CN102899243B - 基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的dna测序装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及方法，该测序装置主要由带有石墨烯纳米孔的石墨烯微带、硅基衬底中倒金字塔形微腔、微腔顶部的固态纳米孔构成。测序时，测序反应腔被石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构一分为二，单链DNA分子在静电场的作用下成线状穿过石墨烯纳米孔，进入倒金字塔形微腔，最后经固态纳米孔穿出。利用微弱电流测量设备同时测量DNA分子穿越活动引起的纳米孔中纵向离子电流阻塞和石墨烯微带中纳米孔周围横向电导变化，进而利用同步数据记录和处理系统对双向数据进行解析计算，实现单链DNA分子的序列分析。
Description
技术领域
本发明属于DNA分子测序技术领域，具体涉及一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及方法。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一。为实现千美元人类基因组(TDG)、百美元人类基因组(HDG)目标，推进个体化疾病诊断与治疗，迫切需要一种低成本、高通量的直接测序方法。基于纳米孔的单分子测序被认为是最有希望实现上述目标的关键技术。
截止目前，已经报道的各种基于纳米孔的DNA单分子测序方法中，离子电流阻塞法提出的最早，研究也最为广泛。这种方法的基本原理如下，测序反应腔被带有纳米孔的膜一分为二，单链DNA分子被加入到膜的一边，在膜另一边正电位电极的吸引下，带有负电荷的聚合链进入纳米孔，并从膜的一边滑动到膜的另一边,在聚合链穿越纳米孔时对会对原有的纳米孔中离子电流造成堵塞，电流会急剧下降到原电流的10％左右，研究人员通过对多聚核苷酸链穿越过程的穿越时间(t)、阻塞发生的间隙(Δt)以及阻塞电流(IB)的定量检测来实现DNA分子测序。
然而，这种纳米孔离子电流阻塞法在实际应用中面临一些根本性的问题。早期所采用的生物分子纳米孔(其典型代表是α-溶血素蛋白分子(proteinα-hemolysin)构成的纳米孔)稳定性差、寿命短，对环境因素极其敏感,且生物分子纳米孔的孔径难以人工控制，内部孔径仅约为1.5nm，不适于不同核酸分子的检测。目前普遍采用的固态纳米孔(Solid-state nanopore)虽然克服了上述生物分子纳米孔的缺点，但是也存在如下问题：首先，固态纳米孔通道长度通常为5nm以上,可以容纳十多个碱基,这一尺寸对于测序所需要的分辨单个碱基引起的电流变化过长；其次，当单个核苷酸占据纳米孔时只有大约100个离子穿过纳米孔，而4个碱基在结构上只有数个原子的差异，这种细微的结构化差异导致的离子电流变化很微弱，以至于研究人员很难区分出每个碱基；第三，基于固态纳米孔的测序方法目前尚不能有效地控制DNA通过纳米孔的速度，由于速度太快，造成了碱基检测识别率不高。这些问题严重制约了这种测序方法的实际应用。
借助于其他辅助手段的各种纳米孔测序方法，如荧光标记辅助纳米孔测序法、杂交辅助纳米孔测序法、隧道电流辅助纳米孔测序法、以及探针修饰纳米孔测序法等，在本质上仍属于间接测序方法，存在设备复杂、低速、高成本等问题。所以，实现千美元人类基因组(TDG)目标、甚至百美元人类基因组(HDG)目标，推进个体化疾病诊断与治疗的发展，需要新型的直接、高效、低成本测序方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及方法，能够实现DNA分子的准确、高效、低成本测序。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置，该DNA测序装置是以石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构为核心组装的测序装置，具体包括置于电解液11中的硅基衬底1，在硅基衬底1上半部刻蚀有倒金字塔形微腔2，下半部刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔2塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔2的塔顶为固态纳米孔3，绝缘层6包覆在硅基衬底1外部，在硅基衬底1上部有通过内置电极8固定于绝缘层6上的石墨烯微带4，石墨烯微带4上刻蚀有石墨烯纳米孔5，石墨烯纳米孔5和固态纳米孔3同轴，所述石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构将测序反应腔分为上下两部分，置于反应腔上部的外接电极7接负电位，置于反应腔下部的外接电极7接正电位，外接电极7和纵向微弱电流测量设备9以及电源12构成纵向微弱电流测量回路，内置电极8和横向微弱电流测量设备10以及电源14构成横向微弱电流测量回路。
所述固态纳米孔3的直径为1.5-10nm。
所述石墨烯纳米孔5的直径为1.5-7nm。
所述石墨烯微带4为单层或多层石墨烯。
所述纵向微弱电流测量设备9为皮安级电流测量仪。
所述横向微弱电流测量设备10为亚微安级电流测量仪。
用于产生驱动单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的静电场由电源12提供，所述电源12的偏置电压应为0.05-0.2V，靠近石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构中石墨烯纳米孔5一侧的电极接负电位，靠近固态纳米孔3一侧的电极接正电位。
所述电解液11为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L,pH值为8.0。
上述所述的DNA测序装置的测序方法，首先将单链DNA分子13加入到盛有电解液11的测序反应腔上部，在静电场的驱动作用下，单链DNA分子13成线状通过石墨烯纳米孔5，进入倒金字塔形微腔2，并最终通过固态纳米孔3到达测序反应腔的下部；在单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时，一方面对通过石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的电解液离子电流造成堵塞，导致纵向离子电流急剧变化，另一方面，对石墨烯纳米孔5周边电导产生影响，导致石墨烯微带4中横向电流密度发生改变，由于单链DNA分子13中不同碱基结构不同，在穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时在上述纵向和横向两个方向造成的电流和电导改变也不同，采用纵向微弱电流测量设备9对单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构过程中的穿越时间，纵向离子电流发生阻塞的时间间隔、阻塞离子电流的大小进行定量检测；采用横向微弱电流测量设备10对横向石墨烯微带4中电流密度发生改变的时间间隔、电流的大小进行定量检测；再通过对所测得的双向数据进行解析计算，即可得到所测DNA分子的序列。
本发明和现有技术相比，具有如下优点：
第一，本发明所采用的石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构中，固态纳米孔克服了生物分子纳米孔的不稳定性和孔径不易控制性；石墨烯纳米孔的采用解决了常规固态纳米孔通道太长导致测序分辨率难以达到单个碱基的问题。此外，通过在石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构周围增加环形电场、改变电解质溶液组分、控制温度、改变石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构容积等方法，可以调节、甚至定量控制单链DNA分子通过纳米孔的速度，为检测赢得了时间。这些优点为实现单碱基分辨率、直接纳米孔测序奠定了基础。
第二，本发明采用了DNA分子穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔孔结构时，纵向离子电流阻塞和横向石墨烯微带中纳米孔周围电导变化的双数据解析测序新思想。采用这种双向数据解析测序可以提供单链DNA分子穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时更多的信息，改善了传统纳米孔离子电流阻塞法信噪比低、易受外界环境干扰等问题，从而提高测序精度，有望从根本上解决目前新一代DNA测序所面临的问题。
附图说明
附图为本发明基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及测序方法原理示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。
如附图所示，基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置，该DNA测序装置是以石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构为核心组装的测序装置，具体包括置于电解液11中的硅基衬底1，在硅基衬底1上半部刻蚀有倒金字塔形微腔2，下半部刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔2塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔2的塔顶为固态纳米孔3，倒金字塔形微腔2用于控制DNA分子链穿越固态纳米孔3的速度，绝缘层6包覆在硅基衬底1外部，用来保证硅基衬底1与石墨烯微带4间的绝缘，在硅基衬底1上部有通过内置电极8固定于绝缘层6上的石墨烯微带4，石墨烯微带4中央刻蚀有石墨烯纳米孔5，石墨烯纳米孔5和固态纳米孔3同轴，所述石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构将测序反应腔分为上下两部分，置于反应腔上部的外接电极7接负电位，置于反应腔下部的外接电极7接正电位，外接电极7和纵向微弱电流测量设备9以及电源12构成纵向微弱电流测量回路，纵向微弱电流测量设备9用于测量纵向离子电流阻塞，内置电极8和横向微弱电流测量设备10以及电源14构成横向微弱电流测量回路，横向微弱电流测量设备10用于测量横向石墨烯微带4中石墨烯纳米孔5周围电导的变化。
优选固态纳米孔3的直径为1.5-10nm。
优选石墨烯纳米孔5的直径为1.5-7nm。
优选石墨烯微带4为单层或多层石墨烯。
优选纵向微弱电流测量设备9为皮安级电流测量仪。
优选横向微弱电流测量设备10为亚微安级电流测量仪。
用于产生驱动单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的静电场由电源12提供，优选电源12的偏置电压为0.05-0.2V，靠近石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构中石墨烯纳米孔5一侧的电极接负电位，靠近固态纳米孔3一侧的电极接正电位。
优选电解液11为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L,pH值为8.0。
本发明一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序方法，首先将单链DNA分子13加入到盛有电解液11的测序反应腔上部，在静电场的驱动作用下，单链DNA分子13成线状通过石墨烯纳米孔5，进入倒金字塔形微腔2，并最终通过固态纳米孔3到达测序反应腔的下部；在单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时，一方面对通过石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的电解液离子电流造成堵塞，导致纵向离子电流急剧变化，另一方面，对石墨烯纳米孔5周边电导产生影响，导致石墨烯微带4中横向电流密度发生改变，由于单链DNA分子13中不同碱基结构不同，在穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时在上述纵向和横向两个方向造成的电流和电导改变也不同，采用纵向微弱电流测量设备9对单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构过程中的穿越时间，纵向离子电流发生阻塞的时间间隔、阻塞离子电流的大小进行定量检测。采用横向微弱电流测量设备10对横向石墨烯微带4中电流密度发生改变的时间间隔、电流的大小进行定量检测；再通过对所测得的双向数据进行解析计算，即可得到所测DNA分子的序列。
Claims (7)
1.基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置，其特征在于：该DNA测序装置是以石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构为核心组装的测序装置，具体包括置于电解液(11)中的硅基衬底(1)，在硅基衬底(1)上半部刻蚀有倒金字塔形微腔(2)，下半部刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔(2)塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔(2)的塔顶为固态纳米孔(3)，绝缘层(6)包覆在硅基衬底(1)外部，在硅基衬底(1)上部有通过内置电极(8)固定于绝缘层(6)上的石墨烯微带(4)，石墨烯微带(4)中央刻蚀有石墨烯纳米孔(5)，石墨烯纳米孔(5)和固态纳米孔(3)同轴，所述石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构将测序反应腔分为上下两部分，置于反应腔上部的外接电极(7)接负电位，置于反应腔下部的外接电极(7)接正电位，外接电极(7)和纵向微弱电流测量设备(9)以及电源(12)构成纵向微弱电流测量回路，内置电极(8)和横向微弱电流测量设备(10)以及电源(14)构成横向微弱电流测量回路；所述固态纳米孔(3)的直径为1.5-10nm；所述石墨烯纳米孔(5)的直径为1.5-7nm。
2.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述石墨烯微带(4)为单层或多层石墨烯。
3.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述纵向微弱电流测量设备(9)为皮安级电流测量仪。
4.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述横向微弱电流测量设备(10)为亚微安级电流测量仪。
5.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：用于产生驱动单链DNA分子(13)穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的静电场由电源(12)提供，所述电源(12)的偏置电压应为0.05-0.2V，靠近石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构中石墨烯纳米孔(5)一侧的电极接负电位，靠近固态纳米孔(3)一侧的电极接正电位。
6.根据权利要求1所述的DNA测序装置，其特征在于：所述电解液(11)为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L,pH值为8.0。
7.利用权利要求1至6任一项所述DNA测序装置对DNA分子进行测序的方法，其特征在于：首先将单链DNA分子(13)加入到盛有电解液(11)的测序反应腔上部，在静电场的驱动作用下，单链DNA分子(13)成线状通过石墨烯纳米孔(5)，进入倒金字塔形微腔(2)，并最终通过固态纳米孔(3)到达测序反应腔的下部；在单链DNA分子(13)穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时，一方面对通过石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的电解液离子电流造成堵塞，导致纵向离子电流急剧变化，另一方面，对石墨烯纳米孔(5)周边电导产生影响，导致石墨烯微带(4)中横向电流密度发生改变，由于单链DNA分子(13)中不同碱基结构不同，在穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构时在上述纵向和横向两个方向造成的电流和电导改变也不同，采用纵向微弱电流测量设备(9)对单链DNA分子(13)穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构过程中的穿越时间，纵向离子电流发生阻塞的时间间隔、阻塞离子电流的大小进行定量检测，采用横向微弱电流测量设备(10)对横向石墨烯微带(4)中电流密度发生改变的时间间隔、电流的大小进行定量检测，再通过对所测得的双向数据进行解析计算，即可得到所测DNA分子的序列。
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