以将两个腔室隔开。例如，多个层包括：第一层；第二层；以及被设置在第一和第二层之间的导电中间层。在这两个腔室中，两孔设备，第一纳米孔125和第二纳米孔130可以通过位于导电中间层内的通道被连接至彼此。通道是指实现在第一纳米孔125与第二纳米孔130之间的流体流动的任何流体路径。

示例两孔、一个传感器

在本公开中，使用包括TIA(诸如电压钳或者膜片钳)的传感器电路系统来施加恒定电压，并且检测跨纳米孔的离子变化。此外，在纳米孔处使用控制电路系统来控制分子的运动。图2A至图2B分别描绘了根据两个实施例的包含示例纳米孔设备的第一纳米孔125和第二纳米孔130的示例电路系统。

具体地，图2A描绘了包括第一腔室105、第二腔室110和第三腔室115的示例多室、两孔设备100(见图1)的电路系统。在该实施例中，当分子的至少一部分驻留在第二腔室110内时，可以发生对分子的感测和控制。此外，图2B描绘了包括第一腔室105、第二腔室110和位于第一纳米孔125与第二纳米孔130之间的通道150的两腔室、两孔设备100。在该实施方案中，当分子的至少一部分驻留在通道150内时，可以发生对分子的感测和控制。

虽然该实施例描绘了两个纳米孔，但是电路系统设计可以被应用于多于两个的纳米孔。此外，如在图2A和图2B中示出的实施例中描绘的，示例电路系统包括包含第一纳米孔125的传感器电路系统225和包含第二纳米孔130的控制电路系统240。在其他实施方式中，传感器电路系统225反而可以包含第二纳米孔130，而控制电路系统240包含第一纳米孔125。在另一些实施例中，第一纳米孔125和第二纳米孔130中的每一个纳米孔可以被包含在可在传感器电路系统与控制电路系统之间切换的电路系统内。因此，可以在纳米孔125和130处执行感测并且控制分子。

传感器电路系统

如在图2A和图2B中示出的，传感器电路系统225可以是电压钳或者膜片钳中的一种，该电压钳或者膜片钳：1)跨第二纳米孔130施加静态电压，并且2)在分子穿过第二纳米孔130时捕获传感器数据。

纳米孔设备可以包括针对传感器电路系统225的第一纳米孔125和第二纳米孔130的公共电压。例如，在图2A中示出的实施例中，纳米孔设备的中腔室110可以用作第一纳米孔125和第二纳米孔130的公共电压。如在图2B中示出的，两腔室、两孔设备可以包括可以用作公共电压的中间导电层280。在各个实施例中，通过位于在两个纳米孔125和130之间的两个膜层120a和120b内的金属电极来实现中腔室110的电气连接。在一些实施例中，通过与在中腔室110的外部的金属电极的物理连接来实现电气连接。公共电压电位可以是指由外部系统设置的参考电压。在一些实施例中，公共电压是针对第一纳米孔125和第二纳米孔130的公共接地。

传感器电路系统225还可以被配置为使得能够捕获与跨第二纳米孔130易位的分子(例如多核苷酸，诸如DNA)对应的传感器数据。在一个方面中，传感器电路系统225还包括用于捕获传感器数据的一个或者多个传感器。在一个方面中，传感器包括一对电极，该一对电极被放置在第二纳米孔130的任何一侧以在分子，特别是多核苷酸易位穿过时测量跨第二纳米孔130的离子电流。

跨第二纳米孔130的、测得的离子电流依赖于第二纳米孔130的几何形状。例如，第二纳米孔130在传感器电路系统225内具有电阻R2。该电阻R2依赖于第二纳米孔130的几何形状(例如直径)。电阻R2表示由传感器电路系统225测量以感测分子穿过第二纳米孔130的易位的动态孔导率。

在一些方面中，传感器被配置为在第二纳米孔130处形成隧道间隙，该隧道间隙允许在易位穿过隧道间隙时检测分子。当分子移动穿过隧道间隙时，传感器然后能够标识分子的单独的成分(例如核苷酸)。在一些实施例中，利用与每个核苷酸碱基形成不同的非共价键的试剂来使传感器功能化。利用功能化传感器的隧道感测被称为“识别隧道”。通过使用具有识别隧道的扫描隧道显微镜(STM)，可以标识短DNA低聚物中侧翼为其他碱基的DNA碱基。识别隧道还可以提供“通用阅读器”，该通用阅读器被设计为以唯一的定向与四个DNA碱基(A、C、G、T)中的每一个氢键，并且还与由于表观遗传修饰而自然存在的碱基—5-甲基胞嘧啶(mC)氢键。

控制电路系统

控制电路系统控制同时被捕获到第一和第二纳米孔中的分子(例如DNA多核苷酸、蛋白质等)的运动。通常，控制电路系统施加与由传感器电路系统在第二纳米孔130处所施加的电压引起的场力相反的方向场力。控制电路系统不包含电压钳电路或者膜片钳电路。相反，控制电路系统利用电压控制元件。这些电压控制元件针对控制提供性能，该性能优于利用电压钳放大器电路系统或者膜片钳放大器电路系统(例如传感器电路系统)所可能达到的性能。具体地，这种控制元件可以提供各种各样的波形，这些各种各样的波形可以被具体地配置为精确地控制分子在两个纳米孔内的运动。此外，由传感器电路系统在第二纳米孔130处检测到的电流测量值可以实时地用作控制电路系统的控制元件的反馈。

参照图2A或者图2B中的控制电路系统240，控制电路系统240可以包括用于控制电流和电压的各种方式。控制方法可以包括但不限于：单独地或者组合地起作用的压控放大器(VCA)、数字控制放大器(DCA)、脉冲宽度调制器(PWM)、幅度控制或者锁相环(PLL)。通常，控制电路系统240：1)跨第一纳米孔125施加动态电压，并且2)控制分子穿过第二纳米孔130的运动。控制电路系统240跨第一纳米孔125施加动态电压。施加的动态电压对分子产生力，该力与由传感器电路系统225产生的静力所产生的力相反，具有小于朝着感测孔的分子运动的静力强度的相反力强度，或者具有大于朝着控制孔的分子运动的静力强度的相反力强度。因此，改变动态电压使得能够控制分子的运动方向以及分子穿过第二纳米孔130的运动速率(例如速度)。

控制电路系统还可以被配置为提供与直流(DC)源或者交流(AC)源相关联的电场。在一种应用中，通过AC电场具有相关联的频率的方式来施加驱动力可以被用于控制目标在系统的纳米孔中的一个或者多个纳米孔处、穿过该一个或者多个纳米孔或者在该一个或者多个纳米孔之间的位置、速度和/或加速度。

控制电路系统可以接收可以被用于施加动态电压的反馈数据。作为示例，反馈数据可以由传感器电路系统225检测(例如穿过被包含在传感器电路系统225中的纳米孔的、测得的电流)。在一个实施例中，反馈数据可以是分子反复来回地穿过第二纳米孔130的频率(例如周期)，该频率是从由传感器电路系统225捕获到的传感器数据导出的。因此，施加的动态电压可以确保分子继续来回地穿过感测电路系统225所包含的第二纳米孔130。

为了产生动态电压，控制电路系统240的PLL接收反馈数据，该反馈数据可以与由感测电路系统225检测到的、测得的电流对应。可以对测得的电流进行滤波，并且将其与参考信号相比较，以产生误差信号(例如参考信号与频率数据之间的差值)。此外，可以使用误差信号的其他滤过的版本来实时调整控制电压信号。除了比例误差项外，误差信号的一阶和高阶导数和/或误差信号的(多个)积分还可以被用于反馈计算。可以基于在先前的实验中完成的数据收集和学习而已知参考信号是先验，或者可以在实验期间通过自适应或者实时学习过程或者其组合来产生参考信号。

在各个实施例中，如果分子是DNA分子，则示例参考信号可以是DNA信号内与在双链DNA(dsDNA)支架上的已知站点处被键合的已知序列特异性有效载荷相匹配的衰减脉冲，其中相对于没有有效载荷的dsDNA信号水平，每个有效载荷在其穿过纳米孔时产生脉冲。在那个示例中，所期望的参考脉冲频率可以与穿过纳米孔的已知DNA速率对应。另一参考信号可以基于反馈数据中、测得的信号的期望变化率对应，即，与使对在测得的信号内的阶跃变化事件的检测加快或者减慢对应，无论是否已知先验存在与否。另一参考信号基于频率数据的期望相位，该期望相位可以被用于锁相环控制器电路。

控制电路系统240可以包括反馈控制器，该反馈控制器被配置为在前馈或者反馈方向上相对于该参考信号来稳定控制电压信号。在各个实施例中，可以利用整个系统的足够详细的模型(例如通过使用系统标识工具而标识的)来设计并且实施反馈和前馈控制系统。反馈促使误差为零(例如使得测得的信号将与定义的参考信号相匹配)。即使存在不确定性，前馈也帮助进行参照追踪和干扰抑制以提高整个系统性能。可以在频域(例如频率)或者时域(例如周期)中设计反馈或者前馈信号。

在各个实施例(诸如在图2A和2B中描绘的那些实施例)中，处理参考信号，以确定反馈数据的相位。相位检测器的输出电压被用于控制压控振荡器(VCO)，使得由VCO输出的电压信号的相位与参考信号的相位之间的相位差保持恒定，从而使其成为负反馈系统。在各个实施例中，如在图2A/2B中描绘的，反馈环路包含分数N型合成器，诸如除以N的函数。这确保了来自VCO的输出是参考频率的合理倍数，并且可以实现在指定的频率分辨率下的比较。

压控放大器(VCA)基于幅度控制来放大从PLL的输出的电压。VCA提供对被施加跨第一纳米孔125的峰值电压的控制。第一纳米孔125具有依赖于第一纳米孔125的几何形状(例如直径)的电阻R1。该电阻R1表示充当PLL和VCA输出的负荷的动态孔隙导率。

总而言之，包含第一纳米孔125的控制电路系统240用作电磁力电路。换句话说，跨第一纳米孔125施加的电压产生电磁场力，该电磁场力与位于中腔室110中的膜层120a和120b之间的分子相互作用。通过相对于跨第二纳米孔130的、施加的电压的大小选择跨第一纳米孔125的、施加的电压的大小，施加的力沿任何方向(例如朝着第一纳米管125，而远离第二纳米孔130，或者朝着第二纳米孔130，而远离第一纳米孔125)引导分子。在控制期间，设置电压极性，以从孔之间的中腔室拉出DNA，并且相对于由感测电路系统施加的电压调整控制电路系统的电压幅度以实现DNA沿任何方向的净运动。因此，施加改变与分子相互作用的电磁场力的动态电压实现了分子穿过第二纳米孔130的反复的来回运动。

在各个实施例中，控制电路系统240通过使用直流(DC)偏置的AC信号源来跨第一纳米孔125采用周期性的电压控制机构。该信号源可以调谐使得能够动态地调整施加的电压和在第一纳米孔125处的所产生的电场/力的至少两个参数，：

1)信号源的幅度(或者增益)，以及

2)信号源的周期(或者频率)。

输入电压信号的其他参数(诸如占空比、波形(正弦波、方波、锯齿波)和停止周期)也可以由信号源应用。在各个实施例中，信号源可以是单个设备，诸如AD9102数模转换器和波形发生器。这种设备可以很容易地产生较宽范围(例如0.001Hz至100MHz的频率范围)的波形，同时控制：增益、周期、占空比和波形。在一些实施例中，如在图2A/2B中描绘的，可以通过采用可变频率输出锁相环(PLL)(或者其他时钟发生器)，来实现输入电压信号的较宽频率范围的波形。可以与可变增益放大器串联地放置PLL。PLL可以是固定频率的或者可以根据特定范围(例如8kHz至250MHz，参见：IDT8T49N1012)可变。在各个实施例中，多个PLL可以被串联地包括在控制电路系统240中，以实现更宽的频率范围。

可切换的感测和控制电路系统

在各个实施例中，传感器和控制电路系统选项在两个孔中的每个孔处可用。图3描绘了根据一个实施例的示例两纳米孔设备，该示例两纳米孔设备具有针对每个纳米孔的感测电路系统225和控制电路系统240选项以及在针对每个孔的两个选项之间的开关310。具体地，第一纳米孔125被包含在第一总体电路系统350A中，该第一总体电路系统350A包括感测电路系统225A和控制电路系统240A的第一集合。此外，第二纳米孔130被包含在第二总体电路系统350B中，该第二总体电路系统350B包括感测电路系统225B和控制电路系统240B的第二集合。每个总体电路系统350包括开关310A和310B，使得能够在每个总体电路系统350的感测电路系统225与控制电路系统240之间进行切换。在一个实施例中，设置每个开关310可以使得能够跨第一纳米孔125进行感测并且在第二纳米孔130处进行控制，反之亦然。在各个实施例中，可以与在图3中所显示的不同地体现开关310A和310B。例如，可以在感测电路系统225与控制电路系统240之间共享某些硬件组件，并且因此，每个开关310可以被配置成使得在需要时适当地启用每个电路系统的功能(包括必需的硬件组件)。下面在图4A和图4B中更详细地描述这些实施例。

在这些实施例中，第一纳米孔125和第二纳米孔130中的每一个纳米孔可以被包含在总体电路系统350中，该总体电路系统350具有以下双重作用：1)施加动态电压以控制分子的运动，以及2)检测与跨纳米孔的易位事件对应的离子测量值。每个总体电路系统350的开关310A和310B被用于设置每个总体电路系统350A和350B的作用。

如在图3中示出的，每个感测电路系统225可以提供传感器数据，而每个控制电路系统240接收反馈数据。来自每个感测电路系统225的传感器数据可以由配置选择和信号多路复用器接收并且处理。在各个实施例中，多路复用器可以从每个感测电路系统225接收传感器数据并且对其进行过滤。例如，多路复用器从每个传感器数据中过滤掉噪声。多路复用器将传感器数据作为反馈数据引导至相对的总体电路系统350。例如，如果传感器数据是由第一总体电路系统350A的感测电路系统225A生成的，则多路复用器将传感器数据作为反馈数据引导至第二总体电路系统350B的控制电路系统240B。

现在参照图4A和图4B，图4A和图4B分别描绘了根据一个实施例的、处于第一和第二配置的示例两纳米孔设备。在第一和第二配置中，开关310控制与一个感测电路系统225和一个控制电路系统240的连接性。具体地，以白框示出了闭合电路系统(以及对应的传感器数据和反馈数据)，而以阴影框描绘了未连接的电路系统(例如开路)以及对应的传感器数据和反馈数据。

参照图4A，两纳米孔设备的第一配置是指第一开关310A连接第一总体电路系统350A的感测电路系统225A并且第二开关310B连接第二总体电路系统350B的控制电路系统240B。因此，第一总体电路系统350A的感测电路系统225A被用于检测分子穿过第一纳米孔125的易位。此外，第二总体电路系统350B的控制电路系统240B被用于控制分子的运动。

参照图4B，两纳米孔设备的第二配置是指第一开关310A连接至第一总体电路系统350A的控制电路系统240A并且第二开关310B连接第二总体电路系统350B的感测电路系统225B。因此，第一总体电路系统350A的控制电路系统240A被用于控制分子的运动，而第二总体电路系统350B的感测电路系统被用于检测分子穿过第二纳米孔130的易位。

在各个实施例中，可以使两纳米孔设备处于其他配置。例如，第三配置包括：分别通过开关310A和310B来连接两个感测电路系统225A和225B。因此，由感测电路系统225A和225B跨其相应的纳米孔125和130施加的静态电压可以被用于通过纳米孔中的一个纳米孔来将分子引入中腔室110或者引入位于两个纳米孔之间的通道150。在各个实施例中，在最初将分子装载到两纳米孔设备的腔室(例如第一腔室105)中之后实施两纳米孔设备的第三配置。

作为另一示例，其他配置包括：分别通过开关310A和310B来连接两个控制电路系统240A和240B。可以结合感测穿过纳米孔的分子易位的其他方法来利用该配置。作为示例，可以实施光学辅助传感器以光学地使可以被光学地标记的分子成像。因此，该其他配置中的两个控制电路系统240A和240B可以实现对穿过一个或者两个纳米孔的分子运动的更好的控制。

两孔、一个传感器的操作

通常，可以在两孔、一个传感器设备中同时采用如在图2A/2B中示出的控制电路系统240和传感器电路系统225或者如在图3/4A/4B中示出的多个控制电路系统240A/240B和多个传感器电路系统225A/225B以控制分子(诸如DNA片段)的运动，以便进行感测和数据采集。虽然后续描述涉及处于第二配置状态(例如感测电路系统225B包含第二纳米孔130并且控制电路系统240A包含第一纳米孔125)的两纳米孔设备，但是该描述类似地可以被应用于其他配置状态(例如第一配置状态)。

例如，在图2A和图2B中描绘的两孔设备中，控制电路系统240跨第一纳米孔125施加动态地改变的电压，该动态地改变的电压产生在方向上与由传感器电路系统225跨第二纳米孔130所施加的静态电压所产生的力相反的力，具有引起分子沿任何方向的受控运动的动态幅度。具体地，由控制电路系统240跨第一纳米孔125施加的电压可以通过产生变化的场力强度来引导分子的运动，这些变化的场力强度的大小大于、等于或者小于从由传感器电路系统225施加跨第二纳米孔130的电压导出的静态力。因此，通过传感器电路225将第二纳米孔130置于第二纳米孔130中。因此，相对于在第二纳米孔130处的静态场力动态地调整在第一纳米孔125处的电压场力，这使得能够控制分子的净运动方向以及位于两个纳米孔125和130之间的分子在中腔室110或者通道150中的运动速率(例如速度)。

在相关的示例中，在图2A和图2B中描绘的两孔设备中，控制电路系统240通过使用具有相关联的AC频率的AC电场来施加驱动力。对AC频率(或者施加驱动力的AC电场的另一方面)的控制或者选择可以基于来自传感器电路系统225的信息。例如，频率(例如目标来回地穿过纳米孔的频率)、信号的幅度、信号的相位、事件持续时间(例如与在孔处的目标运动相关联)、目标的数量和/或来自传感器电路系统225的电信号的任何其他合适的特征可以被用于动态地调整施加控制电路系统240的驱动力的AC电场的各个方面。因此，来自AC源在一个纳米孔(例如第二纳米孔130)处的驱动力可以使得能够控制分子的净运动方向以及位于纳米孔125、130之间的分子的运动速率(例如速度)。

具体地，由控制电路系统240施加的动态电压可以具有与由传感器电路系统225收集到的传感器数据中的相位相比较，发生偏移的相位。因此，当分子沿第一方向穿过第二纳米孔130时，施加的动态电压发生改变，使得由动态电压产生的力与分子的运动方向相反。然后，分子改变方向并且沿第二方向(例如第一方向的相反方向)穿过第二纳米孔130。此处，动态电压再次发生改变以与分子的第二运动方向相反。可以重复该过程，以使分子能够来回地穿过第二纳米孔130，直到获得分子的片段的充分的测量值。

通过相对于在第二纳米孔130处的静态力，使在第一纳米孔125处的更小的或者更大的力振荡，传感器电路系统225B可以通过反复使分子穿过第二纳米孔130来多次感测分子的片段。这样做可以改善与分子跨第二纳米孔130的易位对应的、检测到的离子变化的信号，该信号可用于各种信号处理目的，例如改进对分子(诸如DNA)的测序。分子(诸如多核苷酸)反复来回地穿过第二纳米孔130被称为多核苷酸的“牙线剔除(flossing)”。具体地，DNA片段(或者DNA片段的一部分)穿过第二纳米孔130的牙线剔除响应于施加的力(例如从施加的电压导出的电力)，并且还可以包括与DNA片段穿过第二纳米孔130的易位的速率对应的频率数据。作为示例，频率数据是开始于初始位置，沿第一方向跨第二纳米孔130易位(例如进入中间室110或者离开中间室110)，沿与第一方向相反的方向跨第二纳米孔130向后易位，并且返回至初始位置的单个核苷酸碱基的周期。

图5描绘了根据实施例的对分子(诸如多核苷酸)进行测序的流程。具体地，将包括多核苷酸的样品装载到纳米孔设备100的第一腔室105中(505)。在一些实施例中，可以将多核苷酸装载到不同的腔室中(例如在图2A中示出的第三腔室115或者图2B中的第二腔室110)。两纳米孔设备跨第一纳米孔125施加第一电压(510)，并且跨第二纳米孔130施加第二电压(510)。在各个实施例中，可以通过使两纳米孔设备处于第三配置状态(例如分别将第一纳米孔125和第二纳米孔130包含在感测电路系统225A和225B中)来实现这一点。因此，第一和第二电压分别由感测电路系统225施加。多核苷酸从第一腔室105开始易位，并且穿过第一纳米孔125(515)。具体地，第一纳米孔125的传感器电路系统225A可以跨第一纳米孔125施加恒定电压，该恒定电压产生将多核苷酸引过第一纳米孔125的电力。传感器电路系统225可以被配置为测量穿过第一纳米孔125的离子电流的变化。因此，当多核苷酸易位穿过第一纳米孔125时，传感器电路系统基于检测到的离子电流变化来检测易位事件。此外，多核苷酸由于传感器电路系统225B施加的电压而易位穿过第二纳米孔130(520)。

两纳米孔设备可以切换到与分子的运动方向相反的不同配置。例如，两纳米孔设备根据分子的方向运动来从第三配置状态切换为第一配置状态或者第二配置状态。如果分子在最初被装载到第一腔室105中，则分子在方向上从第一腔室105离开并且朝着第二腔室110或者第三腔室115移动。因此，为了与分子的运动相反，两纳米孔设备可以从第三配置切换为第一配置状态(例如参见图4A)。在一些实施例中，如果分子在最初被装载到底部腔室(例如图2A中的第三腔室115或者图2B中的第二腔室110)中，则分子在方向上朝着第一腔室105移动。因此，为了与分子的运动相反，两纳米孔设备可以从第三配置切换为第二配置状态(例如参见图4B)。

后续描述涉及将两纳米孔设备切换为第一配置状态，但是也可以被应用于切换为第二配置状态。在各个实施例中，调整由包含第一纳米孔125的电路系统施加的第一电压(525)。具体地，设置感测电路系统225A的极性，使得其与分子的运动相反。例如，可以使感测电路系统225A的极性从处于第三配置状态的第一极性反转为处于第一配置状态的第一极性的反极性。此外，还调整由包含第二纳米孔130的电路系统施加的第二电压(530)。具体地，响应于检测到多核苷酸已经易位穿过第一纳米孔125，第二总体电路系统350B的控制电路系统240B跨第二纳米孔130施加经调整的第二电压(320)。通常，由控制电路系统240施加的经调整的第二电压的大小动态地发生改变(例如振荡电压)，使得由于经调整的第二电压而引起的电力可以与由经过调整的第一电压引起的静态力相反。由控制电路系统240施加的第二电压具有特定的波形(例如以特定的频率改变幅度/大小)，使得多核苷酸类似地可以来回振荡(例如进行牙线剔除)穿过第一纳米孔125。由于多核苷酸振荡，因此，传感器电路系统225A可以检测穿过第一纳米孔125的离子电流变化，该第一纳米孔125与多核苷酸的核苷酸碱基的易位对应。当多核苷酸来回地进行牙线剔除穿过第一纳米孔125时，可以多次读取每个核苷酸碱基，从而使得能够更准确地标识多核苷酸中的单独的核苷酸(535)。

当已经充分地读取了多核苷酸中的单个核苷酸碱基时，可以通过控制电路系统240B来应用处于施加的第二电压的多核苷酸退出状态以允许DNA片段增量。换句话说，可以临时调整第二电压以允许随后的核苷酸碱基对易位穿过第一纳米孔125，在这点上，可以恢复第二电压以使随后的核苷酸碱基对来回地进行牙线剔除穿过第一纳米孔125。可以根据与由传感器电路系统225A检测到的离子电流测量值对应的频率信息，来定制由控制电路系统240B跨第二纳米孔130所施加的第二电压的大小和频率。

在各个实施例中，自动化和功能性电路系统(例如通过使用状态机或者与反馈控制一起机器学习算法)可以控制传感器电路系统225A和控制电路系统240B两者，以连续地监测感测到的数据。因此，可以读取一段DNA，以获得最佳性能。例如，如果没有对与穿过第一纳米孔125的DNA易位事件对应的离子电流进行解析，则控制电路系统240可以跨第二纳米孔130执行施加的电压的逐步增加。这样做增加了与由传感器电路系统225施加的静态力相反的力，从而在DNA片段易位穿过第一纳米孔125时减慢了DNA片段的运动。这针对跨第一纳米孔125的每次DNA易位提高信噪比，直到实现期望的性能(例如信号分辨率)。

使DNA片段进行牙线剔除并且通过使用感测电路系统来多次感测片段使得能够将信号误差降低到可接受的水平。使信号对准可以被用于以可接受的准确度实现共有序列。在一些实施例中，与多次DNA易位对应的多个读数可以被用于产生共有信号，该共有信号随后可以被用于标识核苷酸碱基对。

其他注意事项

虽然上面描述了两孔设备和利用两孔设备实施的方法的实施例、变化和示例，但是所描述的(多个)发明的备选实施例、变化和示例可以涉及非两孔设备。例如，在变化中，第二腔室110(和第二腔室110的、描述的变化)可以是单孔设备的导电通道，其中单孔设备具有控制电路系统(例如通过栅极电压的方式)、感测电路系统(例如与源极到漏极电流流动有关)，具有在控制电路系统与感测电路系统之间进行切换的能力。可以利用光刻工艺、钻孔工艺或者产生穿过材料层的通道或者腔室的任何其他合适的工艺来制造这种单孔设备。

应该理解，虽然已经结合上述实施例描述了本发明，但是前述描述和示例旨在说明而非限制本发明的范围。在本发明的范围内的其他方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员而言将是清楚的。

Claims

1.一种两孔设备，包括：

上腔室、中腔室和下腔室，其中所述上腔室通过第一纳米孔与所述中腔室连通，并且其中所述中腔室通过第二纳米孔与所述下腔室连通，

针对所述第一纳米孔和第二纳米孔中的每一个纳米孔的感测电路系统和控制电路系统，

每个感测电路系统被配置为跨对应的纳米孔施加恒定电压，并且还被配置为测量穿过所述对应的纳米孔的感测电流，

每个控制电路系统，被配置为跨对应的纳米孔施加动态电压，所施加的动态电压确定带电聚合物跨所述第一纳米孔和所述第二纳米孔的受控运动，以及

其中所述感测电流是在所述受控运动期间从所述带电聚合物导出的。

2.根据权利要求1所述的两孔设备，其中每个传感器电路系统包括跨阻放大器。

3.根据权利要求2所述的两孔设备，其中所述跨阻放大器是膜片钳放大器或者电压钳放大器中的一种。

4.根据权利要求1至3中的任一项所述的两孔设备，其中每个控制电路系统包括锁相环(PLL)。

5.根据权利要求4所述的两孔设备，其中所述第一纳米孔的所述控制电路系统被配置为：基于来自所述第二纳米孔的所述传感器电路系统的反馈来产生振荡电压输出。

6.根据权利要求5所述的两孔设备，其中所述振荡电压输出的频率与所述感测电流的所述频率之间的相位差随着时间的推移而被固定。

7.根据权利要求5至6中任一项所述的两孔设备，其中所述振荡电压输出被提供至跨所述第二纳米孔施加所述动态电压的压控放大器(VCA)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的两孔设备，其中所述中腔室被电耦合为针对所述第一纳米孔或者第二纳米孔中的至少一个纳米孔的所述传感器电路系统和所述控制电路系统两者的电返回路径。

9.一种两孔设备，包括：

上腔室和下腔室，其中所述上腔室通过第一纳米孔和第二纳米孔与所述下腔室连通，

每个控制电路系统被配置为跨对应的纳米孔施加动态电压，所施加的动态电压确定带电聚合物跨所述第一纳米孔和所述第二纳米孔的受控运动，以及

10.根据权利要求9所述的两孔设备，其中所述第一纳米孔和所述第二纳米孔通过通道被连接。

11.根据权利要求9至10中任一项所述的两孔设备，其中所述设备还包括：包括所述第一纳米孔的第一膜层、包括所述第二纳米孔的第二膜层、以及在所述第一膜层与所述第二膜层之间的导电中间层。

12.根据权利要求11所述的两孔设备，其中所述导电中间层被电耦合为针对所述第一纳米孔或者第二纳米孔中的至少一个纳米孔的所述传感器电路系统和所述控制电路系统两者的电返回路径。

13.一种用于对多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：

将包括所述多核苷酸的样品装载到纳米孔设备的第一腔室中，通过使用第一纳米孔的感测电路跨所述第一纳米孔施加第一电压，来使所述多核苷酸易位穿过所述第一纳米孔；

通过使用第二纳米孔的感测电路跨所述第二纳米孔施加第二电压，来使所述多核苷酸易位穿过所述第二纳米孔；

通过使由所述第一纳米孔的所述感测电路施加的所述第一电压的极性反转，来调整跨所述第一纳米孔施加的所述第一电压；

通过将所述第二纳米孔的所述感测电路切换为控制电路，来调整跨所述第二纳米孔的所述第二电压，其中经调整的第二电压产生与由所述经调整的第一电压产生的电力相反的电力；以及

标识所述多核苷酸中的核苷酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述经调整的第二电压是振荡控制电路电压，并且其中标识所述多核苷酸中的核苷酸包括：

对于所施加的振荡电压的初始振荡，检测跨所述第一纳米孔的离子电流的第一变化，所述第一变化与所述多核苷酸中的核苷酸的第一次易位对应；以及

对于所施加的振荡电压的后续振荡，检测跨所述第一纳米孔的离子电流的第二变化，所述第二变化与所述多核苷酸中的所述核苷酸的第二次易位对应。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述经调整的第二电压基于由所述第一纳米孔的所述感测电路捕获到的反馈信号而被施加。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述反馈信号是跨所述第一纳米孔测得的电流，所述电流是跨所述第一纳米孔的多核苷酸运动的测量值。

17.根据权利要求16所述的方法，其中多核苷酸运动的所述测量值是多核苷酸位置、速度或者加速度中的一个的测量值。

18.根据权利要求16至17中任一项所述的方法，其中多核苷酸运动的所述测量值至少通过使用卡尔曼滤波器而被确定。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述反馈信号是通过使用前馈或者反馈中的一种在频域或者时域中被设计的。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述反馈信号是通过使用被共同设计的估计器和控制器被设计的。

21.根据权利要求13至18中的任一项所述的方法，其中所述经调整的第二电压通过使用直流偏置的交流信号源而被施加。

22.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述经调整的第二电压以在0.001Hz与100MHz之间的频率范围和在0.001mV与10V之间的幅度范围被施加。