JP2014520568A - ナノ細孔ポリヌクレオチド配列決定、その他の用途のための補償型パッチクランプ増幅器 - Google Patents

Abstract

ポリヌクレオチド配列決定、その他の用途のための補償型パッチクランプシステム

Description

（補助声明）
本発明は、全米科学財団キャリア認可番号ＥＣＣＳ−０８４５７６６からの補助金を部分的に用いてなされた。米国連邦政府は本発明に対して特定の権利を有する。

（他の出願との関係）
本願は、２０１１年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／５７２，８２９号「Ａ ＳＷＩＴＣＨＥＤ ＶＯＬＴＡＧＥ ＰＡＴＣＨ−ＣＬＡＭＰ ＡＭＰＬＩＦＩＥＲ ＦＯＲ ＤＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＯＮ ＳＯＬＩＤ−ＳＴＡＴＥ ＮＡＮＯＰＯＲＥ」の優先権を主張する。係る出願およびその中で引用された文献を本願において援用する。

本願にて開示される主題は、ＤＮＡシークエンサーにおいて使用するための、かつ、ポリヌクレオチドにおいて個々のヌクレオチドを検出し定量化するための適切な電子装置およびシステムに関する。より詳細には、本発明は、補償型パッチクランプ増幅器およびＤＮＡ配列決定システムおよび方法ならびに類似する用途におけるそれらの使用に関する。

ＤＮＡは、スイスの科学者であるフリードリッヒ・ミーシャーによって１８６９年に最初に細胞から隔離された。１９４４年に、デオキシリボ核酸が生細胞において極小の遺伝子の記録を有する化学物質であることが発見された。１９５３年に、イギリスのケンブリッジ大学に勤めていたアメリカの科学者であるジェームズ・ワトソンおよびイギリスの科学者であるフランシス・クリックがＤＮＡの現在有名な「二重らせん」分子構造を発見し、彼らはこれによって１９６２年ノーベル賞を受賞した。

ナノ細孔（ナノポア）配列決定（シークエンシング）において、配列決定されるべきＤＮＡ鎖は、極小の細孔を有しイオン流体で満たされたセンサーを通過し、この間、電圧がセンサーに発生する。結果として生じるセンサー電流はＤＮＡ鎖の構造に依る。センサー電流を分析することによって、ＤＮＡ鎖を配列決定することができる。ナノ細孔配列決定の理論的枠組みはよく理解されているが、従来技術のナノ細孔配列決定システムおよび装置は完全には開発されていない。ナノ細孔配列決定電流は非常に小さく、現実的なナノ細孔配列決定システムは非常に高い利得（ゲイン）を必要とする。非常に高い利得は分布抵抗およびキャパシタンスならびに内部および外部雑音によって生じる読み取りの不安定さを生じ易い。

これらの問題にも関わらず、ナノ細孔配列決定の有望性が、ポリヌクレオチドにおいて個々のヌクレオチドを検出および定量化することができる電子装置およびシステムの開発を動機付けている。実際にはナノ細孔センサーは、シス形およびトランス形チャンバと呼ばれる２つのチャンバ有する。これらのチャンバは、緩衝されたイオン伝導溶液（例えば、ＫＣ１）で満たされ、電圧がナノ細孔チャンバに印加される。結果として、シス形チャンバに最初に置かれた荷電されたＤＮＡはトランス形に向かって動き始める。それがナノ細孔を横切る際、イオン電流は瞬間的に減少する。イオン電流は典型的には数十〜数百ピコアンペアの範囲にある。結果として生じる電流は（電荷／正味荷電）ナノ細孔におけるイオンの数と、ナノ細孔寸法とに依る。イオンの数および電荷は、ＤＮＡヌクレオチド鎖がナノ細孔を通過する（またはナノ細孔開口部にアプローチする）結果であり得る。結果として生じる電流を監視することによってＤＮＡヌクレオチドを配列決定することができる。

超低電流変動を正確に測定するには、非常に特殊な増幅器が必要であり、これは本明細書においてパッチクランプと呼ばれる。実用的なパッチクランプは、入力ヘッドステージ電流／電圧コンバータと、このヘッドステージから電圧を増幅する差動増幅器（差動アンプ）とを含む。パッチクランプは非常に困難な設計要件を満たさなければならない。第１に、ヘッドステージの入力オフセット電圧（Ｖ_ＯＳ）は最小限に抑えなければならない。利用可能な最高の高利得増幅器でさえ、いくらかのＶ_ＯＳを有する。Ｖ_ＯＳの原因はランダムプロセスミスマッチおよび不可避の体系的変化を含む。Ｖ_ＯＳがどのようでも、それは差動増幅器によって増幅される。実際には、Ｖ_ＯＳは出力ダイナミックレンジを制限する。

第２に、パッチクランプ入力寄生キャパシタンスはヘッドステージ飽和を防ぐために減少されなければならない。コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤがナノ細孔センサーに印加されて動作電流が生成されるとき、その電圧は抵抗を介してオペアンプの反転入力に実際に印加される。よってコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化は不可避の漂遊システムキャパシタンスによって時間的に遅れる。このことは反転入力と反転入力との間の過渡差を生じ、このことは寄生キャパシタンスが荷電され、反転入力が再びＶ_ＣＭＤと等しくなるまで出力飽和をもたらす。この間隔（「デッドタイム」）の間、入ってくるデータの全てが失われる。Ｖ_ＯＳを最小限にして入力寄生キャパシタンスおよび抵抗を補償することは、ナノ細孔配列決定における主な設計問題である。

現代のパッチクランプはむしろ特殊化した高利得差動オペアンプトランスインピーダンス増幅器であり、これは抵抗帰還または容量帰還を用いる。図１（ａ）および１（ｂ）はこれらの２つの基本的パッチクランプ・アーキテクチャを示す。どのようにしても、基本的パッチクランプは２つの部品を備え、これらは、増幅器１０と、抵抗１２（図１（ａ）に記載の抵抗帰還パッチクランプ回路６を参照）もしくはリセットスイッチ１６と並列のコンデンサ１４（図１（ｂ）に記載の容量帰還パッチクランプ回路を参照）のいずれか備える補償システムである。両方の回路においてコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤが増幅器１０の非反転入力１７に印加され、一方、ナノ細孔センサー３０２（例えば図６を参照）に亘る電位が反転入力１８に印加される。

図１（ａ）において、反転入力１８上の入力電流Ｉ_ｉｎが帰還抵抗１２（Ｒ_ｆ）の値に従って増幅される。結果として生じるトランスインピーダンス利得は単にＶ_ＯＵＴ＝Ｒ_ｆ×Ｉ_ｉｎである。図１（ｂ）において、容量帰還は積分回路として動作し、よって増幅器１０は実際には微分回路によって追従されなければならない。

理論的には基本的なパッチクランプ６および８は健全である。実際には、物事は誤った方向に進む。抵抗帰還を用いるトランスインピーダンスパッチクランプ増幅器（図１（ａ）を参照）は、コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化の後に著しい時間遅延を被る。図６に示されたナノ細孔センサー３０２を参照すると、それらの遅延は、極零特性、比較的大きな帰還抵抗１２（図１（ａ）を参照）、不可避的な直列抵抗Ｒ_ｓ３０３、ナノ細孔センサー３０２キャパシタンス（Ｃ_Ｎ）３０５、およびナノ細孔センサー３０２抵抗（Ｒ_Ｎ）３０７の結果である。図１（ａ）に示された抵抗帰還パッチクランプ回路６は、コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化の直後に（１＋Ｃ_Ｎ／Ｃ_Ｐ）の利得を伴う非反転増幅器として動作する。Ｃ_ＮはＣ_Ｐよりも常に大きいため、増幅器１０が通常の動作に戻ることができるのに十分な電荷をキャパシタンスに供給する時間が経過するまで、増幅器１０の出力は飽和し、データが喪失する。その「デッドタイム」は非常に望ましくない。

先行技術において、複雑な補償回路は、デッドタイムを避けるか、短縮するか、あるいは少なくとも最小限にするために使用されてきた。係る従来技術の補償回路は、基本的なパッチクランプの複雑性を高めただけではなく、入力キャパシタンスを増加させ、抵抗帰還パッチクランプ回路６といった抵抗帰還パッチクランプ回路の帯域幅を制限するのみならず、通常、ステップ入力に応じて出力電圧「リンギング（ｒｉｎｇｉｎｇ）」となる。

図１（ｂ）に示された容量帰還パッチクランプ回路８は、抵抗帰還パッチクランプ回路６（図１（ａ）を参照）のデッドタイムおよびシステムの複雑性を少なくとも部分的に避けるために開発された。容量帰還パッチクランプ回路８は広い帯域幅を有し、リセットスイッチ１６が閉じられた瞬間に効果的に単位利得を有する。キャパシタンスＣ_ｆを有するコンデンサ１４に係るリセットスイッチ１６の閉鎖を適切なタイミングにすることによって、非反転端子１７のコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化は増幅器１０の出力に初期には影響を与えず、出力飽和が避けられる。

あいにく、リセットスイッチ１６が開くと、反転入力１８にて入力キャパシタンスがＣ_ｆ×（１＋Ａ_０）だけ増加し、ここで、Ａ_０は増幅器１０の利得である（周知のミラーの定理を参照）。そのかなり劇的な入力キャパシタンス変化はその後容量帰還パッチクランプ回路８の帯域幅を制限する。よって、容量帰還トランスインピーダンス増幅器を用いることで恣意的なコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化を適用することを非常に困難なものにし、なぜなら、リセット周波数（ｆ_ＲＳＴ）はＩ_ｉｎ／（Ｃ_ｆ×ΔＶ）によって決定され、ここで、ΔＶは電圧反転入力１８と出力電圧Ｖ_０との間の電圧差である。その周波数はコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化と同期する必要はない。

リセット周波数−コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化の問題に対する一解決策は、リセット周波数がコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化に適合するように、単にキャパシタンス１４のキャパシタンスＣ_ｆを減少させることによってリセット周波数（ｆ_ＲＳＴ）を増加させることである。このことはコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤが変化する際に異なる過渡期を有する波形が印加されるときにはいつでも、複数のコンデンサを必要とし、かつ帰還コンデンサ１４キャパシタンスとしてそれらの適切な選択を必要とする。結果、より大きくかつより複雑なパッチクランプ増幅器となる。

パッチクランプ増幅器の従来技術の補償は、直列抵抗（Ｒ_ｓ）および寄生キャパシタンス（Ｃ_Ｐ）を推測するために付加的な増幅器を使用し、結果、かなり複雑な回路となる。

従って、先行技術において上記の制限およびその他の制限を避ける新規なパッチクランプ増幅器回路が望ましい。特定の用途に適合させた補償を組み込む新規なパッチクランプ増幅器システムがより望ましい。デジタル制御されることができる補償を有する新規なパッチクランプシステムがより有益である。

本発明の原理は、補償を組み込み、特定の用途に適合させることができるパッチクランプ増幅器回路用の技術を提供する。この新規なパッチクランプ回路は、デジタル制御された補償を使用し、ポリヌクレオチドを配列決定するためのナノ細孔シークエンサーにおいて使用することができる。

それらの原理は、タイミング信号を生成するクロックを有するパッチクランプ回路に組み込まれる。パッチクランプ回路は、非反転入力と、寄生キャパシタンスおよび電極抵抗を伴う反転入力と、出力とを有する差動増幅回路を更に備える。帰還抵抗は出力と反転入力との間に結合される。リセットスイッチはタイミング信号を受け取り、それに応じてこの出力を反転部に選択的に結合する。コマンド電圧回路はコマンド電圧およびタイミング信号を受け取る。コマンド電圧回路は、タイミング信号に応じて非反転入力に印加される、階段状コマンド電圧を生成する。入力キャパシタンスおよび直列抵抗を有するセンサーは反転入力に動作的に結合される。リセットスイッチは、階段状コマンド電圧における階段状変化（ステップ変化）と同期して時間ＴＲの間、閉じて、そして開く。時間ＴＲは階段状変化の間、階段状電圧を遮ることなく差動増幅回路の飽和を避けるのに十分なものである。階段状コマンド電圧は、センサーに全体に所定の電圧を生成するように直列抵抗および電極抵抗に対して補償するように選択される。

実際にはパッチクランプシステムはナノ細孔センサーを使用し、一方、差動増幅回路は電圧コンバータおよび差動増幅器への電流を有することができる。コマンド電圧回路はサンプルアンドホールド回路、デジタル／アナログコンバータ（Ｄ／Ａコンバータ）または明確な階段（ステップ）を作る他の種類の回路でよい。実際には出力は、センサーにおいて電流の増幅されたデジタルバージョンを作るアナログ・デジタルコンバータに印加することができる。このデジタルバージョンは、フィールド・プログラマブル・アレイに適用することができ、あるいはコンピュータに入力することができる。このコンピュータは、コマンド電圧をコマンド電圧回路に印加することが好ましい。

本発明の原理は更に、パッチクランプシステムにおいて使用されるセンサーを補償する方法を可能にする。係る方法は、電極の第１の端部をパッチクランプシステムの反転入力に結合し、この電極の第２の端部をアースに接続し、パッチクランプシステムの反転入力と出力との間の帰還抵抗Ｒ_Ｆを結合することを含む。これは、パッチクランプシステムから定常状態の出力を得ることができる。そしてステップ電圧がパッチクランプシステムの非反転入力に印加される。そしてステップ電圧に応じるパッチクランプシステムコンバータの出力電圧変動が得られ、その出力電圧変動から、電極の直列抵抗Ｒ_Ｅを決定することができる。直列抵抗が決定された後、センサーは、電極の第２の端部とアースとの間に接続される。そしてパッチクランプシステムの定常状態の出力が分かり、センサー電流が測定される。そしてセンサー直列抵抗Ｒ_ｓを、この測定されたセンサー電流ｉ、直列抵抗Ｒ_Ｅ、および定常状態の出力から決定することができる。一旦、直列抵抗Ｒ_Ｅが分かると、補償された電圧を非反転入力に印加することによって所定の電圧がセンサー全体に印加されることができ、ここで補償された電圧は、所定の電圧にセンサー電流ｉ掛ける直列抵抗Ｒｓを足したものに等しい。

抵抗を補償することに加え、本発明は寄生キャパシタンスを決定するのにも使用することができる。これを行うために、センサー直列抵抗Ｒ_ｓが決定された後にパッチクランプシステムが定常状態の応答を生成するように設定される。そして補償ステップ電圧が、パッチクランプシステムの非反転入力に印加される。そしてこの出力の時定数が分かる。そして入力寄生キャパシタンスが先に得られたセンサー直列抵抗Ｒ_ｓおよび時定数を用いて決定される。

更に本発明の原理は、新規、有用、かつ非自明なナノ細孔シークエンサーを可能にする。係るナノ細孔シークエンサーは入力抵抗Ｒ_Ｎおよび入力キャパシタンスＣ_Ｎを有するナノ細孔センサーを備え、このナノ細孔シークエンサーは、非反転入力、寄生キャパシタンスＣ_ｐを有する反転入力、および出力を有するパッチクランプ回路を更に備える。電極直列抵抗Ｒ_Ｅを有する電極はナノ細孔センサーを反転入力に結合する。値Ｒ_Ｆを有する帰還抵抗は出力と反転入力との間に結合される。リセットスイッチはリセットスイッチが出力を反転入力に選択的に結合するようにするタイミング信号を受信する。デジタル／アナログ回路は、時間が指定されたデジタルコマンド電圧を受信し、この時間が指定されたデジタルコマンド電圧に応じて階段状コマンド電圧を非反転入力に印加する。このリセットスイッチは階段状コマンド電圧における階段状変化と同期して時間Ｔ_Ｒの間、閉じて、そして開く。Ｔ_Ｒは、階段状電圧を遮ることなしにパッチクランプ回路の飽和を避けるのに十分となるように選択される。階段状コマンド電圧は、ナノ細孔センサー全体に所定の電圧を生成するようにナノ細孔抵抗Ｒ_Ｎおよび電極直列抵抗Ｒ_Ｅを補償するように選択される。

ナノ細孔センサーは半導体材料を備えていてもよく、または細胞膜であってもよい。パッチクランプ回路は電流／電圧コンバータおよび差動増幅器を含み得る。この出力は、ナノ細孔センサーにおいて電流の増幅されたデジタルバージョンを生成するアナログ・デジタルコンバータに有益に印加される。その増幅されたデジタルバージョンは、フィールド・プログラマブル・アレイに入力することができ、および／またはコンピュータへの入力として入力することができる。好ましくはこのコンピュータはタイミング信号および時間が指定されたデジタルコマンド電圧を動作可能に生成する。

本発明の利点および特徴は、添付の図面（同じ要素は同じ符号で表される）と共に、下記の詳細な説明および特許請求の範囲を参照にしてよりよく理解することができる。

図１（ａ）は、従来技術の抵抗帰還パッチクランプ回路の概略図である。

図１（ｂ）は、従来技術の容量帰還パッチクランプ回路の概略図である。

図２は、本発明の原理による簡略化した補償型パッチクランプ回路概略図である。

図３（ａ）は、リセットスイッチ１６が閉じられた場合の図２に示された補償型パッチクランプ回路の動作の概略図である。

図３（ｂ）は、リセットスイッチ１６が開いた場合の図２に示された補償型パッチクランプ回路の動作の概略図である。

図４は、デジタル／アナログコンバータ（ＤＡＣ）を使用する本発明の原理による補償型パッチクランプ回路の概略図である。

図５は、従来技術のパッチクランプシステムおよびナノ細孔センサーの概略図を示す。

図６は、好適な実施形態の補償型パッチクランプ回路の概略図である。

図７は、初期の抵抗補償動作中の図６に示された補償型パッチクランプ回路の簡略化したバージョンの概略図である。

図８は、後期の抵抗補償動作中の図６に示された補償型パッチクランプ回路の簡略化したバージョンの概略図である。

図９は、ナノ細孔センサー抵抗を補償するための動作フローチャートである。

図１０は、ナノ細孔センサーキャパシタンスを補償するための動作フローチャートである。

図１１は、コンデンサ補償中の簡略化した好適な実施形態の補償型パッチクランプ回路の概略図である。

図１２は、簡略化した好適な実施形態の補償型コンデンサパッチクランプ回路の概略図である。

図１３は、本発明を実施するための３端末ナノ細孔センサー前端を示す。

本願にて開示される主題は、一実施形態が示された添付の図面を参照に以下により完全に記載される。しかしながら、本発明は多くの異なる構成をとることができ、よって本願に記載された実施形態に限定されるものと解してはならない。

本願において記載された全ての文献は法律で許される限り全ての目的に対して参照により組み込まれる。更に、図面において、その全体において同じ符号は同じ要素を指す。更に、本明細書において使用される用語「ａ」および「ａｎ」は量の制限を表すものではなく、示された物が少なくとも一つ存在するこを表す。

以下では包括的なナノ細孔センサー３０２（図６を参照）が記載され、使用され、および補償される。ナノ細孔センサー３０２は生細胞膜を組み込むことができ、またはソリッドステートのナノ細孔を組み込むことができると理解されたい。更に、後述する回路の全てが回路動作をより良く表すためにナノ細孔センサー３０２を具体的に示すわけではないが、ナノ細孔センサー３０２は様々に示され記載された回路に接続することができると理解されたい。電極直列抵抗が記載されるところでは、センサー直列抵抗がいくつかの実施形態において使用されてもよいことに留意さたい。

本発明で使用するために適切な装置は、例えば、米国特許第５，７９５，７８２号，米国特許第６，０１５，７１４号，米国特許第６，２６７，８７２号，米国特許第６，６２７，０６７号，米国特許第６，７４６，５９４号，米国特許第６，４２８，９５９号，米国特許第６，６１７，１１３号，および国際公報第ＷＯ２００６／０２８５０８号に開示されており、その全てが本明細書に援用される。本明細書に記載された個々の装置はいずれも新規なものではない可能性があるが、個々の装置の組み合わせは、トランスインピーダンス増幅器または電流／電圧コンバータを用いて測定することができるグルコース、酸素、神経伝達物質および病原体といった生化学的な分析濃度を測定するための新規、有用かつ非自明な電気化学的用途、ＤＮＡシークエンサーおよびナノ細孔パッチクランプシステムとなる。

ナノ細孔の感度（特に固体のナノ細孔の場合）は、細孔のサイズおよび厚みによって決定される。ナノ細孔センサーにおける一本鎖ＤＮＡの単体のヌクレオチド（〜０．３５ｎｍ）を特定するために、ナノ細孔センサーは約０．３５ｎｍまたはそれ以下の直径を有する。それは、大体以下のナノ細孔キャパシタンスを生じる。

ここで、ε_γ，ε_０，Ａおよびｄは、それぞれ比誘電率電気的定数（８．８５４×ｌ０^−１２Ｆｍ^−１）、露出面積、および厚みを表す。原子層（すなわちＡｌ_２Ｏ_３およびグラフェン）がナノ細孔センサーのために使用される場合、ナノ細孔キャパシタンスは大きく、この結果、コマンド電圧が変化した際により長いデッドタイム（下記参照）をもたらす。係る原子層センサーは本発明の原理によって利益を得る。

図２は、本発明による基本的な補償型パッチクランプ回路１００を示す。この基本的な補償型パッチクランプ回路１００は、帰還抵抗１２を選択的に短絡させるためのリセットスイッチ１６を組み込むことによって、サンプルアンドホールド回路１０２の入力１０４に印加されたコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤと非反転入力１８との間に置かれたサンプルアンドホールド回路１０２を組み込むことによって抵抗帰還パッチクランプ回路６（図１（ａ）を参照）とはハードウェアにおいて異なる。

動作中、リセットスイッチ１６はサンプルアンドホールド回路１０２の出力のステップ遷移と同期して閉じられる。実際にはこれらの遷移とリセットスイッチ１６との同期化はクロック３１からのタイミングパルスによって制御される。説明を明確にするために、それらのタイミングパルスおよびクロック３１は後続する図面からは省略される。しかしながら、リセットスイッチ１６は、コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化と同期して動作し、サンプルアンドホールド回路、デジタル／アナログコンバータ（ＤＡＣ）、またはいくつかの他の回路、および一種の同期されたタイミングが必要とされると理解されよう。

基本的な補償型パッチクランプ回路１００は２つの動作モードを有し、すなわち、図３（ａ）に記載されたコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤが変化する際の過渡モードと、図３（ｂ）に記載されたコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤが安定した際の定常状態モードである。双方の動作モードにおいて、コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤは離散的なステップにデジタル化されたものであることが理解されよう。過渡モード動作中、オペアンプ１０の飽和および関連するデッドタイムはリセットスイッチ１６を閉じることによって回避される。そして補償型パッチクランプ回路１００の動作は図１（ｂ）に示された容量帰還パルスクランプ回路に類似し、オペアンプ１０は単位利得増幅器として動作する。定常状態モードにおいて、リセットスイッチ１６はオフになり、基本的な補償型パッチクランプ回路１００は図１（ａ）に示された抵抗／フィードバックパッチクランプと同様に動作する。

帰還コンデンサ１４は基本的な補償型パッチクランプ回路１００において使用されないため、周期的リセットパルスはビルトアップ電荷を除去するのに必要とされない。更に、複雑な補償回路は、抵抗／フィードバックが使用されないため必要とされない。基本的な補償型パッチクランプ回路１００アーキテクチャは、更にハードウェアの複雑性を減少させるために複雑なコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ波形の使用および様々なドウェル時間の使用を可能なものとする。

基本的な補償型パッチクランプ回路１００ならびにそのサンプルアンドホールド回路１０２はナノ細孔パッチクランプ回路における大きな変化を表す。基本的な補償型パッチクランプ回路１００に対する一の改善点は、図４の改良した補償型パッチクランプ回路２００に示される。改良した補償型パッチクランプ回路２００は図２に示されたサンプルアンドホールド回路１０２の代わりに低域濾波したデジタル／アナログコンバータ２０２を使用する。デジタル／アナログコンバータ２０２は改良されたものであり、なぜなら、デジタル／アナログコンバータ２０２は、パーソナルコンピュータといったコンピュータ化されたシステムに直接接続され、かつこのシステムよって制御することができるからである。係るコンピュータ化されたシステムは後述する（図６およびそれを支持する記載を参照）。更に、リセットスイッチ１６は、コンピュータまたはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイによって制御することができる。しかしながら、図２に示された単純なクロック３１はクロックドデジタル／アナログコンバータ２０２タイミング信号またはコンピュータから出力されるタイミングによって置き換えられ得るが、リセットスイッチ１６動作とコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤ変化のタイミング同期がなお要求される。

既述の通り、パッチクランプは従来技術のＤＮＡシークエンサーにおいて使用されていた。図５は従来技術のＤＮＡシークエンサー２７０を示す。これは２つの「チャネル」を有するナノ細孔センサー２７２を備え、これらのチャネルは、半導体材料を介してナノ細孔２７４によって分離され、イオン（ＫＣ１）流体で満たされた容器に保持されるシス形チャネルおよびトランス形チャネルである。これらのシス形チャネルとトラム形チャネルとの間で流れる電流は、第１のオペアンプによって電圧に変換され（Ｉ−Ｖ変換）、そして差動増幅器によって増幅される。基本的なパッチクランプ増幅器６および８（図１参照）は、実際にはＩ−Ｖ変換段階および差動増幅器段階を有する２段階パッチクランプ増幅器２７８によって置き換えられる。

基本的なパッチクランプ回路１００および２００はそれ自体、新規、有益かつ有用なものであるが、本発明の好適な実施形態は、図６に示されたコンピュータ化された補償型ＤＮＡシークエンサー３００システムである。ＤＮＡシークエンサー３００は、ナノ細孔センサー３０２が細胞膜ナノ細孔または半導性ナノ細孔を含み得ることを除き、図５に示されたナノ細孔センサー２７２に直接対応するナノ細孔センサー３０２を含む。理解を容易にするために、図６はその物理的な構成はナノ細孔センサー２７２またはその細胞膜の対応物のそれであるという理解の下でナノ細孔センサー３０２の電気モデルを表す。その電気モデルは、ナノ細孔キャパシタンス３０４（Ｃ_Ｎ），ナノ細孔抵抗（Ｒ_Ｎ）３０６，電極直列抵抗（Ｒ_ｓ）３０８、および入力寄生キャパシタンス（Ｃ_Ｐ）３１０を含む。

ナノ細孔センサー３０２はパッチクランプ回路の反転入力１８に結合され、この回路は図５に示されるものと同等の入力（Ｉ−Ｖ）コンバータ３１４ヘッド段階（ｈｅａｄｓｔａｇｅ）および差動増幅器３１６からなる。パッチクランプ回路の出力は、そのアナログ電圧入力をデジタル化するおよびアナログ・デジタルコンバータ（ＡＤＣ）３２０に入力され、そのデジタル化された出力バージョンを入力としてフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ３２４に印加する。フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ３２４は、受信されデジタル化された電圧読み出し（読み出し値）の適切に処理されたバージョンをパーソナルコンピュータ３２６（または別の適切なコンピュータ化されたシステム）に送る。

パーソナルコンピュータ（ＰＣ）３２６は、ナノ細孔センサー３０２読み出しにデータ分析を行う。更に、パーソナルコンピュータＰＣ３２６は、デジタル／アナログコンバータ（ＤＡＣ）３３０の動作を制御するために後に使用されるフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）３２４に制御信号を印加する。このデジタル／アナログコンバータ３３０はコマンド電圧（Ｖ_ＣＭＤ）を入力（Ｉ−Ｖ）コンバータ３１４ヘッドステージおよび差動増幅器３１６の非反転入力１７に供給する。よってＤＮＡシークエンサー３００の動作は、コンピュータ制御され、その出力はデータ分析のために利用可能であり、パッチクランプ補償は下記のように設けられる。

ＤＮＡシークエンサー３００は自動化された補償のために適している。補償動作４５０は図９フローチャートに示される。その動作４５０は、定常状態のモード、ステップ４５２において入力（Ｉ−Ｖ）コンバータ３１４ヘッドステージおよび差動増幅器３１６を駆動することによって開始し、実行される。定常状態のモードを得ることは図６に示される簡略化したパッチクランプ回路３６０（入力（Ｉ−Ｖ）コンバータ３１４ヘッドステージおよび差動増幅器３１６）の助けをもって説明される。簡略化したパッチクランプ回路３６０は、ナノ細孔センサー３０２なしで示され、電極直列抵抗（Ｒ_ｓ）３０８および接地された入力寄生キャパシタンス（Ｃ_Ｐ）３１０を備えて示されていることに留意されたい。この直列抵抗（Ｒ_ｓ）３０８および寄生キャパシタンス（Ｃｐ）３１０は分配され不可避である。コマンド電圧（Ｖ_ＣＭＤ）は所定の電圧（通常は接地）に設定される。このことによって、出力端子３２５上の出力電圧Ｖ_Ｏが安定し、パッチクランプ回路３６０が定常状態モードに置かれる。様々な実施形態において、ナノ細孔はセンサー直列抵抗を有しない。

しばらくした後、Ｖ_ＣＭＤ電圧ステップであるステップ４５４が適用され、このステップは幾分かの時間遅延の後に直列抵抗（Ｒ_ｓ）３０８および寄生キャパシタンス（Ｃ_Ｐ）３１０に亘って電圧Ｖ_ＰをＶ_ＣＭＤに設定する（ステップ４５６を参照）。次に、出力電圧変動が測定され、これはステップ４５８である。出力電圧はデジタル化されＰＣ３２６に印加されることに留意されたい。出力電圧変動および公知のＲ_Ｆ１２から、電極直列抵抗Ｒ_Ｓの値は正確に測定（決定）することができ、これはステップ４６０である。出力電圧変動およびＲ_Ｓに関する式はステップ４５８に示されている。

次に、ナノ細孔センサー３０２はパッチクランプ増幅器３６０に適用され、結果として生じるナノ細孔電流（ｉ）が測定され、これはステップ４６２である（図８参照）。電流（ｉ）が測定された後、ＰＣ３２６によってフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ３２４を介してデジタル／アナログコンバータ３３０が別の異なるコマンド電圧Ｖ’_ＣＭＤを生成し、ここでＶ’_ＣＭＤ＝Ｖ_ＣＭＤ＋ｉ×Ｒ_Ｓであり、これはステップ４６４である。これは、Ｒ_Ｓが既に分かっているため可能である（ステップ４５０〜４６０）。ナノ細孔センサー３０２抵抗Ｒ_Ｎ３０７は出力Ｖ_Ｏ変化からも決定することができる。ステップ４６６にて直列抵抗補償が終了する。全てのナノ細孔に関連する抵抗が決定されているため、ナノ細孔センサー３０２に印加された実際の電圧は直列抵抗（Ｒ_Ｓ）３０８、寄生キャパシタンス（Ｃ_Ｐ）３１０およびナノ細孔抵抗３０７に関わらず正確に知ることができる。よってナノ細孔センサー３０２の抵抗環境は正確に補償される。

更に抵抗補償のために、キャパシタンスを補償することが可能である。図１０はキャパシタンス補償の動作５００を示している。動作５００が開始し（ステップ５０２）、過渡モードに入ることによって進む（ステップ５０４）。図１１は、過渡モードを示しており、このモードはリセットスイッチ１６を閉じることによって入り、反転入力を出力端子３２５に短絡させ、よって帰還抵抗Ｒ_Ｆ１２を短絡させ（図１（ａ）を参照）、全てのキャパシタンスを荷電する。次に、コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤステップが適用される（ステップ５０６）。出力端子３２５での出力電圧Ｖ_Ｏは監視され、Ｖ_Ｏの時定数が測定され（ステップ５０８）、メモリに記憶される（ステップ５１０）。電極直列抵抗Ｒ_Ｓおよび時定数が決定されているため、寄生コンデンサＣ_Ｐの値（ナノ細孔電極キャパシタンスＣ_Ｎよりも非常に小さい）は正確に算出される（ステップ５１２）。このＣ_Ｐの算出された値から、最適なリセットパルス幅（Ｔｔ）の決定をなすことができる（ステップ５１４）。リセットパルス幅はステップ５０６において分かった時定数よりもいくらか長くなるべきであるが、電圧ステップをなくす（ブランクアウト）ほど長くなるべきではない。ブランクアウトによって、それは電圧ステップに対するパッチクランプ回路の反応が別のステップが生じる前にシステムによって決定されることができるほどリセットパルス幅が長いことを意味する。そのリセットパルス幅の遅延は、反転入力電極、接続ケーブルおよびナノ細孔センサーを含む入力寄生キャパシタンス補償し、コンデンサ補償が終了する（ステップ５１６）。

新規な抵抗帰還パッチクランプシステムを説明してきたが、ＤＮＡ配列決定におけるその使用、および抵抗パッチクランプ回路に基づいて自動化された補償、本発明の原理は容量性パッチクランプ回路に対しても有用である。図１２は、本発明の補償技術が容量帰還トランスインピーダンス増幅器にどのように適用するこをができるかの説明を助けるものである。周期的なリセットパルスは、高インピーダンスＺ_１６１０が不可避的な漏れによって引き起こされるため必要とされない。周期的なリセットをなくすことによって、電荷およびクロックフィードスルー（ｆｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）のための入力においてグリッッチが避けられる。しかしながら、Ｚ_１は、寄生入力キャパシタンスＣ_Ｐおよび電極直列抵抗Ｒ_Ｓを必要とするようになお補償を必要とする。Ｚ_１およびＣ_ｆ１４と並列にリセットスイッチ１６を加えることで、容量帰還ＴＩＡのための補償手続きは前述と同じである。

更なる実施形態および開示は以下の通りである。

本明細書に記載された発明は、ポリヌクレオチドにおいて個々のヌクレオチドを検出し定量化することができる装置および方法を提供する。この装置は、固体のナノ細孔でよく、あるいは基板および／または表面の決められた箇所にて位置決めされるナノ細孔でよい。

本明細書において開示された装置は多くの用途において使用することができ、これにはナノ細孔システムが含まれる（これに限定されない）。このシステムは、抵抗帰還を伴う従来のトランスインピーダンス増幅器にスイッチを配置することによって「デッドタイム」を避けることができる。様々な離散波形が、コマンド電圧制御のためのサンプル／ホールド回路またはＤＡＣを用いることによって生成され電圧コマンドに印加される。電圧パッチクランプ増幅器はコンピュータ・インターフェース・システムによって完全に制御することができる。

本発明は上記の帰還抵抗を補償する方法も開示する。本発明は更にプローブ入力キャパシタンスを補償する方法を開示する。

本発明は、決められた箇所に関連する分子の位置を検出し、その分子の量を測定するのに使用することができる。一例において、その決められた箇所はナノ細孔である。この分子はナノ細孔の一側部での電位差を変えることによって位置決めすることができる。この分子は巨大分子であり得、更にポリ陰イオンおよび／またはポリ陽イオンといったポリイオンを含む。一の好適な実施形態において、このポリイオンはポリヌクレオチドである。別の好適な実施形態において、このポリイオンはポリペプチドである。この基板および／または表面は２つのチャンバの境界を定めることができ、基板または表面に位置する細孔を更に備えることができる。これらのチャンバの一方はこの細孔に対してシス形であり、他方はこの細孔に対してトランス形である。この分子はこれらのチャンバ間の電位差を変えることによって位置決めすることができる。好ましくは、この分子はシス形チャンバに最初に存在する。この存在および／もしくは欠如ならびに／または分子構造の変化は細孔を通る電流を測定することによって検知することができる。本発明は、分子を検出するセンサーとして使用することができる。本発明は、分子生物学、構造生物学、細胞生物学、分子スイッチ、分子回路、および分子計算装置、ならびにその製造の分野において特に使用される。

本発明は装置およびこの装置を使用する方法を提供する。この装置はナノ細孔装置システムまたは別の適切なシステムにおいて使用することができる。一の例示的な実施形態において、この装置は電圧パッチクランプ回路であり、これは、クロック遷移を有するクロック信号を生成するクロックと；非反転入力、反転入力、および出力を有する差動増幅器と；前記出力と前記反転入力との間に結合された帰還抵抗と；前記クロック信号を受信するリセットスイッチであって、クロック信号に応じて前記出力を前記反転入力に選択的に結合するリセットスイッチと；クロック信号およびコマンド電圧を受けるサンプルアンドホールド回路であって、クロック信号に応じてコマンド電圧をデジタル化するためおよびデジタル化されたコマンド電圧を前記非反転入力に印加するサンプルアンドホールド回路と；を備え、前記リセットスイッチは前記差動増幅器の利得を減少させるためにクロック遷移中に閉じられ、前記リセットスイッチは前記差動増幅器の利得を増加させるために前記クロック遷移の後に開かれる、回路である。

別の例示的な実施形態において、このシステムは、センサーにおける小さな電流変動を増幅する方法のために使用することができ、この方法は、クロック信号によるコマンド電圧をデジタル化するステップと；センサー電流における変動を誘発させるために、デジタル化されたコマンド電圧から生じた電圧をセンサーに印加するステップと；出力を生成するためにセンサー電流における変動を増幅するステップと；クロック信号が飽和を制限すうように変化する場合に、センサー電流における前記変動に印加された増幅を減少させるステップと、クロック信号が変化しない場合に、センサー電流における前記変動に印加された増幅を増加させるステップと；を含む。

更に別の例示的な実施形態において、このシステムは、ナノ細孔センサーの直列抵抗を補償する方法のために使用することができ、この方法は、定常状態の反応を達成するために電流／電圧コンバータを駆動するステップと；電流／電圧 コンバータの反転入力に印加された電圧がステップ電圧と実質的に等しくなるように電流／電圧コンバータの非反転入力にステップ電圧を印加するステップと；ステップ電圧に対する電流／電圧コンバータの出力電圧変動を決定するステップと；ナノ細孔センサーの直列抵抗を測定するステップと；ナノ細孔センサーを電流／電圧コンバータの非反転入力に結合するステップと；ナノ細孔センサーの電流を測定するステップと；ステップ電圧にナノ細孔センサー電流掛ける直列抵抗を足したものに等しい電圧を電流／電圧コンバータの反転入力に印加することによってナノ細孔センサーを補償するステップを含む。

更なる実施形態において、このシステムは、細胞膜センサーの直列抵抗を補償する方法のために使用することができ、この方法は、定常状態の反応を達成するために電流／電圧コンバータを駆動するステップと；電流／電圧 コンバータの反転入力に印加された電圧がステップ電圧と実質的に等しくなるように電流／電圧コンバータの非反転入力にステップ電圧を印加するステップと；ステップ電圧に対する電流／電圧コンバータの出力電圧変動を決定するステップと；細胞膜センサーの直列抵抗を測定するステップと；細胞膜センサーを電流／電圧コンバータの非反転入力に結合するステップと；細胞膜センサーの電流を測定するステップと；ステップ電圧に細胞膜センサー電流掛ける直列抵抗を足したものに等しい電圧を電流／電圧コンバータの反転入力に印加することによって細胞膜センサーを補償するステップを含む。

更に、このシステムは、ナノ細孔センサーの入力寄生キャパシタンスを補償する方法のために使用することもでき、この方法は、ナノ細孔センサーを電流／電圧コンバータの非反転入力に結合するステップと；ナノ細孔センサーの直列抵抗を得るステップと；定常状態の反応を達成するために電流／電圧コンバータを駆動するステップと；ステップ電圧を電流／電圧コンバータの非反転入力に印加するステップと、ステップ電圧に対する電流／電圧コンバータの時定数を決定するステップと、ナノ細孔センサーの直列抵抗および前記決定された時定数からナノ細孔センサーの入力寄生キャパシタンスを決定するステップと、を含む。

別の実施形態において、このシステムは、細胞膜センサーの入力寄生キャパシタンスを補償する方法のために使用することができ、この方法は、細胞膜センサーを電流／電圧コンバータの非反転入力に結合するステップと；細胞膜センサーの直列抵抗を得るステップと；定常状態の反応を達成するために電流／電圧コンバータを駆動するステップと；ステップ電圧を電流／電圧コンバータの非反転入力に印加するステップと；ステップ電圧に対する電流／電圧コンバータの時定数を決定するステップと；細胞膜センサーの直列抵抗および前記決定された時定数から細胞膜センサーの入力寄生キャパシタンスを決定するステップと、を含む。

このナノ細孔デバイスシステムは、電気通信手段によって接続された「シス形」チャンバおよび「トランス形」チャンバを備えることができる。一実施形態において、このチャンバは、媒体を備え、この媒体は、水媒体，非水媒体，有機媒体等からなる群から選択される。一実施形態において、この媒体は流体である。別の実施形態において、この媒体はガスである。一実施形態においてこの電気通信手段は、固体の細孔であり、この細孔は、例えば、窒化ケイ素、二官能硫化アルキル、および／もしくは金または他の金属または合金を含む。あるいは、このシス形チャンバおよびトランス形チャンバは、少なくとも一つの細孔またはチャネルを備える薄膜によって分離される。一の好適な実施形態において、この薄膜は、疎水性ドメインおよび親水性ドメインを有する化合部を備える。より好適な実施形態において、この薄膜は、リン脂質を含む。このデバイスは更にシス形チャンバとトランス形チャンバとの間に電場を印加する手段を備える。一実施形態において、細孔またはチャネルはポリイオンの一部を収容する。別の実施形態においてこの細孔またはチャネルは分子の一部を収容する。一の好適な実施形態において、この分子は巨大分子である。別の好適な実施形態において、このポリイオンは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、多糖、およびポリケチドからなる群から選択される。

一実施形態において、この化合物は酵素を含む。この酵素活性は、例えば、プロテアーゼ，キナーゼ，ホスファターゼ，ヒドロラーゼ，オキシドレダクターゼ，イソメラーゼ，トランスフェラーゼ，メチラーゼ，アセチラーゼ，リガーゼ，リアーゼ，リボザイム等の酵素活性であり得る（これらの限定されない）。より好適な実施形態において、この酵素活性は、ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ，エンドヌクレアーゼ，エキソヌクレアーゼ，ＤＮＡリガーゼ，ＤＮアーゼ，ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ，キナーゼ，ホスファターゼ，メチラーゼ，アセチラーゼ，グルコースオキシダーゼ，リボザイム等の酵素活性であり得る。

更に興味のある実施形態において、この細孔は活性剤（アクティベータ）か通過することができるように大きさおよび形状が決定され、ここで、この活性剤はＡＴＰ，ＮＡＤ^＋，ＮＡＤＰ^＋，ジアシルグリセロール，ホスファチジルセリン，エイコサノイド，レチノイン酸，カルシフェロール，アスコルビン酸，神経ペプチド，エンケファリン，エンドルフィン，４−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ），５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ），カテコールアミン，アセチルＣｏＡ，Ｓ−アデノシルメチオニン，ヘキソース糖，ペントース糖，リン脂質，脂質，グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ），および任意の他の生体活性剤からなる群から選択される。

ある実施形態において、この細孔はモノマーが通過できるように大きさおよび形状が決定され、ここで、このモノマーは、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ＵＴＰ，アラニン，システイン，アスパラギン酸，グルタミン酸，フェニルアラニン，グリシン，ヒスチジン，イソロイシン，リシン，ロイシン，メチオニン，アスパラギン，プロリン，グルタミン，アルギニン，セリン，トレオニン，バリン，トリプトファン，チロシン，ヘキソース糖，ペントース糖，リン脂質，脂質，および任意の他の生体モノマーからなる群から選択される。

更に別の実施形態において、この細孔は共同因子（コファクター）が通過することができるように大きさおよび形状が決定され、ここで、この共同因子は、Ｍｇ２^＋，Ｍｎ２^＋，Ｃａ２^＋，ＡＴＰ，ＮＡＤ^＋，ＮＡＤＰ^＋，および任意の他の生体共同因子からなる群から選択される。

一の重要な実施形態において、この細孔またはチャネルは、生体分子，または合成の修飾されたか変化された生体分子を備える。係る生体分子は、例えば，イオンチャネル（ａ−溶血素など）、ヌクレオシドチャネル，ペプチドチャネル，糖輸送体，シナプスのチャネル，膜貫通レセプタ（ＧＰＣＲなど），受容体チロシン・キナーゼ等、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣ受容体、核内受容体（ステロイドホルモン受容体など），核細孔等である（これらに限定されない）。

あるいは、この化合物は、非酵素生体活性を有する。非酵素生体活性を有するこの化合物は、，例えば，タンパク，ペプチド，抗体，抗原，核酸，ペプチド核酸（ＰＮＡ），固定された核酸（ＬＮＡｓ），モルホリノ，糖，脂質，グリコシルホスファチジルイノシトール，グリコ燐酸イノシトール，リポ多糖等であり得る（これらに限定されない）。この化合物は抗原活性を有することができる。この化合物はリボザイム活性を有することができる。この化合物は、選択的結合特性を有し、これによりこのポリマーは特定の制御された環境条件（状態）において化合物と結合するが、環境条件が変化した場合には結合しない。係る条件は、例えば、［Ｈ^＋］の変化、環境温度の変化、過酷さの変化、疎水性の変化、親水性の変化などであり得る（これらに限定されない）。

一実施形態において、巨大分子は酵素活性を有する。この酵素活性は、例えば、プロテアーゼ，キナーゼ，ホスファターゼ，ヒドロラーゼ，オキシドレダクターゼ，イソメラーゼ，トランスフェラーゼ，メチラーゼ，アセチラーゼ，リガーゼ，およびリアーゼなどの酵素活性であり得る（これらに限定されない）。より好適な実施形態において、この酵素活性はＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ，エンドヌクレアーゼ，エキソヌクレアーゼ，ＤＮＡリガーゼ，ＤＮアーゼ，ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ，キナーゼ，ホスファターゼ，メチラーゼ，アセチラーゼ，またはグルコースオキシダーゼなどの酵素活性であり得る。別の実施形態において、巨大分子は一以上の酵素活性，例えばシトクロムＰ４５０酵素の酵素活性、を有することができる。別の別の実施形態において、巨大分子は２種類以上の酵素活性、例えば哺乳類の脂肪酸合成酵素、を有することができる。別の実施形態において、巨大分子はリボザイム活性を有する。

別の実施形態において、本発明は化合物を含み、この化合物は更にリンカー分子を含み、このリンカー分子は、チオール基，スルフィド基，リン酸基，硫酸基，シアン基，ピペリジン基，Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基，およびＢｏｃ（ブチルオキシカルボニル）基からなる群から選択される。別の実施形態において、この化合物は二官能硫化アルキルおよび金からなる群から選択される。

本発明の方法を実施するために使用することができる装置は、例えば、米国特許第５，７９５，７８２号、第６，０１５，７１４号，第６，２６７，８７２号，第６，６２７，０６７号，第６，７４６，５９４号，第６，４２８，９５９号，第６，６１７，１１３号および国際公報ＷＯ２００６／０２８５０８に記載されている（全て参照により組み込まれる）。

上記ではパッチクランプに関する発明的な補償技術を記載したが、過剰なデッドタイムを避ける必要がある用途において使用することもできる。正確なリセットパルス幅がデッドタイムを減らすことができる。

図面および上記説明は本発明を説明するものであるが、それらは例示的なものにすぎないことを理解されたい。それらは網羅的なものではなく、また本発明を開示された厳密な形態に限定することを意図せず、かつ、上記の教示に鑑み多くの変更および変形が可能であることは自明である。当業者は示された実施形態の数多くの変更および改造のうち本発明の原理を保持するものを理解するであろう。

従来の２電極ナノ細孔センサーを用いる本発明を説明してきたが、本発明の原理は他のアーキテクチャと共に使用することができる程度に柔軟なものである。例えば、図１３は、３つの電極ナノ細孔センサー６９０フロントエンド回路７００を示す。単位利得緩衝増幅器７０２はその非反転入力でのコマンド電圧Ｖ_ＣＭＤを緩衝する。その緩衝された出力はスイッチＳ１ ７０６を通してシス形チャンバに結合される。コマンド電圧Ｖ_ＣＭＤが変化すると、スイッチＳ１ ７０６が電流を注入するためにオンにされて、シス形チャンバ７１０電位がＶ_ＣＭＤと等しくなるまでナノ細孔センサーのキャパシタンスＣＮを充電する。これはデッドタイムの補償を助ける。この本願にて発明された補償技術はナノ細孔用途、パッチクランプ用途および電気化学用途に機器用することができ、生化学的分析濃度（例えば、トランスインピーダンス増幅器または電流／電圧コンバータを用いて測定されることができるグルコース、酸素、神経伝達物質、病原体）を測定する。

Claims (21)

1. パッチクランプシステムであって、
   タイミング信号を生成する回路と、
   非反転入力、寄生キャパシタンスを備え電極抵抗に結合された反転入力、および出力を有する差動増幅回路と、
   前記出力と前記反転入力との間に結合された帰還抵抗と、
   前記タイミング信号を受信するリセットスイッチであって、前記タイミング信号に応じて前記出力を前記反転入力に選択的に結合するためのリセットスイッチと、
   タイミング信号およびコマンド電圧を受けるコマンド電圧回路であって、前記タイミング信号に応じて階段状コマンド電圧を前記非反転入力に印加するためのコマンド電圧回路と、
   入力キャパシタンスおよび直列抵抗を有するセンサーであって、前記反転入力に動作的に結合されたセンサーと、
   を備えており、
   前記リセットスイッチは時間Ｔ_Ｒの間、前記階段状コマンド電圧における階段状変化と同期して閉じられ、
   前記リセットスイッチは前記時間Ｔ_Ｒの後に開かれ、
   前記時間Ｔ_Ｒは、前記階段状電圧をなくすことなしに前記差動増幅回路の飽和を避けるのに十分であり、
   前記階段状コマンド電圧は、前記センサーに所定の電圧を生成するために前記直列抵抗および前記電極抵抗を補償するように選択される、パッチクランプシステム。
2. 前記センサーはナノ細孔センサーを含む、請求項１に記載のパッチクランプシステム。
3. 前記差動増幅回路は、電流／電圧コンバータおよび差動増幅器を含む、請求項１に記載のパッチクランプシステム。
4. 前記コマンド電圧回路は、サンプルアンドホールド回路を備える、請求項１に記載のパッチクランプシステム。
5. 前記コマンド電圧回路は、デジタル／アナログコンバータを備える、請求項１に記載のパッチクランプシステム。
6. 前記出力は、前記センサーにおいて前記電流の増幅されたデジタルバージョンを生成するアナログ／デジタルコンバータに印加される、請求項５に記載のパッチクランプシステム。
7. 前記増幅されたデジタルバージョンはフィールド・プログラマブル・アレイに印加される請求項６に記載のパッチクランプシステム。
8. 前記増幅されたデジタルバージョンはコンピュータに入力される、請求項６に記載のパッチクランプシステム。
9. 前記コンピュータによって、前記コマンド電圧が前記コマンド電圧回路に印加される、請求項８に記載のパッチクランプシステム。
10. パッチクランプシステムにおいてセンサーを補償する方法であって、
    ａ） 電極の第１の端部をパッチクランプシステムの反転入力に結合するステップと、
    ｂ） 前記電極の第２の端部をアースに接続するステップと、
    ｃ） 前記パッチクランプシステムの反転入力および出力との間に帰還抵抗Ｒ_Ｆを結合するステップと、
    ｄ） 非反転入力の電圧を基準電圧に設定することによって前記パッチクランプシステムの定常状態の出力を得るステップと、
    ｅ） ステップ電圧を前記非反転入力に印加するステップと、
    ｆ） 前記ステップ電圧に応じて前記パッチクランプシステムのコンバータの出力電圧変動を決定するステップと、
    ｇ） ステップｆ）において決定された出力電圧変動を用いて電極直列抵抗Ｒ_Ｅを算出するステップと、
    ｈ） 前記電極の第２の端部とアースとの間にセンサーを接続するステップと、
    ｉ） 前記非反転入力を基準電圧に設定することによって前記パッチクランプシステムの定常状態の出力を得るステップと、
    ｊ） 前記定常状態の出力が達成された後にセンサー電流ｉを測定するステップと、
    ｋ） 前記測定されたセンサー電流ｉ，前記電極直列抵抗Ｒ_Ｅ，および前記定常状態の出力からセンサー直列抵抗Ｒｓを決定するステップと、
    ｌ） 補償された電圧を前記非反転入力に印加することによって前記センサーに所定の電圧を得ることによって前記センサーを使用するステップであって、ここで、前記補償された電圧は前記所定の電圧にセンサー電流ｉ掛けるセンサー直列抵抗Ｒｓを足したものに等しい、方法。
11. 前記センサー直列抵抗Ｒｓが決定された後に定常状態の反応を達成するように前記パッチクランプシステムを駆動するステップと、
    補償ステップ電圧を前記パッチクランプシステムの非反転入力に印加するステップと、
    前記補償ステップ電圧に対する前記パッチクランプシステムの出力の時定数を決定するステップと、
    前記センサー直列抵抗Ｒｓおよび前記決定された時定数から前記センサーの入力寄生キャパシタンスを決定するステップと、
    を更に含む、請求項１０に記載のパッチクランプシステムにおいてセンサーを補償する方法。
12. 前記決定された入力寄生キャパシタンスに基づきリセットパルス幅を決定するステップを更に含む、請求項１１に記載のパッチクランプシステムにおいてセンサーを補償する方法。
13. 入力抵抗Ｒ_Ｎおよび入力キャパシタンスＣ_Ｎを有するナノ細孔センサーと、
    非反転入力、寄生キャパシタンスＣ_Ｐを備える反転入力、および出力を有する、パッチクランプ回路と、
    前記ナノ細孔センサーを前記反転入力に結合する電極であって、電極直列抵抗Ｒ_Ｅを有する電極と、
    前記出力と前記反転入力との間に結合された帰還抵抗と、
    タイミング信号を受信するリセットスイッチであって、前記タイミング信号に応じて選択的に前記出力を前記反転入力に結合するリセットスイッチと、
    時間が指定されたデジタルコマンド電圧を受けるデジタル／アナログ回路であって、前記時間が指定されたデジタルコマンド電圧に応じて階段状コマンド電圧を前記非反転入力に印加するデジタル／アナログ回路と、
    を備え、前記リセットスイッチは、時間Ｔ_Ｒの間、前記階段状コマンド電圧における階段状変化と同期して閉じ、
    前記リセットスイッチは、前記時間Ｔ_Ｒの後に開かれ、
    前記時間Ｔ_Ｒは、前記階段状電圧をなくすことなく前記パッチクランプ回路の飽和を避けるのに十分であり、
    前記階段状コマンド電圧は、前記ナノ細孔センサーに所定の電圧を生成するように前記入力抵抗Ｒ_Ｎおよび前記電極直列抵抗Ｒ_Ｅを補償するように選択される、ナノ細孔シークエンサー。
14. 前記ナノ細孔センサーは半導体材料を備える、請求項１３に記載のナノ細孔シークエンサー。
15. 前記ナノ細孔センサーは細胞膜を備える、請求項１３に記載のナノ細孔シークエンサー。
16. 前記パッチクランプ回路は、電流／電圧コンバータおよび差動増幅器を含む、請求項１３に記載のナノ細孔シークエンサー。
17. 前記出力は、前記ナノ細孔センサーにおいて前記電流の増幅されたデジタルバージョンを生成するアナログ／デジタルコンバータに印加される、請求項１３に記載のナノ細孔シークエンサー。
18. 前記増幅されたデジタルバージョンはフィールド・プログラマブル・アレイに入力される、請求項１７に記載のナノ細孔シークエンサー。
19. 前記増幅されたデジタルバージョンは、コンピュータに入力される、請求項１７に記載のナノ細孔シークエンサー。
20. 前記コンピュータは、前記タイミング信号と、前記時間が指定されたデジタルコマンド電圧とを動作的に生成する、請求項１３に記載のナノ細孔シークエンサー。
21. ポリヌクレオチドを配列決定するようになされた請求項１３に記載のナノ細孔シークエンサー。
    

Images